病原体の検出および分析のための方法および装置
【課題】微小流体の分析を実行するための方法および装置の提供。
【解決手段】統合された空気マニホルドに関連するモノリシックエラストマ膜により、流体を分離、経路指定、合流、分割、および貯蔵するための構造など、様々な流体制御構造の高密度の配列を、配置および作動させることが可能になる。流体制御構造は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびキャピラリ電気泳動（ＣＥ）分析など、統合的な免疫親和捕捉および分析を備える病原体検出および分析システムを実施するために用いることができる。被分析溶液は、デバイスに入力されると、細菌、ウィルス、および細菌胞子など、様々な種類の微生物有機体を対象とした抗体を有する微細加工されたチャンバ内の一連の免疫親和捕捉マトリクスを通してポンプによって送られてよい。免疫捕捉チャンバは、さらなる分析工程のために、ターゲットを捕捉、精製、および濃縮することができる。
【解決手段】統合された空気マニホルドに関連するモノリシックエラストマ膜により、流体を分離、経路指定、合流、分割、および貯蔵するための構造など、様々な流体制御構造の高密度の配列を、配置および作動させることが可能になる。流体制御構造は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびキャピラリ電気泳動（ＣＥ）分析など、統合的な免疫親和捕捉および分析を備える病原体検出および分析システムを実施するために用いることができる。被分析溶液は、デバイスに入力されると、細菌、ウィルス、および細菌胞子など、様々な種類の微生物有機体を対象とした抗体を有する微細加工されたチャンバ内の一連の免疫親和捕捉マトリクスを通してポンプによって送られてよい。免疫捕捉チャンバは、さらなる分析工程のために、ターゲットを捕捉、精製、および濃縮することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体の検出および分析に関する。一例では、本発明は、微小流体制御構造を用いて実施される標本の準備、処理、検出、および分析のためのシステムを提供する。別の例では、本発明は、高スループット分析の用途のために、高密度配列の流体制御素子を製造するための頑強な技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
微小流体分析のための従来の機構には限界がある。一部の利用可能な機構は、単一チャネルの分離デバイスと、複数チャネルの分離デバイスとを含む。他の機構は、いくつかの標本の準備および分析の工程を備える分析器を含む。しかしながら、流体制御が可能な多くの微小流体分析デバイスは、多くの化学的または生化学的分析と化学的または物理学的に互換性がない。さらに、多くの微小流体制御素子は、加工プロセス、頑健性、および／または、設計における制限のために、高密度配列で加工することが困難である。多くの従来のデバイスは、流体制御を維持するために持続的に作動させることが必要である。かかるバルブを用いる微小流体デバイスは、デバイスの流体の内容物の制御を失うことなしに制御システムから取り外すことができない。さらに、微小流体分析のための多くの技術および機構は、感度、特異性、または、定量的な分析の能力に欠けている。特に、従来の微小流体分析機構は、病原体の検出器および分析器などのシステムのために標本の準備を効率的に行う機能および能力に欠けている。
【０００３】
したがって、バルブ、ポンプ、ルータ、反応炉など、微小流体制御機構を実施するための方法および装置を改良して、微小流体デバイスにおける標本の導入、準備処理、および分析能力の効果的な統合を実現することが望まれている。一例では、偽陽性が少なく高スループットかつ安価な連続監視を実現する病原体の検出器および分析器として用いることのできる単一チャネルシステムおよびアレイシステムの両方を実施するのに利用可能な微細加工の効率を有する微小流体デバイスを提供することが望まれている。
【発明の概要】
【０００４】
微小流体の分析を実行するための方法および装置が提供されている。統合されている空気マニホルドに関連するモノリシックエラストマ膜により、流体を分離、経路指定、合流、分割、および貯蔵するための構造など、様々な流体制御構造の高密度の配列を、配置および作動させることが可能になる。流体制御構造は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびキャピラリ電気泳動（ＣＥ）分析など、統合的な免疫親和捕捉および分析を備える病原体検出および分析システムを実施するために用いることができる。被分析溶液は、デバイスに入力されると、細菌、ウィルス、および細菌胞子など、様々な種類の微生物有機体を対象とした抗体を有する微細加工されたチャンバ内の一連の免疫親和捕捉マトリクスを通してポンプによって送られてよい。免疫捕捉チャンバは、さらなる分析工程のために、ターゲットを捕捉、精製、および濃縮することができる。
【０００５】
一実施形態では、病原体検出システムが提供されている。そのシステムは、微小流体デバイスに統合されている免疫捕捉チャンバを備える。免疫捕捉チャンバは、微小流体チャネルを通して免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる。そのシステムは、さらに、免疫捕捉チャンバに関連付けられているＤＮＡ分析機構を備える。ＤＮＡ分析機構は、微小流体デバイスに統合されている。ＤＮＡ分析機構は、ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行できる。
【０００６】
別の実施形態では、モノリシックデバイス上の病原体検出システムが提供されている。そのシステムは、モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバを備える。免疫捕捉チャンバは、微小流体チャネルを通して免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる。そのシステムは、さらに、免疫捕捉チャンバに関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を備える。複数のＤＮＡ分析機構は、モノリシックデバイスに統合されている。複数のＤＮＡ分析機構は、ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行できる。
【０００７】
別の実施形態では、病原体分析のための方法が提供されている。被分析流体が、モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバに、微小流体チャネルを通じて供給される。免疫捕捉チャンバにおいて、被分析流体に関連するターゲットが捕捉される。複数の免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を用いて、ターゲットに対してＤＮＡ分析が実行される。複数のＤＮＡ分析機構は、モノリシックデバイスに統合されている。
本発明に関する上述およびその他の特徴と利点は、本発明の原理を例示的に説明する本発明の明細書および添付の図面を参照して詳細に提示される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｂ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｃ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｄ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｅ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図２Ａ】ダイヤフラムポンプを示す図。
【図２Ｂ】ダイヤフラムポンプを示す図。
【図３】流体ルータを示す平面図。
【図４】混合ループを示す平面図。
【図５Ａ】流体容器を示す図。
【図５Ｂ】流体容器を示す図。
【図５Ｃ】流体容器を示す図。
【図５Ｄ】流体容器を示す図。
【図６】バスバルブを示す図。
【図７】病原体検出システムを示す図。
【図８】免疫親和捕捉バルブ機構を示す図。
【図９】免疫親和捕捉バルブ機構を示す図。
【図１０Ａ】被分析物の捕捉を示す図。
【図１０Ｂ】免疫親和捕捉のための被分析物の経路指定を示す図。
【図１１】免疫親和捕捉と統合可能なＰＣＲおよびＣＥを示す図。
【図１２】組み合わされた免疫捕捉およびＰＣＲチャンバを示す図。
【図１３Ａ】病原体検出システムを示す図。
【図１３Ｂ】微細加工の段階を示す図。
【図１４】放射状配列の病原体検出システムを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ここで、本発明を実施するために発明者が考慮した最良の実施形態を含む本発明のいくつかの具体的な実施形態について説明する。これら具体的な実施形態の例は、添付の図面に示されている。本発明は、これら具体的な実施形態に関連して説明されているが、説明されている実施形態に本発明を限定する意図はない。逆に、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の趣旨および範囲に含まれうる代替物、変形物、および等価物を網羅するよう意図されている。例えば、本発明の技術は、ガラス製の微小流体デバイスに関連して説明されているが、プラスチック製のデバイスなど、他のデバイスを用いることも可能である。
【００１０】
ガラス製の微小流体デバイスの利用に適した流体制御構造は、様々な微小流体デバイスに適用可能であることに注意されたい。流体制御構造が役立つ用途の好例としては、病原体検出システムが挙げられる。以下の説明では、本発明の完全な理解を促すために、数多くの具体的な詳細事項が記載されている。本発明は、これら具体的な詳細事項の一部あるいはすべてがなくとも実施可能である。また、本発明を不必要にわかりにくくすることを避けるために、周知の処理動作については、説明を省略した。
【００１１】
微小流体分析技術の分野は、初期の単一チャネル分離デバイスから急速に発達してきた。一部のデバイスは、正弦標本準備および分析を１つのチップに統合した高スループットの分析および分析器のための複数チャネル分離デバイスを含む。複数チャネル分析と、統合された標本準備との両方を組み合わせたデバイスは、様々な分析を実行する際に必要な資源の量およびコストを低減することができる。その実例は、ゲノム学の分野に見いだすことができる。すなわち、配列決定のための標本の準備、精製、電気泳動分析を統合することにより、分析時間およびコストが低減され、分析の処理効率および頑健性が増大される。すべての場合において、微小流体デバイスの高度な統合を行うには、大量の流体を分離、経路指定、合流、分割、および貯蔵するためのチップ機構の頑健性が必要になる。
【００１２】
シリコン、ガラスシリコン、ポリマ、およびエラストマの微小流体デバイスで用いられる一部のバルブ技術については、上述の要件を満たすには限界があった。しかしながら、これらの技術の多くは、多くの化学的または生化学的分析と化学的または物理学的に互換性がない。さらに、多くの技術は、ガラス製の微小流体デバイスで利用できる頑健な表面改質剤の多様性に欠けている。加えて、個々の微小流体バルブは、通例、個々の膜が通常時に開状態を保持されるように加工される。通常時に開状態のバルブを用いる場合には、流体制御を維持するために恒常的な作動を必要とする。かかるバルブを用いる微小流体デバイスは、デバイスの流体の内容物の制御を失うことなしに制御システムから取り外すことができない。さらに、一部の典型的なデバイスは、個々に配置されたラテックスの膜を用いる。個々に配置され空気圧で作動されるラテックスの膜が開発されたが、この加工方法は、複数チャネルの高スループット分析デバイスへの大規模集積の妨げとなる。
【００１３】
別の微小流体デバイスは、陽極に接着されたシリコンとガラス製のウエハとを用いて加工され、圧電によって作動される。しかしながら、シリコンの導電性および化学的な互換性から、分析デバイスでの利用が困難である。シリコンに接着または蒸着された薄膜によって、導電性および化学的な互換性を部分的に軽減できるに過ぎない。
【００１４】
エラストマ製のデバイスについても説明する。しかしながら、エラストマ材料の疎水性および多孔性により、エラストマ製のデバイスは、多くの化学的または生化学的分析と互換性がない。したがって、エラストマの表面との流体の接触を最小限にすることが望まれる。複雑な加工、化学的な互換性、信頼性のない流体操作などの問題から、既存の流体操作技術は、大規模かつ高スループットのラボオンチップ・デバイスへの組み込みには不十分である。
【００１５】
したがって、本発明の技術および機構は、微小流体デバイスへの高密度集積に適したモノリシック膜バルブ構造を提供する。また、モノリシック膜バルブ構造に基づく様々な流体制御構造も提供されている。
【００１６】
モノリシック膜を有する微小流体デバイスは、１つのチップに病原体検出システムを実装するのに特に適したデバイスの一例である。様々な実施形態によると、病原体検出システムは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびキャピラリ電気泳動（ＣＥ）機構など、免疫捕捉およびＤＮＡ分析機構を含む。一例では、病原体検出システムは、様々な流体制御構造を有するガラス製の微小流体デバイスに実装されてよい。
【００１７】
図１Ａないし１Ｅは、ガラス製の微小流体デバイスに実装可能なモノリシック膜バルブを示す図である。図１Ａは、モノリシック膜バルブを示す上面図である。図１Ｂは、バルブを有する３層デバイスを示す側面図である。図１Ｃは、バルブを有する４層デバイスを示す側面図である。図１Ｄは、３層デバイスの開バルブを示す側面図である。図１Ｅは、開バルブの４層デバイスを示す側面図である。図１Ａおよび１Ｂに示した様々な実施形態によると、３層ガラス製微小流体デバイスは、２つのガラスウエハ１０１と１０５の間に挟まれたエラストマ膜１１１を備える。一例では、エラストマ膜は、イリノイ州エルクグローブのＢｉｓｃｏ Ｓｉｌｉｃｏｎｓから２５４μｍ厚のＨＴ−６１３５およびＨＴ−６２４０膜として入手可能なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の膜である。他の柔軟な膜を用いることも可能である。エラストマ膜１１１は、ウエハの間に可逆的であるが強固な接着を提供する。
【００１８】
接着の前に、流体を運ぶための流体チャネル１０３が、ウエハ内にエッチングされる。同様に、加圧下または真空下で空気またはその他の作用流体を運んでバルブを作動させるためのマニホルドチャネル１０７およびバルブ領域１０９がエッチングされる。通例、空気チャネル１０７および１０９は、一方のウエハ１０５（以後、空気ウエハと呼ぶ）に配置され、流体チャネルは、第２のウエハ１０１（以後、流体ウエハと呼ぶ）にエッチングされる。これらのエッチングされたチャネル形状は、膜に対して直接的に接触して、図１Ｂに示すような複合型のガラス／エラストマチャネルを形成することができる。
【００１９】
あるいは、膜は、図１Ｃの４層デバイス１５０に示すように、熱接着された完全ガラス製の流体ウエハサンドイッチ構造（ＸＹ）と、空気ウエハ１５９との間に配置されてもよい。完全ガラス製のチャネルを有することにより、ガラスの持つ好ましい物理的および化学的特性が、デバイスに役立つ。好ましい物理的および化学的特性を有する任意の層を、化学的に不活性な層と呼ぶこととする。化学的に不活性な層は、ＸＹの加工に用いられてよい。一例では、ＸＹを構成する１５１および１５５のサンドイッチ構造は、ガラスから形成される。
【００２０】
４層デバイスの一例は、ビアウエハ１５５に熱接着された流体ウエハ１５１を備える。直径の小さいビアホールが、流体チャネル１５３内の断絶部分に配置される。エラストマ膜１５７は、流体／ビアウエハのサンドイッチ構造ＸＺのビアウエハ１５５側に貼り付けられる。バルブたわみチャンバ１６１が、マニホルドウエハ１５９にエッチングされて、膜１５７に接着され、４層デバイス１５０が完成される。このように、流体チャネル１５３は、完全ガラス製の化学的に好ましい構成を保持すると共に、大規模集積の流体制御構造の実装を可能にする。一部の実施形態では、図１Ｃに示された４層デバイスは、標本とエラストマ膜との接触を最小限に抑えることから、３層デバイスを大幅に超える利点を提供する。
【００２１】
様々な実施形態によると、モノリシック膜デバイス内の様々な流体制御構成要素は、空気ウエハの穴に圧力または真空を作用させることにより作動される。本明細書では、任意の単一の膜を、モノリシック膜と呼ぶこととする。また、本明細書では、モノリシック膜を備える任意の単一のデバイスを、モノリシックデバイスと呼ぶこととする。本明細書では、空気ウエハに関連するエッチングされたチャネルに圧力または真空を供給するための機構を、ポートまたは空気ポートと呼ぶこととする。３層デバイスでは、空気ウエハにエッチングされたチャネルは、エラストマ膜１１１のバルブ領域１０９に作動真空を分配する。図１Ｄに示すように、マニホルドチャネルを通してバルブ領域１０９に真空を作用させると、チャネル断絶部分から遠ざかるように膜が引っ張られて、断絶部分を流れる流路が提供され、バルブが開放される。本明細書では、空気圧を用いて開閉できるバルブを、開閉可能なバルブまたは空気開閉可能なバルブと呼ぶこととする。
【００２２】
空気圧を作用させる工程は、圧力を作用させる工程と、真空を作用させる工程の両方を含む。したがって、膜１５７は、図１Ｄに示すように、隣接する流体チャネル内の流体の流れを調節することができる。図１Ｄにおいては、空気ウエハ１０５に関連するエッチングされたチャネルを通してバルブ領域１０９に真空が作用されて、流体チャネル１０３が開放されている。真空の圧力すなわち吸引力が、バルブ領域１０９に作用されなくなると、膜１１１は、図１Ｂに示すように、流体チャネル１０３を閉じる。図１Ｅは、４層デバイスを示している。４層デバイスは、チャネル層１５１と、チャネル１５３と、ビア層１５５と、膜層１５７と、空気層１５９とを備える。上述のように、４層デバイスは、一部の場合においては標本とエラストマ膜との接触をバルブ領域１６１のみに限定することから、３層デバイスを大幅に超える利点を提供する。
【００２３】
図に示した構造は、任意の方向に配置されてよいことに注意されたい。一部の例では、バルブが、デバイスに関して反転されてもよい。空気層は、流体層の上側に配置されても下側に配置されてもよい。重力が、膜バルブに悪影響を与えないことから、本発明の技術は、様々な方向の配置を許容する。
【００２４】
流体制御構造は、様々な利点を提供する。例えば、モノリシック膜バルブは、通常時には閉バルブであり、それは、デバイスが作動圧力源から取り外された際にもバルブが閉状態を保つことを意味する。通常時に開状態となる既存の微小流体バルブは、デバイスの流体内容物の制御を維持するために恒常的な作動を必要とする。さらに、形状記憶合金の構造と違って、バルブ構造の開閉温度が両方とも常温であるため、水を含む生体液での作業が容易になる。
【００２５】
多くの典型的な実施例では、様々な流体制御機構を操作するために、微小流体デバイス間のインターフェースが数多く必要になる。しかしながら、本発明の様々な実施形態によると、膜における複数領域の空気制御チャネルを結合することによって、それら複数領域を並列に作動させることもできる。一例では、単一の空気ポートを用いて、一連のバルブを制御することができる。したがって、限られた数の外部インターフェースすなわち空気ポートを用いて、かなりの数のバルブを制御することができる。これにより、実装が簡単になり、デバイスとの接続の際の問題が最小限に抑えられる。様々な実施形態によると、このようにバルブを制御することにより、デバイス内のバルブ、ポンプ、貯蔵容器、ルータ、およびその他の流体制御構造を動作させるためのモノリシック膜の大規模並列の空気作動が可能になる。
【００２６】
膜バルブは、様々な流体制御機構の形成に用いられてよい。図２Ａおよび２Ｂは、膜バルブを用いて形成されたポンプを示す図である。図２Ａおよび２Ｂに示された様々な実施形態によると、直列に配置された３つのバルブが、ダイヤフラムポンプ２１０を形成している。５工程のサイクルに従ってバルブを作動させることにより、ポンプ動作が実現される。図２Ａは、３層モノリシック膜ダイヤフラムポンプを示す上面図である。図２Ｂは、３層モノリシック膜ダイヤフラムポンプを示す側面図である。ダイヤフラムポンプは、入力バルブ２０１と、ダイヤフラムバルブ２０３と、出力バルブ２０５とを備える。ダイヤフラムポンプは両方向に動作可能であるため、入力バルブおよび出力バルブの指定は任意であることに注意されたい。ポンプは、エッチングされた流体チャネル２１１と、モノリシック膜２０７と、マニホルド層２１３とを有する流体層２０９を備える。バルブが有する気密性により、ポンプは、自吸式となるため、他の気体および流体に加えて空気にもポンプ動作を行うことができる。
【００２７】
様々な実施形態によると、一連の段階で、ポンプ動作を実行することができる。第１の段階では、出力バルブ２０５が閉じられると共に、入力バルブ２０１が開かれる。第２の段階では、ダイヤフラムバルブ２０３が開かれる。第３の段階では、入力バルブ２０１が閉じられる。第４の段階では、出力バルブ２０５が開かれる。第５の段階では、ダイヤフラムバルブ２０３が閉じられ、開かれた出力バルブ２０５を通して被分析流体が送出される。
【００２８】
１サイクル当たりのポンプの送出量は、開かれたダイヤフラムバルブ内に含まれる量、すなわち、ダイヤフラムバルブ内の空気チャンバのサイズによって決まる量によって決定される。したがって、ダイヤフラムバルブの空気チャンバのサイズを調節することにより、既知のナノリットルからマイクロリットルの尺度の量の流体を測定するために設計されたポンプを加工することができる。ダイヤフラムポンプは、自吸式であり、作動周期を逆転することにより順方向と逆方向に流体を送ることができる。また、膜がガラスシーリング面に接触するバルブ台は、膜とガラス面との接着を制御するための尾根またはその他の表面構造を有するようエッチングされてよいことに注意されたい。
【００２９】
モノリシックバルブは、ルータ、合流手段、および分割手段を形成するために用いられてもよい。以下の構造は、３層構造に関して説明されているが、４以上の層を用いて実施してもよいことに注意されたい。図３は、ルータ３００を示す図である。ルータは、バルブ３０１、３０３、３０５、および３１７と、空気チャネル３３１、３３３、３３５、３３７、および３３９と、流体チャネル３２１、３２３、３２５、および３２７と、ダイヤフラムバルブ３０９とを備える。ルータは、ポンプ動作サイクル中のどの時点でどの入力／出力バルブが作動されるかに応じて、任意の入力から任意の出力に流体を送る。２以上の入力バルブを同時に作動させることにより、いくつかの異なる流体の流れが、出力バルブにおいて１つの流れに合流される。逆に、２以上の出力バルブを同時に作動させることにより、１つの流体の流れが、出力バルブにおいていくつかの異なる流れに分割される。
【００３０】
例えば、流体をチャネル３２７からチャネル３２１に送るには、バルブ３０１および３０５が閉状態に保たれる。これで、バルブ３１７、３０９、および３０３が、上述のように、ポンプとして用いられることが可能になる。ルータは、流体チャネルを合流および分割する機能を有する。流体をチャネル３２５および３２７からチャネル３２３に合流させるには、バルブ３０３が閉状態に保たれる。流体をチャネル３２１からチャネル３２３および３２７に分割するには、バルブ３０１が閉状態に保たれる。さらに別の例では、チャネル３２７を通して導入された流体をチャネル３２５に送るために、バルブ３０３および３０５が閉状態に保たれる。バルブ３１７および３０１の開放が可能となり、チャネル３２７を通してのチャネル３２５への流体の流れが実現する。なお、様々な構成が可能である。
【００３１】
モノリシックバルブを用いて、混合ループが形成されてもよい。一例では、デバイスの２つの領域間で流体を移動させることにより、混合を実行することができる。混合は、すべての種類のオンチップ動作を実行するために用いられてよい。図４は、混合ループ４００を示す図である。混合ループは、バルブ４０１、４０３、および４０５と、流体チャネル４１１、４１３、および４１５と、空気チャネル４２１、４２３、および４２５とを備える。さらなるバルブ付きのチャネルが、ループに接続し、混合器への流体の出入りを提供している。２種類以上の流体が、チャネル４１３および４１５を通して混合ループ内に流入され、それらの流体が拡散によって混合されるまで、上述のように周期的にポンプで送られる。次いで、混合物は、混合ループからポンプで送出されてよい。また、２つの容器の間で流体を往復移動させることにより、混合を実現してもよい。
【００３２】
図５Ａないし５Ｃは、容器５００を示す図である。図５Ａは、エッチングされた移動チャンバを備えた容器を示す上面図である。図５Ｂは、容器の側面図である。図５Ｃは、満たされた容器を示す側面図である。図５Ｄは、ドリルによって形成された移動チャンバと、自律的な流入／流出のためのポンプとを備えた大容量容器を示す側面図である。容器は、流体ウエハ５１１との間に膜５０５を挟む空気ウエハ５１３に備えられている。容器は、チャネル５０１を通して満たされたり空にされたりすることが可能である。様々な実施形態によると、バルブ領域５０３内の開かれたモノリシック膜バルブは、オンチップ流体貯蔵のための容器として機能する。空気ウエハ５１３内のチャンバのサイズは、容器内に貯蔵される流体の量を決定する。容器は、真空を作用させることにより満たされ、圧力を作用させることにより空になる。
【００３３】
様々な実施形態によると、エッチングされた空気チャンバの代わりにドリルで空けられた穴を用いて、その穴に直接的に作動圧力または真空を作用させることにより、大量の流体を貯蔵するための容器を加工することができる。あるいは、容器をダイヤフラムポンプに接続することにより、直接的な空気の接続を持たない容器を加工してもよい。図５Ｄは、ポンプに接続された容器５０３を示す図である。容器は、ポンプ動作の方向によって充填または排出されるため、容量が可変であるという利点を有する。一例では、バルブ５３１、５３３、および５３５などのポンプは、容器５０３に対する流体の充填または排出のために用いられる。
【００３４】
１以上の流体入力を備えたモノリシック膜容器は、オンチップ反応炉として機能する。容器と同様に、反応炉は、空気マニホルドウエハを通して加えられる直接的な圧力または真空を用いることにより、反応物質を吸い込み、生成物を放出することができる。あるいは、反応炉は、統合されたポンプ、混合器、および／またはルータ構造を間接的に用いて、反応物質を吸い込み、生成物を放出することができる。様々な実施形態によると、反応炉の容量は、空気ウエハ内のチャンバ５０３のサイズによって規定されるため、流体ウエハの構造の配置を大きく変えることなく、任意の容量を持つ反応炉を、デバイスの任意の点に設けることが可能である。また、反応炉は、可変量の反応物質を含むオンチップ反応の必要に応じて、部分的に満たされてもよい。
【００３５】
ほとんどのエラストマ膜は、気体透過性を有し、この特性は、これまで、すべてのエラストマデバイスに対して流体の充填を簡単にするために用いられてきた。
【００３６】
様々な実施形態によると、膜の気体透過性により、気泡およびエアポケットを排除できる。作動真空をモノリシック膜反応炉またはその他の流体構造に作用させると、気体を発生する反応による気泡を排除できる。例えば、気体透過性の膜は、ＰＣＲの反応物質のオンチップ温度サイクリングの間に生成されて反応混合物の閉じこめの失敗につながりうる気泡を低減することが可能である。
【００３７】
複合微小流体デバイスは、流体バスに接続されているいくつかの独立したモジュールを備えてよい。一例では、そのデバイスは、複数の異なる流体チャネルに被分析流体を供給するのに有用である。別の例では、様々な試薬が、微小流体デバイスへ導入されてよい。図６は、被分析流体を分配するために利用可能なバスバルブ６００を示す図である。バスバルブ６００は、流体を流体バスチャネル６１１から流体チャネル６２１、６２３、６２５、および６２７に送るよう設計されたバルブ６０１、６０３、６０５、および６０７を備える。空気チャネル６３１、６３３、６３５、および６３７は、流体の分配を制御するためのバルブを管理する。典型的なバスバルブの実施例は、バス側にデッドボリュームを有する。デッドボリュームは、流体の経路指定動作の合間に完全にバスを洗浄することを困難にする。様々な実施形態によると、本発明の技術は、バス側にデッドボリュームをほとんどまたは全く持たないバスバルブを提供する。これにより、流体の経路指定動作の合間に完全にバスを洗浄することが可能になり、デバイスの動作中の異なる流体間での混合すなわち交差汚染が防止される。
【００３８】
微小流体デバイスの機構は、様々な技術を用いて加工されてよい。様々な実施形態によると、チャネル形状は、例えば、標準的な湿式化学エッチングを用いて、ガラスウエハにエッチングされる。ガラスウエハ（厚さ１．１ｍｍ、直径１００ｍｍ）は、ＬＰＣＶＤ炉またはスパッタリングシステムを用いて、ピラニア洗浄され（２０：１）、犠牲（２００ｎｍ）ポリシリコンエッチングマスク層で被覆される。３層または４層設計のデバイスには、ボロフロートガラスウエハすなわちＳｃｈｏｔｔ Ｄ２６３ホウケイ酸ガラスウエハが用いられる。ポリシリコンの蒸着後、ウエハは、ポジティブフォトレジストでスピンコーティングされ、軽く焼成されて、接触式アライナでパターン化される。フォトレジストのＵＶ露出領域は、Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ現像液の中で除去される。ポリシリコンの露出領域は、ＳＦ６プラズマ内でのエッチングによって除去される。ウエハは、所望のエッチング深さに到達するまで、ＨＦ溶液（ボロフロートウエハに対しては４９％のＨＦ、Ｄ２６３ウエハに対してはＨＦ：ＨＣｌ：Ｈ２Ｏを１：１：２で混ぜた溶液）内で７μｍ／ｍｉｎで等方的にエッチングされる。
【００３９】
様々な実施形態によると、流体チャネルウエハは、３層デバイスについては２０μｍの深さ、４層デバイスについては４０μｍの深さまでエッチングされる。マニホルドウエハは、３層デバイスについては７０μｍの深さまでエッチングされ、４層デバイスについてはバルブ位置にドリルで穴を空けられる。次いで、残りのフォトレジストおよびポリシリコンは、それぞれＰＲＳ−３０００およびＳＦプラズマによって、ウエハから剥離される。流体およびマニホルドウエハを貫くアクセス穴がドリルによって空けられ、ウエハは、再びピラニア洗浄される。
【００４０】
一部の例では、３層設計を用いるデバイスは、ドリルまたはエッチングによって形成された移動チャンバが、バルブ台からＰＤＭＳ膜を隔てて、どの方向に配置された場合でも、流体チャネルウエハ内のエッチングされた形状の上にＰＤＭＳ膜（２５４μｍ厚ＨＴ−６１３５およびＨＴ−６２４０、イリノイ州エルクグローブのＢｉｓｃｏ Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）を貼り付け、バルブと共にマニホルド複合ガラス−ＰＤＭＳ流体チャネルを圧迫することにより、組み立てられる。４層設計を用いるデバイスは、まず、一対の直径２５４μｍのドリルによるビアホールをチャネルのギャップの位置に対応するよう位置決めした状態で、流体チャネルウエハを２１０μｍ厚Ｄ２６３ビアウエハに熱接着することにより組み立てられる。流体チャネルおよびビアウエハは、真空炉（カリフォルニア州ユカイパのＪ．Ｍ．Ｎｅｙ）内で３．５時間５７０℃で加熱することにより接着される。それにより形成された完全ガラス製のチャネルを含む２層構造は、次に、ＰＤＭＳ膜およびマニホルドウエハに接着される。このように形成されたガラス−ＰＤＭＳ間の接着は、可逆的であるが、デバイスに与えられる範囲の真空および圧力に耐えるほど十分に強い。必要に応じて、組み立ての前にＵＶオゾンクリーナ（カリフォルニア州アービンのＪｅｌｉｇｈｔ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．）でマニホルドウエハおよびＰＤＭＳ膜を洗浄することにより、不可逆的なガラス−ＰＤＭＳ間の接着が得られる。
【００４１】
上述の微小流体デバイスの機構は、様々なデバイスの実施に用いることができる。バルブおよびポンプを備える特徴は、標本の準備および分析の工程を１つのデバイスに統合できる複数チャネルのラボオンチップ機器を提供するために柔軟に構成されることが可能である。微小流体プラットフォームは、特に、統合病原体検出システムを実施できる単一のデバイスとして適切である。
【００４２】
従来の高速病原体検出システムは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）を利用した検出を用いる。通例、検出は、分析される特定の抗体の固定化、標本溶液での培養、現像および検出の前の酵素または蛍光プローブに結合したサンドイッチ抗体での認識を含む。免疫蛍光検出法も用いられる。しかしながら、これらの検査の各々に関する制限は、比較的厳しい。
【００４３】
ＰＣＲを利用した遺伝子検出および同定の様々なフォーマットも、高い特異性と増幅率のために一般的に利用されている。しかしながら、ＤＮＡを利用したＰＣＲの方法は強力ではあるが、生存および非生存の病原体の両方に陽性の反応をすることから、偽陽性を引き起こす場合がある。そのため、急速に分解する性質のため、検出の際に生きたターゲットが必要なことから、ＲＮＡターゲットの検出が好まれる場合がある。
【００４４】
様々な別の検出方法も提案されている。質量分析法は、中性脂質、極性脂質、および胞子に特有のバイオマーカの検出によって病原体、胞子、およびその他の生体を検出するために開発された。しかしながら、質量分析法の速度、スループット、および可搬性は明白ではなく、特異性は実証されていない。
【００４５】
例えば、土壌、空気などからの炭疽菌のような胞子の検出は、感染性が高い（１０胞子／Ｌで１０分の場合、１０，０００胞子の空気感染量が起こりうる）ため困難である。最も進んだ検出の概念は、薄膜ヒータを備えたシリコンの微小反応炉内で実行されるＰＣＲ生成物のリアルタイム検出と、統合された蛍光励起および検出とを用いる。このシステムは、後に、１０チャネルの先進核酸分析器（ＡＮＡＡ）と、携帯型とに拡張された。このシステムのバージョンは、軍事用や郵便局用も開発されている。リアルタイムＰＣＲ分析のために統合された（複数マイクロリットルの）標本処理を備えたＧｅｎｅＸｐｅｒｔ標本準備システムも開発されている。
【００４６】
自動化された複雑な最前線の化学反応の実行と、病原体濃度および抗生物質に対する耐性の定量化を迅速に実行する携帯型分析が開発されれば、大きな前進になるだろう。同様に、高スループットで非常に低い偽陽性で高速に多数の標本を検出および同定する（すなわち、複数標本をスクリーニングする用途での）能力も、多数の標本または感染の可能性のある個体がスクリーニングされる必要のある場合に有用であり、すなわち、自動臨床分析器への前進となった。一例では、基本的に一般の自動分析器の小型版である血液臨床分析用の複雑な微小流体回路システムが開発された。マイクロアレイでのＨＩＶ分析用の血液からの標本を準備するために用いられる完全統合分析器（マイクロリットルの尺度）も開発された。このシステムは、多数の核酸の工程を含む複雑な分析を実行し、以下で詳述する＞１００ｎＬデッドボリュームの空気膜バルブを用いるものであった。
【００４７】
単純な圧力除去システムで流体を制御して、小型携帯システムでの免疫検査の性能を向上させる６つの異なる免疫検査センサにわたって溶液の流れを制御するためのルーサイト製の微小流体キューブが開発された。このフォーマットは、統合フローシステムと光ファイバ製のバイオセンサキャピラリとを用いて、１０分の動作で４つの異なる物質を分析するＲａｐｔｏｒ携帯型分析器として開発された。アドレス可能なアレイという独特の特徴が認識され、自動化された電界駆動免疫捕捉およびＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ解析を実行する統合型の積層微小ラボラトリが開発された。例えば、免疫捕捉に続いて、細菌は、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）のために放出され、次いで、増幅された志賀様毒素遺伝子のハイブリダイゼーション分析が実行される。しかしながら、多重標本分析は実行されず、検出の制限は研究されていない。
【００４８】
従来の微細加工はシリコンでなされるが、化学および生化学の分析では、ガラス製の微小流体構造が、好ましい化学的および電気泳動の特性を示すことがわかっており、プラスチック構造への拡張が進んでいる。高スループットの用途では、本発明の技術は、９６から３８４断片のサイズ決定または配列決定用の分離物の高速な並列分析を可能にする放射状のチャネル配置を提供する。ＰＣＲとＣＥ分析とを１つのチップに直接的に統合すると、酵素によるＤＮＡの分解と親和捕捉とが提供される。
【００４９】
様々な実施形態によると、本発明の微小流体デバイス機構は、チャンバ、バルブ、ＣＥ分析チャネルの複雑な配列の形成を可能にする複雑なチャネル構造の形成を実現する。これらのＣＥチャネルのサイズの小ささと、交差した注入器の利用により、非常に高速で高解像度の電気泳動分離の性能が実現される。クロマトグラフのカラムまたはキャピラリで実行されていたほぼすべての動作が、１つのチップのフォーマットに組み込まれることで、必要な標本量が低減されると共に分析時間および感度が改善される。
【００５０】
様々な実施形態によると、本発明の病原体検出システムは、感度と共に特異性および定量化の属性を有するため、特に有用な分析を提供する。多くの病原体は、＞１０3の細菌の摂取で感染するが、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａは、１０5未満が経口で摂取されても症状を引き起こさず、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓについては、はるかに低いレベルで影響があると考えられている。脅威となるものを同定して処置を決定するためには、病原性を持つものと持たないものとを区別できるように株を同定することと、特定の毒素または抗生物質耐性遺伝子の存在を特定することが重要である。さらに、細菌の濃度または分量を決定して、同定すると共にこれを量的に報告する能力は、背後の課題と重要な課題とを区別する。
【００５１】
図７は、病原体検出システム７００の一例を示す図である。被分析物は、チャネル７０１を通して免疫親和捕捉チャンバ７０３、７１３、および７２３に導入され、チャネル７３１で廃棄物が収集される。様々な実施形態によると、入力された細菌の混合物を捕捉、濃縮、および階層化して、一連の別個の免疫チャンバ７０３、７１３、および７２３に導入するために、免疫親和試薬が用いられる。この簡単なプロセスは、病原体検出を追跡する微小流体システムの用途での障害となっていた重要なマクロからマイクロへのインターフェースに対処するものである。免疫捕捉の第１段階は、分析の特異性を増大させるのに大きな役割を果たす。感度の増大を実現するために、次に、病原体検出システムのユーザは、ＰＣＲを用いて物質の存在の冗長な確認を行い、さらに、特定のプライマに基づく方法またはＰＣＲなどのより一般的な遺伝子型特定方法を開発して、ＤＮＡ分析機構７０５、７１５、および７２５により、特定の株、毒素遺伝子の存在、および抗生物質耐性マーカを特定する。一例では、ＤＮＡ分析機構７０５、７１５、および７２５は、ＰＣＲおよびＣＥを含む。
【００５２】
様々な実施形態によると、免疫親和捕捉チャンバ７０３、７１３、および７２３は、ＰＣＲチャンバと統合されるが、ＣＥ機構は別個のままである。免疫捕捉および核酸分析を組み合わせると、個々の分析の感度および特異性が劇的に向上される。
【００５３】
病原性を持つものと持たないものとを遺伝的に区別する能力は、多くの用途で重要である。前工程としての免疫捕捉とＰＣＲ分析とを組み合わせると、入力された細菌のポピュレーションに対して有効な精製が実現されるため、不純で複雑な「実世界の」標本でしばしば見られるＰＣＲ阻害物の存在に関する不安に対処できる。様々な実施形態によると、病原体検出システムは、入力されたターゲットポピュレーションの定量化が維持および報告されるように、低サイクル数の（漸近的ではない）レジメでＰＣＲを実行するよう設定される。多くの例で、次に、処理された標本に対してＣＥ分析を施すことができる。現代の微小流体技術を利用することで、小さい携帯型で、動作に必要な電力、資源、および技量が最小限の安価、高速、および頑丈な分析システムが提供される。
【００５４】
病原体分析器には、統合された免疫親和捕捉チャンバが備えられている。フリット、ビーズ、ゲル、モノリス、およびポリマなど、様々な捕捉機構を用いることができる。図８および９は、シリカのフリットまたはビーズを用いて実装された免疫捕捉チャンバを示す図である。様々な実施形態によると、免疫捕捉チャンバは、シリカの粉末とケイ酸ナトリウムの結合剤との混合物でウエハの穴を満たすことにより加工された一連のシリカフリットを備える。脱水および洗浄されると、ケイ酸塩がシリカゲルに濃縮され、不溶性のシリカフリットが、８０１、８０３、８０５、および８０７において形成される。
【００５５】
様々な実施形態によると、１．１ｍｍの厚さのガラスウエハに形成された各シリカフリットは、１ｍｍの直径を有する。免疫捕捉チャンバは、被分析物を導入および排出するためにチャネル８２１と結合されている。ウエハ内のフリットは、膜８１１および８１３とバルブとポンプ構造とを含むデバイス内に、容易に統合されることが可能である。図８において、４つのシリカフリット８０１、８０３、８０５、および８０７は、膜８１１および８１３によってシーリングされている。各フリットの大きいシリカ表面は、様々な有機シラン試薬による化学的な誘導体化に適切である。デバイスの加工をさらに簡単にするために、モノリスウエハは、ＰＤＭＳとデバイスの残り部分との非加熱的な接着の前に、化学的に誘導体化されてもよい。
【００５６】
一例では、１．５μｍのフリットまたはビーズのような機構が、捕捉チャンバ内に設けられることにより、胞子および細菌などの多くのマクロ種の捕捉が可能になる。多くのマクロ種の固相捕捉は、当業者に周知であり、Ｗｅｉｍｅｒ，Ｂ．Ｃ．、Ｍ．Ｋ．Ｗａｌｓｈ、Ｃ．Ｂｅｅｒ、Ｒ．Ｋｏｋａ、およびＸ．Ｗａｎｇの２００１、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｐｏｒｅｓ， ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６７：１３００−１３０７でよく特徴付けられている。一部の例では、補足にビーズ試薬を用いるために、チャンバは、ビーズ止めを提供するための堰構造とビーズ導入チャネルとを備えるよう変形される。動電学的なビーズベッド包装や堰ビーズ捕獲が、当業者に周知である。あるいは、免疫機能を持たせた磁性ビーズが、堰を設けずにチャンバ内に導入されてもよい。
【００５７】
図９は、モノリスがシーリングされていない状態の開バルブを示す図である。様々な実施形態によると、領域９０１、９０３、９０５、９０７、および９０９において減圧がなされると、チャネル９２１に沿ってフリット９３１、９３３、９３５、および９３７を通して、被分析物が流れることが可能になる。加工されるデバイスには、任意の数のフリットが備えられてよい。
【００５８】
図１０Ａは、被分析物の補足を示す図である。様々な実施形態によると、一連の免疫捕捉チャンバを通して、オリゴヌクレオチド、タンパク質、細胞などを含む被分析溶液を送るために、３つの膜バルブ１００１、１００３、および１００５を備えるポンプ１０００が用いられる。
【００５９】
チャンバは、対象となるターゲットを補足するために様々な機構を用いることができる。免疫捕捉チャンバで捕捉されるよう構成された任意の対象物を、本明細書ではターゲットと呼ぶこととする。ターゲットを運ぶ流体または物質については、本明細書では被分析物と呼ぶこととする。一例では、ターゲットは、被分析流体に運ばれるサルモネラ菌またはリステリア菌である。
【００６０】
他の例では、各捕捉チャンバは、ターゲット分子を選択的に捕らえるために、オリゴヌクレオチドプローブを含む粘性ポリママトリクスで満たされる。ＤＮＡ分析の場合には、プライマや高塩分濃度のポリメラーゼ試薬を含むサンガー法のＤＮＡ配列決定の伸張産物が、電子対を共有するオリゴヌクレオチドプローブを含む固定されたアクリルアミドマトリクスを含む免疫捕捉チャンバを通して電気泳動される。捕捉体の配列は、ＤＮＡ増幅産物のみがプローブによって補足されて、プライマおよびポリメラーゼ試薬は、塩と共にデバイスを通り抜けるように選択される。これは、注意深い分析という点で直面する複雑で汚れた混合物からターゲットの分子を精製する必要性と異なるものではない。
【００６１】
機能化されたポリマ捕捉マトリクスを備えた微小捕捉チャンバの準備のための別の方法は、１０−２０μｍの範囲の孔を有するモノリスの準備と、機能ポリマの薄い架橋された層によって改質された大きい微細加工素子（約１００μｍ）表面を有するチャンバの準備とを含む。この方法は、ビーズを捕捉チャンバ内にパッキングすることが時に困難であることと、通常の動作に対するビーズベッドの機械的な安定性がしばしば不十分であることから有用である。様々な実施形態によると、多孔質（１０−２０μｍ）の表面で機能化されたポリマモノリスの成型ブロックは、モノマと多孔化剤とを含む前駆体混合物の光重合によって、捕捉チャンバ内に直接形成される。
【００６２】
重合プロセスはＵＶ光を用いて実現されるので、多孔質のポリマは、フォトリソグラフィを用いて微小流体デバイスの任意の所望の領域に形成可能である。前駆体混合物で満たされたガラスチップを用いるこのような「微小リソグラフィック」重合プロセスの動力学については、Ｙｕ，Ｃ．、Ｆ．Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２０００、「Ｔｏｗａｒｄｓ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ Ｍｏｌｄｅｄ ｐｏｒｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｏｎｏｌｉｔｈｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ｂｙ ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２１：１２０−１２７、および、Ｙｕ，Ｃ．、Ｍ．Ｘｕ、Ｆ．Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２００２、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｏｕｓ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｔｏｉｎｉｔａｔｅｄ ｆｒｅｅ ｒａｄｉａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｊ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、４０：７５５、に示されているように、すでに特徴付けられ、当業者に周知である。同様に、デバイスにおけるモノリシック材料の正確な位置や、その表面の化学的性質は、Ｒｏｈｒ，Ｔ．Ｃ、Ｃ．Ｙｕ、Ｈ．Ｍ．Ｄａｖｅｙ、Ｆ． Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２００１、「Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｘｅｒｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：３９５９、に示されている通り、当業者に周知のように、制御可能である。モノリシックポリマの多孔質の特性の制御は、多孔化剤の組成を調整することによって実現可能である。
【００６３】
微細加工された素子を有するモノリスもしくは表面のいずれが用いられる場合でも、所望の結合素子を導入するために、同一の接合方法を用いることができる。目標は、これらのモノリスの多孔の表面に抗体を固定することなので、接合される化学物質は、容易にバイオポリマと反応するように指定される。一例では、表面の接合体に組み込まれた２−ビニル−４、４−ジメチルアズラクトンの単位は、迅速にタンパク質と反応できる。かかる機構は、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．、Ｔ．Ｒｏｈｒ、Ｆ．Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２００２、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ ｐｒｏｔｅｉｎ： Ｍａｐｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｐｏｒｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｏｎｏｌｉｔｈｓ ｍｏｌｄｅｄ ｉｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７４：４０８１：４０８８、に示すように、当業者に周知である。改質すべき表面（多孔質のモノリス、または微細加工素子）は、モノマ溶液に浸されることが可能であり、デバイスは、事前に選択された領域での接合を実現するためにＵＶ光を照射されることが可能である。表面の機能化の程度は、反応溶液におけるモノマの濃度、ＵＶ光の照射時間および強度によって制御される。
【００６４】
別の実施形態では、２−ビニル−４、４−ジメチルアズラクトン、エチレンジメタクリレート、およびアクリルアミドまたは２−ヒドロキシエチルメタクリレートからなる多孔質のポリマモノリスに、トリプシンが固定される。アズラクトンの機能は、酵素のアミンまたはチオール基と容易に反応し、安定した共有結合を形成する。一部の例では、モノリスの多孔質の特性が最適化されると、背圧が非常に低くなり、単純な機械的なポンプ動作を利用して、溶液からの酵素の固定と、基質溶液の次の分析との両方を実行することが可能になる。反応炉のミカエリス・メンテン動力学特性は、Ｎ−ａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルなど、低分子量の基質を用いて調べることができる。
【００６５】
溶液中のトリプシンの濃度やモノリスにおけるアズラクトンの機能の割合など、固定動作の変量の影響、酵素活性への反応時間の影響、および、反応炉内での基質の流速や滞留時間など、プロセス変量の影響が、詳細に研究された。オンチップの酵素微小反応炉のタンパク質分解作用は、基質として用いられる蛍光標識されたカゼインの分解に関して、様々な流速で示された。また、モノリシック微小反応炉の優れた性能は、０．５μＬ／分の速い流速（すなわち、わずか１１．７秒の滞留時間）でのミオグロビンの消化によっても示された。次いで、消化産物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて特徴付けられ、可能性のある１５３のペプチド断片の内の１０２が同定されたため、配列決定の可能範囲は６７％となった。
【００６６】
微小総合分析システム（Ｐｔａｓ）を創出するために、新しい微細加工分析デバイスの開発および統合に多大な努力が注がれてきた。これらのシステムは、フルサイズの設備に比べて、スループットの増大、サンプルおよび試薬の消費量の低下、小型化、および動作コストの低減を実現する。微小流体デバイスの様々な用途の中では、電気泳動、電気クロマトグラフィ、酵素を用いた分析、および免疫分析などの分析技術については、このフォーマットですでに実証されている。微小流体チップ技術の疑いのない成功にも関わらず、いくつかの問題が残っている。例えば、微小流体チップの大部分は、開チャネル構造を特徴とする。したがって、これらのチャネルは、比較的小さい表面対容量の比を示す。それらは、クロマトグラフィによる分離、固相抽出、および不均一触媒作用など、固体の表面との相互作用に依存する用途において深刻な問題になりうる。所望の相互作用を提供するために利用できるのはチャネルの壁だけなので、微小デバイスが取り扱うことのできるのは、微量な化合物だけである。
【００６７】
図１０Ｂは、二次元分析システムの利用を示す図である。モノリス１０２７が、バルブ１００１、１００３、および１００５を備えたポンプによって提供されるターゲットを補足すると、モノリス１０２７はシーリングされる。一例では、次に、各チャンバが加熱され、二本鎖ＤＮＡを溶かして一本鎖ＤＮＡ生成物を送り出す。様々な実施形態によると、精製は１２０秒実行され、最初の量３μＬから、わずか２０ｎＬまで、２００倍の濃縮が実現可能である。各ライン１０１１、１０１３、１０１５、１０１７、１０１９、および１０２１は、さらなる分析工程に向けて、捕捉されたターゲットを制御またはポンプ送出するためのバルブを備える。
【００６８】
一例では、捕捉されたターゲットは、試験デバイスにおいてＰＣＲおよびＣＥ分析を施される。捕捉されたターゲットは、加熱またはｐＨの変更などの機構を用いるＤＮＡ分析を施されてもよい。かかる統合試験デバイスの基本的な特徴は、以下の通りである。１）微細加工されたヒータと温度センサとを備えるよう、ガラス基板にエッチングされた免疫捕捉チャンバ、２）対象となる細胞の溶解で得られたＤＮＡの増幅のための１００ ３００ｎＬのポリメラーゼ連鎖反応チャンバ、および、３）ＰＣＲ増幅産物の分離および検出のためにガラス基板にエッチングされたキャピラリ電気泳動用の微小チャネル。
【００６９】
必要であれば、放出された病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されたＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、随意的な４番目の構成要素、すなわち、統合ＤＮＡ事前濃縮／浄化チャンバがデバイスに追加されてもよい。分析を成功させるためにＣＥ微小チャネルに直接的にＰＣＲ増幅産物を注入して、上述のように複雑さを増す必要性を避けることが可能であると以前の研究から示されているが、質の高い電気泳動像を得るためには、かかる精製が必要になりうる。この増幅産物の精製は、オリゴヌクレオチド捕捉マトリクス薬剤を用いることにより可能になる。ゲノムＤＮＡを精製する必要がある場合には、浄化チャンバは、カルボン酸シリカビーズで満たされ、ＰＣＲの前の細菌ＤＮＡのための一般的な捕捉マトリクスとして用いられてよい。
【００７０】
統合の１つの方法は、免疫捕捉、テンプレート精製、ＰＣＲ、増幅産物の浄化、およびＣＥを、ガラスチップ上に別個のモジュールとして単に加工する方法である。次に、それらのモジュールは、微小チャネルおよび様々なＰＤＭＳバルブ構造を用いて互いに接続される。別個の免疫捕捉およびＰＣＲ反応炉を備えるよう構成された病原体分析チップの図が、図１１に示されている。統合された病原体検出システムは、免疫親和捕捉チャンバ１１０１を備える。検体が、免疫捕捉チャンバ１１０１を通して病原体検出システム内に導入される。ＰＣＲチャンバ１１０３が、免疫親和捕捉チャンバ１１０１に接続され、免疫親和捕捉チャンバ１１０１によって捕捉されたターゲットを受け入れる。さらなる分析のために、ＰＣＲチャンバ１１０３に、ＣＥチャネル１１０５が接続される。微細加工された電極１１１３は、電位差を提供するよう動作可能である。さらに、免疫捕捉チャンバおよび／またはＰＣＲチャンバに接続されたヒータ（図示せず）が提供される。様々なバルブが、統合システムを通る被分析物の流れを制御する。様々な実施形態によると、それらのバルブは、モノリシックバルブである。
【００７１】
免疫捕捉、ＰＣＲ、ＣＥ、および浄化を、１つのデバイス上に別個のモジュールとして提供することは、妥当な方法であるが、様々な実施形態に従って促進されるＤＮＡ断片の捕捉効率、ＰＣＲ効率、および高感度の分離と検出によると、比較的複雑でないデバイスを用いることも可能であることが示唆される。免疫捕捉およびＰＣＲは、別個のチャンバで実行することも可能であるが、一例では、デバイスおよびプロセスを簡略化するために、それらを組み合わせることもできる。この例では、固体の基質と、固相の免疫捕捉試薬から、ＰＣＲを良好に実行できる。一例では、免疫標識されたビーズを用いて、ＰＣＲを実行できる。
【００７２】
図１２は、組み合わされた免疫捕捉およびＰＣＲチャンバ１２０１を示す図である。様々な実施形態によると、組み合わされたチャンバは、ナノリットルチャンバ内に加工された統合抵抗加熱機構（図示せず）と抵抗温度検出器（ＲＴＤ）１２０５とを有する。一部の例では、被分析物は、入力１２１１と膜バルブ１２２１とを通して導入される。対象となる病原体は、圧力による流れを用いてチャンバ１２０１内に固定され、廃棄物は、バルブ１２２３を通して出力１２１３において収集される。病原体が固定されると、チャンバ１２０１は、緩衝液で流され、緩やかに固着した細胞や非特異的に結合した物質が除去される。
【００７３】
ＰＣＲ緩衝液は、元々の標本注入口１２１１または別個の専用注入口を通して導入される。チャンバ１２０１内の対象となる病原体に応じて、化学的な溶解剤が、ＰＣＲ緩衝液に直接導入されることが可能である。溶解試薬および／またはＰＣＲ緩衝液の導入後、捕捉／ＰＣＲチャンバの統合ヒータ１２０３は、複数の病原体が、捕捉マトリクスから同時に放出され、薬剤の種類に応じて溶解される温度まで、標本の温度を上昇させるために用いられる。
【００７４】
最も簡単で、しばしば最も効果的な溶解方法は、加熱／冷却のサイクルを単純に繰り返す方法である。グラム陰性菌および一部の真核細胞は、比較的薄い外膜を持っており、加熱のみ、または、低濃度の化学的な溶解溶液を伴った加熱による溶解の影響を比較的受けやすい。胞子またはグラム陽性菌など、一部の場合には、ＰＣＲを妨げるほどの比較的強力な溶解剤が必要になる場合もある。例えば、一部の処理しにくいグラム陽性のブドウ球菌および連鎖球菌の株を溶解するためには、一般に、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、リソスタフィン、およびムタノリシンを別個または組み合わせて用いる必要がある。これらの場合には、別個の免疫捕捉チャンバを用いると共に、浄化／事前濃縮チャンバを追加することで、細胞の溶解後、ＰＣＲの増幅前に、ＤＮＡを途中で捕捉することが可能になる。
【００７５】
このシナリオでは、捕捉および溶解に続いて、カルボキシルビーズに吸着させることにより貯蔵するために、抽出されたＤＮＡを、電気泳動によって浄化チャンバ内に移動させることができる。精製されたＤＮＡは、熱またはイオン強度のばらつきを用いて浄化チャンバから放出され、増幅のために電気泳動的にＰＣＲチャンバ内に移動されることが可能である。溶解された細胞に由来するＤＮＡが、ＰＣＲ緩衝液を有するチャンバに供給されると、微細加工されたヒータおよび温度センサを用いて、放出された遺伝物質に対して、直接的にＰＣＲを実行することができる。
【００７６】
一部の場合では、捕捉およびＰＣＲために単一のチャンバを併用することは、複雑さやＰＣＲの妨害となるために問題があることに注意されたい。これら特定の場合には、２つの段階を簡単に分離することができる。一部の例では、これは、捕捉マトリクスすなわちビーズの存在がＰＣＲ反応を妨害する場合、または、入力された標本が、洗浄または中和のできないＰＣＲの阻害物をもたらす場合に実行されてよい。この場合、放出されたＤＮＡは、捕捉チャンバ内の溶解された細菌から、分析のための別個のＰＣＲ反応炉に、ポンプまたは電気泳動によって送られてよい。
【００７７】
ＰＣＲが完了すると、分離マトリクス内の挿入色素または蛍光標識されたプライマと、所望の解像度に応じた変性分離マトリクスとを用いて、分離および検出するために、直接的にＣＥ微小チャネルに増幅産物を注入できる。一部の場合には、ＣＥ微小チャネルに注入する前に、増幅されたＤＮＡを脱塩および濃縮するために、ＤＮＡ浄化チャンバが導入される。浄化は、増幅されたＤＮＡを電気泳動によって浄化チャンバ内に移動させ、そこで、カルボキシル化されたビーズまたはオリゴヌクレオチド捕捉マトリクス（所望のターゲットと相補的な捕捉用のオリゴ）に結合させることにより実現される。結合後には、洗浄と、微小ヒータによる温度依存の放出とが続き、次いで、分離および検出のために、ＣＥ微小チャネルの注入クロスを通して、濃縮および脱塩されたＰＣＲ増幅産物の電気泳動が実行される。
【００７８】
モノリシック膜バルブを用いて病原体検出および分析システムを構築するためのデバイス構成は、大幅に変更されてもよい。図１３Ａは、病原体検出および分析システムのための設計の一例を示す図である。その設計は、チャネル層１３０３と、ビア層１３０５と、マニホルド層１３０９とを含む３つのガラス層を備える。ビア層１３０５とマニホルド層１３０９との間には、ＰＤＭＳ膜層が設けられる。マニホルド層１３０９は、膜１３０７に真空圧を作用させて、バルブ機構の制御を実現する機構を備える。
【００７９】
層１３０１には、電気的な接続が提供され、層１３１１には、マニホルドチャック層が備えられる。チャネル層１３０３は、免疫捕捉／ＰＣＲ／浄化チャンバおよびＣＥ微小チャネルと、ウエハの上面のヒータとを備える。様々な実施形態によると、チャネル層１３０３は、バルブのビアとして機能するドリルで空けられたガラスの穴を含む薄いガラスウエハ１３０５に熱接着される。ＰＤＭＳバルブ／ポンプ膜１３０７は、この複数の層の積層体に対して、可逆的または不可逆的に接着される。底面をエッチングされたマニホルド層１３０９は、真空または圧力を、デバイス上のバルブおよびポンプに伝える。
【００８０】
既存の薄膜技術を用いて、温度制御素子を形成することで、試験デバイスを構築するための実行可能な第１の方法を提供できる。しかしながら、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）のヒータを用いることにより、デバイスの加工の複雑さを低減できる。ＩＴＯヒータは、低い抵抗率、光透過性、およびガラス物質との適合性に定評がある。これらのヒータは、温度センサと同じウエハ上に蒸着されることが可能であるため、ヒータを形成するための背面の加工や電気メッキの必要性がなくなる。ヒータは、最適な熱伝導のためにチャンバ内に直接配置されてもよいし、ガラスウエハを介して熱エネルギを伝えるためにチャンバに向かって配置されてもよい。ＩＴＯの光透過性は、標本またはＰＣＲ増幅産物の視覚化または検出を妨害することなしに、流体微小チャネルの上に電気ヒータのリード線を引くことを可能にする。
【００８１】
図１３Ｂは、様々な実施形態に従って、微細加工プロセスを示す図である。図の１３８１および１３８３に、微細加工プロセスが示されている。一部の例では、カリフォルニア州サンノゼのＵＨＶ Ｓｐｕｔｔｅｉｎｇから入手可能なＤＣマグネトロンスパッタリングによって片面に２０００Åのアモルファスシリコン層をスパッタ蒸着する前に、ガラスウエハ（ニューヨーク州ヨンカーズのＳｃｈｏｔｔから入手可能な５５０μｍ厚のＤ２６３）を洗浄する。マサチューセッツ州マールボロのＳｈｉｐｌｅｙ １８１８から入手可能なフォトレジストがスピンコーティングされて、バーモント州ウォーターベリーセンターのＫａｒｌ Ｓｕｓｓから入手可能な接触式アライナを用いてフォトリソグラフィでパターン化され、下層のシリコンエッチングマスクは、フロリダ州セントピーターズバーグのＰｌａｓｍａ Ｔｈｅｒｍから入手可能な平行板反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）システム内でＳＦ６を用いて選択的に除去される。
【００８２】
一部の例では、流体チャネル、電気泳動チャネル、およびＰＣＲチャンバが、４９％のフッ化水素酸の中で３６μｍの深さまでエッチングされる。容器アクセス穴（直径１．５ｍｍ）と、ＰＤＭＳバルブ用の流体ビアホール（直径０．０２”）が、カリフォルニア州メンロパークのＦｌａｓｈｃｕｔ ＣＮＣから入手可能なＣＮＣミル（先端がダイヤモンドになったドリル用ビットを備える）を用いて空けられる。次いで、ウエハは、ウエハダイシング装置を用いてダイシングされ、２つの２０ｍｍ×７５ｍｍのスライドが形成される。
【００８３】
ＲＴＤおよび電極を形成するために、最初に、２００ÅのＴｉおよび２０００ÅのＰｔ（ＵＨＶ）で、５５０μｍ厚のＤ２６３ウエハをスパッタコーティングすることができる。マサチューセッツ州マールボロのＳｈｉｐｌｅｙ（ＳＪＲ５７４０）から入手可能な厚いフォトレジストがスピンコーティングされ、バーモント州ウォーターベリーセンターのＫａｒｌ Ｓｕｓｓから入手可能な接触式アライナを用いてパターン化される。様々な実施形態によると、フォトレジストは、７０℃で２時間、強く焼成される。ＲＴＤ素子を形成するために、高温の王水（ＨＣｌ：ＨＮＯ３の比が３：１で、９０℃）を用いて、金属をエッチングすることが可能である。統合ヒータは、まず、マサチューセッツ州ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＲＦスパッタリングを用いて、複数層の薄膜すなわち２００ÅのＴｉおよび２０００ÅのＰｔを、ＲＴＤウエハの背面に蒸着することにより形成される。その面に、厚いフォトレジストがスピンコーティングされ、ウエハは、背面接触式アライナ（Ｓｕｓｓ）を用いてパターン化され、強く焼成される。Ｔｉ／Ｐｔシード層の上には、カリフォルニア州アナハイムのＴｅｃｈｎｉｃ（ＴＧ２５Ｅ）から入手可能な亜硫酸金メッキ溶液を用いて、４．３ｍＡ／ｃｍ２で２３分間、５μｍの厚さまで電気蒸着され、ヒータのリード線が形成される。
【００８４】
様々な実施形態によると、フォトレジストは除去されて、背面は、厚いフォトレジストを用いて再びパターン化される。加熱素子は、ニューヨーク州プレインビューのＶｅｅｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能なイオンビームエッチングシステムを用いて、Ｔｉ／Ｐｔシード層にエッチングされる。ＲＴＤ／ヒータウエハは、２つの２５ｍｍ×７５ｍｍスライドにダイシングされる（Ｄｉｓｃｏ）。一部の例では、ドリルで穴を空けられたチャネルウエハは、カリフォルニア州ユカイパのＣｅｎｔｕｒｉｏｎ ＶＰＭ，Ｊ．Ｍ．Ｎｅｙから入手できるプログラム可能な真空炉を用いて、ＲＴＤ／ヒータウエハに熱接着される。
【００８５】
１つの基板に、免疫捕捉、ＰＣＲ、およびＣＥのための１つのシステムを備えてもよいが、本発明の技術によると、臨床検査で利用するためには、免疫捕捉、ＰＣＲ、およびＣＥのための並列システムを開発することが効率的である可能性が認識されている。一例では、携帯型の病原体分析器は、標本内の３つの異なる病原体を対象とする３つの直列の免疫捕捉／ＰＣＲシステムを備える。３つのシステムのための流体制御システム、ヒータ用の電気回路、温度センサ、および電気泳動の並列化は容易であり、１つの顕微鏡用スライドの有する表面積でも十分に、３つの完全な並列システムを加工できる。
【００８６】
別の例では、臨床検査で利用するための大規模並列の免疫捕捉／ＰＣＲシステムが提供されている。複数の人物または複数グループの人物にわたって、複数の異なる感染体を分析できることから、感染体を同定して疫学的に追跡するための強力な方法となる。図１４は、放射状に並列された免疫捕捉／ＰＣＲデバイス１４００の一部を示す図である。本明細書では、円の軸の周りに配列された複数の免疫捕捉およびＤＮＡ分析の機構を有する任意のシステムまたはデバイスを、放射状の並列デバイスと呼ぶこととする。
【００８７】
様々な実施形態によると、この設計は、ＣＥ分析器と一体化された独自の免疫捕捉／ＰＣＲチャンバ１４２３をそれぞれ備える複数の対の分析器の配列を備える。標本は、そのデバイスの所与のサブセット内のすべてのチャンバを順次通過するため、複数の感染体が順次捕捉される。そのデバイスの備える個々のサブセット１４０１、１４０３、１４０５、１４０７、１４０９、１４１１は、異なる物質を並列で分析することができる。容器１４４７および１４４５は、ビーズ入力およびビーズ廃棄を実現する。容器１４４３および１４４１は、それぞれ、共通のキャピラリ電気泳動の陰極の容器および廃棄の容器となる。
【００８８】
チャンバは、カスケード式の免疫親和捕捉を行うために相互接続される。バルブ１４３１および１４３３は、カスケードループ上のチャンバをシーリングする。バルブ１４３５および１４３７は、ビーズ導入および廃棄のためのチャネルから、チャンバをシーリングする。ＣＥ微小チャネルは、周知の回転式共焦点蛍光スキャナ（図示せず）を用いて検出を行うために、共通の中央陽極に接続される。捕捉チャンバ１４２３と、リード線１４５１を有するヒータとの組み合わせの平行配列が提供され、バルブおよびポンプの頑丈な配列が構築されている。チャンバ１４２３に関連するヒータおよび温度センサは、分析チャネルにおいて並列で動作するため、単純なリング状のヒータを用いれば十分である。そのため、個々のヒータおよび温度センサは、効率的かつ効果的な並列病原体検出システムを提供するためには、もはや必要ない。
【００８９】
構成要素およびプロセスの多くは、便宜上、単数で記述したが、本発明の技術を実施するために、複数の構成要素やプロセスの反復を用いてもよいことは、当業者にとって明らかなことである。
【００９０】
本発明は、具体的な実施形態を参照して詳細に図示および記載されているが、本発明の趣旨や範囲から逸脱せずに、開示された実施形態の形態および詳細事項を変更することができることも、当業者にとって明らかなことである。例えば、上述の実施形態は、様々な材料を用いて実施されてよい。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体の検出および分析に関する。一例では、本発明は、微小流体制御構造を用いて実施される標本の準備、処理、検出、および分析のためのシステムを提供する。別の例では、本発明は、高スループット分析の用途のために、高密度配列の流体制御素子を製造するための頑強な技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
微小流体分析のための従来の機構には限界がある。一部の利用可能な機構は、単一チャネルの分離デバイスと、複数チャネルの分離デバイスとを含む。他の機構は、いくつかの標本の準備および分析の工程を備える分析器を含む。しかしながら、流体制御が可能な多くの微小流体分析デバイスは、多くの化学的または生化学的分析と化学的または物理学的に互換性がない。さらに、多くの微小流体制御素子は、加工プロセス、頑健性、および／または、設計における制限のために、高密度配列で加工することが困難である。多くの従来のデバイスは、流体制御を維持するために持続的に作動させることが必要である。かかるバルブを用いる微小流体デバイスは、デバイスの流体の内容物の制御を失うことなしに制御システムから取り外すことができない。さらに、微小流体分析のための多くの技術および機構は、感度、特異性、または、定量的な分析の能力に欠けている。特に、従来の微小流体分析機構は、病原体の検出器および分析器などのシステムのために標本の準備を効率的に行う機能および能力に欠けている。
【０００３】
したがって、バルブ、ポンプ、ルータ、反応炉など、微小流体制御機構を実施するための方法および装置を改良して、微小流体デバイスにおける標本の導入、準備処理、および分析能力の効果的な統合を実現することが望まれている。一例では、偽陽性が少なく高スループットかつ安価な連続監視を実現する病原体の検出器および分析器として用いることのできる単一チャネルシステムおよびアレイシステムの両方を実施するのに利用可能な微細加工の効率を有する微小流体デバイスを提供することが望まれている。
【発明の概要】
【０００４】
微小流体の分析を実行するための方法および装置が提供されている。統合されている空気マニホルドに関連するモノリシックエラストマ膜により、流体を分離、経路指定、合流、分割、および貯蔵するための構造など、様々な流体制御構造の高密度の配列を、配置および作動させることが可能になる。流体制御構造は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびキャピラリ電気泳動（ＣＥ）分析など、統合的な免疫親和捕捉および分析を備える病原体検出および分析システムを実施するために用いることができる。被分析溶液は、デバイスに入力されると、細菌、ウィルス、および細菌胞子など、様々な種類の微生物有機体を対象とした抗体を有する微細加工されたチャンバ内の一連の免疫親和捕捉マトリクスを通してポンプによって送られてよい。免疫捕捉チャンバは、さらなる分析工程のために、ターゲットを捕捉、精製、および濃縮することができる。
【０００５】
一実施形態では、病原体検出システムが提供されている。そのシステムは、微小流体デバイスに統合されている免疫捕捉チャンバを備える。免疫捕捉チャンバは、微小流体チャネルを通して免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる。そのシステムは、さらに、免疫捕捉チャンバに関連付けられているＤＮＡ分析機構を備える。ＤＮＡ分析機構は、微小流体デバイスに統合されている。ＤＮＡ分析機構は、ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行できる。
【０００６】
別の実施形態では、モノリシックデバイス上の病原体検出システムが提供されている。そのシステムは、モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバを備える。免疫捕捉チャンバは、微小流体チャネルを通して免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる。そのシステムは、さらに、免疫捕捉チャンバに関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を備える。複数のＤＮＡ分析機構は、モノリシックデバイスに統合されている。複数のＤＮＡ分析機構は、ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行できる。
【０００７】
別の実施形態では、病原体分析のための方法が提供されている。被分析流体が、モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバに、微小流体チャネルを通じて供給される。免疫捕捉チャンバにおいて、被分析流体に関連するターゲットが捕捉される。複数の免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を用いて、ターゲットに対してＤＮＡ分析が実行される。複数のＤＮＡ分析機構は、モノリシックデバイスに統合されている。
本発明に関する上述およびその他の特徴と利点は、本発明の原理を例示的に説明する本発明の明細書および添付の図面を参照して詳細に提示される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｂ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｃ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｄ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図１Ｅ】本発明の技術の実施に適した微小流体デバイス上の機構を示す図。
【図２Ａ】ダイヤフラムポンプを示す図。
【図２Ｂ】ダイヤフラムポンプを示す図。
【図３】流体ルータを示す平面図。
【図４】混合ループを示す平面図。
【図５Ａ】流体容器を示す図。
【図５Ｂ】流体容器を示す図。
【図５Ｃ】流体容器を示す図。
【図５Ｄ】流体容器を示す図。
【図６】バスバルブを示す図。
【図７】病原体検出システムを示す図。
【図８】免疫親和捕捉バルブ機構を示す図。
【図９】免疫親和捕捉バルブ機構を示す図。
【図１０Ａ】被分析物の捕捉を示す図。
【図１０Ｂ】免疫親和捕捉のための被分析物の経路指定を示す図。
【図１１】免疫親和捕捉と統合可能なＰＣＲおよびＣＥを示す図。
【図１２】組み合わされた免疫捕捉およびＰＣＲチャンバを示す図。
【図１３Ａ】病原体検出システムを示す図。
【図１３Ｂ】微細加工の段階を示す図。
【図１４】放射状配列の病原体検出システムを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ここで、本発明を実施するために発明者が考慮した最良の実施形態を含む本発明のいくつかの具体的な実施形態について説明する。これら具体的な実施形態の例は、添付の図面に示されている。本発明は、これら具体的な実施形態に関連して説明されているが、説明されている実施形態に本発明を限定する意図はない。逆に、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の趣旨および範囲に含まれうる代替物、変形物、および等価物を網羅するよう意図されている。例えば、本発明の技術は、ガラス製の微小流体デバイスに関連して説明されているが、プラスチック製のデバイスなど、他のデバイスを用いることも可能である。
【００１０】
ガラス製の微小流体デバイスの利用に適した流体制御構造は、様々な微小流体デバイスに適用可能であることに注意されたい。流体制御構造が役立つ用途の好例としては、病原体検出システムが挙げられる。以下の説明では、本発明の完全な理解を促すために、数多くの具体的な詳細事項が記載されている。本発明は、これら具体的な詳細事項の一部あるいはすべてがなくとも実施可能である。また、本発明を不必要にわかりにくくすることを避けるために、周知の処理動作については、説明を省略した。
【００１１】
微小流体分析技術の分野は、初期の単一チャネル分離デバイスから急速に発達してきた。一部のデバイスは、正弦標本準備および分析を１つのチップに統合した高スループットの分析および分析器のための複数チャネル分離デバイスを含む。複数チャネル分析と、統合された標本準備との両方を組み合わせたデバイスは、様々な分析を実行する際に必要な資源の量およびコストを低減することができる。その実例は、ゲノム学の分野に見いだすことができる。すなわち、配列決定のための標本の準備、精製、電気泳動分析を統合することにより、分析時間およびコストが低減され、分析の処理効率および頑健性が増大される。すべての場合において、微小流体デバイスの高度な統合を行うには、大量の流体を分離、経路指定、合流、分割、および貯蔵するためのチップ機構の頑健性が必要になる。
【００１２】
シリコン、ガラスシリコン、ポリマ、およびエラストマの微小流体デバイスで用いられる一部のバルブ技術については、上述の要件を満たすには限界があった。しかしながら、これらの技術の多くは、多くの化学的または生化学的分析と化学的または物理学的に互換性がない。さらに、多くの技術は、ガラス製の微小流体デバイスで利用できる頑健な表面改質剤の多様性に欠けている。加えて、個々の微小流体バルブは、通例、個々の膜が通常時に開状態を保持されるように加工される。通常時に開状態のバルブを用いる場合には、流体制御を維持するために恒常的な作動を必要とする。かかるバルブを用いる微小流体デバイスは、デバイスの流体の内容物の制御を失うことなしに制御システムから取り外すことができない。さらに、一部の典型的なデバイスは、個々に配置されたラテックスの膜を用いる。個々に配置され空気圧で作動されるラテックスの膜が開発されたが、この加工方法は、複数チャネルの高スループット分析デバイスへの大規模集積の妨げとなる。
【００１３】
別の微小流体デバイスは、陽極に接着されたシリコンとガラス製のウエハとを用いて加工され、圧電によって作動される。しかしながら、シリコンの導電性および化学的な互換性から、分析デバイスでの利用が困難である。シリコンに接着または蒸着された薄膜によって、導電性および化学的な互換性を部分的に軽減できるに過ぎない。
【００１４】
エラストマ製のデバイスについても説明する。しかしながら、エラストマ材料の疎水性および多孔性により、エラストマ製のデバイスは、多くの化学的または生化学的分析と互換性がない。したがって、エラストマの表面との流体の接触を最小限にすることが望まれる。複雑な加工、化学的な互換性、信頼性のない流体操作などの問題から、既存の流体操作技術は、大規模かつ高スループットのラボオンチップ・デバイスへの組み込みには不十分である。
【００１５】
したがって、本発明の技術および機構は、微小流体デバイスへの高密度集積に適したモノリシック膜バルブ構造を提供する。また、モノリシック膜バルブ構造に基づく様々な流体制御構造も提供されている。
【００１６】
モノリシック膜を有する微小流体デバイスは、１つのチップに病原体検出システムを実装するのに特に適したデバイスの一例である。様々な実施形態によると、病原体検出システムは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびキャピラリ電気泳動（ＣＥ）機構など、免疫捕捉およびＤＮＡ分析機構を含む。一例では、病原体検出システムは、様々な流体制御構造を有するガラス製の微小流体デバイスに実装されてよい。
【００１７】
図１Ａないし１Ｅは、ガラス製の微小流体デバイスに実装可能なモノリシック膜バルブを示す図である。図１Ａは、モノリシック膜バルブを示す上面図である。図１Ｂは、バルブを有する３層デバイスを示す側面図である。図１Ｃは、バルブを有する４層デバイスを示す側面図である。図１Ｄは、３層デバイスの開バルブを示す側面図である。図１Ｅは、開バルブの４層デバイスを示す側面図である。図１Ａおよび１Ｂに示した様々な実施形態によると、３層ガラス製微小流体デバイスは、２つのガラスウエハ１０１と１０５の間に挟まれたエラストマ膜１１１を備える。一例では、エラストマ膜は、イリノイ州エルクグローブのＢｉｓｃｏ Ｓｉｌｉｃｏｎｓから２５４μｍ厚のＨＴ−６１３５およびＨＴ−６２４０膜として入手可能なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の膜である。他の柔軟な膜を用いることも可能である。エラストマ膜１１１は、ウエハの間に可逆的であるが強固な接着を提供する。
【００１８】
接着の前に、流体を運ぶための流体チャネル１０３が、ウエハ内にエッチングされる。同様に、加圧下または真空下で空気またはその他の作用流体を運んでバルブを作動させるためのマニホルドチャネル１０７およびバルブ領域１０９がエッチングされる。通例、空気チャネル１０７および１０９は、一方のウエハ１０５（以後、空気ウエハと呼ぶ）に配置され、流体チャネルは、第２のウエハ１０１（以後、流体ウエハと呼ぶ）にエッチングされる。これらのエッチングされたチャネル形状は、膜に対して直接的に接触して、図１Ｂに示すような複合型のガラス／エラストマチャネルを形成することができる。
【００１９】
あるいは、膜は、図１Ｃの４層デバイス１５０に示すように、熱接着された完全ガラス製の流体ウエハサンドイッチ構造（ＸＹ）と、空気ウエハ１５９との間に配置されてもよい。完全ガラス製のチャネルを有することにより、ガラスの持つ好ましい物理的および化学的特性が、デバイスに役立つ。好ましい物理的および化学的特性を有する任意の層を、化学的に不活性な層と呼ぶこととする。化学的に不活性な層は、ＸＹの加工に用いられてよい。一例では、ＸＹを構成する１５１および１５５のサンドイッチ構造は、ガラスから形成される。
【００２０】
４層デバイスの一例は、ビアウエハ１５５に熱接着された流体ウエハ１５１を備える。直径の小さいビアホールが、流体チャネル１５３内の断絶部分に配置される。エラストマ膜１５７は、流体／ビアウエハのサンドイッチ構造ＸＺのビアウエハ１５５側に貼り付けられる。バルブたわみチャンバ１６１が、マニホルドウエハ１５９にエッチングされて、膜１５７に接着され、４層デバイス１５０が完成される。このように、流体チャネル１５３は、完全ガラス製の化学的に好ましい構成を保持すると共に、大規模集積の流体制御構造の実装を可能にする。一部の実施形態では、図１Ｃに示された４層デバイスは、標本とエラストマ膜との接触を最小限に抑えることから、３層デバイスを大幅に超える利点を提供する。
【００２１】
様々な実施形態によると、モノリシック膜デバイス内の様々な流体制御構成要素は、空気ウエハの穴に圧力または真空を作用させることにより作動される。本明細書では、任意の単一の膜を、モノリシック膜と呼ぶこととする。また、本明細書では、モノリシック膜を備える任意の単一のデバイスを、モノリシックデバイスと呼ぶこととする。本明細書では、空気ウエハに関連するエッチングされたチャネルに圧力または真空を供給するための機構を、ポートまたは空気ポートと呼ぶこととする。３層デバイスでは、空気ウエハにエッチングされたチャネルは、エラストマ膜１１１のバルブ領域１０９に作動真空を分配する。図１Ｄに示すように、マニホルドチャネルを通してバルブ領域１０９に真空を作用させると、チャネル断絶部分から遠ざかるように膜が引っ張られて、断絶部分を流れる流路が提供され、バルブが開放される。本明細書では、空気圧を用いて開閉できるバルブを、開閉可能なバルブまたは空気開閉可能なバルブと呼ぶこととする。
【００２２】
空気圧を作用させる工程は、圧力を作用させる工程と、真空を作用させる工程の両方を含む。したがって、膜１５７は、図１Ｄに示すように、隣接する流体チャネル内の流体の流れを調節することができる。図１Ｄにおいては、空気ウエハ１０５に関連するエッチングされたチャネルを通してバルブ領域１０９に真空が作用されて、流体チャネル１０３が開放されている。真空の圧力すなわち吸引力が、バルブ領域１０９に作用されなくなると、膜１１１は、図１Ｂに示すように、流体チャネル１０３を閉じる。図１Ｅは、４層デバイスを示している。４層デバイスは、チャネル層１５１と、チャネル１５３と、ビア層１５５と、膜層１５７と、空気層１５９とを備える。上述のように、４層デバイスは、一部の場合においては標本とエラストマ膜との接触をバルブ領域１６１のみに限定することから、３層デバイスを大幅に超える利点を提供する。
【００２３】
図に示した構造は、任意の方向に配置されてよいことに注意されたい。一部の例では、バルブが、デバイスに関して反転されてもよい。空気層は、流体層の上側に配置されても下側に配置されてもよい。重力が、膜バルブに悪影響を与えないことから、本発明の技術は、様々な方向の配置を許容する。
【００２４】
流体制御構造は、様々な利点を提供する。例えば、モノリシック膜バルブは、通常時には閉バルブであり、それは、デバイスが作動圧力源から取り外された際にもバルブが閉状態を保つことを意味する。通常時に開状態となる既存の微小流体バルブは、デバイスの流体内容物の制御を維持するために恒常的な作動を必要とする。さらに、形状記憶合金の構造と違って、バルブ構造の開閉温度が両方とも常温であるため、水を含む生体液での作業が容易になる。
【００２５】
多くの典型的な実施例では、様々な流体制御機構を操作するために、微小流体デバイス間のインターフェースが数多く必要になる。しかしながら、本発明の様々な実施形態によると、膜における複数領域の空気制御チャネルを結合することによって、それら複数領域を並列に作動させることもできる。一例では、単一の空気ポートを用いて、一連のバルブを制御することができる。したがって、限られた数の外部インターフェースすなわち空気ポートを用いて、かなりの数のバルブを制御することができる。これにより、実装が簡単になり、デバイスとの接続の際の問題が最小限に抑えられる。様々な実施形態によると、このようにバルブを制御することにより、デバイス内のバルブ、ポンプ、貯蔵容器、ルータ、およびその他の流体制御構造を動作させるためのモノリシック膜の大規模並列の空気作動が可能になる。
【００２６】
膜バルブは、様々な流体制御機構の形成に用いられてよい。図２Ａおよび２Ｂは、膜バルブを用いて形成されたポンプを示す図である。図２Ａおよび２Ｂに示された様々な実施形態によると、直列に配置された３つのバルブが、ダイヤフラムポンプ２１０を形成している。５工程のサイクルに従ってバルブを作動させることにより、ポンプ動作が実現される。図２Ａは、３層モノリシック膜ダイヤフラムポンプを示す上面図である。図２Ｂは、３層モノリシック膜ダイヤフラムポンプを示す側面図である。ダイヤフラムポンプは、入力バルブ２０１と、ダイヤフラムバルブ２０３と、出力バルブ２０５とを備える。ダイヤフラムポンプは両方向に動作可能であるため、入力バルブおよび出力バルブの指定は任意であることに注意されたい。ポンプは、エッチングされた流体チャネル２１１と、モノリシック膜２０７と、マニホルド層２１３とを有する流体層２０９を備える。バルブが有する気密性により、ポンプは、自吸式となるため、他の気体および流体に加えて空気にもポンプ動作を行うことができる。
【００２７】
様々な実施形態によると、一連の段階で、ポンプ動作を実行することができる。第１の段階では、出力バルブ２０５が閉じられると共に、入力バルブ２０１が開かれる。第２の段階では、ダイヤフラムバルブ２０３が開かれる。第３の段階では、入力バルブ２０１が閉じられる。第４の段階では、出力バルブ２０５が開かれる。第５の段階では、ダイヤフラムバルブ２０３が閉じられ、開かれた出力バルブ２０５を通して被分析流体が送出される。
【００２８】
１サイクル当たりのポンプの送出量は、開かれたダイヤフラムバルブ内に含まれる量、すなわち、ダイヤフラムバルブ内の空気チャンバのサイズによって決まる量によって決定される。したがって、ダイヤフラムバルブの空気チャンバのサイズを調節することにより、既知のナノリットルからマイクロリットルの尺度の量の流体を測定するために設計されたポンプを加工することができる。ダイヤフラムポンプは、自吸式であり、作動周期を逆転することにより順方向と逆方向に流体を送ることができる。また、膜がガラスシーリング面に接触するバルブ台は、膜とガラス面との接着を制御するための尾根またはその他の表面構造を有するようエッチングされてよいことに注意されたい。
【００２９】
モノリシックバルブは、ルータ、合流手段、および分割手段を形成するために用いられてもよい。以下の構造は、３層構造に関して説明されているが、４以上の層を用いて実施してもよいことに注意されたい。図３は、ルータ３００を示す図である。ルータは、バルブ３０１、３０３、３０５、および３１７と、空気チャネル３３１、３３３、３３５、３３７、および３３９と、流体チャネル３２１、３２３、３２５、および３２７と、ダイヤフラムバルブ３０９とを備える。ルータは、ポンプ動作サイクル中のどの時点でどの入力／出力バルブが作動されるかに応じて、任意の入力から任意の出力に流体を送る。２以上の入力バルブを同時に作動させることにより、いくつかの異なる流体の流れが、出力バルブにおいて１つの流れに合流される。逆に、２以上の出力バルブを同時に作動させることにより、１つの流体の流れが、出力バルブにおいていくつかの異なる流れに分割される。
【００３０】
例えば、流体をチャネル３２７からチャネル３２１に送るには、バルブ３０１および３０５が閉状態に保たれる。これで、バルブ３１７、３０９、および３０３が、上述のように、ポンプとして用いられることが可能になる。ルータは、流体チャネルを合流および分割する機能を有する。流体をチャネル３２５および３２７からチャネル３２３に合流させるには、バルブ３０３が閉状態に保たれる。流体をチャネル３２１からチャネル３２３および３２７に分割するには、バルブ３０１が閉状態に保たれる。さらに別の例では、チャネル３２７を通して導入された流体をチャネル３２５に送るために、バルブ３０３および３０５が閉状態に保たれる。バルブ３１７および３０１の開放が可能となり、チャネル３２７を通してのチャネル３２５への流体の流れが実現する。なお、様々な構成が可能である。
【００３１】
モノリシックバルブを用いて、混合ループが形成されてもよい。一例では、デバイスの２つの領域間で流体を移動させることにより、混合を実行することができる。混合は、すべての種類のオンチップ動作を実行するために用いられてよい。図４は、混合ループ４００を示す図である。混合ループは、バルブ４０１、４０３、および４０５と、流体チャネル４１１、４１３、および４１５と、空気チャネル４２１、４２３、および４２５とを備える。さらなるバルブ付きのチャネルが、ループに接続し、混合器への流体の出入りを提供している。２種類以上の流体が、チャネル４１３および４１５を通して混合ループ内に流入され、それらの流体が拡散によって混合されるまで、上述のように周期的にポンプで送られる。次いで、混合物は、混合ループからポンプで送出されてよい。また、２つの容器の間で流体を往復移動させることにより、混合を実現してもよい。
【００３２】
図５Ａないし５Ｃは、容器５００を示す図である。図５Ａは、エッチングされた移動チャンバを備えた容器を示す上面図である。図５Ｂは、容器の側面図である。図５Ｃは、満たされた容器を示す側面図である。図５Ｄは、ドリルによって形成された移動チャンバと、自律的な流入／流出のためのポンプとを備えた大容量容器を示す側面図である。容器は、流体ウエハ５１１との間に膜５０５を挟む空気ウエハ５１３に備えられている。容器は、チャネル５０１を通して満たされたり空にされたりすることが可能である。様々な実施形態によると、バルブ領域５０３内の開かれたモノリシック膜バルブは、オンチップ流体貯蔵のための容器として機能する。空気ウエハ５１３内のチャンバのサイズは、容器内に貯蔵される流体の量を決定する。容器は、真空を作用させることにより満たされ、圧力を作用させることにより空になる。
【００３３】
様々な実施形態によると、エッチングされた空気チャンバの代わりにドリルで空けられた穴を用いて、その穴に直接的に作動圧力または真空を作用させることにより、大量の流体を貯蔵するための容器を加工することができる。あるいは、容器をダイヤフラムポンプに接続することにより、直接的な空気の接続を持たない容器を加工してもよい。図５Ｄは、ポンプに接続された容器５０３を示す図である。容器は、ポンプ動作の方向によって充填または排出されるため、容量が可変であるという利点を有する。一例では、バルブ５３１、５３３、および５３５などのポンプは、容器５０３に対する流体の充填または排出のために用いられる。
【００３４】
１以上の流体入力を備えたモノリシック膜容器は、オンチップ反応炉として機能する。容器と同様に、反応炉は、空気マニホルドウエハを通して加えられる直接的な圧力または真空を用いることにより、反応物質を吸い込み、生成物を放出することができる。あるいは、反応炉は、統合されたポンプ、混合器、および／またはルータ構造を間接的に用いて、反応物質を吸い込み、生成物を放出することができる。様々な実施形態によると、反応炉の容量は、空気ウエハ内のチャンバ５０３のサイズによって規定されるため、流体ウエハの構造の配置を大きく変えることなく、任意の容量を持つ反応炉を、デバイスの任意の点に設けることが可能である。また、反応炉は、可変量の反応物質を含むオンチップ反応の必要に応じて、部分的に満たされてもよい。
【００３５】
ほとんどのエラストマ膜は、気体透過性を有し、この特性は、これまで、すべてのエラストマデバイスに対して流体の充填を簡単にするために用いられてきた。
【００３６】
様々な実施形態によると、膜の気体透過性により、気泡およびエアポケットを排除できる。作動真空をモノリシック膜反応炉またはその他の流体構造に作用させると、気体を発生する反応による気泡を排除できる。例えば、気体透過性の膜は、ＰＣＲの反応物質のオンチップ温度サイクリングの間に生成されて反応混合物の閉じこめの失敗につながりうる気泡を低減することが可能である。
【００３７】
複合微小流体デバイスは、流体バスに接続されているいくつかの独立したモジュールを備えてよい。一例では、そのデバイスは、複数の異なる流体チャネルに被分析流体を供給するのに有用である。別の例では、様々な試薬が、微小流体デバイスへ導入されてよい。図６は、被分析流体を分配するために利用可能なバスバルブ６００を示す図である。バスバルブ６００は、流体を流体バスチャネル６１１から流体チャネル６２１、６２３、６２５、および６２７に送るよう設計されたバルブ６０１、６０３、６０５、および６０７を備える。空気チャネル６３１、６３３、６３５、および６３７は、流体の分配を制御するためのバルブを管理する。典型的なバスバルブの実施例は、バス側にデッドボリュームを有する。デッドボリュームは、流体の経路指定動作の合間に完全にバスを洗浄することを困難にする。様々な実施形態によると、本発明の技術は、バス側にデッドボリュームをほとんどまたは全く持たないバスバルブを提供する。これにより、流体の経路指定動作の合間に完全にバスを洗浄することが可能になり、デバイスの動作中の異なる流体間での混合すなわち交差汚染が防止される。
【００３８】
微小流体デバイスの機構は、様々な技術を用いて加工されてよい。様々な実施形態によると、チャネル形状は、例えば、標準的な湿式化学エッチングを用いて、ガラスウエハにエッチングされる。ガラスウエハ（厚さ１．１ｍｍ、直径１００ｍｍ）は、ＬＰＣＶＤ炉またはスパッタリングシステムを用いて、ピラニア洗浄され（２０：１）、犠牲（２００ｎｍ）ポリシリコンエッチングマスク層で被覆される。３層または４層設計のデバイスには、ボロフロートガラスウエハすなわちＳｃｈｏｔｔ Ｄ２６３ホウケイ酸ガラスウエハが用いられる。ポリシリコンの蒸着後、ウエハは、ポジティブフォトレジストでスピンコーティングされ、軽く焼成されて、接触式アライナでパターン化される。フォトレジストのＵＶ露出領域は、Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ現像液の中で除去される。ポリシリコンの露出領域は、ＳＦ６プラズマ内でのエッチングによって除去される。ウエハは、所望のエッチング深さに到達するまで、ＨＦ溶液（ボロフロートウエハに対しては４９％のＨＦ、Ｄ２６３ウエハに対してはＨＦ：ＨＣｌ：Ｈ２Ｏを１：１：２で混ぜた溶液）内で７μｍ／ｍｉｎで等方的にエッチングされる。
【００３９】
様々な実施形態によると、流体チャネルウエハは、３層デバイスについては２０μｍの深さ、４層デバイスについては４０μｍの深さまでエッチングされる。マニホルドウエハは、３層デバイスについては７０μｍの深さまでエッチングされ、４層デバイスについてはバルブ位置にドリルで穴を空けられる。次いで、残りのフォトレジストおよびポリシリコンは、それぞれＰＲＳ−３０００およびＳＦプラズマによって、ウエハから剥離される。流体およびマニホルドウエハを貫くアクセス穴がドリルによって空けられ、ウエハは、再びピラニア洗浄される。
【００４０】
一部の例では、３層設計を用いるデバイスは、ドリルまたはエッチングによって形成された移動チャンバが、バルブ台からＰＤＭＳ膜を隔てて、どの方向に配置された場合でも、流体チャネルウエハ内のエッチングされた形状の上にＰＤＭＳ膜（２５４μｍ厚ＨＴ−６１３５およびＨＴ−６２４０、イリノイ州エルクグローブのＢｉｓｃｏ Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）を貼り付け、バルブと共にマニホルド複合ガラス−ＰＤＭＳ流体チャネルを圧迫することにより、組み立てられる。４層設計を用いるデバイスは、まず、一対の直径２５４μｍのドリルによるビアホールをチャネルのギャップの位置に対応するよう位置決めした状態で、流体チャネルウエハを２１０μｍ厚Ｄ２６３ビアウエハに熱接着することにより組み立てられる。流体チャネルおよびビアウエハは、真空炉（カリフォルニア州ユカイパのＪ．Ｍ．Ｎｅｙ）内で３．５時間５７０℃で加熱することにより接着される。それにより形成された完全ガラス製のチャネルを含む２層構造は、次に、ＰＤＭＳ膜およびマニホルドウエハに接着される。このように形成されたガラス−ＰＤＭＳ間の接着は、可逆的であるが、デバイスに与えられる範囲の真空および圧力に耐えるほど十分に強い。必要に応じて、組み立ての前にＵＶオゾンクリーナ（カリフォルニア州アービンのＪｅｌｉｇｈｔ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．）でマニホルドウエハおよびＰＤＭＳ膜を洗浄することにより、不可逆的なガラス−ＰＤＭＳ間の接着が得られる。
【００４１】
上述の微小流体デバイスの機構は、様々なデバイスの実施に用いることができる。バルブおよびポンプを備える特徴は、標本の準備および分析の工程を１つのデバイスに統合できる複数チャネルのラボオンチップ機器を提供するために柔軟に構成されることが可能である。微小流体プラットフォームは、特に、統合病原体検出システムを実施できる単一のデバイスとして適切である。
【００４２】
従来の高速病原体検出システムは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）を利用した検出を用いる。通例、検出は、分析される特定の抗体の固定化、標本溶液での培養、現像および検出の前の酵素または蛍光プローブに結合したサンドイッチ抗体での認識を含む。免疫蛍光検出法も用いられる。しかしながら、これらの検査の各々に関する制限は、比較的厳しい。
【００４３】
ＰＣＲを利用した遺伝子検出および同定の様々なフォーマットも、高い特異性と増幅率のために一般的に利用されている。しかしながら、ＤＮＡを利用したＰＣＲの方法は強力ではあるが、生存および非生存の病原体の両方に陽性の反応をすることから、偽陽性を引き起こす場合がある。そのため、急速に分解する性質のため、検出の際に生きたターゲットが必要なことから、ＲＮＡターゲットの検出が好まれる場合がある。
【００４４】
様々な別の検出方法も提案されている。質量分析法は、中性脂質、極性脂質、および胞子に特有のバイオマーカの検出によって病原体、胞子、およびその他の生体を検出するために開発された。しかしながら、質量分析法の速度、スループット、および可搬性は明白ではなく、特異性は実証されていない。
【００４５】
例えば、土壌、空気などからの炭疽菌のような胞子の検出は、感染性が高い（１０胞子／Ｌで１０分の場合、１０，０００胞子の空気感染量が起こりうる）ため困難である。最も進んだ検出の概念は、薄膜ヒータを備えたシリコンの微小反応炉内で実行されるＰＣＲ生成物のリアルタイム検出と、統合された蛍光励起および検出とを用いる。このシステムは、後に、１０チャネルの先進核酸分析器（ＡＮＡＡ）と、携帯型とに拡張された。このシステムのバージョンは、軍事用や郵便局用も開発されている。リアルタイムＰＣＲ分析のために統合された（複数マイクロリットルの）標本処理を備えたＧｅｎｅＸｐｅｒｔ標本準備システムも開発されている。
【００４６】
自動化された複雑な最前線の化学反応の実行と、病原体濃度および抗生物質に対する耐性の定量化を迅速に実行する携帯型分析が開発されれば、大きな前進になるだろう。同様に、高スループットで非常に低い偽陽性で高速に多数の標本を検出および同定する（すなわち、複数標本をスクリーニングする用途での）能力も、多数の標本または感染の可能性のある個体がスクリーニングされる必要のある場合に有用であり、すなわち、自動臨床分析器への前進となった。一例では、基本的に一般の自動分析器の小型版である血液臨床分析用の複雑な微小流体回路システムが開発された。マイクロアレイでのＨＩＶ分析用の血液からの標本を準備するために用いられる完全統合分析器（マイクロリットルの尺度）も開発された。このシステムは、多数の核酸の工程を含む複雑な分析を実行し、以下で詳述する＞１００ｎＬデッドボリュームの空気膜バルブを用いるものであった。
【００４７】
単純な圧力除去システムで流体を制御して、小型携帯システムでの免疫検査の性能を向上させる６つの異なる免疫検査センサにわたって溶液の流れを制御するためのルーサイト製の微小流体キューブが開発された。このフォーマットは、統合フローシステムと光ファイバ製のバイオセンサキャピラリとを用いて、１０分の動作で４つの異なる物質を分析するＲａｐｔｏｒ携帯型分析器として開発された。アドレス可能なアレイという独特の特徴が認識され、自動化された電界駆動免疫捕捉およびＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ解析を実行する統合型の積層微小ラボラトリが開発された。例えば、免疫捕捉に続いて、細菌は、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）のために放出され、次いで、増幅された志賀様毒素遺伝子のハイブリダイゼーション分析が実行される。しかしながら、多重標本分析は実行されず、検出の制限は研究されていない。
【００４８】
従来の微細加工はシリコンでなされるが、化学および生化学の分析では、ガラス製の微小流体構造が、好ましい化学的および電気泳動の特性を示すことがわかっており、プラスチック構造への拡張が進んでいる。高スループットの用途では、本発明の技術は、９６から３８４断片のサイズ決定または配列決定用の分離物の高速な並列分析を可能にする放射状のチャネル配置を提供する。ＰＣＲとＣＥ分析とを１つのチップに直接的に統合すると、酵素によるＤＮＡの分解と親和捕捉とが提供される。
【００４９】
様々な実施形態によると、本発明の微小流体デバイス機構は、チャンバ、バルブ、ＣＥ分析チャネルの複雑な配列の形成を可能にする複雑なチャネル構造の形成を実現する。これらのＣＥチャネルのサイズの小ささと、交差した注入器の利用により、非常に高速で高解像度の電気泳動分離の性能が実現される。クロマトグラフのカラムまたはキャピラリで実行されていたほぼすべての動作が、１つのチップのフォーマットに組み込まれることで、必要な標本量が低減されると共に分析時間および感度が改善される。
【００５０】
様々な実施形態によると、本発明の病原体検出システムは、感度と共に特異性および定量化の属性を有するため、特に有用な分析を提供する。多くの病原体は、＞１０3の細菌の摂取で感染するが、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａは、１０5未満が経口で摂取されても症状を引き起こさず、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓについては、はるかに低いレベルで影響があると考えられている。脅威となるものを同定して処置を決定するためには、病原性を持つものと持たないものとを区別できるように株を同定することと、特定の毒素または抗生物質耐性遺伝子の存在を特定することが重要である。さらに、細菌の濃度または分量を決定して、同定すると共にこれを量的に報告する能力は、背後の課題と重要な課題とを区別する。
【００５１】
図７は、病原体検出システム７００の一例を示す図である。被分析物は、チャネル７０１を通して免疫親和捕捉チャンバ７０３、７１３、および７２３に導入され、チャネル７３１で廃棄物が収集される。様々な実施形態によると、入力された細菌の混合物を捕捉、濃縮、および階層化して、一連の別個の免疫チャンバ７０３、７１３、および７２３に導入するために、免疫親和試薬が用いられる。この簡単なプロセスは、病原体検出を追跡する微小流体システムの用途での障害となっていた重要なマクロからマイクロへのインターフェースに対処するものである。免疫捕捉の第１段階は、分析の特異性を増大させるのに大きな役割を果たす。感度の増大を実現するために、次に、病原体検出システムのユーザは、ＰＣＲを用いて物質の存在の冗長な確認を行い、さらに、特定のプライマに基づく方法またはＰＣＲなどのより一般的な遺伝子型特定方法を開発して、ＤＮＡ分析機構７０５、７１５、および７２５により、特定の株、毒素遺伝子の存在、および抗生物質耐性マーカを特定する。一例では、ＤＮＡ分析機構７０５、７１５、および７２５は、ＰＣＲおよびＣＥを含む。
【００５２】
様々な実施形態によると、免疫親和捕捉チャンバ７０３、７１３、および７２３は、ＰＣＲチャンバと統合されるが、ＣＥ機構は別個のままである。免疫捕捉および核酸分析を組み合わせると、個々の分析の感度および特異性が劇的に向上される。
【００５３】
病原性を持つものと持たないものとを遺伝的に区別する能力は、多くの用途で重要である。前工程としての免疫捕捉とＰＣＲ分析とを組み合わせると、入力された細菌のポピュレーションに対して有効な精製が実現されるため、不純で複雑な「実世界の」標本でしばしば見られるＰＣＲ阻害物の存在に関する不安に対処できる。様々な実施形態によると、病原体検出システムは、入力されたターゲットポピュレーションの定量化が維持および報告されるように、低サイクル数の（漸近的ではない）レジメでＰＣＲを実行するよう設定される。多くの例で、次に、処理された標本に対してＣＥ分析を施すことができる。現代の微小流体技術を利用することで、小さい携帯型で、動作に必要な電力、資源、および技量が最小限の安価、高速、および頑丈な分析システムが提供される。
【００５４】
病原体分析器には、統合された免疫親和捕捉チャンバが備えられている。フリット、ビーズ、ゲル、モノリス、およびポリマなど、様々な捕捉機構を用いることができる。図８および９は、シリカのフリットまたはビーズを用いて実装された免疫捕捉チャンバを示す図である。様々な実施形態によると、免疫捕捉チャンバは、シリカの粉末とケイ酸ナトリウムの結合剤との混合物でウエハの穴を満たすことにより加工された一連のシリカフリットを備える。脱水および洗浄されると、ケイ酸塩がシリカゲルに濃縮され、不溶性のシリカフリットが、８０１、８０３、８０５、および８０７において形成される。
【００５５】
様々な実施形態によると、１．１ｍｍの厚さのガラスウエハに形成された各シリカフリットは、１ｍｍの直径を有する。免疫捕捉チャンバは、被分析物を導入および排出するためにチャネル８２１と結合されている。ウエハ内のフリットは、膜８１１および８１３とバルブとポンプ構造とを含むデバイス内に、容易に統合されることが可能である。図８において、４つのシリカフリット８０１、８０３、８０５、および８０７は、膜８１１および８１３によってシーリングされている。各フリットの大きいシリカ表面は、様々な有機シラン試薬による化学的な誘導体化に適切である。デバイスの加工をさらに簡単にするために、モノリスウエハは、ＰＤＭＳとデバイスの残り部分との非加熱的な接着の前に、化学的に誘導体化されてもよい。
【００５６】
一例では、１．５μｍのフリットまたはビーズのような機構が、捕捉チャンバ内に設けられることにより、胞子および細菌などの多くのマクロ種の捕捉が可能になる。多くのマクロ種の固相捕捉は、当業者に周知であり、Ｗｅｉｍｅｒ，Ｂ．Ｃ．、Ｍ．Ｋ．Ｗａｌｓｈ、Ｃ．Ｂｅｅｒ、Ｒ．Ｋｏｋａ、およびＸ．Ｗａｎｇの２００１、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｐｏｒｅｓ， ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６７：１３００−１３０７でよく特徴付けられている。一部の例では、補足にビーズ試薬を用いるために、チャンバは、ビーズ止めを提供するための堰構造とビーズ導入チャネルとを備えるよう変形される。動電学的なビーズベッド包装や堰ビーズ捕獲が、当業者に周知である。あるいは、免疫機能を持たせた磁性ビーズが、堰を設けずにチャンバ内に導入されてもよい。
【００５７】
図９は、モノリスがシーリングされていない状態の開バルブを示す図である。様々な実施形態によると、領域９０１、９０３、９０５、９０７、および９０９において減圧がなされると、チャネル９２１に沿ってフリット９３１、９３３、９３５、および９３７を通して、被分析物が流れることが可能になる。加工されるデバイスには、任意の数のフリットが備えられてよい。
【００５８】
図１０Ａは、被分析物の補足を示す図である。様々な実施形態によると、一連の免疫捕捉チャンバを通して、オリゴヌクレオチド、タンパク質、細胞などを含む被分析溶液を送るために、３つの膜バルブ１００１、１００３、および１００５を備えるポンプ１０００が用いられる。
【００５９】
チャンバは、対象となるターゲットを補足するために様々な機構を用いることができる。免疫捕捉チャンバで捕捉されるよう構成された任意の対象物を、本明細書ではターゲットと呼ぶこととする。ターゲットを運ぶ流体または物質については、本明細書では被分析物と呼ぶこととする。一例では、ターゲットは、被分析流体に運ばれるサルモネラ菌またはリステリア菌である。
【００６０】
他の例では、各捕捉チャンバは、ターゲット分子を選択的に捕らえるために、オリゴヌクレオチドプローブを含む粘性ポリママトリクスで満たされる。ＤＮＡ分析の場合には、プライマや高塩分濃度のポリメラーゼ試薬を含むサンガー法のＤＮＡ配列決定の伸張産物が、電子対を共有するオリゴヌクレオチドプローブを含む固定されたアクリルアミドマトリクスを含む免疫捕捉チャンバを通して電気泳動される。捕捉体の配列は、ＤＮＡ増幅産物のみがプローブによって補足されて、プライマおよびポリメラーゼ試薬は、塩と共にデバイスを通り抜けるように選択される。これは、注意深い分析という点で直面する複雑で汚れた混合物からターゲットの分子を精製する必要性と異なるものではない。
【００６１】
機能化されたポリマ捕捉マトリクスを備えた微小捕捉チャンバの準備のための別の方法は、１０−２０μｍの範囲の孔を有するモノリスの準備と、機能ポリマの薄い架橋された層によって改質された大きい微細加工素子（約１００μｍ）表面を有するチャンバの準備とを含む。この方法は、ビーズを捕捉チャンバ内にパッキングすることが時に困難であることと、通常の動作に対するビーズベッドの機械的な安定性がしばしば不十分であることから有用である。様々な実施形態によると、多孔質（１０−２０μｍ）の表面で機能化されたポリマモノリスの成型ブロックは、モノマと多孔化剤とを含む前駆体混合物の光重合によって、捕捉チャンバ内に直接形成される。
【００６２】
重合プロセスはＵＶ光を用いて実現されるので、多孔質のポリマは、フォトリソグラフィを用いて微小流体デバイスの任意の所望の領域に形成可能である。前駆体混合物で満たされたガラスチップを用いるこのような「微小リソグラフィック」重合プロセスの動力学については、Ｙｕ，Ｃ．、Ｆ．Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２０００、「Ｔｏｗａｒｄｓ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ Ｍｏｌｄｅｄ ｐｏｒｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｏｎｏｌｉｔｈｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ｂｙ ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２１：１２０−１２７、および、Ｙｕ，Ｃ．、Ｍ．Ｘｕ、Ｆ．Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２００２、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｏｕｓ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｔｏｉｎｉｔａｔｅｄ ｆｒｅｅ ｒａｄｉａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｊ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、４０：７５５、に示されているように、すでに特徴付けられ、当業者に周知である。同様に、デバイスにおけるモノリシック材料の正確な位置や、その表面の化学的性質は、Ｒｏｈｒ，Ｔ．Ｃ、Ｃ．Ｙｕ、Ｈ．Ｍ．Ｄａｖｅｙ、Ｆ． Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２００１、「Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｘｅｒｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：３９５９、に示されている通り、当業者に周知のように、制御可能である。モノリシックポリマの多孔質の特性の制御は、多孔化剤の組成を調整することによって実現可能である。
【００６３】
微細加工された素子を有するモノリスもしくは表面のいずれが用いられる場合でも、所望の結合素子を導入するために、同一の接合方法を用いることができる。目標は、これらのモノリスの多孔の表面に抗体を固定することなので、接合される化学物質は、容易にバイオポリマと反応するように指定される。一例では、表面の接合体に組み込まれた２−ビニル−４、４−ジメチルアズラクトンの単位は、迅速にタンパク質と反応できる。かかる機構は、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．、Ｔ．Ｒｏｈｒ、Ｆ．Ｓｖｅｃ、およびＪ．Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｃｈｅｔの２００２、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ ｐｒｏｔｅｉｎ： Ｍａｐｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｐｏｒｏｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｏｎｏｌｉｔｈｓ ｍｏｌｄｅｄ ｉｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７４：４０８１：４０８８、に示すように、当業者に周知である。改質すべき表面（多孔質のモノリス、または微細加工素子）は、モノマ溶液に浸されることが可能であり、デバイスは、事前に選択された領域での接合を実現するためにＵＶ光を照射されることが可能である。表面の機能化の程度は、反応溶液におけるモノマの濃度、ＵＶ光の照射時間および強度によって制御される。
【００６４】
別の実施形態では、２−ビニル−４、４−ジメチルアズラクトン、エチレンジメタクリレート、およびアクリルアミドまたは２−ヒドロキシエチルメタクリレートからなる多孔質のポリマモノリスに、トリプシンが固定される。アズラクトンの機能は、酵素のアミンまたはチオール基と容易に反応し、安定した共有結合を形成する。一部の例では、モノリスの多孔質の特性が最適化されると、背圧が非常に低くなり、単純な機械的なポンプ動作を利用して、溶液からの酵素の固定と、基質溶液の次の分析との両方を実行することが可能になる。反応炉のミカエリス・メンテン動力学特性は、Ｎ−ａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルなど、低分子量の基質を用いて調べることができる。
【００６５】
溶液中のトリプシンの濃度やモノリスにおけるアズラクトンの機能の割合など、固定動作の変量の影響、酵素活性への反応時間の影響、および、反応炉内での基質の流速や滞留時間など、プロセス変量の影響が、詳細に研究された。オンチップの酵素微小反応炉のタンパク質分解作用は、基質として用いられる蛍光標識されたカゼインの分解に関して、様々な流速で示された。また、モノリシック微小反応炉の優れた性能は、０．５μＬ／分の速い流速（すなわち、わずか１１．７秒の滞留時間）でのミオグロビンの消化によっても示された。次いで、消化産物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて特徴付けられ、可能性のある１５３のペプチド断片の内の１０２が同定されたため、配列決定の可能範囲は６７％となった。
【００６６】
微小総合分析システム（Ｐｔａｓ）を創出するために、新しい微細加工分析デバイスの開発および統合に多大な努力が注がれてきた。これらのシステムは、フルサイズの設備に比べて、スループットの増大、サンプルおよび試薬の消費量の低下、小型化、および動作コストの低減を実現する。微小流体デバイスの様々な用途の中では、電気泳動、電気クロマトグラフィ、酵素を用いた分析、および免疫分析などの分析技術については、このフォーマットですでに実証されている。微小流体チップ技術の疑いのない成功にも関わらず、いくつかの問題が残っている。例えば、微小流体チップの大部分は、開チャネル構造を特徴とする。したがって、これらのチャネルは、比較的小さい表面対容量の比を示す。それらは、クロマトグラフィによる分離、固相抽出、および不均一触媒作用など、固体の表面との相互作用に依存する用途において深刻な問題になりうる。所望の相互作用を提供するために利用できるのはチャネルの壁だけなので、微小デバイスが取り扱うことのできるのは、微量な化合物だけである。
【００６７】
図１０Ｂは、二次元分析システムの利用を示す図である。モノリス１０２７が、バルブ１００１、１００３、および１００５を備えたポンプによって提供されるターゲットを補足すると、モノリス１０２７はシーリングされる。一例では、次に、各チャンバが加熱され、二本鎖ＤＮＡを溶かして一本鎖ＤＮＡ生成物を送り出す。様々な実施形態によると、精製は１２０秒実行され、最初の量３μＬから、わずか２０ｎＬまで、２００倍の濃縮が実現可能である。各ライン１０１１、１０１３、１０１５、１０１７、１０１９、および１０２１は、さらなる分析工程に向けて、捕捉されたターゲットを制御またはポンプ送出するためのバルブを備える。
【００６８】
一例では、捕捉されたターゲットは、試験デバイスにおいてＰＣＲおよびＣＥ分析を施される。捕捉されたターゲットは、加熱またはｐＨの変更などの機構を用いるＤＮＡ分析を施されてもよい。かかる統合試験デバイスの基本的な特徴は、以下の通りである。１）微細加工されたヒータと温度センサとを備えるよう、ガラス基板にエッチングされた免疫捕捉チャンバ、２）対象となる細胞の溶解で得られたＤＮＡの増幅のための１００ ３００ｎＬのポリメラーゼ連鎖反応チャンバ、および、３）ＰＣＲ増幅産物の分離および検出のためにガラス基板にエッチングされたキャピラリ電気泳動用の微小チャネル。
【００６９】
必要であれば、放出された病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されたＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、随意的な４番目の構成要素、すなわち、統合ＤＮＡ事前濃縮／浄化チャンバがデバイスに追加されてもよい。分析を成功させるためにＣＥ微小チャネルに直接的にＰＣＲ増幅産物を注入して、上述のように複雑さを増す必要性を避けることが可能であると以前の研究から示されているが、質の高い電気泳動像を得るためには、かかる精製が必要になりうる。この増幅産物の精製は、オリゴヌクレオチド捕捉マトリクス薬剤を用いることにより可能になる。ゲノムＤＮＡを精製する必要がある場合には、浄化チャンバは、カルボン酸シリカビーズで満たされ、ＰＣＲの前の細菌ＤＮＡのための一般的な捕捉マトリクスとして用いられてよい。
【００７０】
統合の１つの方法は、免疫捕捉、テンプレート精製、ＰＣＲ、増幅産物の浄化、およびＣＥを、ガラスチップ上に別個のモジュールとして単に加工する方法である。次に、それらのモジュールは、微小チャネルおよび様々なＰＤＭＳバルブ構造を用いて互いに接続される。別個の免疫捕捉およびＰＣＲ反応炉を備えるよう構成された病原体分析チップの図が、図１１に示されている。統合された病原体検出システムは、免疫親和捕捉チャンバ１１０１を備える。検体が、免疫捕捉チャンバ１１０１を通して病原体検出システム内に導入される。ＰＣＲチャンバ１１０３が、免疫親和捕捉チャンバ１１０１に接続され、免疫親和捕捉チャンバ１１０１によって捕捉されたターゲットを受け入れる。さらなる分析のために、ＰＣＲチャンバ１１０３に、ＣＥチャネル１１０５が接続される。微細加工された電極１１１３は、電位差を提供するよう動作可能である。さらに、免疫捕捉チャンバおよび／またはＰＣＲチャンバに接続されたヒータ（図示せず）が提供される。様々なバルブが、統合システムを通る被分析物の流れを制御する。様々な実施形態によると、それらのバルブは、モノリシックバルブである。
【００７１】
免疫捕捉、ＰＣＲ、ＣＥ、および浄化を、１つのデバイス上に別個のモジュールとして提供することは、妥当な方法であるが、様々な実施形態に従って促進されるＤＮＡ断片の捕捉効率、ＰＣＲ効率、および高感度の分離と検出によると、比較的複雑でないデバイスを用いることも可能であることが示唆される。免疫捕捉およびＰＣＲは、別個のチャンバで実行することも可能であるが、一例では、デバイスおよびプロセスを簡略化するために、それらを組み合わせることもできる。この例では、固体の基質と、固相の免疫捕捉試薬から、ＰＣＲを良好に実行できる。一例では、免疫標識されたビーズを用いて、ＰＣＲを実行できる。
【００７２】
図１２は、組み合わされた免疫捕捉およびＰＣＲチャンバ１２０１を示す図である。様々な実施形態によると、組み合わされたチャンバは、ナノリットルチャンバ内に加工された統合抵抗加熱機構（図示せず）と抵抗温度検出器（ＲＴＤ）１２０５とを有する。一部の例では、被分析物は、入力１２１１と膜バルブ１２２１とを通して導入される。対象となる病原体は、圧力による流れを用いてチャンバ１２０１内に固定され、廃棄物は、バルブ１２２３を通して出力１２１３において収集される。病原体が固定されると、チャンバ１２０１は、緩衝液で流され、緩やかに固着した細胞や非特異的に結合した物質が除去される。
【００７３】
ＰＣＲ緩衝液は、元々の標本注入口１２１１または別個の専用注入口を通して導入される。チャンバ１２０１内の対象となる病原体に応じて、化学的な溶解剤が、ＰＣＲ緩衝液に直接導入されることが可能である。溶解試薬および／またはＰＣＲ緩衝液の導入後、捕捉／ＰＣＲチャンバの統合ヒータ１２０３は、複数の病原体が、捕捉マトリクスから同時に放出され、薬剤の種類に応じて溶解される温度まで、標本の温度を上昇させるために用いられる。
【００７４】
最も簡単で、しばしば最も効果的な溶解方法は、加熱／冷却のサイクルを単純に繰り返す方法である。グラム陰性菌および一部の真核細胞は、比較的薄い外膜を持っており、加熱のみ、または、低濃度の化学的な溶解溶液を伴った加熱による溶解の影響を比較的受けやすい。胞子またはグラム陽性菌など、一部の場合には、ＰＣＲを妨げるほどの比較的強力な溶解剤が必要になる場合もある。例えば、一部の処理しにくいグラム陽性のブドウ球菌および連鎖球菌の株を溶解するためには、一般に、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、リソスタフィン、およびムタノリシンを別個または組み合わせて用いる必要がある。これらの場合には、別個の免疫捕捉チャンバを用いると共に、浄化／事前濃縮チャンバを追加することで、細胞の溶解後、ＰＣＲの増幅前に、ＤＮＡを途中で捕捉することが可能になる。
【００７５】
このシナリオでは、捕捉および溶解に続いて、カルボキシルビーズに吸着させることにより貯蔵するために、抽出されたＤＮＡを、電気泳動によって浄化チャンバ内に移動させることができる。精製されたＤＮＡは、熱またはイオン強度のばらつきを用いて浄化チャンバから放出され、増幅のために電気泳動的にＰＣＲチャンバ内に移動されることが可能である。溶解された細胞に由来するＤＮＡが、ＰＣＲ緩衝液を有するチャンバに供給されると、微細加工されたヒータおよび温度センサを用いて、放出された遺伝物質に対して、直接的にＰＣＲを実行することができる。
【００７６】
一部の場合では、捕捉およびＰＣＲために単一のチャンバを併用することは、複雑さやＰＣＲの妨害となるために問題があることに注意されたい。これら特定の場合には、２つの段階を簡単に分離することができる。一部の例では、これは、捕捉マトリクスすなわちビーズの存在がＰＣＲ反応を妨害する場合、または、入力された標本が、洗浄または中和のできないＰＣＲの阻害物をもたらす場合に実行されてよい。この場合、放出されたＤＮＡは、捕捉チャンバ内の溶解された細菌から、分析のための別個のＰＣＲ反応炉に、ポンプまたは電気泳動によって送られてよい。
【００７７】
ＰＣＲが完了すると、分離マトリクス内の挿入色素または蛍光標識されたプライマと、所望の解像度に応じた変性分離マトリクスとを用いて、分離および検出するために、直接的にＣＥ微小チャネルに増幅産物を注入できる。一部の場合には、ＣＥ微小チャネルに注入する前に、増幅されたＤＮＡを脱塩および濃縮するために、ＤＮＡ浄化チャンバが導入される。浄化は、増幅されたＤＮＡを電気泳動によって浄化チャンバ内に移動させ、そこで、カルボキシル化されたビーズまたはオリゴヌクレオチド捕捉マトリクス（所望のターゲットと相補的な捕捉用のオリゴ）に結合させることにより実現される。結合後には、洗浄と、微小ヒータによる温度依存の放出とが続き、次いで、分離および検出のために、ＣＥ微小チャネルの注入クロスを通して、濃縮および脱塩されたＰＣＲ増幅産物の電気泳動が実行される。
【００７８】
モノリシック膜バルブを用いて病原体検出および分析システムを構築するためのデバイス構成は、大幅に変更されてもよい。図１３Ａは、病原体検出および分析システムのための設計の一例を示す図である。その設計は、チャネル層１３０３と、ビア層１３０５と、マニホルド層１３０９とを含む３つのガラス層を備える。ビア層１３０５とマニホルド層１３０９との間には、ＰＤＭＳ膜層が設けられる。マニホルド層１３０９は、膜１３０７に真空圧を作用させて、バルブ機構の制御を実現する機構を備える。
【００７９】
層１３０１には、電気的な接続が提供され、層１３１１には、マニホルドチャック層が備えられる。チャネル層１３０３は、免疫捕捉／ＰＣＲ／浄化チャンバおよびＣＥ微小チャネルと、ウエハの上面のヒータとを備える。様々な実施形態によると、チャネル層１３０３は、バルブのビアとして機能するドリルで空けられたガラスの穴を含む薄いガラスウエハ１３０５に熱接着される。ＰＤＭＳバルブ／ポンプ膜１３０７は、この複数の層の積層体に対して、可逆的または不可逆的に接着される。底面をエッチングされたマニホルド層１３０９は、真空または圧力を、デバイス上のバルブおよびポンプに伝える。
【００８０】
既存の薄膜技術を用いて、温度制御素子を形成することで、試験デバイスを構築するための実行可能な第１の方法を提供できる。しかしながら、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）のヒータを用いることにより、デバイスの加工の複雑さを低減できる。ＩＴＯヒータは、低い抵抗率、光透過性、およびガラス物質との適合性に定評がある。これらのヒータは、温度センサと同じウエハ上に蒸着されることが可能であるため、ヒータを形成するための背面の加工や電気メッキの必要性がなくなる。ヒータは、最適な熱伝導のためにチャンバ内に直接配置されてもよいし、ガラスウエハを介して熱エネルギを伝えるためにチャンバに向かって配置されてもよい。ＩＴＯの光透過性は、標本またはＰＣＲ増幅産物の視覚化または検出を妨害することなしに、流体微小チャネルの上に電気ヒータのリード線を引くことを可能にする。
【００８１】
図１３Ｂは、様々な実施形態に従って、微細加工プロセスを示す図である。図の１３８１および１３８３に、微細加工プロセスが示されている。一部の例では、カリフォルニア州サンノゼのＵＨＶ Ｓｐｕｔｔｅｉｎｇから入手可能なＤＣマグネトロンスパッタリングによって片面に２０００Åのアモルファスシリコン層をスパッタ蒸着する前に、ガラスウエハ（ニューヨーク州ヨンカーズのＳｃｈｏｔｔから入手可能な５５０μｍ厚のＤ２６３）を洗浄する。マサチューセッツ州マールボロのＳｈｉｐｌｅｙ １８１８から入手可能なフォトレジストがスピンコーティングされて、バーモント州ウォーターベリーセンターのＫａｒｌ Ｓｕｓｓから入手可能な接触式アライナを用いてフォトリソグラフィでパターン化され、下層のシリコンエッチングマスクは、フロリダ州セントピーターズバーグのＰｌａｓｍａ Ｔｈｅｒｍから入手可能な平行板反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）システム内でＳＦ６を用いて選択的に除去される。
【００８２】
一部の例では、流体チャネル、電気泳動チャネル、およびＰＣＲチャンバが、４９％のフッ化水素酸の中で３６μｍの深さまでエッチングされる。容器アクセス穴（直径１．５ｍｍ）と、ＰＤＭＳバルブ用の流体ビアホール（直径０．０２”）が、カリフォルニア州メンロパークのＦｌａｓｈｃｕｔ ＣＮＣから入手可能なＣＮＣミル（先端がダイヤモンドになったドリル用ビットを備える）を用いて空けられる。次いで、ウエハは、ウエハダイシング装置を用いてダイシングされ、２つの２０ｍｍ×７５ｍｍのスライドが形成される。
【００８３】
ＲＴＤおよび電極を形成するために、最初に、２００ÅのＴｉおよび２０００ÅのＰｔ（ＵＨＶ）で、５５０μｍ厚のＤ２６３ウエハをスパッタコーティングすることができる。マサチューセッツ州マールボロのＳｈｉｐｌｅｙ（ＳＪＲ５７４０）から入手可能な厚いフォトレジストがスピンコーティングされ、バーモント州ウォーターベリーセンターのＫａｒｌ Ｓｕｓｓから入手可能な接触式アライナを用いてパターン化される。様々な実施形態によると、フォトレジストは、７０℃で２時間、強く焼成される。ＲＴＤ素子を形成するために、高温の王水（ＨＣｌ：ＨＮＯ３の比が３：１で、９０℃）を用いて、金属をエッチングすることが可能である。統合ヒータは、まず、マサチューセッツ州ウェルズリーのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＲＦスパッタリングを用いて、複数層の薄膜すなわち２００ÅのＴｉおよび２０００ÅのＰｔを、ＲＴＤウエハの背面に蒸着することにより形成される。その面に、厚いフォトレジストがスピンコーティングされ、ウエハは、背面接触式アライナ（Ｓｕｓｓ）を用いてパターン化され、強く焼成される。Ｔｉ／Ｐｔシード層の上には、カリフォルニア州アナハイムのＴｅｃｈｎｉｃ（ＴＧ２５Ｅ）から入手可能な亜硫酸金メッキ溶液を用いて、４．３ｍＡ／ｃｍ２で２３分間、５μｍの厚さまで電気蒸着され、ヒータのリード線が形成される。
【００８４】
様々な実施形態によると、フォトレジストは除去されて、背面は、厚いフォトレジストを用いて再びパターン化される。加熱素子は、ニューヨーク州プレインビューのＶｅｅｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能なイオンビームエッチングシステムを用いて、Ｔｉ／Ｐｔシード層にエッチングされる。ＲＴＤ／ヒータウエハは、２つの２５ｍｍ×７５ｍｍスライドにダイシングされる（Ｄｉｓｃｏ）。一部の例では、ドリルで穴を空けられたチャネルウエハは、カリフォルニア州ユカイパのＣｅｎｔｕｒｉｏｎ ＶＰＭ，Ｊ．Ｍ．Ｎｅｙから入手できるプログラム可能な真空炉を用いて、ＲＴＤ／ヒータウエハに熱接着される。
【００８５】
１つの基板に、免疫捕捉、ＰＣＲ、およびＣＥのための１つのシステムを備えてもよいが、本発明の技術によると、臨床検査で利用するためには、免疫捕捉、ＰＣＲ、およびＣＥのための並列システムを開発することが効率的である可能性が認識されている。一例では、携帯型の病原体分析器は、標本内の３つの異なる病原体を対象とする３つの直列の免疫捕捉／ＰＣＲシステムを備える。３つのシステムのための流体制御システム、ヒータ用の電気回路、温度センサ、および電気泳動の並列化は容易であり、１つの顕微鏡用スライドの有する表面積でも十分に、３つの完全な並列システムを加工できる。
【００８６】
別の例では、臨床検査で利用するための大規模並列の免疫捕捉／ＰＣＲシステムが提供されている。複数の人物または複数グループの人物にわたって、複数の異なる感染体を分析できることから、感染体を同定して疫学的に追跡するための強力な方法となる。図１４は、放射状に並列された免疫捕捉／ＰＣＲデバイス１４００の一部を示す図である。本明細書では、円の軸の周りに配列された複数の免疫捕捉およびＤＮＡ分析の機構を有する任意のシステムまたはデバイスを、放射状の並列デバイスと呼ぶこととする。
【００８７】
様々な実施形態によると、この設計は、ＣＥ分析器と一体化された独自の免疫捕捉／ＰＣＲチャンバ１４２３をそれぞれ備える複数の対の分析器の配列を備える。標本は、そのデバイスの所与のサブセット内のすべてのチャンバを順次通過するため、複数の感染体が順次捕捉される。そのデバイスの備える個々のサブセット１４０１、１４０３、１４０５、１４０７、１４０９、１４１１は、異なる物質を並列で分析することができる。容器１４４７および１４４５は、ビーズ入力およびビーズ廃棄を実現する。容器１４４３および１４４１は、それぞれ、共通のキャピラリ電気泳動の陰極の容器および廃棄の容器となる。
【００８８】
チャンバは、カスケード式の免疫親和捕捉を行うために相互接続される。バルブ１４３１および１４３３は、カスケードループ上のチャンバをシーリングする。バルブ１４３５および１４３７は、ビーズ導入および廃棄のためのチャネルから、チャンバをシーリングする。ＣＥ微小チャネルは、周知の回転式共焦点蛍光スキャナ（図示せず）を用いて検出を行うために、共通の中央陽極に接続される。捕捉チャンバ１４２３と、リード線１４５１を有するヒータとの組み合わせの平行配列が提供され、バルブおよびポンプの頑丈な配列が構築されている。チャンバ１４２３に関連するヒータおよび温度センサは、分析チャネルにおいて並列で動作するため、単純なリング状のヒータを用いれば十分である。そのため、個々のヒータおよび温度センサは、効率的かつ効果的な並列病原体検出システムを提供するためには、もはや必要ない。
【００８９】
構成要素およびプロセスの多くは、便宜上、単数で記述したが、本発明の技術を実施するために、複数の構成要素やプロセスの反復を用いてもよいことは、当業者にとって明らかなことである。
【００９０】
本発明は、具体的な実施形態を参照して詳細に図示および記載されているが、本発明の趣旨や範囲から逸脱せずに、開示された実施形態の形態および詳細事項を変更することができることも、当業者にとって明らかなことである。例えば、上述の実施形態は、様々な材料を用いて実施されてよい。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体検出システムであって、
微小流体デバイスに統合されている免疫捕捉チャンバであって、微小流体チャネルを通して前記免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる免疫捕捉チャンバと、
前記免疫捕捉チャンバと関連付けられているＤＮＡ分析機構であって、前記微小流体デバイスに統合され、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行することができるＤＮＡ分析機構と、を備える、病原体検出システム。
【請求項２】
請求項１に記載の病原体検出システムであって、前記ＤＮＡ分析機構は、ＰＣＲとＣＥとを備える、病原体検出システム。
【請求項３】
請求項２に記載の病原体検出システムであって、前記免疫捕捉チャンバとは別のチャンバに、ＰＣＲが備えられている、病原体検出システム。
【請求項４】
請求項２に記載の病原体検出システムであって、前記免疫捕捉チャンバに、ＰＣＲが備えられている、病原体検出システム。
【請求項５】
請求項２に記載の病原体検出システムであって、前記ＰＣＲ用のチャンバは、対象となる前記ターゲットを溶解して得られるＤＮＡを増幅するために用いられる、病原体検出システム。
【請求項６】
請求項３に記載の病原体検出システムであって、さらに、ＰＣＲの増幅産物を分離および検出するために、エッチングされているキャピラリ電気泳動微小チャネルを備える、病原体検出システム。
【請求項７】
請求項６に記載の病原体検出システムであって、さらに、放出されている病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、前記ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されているＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、ＤＮＡ事前濃縮および浄化チャンバを備える、病原体検出システム。
【請求項８】
病原体検出システムであって、
微小流体デバイスに統合されている免疫捕捉手段であって、微小流体チャネルを通して供給されるターゲットを捕捉することができる免疫捕捉手段と、
前記免疫捕捉手段と関連付けられているＤＮＡ分析手段であって、前記微小流体デバイスに統合され、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行することができるＤＮＡ分析手段と、を備える、病原体検出システム。
【請求項９】
請求項８に記載の病原体検出システムであって、前記ＤＮＡ分析手段は、前記免疫捕捉手段とは別のＰＣＲチャンバを備える、病原体検出システム。
【請求項１０】
請求項９に記載の病原体検出システムであって、前記ＰＣＲチャンバは、対象となる前記ターゲットを溶解して得られるＤＮＡを増幅するために用いられる、病原体検出システム。
【請求項１１】
モノリシックデバイス上の病原体検出システムであって、
前記モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバであって、微小流体チャネルを通して前記免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる複数の免疫捕捉チャンバと、
前記免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構であって、前記モノリシックデバイスに統合され、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行することができる複数のＤＮＡ分析機構と、を備える、病原体検出システム。
【請求項１２】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記複数のＤＮＡ分析機構は、ＰＣＲとＣＥとを備える、病原体検出システム。
【請求項１３】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記複数の免疫捕捉チャンバとは別のチャンバで、ＰＣＲが実行される、病原体検出システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載の病原体検出システムであって、さらに、ＰＣＲの増幅産物を分離および検出するために、複数のエッチングされているキャピラリ電気泳動微小チャネルを備える、病原体検出システム。
【請求項１５】
請求項１４に記載の病原体検出システムであって、さらに、放出されている病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、前記ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されているＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、複数の組み込みＤＮＡ事前濃縮および浄化チャンバを備える、病原体検出システム。
【請求項１６】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記免疫捕捉チャンバは、さらに、ターゲットを精製および濃縮することができる、病原体検出システム。
【請求項１７】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記複数の微細加工されている免疫捕捉チャンバは、選択されている抗体を保持するよう構成されている、病原体検出システム。
【請求項１８】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記選択されている抗体は、ビーズ、フリット、ゾル・ゲル、ゲル、またはポリマモノリスによって保持される、病原体検出システム。
【請求項１９】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記選択されている抗体は、前記捕捉チャンバ内に直接形成されている多孔質の表面で機能化されたポリマの成型ブロックによって保持される、病原体検出システム。
【請求項２０】
請求項１９に記載の病原体検出システムであって、前記成型ブロックは、モノマと多孔化剤とを含む前駆体混合物の光重合によって形成される、病原体検出システム。
【請求項２１】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記複数の免疫捕捉チャンバは、放射状に並列になるよう構成されている、病原体検出システム。
【請求項２２】
請求項２１に記載の病原体検出システムであって、さらに、前記複数の免疫捕捉チャンバに接続され、前記捕捉されたターゲットを放出するために前記複数の免疫捕捉チャンバを加熱することができるリング状のヒータを備える、病原体検出システム。
【請求項２３】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記複数の免疫捕捉チャンバは、ガラス層の上に構成されている、病原体検出システム。
【請求項２４】
請求項２３に記載の病原体検出システムであって、前記ガラス層は、モノリシック膜層に結合されている、病原体検出システム。
【請求項２５】
請求項２３に記載の病原体検出システムであって、前記ガラス層は、流体の流路を提供できる複数のエッチングされているチャネルを備える、病原体検出システム。
【請求項２６】
請求項２５に記載の病原体検出システムであって、前記ガラス層と空気層とが、前記膜層を挟んでいる、病原体検出システム。
【請求項２７】
病原体分析のための方法であって、
モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバに、微小流体チャネルを通じて被分析流体を供給する工程と、
前記免疫捕捉チャンバにおいて、前記被分析流体に関連するターゲットを捕捉する工程と、
前記複数の免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を用いて、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行する工程とを備え、前記複数のＤＮＡ分析機構は、前記モノリシックデバイスに統合されている、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記複数のＤＮＡ分析機構は、ＰＣＲとＣＥとを備える、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、前記複数の免疫捕捉チャンバとは別のチャンバに、ＰＣＲ機構が備えられている、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記複数のＤＮＡ分析機構は、対象となる前記ターゲットを溶解して得られるＤＮＡを増幅するためのＰＣＲチャンバを備える、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の病原体検出システムであって、さらに、ＰＣＲの増幅産物を分離および検出するために、複数のエッチングされているキャピラリ電気泳動微小チャネルを備える、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、さらに、放出されている病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、前記ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されているＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、複数の組み込みＤＮＡ事前濃縮および浄化チャンバを備える、方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法であって、前記免疫捕捉チャンバは、さらに、ターゲットを精製および濃縮することができる、方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法であって、前記複数の微細加工されている免疫捕捉チャンバは、選択されている抗体を保持するよう構成されている、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記選択されている抗体は、ビーズ、ゾル・ゲル、ゲル、またはポリマモノリスによって保持される、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記選択されている抗体は、前記捕捉チャンバ内に直接形成されている多孔質の表面で機能化されたポリマの成型ブロックによって保持される、方法。
【請求項３７】
病原体を検出するための装置であって、
モノリシックデバイスに組み込まれている複数の免疫捕捉チャンバに、微小流体チャネルを通じて被分析流体を供給する手段と、
前記被分析流体に関連するターゲットを捕捉する手段と、
前記複数の免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を用いて、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行する手段とを備え、前記複数のＤＮＡ分析機構は、前記モノリシックデバイスに統合されている、装置。
【請求項１】
病原体検出システムであって、
微小流体デバイスに統合されている免疫捕捉チャンバであって、微小流体チャネルを通して前記免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる免疫捕捉チャンバと、
前記免疫捕捉チャンバと関連付けられているＤＮＡ分析機構であって、前記微小流体デバイスに統合され、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行することができるＤＮＡ分析機構と、を備える、病原体検出システム。
【請求項２】
請求項１に記載の病原体検出システムであって、前記ＤＮＡ分析機構は、ＰＣＲとＣＥとを備える、病原体検出システム。
【請求項３】
請求項２に記載の病原体検出システムであって、前記免疫捕捉チャンバとは別のチャンバに、ＰＣＲが備えられている、病原体検出システム。
【請求項４】
請求項２に記載の病原体検出システムであって、前記免疫捕捉チャンバに、ＰＣＲが備えられている、病原体検出システム。
【請求項５】
請求項２に記載の病原体検出システムであって、前記ＰＣＲ用のチャンバは、対象となる前記ターゲットを溶解して得られるＤＮＡを増幅するために用いられる、病原体検出システム。
【請求項６】
請求項３に記載の病原体検出システムであって、さらに、ＰＣＲの増幅産物を分離および検出するために、エッチングされているキャピラリ電気泳動微小チャネルを備える、病原体検出システム。
【請求項７】
請求項６に記載の病原体検出システムであって、さらに、放出されている病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、前記ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されているＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、ＤＮＡ事前濃縮および浄化チャンバを備える、病原体検出システム。
【請求項８】
病原体検出システムであって、
微小流体デバイスに統合されている免疫捕捉手段であって、微小流体チャネルを通して供給されるターゲットを捕捉することができる免疫捕捉手段と、
前記免疫捕捉手段と関連付けられているＤＮＡ分析手段であって、前記微小流体デバイスに統合され、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行することができるＤＮＡ分析手段と、を備える、病原体検出システム。
【請求項９】
請求項８に記載の病原体検出システムであって、前記ＤＮＡ分析手段は、前記免疫捕捉手段とは別のＰＣＲチャンバを備える、病原体検出システム。
【請求項１０】
請求項９に記載の病原体検出システムであって、前記ＰＣＲチャンバは、対象となる前記ターゲットを溶解して得られるＤＮＡを増幅するために用いられる、病原体検出システム。
【請求項１１】
モノリシックデバイス上の病原体検出システムであって、
前記モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバであって、微小流体チャネルを通して前記免疫捕捉チャンバに供給されるターゲットを捕捉することができる複数の免疫捕捉チャンバと、
前記免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構であって、前記モノリシックデバイスに統合され、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行することができる複数のＤＮＡ分析機構と、を備える、病原体検出システム。
【請求項１２】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記複数のＤＮＡ分析機構は、ＰＣＲとＣＥとを備える、病原体検出システム。
【請求項１３】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記複数の免疫捕捉チャンバとは別のチャンバで、ＰＣＲが実行される、病原体検出システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載の病原体検出システムであって、さらに、ＰＣＲの増幅産物を分離および検出するために、複数のエッチングされているキャピラリ電気泳動微小チャネルを備える、病原体検出システム。
【請求項１５】
請求項１４に記載の病原体検出システムであって、さらに、放出されている病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、前記ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されているＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、複数の組み込みＤＮＡ事前濃縮および浄化チャンバを備える、病原体検出システム。
【請求項１６】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記免疫捕捉チャンバは、さらに、ターゲットを精製および濃縮することができる、病原体検出システム。
【請求項１７】
請求項１１に記載の病原体検出システムであって、前記複数の微細加工されている免疫捕捉チャンバは、選択されている抗体を保持するよう構成されている、病原体検出システム。
【請求項１８】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記選択されている抗体は、ビーズ、フリット、ゾル・ゲル、ゲル、またはポリマモノリスによって保持される、病原体検出システム。
【請求項１９】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記選択されている抗体は、前記捕捉チャンバ内に直接形成されている多孔質の表面で機能化されたポリマの成型ブロックによって保持される、病原体検出システム。
【請求項２０】
請求項１９に記載の病原体検出システムであって、前記成型ブロックは、モノマと多孔化剤とを含む前駆体混合物の光重合によって形成される、病原体検出システム。
【請求項２１】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記複数の免疫捕捉チャンバは、放射状に並列になるよう構成されている、病原体検出システム。
【請求項２２】
請求項２１に記載の病原体検出システムであって、さらに、前記複数の免疫捕捉チャンバに接続され、前記捕捉されたターゲットを放出するために前記複数の免疫捕捉チャンバを加熱することができるリング状のヒータを備える、病原体検出システム。
【請求項２３】
請求項１７に記載の病原体検出システムであって、前記複数の免疫捕捉チャンバは、ガラス層の上に構成されている、病原体検出システム。
【請求項２４】
請求項２３に記載の病原体検出システムであって、前記ガラス層は、モノリシック膜層に結合されている、病原体検出システム。
【請求項２５】
請求項２３に記載の病原体検出システムであって、前記ガラス層は、流体の流路を提供できる複数のエッチングされているチャネルを備える、病原体検出システム。
【請求項２６】
請求項２５に記載の病原体検出システムであって、前記ガラス層と空気層とが、前記膜層を挟んでいる、病原体検出システム。
【請求項２７】
病原体分析のための方法であって、
モノリシックデバイスに統合されている複数の免疫捕捉チャンバに、微小流体チャネルを通じて被分析流体を供給する工程と、
前記免疫捕捉チャンバにおいて、前記被分析流体に関連するターゲットを捕捉する工程と、
前記複数の免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を用いて、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行する工程とを備え、前記複数のＤＮＡ分析機構は、前記モノリシックデバイスに統合されている、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記複数のＤＮＡ分析機構は、ＰＣＲとＣＥとを備える、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、前記複数の免疫捕捉チャンバとは別のチャンバに、ＰＣＲ機構が備えられている、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記複数のＤＮＡ分析機構は、対象となる前記ターゲットを溶解して得られるＤＮＡを増幅するためのＰＣＲチャンバを備える、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の病原体検出システムであって、さらに、ＰＣＲの増幅産物を分離および検出するために、複数のエッチングされているキャピラリ電気泳動微小チャネルを備える、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、さらに、放出されている病原体ゲノムＤＮＡを精製するため、または、前記ＣＥ微小チャネルへの注入の前に、増幅されているＤＮＡを脱塩および事前濃縮するために、複数の組み込みＤＮＡ事前濃縮および浄化チャンバを備える、方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法であって、前記免疫捕捉チャンバは、さらに、ターゲットを精製および濃縮することができる、方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法であって、前記複数の微細加工されている免疫捕捉チャンバは、選択されている抗体を保持するよう構成されている、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記選択されている抗体は、ビーズ、ゾル・ゲル、ゲル、またはポリマモノリスによって保持される、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記選択されている抗体は、前記捕捉チャンバ内に直接形成されている多孔質の表面で機能化されたポリマの成型ブロックによって保持される、方法。
【請求項３７】
病原体を検出するための装置であって、
モノリシックデバイスに組み込まれている複数の免疫捕捉チャンバに、微小流体チャネルを通じて被分析流体を供給する手段と、
前記被分析流体に関連するターゲットを捕捉する手段と、
前記複数の免疫捕捉チャンバと関連付けられている複数のＤＮＡ分析機構を用いて、前記ターゲットに対してＤＮＡ分析を実行する手段とを備え、前記複数のＤＮＡ分析機構は、前記モノリシックデバイスに統合されている、装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−２３４７２８（Ｐ２０１１−２３４７２８Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１５５３００（Ｐ２０１１−１５５３００）
【出願日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【分割の表示】特願２００５−５０８６２８（Ｐ２００５−５０８６２８）の分割
【原出願日】平成１５年１２月２９日（２００３．１２．２９）
【出願人】（５０１０３５０７７）ザ・リージェンツ・オブ・ジ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５５３００（Ｐ２０１１−１５５３００）
【出願日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【分割の表示】特願２００５−５０８６２８（Ｐ２００５−５０８６２８）の分割
【原出願日】平成１５年１２月２９日（２００３．１２．２９）
【出願人】（５０１０３５０７７）ザ・リージェンツ・オブ・ジ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア (6)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【Ｆターム（参考）】
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