癌マーカー用生物合成結合蛋白質
【課題】ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合する免疫グロブリンの免疫学結合特性を示す結合部位を特定する一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドを提供すること。
【解決手段】ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合する免疫グロブリンの免疫学結合特性を示す結合部位を特定する一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドを開示する。ｓＦｖは、１つのドメインのＣ末端と他のドメインのＮ末端の間の距離をつなぐポリペプチドリンカーによって結合されている少なくとも２つのポリペプチドドメインを含む。ポリペプチドドメインのそれぞれのアミノ酸配列はフレームワーク領域の間の挿入された一組の相補的決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、そのＣＤＲｓはｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に免疫学結合に関与する。
【解決手段】ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合する免疫グロブリンの免疫学結合特性を示す結合部位を特定する一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドを開示する。ｓＦｖは、１つのドメインのＣ末端と他のドメインのＮ末端の間の距離をつなぐポリペプチドリンカーによって結合されている少なくとも２つのポリペプチドドメインを含む。ポリペプチドドメインのそれぞれのアミノ酸配列はフレームワーク領域の間の挿入された一組の相補的決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、そのＣＤＲｓはｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に免疫学結合に関与する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（癌マーカー用生物合成結合蛋白質）
（発明の分野）
本発明は、一般的には、新規な生物合成組成物に関し、特に生物合成抗体結合部位（ＢＡＢＳ）の蛋白質とそれらの融合体に関する。本発明の組成物は、例えば薬剤や毒物を用いた種々の癌の免疫学的治療やターゲッティング、イメージングに有用であり、さらに特異的なバインディングアッセイ、アフィニティーによる精製法および生体触媒として有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
乳癌は、北米では女性の最も多い悪性疾患であり、１９８７年には１３０，０００人の新患者が発生している。おおよそ女性は１１人に１人の割合での一生の間に、乳癌が発生し、米国の女性にとっては、肺癌に次いで第２位の癌による死亡の原因となっている。乳癌女性の大多数は完全に切除可能疾患であったにもかかわらず、転移病巣が残存しており、完治させるためには障害となる。補助化学療法やホルモン療法は、病巣のない場合の延命と、完全切除の乳癌女性の特定の群の全体的な延命に対して明らかな有効性を示が、一般的な女性の場合は、未だに転移病巣によって悪い状態のままである（Ｆｉｓｈｅｒ他，１９８６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，４：９２９−９４１；”Ｔｈｅ Ｓｃｏｔｔｉｓｈ ｔｒｉａｌ”，Ｌａｎｃｅｔ，１９８７，２：１７１−１７５）。適切に選定された患者に対する化学療法やホルモン療法によって、正しく誘導性の目的とする応答が起こったとしても、転移性乳癌の完治は達成されない（Ａｉｓｎｅｒ他，１９８７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，５：１５２３−１５３３）。この目的のために、新しい薬剤の使用、薬剤の併用、高容量療法（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ他 同上）や投与量増強療法（Ｋｅｒｎａｎ他、１９８８、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２５９ ：３１５４−３１５７）を含む革新的な治療計画が多用されている。改善は認められてはいるが、完治への最初のステップである転移病巣の完全な寛解の一般的な達成は未だ得られていない。治療のための新しいアプローチが求められている。
【０００３】
免疫グロブリンのＦｖフラグメント分子はＩｇＭおよびまれな場合にはＩｇＧあるいはＩｇＡなどから蛋白分解によって調製できる。さらにこのＦｖフラグメントは通常の抗原結合部位に存在する非共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロダイマーを有している。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって結合したＶＨとＶＬをコードする遺伝子を含む融合遺伝子の発現される共有的に結合したＶＨ−ＶＬヘテロダイマーである。引用により本発明と一体となっているＨｕｓｔｏｎ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．８５：５８７９の文献を参照のこと。
【０００４】
米国特許４，７５３，８９４号公報にはヒト乳癌細胞に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体が開示されており、リシンＡ鎖との融合体は、１０ｎＭ以下でＭＣＦ−７，ＣＡＭＡ−１，ＳＫＢＲ−３，ＢＴ−２０等の細胞の少なくとも１種に対して５０％のＴＣＩＤを示す。モノクローナル抗体５２０Ｃ９はＳＫＢＲ−３細胞を特異的に認識する。５２０Ｃ９の名称で特定された抗体はマウスハイブリドーマから分泌され、さらにｃ−ｅｒｂＢ−２を認識することが知られている （Ｒｉｎｇ他、１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２８：９１５）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドとして公知であった蛋白質のクラスの新規合成物を特徴としている。このポリペプチドは、生物合成一本鎖ポリペプチドの結合部位（ＢＡＢＳ）を含み、ｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合する免疫グロブリン分子の免疫学的結合特性を示す結合部位を特定している。
【０００６】
ｓＦｖは、ポリペプチドリンカーによって連結された少なくとも２つのポリペプチドからなり、一つのドメインのカルボキシ（Ｃ）末端と他のドメインのアミノ（Ｎ）末端をリンカーがつないでおり、それぞれのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、一セットのフレームワーク部位（ＦＲｓ）の間に挟まれている一セットの相補性決定部位（ＣＤＲｓ）を含み、ＣＤＲｓはｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に対する免疫学的結合に関与している。
【０００７】
その広範な目的において、本発明は、生物合成性抗体の結合部位を含む一本鎖Ｆｖポリペプチドを特徴としており、さらにはこれらのポリペプチドを含み、且つこれらのポリペプチドをコードするＤＮＡを発現することが可能である、組換えＤＮＡ技術によって調製された複製可能な発現ベクターにあり、さらにまた、これらのポリペプチドの生産方法、ｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原を発現している腫瘍をイメージングする方法およびこれらのポリペプチドを用いて、結合蛋白質や融合物の作用によるターゲッティング可能な治療剤を使用して腫瘍を治療する方法にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合する免疫グロブリン分子の免疫学的結合機能を有する結合部位で特定される一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドであって、該ｓＦｖが、一つのドメインのＣ末端と他の１つのＮ末端の間の距離をつなぐポリペプチドリンカーでつながっている少なくとも２つのポリペプチドドメインからなり、上記のポリペプチドドメインのそれぞれのアミノ酸配列が一組のフレームワーク領域（ＦＲｓ）の間に挿入された相補的決定領域（ＣＤＲｓ）からなり、該ＣＤＲｓが上記ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原への免疫学的結合性を与えるＣＤＲｓである、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチド、に関する。
【０００９】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ＣＤＲｓは、５２０Ｃ９、７４１Ｆ８、４５４Ｃ１１モノクローナル抗体からなる群から選択されるｃ−ｅｒｂＢ−２結合免疫グロブリン分子のＣＤＲｓと実質的にホモローガスである。
【００１０】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ｓＦｖの各ＣＤＲｓおよび各ＦＲｓのアミノ酸配列は、５２０Ｃ９抗体の可変領域のＣＤＲｓおよびＦＲｓのアミノ酸配列と実質的にホモローガスである。
【００１１】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ポリペプチドリンカーは、配列表配列番号４のアミノ酸残基番号１１８−１３３として配列表に示されているアミノ酸配列からなる。
【００１２】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ポリペプチドリンカーは、配列表配列番号６のアミノ酸残基１１６−１３５または配列表配列番号１５のアミノ酸残基１２２−１３５、およびアミノ酸配列配列表配列番号１２および配列表配列番号１４に示されているアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる。
【００１３】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、一本鎖Ｆｖポリペプチド
は、上記ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原を有する細胞のイメージングを可能にするために遠隔的に検出可能な成分が結合している。
【００１４】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記の遠隔的に検出可能な成分は放射性原子である。
【００１５】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記結合ドメインのＮまたはＣ末端に結合する第３のドメインは、ＦＲｓの間に挿入されたとＣＤＲｓを特定しかつ第二の免疫学的に活性な部位を特定するアミノ酸配列からなる。
【００１６】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、一本鎖Ｆｖポリペプチドは、さらに第四のポリペプチドドメインを含み、上記第三のドメインと第四のドメインがともに、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に免疫学的に結合する第二の部位からなる。
【００１７】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、一本鎖Ｆｖポリペプチドは、上記の結合したドメインのＮまたはＣ末端に結合した毒素をさらに含む。
【００１８】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記毒素は、シュードモナス エンドトキシン、リシン、リシンＡ鎖、フィトラシンおよびジフテリアトキシンからなる群から選択された毒性部分からなる。
【００１９】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記毒素は少なくともリシンＡ鎖の一部分からなる。
【００２０】
さらに本発明は、上記ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列、に関する。
【００２１】
さらに本発明は、次のステップからなるｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に特異性を有する一本鎖ポリペプチドを生産する方法、に関する：
（ａ）上記ＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして形質転換体を生産し、（ｂ）上記形質転換体を培養して上記一本鎖ポリペプチドを生産する。
【００２２】
さらに本発明は、次のステップからなるｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を発現する腫瘍をイメージングする方法、に関する：
（ａ）上記ポリペプチドからなるイメージング剤を準備し、（ｂ）イメージング剤が腫瘍に結合した後に上記腫瘍の体外検出を充分に可能にする量の上記イメージング剤を生理学的に受容可能なキャリアーとともに上記腫瘍をもつ哺乳動物に投与する、（ｃ）上記対象における遠隔的に検出可能な成分の位置を検出して上記腫瘍の像を得る。
【００２３】
さらに本発明は、上記ＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞、に関する。
【００２４】
さらに本発明は、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原発現腫瘍の成長をインビボで阻害する方法であって、上記一本鎖Ｆｖと少なくともそれに結合した第一の成分ペプチドからなり、該ペプチドが腫瘍細胞の増殖を抑制することのできるからなる治療剤を腫瘍を阻害する量投与することからなる方法、に関する。
【００２５】
本発明の上記方法の一つの実施形態において、上記第一の成分は細胞毒素またはその毒性フラグメントからなる。
【００２６】
本発明の上記方法の一つの実施形態において、上記第一の成分は上記腫瘍細胞の増殖を阻害するために充分な放射能活性をもつラジオアイソトープからなる。
【００２７】
さらに本発明は、上記ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列、に関する。
【００２８】
本発明の用語は以下に示すものである。”免疫学的結合”あるいは”免疫学的な反応性”とは免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的である抗原の間に起こる非共有性結合を意味する。”ｃ−ｅｒｂＢ−２”とは乳癌および卵巣癌細胞のような腫瘍細胞の表面に発現している蛋白抗原であって、等電点約５．３、分子量２００，０００の酸性糖蛋白質であり、配列表配列番号１および２に示したアミノ酸配列を含んでいるものを意味する。”ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原”とは、乳癌および卵巣癌細胞のような腫瘍細胞の表面に存在している蛋白質であって、ｃ−ｅｒｂＢ−２抗原と抗原特性的に関連したものである。即ちｃ−ｅｒｂＢ−２抗原に結合可能な免疫グロブリンであって、例えば５２０Ｃ９，７４１Ｆ８，４５４Ｃ１１抗体のような免疫グロブリンと結合する蛋白質、あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを持ち、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを持つ蛋白質である。ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原として上皮成長因子のレセプターを例示する。
【００２９】
免疫グロブリンＣＤＲに”実質的にホモーローガス”であるｓＦｖＣＤＲは、少なくとも免疫グロブリンＣＤＲのアミノ酸配列の少なくとも７０％好ましくは８０％または９０％が残存しており、免疫グロブリンの免疫学的な結合能を有しているものである。
【００３０】
”ドメイン（領域）”の用語は、天然のコンフォメーションでは単一な球状部分に折り畳まれたポリペプチドの配列を意味しており、個別の結合能あるいは機能特性であっても良い。ここで使用する”ＣＤＲ”あるいは相補的決定部位とは、結合親和性と天然の免疫グロブリン結合部位のナチュラルなＦｖ部分の特異性の両方で特定されるアミノ酸配列を意味しており、あるいはこの機能を模倣した合成ポリペプチドであっても良い。ＣＤＲｓは通常、ナチュラルなＦｖの高度可変領域に対しては全くホモロジーがない。しかし特異的なアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいても良い。このアミノ酸配列は高度可変領域の側面にあり、これまで相補性に直接係わらないフレームワークと考えられていた。”ＦＲ”またはフレームワーク部位（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）の用語は、ここでは免疫グロブリンのＣＤＲｓの中に通常認められるアミノ酸配列を意味する。
【００３１】
本発明に従って調製された一本鎖のＦｖポリペプチドは、あらかじめ選択されたｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはその関連抗原性物質に結合するためにデザインされた、ポリペプチドを定義付けている、生物合成的に調製されたアミノ酸の新規な配列を含んでいる。この合成ポリペプチドの構造は、天然に得られる抗体、そのフラグメント、公知の合成ポリペプチドの構造とは異なっており、また、結合の親和性と特異性に関与している一本鎖Ｆｖの部位（天然の抗体の可変領域（ＶＨ／ＶＬ）に対する変異体）を持つ”キメラ抗体”はそれ自身、キメラであっても良いが、この場合例えば同一か又は異なる種由来の、少なくとも２つの異なった抗体分子の一部とホモローガスかあるいは由来するアミノ酸配列を含むキメラ体である。この変異ＶＨとＶＬ領域は、生物合成性リンカーペプチドに結合したぺプチドを介して、一方のＮ末端から他方のＣ末端に結合している。
【００３２】
本発明は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合可能な、少なくとも一つの完全な結合部位で特徴づけられた一本鎖のＦｖポリペプチドを提供するものである。一つの完全な結合部位は、二つのポリペプチドドメイン、例えば一つのアミノ酸リンカー領域によって連結したＶＨとＶＬを有するアミノ酸の単一の連続した鎖を含むものである。２つの結合部位のようなｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に結合できる一つ以上の完全な結合部分を含んでいるｓＦｖは、４つのポリペプチドドメインを有する１本の連続したアミノ酸鎖であり、このドメインはそれぞれ相互にＶＨ１−リンカー−ＶＬ１−リンカー−ＶＨ２−リンカー−ＶＬ２のようにアミノ酸のリンカー部分を介して共有結合的につ
ながっている。本発明のｓＦｖは、（ＶＨｎ−リンカー−ＶＬｎ）ｎで表すことのできる複数の結合部位を含むことができる（ここでｎはｎ＞１）。さらに、このドメインはｎ個の抗原結合部位とｎ×２個のポリペプチドドメインを有する連続したアミノ酸の一本鎖とすることもできる。
【００３３】
本発明の好ましい実例において、一本鎖Ｆｖポリペプチドは第一の種由来の免疫グロブリン分子の可変部分のＣＤＲｓのアミノ酸配列の少なくとも一部分と基本的にホモローガスであるＣＤＲｓを含んでおり、さらに第二の種由来の免疫グロブリン分子の可変部分のＦＲｓのアミノ酸配列の少なくとも一部分と実質的にホモローガスであるＦＲｓを含んでいる。好ましくは、第一の種はマウスであり、第二の種はヒトである。
【００３４】
それぞれのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、一組のＦＲｓ間に挿入されている一組のＣＤＲｓを含んでいる。本発明においては、”ＣＤＲｓの組み合わせ”の一組は各ドメインの３ ＣＤＲｓを意味し、”ＦＲｓの組み合わせ”の一組は各ドメインの４ ＦＲｓを意味している。構造の検討のために、免疫グロブリン由来のＣＤＲｓの完全な一つの組み合わせが使用できるが、特定の残基の置換が生物学的活性を促進するためには好ましい。この生物学的活性はｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を結合する免疫グロブリンの種のＣＤＲｓ中に保存されている残基の観察に基づいている。
【００３５】
本発明の好ましいその他の実例においては、ポリペプチド鎖のＣＤＲｓは５２０Ｃ９，７４１Ｆ８，４５４Ｃ１１のモノクローナル抗体のいずれか一つの可変領域のＣＤＲｓに実質的にホモロ−ガスなアミノ酸配列を有している。５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓは配列表に示しており、配列表配列番号３および４のアミノ酸残基番号３１−３５、５０−６６、９９−１０４、１５９−１６９、１８５−１９１、２２４−２３２が対応している。
【００３６】
一つの実例ではｓＦｖはヒト型ハイブリッド分子であって、１またはそれ以上のヒト免疫グロブリン分子由来のＦＲｓの間に挿入されたマウス５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓを含んでいる。このハイブリッドｓＦｖは、このように、ヒトＦＲのアミノ酸配列によって適切な免疫化学的結合性コンフォメーションを保持している、ｃ−ｅｒｂＢ−２抗原またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に高い特異性のある結合部分を含んでいる。さらにまた、このハイブリッドｓＦｖは、ヒトの生体では異物として認識されないことが好ましい。
【００３７】
別の実例においては、ポリペプチドリンカー部分は、配列表配列番号３と４にアミノ酸残基番号１２３−１３７として配列を示しているアミノ酸配列、および配列表配列番号１１と１２にアミノ酸残基番号１−１６として配列を示しているアミノ酸配列を含んでいる。別の実例では、リンカー配列は、配列表配列番号９と１０にアミノ酸残基番号４１０−４２４として配列を示しているアミノ酸配列、および配列表配列番号１３と１４にアミノ酸残基番号１−１５として配列を示しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００３８】
さらに上記の一本鎖ポリペプチドは、それらに結合した遠隔的に検出可能な、ｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原を持った腫瘍のイメージングや放射化免疫療法に採用することのできる成分を含んでいることがある。“遠隔的に検出可能”な成分とは、ｓＦｖに結合した成分が外部およびその成分の部位から離れている場合でも検出できることを意味している。イメージングのために遠隔的に検出可能な成分として好ましくは、９９ｍテクネチュウム（９９ｍＴｃ）のようなガンマー線源である放射性原子を含むものを上げることができる。高容量の放射化免疫療法のための好ましいヌクレオチドとしては、９０イットリウム（９０Ｙｔ）、１３１ヨウ素（１３１Ｉ）、１１１インジュウム（１１１Ｉｎ）を含むものを上げることができる。
【００３９】
さらに、ｓＦｖは融合遺伝子に由来する融合蛋白質を含んでいることがある。この場合
発現ｓＦｖ融合蛋白質は結合性部位のポリペプチドにペプチド結合している補助的なポリペプチドを含んでいる。好ましい実例として、補助的ポリペプチドセグメントは、さらにまたｃ−ｅｒｂＢ−２あるいは関連抗原に結合親和性を有しており、三番目あるいはさらに四番目のポリペプチドドメインを含んでいてもよい。これらのポリペプチドドメインはＦＲｓの間に挿入されたＣＤＲｓを特定するアミノ酸配列から構成されており、そして上記の第一のポリペプチドに対すると同様な第二の一本鎖ポリペプチドの生物合成結合部位を一緒に形成する。
【００４０】
別の実例において、補助的なポリペプチド配列は、ｓＦｖのＮ末端またはＣ末端に対して結合した毒素を構成する。この毒素として、シュードモナスのエンドトキシンの毒素部分、フィトラシン、リシン、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素あるいはリシンＡ鎖様のリボゾーム性蛋白質阻害物として公知の蛋白質を上げることができる。リボゾームのレベルで蛋白質合成を阻害する蛋白質としては、ポークウイードの抗ウイルス性蛋白質、ゲロニン、大麦リボゾーム蛋白質阻害物などがある。その他の実例では、ｓＦｖは、ｓＦｖの内部組み込みを促進する、少なくとも第二のポリペプチドあるいは成分を含むことができる。
【００４１】
本発明は、さらにまたｓＦｖを調製するための方法を含み、この方法は、一本鎖のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、かつ、発現させる複製可能な発現ベクターを得るためのステップ、宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトし形質転換体を得、形質転換体を培養してｓＦｖポリペプチドを生産する方法からなっている。
【００４２】
本発明はさらにまた、ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連腫瘍抗原を発現している腫瘍をイメージングする方法を含む。この方法は、上記の一本鎖Ｆｖポリペプチドを含有するイメージング剤を投与するステップと遠隔的に検出可能な成分を結合させることからなる。この方法は、体外での腫瘍の検出を可能にするに充分な、製剤学的に許容されたキャリアーを用いたイメージング剤の、一定量を使用して、腫瘍のひそむ臓器にイメージング剤を投与し、薬剤が腫瘍に結合したことを確認して、そして腫瘍像の視覚化を行うために非結合剤を充分に排出させた後、患者における成分の分布を検出することからなる。
【００４３】
本発明は、さらにまたｃ−ｅｒｂＢ−２あるいは関連抗原の発現している腫瘍の増殖をインビボで抑制することによって癌を治療する方法を含む。この方法は、発明のｓＦｖを含む治療剤の腫瘍抑制量を癌患者に投与し、さらにすくなくとも最初のペプチド成分が腫瘍に結合し、腫瘍細胞の増殖を抑制させることを含む。
【００４４】
好ましくは最初の成分は毒素またはリシンＡのような毒素のフラグメントを含んでいる。さらにまた９０イットリウム（９０Ｙｔ）、１１１インジュウム（１１１Ｉｎ）、１３１ヨウ素（１３１Ｉ）のような腫瘍細胞の増殖を阻害するに充分な放射能活性を有する放射性同位元素を含んでいる。治療剤はさらにその有効性を促進するような第二の成分を少なくとも含んでいても良い。
【００４５】
本発明である天然型の活性を有し、対応する免疫グロブリンのＦｖよりも相対的に小さな、一本鎖のＦｖあるいは適切なｓＦｖ融合蛋白質の臨床的な投与は、より大きななフラグメントあるいは完全な抗体分子の使用と比較して多くの利点がある。本発明の一本鎖ＦｖおよびｓＦｖの融合蛋白質は、循環する蛋白分解酵素によって切断される部位を殆ど有していないため、非常に安定である。標的臓器に速やかに到達し、そして生体から速やかに排出されるため、腫瘍を検出するための理想的なイメージング剤であり、腫瘍を殺すための理想的な放射化免疫治療剤となる。
【００４６】
さらにまた、これらは非特異的な結合性がなく、マウス抗体に比べて抗原性が殆どない。さらに、単一の遺伝子からの発現は、その他の分子や薬剤と特異的にカップリングさせ
るその他の毒素蛋白質あるいはペプチド配列との融合によってターゲッティングへの応用が容易になる。さらに、本発明の幾つかのｓＦｖ誘導体または融合蛋白質は、細胞の表面にｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはその関連抗原と共通に結合した場合、腫瘍細胞の表面に発現したｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはその関連抗原の内在化を促進する作用を持つ。この方法は、適切なデザインの一本鎖−Ｆｖ−毒素の融合体を用いてこのような抗原の発現した細胞の選択的な死滅を可能にする。本発明のｓＦｖ −毒素融合蛋白質は、抗体全体あるいはＦａｂと化学的に交差結合させた毒素を含む共有結合体と比べて１５−２００倍以上も高い殺腫瘍細胞活性を有している。
【００４７】
悪性化した細胞でのｃ−ｅｒｂＢ−２あるいは関連レセプター過剰発現は、腫瘍が良性な局所型であるか転移性であるか、腫瘍細胞のｓＦｖの種のターゲッティングを可能にする。上記の場合、ｓＦｖ−毒素融合蛋白質の内在化が、ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原が過剰に発現した腫瘍細胞の特異的な破壊をさせる。別の例では、感染細胞、悪性化の特性、あるいは患者個々の治療上の因子に依存して同じｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連レセプターが殆ど内在化しなかったり、安定な腫瘍抗原の個体群である場合がある。このような時、毒素融合物の内在化を利用可能にする目的以外に異なった状態で、一本鎖のＦｖとその融合蛋白質が生産的に使用することができる。ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプター／ｓＦｖまたはｓＦｖ融合蛋白質複合体が殆ど内在化しない場合、リボゾームの不活性化によって細胞質的に機能するリシンＡ鎖のような毒素は殺細胞には有効性を示さない。それにも関わらず、一本鎖非融合Ｆｖは有用である。例えばイメージング、放射化免疫療法があげられる。同じポリペプチド鎖上の二つの異なった結合部位を有するような、種々のデザインの二特異性一本鎖Ｆｖ融合蛋白質は、その分子が特異性を示す二つの抗原に対するターゲッティングに使用可能である。例えば、二特異的一本鎖抗体として、ｃ−ｅｒｂＢ−２とサイトトキシックリンフォサイト（ＣＴＬｓ）上に存在していることが最近明らかになったＣＤ３抗原の両方に特異性を有しているものを上げることができる。この二特異的分子は、腫瘍細胞のＣＴＬ依存性溶解をもたらす、抗体依存性殺細胞活性（ＡＤＣＣ）を引き起こすことができる。同様な結果がｃ−ｅｒｂＢ−２とＦｃγレセプタータイプＩまたはＩＩに特異的な二特異的一本鎖Ｆｖを用いて得ることができる。その他の二特異的ｓＦｖの構成として、ｃ−ｅｒｂＢ−２特異的なドメインとトランスフェリンまたは上皮成長因子（ＥＧＦ）のレセプターのようなホルモンや成長因子レセプターに特異的な成長因子ドメインの組み合わせによるものを上げることができる。
【００４８】
（発明の詳細な説明）
乳癌および卵巣癌細胞、さらには癌の形態が明らかに類似している腫瘍細胞に高いレベルで発現している、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原への親和性を有する一本鎖のＦｖとｓＦｖの融合蛋白質が本発明で開示される。このポリペプチドは、生物合成した抗体結合部位として挙動する領域を構成する一つまたはそれ以上のアミノ酸配列によって特徴付けられる。図１に示したように、この部位は重鎖の可変領域（ＶＨ）１０、軽鎖の可変領域（ＶＬ）１４の一本鎖からなっている。ここでＶＨ １０とＶＬ １４はポリペプチドリンカー１２により結合されている。結合ドメインは、分離した免疫グロブリンから得ることができるＦＲｓ３２、３４、３６、３８および３２’、３４’、３６’、３８’に結合した、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合することのできる免疫グロブリン分子由来のＣＤＲｓ ２、４、６と２’、４’、６’を含む。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃに示したようにＢＡＢＳの一本鎖ポリペプチド（ＶＨ １０、ＶＬ １４、リンカー１２）は遠隔的に検出可能な成分および／またはその他のポリペプチド配列１６、１８又は２２を含むことができ、これは酵素、毒素、結合部位、固定化マトリックスあるいは放射能活性原子に結合する部位などの機能を持っている。本発明は蛋白質の生産方法およびその使用方法を開示する。
【００４９】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドは、合成ＤＮＡ、即ち複数の化学的に合成され再クロ
−ン化されたオリゴヌクレオチドのライゲ−ションからなるまたはハイブリド−マのゲノム由来のフラグメントのライゲ−ションによる組み換えＤＮＡ、成熟Ｂ細胞クロ−ンまたは天然材料由来のｃＤＮＡライブラリ−、に一部基づいた遺伝子配列を含むプラスミドによってコ−ドされた蛋白質を発現させる宿主細胞中で合成され、再クロ−ン化されるという意味で生物合成される。
【００５０】
発明の蛋白質は、これら合成一本鎖ポリペプチドは、あらかじめ選択されたｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連腫瘍抗原への親和性を保持させるために、特異的にデザインされた３次元コンフォメーションにリフォールディングさせることができる“抗体結合部位”として正しく特徴づけられる。一本鎖Ｆｖポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＵＳ８８／０１７３７に開示されたようにして調製可能である。このＰＣＴ出願ＵＳ８８／０１７３７は、１９８９年２月６日づけで出願されたＵＳＳＮ ３４２，４４９の対応出願であり１９８７年５月２１日付け出願されたＵＳＳＮ ０５２，８００を優先権主張しており、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓＩｎｃ．が出願人であり、引用により本発明と一体となっている。本発明のポリペプチドは、その構造がｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識するために、反応性を有していることが公知の天然型抗体の部分に続けて模倣されている点で抗体様であると言える。
【００５１】
さらに特徴的なこととして、蛋白質に対する結合能を付与する部分でのこれらの生物合成抗体の結合部位（ＢＡＢＳ）の構造は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原に対する天然型抗体のＦｖ部分に類似している。親和性と結合性に必要な三次元分子構造を形成する、少なくとも３つのポリペプチドセグメントを特定しているアミノ酸配列からなっている一連の領域を含んでいる。ＣＤＲｓは、天然型抗体のＦｖフラグメントのフレームワーク部位に類似するポリペプチドセグメントにより、適切なコンフォメーションを保持している。
【００５２】
ＣＤＲとＦＲポリペプチドセグメントは、米国特許第４，７５３，８９４号に記載され引用により本発明と一体となっている、すでに存在する抗体のＦｖ部分の配列分析またはこの抗体をコードするＤＮＡ配列に基づいて、経験的にデザインされている。
【００５３】
このような抗体の一つとしての５２０Ｃ９はマウスモノクローナル抗体であり、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−Ｂｒ−３（米国特許第４，７５３，８９４号）により発現されている抗原に反応性を有していることが知られている。抗原は約２００ＫＤの酸性の糖蛋白質であり、等電点５．３であり、細胞あたり５００万コピーが存在する。放射化ラベル抗体を用いて測定したた結合定数はおよそ４．６×１０８ Ｍ −１である。
【００５４】
一つの実例において、一本鎖ポリペプチドのＦＲｓを構成するアミノ酸配列は、例えばヒトＩｇＧのような、第一の既に存在する抗体のＦＲ配列の類似体である。ＣＤＲｓを構成するアミノ酸配列は、卵巣癌および乳癌細胞の表面に発現しているｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原を認識する、齧歯類またはヒトＩｇＧのＣＤＲｓのような第二の異なった既に存在する抗体のアミノ酸配列に類似している。さらにまた、ＣＤＲｓとＦＲｓは、セルラインからの単一の既存抗体から完全に複製しても良い。セルラインとしては、培養が困難で、不安定であっても良い。例えばマウス、マウス／ヒト、ヒトモノクローナル抗体分泌細胞株に基づいたｓＦｖ生産セルラインを上げることができる。
【００５５】
本発明の実施は種々の試薬のデザインと生物合成を可能とする。これらの全てが、あらかじめ選択されたｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原に対する親和性を有する領域によって特徴づけられている。生物合成蛋白質のその他の領域は、思いつく蛋白質の利用を特に計画する場合にデザインされるものである。このように、仮に試薬が哺乳類に静脈投与するようにデザインされるならば、ＦＲｓは、哺乳動物の種の天然型抗体のＦＲのアミノ
酸の少なくとも一部分と同一かまたは類似したアミノ酸配列を含んでいても良い。一方、ＣＤＲｓを含むアミノ酸配列は、超可変領域由来のアミノ酸配列（そして明らかなフランキングアミノ酸配列）の一部分に類似する。この超可変領域はマウスまたはラット由来のｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原に対する抗体、あるいは特異的ヒト抗体または免疫グロブリンなどの公知の親和性と特異性を有する抗体のもので良い。
【００５６】
ＣＨおよびＣＬのような天然型免疫グロブリン蛋白質の構造のその他の部分は、本発明には必要なく、本発明の生物合成蛋白質をからは、通常意図的に除去しておく。しかし、本発明の一本鎖ポリペプチドはリーダー配列や第二のポリペプチド鎖を特定している付加的なポリペプチド領域を含んでいても良い。第二のポリペプチド鎖としてはサイトカイン、毒素、リガンド、ホルモン、免疫グロブリンドメイン、酵素などの生物活性物や、毒素、薬剤、放射性核種のような遠隔的に検出可能成分を結合させる部位である。
【００５７】
有用な毒素であるリシンはヒマの実からとれる酵素であり、高い毒性を有している。リシンは１ ｎｇ／ｍｌのような低濃度で培養細胞の増殖を阻害する。リシンＡ鎖は分子量３０，０００で糖鎖が結合している。リシンＢ鎖は分子量が大きく（３４，０００）、同様に糖鎖が結合している。Ｂ鎖は２つのガラクトース結合部位を持ち、折り畳みサブユニットを構成する２つのドメインからなる。リシンの結晶学的構造はＡ鎖のトレーシングが骨格となっている。恐らく活性部位である割れ目が存在しており、分子を斜めに走っている。さらに分子内にはα−螺旋とβ−構造が存在し、不規則な構造である。
【００５８】
Ａ鎖は真核細胞のリボゾームの６０ｓリボゾームサブユニットを酵素的に不活性化する。Ｂ鎖は細胞表面に存在するガラクトース基の炭化水素残基に結合する。その糖は細胞表面へ毒素が結合するためには必要であると考えられ、細胞内への毒素侵入のメカニズムを容易にし、かつ関与する。全ての細胞はガラクトースを含む細胞表面のレセプターを有しており、リシンは全てのタイプの哺乳動物細胞殆ど同じ有効性をもって阻害する。
【００５９】
リシンＡ鎖とリシンＢ鎖は、ＡおよびＢ鎖共に特徴付ける遺伝子によってコードされている。遺伝子から転写されたｍＲＮＡで合成されたポリペプチドは、’Ｊ’（結合のため）ペプチドによってＢ鎖に結合したＡ鎖を含んでいる。ＪペプチドフラグメントはＡ鎖とＢ鎖を放出するために、翻訳後修飾によって除去される。しかしＡ鎖とＢ鎖は鎖間のＳＳ結合によりまだ両方とも保持されている。好ましいリシンの形状はＢ鎖が全てはずれた遺伝子組換えＡ鎖であって、大腸菌で発現させるとき、糖鎖を持たず、糖鎖を持つものよりも血液中からゆっくりと消失する。リボゾームに対する遺伝子組換えリシンＡ鎖の特異的な活性とヒマの実リシンから単離した天然型リシンＡ鎖の活性は同じである。リシンＡ鎖のアミノ酸配列と対応する核酸配列は配列表配列番号７と８として示した。
【００６０】
遺伝子組み換えリシンＡ鎖、植物由来リシンＡ鎖、脱糖鎖リシンＡまたはこれらの誘導体は、本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドにより、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原を発現している細胞に対するターゲット剤とすることができる。これを行う場合、ｓＦｖはリシンＡ鎖またはそれらの活性な類似体に化学的に交差結合させることができる。また好ましい実施例においては、一本鎖Ｆｖ− リシンＡ鎖イムノトキシンが、相応する遺伝子融合を通して一本鎖Ｆｖポリペプチドと１またはそれ以上のリシンＡ鎖を融合させることによって形成させることができる。リシンＢ鎖に置き換えてｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原への抗体結合部位を備えたＡ鎖は、細胞の表面のこのような抗原部位へ誘導されてゆく。この方法では、これらの抗原を発現している腫瘍細胞の選択的な死滅を可能にする。この選択性は、培養中の細胞増殖対して起きる多くの例で示されている。この細胞増殖に対する効果は、イムノトキシンが直接作用する細胞の表面に抗原が存在するか否かに依存している。
【００６１】
本発明は、イメージング法および腫瘍治療の一部として、ヒト型化した一本鎖Ｆｖ結合部位の使用をも含んでいる。蛋白質は経静脈または筋肉注射で投与することができる。抗腫瘍療法または有効な腫瘍イメージングに一本鎖Ｆｖの構成物の有効な投与は治療の対象の状態を保持しているようなルーチン化した試験によって決定できる。
【００６２】
注射可能な用法に適した製剤の形態は滅菌液剤または分散剤の形態を含んでいる。全てのケースで、剤形は滅菌されていなければならないし、注射器によって投与が容易なように液状でなければならない。薬剤は、生産および保存の条件で安定でなければならないし、微生物汚染のないようにしなければならない。これは、例えば、０．２２μｍのフィルターによる濾過滅菌および／またはガンマー線による殺菌後の凍結乾燥によって行うことができる。滅菌した注射溶液は、フィルター滅菌したリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水のような、適切な溶媒に必要な量の本発明の一本鎖構成物溶解させて調製する。ここに示したように、”製剤学的に許容可能なキャリアー”はヒトに対して毒性を示さない全ての溶媒、分散剤、抗菌剤、抗カビ剤およびこれらの類似物を含む。この媒体や薬剤は、一本鎖ポリペプチドの適切なコンフォメーションの保持に適合していなければならない。そしてそれを治療組成物に使用する。補助的な活性成分も組成物に加えることができる。
【００６３】
二特異性一本鎖Ｆｖは毒素と融合させることができる。例えばｃ−ｅｒｂＢ−２と速やかに内在化されるターゲットであるトランスフェリンレセプターに特異性を持つ二特異的ｓＦｖ構成物は、トランスフェリンレセプター／ ｓＦｖ −毒素コンプレックスの内在化を誘導する有効な殺細胞剤となるであろう。ｓＦｖ融合蛋白質は、例えばＥＧＦ−ｓＦｖ − リシンＡのように、同一のポリペプチド鎖上に複数の蛋白質ドメインを含むことができる。ここではＥＧＦドメインはＥＧＦレセプターにインターラクションしたｓＦｖに結合している毒素の内在化を促進する。
【００６４】
本発明の一本鎖ポリペプチドは、例えばヨウ素１３１、インジュウム１１１、テクネチウム９９ｍなどの放射性同位元素でラベル化することができる。テクネチウム９９ｍやインジュウム１１１のようなβ線源が好ましい。それは、インビボのイメージングにγカメラを用いて検出を行うためであり、半減期が適しているためである。一本鎖ポリペプチドは、例えばイットリウム９０、テクネチウム９９ｍ、インジュウム１１１のような放射性同位元素でラベル化する際に、複合金属キレートを用いる（Ｋｈａｗ他、１９８０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９ ：２９５； Ｇａｎｓｏｗ 他、米国特許第４，４７２，５０９；
Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，米国特許第４，４７９，９３０）。また先行技術によって公知となっているアイソトープ結合のための標準的な方法であっても良い。
【００６５】
本発明はｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原への完全な結合部位を提供する。これは複合体である（ＶＨ − リンカー− ＶＬ）ｎまたは（ＶＬ− リンカー− ＶＨ）ｎ構造のポリペプチドを構成するポリペプチド配列によって結合したＶＨ − ＶＬ二量体の類似体である。ここでｎは１またはそれ以上の数である。ポリペプチドは抗体分子の認識には基本的に必須であり、さらに検出可能な成分あるいは、ＶＨまたはＶＬに結合した第三のポリペプチド配列を含んでいても良い。
【００６６】
ここに開示された技術を用いて調製できる、本発明の実施物である蛋白質の構造の例を図２Ａ−２Ｅは示している。全ての構造図は、すくなくとも一つの、結合部位を特定する生物合成ｓＦｖ 一本鎖セグメントによって特徴づけられており、異なる免疫グロブリン由来のＣＤＲｓとＦＲｓを包含するアミノ酸配列からなっており、また異なる免疫グロブリンのＣＤＲｓとＦＲｓの一部とホモローガスな配列からなっている。
【００６７】
図２Ａは、与えられた抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）に類似のアミノ酸配列を持つポリペプチド１０からなる一本鎖ｓＦｖ １００を図で説明
している。抗体はポリペプチドリンカー１２ヘカルボキシル末端を介して結合しており、そして抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド１４にリンカーが結合している。
【００６８】
当然のことであるが、軽鎖と重鎖のドメインは逆に配置することもできる。リンカー１２は少なくとも、鎖１０と１４が正しいコンフォメーションとドメイン内の相互関係を取るために充分長くなっている（１０ないし１５アミノ酸また４０Å）。
【００６９】
薬剤の使用を目的とした場合、リンカー１２は、それが導入される種によって”自身”として認識される配列のホモローガスなアミノ酸配列を含むことができる。不構造性の場合には、親水性アミノ酸配列が好ましい。このようなリンカー配列は、配列表配列番号３、４の配列のアミノ酸残基数１１６−１３５として配列を示した。この配列は配列表配列番号１２および１４に示した１５アミノ酸のリンカー配列を含んでいる。
【００７０】
その他の蛋白質またはポリペプチドは図２Ａに示したタイプの蛋白質のアミノまたはカルボキシ末端のいずれかに結合している。実施例のように、リーダ配列１６はＶＨドメイン１０のアミノ末端から延長していることを示している。
【００７１】
図２Ｂは一本鎖ポリペプチド１００とペンダント蛋白質１８を含む試薬２００の別のタイプを図示したものである。ポリペプチド鎖１００（免疫グロブリン結合部位からなるＦＲとＣＤＲ配列を含む）のカルボキシル末端に結合したものはペンダント蛋白質１８であり、例えば毒素や毒素のフラグメント、結合蛋白質、酵素、酵素活性フラグメント、イメージング剤のための結合部位（インジュウム１１１のような放射活性イオンをキレートしている）からなる。
【００７２】
図２Ｃは、同一または異なる特異性を持ち、そして最初の一本鎖ポリペプチド１００にリンカー２２を介して結合した発明の第二の一本鎖ポリペプチド１１０を含む一本鎖ポリペプチド３００を図示している。
【００７３】
図２Ｄは、リンカー２２により結合した一本鎖ポリペプチド１１０と１００および、１１０のカルボキシル末端に結合したペンダント蛋白質１８を含む一本鎖ポリペプチド４００を図示している。
【００７４】
図２Ｅは図２Ｄの鎖４００と鎖４００のアミノ末端に結合したぺンダント蛋白質２０（ＥＧＦ）を含む一本鎖ポリペプチド５００を図示している。
【００７５】
図２Ａ−２Ｅに示したように、発明の一本鎖蛋白質は、複数の生物合成結合部位を含むことによって、紐の上のビーズに似た形状となる。それぞれの結合部位は、特徴的な特異性かまたは蛋白質の親和性を促進させるために同一の特異性の繰り返し部位を有する。先に示した事実から、本発明は、可変領域またはｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原に対する免疫グロブリン領域の後に形成された結合部位を特定している、少なくとも一部分の蛋白質から構成される試薬の大きなファミリーを提供するものである。
【００７６】
本発明の一本鎖のポリペプチドはＤＮＡのレベルでデザインされている。合成ＤＮＡｓは適切な宿主系で発現されて、必要に応じて発現蛋白質は回収されて再生化される。
【００７７】
本発明の一本鎖ポリペプチドをデザインするための能力は、目的のモノクローナル抗体を特定し、この抗体の可変領域のアミノ酸配列を決定するかまたはそれらをコードするＤＮＡ配列を決定する能力に依存している。ハイブリドーマ技術は、免疫反応を誘発するために必要な物質に対して必然的に抗体を分泌する細胞株の調製を可能にする。例えば米国
特許第４，７５３，８９４号には、乳癌細胞上のｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識するモノクローナル抗体が開示されており、いかにしてこの抗体を得るか説明されている。この目的に特に有用なモノクローナル抗体は５２０Ｃ９である（Ｂｊｏｎ他、１９８５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５ ：１２４−１２２１；米国特許第４，７５３，８９４号）。この抗体は特異的に、種々の腫瘍セルラインの表面に発現しているｃ−ｅｒｂＢ−２抗原を認識する。そして正常組織に結合することは非常にまれである。必要とする特異性を持つｓＦｖ配列の別の資源としては、ファージ抗体とコンビネーショナルライブラリーの進歩を利用できる。このような配列は、腫瘍細胞膜、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原フラグメントまたはペプチドによって予備免疫したマウスから得たｃＤＮＡに基づいて得られる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３５２ ６２４−６２８（１９９１））。
【００７８】
目的の一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡをデザインする工程は、以下のようにして達成することができる。必要な免疫グロブリンの軽鎖と重鎖をコードするＲＮＡは、免疫グロブリンを生産するハイブリドーマの細胞質から得ることができる。ｍＲＮＡは、先行技術で公知のＰＣＲ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他 編集、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）によってＶＨとＶＬ遺伝子を続けて単離するためにｃＤＮＡを調製する目的で使用することができる。Ｈ鎖、Ｌ鎖のＮ末端アミノ酸配列は、自動エドマン分析によって独自に決定することができる。必要に応じて、ＣＤＲｓとフランキングＦＲｓの延長は、ＨとＬ鎖のＶ領域のフラグメントのアミノ酸配列分析によって決定することができる。このような配列分析は、現在ではルーチンに行うことができる。このような情報は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原に結合する公知のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞からＶＨとＶＬ遺伝子の単離に必要な合成プライマーをデザインするために利用する。これらのＶ遺伝子は、もととなった抗体中に存在している、ｃ−ｅｒｂＢ−２に結合するＦｖ部分をコードしている。
【００７９】
ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連レセプターに特異的なＦｖ結合部位をコードする合成Ｖ遺伝子のデザインと構築を、別のアプローチによって達成できる。例えばＣｏｍｐｕｇｅｎのようなコンピュータプログラムと公知の可変領域のＤＮＡ配列を使用して、最初の抗体分子由来の天然または天然型に近似したＦＲ配列と、第二の抗体分子由来のＣＤＲ配列をデザインし、直接合成する。上記のＶＨとＶＬ配列は、一つのアミノ酸鎖または、その他のＮ末端を有している一本鎖のＣ末端に結合したリンカーを介して直接結合させる。
【００８０】
一度合成したこれらの遺伝子は、リーダーペプチドをコードしているＤＮＡのような付加部分を有しているか、または有していない状態でクローン化することができる。この付加部分としては、分泌を促進するリーダーペプチド、融合ポリペプチドの細胞内安定化、第二のポリペプチドをコードするリーダーまたはトレイル配列などがある。遺伝子は次いで、適切な宿主細胞中で直接発現させることができる。
【００８１】
ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原に対する抗体を直接配列分析するか、文献から配列を得るかして、これらの開示を考慮し、先行技術を使用することで、必要なＣＤＲとＦＲからなる一本鎖のＦｖを生産することができる。例えば、配列表配列番号３に配列を示した５２０Ｃ９モノクローナル抗体のＤＮＡ配列を使用して、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に結合親和性を有する一本鎖ポリペプチドを生産することができる。発現させた配列は、結合性を試験し、アミノ酸配列データおよび／またはコンピュータモデリング技術による傾向の観察に基づいて、相対的に保存されている領域のアミノ酸を選定して交換することによって経験的に改良を行う。
【００８２】
ＶＨとＶＬのデザイン中の有意なフレキシビリティは、ＤＮＡレベルにおいてアミノ酸
配列の変更をもたらしているため可能である。
【００８３】
従って、本発明の一本鎖のＦｖとｓＦｖ融合蛋白質をコードするＤＮＡの構築は、種々の制限酵素の使用を含む公知の技術を使用して行われる。この技術には、制限酵素技術、平滑末端または接続末端を調製するＤＮＡの配列特異的切断、ＤＮＡリガーゼ、平滑末端ＤＮＡにスティッキエンドを酵素的に付加する技術、短いかあるいは中間の長さのオリゴヌクレオチドの集合による合成ＤＮＡｓの構築、ｃＤＮＡ合成技術、免疫グロブリン遺伝子を単離するための合成プローブなどがある。種々のプロモータ配列と発現を行うために使用されるその他の調節ＲＮＡ配列および種々のタイプの宿主細胞も公知であり使用可能である。従来のトランスフェクション技術および同様にＤＮＡのクローニングとサブクローニングのための従来の技術は本発明の実施に有用であり、当業者に知られている。種々のタイプのベクターがプラスミドと動物ウイルスおよびバクテリオファージを含むウイルスベクターとして使用できる。ベクターは、充分にトランスフェクト細胞に伝達され、表現型の特性が検出でき、さらにベクターの組換えＤＮＡが完全にクローンに組み込まれて、クローンのファミリーを特定するために使用できる種々のマーカー遺伝子が使用できる。
【００８４】
もちろん操作や増幅の方法、目的のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡが一般的に良く知られており、従ってここでは詳細に説明を行わない。目的の抗体のＦｖ領域をコードする単離したＶ遺伝子を特定する方法は、良く知られており、特許及びその他の文献に開示されている。一般的に方法は、アミノ酸配列をコードする遺伝子材料を選択することを含んでおり、アミノ酸配列は、遺伝子コードに従って逆転写で目的のＣＤＲｓとＦＲｓを特定している。
【００８５】
ここに開示された一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを得る方法は、適切なリガーゼを用いてライゲーションによって、従来法の自動化ポリヌクレオチドシンセサイザーで調製した合成オリゴヌクレオチドをつなげることである。例えば、１５塩基からなる共通の部分があり、相補的なＤＮＡフラグメントがリン酸化アミド化学により半手作業的に、ライゲーションのあいだの重合を抑制するために、リン酸化されていない残りの末端セグメントを用いて合成する。合成ＤＮＡの一方の末端は特定の制限エンドヌクレアーゼの作用部位に対応する゛“スティッキ−エンド”として残り、他方の末端は他の制限エンドヌクレアーゼの作用部位にそ対応する末端を持って残る。従って、この方法十分に自動化が可能である。一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡは長い一本鎖フラグメント（例えば、５０−１００ヌクレオチド長）を例えば、バイオサーチ製オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使って合成し、そしてフラグメントをライゲーションすることによって調製できる。
【００８６】
一定領域のアミノ酸または生物活性分子をコードする付加的なヌクレオチド配列は、その遺伝子配列に結合させて二機能蛋白質を生産することができる。
【００８７】
例えば、上記のようにデザインされた合成遺伝子およびＤＮＡフラグメントは化学的に合成したオリゴヌクレオチドを集積して製造できる。１５―１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドはバイオサーチ製ＤＮＡ Ｍｏｄｅｌ ８６００シンセサイザーで合成でき、トリス―ホウ酸―ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）中でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製する。次いでＤＮＡをゲルから電気泳動して溶出させる。オーバーラッピングしたオリゴマーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＰＡＧＥによって精製したより大きいブロックにライゲートさせる。
【００８８】
そのブロックあるいはより長いオリゴヌクレオチドのぺアーは、適切なクローニングベクター（例えばｐＵＣ）を使用して大腸菌でクローン化する。最初に、このベクターは、部位を変化させて残基６塩基を除去するために、一本鎖の突然変異誘発を行う。例えばＶ
Ｈを合成し、次の制限酵素切断部位またがる５つのプライマリーなブロックとしてｐＵＣでクローニングする。（１）ＥｃｏＲＩ−第一のＮａｒＩ、（２）第一のＮａｒＩ−ＸｂａＩ （３）ＸｂａＩ−ＳａｌＩ （４）ＳａｌＩ−ＮｃｏＩ （５）ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ。これらのクローン化フラグメントは単離し、３フラグメントのライゲーション体を複数を集め、ｐＵＣ８プラスミド中にクローニングする。ＰＡＧＥで選別した必要なライゲーション体でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ８を形質転換させ、標準方法に従ってＬＢアンピシリン＋Ｘｇａｌプレートで培養する。遺伝子配列はサンガーのジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｄ
ｅｄ．， Ｖｏｌ．２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に従って、Ｍ１３にクローニングするかサブクローニング後スーパーコイルシーケンシングによって確認する。
【００８９】
操作した遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉの変異株などの適切な原核細胞宿主か、あるいはチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）、マウスミエローマ、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、ヒトミエローマ細胞のような真核細胞宿主で発現させる。
【００９０】
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させると、それは最初に発現ベクターをクローン化する。ＴｒｐやＴａｃのようなプロモータ配列下流に操作遺伝子およびスタフィロコッカスのプロテインＡのフラグメントＢ（ＦＢ）のようなリーダーポリペプチドのための遺伝子コーディングを配置することによりクローン化が達成される。その結果発現した融合蛋白質は細胞の細胞質中の屈折体中に蓄積し、フレンチプレスや超音波によって細胞を破壊して回収できる。屈折体は溶解させ、発現した融合蛋白質は、いくつかの他の組換え蛋白質のために、すでに確立させた方法（Ｈｕｓｔｏｎ他 前述）で切断し、リフォールディングさせる。また直接発現法では、リーダー配列がなく、封入体が切断されずにリフォールディングされている（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０３，ｐｐ４６−８８）。
【００９１】
リーダー配列の融合物から単離したｓＦｖを引き続いて蛋白分解性切断をして、フリーのｓＦｖを回収する。フリーのｓＦｖは、完全な生物合成性ハイブリッド抗体結合部位を得るために再生化させることができる。この切断部位は、好ましくはｓＦｖポリペプチドに隣接しており、一本鎖ポリペプチドのアミノ酸構造中に確認されるアミノ酸またはアミノ酸配列の幾つかを除いたアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいる。
【００９２】
切断部位は好ましくは、特定の物質で特異的に切断されるようにデザインされている。エンドペプチダーゼが好ましいが、非酵素的（化学的）切断剤も使用可能である。例えば有用な切断剤としては、固有の切断部位を優先的あるいは特異的に認識し切断するシアン化ブロマイド、希酸、トリプシン、スタフィロコッカス アウレウスのＶ８ポロテアーゼ、ポストプロリン開裂酵素（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｌｉｎｅ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）、血液凝固因子ファクターＸａ、エンテロキナーゼ、レニンなどが上げられる。特に好ましいペプチド配列切断剤としては、Ｖ８プロテアーゼが上げられる。特に好ましい切断部位はＧｌｕ残基である。その他の有用な酵素は、切断部位として複数の残基を認識するものがある。これにはファクターＸａ（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）あるいはエンテロキナーゼ（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）がある。希酸はＡｓｐ−Ｐｒｏ残基の間を優先的に切断し、酸性ＣＮＢｒは、Ｔｙｒが続いている以外のＭｅｔの後ろを切断する。
【００９３】
仮に操作遺伝子が、従来の免疫グロブリン発現系である真核ハイブリドーマ細胞中で発現すると、免疫グロブリンプロモータ、分泌シグナル、免疫グロブリンエンハンサー、および種々のイントロンを含む発現ベクター中に、その遺伝子は組み込まれる。このプラスミドはまた、安定領域の一部または全部、発現させる重鎖または軽鎖の完全部分、さらに
また毒素、酵素、サイトカイン、ホルモンなどの少なくとも一部分のような別のポリペプチドをコードする配列もまた含んでいる。遺伝子は既に確立された電気融合法またはプロトプラスト融合法でミエローマ細胞にトランスフェクトする。トランフェクト細胞はＶＨ− リンカー− ＶＬまたはＶＬ − リンカー− ＶＨの一本鎖Ｆｖポリぺプチドを発現する。それぞれのポリペプチドは上記の種々の方法で別の機能を有する蛋白質ドメイン（細胞毒性物など）を結合している。
【００９４】
もしもこの配列が存在しない場合に、明らかな複数の結合部位のあるアミノ酸配列の、単一の連続した鎖を構築するために、単一の結合部位（即ちＶＨ − リンカー− ＶＬ
）をコードしているＤＮＡの境界部位における切断部位が利用され、もしなければ創造される。発現プラスミドに集め、クローン化した遺伝子からさらに、単一の結合部位をコードするＤＮＡをシャトルプラスミドにライゲーションし、クローン化する。目的のドメインは、多様化させ、そしてドメインの間のスペーサーは、ドメインのフォールディングを独立させるために必要なフレキシビリティー付与している。発現レベル、リフォールディング、機能活性に関する最適技術は経験的に決定される。二機能ｓＦｖを創造するためには、例えば、最初の結合部位をコードする遺伝子のストップコドンはオープンリーディングフレームに変え、そしてＢａｍＨＩ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコード）またはＸｈｏＩ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒをコード）のような制限酵素切断部位になる、いくつかのグリシンにセリンを結合させるコドンは、他のコドン置き換える。第二のｓＦｖ遺伝子は、同じリーディングフレームの同じ制限酵素切断部位を確認して、その５’末端側を同様に改変する。遺伝子は、二機能性ｓＦｖ遺伝子を調製するために、この部位に結合させる。
【００９５】
一つのドメインのＣ 末端を次のドメインのＮ 末端に結合するリンカーは、通常親水性アミノ酸からなる。この親水性アミノ酸は生理学的な溶液中では、不構造性の状態を呈しており、ＶＨ、ＶＬまたはペンダント鎖のフォールディング作用を阻害する大きな側鎖基を持たないことが好ましい。利用可能なリンカーの一つは、［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３のアミノ酸配列を有する（配列表配列番号９および１０のアミノ酸残基番号４１０−４２４）。特に好ましいリンカーは、［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］２及び［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］３のような配列（配列表配列番号３および４）であって、［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］ の２ないし３回の繰り返し配列を有している。
【００９６】
本発明を以下に示す実施例により限定することなくさらに説明する。
【実施例】
【００９７】
１．ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に対する抗体
乳癌に対するモノクローナル抗体は、ヒト乳癌細胞またはマウスに免疫して得た細胞の膜抽出物を用いて、Ｆｒａｎｋｅｌ他の示した方法によって（Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８５， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆ．，４：２７３−２８６） 得た。文献は引用により発明と一体化している。ハイブリドーマを調製し、正常および乳癌細胞のパネルを用いて、抗体生産を選別した。８つの正常組織膜のパネル、線維芽細胞株、および乳癌細胞の凍結切片をスクリーニングに用いた。最初のスクリーニングを通過した候補は、さらに、１６の正常組織切片、５つの正常血球タイプ、１１の乳癌以外の腫瘍切片、２１の乳癌切片、１４の乳癌細胞株を用いて試験を行った。このセレクションにより１２７の抗体が選択された。不適切な抗体および乳癌以外の癌細胞株をコントロール実験に使用した。
【００９８】
有用なモノクローナル抗体として５２０Ｃ９、４５４Ｃ１１（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．番号ＨＢ８６９６およびＨＢ８４８４）、７４１Ｆ８が見出された。抗体は、５種の異なった抗原に対して反応させるスクリーニングで、乳癌を選択することを確認した。抗体が認識する抗原のサイズは以下のとおりである。２００ＫＤ；２００ＫＤの分子サイズの分解物で
ある一連の蛋白質、９３ＫＤ、６０ＫＤ、３７ＫＤ；１８０ＫＤ（トランスフェリンレセプター）；４２ＫＤ；および５５ＫＤ。抗原の５つのクラスに対して結合した抗体の最大の特異性は、２００ＫＤの物質に対するものであった。その抗原のクラスに代表的な抗体は５２０Ｃ９であった。５２０Ｃ９は少数の乳癌組織に反応する（分析条件に依存するが２０−７０％）。そして極わずかな正常組織に反応する。５２０Ｃ９は腎臓の細管に反応する（多くのモノクロナール抗体がそうであるように）。しかし、膵臓、食道、肺、大腸、胃、脳、扁桃、肝臓、心臓、卵巣、皮膚、骨、子宮、膀胱、正常な乳房組織には試験を行ったが反応しなかった。
【００９９】
２．５２０Ｃ９抗体をコードするｃＤＮＡの調製
ポリアデニレートＲＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア）の”ＦＡＳＴ ＴＲＡＣＫ”ｍＲＮＡアイソレーションキットを使用して、約１×１０８個の細胞（５２０Ｃ９ハイブリドーマ）から分離した。免疫グロブリン重鎖ＲＮＡの存在は、重鎖の染色体ＤＮＡの種々のＪ領域を含む組換えプローブを使用して、ノーザン分析で確認した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｄｅｄ．，Ｖｏｌ．２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）。それぞれ６μｇのＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡをインビトロージェンｃＤＮＡ合成システムとランダムおよびオリゴｄＴプライマーの両方を使用して調製した。合成に引き続き、ｃＤＮＡはアガロースゲル電気泳動で０．５−３．０キロベース（Ｋｂ）フラグメントを単離してサイズセレクションを行った。ｃＤＮＡとベクターの比率の最適化を行ってこのフラグメントをインビトロージェン クローニング ベクターｐＣＤＮＡ ＩＩにライゲーションした。
【０１００】
３．ＶＨおよびＶＬドメインの単離
プラスミドライブラリーＤＮＡを用いて細菌の形質転換後、コロニーハイブリダイゼションを、軽鎖または重鎖遺伝子のどちらかについて、抗体の定常（Ｃ）領域と結合（Ｊ）領域のプローブを使用して実施した。なおＯｒｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．８６：３８３３を参照のこと。抗体定常領域のプローブは、公知の方法で免疫グロブリン遺伝子の重鎖または軽鎖のヌクレオチド配列から得ることができる。いくつかの可能性の高いクローンを重鎖および軽鎖遺伝子ともに特定し、精製後に第二のスクリーニングを行なって、この配列を決定した。一つのクローン（Ｍ２０７）は、保存されたシステインに代えてチロシンを有する非機能性κ鎖の配列を含んでおり、そしてさらに、これは可変Ｊ領域のジャンクションにはフレームシフトミューテーシヨンを誘導する４塩基の欠失があるために早期に終了している。第二の軽鎖のクローン（Ｍ２３０）は定常領域の最後の１８残基のアミノ酸とシグナル配列の約半分を除いては、完全な５２０Ｃ９軽鎖の遺伝子を実質的含んでいた。５２０Ｃ９の重鎖の可変領域は、ＣＨ２ ドメインの末端付近で終了しているところの、約１１００塩基対（Ｆ３２０）のクローン上に存在していた。
【０１０１】
４．ＶＨおよびＶＬ ドメインの変異化
ｓＦｖを構築する目的で、重鎖と軽鎖両方の可変領域に適切な制限酵素切断部位を挿入するため変異させた（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３７３）。重鎖クローン（Ｆ３２０）には、ＶＨ（Ｆ３２１）の５’末端にＢａｍＨＩを挿入して変異を起こした。軽鎖にもまた５’末端にＥｃｏＲＶと可変部位（Ｍ２３１）の３’末端に翻訳ストップコドンを含むＰｓｔＩサイトを挿入して同時変異を起こさせた。
【０１０２】
５．スクリーニング
軽および重鎖をコードするｃＤＮＡクローンは、外来の標準ｐＵＣプライマーと複数の特異的内部プライマーを用いてシーケンシングを行なった。
【０１０３】
プライマーは得られた配列に基づいて重鎖用に調製した。ヌクレオチド配列は、内在性免疫グロブリン遺伝子を除くためにジーンバンクホモロジーサーチ（ＤＮＡ−ｓｔａｒ のＮｕｓｃａｎ プログラム）で分析を行なった。アミノ酸への翻訳はＥ．Ｋａｂａｔ編集のＮＩＨアトラスのアミノ酸配列でチェックした。
【０１０４】
５２０Ｃ９免疫グロブリン由来のアミノ酸配列から、ＶＨおよびＶＬ ｃＤＮＡクローンの特性を確認した。重鎖クローンｐＦ３２０は最初のＡＴＧコドンの６塩基上流から始まり、ＣＨ２コード部分まで延長していた。しかし３’側非翻訳領域とポリＡ末端鎖と同様ＣＨ３コード領域の全部とＣＨ２定常ドメインの最後の９アミノ酸は欠けていた。ＣＨ２とＣＨ３コード領域のみを含む別の短い重鎖クローンとポリＡ末端は重鎖５２０Ｃ９の欠落部分にはじめから存在していた。しかしどちらのクローンもオーバーラップはせず独立していた。５２０Ｃ９クローン（ｐＦ３２０）はマウスＩｇＧ１のＣＨ１とＣＨ２をコードしているが、一方短いクローンｐＦ３１５はＩｇＧ２ｂのＣＨ２とＣＨ３をコードしていた。
【０１０５】
６．遺伝子デザイン
ｃ−ｅｒｂ−２関連腫瘍抗原を認識する一本鎖のＦｖ結合部位を含む合成５２０Ｃ９ ｓＦｖ領域をコードする核酸配列はＣｏｍｐｕｇｅｎソフトウェアーの手助けによってデザインした。その遺伝子は５２０Ｃ９抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列を含んでおり、配列表配列番号３および４のアミノ酸残基番号１１６−１３３として配列を示したアミノ酸配列を持ったペプチドをコードする２本鎖の合成オリゴヌクレオチドが同時に結合している。このリンカーオリゴヌクレオチドはヘルパークローニングサイトＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを含んでいる。そしてそれぞれその５’と３’近傍のアセンブリーサイトＳａｃＩとＥｃｏＲＶを含むようにデザインされている。これらのサイトはそれぞれ５２０Ｃ９のＶＨおよびＶＬの５’と３’末端をマッチアップしライゲーションすることを可能にしている。これらはまた、（ＶＨ − リンカー− ＶＬ）サイトを含んでいる。しかしオリゴヌクレオチドのリンケージの順序は、この例や発明のどのｓＦｖでも（ＶＬ −リンカー−ＶＨ）のように逆転できることである。その他の制限酵素切断部位は、選択的なアッセンブリーサイトを提供できるようにデザインされている。プロテインＡのフラグメントをコードする配列をリーダーとして使用した。
【０１０６】
本発明は、ヒトフレームワーク配列を含むヒト型一本鎖Ｆｖおよび５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓ様のｃ−ｅｒｂ−２結合を特定するＣＤＲを包含する。
【０１０７】
本発明の実施は、５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓ様のｃ−ｅｒｂ−２結合を特定する、ヒトフレームワーク配列とＣＤＲ配列を含む、ヒト型一本鎖Ｆｖを提供するものである。ヒト型Ｆｖは、患者に投与した時、免疫反応が極わずかか或いはないにも関わらずｃ−ｅｒｂ−２には結合できる。ヒト化ｓＦｖをコードする核酸配列は、以下のようにデザインし構築することができる。ｓＦｖをデザインするためには二つのストラテジーが特に有用である。最も関連するヒトフレームワーク（ＦＲ）領域をＧｅｎＢａｎｋデータベースでホモロジーサーチして、対応するヒト配列を再生産するために、ｓＦｖのＦＲ領域をサーチで特定した配列に従って変異させる。さらにモデルのＦａｂフラグメントのＸ線解析構造に基づくコンピュータモデル情報を用いた（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３： ７４７−７５３；Ｃｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３５８−３６３；Ｓｈｅｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．，８４：８０７５−８０７９：Ｓａｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．１９０：５９３−６０４全ての文献は引用によって発明と一体化している）。好ましい例として、最もホモローガスなＶＨおよびＶＬ配列はＰＣＲクローン化ヒトＶ領域のコレクションから選択される。完全なヒト化ＶＨおよびＶＬを
完成させるまで、ＦＲを合成し、ＰＣＲ−に基づいたリゲーションにより完全なＶ領域を連続的に調製するためにＣＤＲに融合させる。例えば、マウス５２０Ｃ９抗体ＣＤＲｓとヒトミエローマ蛋白質ＮＥＷ ＦＲｓのハイブリッドであるヒト化ｓＦｖは、ヒトフレームワーク （ＦＲ１−ＣＤＲ−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）のマウス結合部位をそれぞれの可変領域が保持するようにデザインされている。Ｆａｂ ＮＥＷの結晶構造は（Ｓａｕｌ ｅｔａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５８５−５９７）は可変領域のＦＲｓの配置を予測するために使用できる。すでにこれらの領域は予測されており、領域のアミノ酸配列または対応する塩基配列が決定されており、配列は合成されて、シャトルプラスミドにクローン化されている。それらは集合させて、発現プラスミドでもクローン化されている。従って、５２０Ｃ９のｓＦｖのＦＲ配列は直接突然変異させて、変化は内部プライマーを使用してスーパーコイルシーケンシングで確認した（Ｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＤＮＡ ４：１６５−１７０）。
【０１０８】
７．５２０９Ｃ ｓＦｖの調製と精製
Ａ．インクルージョンボディーの溶解化
Ｔ７プロモータとベクターに基づいた５２０Ｃ９ ｓＦｖプラスミドの、配列表配列番号３として配列表を示した融合遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で直接発現させた。２．０１の培養液から得たインクルージョンボディー（１５．８ｇ）を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（ＴＥ）に１Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）加えて洗浄した。インクルーションボディーはＴＥ、６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ９．０に溶解させ、３８２５ Ａ２８０ユニットの物質を回収した。この物質はエタノール沈澱、ＴＥ、３Ｍ尿素洗浄、次いでＴＥ、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０に再分散させた。この沈澱操作で、変成ｓＦｖのイオン交換の精製のための蛋白質を調製した。
【０１０９】
Ｂ．イオン交換クロマトグラフィー
ｓＦｖを再生する前に混入している核酸とＥ．ｃｏｌｉ蛋白質を除去するために、溶解したインクルージョンボディーをイオン交換クロマトグラフィにより処理した。８Ｍ尿素に溶解させたインクルージョンボディーをＴＥで希釈して、最終尿素濃度を６Ｍとして、ついでラジアル フロー カラム中のＤＥＡＥ− セファロース ファースト フロー（１００ｍｌ）を通過させた。ｓＦｖは、非結合画分に回収された（出発サンプルの６９％）。
【０１１０】
Ｓ−セファロース ファースト フローカラムに通す前に、このｓＦｖ溶液（Ａ２８０＝５．７；２９０ｍｌ）のｐＨは１Ｍ酢酸で５．５に調整した。しかしｐＨが６．０になると沈澱が出現した。サンプルは清浄化させた。サンプルの６０％はペレット中に、４０％が上清に存在した。上清を１００ｍｌのｓ−セファロース ファースト フローカラムを通し、ｓＦｖを非吸着画分として回収した。ペレットはＴＥ、６ＭＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ９．０再溶解させ、２８０ｎｍで吸光度を測定して、４５ｍｌのプール中に２０吸光度単位の一次のｓＦｖを含有していることを確認した。この回収したｓＦｖプールは次の精製のステップに回した。
【０１１１】
Ｃ．ｓＦｖの再生
ｓＦｖの再生はジスルフィド開裂リフォールディングアプローチで行った。この方法では、ｓＦｖが完全に変成しているため、ジスルフィドを酸化して、変成を除去し次いでリフォールディングさせる。ｓＦｖサンプルの酸化はＴＥ、６Ｍ
ＧｕＨＣｌ、１ｍＭ 酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１ｍＭ還元グルタチオン（ＧＳＨ）、ｐＨ９．０で行った。ｓＦｖは酸化緩衝液で希釈して４０００ｍｌの容量で、最終蛋白質濃度がＡ２８０＝０．０７５にし、室温で一晩インキュベートした。
【０１１２】
一晩酸化した後、溶液は１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ尿素、ｐＨ ８．０（ＰＮＥＵ）の溶液に対して一晩透析を行った［４×（２０１×２４時間）］。活性の低いものはリフォールディングサンプルに検出された。
【０１１３】
Ｄ．膜分画と活性ｓＦｖの濃縮
濃縮ステップに入る前に凝集したミスフォールディング物を除去する目的で、透析終了リフォールド５２０Ｃ９ ｓＦｖ（５０５０ｍｌ）をミニタン ウルトラフィルトレーション 装置（ミリポア）を使用して１００Ｋ ＭＷＣＯ膜（１００，０００ｍｏｌ．ｗｔ．カットオフ）（４ ｘ ６０ｃｍ２）を通して濾過した。このステップはかなりの長時間（９時間）が必要があったが、これは主として膜処理物中の沈澱形成と処理物中の蛋白質濃度の増加に伴う膜の汚れのためである。リフォールドしたサンプル中の蛋白質の９５％は１００Ｋの膜に不溶物の形の７５％とともにと不溶解物の状態の７９％は１００Ｋの膜に保持された。１００Ｋでの保持物は非常に低い活性であり、廃棄した。１００Ｋの濾過液は、ｃ−ｅｒｂＢ−２に結合する活性を有して可溶性ｓＦｖの大部分を含んでいた。次にミニタンに取りつけた１０ＫのＭＷＣＯ膜（１０，０００ ｍｏｌ．ｗｔ．カットオフ）（４×６０ｃｍ２）を使って１００ｍｌの容量（５０×）に濃縮した。この物質は、さらに５０ｍｌのアミコンスティアードセルのＹＭ１０ １０Ｋ ＭＷＣＯ膜を使用して、最終容量５．２ｍｌまで濃縮した（１０００×）。極わずかな沈澱が２回の１０Ｋ濃縮操作で発生しただけだった。この濃縮物の比活性は、最初の透析リフォールディング物に対して相対的にみて有意に増加していた。
【０１１４】
Ｅ．濃縮ｓＦｖのサイズ排除クロマトグラフィー
折り畳まれたｓＦｖはサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した時に、全ての５２０Ｃ９ ｓＦｖ活性は、折り畳まれたモノマーの位置に溶出することが確認された。活性なモノマーを多く得るために、１０００倍濃縮ｓＦｖ試料を、０．５Ｍ尿素を加えたＰＢＳＡ（２．７ｍＭ ＫＣＩ，１．１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，１３８ｍＭ ＮａＣｌ，８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・ ７Ｈ２Ｏ，０．０２％ＮａＮ３）中で、セファクリルＳ−２００ ＨＲカラム（２．５×４０ｃｍ）で分画した。カラムからの溶出パターンとフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、二つのｓＦｖモノマーのピークを示した。二つのｓＦｖモノマーピークフラクションはプールして（全１０ｍｌ）、ｃ−ｅｒｂＢ−２結合活性を拮抗分析で表示した。
【０１１５】
Ｆ．５２０Ｃ９ ｓＦｖのアフィニティー精製
ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はバキュラウイルス感染昆虫細胞で発現させた。この蛋白質（ＥＣＤ ｃ−ｅｒｂＢ−２）はアガロースアフィニティーマトリックスに固定化させた。ｓＦｖモノマーのピークは尿素を除くためにＰＢＳＡに対して透析を行った。そして次いで、ＰＢＳＡで０．７×４．５ｃｍ ＥＣＤ ｃ−ｅｒｂＢ−２−アガロースアフィニティカラムに適用した。カラムはＡ２８０がベースラインになるまで洗浄し、ＰＢＳＡ＋３Ｍ ＬｉＣｌ，ｐＨ＝６．１で溶出した。ピークのフラクションを集め（４ｍｌ）、そしてＰＢＳＡに対して透析を行ってＬｉＣｌを除去した。精製ｓＦｖ
７２μｇが７５０μｇのＳ−２００モノマーフラクションから得られた。カラムフラクションでの活性測定は拮抗分析によって行った。簡潔に言えば、ｓＦｖアフィニティ精製フラクションとＨＲＰ−複合５２０Ｃ９ＦａｂフラグンメントはＳＫ−ＢＲ−３の膜に対する結合に拮抗することが確認された。ｓＦｖ調製物の充分な結合は、ＨＲＰ−５２０Ｃ９Ｆａｂフラグメントの膜への結合を抑制した。さらにＨＲＰ基質の抑制と減少を行ったが色沢は変化しなかった（拮抗分析の詳細は以下を参照のこと）。その結果は、実際にはｓＦｖ活性の全てがカラムに結合し、溶出ピークに回収された（図４）。期待したように、溶出したピークの比活性はカラムのサンプルに対して相対的に増加していた。そしてこれらの測定の実験誤差の範囲内で、コントロールのペアレントＦａｂと、必然的に同じ結
果を示した。
【０１１６】
９．精製後の収量
表Ｉに精製工程中の種々の５２０Ｃ９調製物の回収率を示した。蛋白質濃度（μｇ／ｍｌ）はバイオラッド プロテインアッセイで測定した。”全収量”の下の３００ＡＵは、０．４１の培養液から３．１５ｇのインクルージョンボディーが含まれている保有ｓＦｖを変成させたものである。酸化緩衝液は２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、６ＭＧｕＨＣｌ、１ ｍＭＧＳＳＧ、０．１ｍＭ
ＧＳＨ、ｐＨ９．０を使用した。酸化は室温で一夜行った。酸化後のサンプルは、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ尿素、ｐＨ ８．０の溶液に対して透析を行った。アフィニティクロマトグラフィーはＰＢＳＡで行ったが、それ以外の工程全ての緩衝液はこれを使用した。
【０１１７】
【表１】
１０．イムノトキシンの構築
リシンＡ−５２０Ｃ９ 一本鎖融合イムノトキシン（配列表配列番号７）をコードする遺伝子は、ｐＰＬ２２９（シータース エメリービル カリフォルニア）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ上のリシンＡ鎖をコードする遺伝子を単離し、図３に示したようにｐＨ７７７の５２０Ｃ９の上流を使用して構築した。融合体はリシンのＡドメインとＢドメインの間に１２２アミノ酸の天然のリンカーを有している。しかし、オリジナルなｐＲＡＰ２９９発現ベクター中を、リシンのアミノ酸２６８のコドンが、翻訳停止コドンＴＡＡに変換していたため、得られた遺伝子の発現は、リシンＡのみを生産していた。それ故、翻訳停止コドンを除去する目的で、部位直接突然変異を行ってＴＡＡを除去し、天然型のセリンコドンに置き換えた。次いで完全なイムノトキシン遺伝子を連続させて、この遺伝子を翻訳させた。
【０１１８】
ｐＰＬ２２９およびｐＲＡ２２９発現ベクターにイムノトキシンのバックを挿入するため、イムノトキシン遺伝子の末端のＰｓｔＩ部位をベクターのＢａｍＨＩと両立した配列に変換する必要がある。ＰｓｔＩと末端の間にＢｃｌＩ部位を含んでいる合成オリゴヌク
レオチドアダプターが挿入された。ＢｃｌＩとＢａｍＨＩ末端は両立しており、ハイブリッドＢｃｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に重ねあわせることができた。ＢｃｌＩヌクレアーゼは、ｄａｍメチレーションに感受性が高いため、構築にあたって最初に、プラスミドＤＮＡをＢｃｌＩ（およびＨｉｎｄＩＩＩ）で消化する目的で、ｄａｍ（−）Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｇｍ４８に形質転換させた。次いでＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｃｌＩフラグメントバック上の完全なイムノトキシン遺伝子を、発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｃｌＩ分解位置に挿入した。
【０１１９】
天然型５２０Ｃ９ ＩｇＧを天然また組換えリシンＡ鎖と結合させた時、得られたイムノトキシンは、０．４×１０−９Ｍの濃度でＳＫ−Ｂｒ−３細胞の蛋白質合成の５０％を阻害できる。さらにＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞の反応に加えて、天然の５２０Ｃ９ ＩｇＧ１イムノトキシンは、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３を阻害し、そのＩＤ５０は２．０×１０−９Ｍであった。
【０１２０】
上記のリシンＡ − ｓＦｖ融合蛋白質では、リシンは発現のリーダとして作用する、即ちｓＦｖのアミノ末端に融合している。ダイレクトエクスプレッションに従うと、溶解蛋白質は天然５２０Ｃ９のＦａｂに対して抗体として反応し、リシンＡ鎖の酵素活性作用を有している。
【０１２１】
別のデザインでは、リシンＡ鎖はｓＦｖのカルボキシ末端に融合している。５２０Ｃ９
ｓＦｖは、ｓＦｖのＣ末端に結合したリシンＡ鎖と一緒に、Ｐｅ１Ｂシグナル配列を介して分泌される。これを構築するためには、ＰｅｌＢ−シグナル配列、ｓＦｖ、リシンをコードする配列をｓＦｖ （発現プラスミド中の）のすぐ後のＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してブルースクリプトプラスミドに結合させる。さらにＨｉｎｄＩＩＩ部位は、３つの部分の集まり（ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ）においてルシン遺伝子より先行する。リシン遺伝子に続く新しいＰｓｔＩサイトは、ブルースクリプト ポリリンカーを介して得ることができる。このＤＮＡ変異は、ｓＦｖの末端でストップコドンとオリジナルのＰｓｔＩサイトを除去し、幾つかのセリン残基をｓＦｖとリシン遺伝子の間に置くところにある。この新しい融合遺伝子Ｐｅ１Ｂシグナル配列／ ｓＦｖ ／リシンＡは発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントに挿入できる。
【０１２２】
別のデザインでは、リシンＡ鎖のアナログであるシュードモナスエキソトキシンフラグメントＰＥ４０を抗ｃ−ｅｒｂＢ−２ ７４１８ ｓＦｖ（配列表配列番号１５および１６）のカルボキシ末端に融合させている。得られた７４１Ｆ８
ｓＦｖ −ＰＥ４０は一本鎖Ｆｖ− トキシン融合蛋白質であり、蛋白質に最初から存在している１８残基短いＦＢリーダーで構築する。この蛋白質のＥ．ｃｏｌｉでの発現は、３Ｍ尿素 グルタチオン／レドックス緩衝液中でリフォールディングしたインクルージョンボディーを生産した。得られたｓＦｖ −ＰＥ４０は、対応する架橋イムノトキシンと比べて、ｃ−ｅｒｂＢ−２保持細胞をより完全にかつ明らかにより強い細胞障害作用で、特異的に殺すことができた。７４１Ｆ８ ｓＦｖと同様に、ｓＦｖ −毒素蛋白質は、この方法で効率良く調製できる。乳癌や卵巣癌などのｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原を保持する腫瘍に対する治療剤、診断剤として使用できる。
【０１２３】
１１．分析
Ａ．拮抗ＥＬＩＳＡ
ＳＫ−Ｂｒ−３抽出物を以下のようなｃ−ｅｒｂＢ−２抗原のソースとして調製した。ＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞（Ｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：３０７０− ３０８０）は、５％ウシ胎児血清と２ｍＭグルタミン添加イソコブの培地（ギブコＢＲＬゲイタースバーグＭＤ）でコンフルエンスに近い状態まで培養した。培地を吸引除去して、細胞をカルシウムとマグネシウムを添加した１０ｍｌ
のウシ胎児血清（ＦＢＳ）ですすぎ洗い、ゴムの付いたガラス棒でカルシウムとマグネシウムを添加したＦＢＳに取り出した。培養容器は新しいこの緩衝液５ｍｌですすいだ。１００ｒｐｍの遠心分離で細胞を回収した。上清を吸引除去し、細胞を１０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、ｐＨ８の緩衝液（ＴＮＮ緩衝液）１０ｍＭを用いて１０７細胞／ｍｌの密度になるように再分散させた。そしてピペッティングでアップダウンを行い、ペレットを溶解させた。溶液は１０００ｒｐｍで遠心し、細胞核とその他の不溶解残渣を除去した。抽出物は０．４５のマイレックスＨＡと０．２のマイレックスＧｖフィルターで濾過した。ＴＮＮ抽出物はアリコートとして、ホエートン凍結用バイアルに入れて−７０℃で保存した。
【０１２４】
ＳＫ−Ｂｒ−３ ＴＮＮ抽出物の新鮮なバイアルは解凍し、そして脱イオン水で２００倍に希釈した。その後直ちに、ダイナテックＰＶＣ９６ウエルプレートに、１ウエル当たり４０μｇを入れ、３７℃の乾燥インキュベータで一晩保持した。プレートはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％脱脂乳、０．０５％ツイーン２０の溶液で４回洗浄した。
【０１２５】
非特異的な結合部位は以下のようにしてブロックした。プレートが乾燥後、１％脱脂乳を含むＰＢＳ １００μｇを各ウエルに加え、１時間室温でインキュベートして反応を進行させた。
【０１２６】
一本鎖Ｆｖ試験サンプルと標準５２０Ｃ９ホール抗体希釈物を以下のように加えた。５２０Ｃ９抗体と試験サンプルは、２倍希釈法により希釈緩衝液（ＰＢＳ＋１％ 脱脂乳）で希釈した。最初に５０μｇ／ｍｌにし、最後に標準５２０Ｃ９を少なくとも１０回希釈する。希釈緩衝液のみを含むコントロールも調製する。希釈サンプル、標準とも５０μｌをウエルに加え室温で３０分間インキュベートした。
【０１２７】
５２０Ｃ９ −ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）プローブを次のように加えた。５２０Ｃ９−ＨＲＰ複合体（ザイムド ラボ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）は１％脱脂乳を含む希釈緩衝液で１４μｇ／ｍｌに希釈した。最適の希釈は、前のステップを省くことなしに、ペルオキシダーゼ複合体の新しいバッチごとに決定する。２０μｌのプローブを各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートはＰＢＳで４回洗浄した。ペルオキシダーゼの基質をさらに添加した。基質溶液は、希釈テトラメチルベンジジンストック（ＴＭＢ；２ｍｇ／ｍｌ １００％エタノール）１：２０と基質緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｎａ ＥＤＴＡ，ｐＨ５．０）中の３％過酸化水素ストック１：２２００を使用する都度調製する。これを室温で３０分間インキュベートする。ウエルに０．８Ｍ硫酸を１００μｌ加え、酵素反応を止め、１５０ｎｍで吸収を測定した。
【０１２８】
図４は、ペアレントのリフォールドしているが未精製５２０Ｃ９モノクローナル抗体、５２０Ｃ９ Ｆａｂフラグメント、および結合後アフィニティーカラムからの溶出（溶出）、または非結合通過フラクション（通過）５２０Ｃ９ ｓＦｖ一本鎖結合部位の結合能を比較した。図４には完全に精製した５２０Ｃ９ ｓＦｖは測定蛋白質濃度の誤差範囲でペアレントなモノクローナル抗体と区別が困難であるｃ−ｅｒｂＢ−２に親和性を有することを示している。
【０１２９】
Ｂ．インビボ試験
培養増殖する乳癌細胞に対して、強い蛋白質合成阻害を示すイムノトキシンは、インビボでその有効性を試験できる。インビボ分析は、ヒト乳癌細胞株ＭＸ−１を移植したヌードマウスモデルを使用して一般的に行うことができる。マウスにはＰＢＳ（コントロール）、種々の濃度のｓＦｖ −毒素のイムノトキシンを注射し、濃度依存的に腫瘍の増殖が抑制されることが観察される。より高い濃度のイムノトキシンの投与がより効果を示すこ
とが予測される。
【０１３０】
本発明はその精神と範囲から離れることなしに、その他の特徴的な形態を実施することが可能である。従って本発明の実施は、説明されているように、そして限定なしに、全てに関して考慮されている。発明の範囲は、記載の説明よりむしろ付属のクレームによって示されており、クレームが意味し均等の範囲からくる全ての変更は、それらを包含するものである。
【０１３１】
（配列表）
【０１３２】
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
本発明の先に示した内容、さらにその他の目的に関する種々の特徴は、本発明と同様に、図面とともに説明を熟読して、以下に示す説明を充分に理解されるものである。
【図１Ａ】図１Ａは本発明のｓＦｖをコードするＤＮＡの構築を模式図で示したものである。ドメインをコードするＶＨおよびＶＬとリンカー部分を示している。
【図１Ｂ】図１ＢはＶＨとＶＬドメインを表しているＦｖの構造を模式図で示した。３つの相補的決定部分（ＣＤＲｓ）と公知の特徴付けられたモノクローナル５２０Ｃ９の４つのフレームワーク部分（ＦＲｓ）からなっており、ｃ−ｅｒｂＢ−２に特異的なマウスモノクローナル抗体である。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ａはぺンダントリーダー配列を有するｓＦｖである。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２ＢはｓＦｖ −毒素（あるいはその他の補助蛋白質）の構成である。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ｃは二価あるいは二特異性ｓＦｖの構成を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ｄはカルボキシ末端にペンダント蛋白質が結合した二価ｓＦｖを示す。
【図２Ｅ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ｅはアミノ末端とカルボキシ末端両方にぺンダント蛋白質を持つ二価ｓＦｖを示す。
【図３】図３は、５２０Ｃ９ ｓＦｖ − リシンＡの融合した免疫毒素遺伝子をコードするプラスミドの構築を図式化して示す。
【図４】図４は５２０９モノクローナル抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２特異的）のｃ−ｅｒｂＢ−２結合活性を比較する拮抗分析の結果をグラフ化して示したものである。モノクローナル抗体のＦａｂフラグメント（黒点）と５２０Ｃ９モノクローナル抗体の可変領域から構築したｃ−ｅｒｂＢ−２に一本鎖−Ｆｖ結合部の異なる親和性で精製したフラクション（ｓＦｖ全サンプル（＋）、ｓＦｖに結合しｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイン固定化カラムから溶出したもの（四角）、ｓＦｖ溶出（未結合、＊）を表す。
【技術分野】
【０００１】
（癌マーカー用生物合成結合蛋白質）
（発明の分野）
本発明は、一般的には、新規な生物合成組成物に関し、特に生物合成抗体結合部位（ＢＡＢＳ）の蛋白質とそれらの融合体に関する。本発明の組成物は、例えば薬剤や毒物を用いた種々の癌の免疫学的治療やターゲッティング、イメージングに有用であり、さらに特異的なバインディングアッセイ、アフィニティーによる精製法および生体触媒として有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
乳癌は、北米では女性の最も多い悪性疾患であり、１９８７年には１３０，０００人の新患者が発生している。おおよそ女性は１１人に１人の割合での一生の間に、乳癌が発生し、米国の女性にとっては、肺癌に次いで第２位の癌による死亡の原因となっている。乳癌女性の大多数は完全に切除可能疾患であったにもかかわらず、転移病巣が残存しており、完治させるためには障害となる。補助化学療法やホルモン療法は、病巣のない場合の延命と、完全切除の乳癌女性の特定の群の全体的な延命に対して明らかな有効性を示が、一般的な女性の場合は、未だに転移病巣によって悪い状態のままである（Ｆｉｓｈｅｒ他，１９８６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，４：９２９−９４１；”Ｔｈｅ Ｓｃｏｔｔｉｓｈ ｔｒｉａｌ”，Ｌａｎｃｅｔ，１９８７，２：１７１−１７５）。適切に選定された患者に対する化学療法やホルモン療法によって、正しく誘導性の目的とする応答が起こったとしても、転移性乳癌の完治は達成されない（Ａｉｓｎｅｒ他，１９８７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，５：１５２３−１５３３）。この目的のために、新しい薬剤の使用、薬剤の併用、高容量療法（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ他 同上）や投与量増強療法（Ｋｅｒｎａｎ他、１９８８、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２５９ ：３１５４−３１５７）を含む革新的な治療計画が多用されている。改善は認められてはいるが、完治への最初のステップである転移病巣の完全な寛解の一般的な達成は未だ得られていない。治療のための新しいアプローチが求められている。
【０００３】
免疫グロブリンのＦｖフラグメント分子はＩｇＭおよびまれな場合にはＩｇＧあるいはＩｇＡなどから蛋白分解によって調製できる。さらにこのＦｖフラグメントは通常の抗原結合部位に存在する非共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロダイマーを有している。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって結合したＶＨとＶＬをコードする遺伝子を含む融合遺伝子の発現される共有的に結合したＶＨ−ＶＬヘテロダイマーである。引用により本発明と一体となっているＨｕｓｔｏｎ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．８５：５８７９の文献を参照のこと。
【０００４】
米国特許４，７５３，８９４号公報にはヒト乳癌細胞に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体が開示されており、リシンＡ鎖との融合体は、１０ｎＭ以下でＭＣＦ−７，ＣＡＭＡ−１，ＳＫＢＲ−３，ＢＴ−２０等の細胞の少なくとも１種に対して５０％のＴＣＩＤを示す。モノクローナル抗体５２０Ｃ９はＳＫＢＲ−３細胞を特異的に認識する。５２０Ｃ９の名称で特定された抗体はマウスハイブリドーマから分泌され、さらにｃ−ｅｒｂＢ−２を認識することが知られている （Ｒｉｎｇ他、１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２８：９１５）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドとして公知であった蛋白質のクラスの新規合成物を特徴としている。このポリペプチドは、生物合成一本鎖ポリペプチドの結合部位（ＢＡＢＳ）を含み、ｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合する免疫グロブリン分子の免疫学的結合特性を示す結合部位を特定している。
【０００６】
ｓＦｖは、ポリペプチドリンカーによって連結された少なくとも２つのポリペプチドからなり、一つのドメインのカルボキシ（Ｃ）末端と他のドメインのアミノ（Ｎ）末端をリンカーがつないでおり、それぞれのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、一セットのフレームワーク部位（ＦＲｓ）の間に挟まれている一セットの相補性決定部位（ＣＤＲｓ）を含み、ＣＤＲｓはｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に対する免疫学的結合に関与している。
【０００７】
その広範な目的において、本発明は、生物合成性抗体の結合部位を含む一本鎖Ｆｖポリペプチドを特徴としており、さらにはこれらのポリペプチドを含み、且つこれらのポリペプチドをコードするＤＮＡを発現することが可能である、組換えＤＮＡ技術によって調製された複製可能な発現ベクターにあり、さらにまた、これらのポリペプチドの生産方法、ｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原を発現している腫瘍をイメージングする方法およびこれらのポリペプチドを用いて、結合蛋白質や融合物の作用によるターゲッティング可能な治療剤を使用して腫瘍を治療する方法にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合する免疫グロブリン分子の免疫学的結合機能を有する結合部位で特定される一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドであって、該ｓＦｖが、一つのドメインのＣ末端と他の１つのＮ末端の間の距離をつなぐポリペプチドリンカーでつながっている少なくとも２つのポリペプチドドメインからなり、上記のポリペプチドドメインのそれぞれのアミノ酸配列が一組のフレームワーク領域（ＦＲｓ）の間に挿入された相補的決定領域（ＣＤＲｓ）からなり、該ＣＤＲｓが上記ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原への免疫学的結合性を与えるＣＤＲｓである、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチド、に関する。
【０００９】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ＣＤＲｓは、５２０Ｃ９、７４１Ｆ８、４５４Ｃ１１モノクローナル抗体からなる群から選択されるｃ−ｅｒｂＢ−２結合免疫グロブリン分子のＣＤＲｓと実質的にホモローガスである。
【００１０】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ｓＦｖの各ＣＤＲｓおよび各ＦＲｓのアミノ酸配列は、５２０Ｃ９抗体の可変領域のＣＤＲｓおよびＦＲｓのアミノ酸配列と実質的にホモローガスである。
【００１１】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ポリペプチドリンカーは、配列表配列番号４のアミノ酸残基番号１１８−１３３として配列表に示されているアミノ酸配列からなる。
【００１２】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記ポリペプチドリンカーは、配列表配列番号６のアミノ酸残基１１６−１３５または配列表配列番号１５のアミノ酸残基１２２−１３５、およびアミノ酸配列配列表配列番号１２および配列表配列番号１４に示されているアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる。
【００１３】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、一本鎖Ｆｖポリペプチド
は、上記ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原を有する細胞のイメージングを可能にするために遠隔的に検出可能な成分が結合している。
【００１４】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記の遠隔的に検出可能な成分は放射性原子である。
【００１５】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記結合ドメインのＮまたはＣ末端に結合する第３のドメインは、ＦＲｓの間に挿入されたとＣＤＲｓを特定しかつ第二の免疫学的に活性な部位を特定するアミノ酸配列からなる。
【００１６】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、一本鎖Ｆｖポリペプチドは、さらに第四のポリペプチドドメインを含み、上記第三のドメインと第四のドメインがともに、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に免疫学的に結合する第二の部位からなる。
【００１７】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、一本鎖Ｆｖポリペプチドは、上記の結合したドメインのＮまたはＣ末端に結合した毒素をさらに含む。
【００１８】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記毒素は、シュードモナス エンドトキシン、リシン、リシンＡ鎖、フィトラシンおよびジフテリアトキシンからなる群から選択された毒性部分からなる。
【００１９】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドの一つの実施形態において、上記毒素は少なくともリシンＡ鎖の一部分からなる。
【００２０】
さらに本発明は、上記ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列、に関する。
【００２１】
さらに本発明は、次のステップからなるｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に特異性を有する一本鎖ポリペプチドを生産する方法、に関する：
（ａ）上記ＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして形質転換体を生産し、（ｂ）上記形質転換体を培養して上記一本鎖ポリペプチドを生産する。
【００２２】
さらに本発明は、次のステップからなるｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を発現する腫瘍をイメージングする方法、に関する：
（ａ）上記ポリペプチドからなるイメージング剤を準備し、（ｂ）イメージング剤が腫瘍に結合した後に上記腫瘍の体外検出を充分に可能にする量の上記イメージング剤を生理学的に受容可能なキャリアーとともに上記腫瘍をもつ哺乳動物に投与する、（ｃ）上記対象における遠隔的に検出可能な成分の位置を検出して上記腫瘍の像を得る。
【００２３】
さらに本発明は、上記ＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞、に関する。
【００２４】
さらに本発明は、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原発現腫瘍の成長をインビボで阻害する方法であって、上記一本鎖Ｆｖと少なくともそれに結合した第一の成分ペプチドからなり、該ペプチドが腫瘍細胞の増殖を抑制することのできるからなる治療剤を腫瘍を阻害する量投与することからなる方法、に関する。
【００２５】
本発明の上記方法の一つの実施形態において、上記第一の成分は細胞毒素またはその毒性フラグメントからなる。
【００２６】
本発明の上記方法の一つの実施形態において、上記第一の成分は上記腫瘍細胞の増殖を阻害するために充分な放射能活性をもつラジオアイソトープからなる。
【００２７】
さらに本発明は、上記ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列、に関する。
【００２８】
本発明の用語は以下に示すものである。”免疫学的結合”あるいは”免疫学的な反応性”とは免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的である抗原の間に起こる非共有性結合を意味する。”ｃ−ｅｒｂＢ−２”とは乳癌および卵巣癌細胞のような腫瘍細胞の表面に発現している蛋白抗原であって、等電点約５．３、分子量２００，０００の酸性糖蛋白質であり、配列表配列番号１および２に示したアミノ酸配列を含んでいるものを意味する。”ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原”とは、乳癌および卵巣癌細胞のような腫瘍細胞の表面に存在している蛋白質であって、ｃ−ｅｒｂＢ−２抗原と抗原特性的に関連したものである。即ちｃ−ｅｒｂＢ−２抗原に結合可能な免疫グロブリンであって、例えば５２０Ｃ９，７４１Ｆ８，４５４Ｃ１１抗体のような免疫グロブリンと結合する蛋白質、あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを持ち、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを持つ蛋白質である。ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原として上皮成長因子のレセプターを例示する。
【００２９】
免疫グロブリンＣＤＲに”実質的にホモーローガス”であるｓＦｖＣＤＲは、少なくとも免疫グロブリンＣＤＲのアミノ酸配列の少なくとも７０％好ましくは８０％または９０％が残存しており、免疫グロブリンの免疫学的な結合能を有しているものである。
【００３０】
”ドメイン（領域）”の用語は、天然のコンフォメーションでは単一な球状部分に折り畳まれたポリペプチドの配列を意味しており、個別の結合能あるいは機能特性であっても良い。ここで使用する”ＣＤＲ”あるいは相補的決定部位とは、結合親和性と天然の免疫グロブリン結合部位のナチュラルなＦｖ部分の特異性の両方で特定されるアミノ酸配列を意味しており、あるいはこの機能を模倣した合成ポリペプチドであっても良い。ＣＤＲｓは通常、ナチュラルなＦｖの高度可変領域に対しては全くホモロジーがない。しかし特異的なアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいても良い。このアミノ酸配列は高度可変領域の側面にあり、これまで相補性に直接係わらないフレームワークと考えられていた。”ＦＲ”またはフレームワーク部位（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）の用語は、ここでは免疫グロブリンのＣＤＲｓの中に通常認められるアミノ酸配列を意味する。
【００３１】
本発明に従って調製された一本鎖のＦｖポリペプチドは、あらかじめ選択されたｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはその関連抗原性物質に結合するためにデザインされた、ポリペプチドを定義付けている、生物合成的に調製されたアミノ酸の新規な配列を含んでいる。この合成ポリペプチドの構造は、天然に得られる抗体、そのフラグメント、公知の合成ポリペプチドの構造とは異なっており、また、結合の親和性と特異性に関与している一本鎖Ｆｖの部位（天然の抗体の可変領域（ＶＨ／ＶＬ）に対する変異体）を持つ”キメラ抗体”はそれ自身、キメラであっても良いが、この場合例えば同一か又は異なる種由来の、少なくとも２つの異なった抗体分子の一部とホモローガスかあるいは由来するアミノ酸配列を含むキメラ体である。この変異ＶＨとＶＬ領域は、生物合成性リンカーペプチドに結合したぺプチドを介して、一方のＮ末端から他方のＣ末端に結合している。
【００３２】
本発明は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合可能な、少なくとも一つの完全な結合部位で特徴づけられた一本鎖のＦｖポリペプチドを提供するものである。一つの完全な結合部位は、二つのポリペプチドドメイン、例えば一つのアミノ酸リンカー領域によって連結したＶＨとＶＬを有するアミノ酸の単一の連続した鎖を含むものである。２つの結合部位のようなｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に結合できる一つ以上の完全な結合部分を含んでいるｓＦｖは、４つのポリペプチドドメインを有する１本の連続したアミノ酸鎖であり、このドメインはそれぞれ相互にＶＨ１−リンカー−ＶＬ１−リンカー−ＶＨ２−リンカー−ＶＬ２のようにアミノ酸のリンカー部分を介して共有結合的につ
ながっている。本発明のｓＦｖは、（ＶＨｎ−リンカー−ＶＬｎ）ｎで表すことのできる複数の結合部位を含むことができる（ここでｎはｎ＞１）。さらに、このドメインはｎ個の抗原結合部位とｎ×２個のポリペプチドドメインを有する連続したアミノ酸の一本鎖とすることもできる。
【００３３】
本発明の好ましい実例において、一本鎖Ｆｖポリペプチドは第一の種由来の免疫グロブリン分子の可変部分のＣＤＲｓのアミノ酸配列の少なくとも一部分と基本的にホモローガスであるＣＤＲｓを含んでおり、さらに第二の種由来の免疫グロブリン分子の可変部分のＦＲｓのアミノ酸配列の少なくとも一部分と実質的にホモローガスであるＦＲｓを含んでいる。好ましくは、第一の種はマウスであり、第二の種はヒトである。
【００３４】
それぞれのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、一組のＦＲｓ間に挿入されている一組のＣＤＲｓを含んでいる。本発明においては、”ＣＤＲｓの組み合わせ”の一組は各ドメインの３ ＣＤＲｓを意味し、”ＦＲｓの組み合わせ”の一組は各ドメインの４ ＦＲｓを意味している。構造の検討のために、免疫グロブリン由来のＣＤＲｓの完全な一つの組み合わせが使用できるが、特定の残基の置換が生物学的活性を促進するためには好ましい。この生物学的活性はｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を結合する免疫グロブリンの種のＣＤＲｓ中に保存されている残基の観察に基づいている。
【００３５】
本発明の好ましいその他の実例においては、ポリペプチド鎖のＣＤＲｓは５２０Ｃ９，７４１Ｆ８，４５４Ｃ１１のモノクローナル抗体のいずれか一つの可変領域のＣＤＲｓに実質的にホモロ−ガスなアミノ酸配列を有している。５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓは配列表に示しており、配列表配列番号３および４のアミノ酸残基番号３１−３５、５０−６６、９９−１０４、１５９−１６９、１８５−１９１、２２４−２３２が対応している。
【００３６】
一つの実例ではｓＦｖはヒト型ハイブリッド分子であって、１またはそれ以上のヒト免疫グロブリン分子由来のＦＲｓの間に挿入されたマウス５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓを含んでいる。このハイブリッドｓＦｖは、このように、ヒトＦＲのアミノ酸配列によって適切な免疫化学的結合性コンフォメーションを保持している、ｃ−ｅｒｂＢ−２抗原またはｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に高い特異性のある結合部分を含んでいる。さらにまた、このハイブリッドｓＦｖは、ヒトの生体では異物として認識されないことが好ましい。
【００３７】
別の実例においては、ポリペプチドリンカー部分は、配列表配列番号３と４にアミノ酸残基番号１２３−１３７として配列を示しているアミノ酸配列、および配列表配列番号１１と１２にアミノ酸残基番号１−１６として配列を示しているアミノ酸配列を含んでいる。別の実例では、リンカー配列は、配列表配列番号９と１０にアミノ酸残基番号４１０−４２４として配列を示しているアミノ酸配列、および配列表配列番号１３と１４にアミノ酸残基番号１−１５として配列を示しているアミノ酸配列を含んでいる。
【００３８】
さらに上記の一本鎖ポリペプチドは、それらに結合した遠隔的に検出可能な、ｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原を持った腫瘍のイメージングや放射化免疫療法に採用することのできる成分を含んでいることがある。“遠隔的に検出可能”な成分とは、ｓＦｖに結合した成分が外部およびその成分の部位から離れている場合でも検出できることを意味している。イメージングのために遠隔的に検出可能な成分として好ましくは、９９ｍテクネチュウム（９９ｍＴｃ）のようなガンマー線源である放射性原子を含むものを上げることができる。高容量の放射化免疫療法のための好ましいヌクレオチドとしては、９０イットリウム（９０Ｙｔ）、１３１ヨウ素（１３１Ｉ）、１１１インジュウム（１１１Ｉｎ）を含むものを上げることができる。
【００３９】
さらに、ｓＦｖは融合遺伝子に由来する融合蛋白質を含んでいることがある。この場合
発現ｓＦｖ融合蛋白質は結合性部位のポリペプチドにペプチド結合している補助的なポリペプチドを含んでいる。好ましい実例として、補助的ポリペプチドセグメントは、さらにまたｃ−ｅｒｂＢ−２あるいは関連抗原に結合親和性を有しており、三番目あるいはさらに四番目のポリペプチドドメインを含んでいてもよい。これらのポリペプチドドメインはＦＲｓの間に挿入されたＣＤＲｓを特定するアミノ酸配列から構成されており、そして上記の第一のポリペプチドに対すると同様な第二の一本鎖ポリペプチドの生物合成結合部位を一緒に形成する。
【００４０】
別の実例において、補助的なポリペプチド配列は、ｓＦｖのＮ末端またはＣ末端に対して結合した毒素を構成する。この毒素として、シュードモナスのエンドトキシンの毒素部分、フィトラシン、リシン、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素あるいはリシンＡ鎖様のリボゾーム性蛋白質阻害物として公知の蛋白質を上げることができる。リボゾームのレベルで蛋白質合成を阻害する蛋白質としては、ポークウイードの抗ウイルス性蛋白質、ゲロニン、大麦リボゾーム蛋白質阻害物などがある。その他の実例では、ｓＦｖは、ｓＦｖの内部組み込みを促進する、少なくとも第二のポリペプチドあるいは成分を含むことができる。
【００４１】
本発明は、さらにまたｓＦｖを調製するための方法を含み、この方法は、一本鎖のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、かつ、発現させる複製可能な発現ベクターを得るためのステップ、宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトし形質転換体を得、形質転換体を培養してｓＦｖポリペプチドを生産する方法からなっている。
【００４２】
本発明はさらにまた、ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連腫瘍抗原を発現している腫瘍をイメージングする方法を含む。この方法は、上記の一本鎖Ｆｖポリペプチドを含有するイメージング剤を投与するステップと遠隔的に検出可能な成分を結合させることからなる。この方法は、体外での腫瘍の検出を可能にするに充分な、製剤学的に許容されたキャリアーを用いたイメージング剤の、一定量を使用して、腫瘍のひそむ臓器にイメージング剤を投与し、薬剤が腫瘍に結合したことを確認して、そして腫瘍像の視覚化を行うために非結合剤を充分に排出させた後、患者における成分の分布を検出することからなる。
【００４３】
本発明は、さらにまたｃ−ｅｒｂＢ−２あるいは関連抗原の発現している腫瘍の増殖をインビボで抑制することによって癌を治療する方法を含む。この方法は、発明のｓＦｖを含む治療剤の腫瘍抑制量を癌患者に投与し、さらにすくなくとも最初のペプチド成分が腫瘍に結合し、腫瘍細胞の増殖を抑制させることを含む。
【００４４】
好ましくは最初の成分は毒素またはリシンＡのような毒素のフラグメントを含んでいる。さらにまた９０イットリウム（９０Ｙｔ）、１１１インジュウム（１１１Ｉｎ）、１３１ヨウ素（１３１Ｉ）のような腫瘍細胞の増殖を阻害するに充分な放射能活性を有する放射性同位元素を含んでいる。治療剤はさらにその有効性を促進するような第二の成分を少なくとも含んでいても良い。
【００４５】
本発明である天然型の活性を有し、対応する免疫グロブリンのＦｖよりも相対的に小さな、一本鎖のＦｖあるいは適切なｓＦｖ融合蛋白質の臨床的な投与は、より大きななフラグメントあるいは完全な抗体分子の使用と比較して多くの利点がある。本発明の一本鎖ＦｖおよびｓＦｖの融合蛋白質は、循環する蛋白分解酵素によって切断される部位を殆ど有していないため、非常に安定である。標的臓器に速やかに到達し、そして生体から速やかに排出されるため、腫瘍を検出するための理想的なイメージング剤であり、腫瘍を殺すための理想的な放射化免疫治療剤となる。
【００４６】
さらにまた、これらは非特異的な結合性がなく、マウス抗体に比べて抗原性が殆どない。さらに、単一の遺伝子からの発現は、その他の分子や薬剤と特異的にカップリングさせ
るその他の毒素蛋白質あるいはペプチド配列との融合によってターゲッティングへの応用が容易になる。さらに、本発明の幾つかのｓＦｖ誘導体または融合蛋白質は、細胞の表面にｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはその関連抗原と共通に結合した場合、腫瘍細胞の表面に発現したｃ−ｅｒｂＢ−２あるいはその関連抗原の内在化を促進する作用を持つ。この方法は、適切なデザインの一本鎖−Ｆｖ−毒素の融合体を用いてこのような抗原の発現した細胞の選択的な死滅を可能にする。本発明のｓＦｖ −毒素融合蛋白質は、抗体全体あるいはＦａｂと化学的に交差結合させた毒素を含む共有結合体と比べて１５−２００倍以上も高い殺腫瘍細胞活性を有している。
【００４７】
悪性化した細胞でのｃ−ｅｒｂＢ−２あるいは関連レセプター過剰発現は、腫瘍が良性な局所型であるか転移性であるか、腫瘍細胞のｓＦｖの種のターゲッティングを可能にする。上記の場合、ｓＦｖ−毒素融合蛋白質の内在化が、ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原が過剰に発現した腫瘍細胞の特異的な破壊をさせる。別の例では、感染細胞、悪性化の特性、あるいは患者個々の治療上の因子に依存して同じｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連レセプターが殆ど内在化しなかったり、安定な腫瘍抗原の個体群である場合がある。このような時、毒素融合物の内在化を利用可能にする目的以外に異なった状態で、一本鎖のＦｖとその融合蛋白質が生産的に使用することができる。ｃ−ｅｒｂＢ−２レセプター／ｓＦｖまたはｓＦｖ融合蛋白質複合体が殆ど内在化しない場合、リボゾームの不活性化によって細胞質的に機能するリシンＡ鎖のような毒素は殺細胞には有効性を示さない。それにも関わらず、一本鎖非融合Ｆｖは有用である。例えばイメージング、放射化免疫療法があげられる。同じポリペプチド鎖上の二つの異なった結合部位を有するような、種々のデザインの二特異性一本鎖Ｆｖ融合蛋白質は、その分子が特異性を示す二つの抗原に対するターゲッティングに使用可能である。例えば、二特異的一本鎖抗体として、ｃ−ｅｒｂＢ−２とサイトトキシックリンフォサイト（ＣＴＬｓ）上に存在していることが最近明らかになったＣＤ３抗原の両方に特異性を有しているものを上げることができる。この二特異的分子は、腫瘍細胞のＣＴＬ依存性溶解をもたらす、抗体依存性殺細胞活性（ＡＤＣＣ）を引き起こすことができる。同様な結果がｃ−ｅｒｂＢ−２とＦｃγレセプタータイプＩまたはＩＩに特異的な二特異的一本鎖Ｆｖを用いて得ることができる。その他の二特異的ｓＦｖの構成として、ｃ−ｅｒｂＢ−２特異的なドメインとトランスフェリンまたは上皮成長因子（ＥＧＦ）のレセプターのようなホルモンや成長因子レセプターに特異的な成長因子ドメインの組み合わせによるものを上げることができる。
【００４８】
（発明の詳細な説明）
乳癌および卵巣癌細胞、さらには癌の形態が明らかに類似している腫瘍細胞に高いレベルで発現している、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原への親和性を有する一本鎖のＦｖとｓＦｖの融合蛋白質が本発明で開示される。このポリペプチドは、生物合成した抗体結合部位として挙動する領域を構成する一つまたはそれ以上のアミノ酸配列によって特徴付けられる。図１に示したように、この部位は重鎖の可変領域（ＶＨ）１０、軽鎖の可変領域（ＶＬ）１４の一本鎖からなっている。ここでＶＨ １０とＶＬ １４はポリペプチドリンカー１２により結合されている。結合ドメインは、分離した免疫グロブリンから得ることができるＦＲｓ３２、３４、３６、３８および３２’、３４’、３６’、３８’に結合した、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連腫瘍抗原に結合することのできる免疫グロブリン分子由来のＣＤＲｓ ２、４、６と２’、４’、６’を含む。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃに示したようにＢＡＢＳの一本鎖ポリペプチド（ＶＨ １０、ＶＬ １４、リンカー１２）は遠隔的に検出可能な成分および／またはその他のポリペプチド配列１６、１８又は２２を含むことができ、これは酵素、毒素、結合部位、固定化マトリックスあるいは放射能活性原子に結合する部位などの機能を持っている。本発明は蛋白質の生産方法およびその使用方法を開示する。
【００４９】
本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドは、合成ＤＮＡ、即ち複数の化学的に合成され再クロ
−ン化されたオリゴヌクレオチドのライゲ−ションからなるまたはハイブリド−マのゲノム由来のフラグメントのライゲ−ションによる組み換えＤＮＡ、成熟Ｂ細胞クロ−ンまたは天然材料由来のｃＤＮＡライブラリ−、に一部基づいた遺伝子配列を含むプラスミドによってコ−ドされた蛋白質を発現させる宿主細胞中で合成され、再クロ−ン化されるという意味で生物合成される。
【００５０】
発明の蛋白質は、これら合成一本鎖ポリペプチドは、あらかじめ選択されたｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連腫瘍抗原への親和性を保持させるために、特異的にデザインされた３次元コンフォメーションにリフォールディングさせることができる“抗体結合部位”として正しく特徴づけられる。一本鎖Ｆｖポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＵＳ８８／０１７３７に開示されたようにして調製可能である。このＰＣＴ出願ＵＳ８８／０１７３７は、１９８９年２月６日づけで出願されたＵＳＳＮ ３４２，４４９の対応出願であり１９８７年５月２１日付け出願されたＵＳＳＮ ０５２，８００を優先権主張しており、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓＩｎｃ．が出願人であり、引用により本発明と一体となっている。本発明のポリペプチドは、その構造がｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識するために、反応性を有していることが公知の天然型抗体の部分に続けて模倣されている点で抗体様であると言える。
【００５１】
さらに特徴的なこととして、蛋白質に対する結合能を付与する部分でのこれらの生物合成抗体の結合部位（ＢＡＢＳ）の構造は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原に対する天然型抗体のＦｖ部分に類似している。親和性と結合性に必要な三次元分子構造を形成する、少なくとも３つのポリペプチドセグメントを特定しているアミノ酸配列からなっている一連の領域を含んでいる。ＣＤＲｓは、天然型抗体のＦｖフラグメントのフレームワーク部位に類似するポリペプチドセグメントにより、適切なコンフォメーションを保持している。
【００５２】
ＣＤＲとＦＲポリペプチドセグメントは、米国特許第４，７５３，８９４号に記載され引用により本発明と一体となっている、すでに存在する抗体のＦｖ部分の配列分析またはこの抗体をコードするＤＮＡ配列に基づいて、経験的にデザインされている。
【００５３】
このような抗体の一つとしての５２０Ｃ９はマウスモノクローナル抗体であり、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−Ｂｒ−３（米国特許第４，７５３，８９４号）により発現されている抗原に反応性を有していることが知られている。抗原は約２００ＫＤの酸性の糖蛋白質であり、等電点５．３であり、細胞あたり５００万コピーが存在する。放射化ラベル抗体を用いて測定したた結合定数はおよそ４．６×１０８ Ｍ −１である。
【００５４】
一つの実例において、一本鎖ポリペプチドのＦＲｓを構成するアミノ酸配列は、例えばヒトＩｇＧのような、第一の既に存在する抗体のＦＲ配列の類似体である。ＣＤＲｓを構成するアミノ酸配列は、卵巣癌および乳癌細胞の表面に発現しているｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原を認識する、齧歯類またはヒトＩｇＧのＣＤＲｓのような第二の異なった既に存在する抗体のアミノ酸配列に類似している。さらにまた、ＣＤＲｓとＦＲｓは、セルラインからの単一の既存抗体から完全に複製しても良い。セルラインとしては、培養が困難で、不安定であっても良い。例えばマウス、マウス／ヒト、ヒトモノクローナル抗体分泌細胞株に基づいたｓＦｖ生産セルラインを上げることができる。
【００５５】
本発明の実施は種々の試薬のデザインと生物合成を可能とする。これらの全てが、あらかじめ選択されたｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原に対する親和性を有する領域によって特徴づけられている。生物合成蛋白質のその他の領域は、思いつく蛋白質の利用を特に計画する場合にデザインされるものである。このように、仮に試薬が哺乳類に静脈投与するようにデザインされるならば、ＦＲｓは、哺乳動物の種の天然型抗体のＦＲのアミノ
酸の少なくとも一部分と同一かまたは類似したアミノ酸配列を含んでいても良い。一方、ＣＤＲｓを含むアミノ酸配列は、超可変領域由来のアミノ酸配列（そして明らかなフランキングアミノ酸配列）の一部分に類似する。この超可変領域はマウスまたはラット由来のｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原に対する抗体、あるいは特異的ヒト抗体または免疫グロブリンなどの公知の親和性と特異性を有する抗体のもので良い。
【００５６】
ＣＨおよびＣＬのような天然型免疫グロブリン蛋白質の構造のその他の部分は、本発明には必要なく、本発明の生物合成蛋白質をからは、通常意図的に除去しておく。しかし、本発明の一本鎖ポリペプチドはリーダー配列や第二のポリペプチド鎖を特定している付加的なポリペプチド領域を含んでいても良い。第二のポリペプチド鎖としてはサイトカイン、毒素、リガンド、ホルモン、免疫グロブリンドメイン、酵素などの生物活性物や、毒素、薬剤、放射性核種のような遠隔的に検出可能成分を結合させる部位である。
【００５７】
有用な毒素であるリシンはヒマの実からとれる酵素であり、高い毒性を有している。リシンは１ ｎｇ／ｍｌのような低濃度で培養細胞の増殖を阻害する。リシンＡ鎖は分子量３０，０００で糖鎖が結合している。リシンＢ鎖は分子量が大きく（３４，０００）、同様に糖鎖が結合している。Ｂ鎖は２つのガラクトース結合部位を持ち、折り畳みサブユニットを構成する２つのドメインからなる。リシンの結晶学的構造はＡ鎖のトレーシングが骨格となっている。恐らく活性部位である割れ目が存在しており、分子を斜めに走っている。さらに分子内にはα−螺旋とβ−構造が存在し、不規則な構造である。
【００５８】
Ａ鎖は真核細胞のリボゾームの６０ｓリボゾームサブユニットを酵素的に不活性化する。Ｂ鎖は細胞表面に存在するガラクトース基の炭化水素残基に結合する。その糖は細胞表面へ毒素が結合するためには必要であると考えられ、細胞内への毒素侵入のメカニズムを容易にし、かつ関与する。全ての細胞はガラクトースを含む細胞表面のレセプターを有しており、リシンは全てのタイプの哺乳動物細胞殆ど同じ有効性をもって阻害する。
【００５９】
リシンＡ鎖とリシンＢ鎖は、ＡおよびＢ鎖共に特徴付ける遺伝子によってコードされている。遺伝子から転写されたｍＲＮＡで合成されたポリペプチドは、’Ｊ’（結合のため）ペプチドによってＢ鎖に結合したＡ鎖を含んでいる。ＪペプチドフラグメントはＡ鎖とＢ鎖を放出するために、翻訳後修飾によって除去される。しかしＡ鎖とＢ鎖は鎖間のＳＳ結合によりまだ両方とも保持されている。好ましいリシンの形状はＢ鎖が全てはずれた遺伝子組換えＡ鎖であって、大腸菌で発現させるとき、糖鎖を持たず、糖鎖を持つものよりも血液中からゆっくりと消失する。リボゾームに対する遺伝子組換えリシンＡ鎖の特異的な活性とヒマの実リシンから単離した天然型リシンＡ鎖の活性は同じである。リシンＡ鎖のアミノ酸配列と対応する核酸配列は配列表配列番号７と８として示した。
【００６０】
遺伝子組み換えリシンＡ鎖、植物由来リシンＡ鎖、脱糖鎖リシンＡまたはこれらの誘導体は、本発明の一本鎖Ｆｖポリペプチドにより、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原を発現している細胞に対するターゲット剤とすることができる。これを行う場合、ｓＦｖはリシンＡ鎖またはそれらの活性な類似体に化学的に交差結合させることができる。また好ましい実施例においては、一本鎖Ｆｖ− リシンＡ鎖イムノトキシンが、相応する遺伝子融合を通して一本鎖Ｆｖポリペプチドと１またはそれ以上のリシンＡ鎖を融合させることによって形成させることができる。リシンＢ鎖に置き換えてｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原への抗体結合部位を備えたＡ鎖は、細胞の表面のこのような抗原部位へ誘導されてゆく。この方法では、これらの抗原を発現している腫瘍細胞の選択的な死滅を可能にする。この選択性は、培養中の細胞増殖対して起きる多くの例で示されている。この細胞増殖に対する効果は、イムノトキシンが直接作用する細胞の表面に抗原が存在するか否かに依存している。
【００６１】
本発明は、イメージング法および腫瘍治療の一部として、ヒト型化した一本鎖Ｆｖ結合部位の使用をも含んでいる。蛋白質は経静脈または筋肉注射で投与することができる。抗腫瘍療法または有効な腫瘍イメージングに一本鎖Ｆｖの構成物の有効な投与は治療の対象の状態を保持しているようなルーチン化した試験によって決定できる。
【００６２】
注射可能な用法に適した製剤の形態は滅菌液剤または分散剤の形態を含んでいる。全てのケースで、剤形は滅菌されていなければならないし、注射器によって投与が容易なように液状でなければならない。薬剤は、生産および保存の条件で安定でなければならないし、微生物汚染のないようにしなければならない。これは、例えば、０．２２μｍのフィルターによる濾過滅菌および／またはガンマー線による殺菌後の凍結乾燥によって行うことができる。滅菌した注射溶液は、フィルター滅菌したリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水のような、適切な溶媒に必要な量の本発明の一本鎖構成物溶解させて調製する。ここに示したように、”製剤学的に許容可能なキャリアー”はヒトに対して毒性を示さない全ての溶媒、分散剤、抗菌剤、抗カビ剤およびこれらの類似物を含む。この媒体や薬剤は、一本鎖ポリペプチドの適切なコンフォメーションの保持に適合していなければならない。そしてそれを治療組成物に使用する。補助的な活性成分も組成物に加えることができる。
【００６３】
二特異性一本鎖Ｆｖは毒素と融合させることができる。例えばｃ−ｅｒｂＢ−２と速やかに内在化されるターゲットであるトランスフェリンレセプターに特異性を持つ二特異的ｓＦｖ構成物は、トランスフェリンレセプター／ ｓＦｖ −毒素コンプレックスの内在化を誘導する有効な殺細胞剤となるであろう。ｓＦｖ融合蛋白質は、例えばＥＧＦ−ｓＦｖ − リシンＡのように、同一のポリペプチド鎖上に複数の蛋白質ドメインを含むことができる。ここではＥＧＦドメインはＥＧＦレセプターにインターラクションしたｓＦｖに結合している毒素の内在化を促進する。
【００６４】
本発明の一本鎖ポリペプチドは、例えばヨウ素１３１、インジュウム１１１、テクネチウム９９ｍなどの放射性同位元素でラベル化することができる。テクネチウム９９ｍやインジュウム１１１のようなβ線源が好ましい。それは、インビボのイメージングにγカメラを用いて検出を行うためであり、半減期が適しているためである。一本鎖ポリペプチドは、例えばイットリウム９０、テクネチウム９９ｍ、インジュウム１１１のような放射性同位元素でラベル化する際に、複合金属キレートを用いる（Ｋｈａｗ他、１９８０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９ ：２９５； Ｇａｎｓｏｗ 他、米国特許第４，４７２，５０９；
Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，米国特許第４，４７９，９３０）。また先行技術によって公知となっているアイソトープ結合のための標準的な方法であっても良い。
【００６５】
本発明はｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原への完全な結合部位を提供する。これは複合体である（ＶＨ − リンカー− ＶＬ）ｎまたは（ＶＬ− リンカー− ＶＨ）ｎ構造のポリペプチドを構成するポリペプチド配列によって結合したＶＨ − ＶＬ二量体の類似体である。ここでｎは１またはそれ以上の数である。ポリペプチドは抗体分子の認識には基本的に必須であり、さらに検出可能な成分あるいは、ＶＨまたはＶＬに結合した第三のポリペプチド配列を含んでいても良い。
【００６６】
ここに開示された技術を用いて調製できる、本発明の実施物である蛋白質の構造の例を図２Ａ−２Ｅは示している。全ての構造図は、すくなくとも一つの、結合部位を特定する生物合成ｓＦｖ 一本鎖セグメントによって特徴づけられており、異なる免疫グロブリン由来のＣＤＲｓとＦＲｓを包含するアミノ酸配列からなっており、また異なる免疫グロブリンのＣＤＲｓとＦＲｓの一部とホモローガスな配列からなっている。
【００６７】
図２Ａは、与えられた抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）に類似のアミノ酸配列を持つポリペプチド１０からなる一本鎖ｓＦｖ １００を図で説明
している。抗体はポリペプチドリンカー１２ヘカルボキシル末端を介して結合しており、そして抗ｃ−ｅｒｂＢ−２モノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド１４にリンカーが結合している。
【００６８】
当然のことであるが、軽鎖と重鎖のドメインは逆に配置することもできる。リンカー１２は少なくとも、鎖１０と１４が正しいコンフォメーションとドメイン内の相互関係を取るために充分長くなっている（１０ないし１５アミノ酸また４０Å）。
【００６９】
薬剤の使用を目的とした場合、リンカー１２は、それが導入される種によって”自身”として認識される配列のホモローガスなアミノ酸配列を含むことができる。不構造性の場合には、親水性アミノ酸配列が好ましい。このようなリンカー配列は、配列表配列番号３、４の配列のアミノ酸残基数１１６−１３５として配列を示した。この配列は配列表配列番号１２および１４に示した１５アミノ酸のリンカー配列を含んでいる。
【００７０】
その他の蛋白質またはポリペプチドは図２Ａに示したタイプの蛋白質のアミノまたはカルボキシ末端のいずれかに結合している。実施例のように、リーダ配列１６はＶＨドメイン１０のアミノ末端から延長していることを示している。
【００７１】
図２Ｂは一本鎖ポリペプチド１００とペンダント蛋白質１８を含む試薬２００の別のタイプを図示したものである。ポリペプチド鎖１００（免疫グロブリン結合部位からなるＦＲとＣＤＲ配列を含む）のカルボキシル末端に結合したものはペンダント蛋白質１８であり、例えば毒素や毒素のフラグメント、結合蛋白質、酵素、酵素活性フラグメント、イメージング剤のための結合部位（インジュウム１１１のような放射活性イオンをキレートしている）からなる。
【００７２】
図２Ｃは、同一または異なる特異性を持ち、そして最初の一本鎖ポリペプチド１００にリンカー２２を介して結合した発明の第二の一本鎖ポリペプチド１１０を含む一本鎖ポリペプチド３００を図示している。
【００７３】
図２Ｄは、リンカー２２により結合した一本鎖ポリペプチド１１０と１００および、１１０のカルボキシル末端に結合したペンダント蛋白質１８を含む一本鎖ポリペプチド４００を図示している。
【００７４】
図２Ｅは図２Ｄの鎖４００と鎖４００のアミノ末端に結合したぺンダント蛋白質２０（ＥＧＦ）を含む一本鎖ポリペプチド５００を図示している。
【００７５】
図２Ａ−２Ｅに示したように、発明の一本鎖蛋白質は、複数の生物合成結合部位を含むことによって、紐の上のビーズに似た形状となる。それぞれの結合部位は、特徴的な特異性かまたは蛋白質の親和性を促進させるために同一の特異性の繰り返し部位を有する。先に示した事実から、本発明は、可変領域またはｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原に対する免疫グロブリン領域の後に形成された結合部位を特定している、少なくとも一部分の蛋白質から構成される試薬の大きなファミリーを提供するものである。
【００７６】
本発明の一本鎖のポリペプチドはＤＮＡのレベルでデザインされている。合成ＤＮＡｓは適切な宿主系で発現されて、必要に応じて発現蛋白質は回収されて再生化される。
【００７７】
本発明の一本鎖ポリペプチドをデザインするための能力は、目的のモノクローナル抗体を特定し、この抗体の可変領域のアミノ酸配列を決定するかまたはそれらをコードするＤＮＡ配列を決定する能力に依存している。ハイブリドーマ技術は、免疫反応を誘発するために必要な物質に対して必然的に抗体を分泌する細胞株の調製を可能にする。例えば米国
特許第４，７５３，８９４号には、乳癌細胞上のｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識するモノクローナル抗体が開示されており、いかにしてこの抗体を得るか説明されている。この目的に特に有用なモノクローナル抗体は５２０Ｃ９である（Ｂｊｏｎ他、１９８５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５ ：１２４−１２２１；米国特許第４，７５３，８９４号）。この抗体は特異的に、種々の腫瘍セルラインの表面に発現しているｃ−ｅｒｂＢ−２抗原を認識する。そして正常組織に結合することは非常にまれである。必要とする特異性を持つｓＦｖ配列の別の資源としては、ファージ抗体とコンビネーショナルライブラリーの進歩を利用できる。このような配列は、腫瘍細胞膜、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原フラグメントまたはペプチドによって予備免疫したマウスから得たｃＤＮＡに基づいて得られる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３５２ ６２４−６２８（１９９１））。
【００７８】
目的の一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡをデザインする工程は、以下のようにして達成することができる。必要な免疫グロブリンの軽鎖と重鎖をコードするＲＮＡは、免疫グロブリンを生産するハイブリドーマの細胞質から得ることができる。ｍＲＮＡは、先行技術で公知のＰＣＲ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他 編集、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）によってＶＨとＶＬ遺伝子を続けて単離するためにｃＤＮＡを調製する目的で使用することができる。Ｈ鎖、Ｌ鎖のＮ末端アミノ酸配列は、自動エドマン分析によって独自に決定することができる。必要に応じて、ＣＤＲｓとフランキングＦＲｓの延長は、ＨとＬ鎖のＶ領域のフラグメントのアミノ酸配列分析によって決定することができる。このような配列分析は、現在ではルーチンに行うことができる。このような情報は、ｃ−ｅｒｂＢ−２またはその関連抗原に結合する公知のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞からＶＨとＶＬ遺伝子の単離に必要な合成プライマーをデザインするために利用する。これらのＶ遺伝子は、もととなった抗体中に存在している、ｃ−ｅｒｂＢ−２に結合するＦｖ部分をコードしている。
【００７９】
ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連レセプターに特異的なＦｖ結合部位をコードする合成Ｖ遺伝子のデザインと構築を、別のアプローチによって達成できる。例えばＣｏｍｐｕｇｅｎのようなコンピュータプログラムと公知の可変領域のＤＮＡ配列を使用して、最初の抗体分子由来の天然または天然型に近似したＦＲ配列と、第二の抗体分子由来のＣＤＲ配列をデザインし、直接合成する。上記のＶＨとＶＬ配列は、一つのアミノ酸鎖または、その他のＮ末端を有している一本鎖のＣ末端に結合したリンカーを介して直接結合させる。
【００８０】
一度合成したこれらの遺伝子は、リーダーペプチドをコードしているＤＮＡのような付加部分を有しているか、または有していない状態でクローン化することができる。この付加部分としては、分泌を促進するリーダーペプチド、融合ポリペプチドの細胞内安定化、第二のポリペプチドをコードするリーダーまたはトレイル配列などがある。遺伝子は次いで、適切な宿主細胞中で直接発現させることができる。
【００８１】
ｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原に対する抗体を直接配列分析するか、文献から配列を得るかして、これらの開示を考慮し、先行技術を使用することで、必要なＣＤＲとＦＲからなる一本鎖のＦｖを生産することができる。例えば、配列表配列番号３に配列を示した５２０Ｃ９モノクローナル抗体のＤＮＡ配列を使用して、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に結合親和性を有する一本鎖ポリペプチドを生産することができる。発現させた配列は、結合性を試験し、アミノ酸配列データおよび／またはコンピュータモデリング技術による傾向の観察に基づいて、相対的に保存されている領域のアミノ酸を選定して交換することによって経験的に改良を行う。
【００８２】
ＶＨとＶＬのデザイン中の有意なフレキシビリティは、ＤＮＡレベルにおいてアミノ酸
配列の変更をもたらしているため可能である。
【００８３】
従って、本発明の一本鎖のＦｖとｓＦｖ融合蛋白質をコードするＤＮＡの構築は、種々の制限酵素の使用を含む公知の技術を使用して行われる。この技術には、制限酵素技術、平滑末端または接続末端を調製するＤＮＡの配列特異的切断、ＤＮＡリガーゼ、平滑末端ＤＮＡにスティッキエンドを酵素的に付加する技術、短いかあるいは中間の長さのオリゴヌクレオチドの集合による合成ＤＮＡｓの構築、ｃＤＮＡ合成技術、免疫グロブリン遺伝子を単離するための合成プローブなどがある。種々のプロモータ配列と発現を行うために使用されるその他の調節ＲＮＡ配列および種々のタイプの宿主細胞も公知であり使用可能である。従来のトランスフェクション技術および同様にＤＮＡのクローニングとサブクローニングのための従来の技術は本発明の実施に有用であり、当業者に知られている。種々のタイプのベクターがプラスミドと動物ウイルスおよびバクテリオファージを含むウイルスベクターとして使用できる。ベクターは、充分にトランスフェクト細胞に伝達され、表現型の特性が検出でき、さらにベクターの組換えＤＮＡが完全にクローンに組み込まれて、クローンのファミリーを特定するために使用できる種々のマーカー遺伝子が使用できる。
【００８４】
もちろん操作や増幅の方法、目的のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡが一般的に良く知られており、従ってここでは詳細に説明を行わない。目的の抗体のＦｖ領域をコードする単離したＶ遺伝子を特定する方法は、良く知られており、特許及びその他の文献に開示されている。一般的に方法は、アミノ酸配列をコードする遺伝子材料を選択することを含んでおり、アミノ酸配列は、遺伝子コードに従って逆転写で目的のＣＤＲｓとＦＲｓを特定している。
【００８５】
ここに開示された一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡを得る方法は、適切なリガーゼを用いてライゲーションによって、従来法の自動化ポリヌクレオチドシンセサイザーで調製した合成オリゴヌクレオチドをつなげることである。例えば、１５塩基からなる共通の部分があり、相補的なＤＮＡフラグメントがリン酸化アミド化学により半手作業的に、ライゲーションのあいだの重合を抑制するために、リン酸化されていない残りの末端セグメントを用いて合成する。合成ＤＮＡの一方の末端は特定の制限エンドヌクレアーゼの作用部位に対応する゛“スティッキ−エンド”として残り、他方の末端は他の制限エンドヌクレアーゼの作用部位にそ対応する末端を持って残る。従って、この方法十分に自動化が可能である。一本鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡは長い一本鎖フラグメント（例えば、５０−１００ヌクレオチド長）を例えば、バイオサーチ製オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使って合成し、そしてフラグメントをライゲーションすることによって調製できる。
【００８６】
一定領域のアミノ酸または生物活性分子をコードする付加的なヌクレオチド配列は、その遺伝子配列に結合させて二機能蛋白質を生産することができる。
【００８７】
例えば、上記のようにデザインされた合成遺伝子およびＤＮＡフラグメントは化学的に合成したオリゴヌクレオチドを集積して製造できる。１５―１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドはバイオサーチ製ＤＮＡ Ｍｏｄｅｌ ８６００シンセサイザーで合成でき、トリス―ホウ酸―ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）中でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製する。次いでＤＮＡをゲルから電気泳動して溶出させる。オーバーラッピングしたオリゴマーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＰＡＧＥによって精製したより大きいブロックにライゲートさせる。
【００８８】
そのブロックあるいはより長いオリゴヌクレオチドのぺアーは、適切なクローニングベクター（例えばｐＵＣ）を使用して大腸菌でクローン化する。最初に、このベクターは、部位を変化させて残基６塩基を除去するために、一本鎖の突然変異誘発を行う。例えばＶ
Ｈを合成し、次の制限酵素切断部位またがる５つのプライマリーなブロックとしてｐＵＣでクローニングする。（１）ＥｃｏＲＩ−第一のＮａｒＩ、（２）第一のＮａｒＩ−ＸｂａＩ （３）ＸｂａＩ−ＳａｌＩ （４）ＳａｌＩ−ＮｃｏＩ （５）ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ。これらのクローン化フラグメントは単離し、３フラグメントのライゲーション体を複数を集め、ｐＵＣ８プラスミド中にクローニングする。ＰＡＧＥで選別した必要なライゲーション体でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ８を形質転換させ、標準方法に従ってＬＢアンピシリン＋Ｘｇａｌプレートで培養する。遺伝子配列はサンガーのジデオキシ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｄ
ｅｄ．， Ｖｏｌ．２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に従って、Ｍ１３にクローニングするかサブクローニング後スーパーコイルシーケンシングによって確認する。
【００８９】
操作した遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉの変異株などの適切な原核細胞宿主か、あるいはチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）、マウスミエローマ、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、ヒトミエローマ細胞のような真核細胞宿主で発現させる。
【００９０】
遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させると、それは最初に発現ベクターをクローン化する。ＴｒｐやＴａｃのようなプロモータ配列下流に操作遺伝子およびスタフィロコッカスのプロテインＡのフラグメントＢ（ＦＢ）のようなリーダーポリペプチドのための遺伝子コーディングを配置することによりクローン化が達成される。その結果発現した融合蛋白質は細胞の細胞質中の屈折体中に蓄積し、フレンチプレスや超音波によって細胞を破壊して回収できる。屈折体は溶解させ、発現した融合蛋白質は、いくつかの他の組換え蛋白質のために、すでに確立させた方法（Ｈｕｓｔｏｎ他 前述）で切断し、リフォールディングさせる。また直接発現法では、リーダー配列がなく、封入体が切断されずにリフォールディングされている（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０３，ｐｐ４６−８８）。
【００９１】
リーダー配列の融合物から単離したｓＦｖを引き続いて蛋白分解性切断をして、フリーのｓＦｖを回収する。フリーのｓＦｖは、完全な生物合成性ハイブリッド抗体結合部位を得るために再生化させることができる。この切断部位は、好ましくはｓＦｖポリペプチドに隣接しており、一本鎖ポリペプチドのアミノ酸構造中に確認されるアミノ酸またはアミノ酸配列の幾つかを除いたアミノ酸またはアミノ酸配列を含んでいる。
【００９２】
切断部位は好ましくは、特定の物質で特異的に切断されるようにデザインされている。エンドペプチダーゼが好ましいが、非酵素的（化学的）切断剤も使用可能である。例えば有用な切断剤としては、固有の切断部位を優先的あるいは特異的に認識し切断するシアン化ブロマイド、希酸、トリプシン、スタフィロコッカス アウレウスのＶ８ポロテアーゼ、ポストプロリン開裂酵素（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｌｉｎｅ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）、血液凝固因子ファクターＸａ、エンテロキナーゼ、レニンなどが上げられる。特に好ましいペプチド配列切断剤としては、Ｖ８プロテアーゼが上げられる。特に好ましい切断部位はＧｌｕ残基である。その他の有用な酵素は、切断部位として複数の残基を認識するものがある。これにはファクターＸａ（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）あるいはエンテロキナーゼ（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）がある。希酸はＡｓｐ−Ｐｒｏ残基の間を優先的に切断し、酸性ＣＮＢｒは、Ｔｙｒが続いている以外のＭｅｔの後ろを切断する。
【００９３】
仮に操作遺伝子が、従来の免疫グロブリン発現系である真核ハイブリドーマ細胞中で発現すると、免疫グロブリンプロモータ、分泌シグナル、免疫グロブリンエンハンサー、および種々のイントロンを含む発現ベクター中に、その遺伝子は組み込まれる。このプラスミドはまた、安定領域の一部または全部、発現させる重鎖または軽鎖の完全部分、さらに
また毒素、酵素、サイトカイン、ホルモンなどの少なくとも一部分のような別のポリペプチドをコードする配列もまた含んでいる。遺伝子は既に確立された電気融合法またはプロトプラスト融合法でミエローマ細胞にトランスフェクトする。トランフェクト細胞はＶＨ− リンカー− ＶＬまたはＶＬ − リンカー− ＶＨの一本鎖Ｆｖポリぺプチドを発現する。それぞれのポリペプチドは上記の種々の方法で別の機能を有する蛋白質ドメイン（細胞毒性物など）を結合している。
【００９４】
もしもこの配列が存在しない場合に、明らかな複数の結合部位のあるアミノ酸配列の、単一の連続した鎖を構築するために、単一の結合部位（即ちＶＨ − リンカー− ＶＬ
）をコードしているＤＮＡの境界部位における切断部位が利用され、もしなければ創造される。発現プラスミドに集め、クローン化した遺伝子からさらに、単一の結合部位をコードするＤＮＡをシャトルプラスミドにライゲーションし、クローン化する。目的のドメインは、多様化させ、そしてドメインの間のスペーサーは、ドメインのフォールディングを独立させるために必要なフレキシビリティー付与している。発現レベル、リフォールディング、機能活性に関する最適技術は経験的に決定される。二機能ｓＦｖを創造するためには、例えば、最初の結合部位をコードする遺伝子のストップコドンはオープンリーディングフレームに変え、そしてＢａｍＨＩ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコード）またはＸｈｏＩ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒをコード）のような制限酵素切断部位になる、いくつかのグリシンにセリンを結合させるコドンは、他のコドン置き換える。第二のｓＦｖ遺伝子は、同じリーディングフレームの同じ制限酵素切断部位を確認して、その５’末端側を同様に改変する。遺伝子は、二機能性ｓＦｖ遺伝子を調製するために、この部位に結合させる。
【００９５】
一つのドメインのＣ 末端を次のドメインのＮ 末端に結合するリンカーは、通常親水性アミノ酸からなる。この親水性アミノ酸は生理学的な溶液中では、不構造性の状態を呈しており、ＶＨ、ＶＬまたはペンダント鎖のフォールディング作用を阻害する大きな側鎖基を持たないことが好ましい。利用可能なリンカーの一つは、［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３のアミノ酸配列を有する（配列表配列番号９および１０のアミノ酸残基番号４１０−４２４）。特に好ましいリンカーは、［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］２及び［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］３のような配列（配列表配列番号３および４）であって、［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］ の２ないし３回の繰り返し配列を有している。
【００９６】
本発明を以下に示す実施例により限定することなくさらに説明する。
【実施例】
【００９７】
１．ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原に対する抗体
乳癌に対するモノクローナル抗体は、ヒト乳癌細胞またはマウスに免疫して得た細胞の膜抽出物を用いて、Ｆｒａｎｋｅｌ他の示した方法によって（Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８５， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄｉｆ．，４：２７３−２８６） 得た。文献は引用により発明と一体化している。ハイブリドーマを調製し、正常および乳癌細胞のパネルを用いて、抗体生産を選別した。８つの正常組織膜のパネル、線維芽細胞株、および乳癌細胞の凍結切片をスクリーニングに用いた。最初のスクリーニングを通過した候補は、さらに、１６の正常組織切片、５つの正常血球タイプ、１１の乳癌以外の腫瘍切片、２１の乳癌切片、１４の乳癌細胞株を用いて試験を行った。このセレクションにより１２７の抗体が選択された。不適切な抗体および乳癌以外の癌細胞株をコントロール実験に使用した。
【００９８】
有用なモノクローナル抗体として５２０Ｃ９、４５４Ｃ１１（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．番号ＨＢ８６９６およびＨＢ８４８４）、７４１Ｆ８が見出された。抗体は、５種の異なった抗原に対して反応させるスクリーニングで、乳癌を選択することを確認した。抗体が認識する抗原のサイズは以下のとおりである。２００ＫＤ；２００ＫＤの分子サイズの分解物で
ある一連の蛋白質、９３ＫＤ、６０ＫＤ、３７ＫＤ；１８０ＫＤ（トランスフェリンレセプター）；４２ＫＤ；および５５ＫＤ。抗原の５つのクラスに対して結合した抗体の最大の特異性は、２００ＫＤの物質に対するものであった。その抗原のクラスに代表的な抗体は５２０Ｃ９であった。５２０Ｃ９は少数の乳癌組織に反応する（分析条件に依存するが２０−７０％）。そして極わずかな正常組織に反応する。５２０Ｃ９は腎臓の細管に反応する（多くのモノクロナール抗体がそうであるように）。しかし、膵臓、食道、肺、大腸、胃、脳、扁桃、肝臓、心臓、卵巣、皮膚、骨、子宮、膀胱、正常な乳房組織には試験を行ったが反応しなかった。
【００９９】
２．５２０Ｃ９抗体をコードするｃＤＮＡの調製
ポリアデニレートＲＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア）の”ＦＡＳＴ ＴＲＡＣＫ”ｍＲＮＡアイソレーションキットを使用して、約１×１０８個の細胞（５２０Ｃ９ハイブリドーマ）から分離した。免疫グロブリン重鎖ＲＮＡの存在は、重鎖の染色体ＤＮＡの種々のＪ領域を含む組換えプローブを使用して、ノーザン分析で確認した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｄｅｄ．，Ｖｏｌ．２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）。それぞれ６μｇのＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡをインビトロージェンｃＤＮＡ合成システムとランダムおよびオリゴｄＴプライマーの両方を使用して調製した。合成に引き続き、ｃＤＮＡはアガロースゲル電気泳動で０．５−３．０キロベース（Ｋｂ）フラグメントを単離してサイズセレクションを行った。ｃＤＮＡとベクターの比率の最適化を行ってこのフラグメントをインビトロージェン クローニング ベクターｐＣＤＮＡ ＩＩにライゲーションした。
【０１００】
３．ＶＨおよびＶＬドメインの単離
プラスミドライブラリーＤＮＡを用いて細菌の形質転換後、コロニーハイブリダイゼションを、軽鎖または重鎖遺伝子のどちらかについて、抗体の定常（Ｃ）領域と結合（Ｊ）領域のプローブを使用して実施した。なおＯｒｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．８６：３８３３を参照のこと。抗体定常領域のプローブは、公知の方法で免疫グロブリン遺伝子の重鎖または軽鎖のヌクレオチド配列から得ることができる。いくつかの可能性の高いクローンを重鎖および軽鎖遺伝子ともに特定し、精製後に第二のスクリーニングを行なって、この配列を決定した。一つのクローン（Ｍ２０７）は、保存されたシステインに代えてチロシンを有する非機能性κ鎖の配列を含んでおり、そしてさらに、これは可変Ｊ領域のジャンクションにはフレームシフトミューテーシヨンを誘導する４塩基の欠失があるために早期に終了している。第二の軽鎖のクローン（Ｍ２３０）は定常領域の最後の１８残基のアミノ酸とシグナル配列の約半分を除いては、完全な５２０Ｃ９軽鎖の遺伝子を実質的含んでいた。５２０Ｃ９の重鎖の可変領域は、ＣＨ２ ドメインの末端付近で終了しているところの、約１１００塩基対（Ｆ３２０）のクローン上に存在していた。
【０１０１】
４．ＶＨおよびＶＬ ドメインの変異化
ｓＦｖを構築する目的で、重鎖と軽鎖両方の可変領域に適切な制限酵素切断部位を挿入するため変異させた（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３７３）。重鎖クローン（Ｆ３２０）には、ＶＨ（Ｆ３２１）の５’末端にＢａｍＨＩを挿入して変異を起こした。軽鎖にもまた５’末端にＥｃｏＲＶと可変部位（Ｍ２３１）の３’末端に翻訳ストップコドンを含むＰｓｔＩサイトを挿入して同時変異を起こさせた。
【０１０２】
５．スクリーニング
軽および重鎖をコードするｃＤＮＡクローンは、外来の標準ｐＵＣプライマーと複数の特異的内部プライマーを用いてシーケンシングを行なった。
【０１０３】
プライマーは得られた配列に基づいて重鎖用に調製した。ヌクレオチド配列は、内在性免疫グロブリン遺伝子を除くためにジーンバンクホモロジーサーチ（ＤＮＡ−ｓｔａｒ のＮｕｓｃａｎ プログラム）で分析を行なった。アミノ酸への翻訳はＥ．Ｋａｂａｔ編集のＮＩＨアトラスのアミノ酸配列でチェックした。
【０１０４】
５２０Ｃ９免疫グロブリン由来のアミノ酸配列から、ＶＨおよびＶＬ ｃＤＮＡクローンの特性を確認した。重鎖クローンｐＦ３２０は最初のＡＴＧコドンの６塩基上流から始まり、ＣＨ２コード部分まで延長していた。しかし３’側非翻訳領域とポリＡ末端鎖と同様ＣＨ３コード領域の全部とＣＨ２定常ドメインの最後の９アミノ酸は欠けていた。ＣＨ２とＣＨ３コード領域のみを含む別の短い重鎖クローンとポリＡ末端は重鎖５２０Ｃ９の欠落部分にはじめから存在していた。しかしどちらのクローンもオーバーラップはせず独立していた。５２０Ｃ９クローン（ｐＦ３２０）はマウスＩｇＧ１のＣＨ１とＣＨ２をコードしているが、一方短いクローンｐＦ３１５はＩｇＧ２ｂのＣＨ２とＣＨ３をコードしていた。
【０１０５】
６．遺伝子デザイン
ｃ−ｅｒｂ−２関連腫瘍抗原を認識する一本鎖のＦｖ結合部位を含む合成５２０Ｃ９ ｓＦｖ領域をコードする核酸配列はＣｏｍｐｕｇｅｎソフトウェアーの手助けによってデザインした。その遺伝子は５２０Ｃ９抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードする核酸配列を含んでおり、配列表配列番号３および４のアミノ酸残基番号１１６−１３３として配列を示したアミノ酸配列を持ったペプチドをコードする２本鎖の合成オリゴヌクレオチドが同時に結合している。このリンカーオリゴヌクレオチドはヘルパークローニングサイトＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを含んでいる。そしてそれぞれその５’と３’近傍のアセンブリーサイトＳａｃＩとＥｃｏＲＶを含むようにデザインされている。これらのサイトはそれぞれ５２０Ｃ９のＶＨおよびＶＬの５’と３’末端をマッチアップしライゲーションすることを可能にしている。これらはまた、（ＶＨ − リンカー− ＶＬ）サイトを含んでいる。しかしオリゴヌクレオチドのリンケージの順序は、この例や発明のどのｓＦｖでも（ＶＬ −リンカー−ＶＨ）のように逆転できることである。その他の制限酵素切断部位は、選択的なアッセンブリーサイトを提供できるようにデザインされている。プロテインＡのフラグメントをコードする配列をリーダーとして使用した。
【０１０６】
本発明は、ヒトフレームワーク配列を含むヒト型一本鎖Ｆｖおよび５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓ様のｃ−ｅｒｂ−２結合を特定するＣＤＲを包含する。
【０１０７】
本発明の実施は、５２０Ｃ９抗体のＣＤＲｓ様のｃ−ｅｒｂ−２結合を特定する、ヒトフレームワーク配列とＣＤＲ配列を含む、ヒト型一本鎖Ｆｖを提供するものである。ヒト型Ｆｖは、患者に投与した時、免疫反応が極わずかか或いはないにも関わらずｃ−ｅｒｂ−２には結合できる。ヒト化ｓＦｖをコードする核酸配列は、以下のようにデザインし構築することができる。ｓＦｖをデザインするためには二つのストラテジーが特に有用である。最も関連するヒトフレームワーク（ＦＲ）領域をＧｅｎＢａｎｋデータベースでホモロジーサーチして、対応するヒト配列を再生産するために、ｓＦｖのＦＲ領域をサーチで特定した配列に従って変異させる。さらにモデルのＦａｂフラグメントのＸ線解析構造に基づくコンピュータモデル情報を用いた（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３： ７４７−７５３；Ｃｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３５８−３６３；Ｓｈｅｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．，８４：８０７５−８０７９：Ｓａｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．１９０：５９３−６０４全ての文献は引用によって発明と一体化している）。好ましい例として、最もホモローガスなＶＨおよびＶＬ配列はＰＣＲクローン化ヒトＶ領域のコレクションから選択される。完全なヒト化ＶＨおよびＶＬを
完成させるまで、ＦＲを合成し、ＰＣＲ−に基づいたリゲーションにより完全なＶ領域を連続的に調製するためにＣＤＲに融合させる。例えば、マウス５２０Ｃ９抗体ＣＤＲｓとヒトミエローマ蛋白質ＮＥＷ ＦＲｓのハイブリッドであるヒト化ｓＦｖは、ヒトフレームワーク （ＦＲ１−ＣＤＲ−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）のマウス結合部位をそれぞれの可変領域が保持するようにデザインされている。Ｆａｂ ＮＥＷの結晶構造は（Ｓａｕｌ ｅｔａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５８５−５９７）は可変領域のＦＲｓの配置を予測するために使用できる。すでにこれらの領域は予測されており、領域のアミノ酸配列または対応する塩基配列が決定されており、配列は合成されて、シャトルプラスミドにクローン化されている。それらは集合させて、発現プラスミドでもクローン化されている。従って、５２０Ｃ９のｓＦｖのＦＲ配列は直接突然変異させて、変化は内部プライマーを使用してスーパーコイルシーケンシングで確認した（Ｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＤＮＡ ４：１６５−１７０）。
【０１０８】
７．５２０９Ｃ ｓＦｖの調製と精製
Ａ．インクルージョンボディーの溶解化
Ｔ７プロモータとベクターに基づいた５２０Ｃ９ ｓＦｖプラスミドの、配列表配列番号３として配列表を示した融合遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で直接発現させた。２．０１の培養液から得たインクルージョンボディー（１５．８ｇ）を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（ＴＥ）に１Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）加えて洗浄した。インクルーションボディーはＴＥ、６Ｍ ＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ９．０に溶解させ、３８２５ Ａ２８０ユニットの物質を回収した。この物質はエタノール沈澱、ＴＥ、３Ｍ尿素洗浄、次いでＴＥ、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０に再分散させた。この沈澱操作で、変成ｓＦｖのイオン交換の精製のための蛋白質を調製した。
【０１０９】
Ｂ．イオン交換クロマトグラフィー
ｓＦｖを再生する前に混入している核酸とＥ．ｃｏｌｉ蛋白質を除去するために、溶解したインクルージョンボディーをイオン交換クロマトグラフィにより処理した。８Ｍ尿素に溶解させたインクルージョンボディーをＴＥで希釈して、最終尿素濃度を６Ｍとして、ついでラジアル フロー カラム中のＤＥＡＥ− セファロース ファースト フロー（１００ｍｌ）を通過させた。ｓＦｖは、非結合画分に回収された（出発サンプルの６９％）。
【０１１０】
Ｓ−セファロース ファースト フローカラムに通す前に、このｓＦｖ溶液（Ａ２８０＝５．７；２９０ｍｌ）のｐＨは１Ｍ酢酸で５．５に調整した。しかしｐＨが６．０になると沈澱が出現した。サンプルは清浄化させた。サンプルの６０％はペレット中に、４０％が上清に存在した。上清を１００ｍｌのｓ−セファロース ファースト フローカラムを通し、ｓＦｖを非吸着画分として回収した。ペレットはＴＥ、６ＭＧｕＨＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ９．０再溶解させ、２８０ｎｍで吸光度を測定して、４５ｍｌのプール中に２０吸光度単位の一次のｓＦｖを含有していることを確認した。この回収したｓＦｖプールは次の精製のステップに回した。
【０１１１】
Ｃ．ｓＦｖの再生
ｓＦｖの再生はジスルフィド開裂リフォールディングアプローチで行った。この方法では、ｓＦｖが完全に変成しているため、ジスルフィドを酸化して、変成を除去し次いでリフォールディングさせる。ｓＦｖサンプルの酸化はＴＥ、６Ｍ
ＧｕＨＣｌ、１ｍＭ 酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０．１ｍＭ還元グルタチオン（ＧＳＨ）、ｐＨ９．０で行った。ｓＦｖは酸化緩衝液で希釈して４０００ｍｌの容量で、最終蛋白質濃度がＡ２８０＝０．０７５にし、室温で一晩インキュベートした。
【０１１２】
一晩酸化した後、溶液は１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ尿素、ｐＨ ８．０（ＰＮＥＵ）の溶液に対して一晩透析を行った［４×（２０１×２４時間）］。活性の低いものはリフォールディングサンプルに検出された。
【０１１３】
Ｄ．膜分画と活性ｓＦｖの濃縮
濃縮ステップに入る前に凝集したミスフォールディング物を除去する目的で、透析終了リフォールド５２０Ｃ９ ｓＦｖ（５０５０ｍｌ）をミニタン ウルトラフィルトレーション 装置（ミリポア）を使用して１００Ｋ ＭＷＣＯ膜（１００，０００ｍｏｌ．ｗｔ．カットオフ）（４ ｘ ６０ｃｍ２）を通して濾過した。このステップはかなりの長時間（９時間）が必要があったが、これは主として膜処理物中の沈澱形成と処理物中の蛋白質濃度の増加に伴う膜の汚れのためである。リフォールドしたサンプル中の蛋白質の９５％は１００Ｋの膜に不溶物の形の７５％とともにと不溶解物の状態の７９％は１００Ｋの膜に保持された。１００Ｋでの保持物は非常に低い活性であり、廃棄した。１００Ｋの濾過液は、ｃ−ｅｒｂＢ−２に結合する活性を有して可溶性ｓＦｖの大部分を含んでいた。次にミニタンに取りつけた１０ＫのＭＷＣＯ膜（１０，０００ ｍｏｌ．ｗｔ．カットオフ）（４×６０ｃｍ２）を使って１００ｍｌの容量（５０×）に濃縮した。この物質は、さらに５０ｍｌのアミコンスティアードセルのＹＭ１０ １０Ｋ ＭＷＣＯ膜を使用して、最終容量５．２ｍｌまで濃縮した（１０００×）。極わずかな沈澱が２回の１０Ｋ濃縮操作で発生しただけだった。この濃縮物の比活性は、最初の透析リフォールディング物に対して相対的にみて有意に増加していた。
【０１１４】
Ｅ．濃縮ｓＦｖのサイズ排除クロマトグラフィー
折り畳まれたｓＦｖはサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した時に、全ての５２０Ｃ９ ｓＦｖ活性は、折り畳まれたモノマーの位置に溶出することが確認された。活性なモノマーを多く得るために、１０００倍濃縮ｓＦｖ試料を、０．５Ｍ尿素を加えたＰＢＳＡ（２．７ｍＭ ＫＣＩ，１．１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，１３８ｍＭ ＮａＣｌ，８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・ ７Ｈ２Ｏ，０．０２％ＮａＮ３）中で、セファクリルＳ−２００ ＨＲカラム（２．５×４０ｃｍ）で分画した。カラムからの溶出パターンとフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、二つのｓＦｖモノマーのピークを示した。二つのｓＦｖモノマーピークフラクションはプールして（全１０ｍｌ）、ｃ−ｅｒｂＢ−２結合活性を拮抗分析で表示した。
【０１１５】
Ｆ．５２０Ｃ９ ｓＦｖのアフィニティー精製
ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はバキュラウイルス感染昆虫細胞で発現させた。この蛋白質（ＥＣＤ ｃ−ｅｒｂＢ−２）はアガロースアフィニティーマトリックスに固定化させた。ｓＦｖモノマーのピークは尿素を除くためにＰＢＳＡに対して透析を行った。そして次いで、ＰＢＳＡで０．７×４．５ｃｍ ＥＣＤ ｃ−ｅｒｂＢ−２−アガロースアフィニティカラムに適用した。カラムはＡ２８０がベースラインになるまで洗浄し、ＰＢＳＡ＋３Ｍ ＬｉＣｌ，ｐＨ＝６．１で溶出した。ピークのフラクションを集め（４ｍｌ）、そしてＰＢＳＡに対して透析を行ってＬｉＣｌを除去した。精製ｓＦｖ
７２μｇが７５０μｇのＳ−２００モノマーフラクションから得られた。カラムフラクションでの活性測定は拮抗分析によって行った。簡潔に言えば、ｓＦｖアフィニティ精製フラクションとＨＲＰ−複合５２０Ｃ９ＦａｂフラグンメントはＳＫ−ＢＲ−３の膜に対する結合に拮抗することが確認された。ｓＦｖ調製物の充分な結合は、ＨＲＰ−５２０Ｃ９Ｆａｂフラグメントの膜への結合を抑制した。さらにＨＲＰ基質の抑制と減少を行ったが色沢は変化しなかった（拮抗分析の詳細は以下を参照のこと）。その結果は、実際にはｓＦｖ活性の全てがカラムに結合し、溶出ピークに回収された（図４）。期待したように、溶出したピークの比活性はカラムのサンプルに対して相対的に増加していた。そしてこれらの測定の実験誤差の範囲内で、コントロールのペアレントＦａｂと、必然的に同じ結
果を示した。
【０１１６】
９．精製後の収量
表Ｉに精製工程中の種々の５２０Ｃ９調製物の回収率を示した。蛋白質濃度（μｇ／ｍｌ）はバイオラッド プロテインアッセイで測定した。”全収量”の下の３００ＡＵは、０．４１の培養液から３．１５ｇのインクルージョンボディーが含まれている保有ｓＦｖを変成させたものである。酸化緩衝液は２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、６ＭＧｕＨＣｌ、１ ｍＭＧＳＳＧ、０．１ｍＭ
ＧＳＨ、ｐＨ９．０を使用した。酸化は室温で一夜行った。酸化後のサンプルは、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ尿素、ｐＨ ８．０の溶液に対して透析を行った。アフィニティクロマトグラフィーはＰＢＳＡで行ったが、それ以外の工程全ての緩衝液はこれを使用した。
【０１１７】
【表１】
１０．イムノトキシンの構築
リシンＡ−５２０Ｃ９ 一本鎖融合イムノトキシン（配列表配列番号７）をコードする遺伝子は、ｐＰＬ２２９（シータース エメリービル カリフォルニア）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ上のリシンＡ鎖をコードする遺伝子を単離し、図３に示したようにｐＨ７７７の５２０Ｃ９の上流を使用して構築した。融合体はリシンのＡドメインとＢドメインの間に１２２アミノ酸の天然のリンカーを有している。しかし、オリジナルなｐＲＡＰ２９９発現ベクター中を、リシンのアミノ酸２６８のコドンが、翻訳停止コドンＴＡＡに変換していたため、得られた遺伝子の発現は、リシンＡのみを生産していた。それ故、翻訳停止コドンを除去する目的で、部位直接突然変異を行ってＴＡＡを除去し、天然型のセリンコドンに置き換えた。次いで完全なイムノトキシン遺伝子を連続させて、この遺伝子を翻訳させた。
【０１１８】
ｐＰＬ２２９およびｐＲＡ２２９発現ベクターにイムノトキシンのバックを挿入するため、イムノトキシン遺伝子の末端のＰｓｔＩ部位をベクターのＢａｍＨＩと両立した配列に変換する必要がある。ＰｓｔＩと末端の間にＢｃｌＩ部位を含んでいる合成オリゴヌク
レオチドアダプターが挿入された。ＢｃｌＩとＢａｍＨＩ末端は両立しており、ハイブリッドＢｃｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に重ねあわせることができた。ＢｃｌＩヌクレアーゼは、ｄａｍメチレーションに感受性が高いため、構築にあたって最初に、プラスミドＤＮＡをＢｃｌＩ（およびＨｉｎｄＩＩＩ）で消化する目的で、ｄａｍ（−）Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｇｍ４８に形質転換させた。次いでＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｃｌＩフラグメントバック上の完全なイムノトキシン遺伝子を、発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｃｌＩ分解位置に挿入した。
【０１１９】
天然型５２０Ｃ９ ＩｇＧを天然また組換えリシンＡ鎖と結合させた時、得られたイムノトキシンは、０．４×１０−９Ｍの濃度でＳＫ−Ｂｒ−３細胞の蛋白質合成の５０％を阻害できる。さらにＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞の反応に加えて、天然の５２０Ｃ９ ＩｇＧ１イムノトキシンは、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３を阻害し、そのＩＤ５０は２．０×１０−９Ｍであった。
【０１２０】
上記のリシンＡ − ｓＦｖ融合蛋白質では、リシンは発現のリーダとして作用する、即ちｓＦｖのアミノ末端に融合している。ダイレクトエクスプレッションに従うと、溶解蛋白質は天然５２０Ｃ９のＦａｂに対して抗体として反応し、リシンＡ鎖の酵素活性作用を有している。
【０１２１】
別のデザインでは、リシンＡ鎖はｓＦｖのカルボキシ末端に融合している。５２０Ｃ９
ｓＦｖは、ｓＦｖのＣ末端に結合したリシンＡ鎖と一緒に、Ｐｅ１Ｂシグナル配列を介して分泌される。これを構築するためには、ＰｅｌＢ−シグナル配列、ｓＦｖ、リシンをコードする配列をｓＦｖ （発現プラスミド中の）のすぐ後のＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してブルースクリプトプラスミドに結合させる。さらにＨｉｎｄＩＩＩ部位は、３つの部分の集まり（ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ）においてルシン遺伝子より先行する。リシン遺伝子に続く新しいＰｓｔＩサイトは、ブルースクリプト ポリリンカーを介して得ることができる。このＤＮＡ変異は、ｓＦｖの末端でストップコドンとオリジナルのＰｓｔＩサイトを除去し、幾つかのセリン残基をｓＦｖとリシン遺伝子の間に置くところにある。この新しい融合遺伝子Ｐｅ１Ｂシグナル配列／ ｓＦｖ ／リシンＡは発現ベクターのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントに挿入できる。
【０１２２】
別のデザインでは、リシンＡ鎖のアナログであるシュードモナスエキソトキシンフラグメントＰＥ４０を抗ｃ−ｅｒｂＢ−２ ７４１８ ｓＦｖ（配列表配列番号１５および１６）のカルボキシ末端に融合させている。得られた７４１Ｆ８
ｓＦｖ −ＰＥ４０は一本鎖Ｆｖ− トキシン融合蛋白質であり、蛋白質に最初から存在している１８残基短いＦＢリーダーで構築する。この蛋白質のＥ．ｃｏｌｉでの発現は、３Ｍ尿素 グルタチオン／レドックス緩衝液中でリフォールディングしたインクルージョンボディーを生産した。得られたｓＦｖ −ＰＥ４０は、対応する架橋イムノトキシンと比べて、ｃ−ｅｒｂＢ−２保持細胞をより完全にかつ明らかにより強い細胞障害作用で、特異的に殺すことができた。７４１Ｆ８ ｓＦｖと同様に、ｓＦｖ −毒素蛋白質は、この方法で効率良く調製できる。乳癌や卵巣癌などのｃ−ｅｒｂＢ−２または関連抗原を保持する腫瘍に対する治療剤、診断剤として使用できる。
【０１２３】
１１．分析
Ａ．拮抗ＥＬＩＳＡ
ＳＫ−Ｂｒ−３抽出物を以下のようなｃ−ｅｒｂＢ−２抗原のソースとして調製した。ＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞（Ｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：３０７０− ３０８０）は、５％ウシ胎児血清と２ｍＭグルタミン添加イソコブの培地（ギブコＢＲＬゲイタースバーグＭＤ）でコンフルエンスに近い状態まで培養した。培地を吸引除去して、細胞をカルシウムとマグネシウムを添加した１０ｍｌ
のウシ胎児血清（ＦＢＳ）ですすぎ洗い、ゴムの付いたガラス棒でカルシウムとマグネシウムを添加したＦＢＳに取り出した。培養容器は新しいこの緩衝液５ｍｌですすいだ。１００ｒｐｍの遠心分離で細胞を回収した。上清を吸引除去し、細胞を１０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、ｐＨ８の緩衝液（ＴＮＮ緩衝液）１０ｍＭを用いて１０７細胞／ｍｌの密度になるように再分散させた。そしてピペッティングでアップダウンを行い、ペレットを溶解させた。溶液は１０００ｒｐｍで遠心し、細胞核とその他の不溶解残渣を除去した。抽出物は０．４５のマイレックスＨＡと０．２のマイレックスＧｖフィルターで濾過した。ＴＮＮ抽出物はアリコートとして、ホエートン凍結用バイアルに入れて−７０℃で保存した。
【０１２４】
ＳＫ−Ｂｒ−３ ＴＮＮ抽出物の新鮮なバイアルは解凍し、そして脱イオン水で２００倍に希釈した。その後直ちに、ダイナテックＰＶＣ９６ウエルプレートに、１ウエル当たり４０μｇを入れ、３７℃の乾燥インキュベータで一晩保持した。プレートはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％脱脂乳、０．０５％ツイーン２０の溶液で４回洗浄した。
【０１２５】
非特異的な結合部位は以下のようにしてブロックした。プレートが乾燥後、１％脱脂乳を含むＰＢＳ １００μｇを各ウエルに加え、１時間室温でインキュベートして反応を進行させた。
【０１２６】
一本鎖Ｆｖ試験サンプルと標準５２０Ｃ９ホール抗体希釈物を以下のように加えた。５２０Ｃ９抗体と試験サンプルは、２倍希釈法により希釈緩衝液（ＰＢＳ＋１％ 脱脂乳）で希釈した。最初に５０μｇ／ｍｌにし、最後に標準５２０Ｃ９を少なくとも１０回希釈する。希釈緩衝液のみを含むコントロールも調製する。希釈サンプル、標準とも５０μｌをウエルに加え室温で３０分間インキュベートした。
【０１２７】
５２０Ｃ９ −ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）プローブを次のように加えた。５２０Ｃ９−ＨＲＰ複合体（ザイムド ラボ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）は１％脱脂乳を含む希釈緩衝液で１４μｇ／ｍｌに希釈した。最適の希釈は、前のステップを省くことなしに、ペルオキシダーゼ複合体の新しいバッチごとに決定する。２０μｌのプローブを各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートはＰＢＳで４回洗浄した。ペルオキシダーゼの基質をさらに添加した。基質溶液は、希釈テトラメチルベンジジンストック（ＴＭＢ；２ｍｇ／ｍｌ １００％エタノール）１：２０と基質緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｎａ ＥＤＴＡ，ｐＨ５．０）中の３％過酸化水素ストック１：２２００を使用する都度調製する。これを室温で３０分間インキュベートする。ウエルに０．８Ｍ硫酸を１００μｌ加え、酵素反応を止め、１５０ｎｍで吸収を測定した。
【０１２８】
図４は、ペアレントのリフォールドしているが未精製５２０Ｃ９モノクローナル抗体、５２０Ｃ９ Ｆａｂフラグメント、および結合後アフィニティーカラムからの溶出（溶出）、または非結合通過フラクション（通過）５２０Ｃ９ ｓＦｖ一本鎖結合部位の結合能を比較した。図４には完全に精製した５２０Ｃ９ ｓＦｖは測定蛋白質濃度の誤差範囲でペアレントなモノクローナル抗体と区別が困難であるｃ−ｅｒｂＢ−２に親和性を有することを示している。
【０１２９】
Ｂ．インビボ試験
培養増殖する乳癌細胞に対して、強い蛋白質合成阻害を示すイムノトキシンは、インビボでその有効性を試験できる。インビボ分析は、ヒト乳癌細胞株ＭＸ−１を移植したヌードマウスモデルを使用して一般的に行うことができる。マウスにはＰＢＳ（コントロール）、種々の濃度のｓＦｖ −毒素のイムノトキシンを注射し、濃度依存的に腫瘍の増殖が抑制されることが観察される。より高い濃度のイムノトキシンの投与がより効果を示すこ
とが予測される。
【０１３０】
本発明はその精神と範囲から離れることなしに、その他の特徴的な形態を実施することが可能である。従って本発明の実施は、説明されているように、そして限定なしに、全てに関して考慮されている。発明の範囲は、記載の説明よりむしろ付属のクレームによって示されており、クレームが意味し均等の範囲からくる全ての変更は、それらを包含するものである。
【０１３１】
（配列表）
【０１３２】
【化１】
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
本発明の先に示した内容、さらにその他の目的に関する種々の特徴は、本発明と同様に、図面とともに説明を熟読して、以下に示す説明を充分に理解されるものである。
【図１Ａ】図１Ａは本発明のｓＦｖをコードするＤＮＡの構築を模式図で示したものである。ドメインをコードするＶＨおよびＶＬとリンカー部分を示している。
【図１Ｂ】図１ＢはＶＨとＶＬドメインを表しているＦｖの構造を模式図で示した。３つの相補的決定部分（ＣＤＲｓ）と公知の特徴付けられたモノクローナル５２０Ｃ９の４つのフレームワーク部分（ＦＲｓ）からなっており、ｃ−ｅｒｂＢ−２に特異的なマウスモノクローナル抗体である。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ａはぺンダントリーダー配列を有するｓＦｖである。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２ＢはｓＦｖ −毒素（あるいはその他の補助蛋白質）の構成である。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ｃは二価あるいは二特異性ｓＦｖの構成を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ｄはカルボキシ末端にペンダント蛋白質が結合した二価ｓＦｖを示す。
【図２Ｅ】図２Ａ−２Ｅは本発明の実例を模式図で示す。それぞれ生物合成した一本鎖Ｆｖポリペプチドからなり、ｃ−ｅｒｂＢ−２関連抗原を認識する。図２Ｅはアミノ末端とカルボキシ末端両方にぺンダント蛋白質を持つ二価ｓＦｖを示す。
【図３】図３は、５２０Ｃ９ ｓＦｖ − リシンＡの融合した免疫毒素遺伝子をコードするプラスミドの構築を図式化して示す。
【図４】図４は５２０９モノクローナル抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２特異的）のｃ−ｅｒｂＢ−２結合活性を比較する拮抗分析の結果をグラフ化して示したものである。モノクローナル抗体のＦａｂフラグメント（黒点）と５２０Ｃ９モノクローナル抗体の可変領域から構築したｃ−ｅｒｂＢ−２に一本鎖−Ｆｖ結合部の異なる親和性で精製したフラクション（ｓＦｖ全サンプル（＋）、ｓＦｖに結合しｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイン固定化カラムから溶出したもの（四角）、ｓＦｖ溶出（未結合、＊）を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍抗原に結合する結合部位を特定する一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドであって、該ｓＦｖポリペプチドは、ポリペプチドリンカーで連結された少なくとも２つのポリペプチドドメインを含み、該ポリペプチドリンカーは、１つのポリペプチドドメインのＣ末端と他のポリペプチドドメインのＮ末端との間の距離にわたっており、該ポリペプチドドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、一組のフレームワーク領域の間に挿入された一組の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、該ＣＤＲｓは、該ｃ−ｅｒｂＢ−２抗原に対する免疫学的結合を与え、ここで、該ポリペプチドリンカーは、配列番号４のアミノ酸残基１１８〜１３３として示される配列、配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５として示される配列、および配列番号１２に示されているアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列からなる、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチド。
【請求項１】
ｃ−ｅｒｂＢ−２腫瘍抗原に結合する結合部位を特定する一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドであって、該ｓＦｖポリペプチドは、ポリペプチドリンカーで連結された少なくとも２つのポリペプチドドメインを含み、該ポリペプチドリンカーは、１つのポリペプチドドメインのＣ末端と他のポリペプチドドメインのＮ末端との間の距離にわたっており、該ポリペプチドドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、一組のフレームワーク領域の間に挿入された一組の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含み、該ＣＤＲｓは、該ｃ−ｅｒｂＢ−２抗原に対する免疫学的結合を与え、ここで、該ポリペプチドリンカーは、配列番号４のアミノ酸残基１１８〜１３３として示される配列、配列番号１５のアミノ酸残基１２２〜１３５として示される配列、および配列番号１２に示されているアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列からなる、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチド。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【図４】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２３１０２７（Ｐ２００７−２３１０２７Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６３２２０（Ｐ２００７−１６３２２０）
【出願日】平成１９年６月２０日（２００７．６．２０）
【分割の表示】特願２００４−１７８９６１（Ｐ２００４−１７８９６１）の分割
【原出願日】平成５年２月５日（１９９３．２．５）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２０日（２００７．６．２０）
【分割の表示】特願２００４−１７８９６１（Ｐ２００４−１７８９６１）の分割
【原出願日】平成５年２月５日（１９９３．２．５）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
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