癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子
癌細胞にのみアポトーシスを誘導して死滅させる新しい癌治療の手段を提供する。ｐ５３又は１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異ｐ５３、及びクラスリン重鎖から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子である。この転写因子は、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写能を高め、癌細胞のアポトーシスを誘導する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
この発明は、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子に関する。
従来技術
癌抑制遺伝子ｐ５３はｐ２１、ｐ５３Ｒ２又はｐ５３ＡＩＰ１等の標的遺伝子のＤＮＡ配列に特異的に結合して、その転写活性を制御する転写因子であり、近年ｐ５３の関与する細胞癌化のメカニズムは詳しく研究されてきている（細胞工学ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，２３−２８（２００３））。ｐ５３が制御する標的遺伝子の中で、ｐ５３ＡＩＰ１はミトコンドリアに局在するタンパク質で、ミトコンドリアの膜電位とシトクロムｃの放出を制御することで正のアポトーシス作用を有している（Ｏｄａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０２，８４９−８６２，２０００；Ｍａｔｓｕｄａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，２８８３−２８８９，２００２）。このｐ５３ＡＩＰ１はｐ５３によるアポトーシス誘導に重要な役割を持つＳｅｒ４６のリン酸化（特願２００１−２９２９５３）に強い相関を示し、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の発現により癌細胞のアポトーシスが誘導される。例えば、ＤＮＡが損傷される等の強いストレスを受けると、転写因子ｐ５３のＳｅｒ４６がｐ５３ＤＩＮＰ１等の働きによりリン酸化を受け、ｐ５３ＡＩＰ１の発現が誘発され、癌細胞のアポトーシスが誘導されると考えられている（細胞工学ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，２３−２８（２００３））。
一方、癌細胞のアポトーシスを誘導することを目的として、シスプラチンなどの抗癌剤が使用されているが、ほとんどがＤＮＡに傷をつけることによってアポトーシスを誘導するものである。そのため、正常細胞のＤＮＡにも傷がついて副作用が現れる。癌の放射線療法も同様に正常細胞のＤＮＡに傷がついて副作用が現れる。
この他にも、ｐ５３の遺伝子や、ｐ５３によって誘導されてアポトーシスを誘導するＢａｘやｐ５３Ａ１Ｐ１などの遺伝子をアデノウィルスベクターに組み込んで癌細胞に感染させ、アポトーシスを誘導させて死滅させようという試みもなされてはいるが、よい結果が得られているとはいえない。
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、癌細胞にのみアポトーシスを誘導して死滅させる新しい癌治療の手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、癌細胞からｐ５３の発現に伴ってクラスリン重鎖と見られる約１７０ｋＤａのタンパク質が共沈殿してくることを見出し、クラスリン重鎖のｃＤＮＡを発現ベクターに導入して癌細胞の核内へトランスフェクトすると、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写能を高めることを見出した。このような結果から、このクラスリン重鎖とｐ５３とが結合して転写因子を構成し、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写能を高め、癌細胞のアポトーシスを誘導すると結論された。
即ち、本発明は、ｐ５３（配列番号１）又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異ｐ５３、及びクラスリン重鎖（配列番号２）から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子である。これらは、ヒト等の組織や細胞から抽出・精製して取り出して用いてもよいし、これらをコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養して得て用いてもよい。
また、前記変異ｐ５３は、少なくとも４６位のＳｅｒが置換されたｐ５３であってもよく、特にその４６位のＳｅｒがＰｈｅに置換されていることが好ましい。
また本発明は、この転写因子を有効成分とする癌の治療薬である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、クラスリン重鎖によるｐ５３ＡＩＰ１の転写活性の制御の概念図を示す。
第２図は、ｐｃ−ｐ５３−ｆベクターの構造を示す。
第３図は、ｐ５３ＡＩＰ１．ｐｒｏ．ｒｅｐｏｒｔｅｒベクターの構造を示す。
第４図は、ｐｃ−ＣＨＣベクターの構造を示す。
第５図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト骨肉腫由来細胞にトランスフェクトし、そのｐ５３Ａ１Ｐ１プロモーターからの転写能を示す。
第６図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトした細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）を示す。
第７図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトした細胞抽出物の抗クラスリン重鎖抗体及び抗ｐ５３抗体によるウエスタンブロットを示す。図中、ＷＴはＷＴ−ｐ５３、４６ＡはＳ４６Ａ−ｐ５３、４６ＤはＳ４６Ｄ−ｐ５３、４６ＦはＳ４６Ｆ−ｐ５３、Δ４４−６３は４４−６３−Ｐ５３を用いたものを示す。
第８図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトした細胞の細胞質及び核抽出物に対し、抗クラスリン重鎖抗体を用いたウエスタンブロットを示す。図中、ｐｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３．１、ＷＴはＷＴ−ｐ５３、４６ＦはＳ４６Ｆ−ｐ５３、Δ４４−６３は４４−６３−ｐ５３を用いたものを示す。
第９図は、クラスリン重鎖のｃＤＮＡを入れた発現ベクター（ｐｃ−ＣＨＣ）とｐ５３発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）を共にヒト骨肉腫由来細胞にトランスフェクトし、その細胞抽出物を調べた結果を示す。図中、Ｃｌａｔｈｒｉｎ ＨＣはｐｃ−ＣＨＣ、ＷＴはＷＴ−ｐ５３、Ｓ４６ＦはＳ４６Ｆ−ｐ５３、Δ４４−６３は４４−６３−ｐ５３を用いたものを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
クラスリンには重鎖と軽鎖とがあり、普通は細胞表面から内部への物質の取り込みであるエンドサイトーシスに働く。しかし、本研究の結果、発明者らは、このクラスリン重鎖が、第１図に示すように、癌細胞の中で軽鎖とは結合せずにｐ５３と結合してｐ５３の転写活性化能を高め、アポトーシスを強く誘導することを見出した。特に、ｐ５３のセリン４６をフェニルアラニンに置換したｐ５３とは特に強く結合してアポトーシスも強く誘導する。
本発明の転写因子を何らかの方法で癌細胞に注入するか、又はクラスリン重鎖のみを何らかの方法で癌細胞に注入し癌細胞中に存在するｐ５３と結合させることにより、癌細胞にアポトーシスを誘導して死滅させることができる。
このような転写因子を利用すれば、正常細胞には傷をつけないで、癌細胞にのみ特異的に、従来の方法よりも効果的にアポトーシスを誘導させて死滅させることが可能になり、従来の方法よりも効率のよい癌治療法になる。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらは本発明を制限することを意図したものではない。
試験例１
この試験例では、以後の試験で用いる下記５種のベクター（これらを総称して「ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ」という。）を作成した。
（ｉ）野生型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、第２図参照）に挿入した野生型ヒトｐ５３発現ベクター（以下「ＷＴ−ｐ５３」という。）
（ｉｉ）４６位のＳｅｒをＡｌａに置き換えた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「Ｓ４６Ａ−ｐ５３」という。）
（ｉｉｉ）４６位のＳｅｒをＡｓｐに置き換えた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「Ｓ４６Ｄ−ｐ５３」という。）
（ｉｖ）４６位のＳｅｒをＰｈｅに置き換えた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「Ｓ４６Ｆ−ｐ５３」という。）
（ｖ）４４〜６３位を欠失させた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「４４−６３−ｐ５３」という。）
以上のベクターを以下の手順で作成した。
各種ｐｃＤＮＡ−Ｐ５３−ｆは、まずｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｈｏＩ部位及びＸｂａＩ部位で切断し、９アミノ酸残基からなるＦｌａｇ配列（ＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）をコードする二本鎖ＤＮＡ（配列番号８）を挿入した（ｐｃＤＮＡ−ｆ）。作製したｐｃＤＮＡ３−ｆプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ部位及びＸｈｏＩ部位を切断し、ＢａｍＨＩ部位及びＸｈｏＩ部位切断末端を持つ野生型ヒトｐ５３遺伝子（配列番号９）又は変異型ヒトｐ５３遺伝子を挿入した（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）。これらベクターの地図を第２図に示す。
試験例２
この試験例では、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子イントロン１内にあるｐ５３結合配列を含む約５００ｂｐをｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の上流へ挿入したレポータープラスミドを作成した。
ｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を制限酵素ＳａｃＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位で切断し、制限酵素ＳａｃＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位切断末端を持つｐ５３結合配列を含むｐ５３ＡＩＰ１イントロン１（約５００ｂｐ、配列番号１０）を挿入した。このベクターの地図を第３図に示す。以下このレポーターを「ｐ５３ＡＩＰ１ｐｒｏ．ｒｅｐｏｒｔｅｒ」という。
試験例３
試験例１と同様の操作で、クラスリン重鎖遺伝子（かずさＤＮＡ研究所から分与、配列番号１１）をｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、第２図参照）に挿入して、クラスリン重鎖発現ベクター（以下「ｐｃ−ＣＨＣ」という。）を作成した。このベクターの地図を第４図に示す。
試験例４
この試験例では、試験例１で用意した５種の発現ベクターをヒト骨肉腫由来細胞にトランスフェクトし、その細胞抽出物を調べた。
試験は以下の手順で行った。
１）７ Ｘ １０４個のＳａｏｓ−２細胞（骨肉腫由来）を２４穴プレートに蒔き、一晩培養した。
２）トランスフェクションするためのＤＮＡを、試験例１と試験例２で用意したｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆとｐ５３ＡＩＰ１ｐｒｏ．ｒｅｐｏｒｔｅｒを用いて、表１のように調製した。加えた各ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆは０〜３０ｎｇ用い、ｐｃＤＮＡ３．１と併せて総量３０ｎｇとした。なお、ｐｈＲＧ−ＴＫは、ウミシイタケｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社、内部コントロール）を示す。トランスフェクションの方法はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキットに添付されているプロトコールに従った。
３）ＤＮＡ溶液とＬｉｐｏ溶液を混和し、室温で３０分間インキュベーションした。
４）そのＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ複合体を１）で調製した細胞に滴下した。
５）４時間後、ＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ複合体を除去し、細胞を１ Ｘ ＰＢＳ−で洗浄した。
６）トランスフェクションしてから２４時間後、細胞を１ Ｘ ＰＢＳ−で洗浄し、Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、細胞中のホタルｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性及びウミシイタケｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性（内部コントロール）をそれぞれルミノメーターで測定した。その測定方法は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキットに添付されているプロトコールに従って行った。
７）ｐｃＤＮＡ３．１を導入した細胞抽出液中のホタルｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をウミシイタケｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性で割った値を１とした時の相対的な活性（Ｆｏｌｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を算出した。
その結果を第５図に示す。ｐ５３のＳｅｒ４６Ｐｈｅ置換体はｐ５３Ａ１Ｐ１プロモーターからの転写を野生型よりもかなり強く誘導することがわかった。
【実施例１】
この実施例では、試験例１で用意した５種の発現ベクターをヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトし、その細胞抽出物を調べた。
試験は以下の手順で行った。
１）９×１０６のＨ１２９９細胞（非小肺がん由来）を１５ｃｍディッシュに蒔き、一晩培養した（１０枚）。
２）トランスフェクションするためのＤＮＡを表２のように調製した。トランスフェクションの方法はＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅのキットに添付されているプロトコールに従った。
３）そのＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅを室温で３０分間インキュベーションし、１）で調製した細胞に滴下した。
４）トランスフェクションしてから２１時間後、細胞をスクレイパーで剥がし、６００ ｘ ｇ、５分間低速遠心して細胞を回収した。
５）細胞を１度 Ｘ ＰＢＳ−で洗浄した後、１０ｍｌの表３の下記細胞溶解緩衝液で細胞を溶解した。
６）細胞を超音波破砕後、不溶性画分を１５ｋｒｐｍ、１５分間、４℃で除去した。
７）その上清を０．２ｍｌの抗ＦＬＡＧ抗体アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と一晩インキュベーションした。
８）インキュベーション後、ビーズを上記細胞溶解緩衝液で４回洗浄した。
９）その後、１．５ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチドを含む上記細胞溶解緩衝液で競合的にビーズからｐ５３タンパク質溶出した。
１０）その溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いで銀染色した。
その結果を第６図に示す。その結果、Ｓ４６Ｆ置換体ではｐ５３と一緒に分子量１７０ｋＤａのタンパク質が強く共沈澱してくる。これをマススペクトロメトリーにかけてみたところ、ＬＨＩＩＥＶＧＴＰＰＴＧＮＱＰＦＰＫ、ＩＶＬＤＮＳＶＦＳＥＨＲ、ＶＡＮＶＥＬＹＹＲ、ＱＬＰＬＶＫＰＹＬＲ、及びＶＤＫＬＤＡＳＥＳＬＲ（配列番号３〜７）のアミノ酸配列が得られた。これらは、それぞれクラスリン重鎖（配列番号２）の２２８−２４５、１０１１−１０２２、１３９８−１４０６、１４４４−１４５３、及び１６１０−１６２０位に相当する。これは、この１７０ｋＤａのタンパク質がクラスリンの重鎖であることを示す。
１１）１７０ ｋＤのタンパク質の同定には銀染色で使われた量の約２０倍のタンパク質を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでＣＢＢ染色、目的バンドの切り出し、トリプシン消化後、質量分析を用いて行った。
１２）１０）の実験手順で得られた溶出液の１００分の１容をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでＰＶＤＦ膜に転写後、抗クラスリン重鎖抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）あるいは抗ｐ５３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いたウエスタンブロッティング法を行った。ここではＡｍｅｒｓｈａｍ社のｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−抗マウスＩｇＧ二次抗体とＥＣＬキットを用いてバンドを視覚化した。
その結果を第７図に示す。Ｓ４６Ｆ置換体にクラスリン重鎖が特に強く結合することがわかった。
試験例５
この試験例では、実施例１で用いたヒト非小肺がん由来細胞の核抽出物を調べた。試験は以下の手順で行った。
１）１５ｃｍディッシュ一枚分を実施例１と同様の手順でトランスフェクションした。
２）細胞を回収後、１ｍｌの表４の低張緩衝液＊１で細胞を懸濁し、ホモジナイザーで細胞膜を破壊した。
３）それを６００ ｘ ｇ、５分間、４℃で低速遠心し、細胞質画分と核画分に分離した。
４）核画分に関しては２）、３）の操作を２回繰り返し、核画分に細胞質由来のタンパク質の持ち込みをできる限り除去した。
５）核画分を０．２ｍｌの表４の高張緩衝液＊２で懸濁し３０分間氷上に置き、核からタンパク質を溶出した。
６）１０ ｋ ｘ ｑ、５分間、４℃で核画分から不溶性画分を除去した。
７）細胞質画分と核画分由来のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでＰＶＤＦ膜に転写後、抗クラスリン重鎖抗体を用いた実施例１と同様にウエスタンブロッティング法を行った。核画分は細胞質に比べ５倍量の細胞由来のタンパク質を用いた。
その結果を第８図に示す。この結果、クラスリンは細胞質でのみ働くと思われていたが、クラスリン重鎖の一部分は核内にも存在することを確認した。
【実施例２】
この実施例では、試験例４の手順のうち２）のトランスフェクションするためのＤＮＡを、試験例３で用意したｐｃ−ＣＨＣを用いて、表５のように調製した以外は、試験例４と同様の試験を行った。
その結果を第９図に示す。上記ＤＮＡ溶液において、ｐｃ−ＣＨＣ（４００ｎｇ）を用いたものをＣｌａｔｈｒｉｎ＋、ｐｃＤＮＡ３．１（４００ｎｇ）を用いたものをＣｌａｔｈｒｉｎ−と表記する。
クラスリン重鎖のｃＤＮＡを発現ベクターに入れてｐ５３と共にトランスフェクトすると、ｐ５３Ａ１Ｐ１プロモーターからの転写能を高めたことが認められた。特に、Ｓ４６Ｆ置換体では強く高められた。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
この発明は、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子に関する。
従来技術
癌抑制遺伝子ｐ５３はｐ２１、ｐ５３Ｒ２又はｐ５３ＡＩＰ１等の標的遺伝子のＤＮＡ配列に特異的に結合して、その転写活性を制御する転写因子であり、近年ｐ５３の関与する細胞癌化のメカニズムは詳しく研究されてきている（細胞工学ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，２３−２８（２００３））。ｐ５３が制御する標的遺伝子の中で、ｐ５３ＡＩＰ１はミトコンドリアに局在するタンパク質で、ミトコンドリアの膜電位とシトクロムｃの放出を制御することで正のアポトーシス作用を有している（Ｏｄａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０２，８４９−８６２，２０００；Ｍａｔｓｕｄａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，２８８３−２８８９，２００２）。このｐ５３ＡＩＰ１はｐ５３によるアポトーシス誘導に重要な役割を持つＳｅｒ４６のリン酸化（特願２００１−２９２９５３）に強い相関を示し、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子の発現により癌細胞のアポトーシスが誘導される。例えば、ＤＮＡが損傷される等の強いストレスを受けると、転写因子ｐ５３のＳｅｒ４６がｐ５３ＤＩＮＰ１等の働きによりリン酸化を受け、ｐ５３ＡＩＰ１の発現が誘発され、癌細胞のアポトーシスが誘導されると考えられている（細胞工学ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，２３−２８（２００３））。
一方、癌細胞のアポトーシスを誘導することを目的として、シスプラチンなどの抗癌剤が使用されているが、ほとんどがＤＮＡに傷をつけることによってアポトーシスを誘導するものである。そのため、正常細胞のＤＮＡにも傷がついて副作用が現れる。癌の放射線療法も同様に正常細胞のＤＮＡに傷がついて副作用が現れる。
この他にも、ｐ５３の遺伝子や、ｐ５３によって誘導されてアポトーシスを誘導するＢａｘやｐ５３Ａ１Ｐ１などの遺伝子をアデノウィルスベクターに組み込んで癌細胞に感染させ、アポトーシスを誘導させて死滅させようという試みもなされてはいるが、よい結果が得られているとはいえない。
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、癌細胞にのみアポトーシスを誘導して死滅させる新しい癌治療の手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、癌細胞からｐ５３の発現に伴ってクラスリン重鎖と見られる約１７０ｋＤａのタンパク質が共沈殿してくることを見出し、クラスリン重鎖のｃＤＮＡを発現ベクターに導入して癌細胞の核内へトランスフェクトすると、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写能を高めることを見出した。このような結果から、このクラスリン重鎖とｐ５３とが結合して転写因子を構成し、ｐ５３ＡＩＰ１プロモーターの転写能を高め、癌細胞のアポトーシスを誘導すると結論された。
即ち、本発明は、ｐ５３（配列番号１）又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異ｐ５３、及びクラスリン重鎖（配列番号２）から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子である。これらは、ヒト等の組織や細胞から抽出・精製して取り出して用いてもよいし、これらをコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養して得て用いてもよい。
また、前記変異ｐ５３は、少なくとも４６位のＳｅｒが置換されたｐ５３であってもよく、特にその４６位のＳｅｒがＰｈｅに置換されていることが好ましい。
また本発明は、この転写因子を有効成分とする癌の治療薬である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、クラスリン重鎖によるｐ５３ＡＩＰ１の転写活性の制御の概念図を示す。
第２図は、ｐｃ−ｐ５３−ｆベクターの構造を示す。
第３図は、ｐ５３ＡＩＰ１．ｐｒｏ．ｒｅｐｏｒｔｅｒベクターの構造を示す。
第４図は、ｐｃ−ＣＨＣベクターの構造を示す。
第５図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト骨肉腫由来細胞にトランスフェクトし、そのｐ５３Ａ１Ｐ１プロモーターからの転写能を示す。
第６図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトした細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）を示す。
第７図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトした細胞抽出物の抗クラスリン重鎖抗体及び抗ｐ５３抗体によるウエスタンブロットを示す。図中、ＷＴはＷＴ−ｐ５３、４６ＡはＳ４６Ａ−ｐ５３、４６ＤはＳ４６Ｄ−ｐ５３、４６ＦはＳ４６Ｆ−ｐ５３、Δ４４−６３は４４−６３−Ｐ５３を用いたものを示す。
第８図は、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）をヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトした細胞の細胞質及び核抽出物に対し、抗クラスリン重鎖抗体を用いたウエスタンブロットを示す。図中、ｐｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３．１、ＷＴはＷＴ−ｐ５３、４６ＦはＳ４６Ｆ−ｐ５３、Δ４４−６３は４４−６３−ｐ５３を用いたものを示す。
第９図は、クラスリン重鎖のｃＤＮＡを入れた発現ベクター（ｐｃ−ＣＨＣ）とｐ５３発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）を共にヒト骨肉腫由来細胞にトランスフェクトし、その細胞抽出物を調べた結果を示す。図中、Ｃｌａｔｈｒｉｎ ＨＣはｐｃ−ＣＨＣ、ＷＴはＷＴ−ｐ５３、Ｓ４６ＦはＳ４６Ｆ−ｐ５３、Δ４４−６３は４４−６３−ｐ５３を用いたものを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
クラスリンには重鎖と軽鎖とがあり、普通は細胞表面から内部への物質の取り込みであるエンドサイトーシスに働く。しかし、本研究の結果、発明者らは、このクラスリン重鎖が、第１図に示すように、癌細胞の中で軽鎖とは結合せずにｐ５３と結合してｐ５３の転写活性化能を高め、アポトーシスを強く誘導することを見出した。特に、ｐ５３のセリン４６をフェニルアラニンに置換したｐ５３とは特に強く結合してアポトーシスも強く誘導する。
本発明の転写因子を何らかの方法で癌細胞に注入するか、又はクラスリン重鎖のみを何らかの方法で癌細胞に注入し癌細胞中に存在するｐ５３と結合させることにより、癌細胞にアポトーシスを誘導して死滅させることができる。
このような転写因子を利用すれば、正常細胞には傷をつけないで、癌細胞にのみ特異的に、従来の方法よりも効果的にアポトーシスを誘導させて死滅させることが可能になり、従来の方法よりも効率のよい癌治療法になる。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらは本発明を制限することを意図したものではない。
試験例１
この試験例では、以後の試験で用いる下記５種のベクター（これらを総称して「ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ」という。）を作成した。
（ｉ）野生型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、第２図参照）に挿入した野生型ヒトｐ５３発現ベクター（以下「ＷＴ−ｐ５３」という。）
（ｉｉ）４６位のＳｅｒをＡｌａに置き換えた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「Ｓ４６Ａ−ｐ５３」という。）
（ｉｉｉ）４６位のＳｅｒをＡｓｐに置き換えた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「Ｓ４６Ｄ−ｐ５３」という。）
（ｉｖ）４６位のＳｅｒをＰｈｅに置き換えた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「Ｓ４６Ｆ−ｐ５３」という。）
（ｖ）４４〜６３位を欠失させた変異型ヒトｐ５３遺伝子をｐｃＤＮＡ３プラスミドに挿入した変異ヒトｐ５３発現ベクター（以下「４４−６３−ｐ５３」という。）
以上のベクターを以下の手順で作成した。
各種ｐｃＤＮＡ−Ｐ５３−ｆは、まずｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｈｏＩ部位及びＸｂａＩ部位で切断し、９アミノ酸残基からなるＦｌａｇ配列（ＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）をコードする二本鎖ＤＮＡ（配列番号８）を挿入した（ｐｃＤＮＡ−ｆ）。作製したｐｃＤＮＡ３−ｆプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ部位及びＸｈｏＩ部位を切断し、ＢａｍＨＩ部位及びＸｈｏＩ部位切断末端を持つ野生型ヒトｐ５３遺伝子（配列番号９）又は変異型ヒトｐ５３遺伝子を挿入した（ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆ）。これらベクターの地図を第２図に示す。
試験例２
この試験例では、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子イントロン１内にあるｐ５３結合配列を含む約５００ｂｐをｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の上流へ挿入したレポータープラスミドを作成した。
ｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を制限酵素ＳａｃＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位で切断し、制限酵素ＳａｃＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位切断末端を持つｐ５３結合配列を含むｐ５３ＡＩＰ１イントロン１（約５００ｂｐ、配列番号１０）を挿入した。このベクターの地図を第３図に示す。以下このレポーターを「ｐ５３ＡＩＰ１ｐｒｏ．ｒｅｐｏｒｔｅｒ」という。
試験例３
試験例１と同様の操作で、クラスリン重鎖遺伝子（かずさＤＮＡ研究所から分与、配列番号１１）をｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、第２図参照）に挿入して、クラスリン重鎖発現ベクター（以下「ｐｃ−ＣＨＣ」という。）を作成した。このベクターの地図を第４図に示す。
試験例４
この試験例では、試験例１で用意した５種の発現ベクターをヒト骨肉腫由来細胞にトランスフェクトし、その細胞抽出物を調べた。
試験は以下の手順で行った。
１）７ Ｘ １０４個のＳａｏｓ−２細胞（骨肉腫由来）を２４穴プレートに蒔き、一晩培養した。
２）トランスフェクションするためのＤＮＡを、試験例１と試験例２で用意したｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆとｐ５３ＡＩＰ１ｐｒｏ．ｒｅｐｏｒｔｅｒを用いて、表１のように調製した。加えた各ｐｃＤＮＡ−ｐ５３−ｆは０〜３０ｎｇ用い、ｐｃＤＮＡ３．１と併せて総量３０ｎｇとした。なお、ｐｈＲＧ−ＴＫは、ウミシイタケｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社、内部コントロール）を示す。トランスフェクションの方法はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のキットに添付されているプロトコールに従った。
３）ＤＮＡ溶液とＬｉｐｏ溶液を混和し、室温で３０分間インキュベーションした。
４）そのＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ複合体を１）で調製した細胞に滴下した。
５）４時間後、ＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ複合体を除去し、細胞を１ Ｘ ＰＢＳ−で洗浄した。
６）トランスフェクションしてから２４時間後、細胞を１ Ｘ ＰＢＳ−で洗浄し、Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、細胞中のホタルｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性及びウミシイタケｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性（内部コントロール）をそれぞれルミノメーターで測定した。その測定方法は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキットに添付されているプロトコールに従って行った。
７）ｐｃＤＮＡ３．１を導入した細胞抽出液中のホタルｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をウミシイタケｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性で割った値を１とした時の相対的な活性（Ｆｏｌｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を算出した。
その結果を第５図に示す。ｐ５３のＳｅｒ４６Ｐｈｅ置換体はｐ５３Ａ１Ｐ１プロモーターからの転写を野生型よりもかなり強く誘導することがわかった。
【実施例１】
この実施例では、試験例１で用意した５種の発現ベクターをヒト非小肺がん由来細胞にトランスフェクトし、その細胞抽出物を調べた。
試験は以下の手順で行った。
１）９×１０６のＨ１２９９細胞（非小肺がん由来）を１５ｃｍディッシュに蒔き、一晩培養した（１０枚）。
２）トランスフェクションするためのＤＮＡを表２のように調製した。トランスフェクションの方法はＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅのキットに添付されているプロトコールに従った。
３）そのＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅを室温で３０分間インキュベーションし、１）で調製した細胞に滴下した。
４）トランスフェクションしてから２１時間後、細胞をスクレイパーで剥がし、６００ ｘ ｇ、５分間低速遠心して細胞を回収した。
５）細胞を１度 Ｘ ＰＢＳ−で洗浄した後、１０ｍｌの表３の下記細胞溶解緩衝液で細胞を溶解した。
６）細胞を超音波破砕後、不溶性画分を１５ｋｒｐｍ、１５分間、４℃で除去した。
７）その上清を０．２ｍｌの抗ＦＬＡＧ抗体アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と一晩インキュベーションした。
８）インキュベーション後、ビーズを上記細胞溶解緩衝液で４回洗浄した。
９）その後、１．５ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチドを含む上記細胞溶解緩衝液で競合的にビーズからｐ５３タンパク質溶出した。
１０）その溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いで銀染色した。
その結果を第６図に示す。その結果、Ｓ４６Ｆ置換体ではｐ５３と一緒に分子量１７０ｋＤａのタンパク質が強く共沈澱してくる。これをマススペクトロメトリーにかけてみたところ、ＬＨＩＩＥＶＧＴＰＰＴＧＮＱＰＦＰＫ、ＩＶＬＤＮＳＶＦＳＥＨＲ、ＶＡＮＶＥＬＹＹＲ、ＱＬＰＬＶＫＰＹＬＲ、及びＶＤＫＬＤＡＳＥＳＬＲ（配列番号３〜７）のアミノ酸配列が得られた。これらは、それぞれクラスリン重鎖（配列番号２）の２２８−２４５、１０１１−１０２２、１３９８−１４０６、１４４４−１４５３、及び１６１０−１６２０位に相当する。これは、この１７０ｋＤａのタンパク質がクラスリンの重鎖であることを示す。
１１）１７０ ｋＤのタンパク質の同定には銀染色で使われた量の約２０倍のタンパク質を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでＣＢＢ染色、目的バンドの切り出し、トリプシン消化後、質量分析を用いて行った。
１２）１０）の実験手順で得られた溶出液の１００分の１容をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでＰＶＤＦ膜に転写後、抗クラスリン重鎖抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）あるいは抗ｐ５３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いたウエスタンブロッティング法を行った。ここではＡｍｅｒｓｈａｍ社のｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−抗マウスＩｇＧ二次抗体とＥＣＬキットを用いてバンドを視覚化した。
その結果を第７図に示す。Ｓ４６Ｆ置換体にクラスリン重鎖が特に強く結合することがわかった。
試験例５
この試験例では、実施例１で用いたヒト非小肺がん由来細胞の核抽出物を調べた。試験は以下の手順で行った。
１）１５ｃｍディッシュ一枚分を実施例１と同様の手順でトランスフェクションした。
２）細胞を回収後、１ｍｌの表４の低張緩衝液＊１で細胞を懸濁し、ホモジナイザーで細胞膜を破壊した。
３）それを６００ ｘ ｇ、５分間、４℃で低速遠心し、細胞質画分と核画分に分離した。
４）核画分に関しては２）、３）の操作を２回繰り返し、核画分に細胞質由来のタンパク質の持ち込みをできる限り除去した。
５）核画分を０．２ｍｌの表４の高張緩衝液＊２で懸濁し３０分間氷上に置き、核からタンパク質を溶出した。
６）１０ ｋ ｘ ｑ、５分間、４℃で核画分から不溶性画分を除去した。
７）細胞質画分と核画分由来のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ次いでＰＶＤＦ膜に転写後、抗クラスリン重鎖抗体を用いた実施例１と同様にウエスタンブロッティング法を行った。核画分は細胞質に比べ５倍量の細胞由来のタンパク質を用いた。
その結果を第８図に示す。この結果、クラスリンは細胞質でのみ働くと思われていたが、クラスリン重鎖の一部分は核内にも存在することを確認した。
【実施例２】
この実施例では、試験例４の手順のうち２）のトランスフェクションするためのＤＮＡを、試験例３で用意したｐｃ−ＣＨＣを用いて、表５のように調製した以外は、試験例４と同様の試験を行った。
その結果を第９図に示す。上記ＤＮＡ溶液において、ｐｃ−ＣＨＣ（４００ｎｇ）を用いたものをＣｌａｔｈｒｉｎ＋、ｐｃＤＮＡ３．１（４００ｎｇ）を用いたものをＣｌａｔｈｒｉｎ−と表記する。
クラスリン重鎖のｃＤＮＡを発現ベクターに入れてｐ５３と共にトランスフェクトすると、ｐ５３Ａ１Ｐ１プロモーターからの転写能を高めたことが認められた。特に、Ｓ４６Ｆ置換体では強く高められた。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ５３又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異ｐ５３、及びクラスリン重鎖から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子。
【請求項２】
前記変異ｐ５３が、少なくとも４６位のＳｅｒが置換されたｐ５３である請求項１又に記載の転写因子。
【請求項３】
前記変異ｐ５３が、その４６位のＳｅｒがＰｈｅに置換されている請求項２に記載の転写因子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の転写因子を有効成分とする癌の治療薬。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の転写因子又はクラスリン重鎖を癌細胞に注入することから成る癌治療法。
【請求項１】
ｐ５３又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異ｐ５３、及びクラスリン重鎖から成る、癌細胞のアポトーシスを誘導する転写因子。
【請求項２】
前記変異ｐ５３が、少なくとも４６位のＳｅｒが置換されたｐ５３である請求項１又に記載の転写因子。
【請求項３】
前記変異ｐ５３が、その４６位のＳｅｒがＰｈｅに置換されている請求項２に記載の転写因子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の転写因子を有効成分とする癌の治療薬。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の転写因子又はクラスリン重鎖を癌細胞に注入することから成る癌治療法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７６４８３
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２９１２（Ｐ２００５−５０２９１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２２３８
【国際出願日】平成１６年２月２５日（２００４．２．２５）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２２３８
【国際出願日】平成１６年２月２５日（２００４．２．２５）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
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