癌転移能評価方法及び癌転移能評価のための三次元二重膜構造
【課題】in vitroにおける正常細胞の介在するより生体に近似した癌転移能評価方法の提供。
【解決手段】（手順１）癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーの膜下面に線維芽細胞を貼り付け膜上面に血管内皮細胞を播種し、膜下面に線維芽細胞のシートと膜上面に血管内皮細胞のシートを作製する、（手順２）膜上面の血管内皮細胞のシート上に癌細胞を播種し、培養プレートの中に配置した癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーに上方から手順１で得た第1のチャンバーを配置し、間隔を置いて重層した状態で培養液中培養する、（手順３）重層した第１のチャンバーを取り出し、残った癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーの膜の上に電気抵抗を有する細胞を所定数播種する、（手順４）第２のチャンバーを培養し、（手順５）第２のチャンバーの電気抵抗値を電気抵抗測定器で測定する癌転移能評価方法。
【解決手段】（手順１）癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーの膜下面に線維芽細胞を貼り付け膜上面に血管内皮細胞を播種し、膜下面に線維芽細胞のシートと膜上面に血管内皮細胞のシートを作製する、（手順２）膜上面の血管内皮細胞のシート上に癌細胞を播種し、培養プレートの中に配置した癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーに上方から手順１で得た第1のチャンバーを配置し、間隔を置いて重層した状態で培養液中培養する、（手順３）重層した第１のチャンバーを取り出し、残った癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーの膜の上に電気抵抗を有する細胞を所定数播種する、（手順４）第２のチャンバーを培養し、（手順５）第２のチャンバーの電気抵抗値を電気抵抗測定器で測定する癌転移能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌転移能評価方法に関する。また、本発明は癌転移能評価のための三次元二重膜構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の早期発見や新規抗癌剤の開発により、生存率の改善が少しずつ認められはじめた癌種も有る。しかし、大部分の固形癌は人類にとっていまだ難解な病気である。その大きな原因は手術で完全摘出されても、予防医学とは無縁の病態メカニズムで、再発・転移を起す。この忌まわしい転移巣に対し、化学療法、放射線療法、免疫療法、分子標的療法を試みるも、癌死する症例が後を絶たない。この癌の転移防止と対策のためには、生体に近似したin vitro系の転移実験モデルは有力な武器となる。
【０００３】
癌の転移形成は、癌細胞の原発巣から離脱および周辺組織への浸潤、脈管内への進入、移動、遠隔組織の微小血管への着床、脈管外への脱出および転移部位での増殖などの複雑な過程を経て成立している。
【非特許文献１】斉木育夫.,1995 :癌転移の分子機構と治療への応用.Molecular Medicine,32(4).372-379
【非特許文献２】村田 純.,1995 :細胞運動促進因子と癌転移. Molecular Medicine,32(4).392-397
【０００４】
このため、転移過程における正常細胞である宿主細胞の役割は原発巣での癌浸潤過程より複雑に関与し、転移メカニズムを解明するには、この正常細胞を除外して転移を語れないと指摘されている。
【非特許文献４】Brooks PC.,1996 :Cell adhesion molecules in angiogenesis.Can.Met.Rev,15.189-194
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の経過より、癌転移、特に遠隔転移モデルは複数の正常細胞の介在を除外しては成り立たたないものと理解される。そのため、in vivoによる動物での転移能研究が主流であり、
【０００６】
In vivoによる転移能研究には、ラットやマウスへの皮下移植、腹腔内移植、脾臓内注入、尾静脈などからの侵襲的癌細胞移入などがおこなわれている。また、その都度、屠殺するため経時的経過観察は困難である。
【非特許文献５】Lue JY et al.,2003 :Establishment of red fluorescent protein-tagged HeLa tumor metastasis models:Determination of DsRed2 insertion effects and comparison of metastatic patterns after subcutaneous,intraperitoneal,or intravenous injection. Clin Exp Metastasis,20.121-133
【０００７】
臨床における転移巣のComputed Tomography（CT）画像は多くの転移巣で円形陰影を呈し、動物実験における尾静脈からの移入による肺転移巣は肺内転移コロニーとして算出され評価される。
【非特許文献１】斉木育夫.,1995 :. 癌転移の分子機構と治療への応用. Molecular Medicine,32(4).372-379
【０００８】
したがって、本発明の第１の目的は実験に動物を使用しないin vitroにおける正常細胞の介在する、より生体に近似した癌転移能評価方法を提供することであり、また、本発明の第２の目的はin vitroにおける癌転移能評価方法のためのモデルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記第１の目的を達成するため、請求項１に記載の本発明に係る癌転移能評価方法、すなわち、（手順１） 癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーの膜下面に線維芽細胞を貼り付け、その後に、当該膜上面に血管内皮細胞を播種し、当該膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに当該膜上面に血管内皮細胞のシートを作製すること、
（手順２）次に、当該膜上面の血管内皮細胞のシート上に所定の細胞数の癌細胞を播種し、その後に、培養プレートの中に配置した、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーに、上方から、手順１で得た第１のチャンバーを挿入配置し、間隔を置いて重層した状態で所定時間静置培養すること、
（手順３）その後、重層した第１のチャンバーを取り出し、残った、癌細胞が通ることができない細孔膜第２のチャンバーの当該膜上に電気抵抗を有する細胞を所定数播種すること、
（手順４）その後、手順３で得た、当該第２のチャンバーを一定期間静置培養すること、
（手順５）続いて、手順４で得た、当該第２のチャンバーの電気抵抗（Transepithelial electrical resistance：TEERと略）値を電気抵抗測定器で測定すること、を順次行うことを特徴とする癌転移能評価方法によって、達成される。
本明細書において、「癌細胞が通ることができる細孔膜」の細孔の寸法は、癌細胞の種類によって異なるが、5.0〜12.0マイクロメーターである。すなわち、癌細胞によって、その細胞の寸法や変形能が異なるため、当該細孔寸法は異なる。また、「癌細胞が通ることができない細孔膜」の細孔の寸法は、おおよそ4.0マイクロメーター以下であり、好ましくは0.4マイクロメーター前後である。
【００１０】
上記第２の目的は、請求項２に記載の本発明に係る癌転移能評価方法のための三次元二重膜構造、すなわち、細孔を有する膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに、膜上面に血管内皮細胞のシートを作製した後に、当該血管内皮細胞のシートの上に、所定細胞数の癌細胞を播種した、癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーと、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーと、培養液を収納した培養プレートと、を含み、 当該培養プレートの中に当該第２のチャンバーを配置し、この当該第２のチャンバーの中に、上方から、当該第１のチャンバーを間隔を置いて重層配置して、また、培養プレートを第２のチャンバーとの間に間隔を置く、癌転移能評価のための三次元二重膜構造によって達成される。
本明細書において、第１のチャンバーの細孔膜と第２のチャンバーの細孔膜との間隔はおよそ0.8〜1.2ミリメーターであり、第２のチャンバーの細孔膜と培養プレートとの間隔は0.8〜1.2ミリメーターである。
【発明の効果】
【００１１】
In vitroの系において、癌細胞が三次元構築した血管内皮細胞や他の正常細胞の細胞接着間を開離または崩壊、移動し、この癌細胞の増殖活性を評価できる本発明に係るin vitroモデルによると、遠隔転移の予測は当然ながら、実験の便宜性、動物愛護、経済的効果の問題以外にも、in vivoで難解な基礎研究や経時的研究が容易に可能となる。このことは、さらに遠隔転移の生物学的機構解明や転移予防の臨床治療へと迅速に進展していくものと期待される。
【００１２】
本発明に係る癌移転評価方法によると、評価時間を大幅に短縮することができる。そのため、新薬開発において、動物実験の前に行なう大量・短時間の実験による評価として、本発明に係る癌転移評価方法や二重膜構造は利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について、添付図面を参照して詳細に説明する。
【００１４】
１．材料と方法
［細胞株と培養］
本実験に使用した細胞株は、正常細胞由来の細胞株として、ラット血管内皮細胞であるGP8、マウス線維芽細胞であるNIH3T3、電気抵抗を有するイヌ腎上皮細胞由来であるMDCKの３細胞株である。癌細胞由来の細胞株としては、SW480（ヒト大腸癌由来）、SW620（ヒト大腸癌由来）の２細胞株である。癌細胞株であるHeLa（ヒト子宮頚癌由来）は陽性コントロールとして採用した。計6種類の細胞株を利用した。
【００１５】
今回のin vitro転移実験に使用した２種類の癌細胞株は、同一患者の異なる部位から樹立された大腸癌細胞株を選択した。つまり、SW480は大腸癌の原発巣より樹立された癌細胞株で、SW620は同一患者のリンパ節転移巣より樹立された癌細胞株である。SW480は低転移細胞株、SW620は高転移細胞株である。
【非特許文献６】Hewitt RE et al.,2000 :Validation of a model of colon cancer progression.J Pathol,192.446-454
【００１６】
本実験における総ての細胞株の継代培養ならびに実験培地はDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEMと略: Sigma（商標）)に10%胎児牛血清(FBSと略: GIBCO（商標）)を添加した培養液（培地）を使用し、37℃の5%CO2インキュベータ内にて、25cm2 細胞培養フラスコ(Cornig社製)で継代培養した。GP8においてはG418 300μg/mlを培地に添加し継代培養した。培地交換は3日目にリン酸緩衝生理食塩水(PBSと略)で洗浄後、0.05%トリプシン-EDTA(GIBCO（商標）)で細胞を剥離し継代培養した。細胞数の調整は0.05%トリプシン-EDTAで細胞単離後、単個細胞になるように振盪、トリパンブルー染色による血球計算盤で生細胞数を計出した（トリパンブルー排出試験）。マイコプラズマ感染は不感染であることを確認し、実験に供した。
【００１７】
［材料］
三次元二重膜構造チャンバーのモデル作成は、12 穴培養プレート内に、2個の細孔膜円筒型チャンバーが組み合わされるように工夫した。今回使用した実験材料を紹介する。
【００１８】
図１は、本実施例で用いられるTranswell(登録商標) 3422チャンバーと3460チャンバーの写真である。3422チャンバーはポリカーボネイト 膜（白色を呈す）で8.0マイクロメーターの 細孔径を有する（図１の上部、左部）。3460チャンバーはポリエステル 膜（白色を呈す）で0.4マイクロメーターの 細孔径を有する（図１の上部、右部）。3422チャンバーは写真のごとく3460チャンバー内に的確に重層して挿入可能である（図１の下部）。
【００１９】
その作製のための2種類のチャンバーは、（１）直径6.5ミリメーター で8.0マイクロメーター の細孔径の膜(ポリカーボネイト膜)を有するTranswell 3422(登録商標)insert（Corning社製)のチャンバーと（２）直径12.0ミリメーターで0.4マイクロメーター の細孔径の膜(ポリエステル膜)を有するTranswell(登録商標)insert 3460(Corning社製)のチャンバーを使用した。3422チャンバーは24穴培養プレートに納められており、3460チャンバーは12 穴培養プレートに納められている。3422チャンバーは12 穴培養プレート内の3460チャンバー内に重層し的確に納まった。3422チャンバーを3460チャンバーの上に重ね合わせる時、両者の膜間隔は約1.0ミリメーターであった。また、3460チャンバー膜と12穴培養プレート底面までの間隔は1.0ミリメーターであった。3422チャンバーは本発明における「第1のチャンバー」の実施例であり、3460チャンバーは本発明における「第2のチャンバー」の実施例であり、12穴培養プレートは本発明における「培養プレート」の実施例である。
【００２０】
図2は本実施例で用いられる三次元二膜構造チャンバーモデルによる構造を示す概略図である。本実施例における3422チャンバー（第１のチャンバー１）を3460チャンバー（第２のチャンバー２）の上に重ね合わせたものを12穴培養プレート（培養プレート３）の中に収納した状態を示す概略断面図である。
【００２１】
100ミリメーター細胞培養皿(Falkon社製)は3422チャンバー１ｃの膜下面に細胞を貼り付け操作時、さらに、35ミリメーター 細胞培養皿(Falcon社製)は顕微鏡による形態観察の時に使用した。
【００２２】
他種類の細胞が介在（共存）する培養時の細胞コロニー同定のための蛍光染色液は、生細胞で染色でき、毒性の低いRhodamine123(Sigma（商標）)をDMEM+10%FBSで溶解して使用した。倒立顕微鏡はOlympus CK 40(オリンパス社製)を使用し、Olympus U-RFLT 50（オリンパス社製）にて蛍光励起を行い、細胞コロニーを観察した。写真はOlympus PM10SP（オリンパス社製）で撮影した。
【００２３】
TEER値測定はRecorder OutputのEVOM(商標)（World Precision Instruments社製)とENDOHM-12（World Precision Instruments社製)を使用した。TEER値の単位はΩ・cm2である。測定方法はマニュアルに従った。図3は本実施例で用いられる電気抵抗測定器の構造を示す概略図である。
【００２４】
［方法］
基礎実験1、2では1試料（ n = 1 ）とし、基礎実験3、本発明の実験は3試料（ n = 3 ）で行った。
【００２５】
１）基礎実験1（Rhodamine123排出時間）
MDCKの介在する培養下における癌細胞同定のために、前記００１４欄の6種類の細胞を35ミリメーター細胞培養皿に培養し、蛍光色素であるRhodamine123の完全に消退する時間を検討した。方法は、培養液にRhodamine123を滴下して、暗所にて30分間細胞培養・染色、30分後に、この検体をPBSで2回洗浄し、Rhodamine123を除去、新しい培地に交換、経時的に24時間まで蛍光顕微鏡で観察を行った。蛍光が蛍光顕微鏡で完全に見えなくなる時間を各細胞のRhodamine123排出時間とした。
【００２６】
２）基礎実験２（MDCKの癌細胞コロニー形成に与える影響）
癌細胞はMDCK介在下に存在することになる。そこで、MDCKの癌細胞コロニー形成にあたえる影響を検討した。MDCKと癌細胞HeLaを35ミリメーター細胞培養皿内で検討した。
【００２７】
当該培養皿へ、HeLaを1×104、5×103、1×103、5×102、1×102個播種した検体(HeLa 単独例)、24時間後に上記細胞数のHeLa存在下の細胞培養皿内へMDCKを播種した検体(HeLa+MDCK例)の2種類を作成し、培養7日目にRhodamine123染色を行い、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡にて形態観察し、比較した。
【００２８】
３）基礎実験3（NIH3T3、GP8がMDCKのTEER値に及ぼす影響）
3422チャンバーの膜下面１ｃと上面１ｂに敷き込むNIH3T3とGP8の細胞動態（行動）と電気抵抗を有するMDCKとの関係を検討した。
【００２９】
まず、3422チャンバー上面１ｂに1×105個のNIH3T3もしくはGP8を播種し、このチャンバーを12穴培養プレート（培養プレート３）の3460チャンバー内に重層し、2日後3422チャンバーを除去し、残った3460チャンバーの膜上面２ｂにMDCKを2×105個播種、7日間静置培養した。その間、培養液の交換は２回行った。MDCK播種後7日目に3460チャンバーのTEER値を測定し、Rhodamine123染色によるMDCK介在下のNIH3T3とGP8の細胞行動を観察した。
【００３０】
４）本発明の実験（三次元二重膜構造チャンバーモデルにおけるTEER値の変化と癌細胞コロニー観察）
図４Ａ，Ｂは本発明に係る今回の実験をモデルとした癌転移能評価方法の実施例手順を示す概略図である。また、本発明に係る三次元二重膜構造チャンバー構造の作成手順を示す概略図である。手順１から手順7は実験の経時的順序を示す。手順7の後に、3460チャンバーを取り出し、この3460チャンバーの電気抵抗を測定、評価をおこなった。また、癌細胞コロニーの観察を行った。
【００３１】
手順１
24穴培養プレートから3422チャンバーを取り出し、当該チャンバーを100ミリメーター細胞培養皿上に反転して置き、上になった3422チャンバー膜下面にNIH3T3を滴下（1×105個：50マイクロリットル）、4時間培養することで3422チャンバー膜下面にNIH3T3を貼り付けた。
【００３２】
手順２
この3422チャンバーを培養液の入った24穴培養プレートへ元のように戻し、24時間静置培養。次に、この3422チャンバーの膜上面にGP8を播種（2×10 5個：100マイクロリットル）した。
【００３３】
手順３
72時間静置培養後、3422チャンバーの膜を上下に挟み込ように、細胞が密着した状態のNIH3T3シート（膜下面）とGP8シート（膜上面）を作製した。
【００３４】
手順４
この24穴培養プレートにある3422チャンバー内上面に、調整した細胞数の癌細胞を播種した。
【００３５】
手順５
その直後、培養液の入った12穴培養プレート内にある3460チャンバー内に3422チャンバーを移し替え挿入することで、２つのチャンバーを重層した。
重層した状態で48時間静置培養した。
【００３６】
手順６
その後、3422チャンバーを3460チャンバーより除去し、残った3460チャンバーの膜上面に電気抵抗を有するMDCKを2×105個播種、培養液を追加した。
【００３７】
手順７
MDCKの細胞密着状態作製（ＭＤＣＫシート）と癌細胞コロニー形成のため、7日間静置培養した。その間、3460チャンバー内の培養液の1/2交換を２回行った。
【００３８】
この7日目に、3460チャンバーのTEER値を、図３に示す電気抵抗測定器を使用し、測定した。さらに、Rhodamine123染色による癌細胞コロニーの観察を行った。
【００３９】
［統計処理］
統計解析ソフトはStat.View Ver.4.0を使用し、統計処理はt検定で行った。統計学的有意差はP<0.05とした。
【００４０】
［結果］
・ 基礎実験1（Rhodamine123排出時間）
【表１】
表1は、基礎実験１で使用した6種類００１４欄の細胞株のRhodamine123蛍光色素排出時間を示す。縦は細胞株の種類、横は時間（ h ）の推移である（○：蛍光顕微鏡で細胞内に蛍光染色の確認ができた時間、×：蛍光顕微鏡で細胞内に蛍光染色の確認できなくなった時間を意味する）。
【００４１】
この結果より、MDCKの介在下における癌細胞コロニーの同定には、MDCKのRhodamine123蛍光が3時間以上経過した時点で完全に消失することより、癌細胞コロニーの蛍光観察ができることを明かとした。そのため、以後の癌細胞コロニー観察はRhodamine123染色除去より3〜４時間目とした。
【００４２】
2）基礎実験２（MDCKの癌細胞コロニー形成に与える影響）
癌細胞HeLa単独例とHeLa+MDCK例の10個以上で構成されるHeLaの癌細胞コロニー数は、それぞれ、1×104個播種で941個と1099個、5×103個播種で303個と366個、1×103個播種では76個と56個、5×102個播種では14個と10個であった。HeLa単独例の1×104個を播種した検体では癌細胞コロニーのお互いの癒合（重なり合い）が認められたが、MDCKを介在させたHeLa+MDCK例では癌細胞コロニー間の癒合は認められなかった。
【００４３】
以上の結果より、HeLaの癌細胞コロニー形成はMDCKの介在によって、コロニー形成数に影響されないこと、ならびにMDCKの介在によりHeLaのコロニーが癒合せず、明らかな癌細胞コロニー数の算出できることが判明した。
【００４４】
３）基礎実験3（NIH3T3、GP8がMDCKのTEER値に及ぼす影響）
電気抵抗を有するMDCKのみの検体と3422チャンバーより落下したNIH3T3介在のMDCK検体には、両検体の3460チャンバーにおけるTEER値に差を認めなかった。 同様の操作をGP8で行った。GP8は3422チャンバーから、落下し、MDCKの介在下で、Rhodamine123染色コロニーを形成した。ただし、コロニーは小さな構成細胞コロニーと樹枝状形態（コロニーを形成していない細胞群）であった。このことは、GP8は3460チャンバーのMDCKのTEER値に影響を及ぼした。
【００４５】
この結果より、GP8では3422チャンバーの8.0マイクロメーターの細孔径を通過するため、3460チャンバーへの進入を阻止する工夫が必要と考えられた。CP8を3422チャンバー膜上面に播種する前に、3422チャンバーの膜下面にNIH3T3を敷き込むことで、MDCKのTEER値は7540±319.1Ω・cm2（平均値±SE）を示した。3422チャンバーにいずれの細胞（NIH3T3、GP8）も播種しない時のMDCKのTEER値は7679±180.3Ω・cm2であり、上記と差を認めなかった。この結果はGP8の膜下面への移動をNIH3T3で阻止でき、GP8のMDCKに対する影響は解決した。
【００４６】
4）本発明の実験（三次元二重膜構造チャンバーモデルにおけるTEER値の変化と癌細胞コロニー観察）
NIH3T3、GP8、MDCKの正常細胞由来の細胞が存在する三次元二重膜構造チャンバーのモデルを使用して、2.5×105個の癌細胞による、電気抵抗を有すMDCK介在3460チャンバーのTEER値変化と癌細胞コロニー観察を行った。
【００４７】
3422チャンバーにNIH3T3シート（膜下面）とGP8シート（膜上面）を作製した後に、3422チャンバーに癌細胞を播種しなかった3460チャンバー（コントロール検体（白抜き星マーク））におけるMDCKのTEER値は7540±319.1Ω・cm2（平均値±SE）であった。3422チャンバーにいずれの細胞(NIH3T3、GP8)も存在しない状態での3460チャンバーにおけるMDCKのTEER値は7679±180.3Ω・cm2であり、コントロール検体（白抜き星マーク）と大差なかった。一方、NIH3T3とGP8の存在する3422チャンバーに癌細胞を播種した検体を測定すると、HeLa播種のMDCK 介在チャンバー(MDCK＋HeLa検体)では3507±1001Ω・cm2、SW480播種のMDCK介在チャンバー(MDCK＋SW480検体)では7643±602.0Ω・cm2、SW620播種のMDCK介在チャンバー(MDCK＋SW620検体)では4417±649.5Ω・cm2であった。コントロール検体とMDCK＋HeLa検体ならびにMDCK＋SW620検体との間に、P<0.05の統計学的有意差を認めた。なお、MDCK＋SW480検体とMDCK＋SW620検体の間にも統計学的有意差を認め、高転移細胞株であるSW620は、低転移細胞株であるSW480より、有意にMDCKのTEERの低値を示した（図５）。
【表２】
表2は、図５と同様の実験内容であるが、本発明モデルに使用した各々3試料の実験結果を詳細に示したものである。各癌細胞株による、MDCKのTEER値に与える影響と癌細胞コロニー形成の一覧表を示している。電気抵抗の測定は図３に示すごとく行った。癌細胞コロニーの数はRhodamine123染色除去後の3〜４時間目に蛍光顕微鏡で観察し算出した。（表２のコントロールは図５のコントロール（白抜き星マーク）と同じ条件である。ＴＥＥＲは電気抵抗値で、単位はΩ・cm2：コロニー細胞数は１つの癌細胞コロニーのコロニー構成細胞数２０〜４９個，５０個以上で2つに分け、その個数で表示している）。
【００４８】
MDCK介在3460チャンバー上で、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡で癌細胞コロニーを観察した。光顕顕微鏡では、MDCKの介在により癌細胞コロニーと紛らわしいMDCKの細胞塊（図６：赤矢印）が存在したが、Rhodamine123染色での蛍光顕微鏡では、明らかな癌細胞コロニーを捕らえることができた（図６：白矢印）。観察の結果は、HeLaとSW480癌細胞コロニーの細胞凝集はやや粗であり、HeLaにおいては50個以上構成コロニーと20個以上構成コロニーが認められ、SW480では50個以上構成コロニーは無く、20個以上構成コロニーも少なかった。一方、SW620癌細胞コロニーの細胞凝集は比較的密であり、50個以上構成コロニーはほとんど無く、20個以上構成コロニーが多数認められた（図６）。この観察結果は、高転移細胞株であるSW620が、低転移細胞株であるSW480より、有意にMDCKのTEERの低値を示した結果と矛盾するものではなかった。
【００４９】
［考察］
遠隔転移は、癌細胞が原発巣で増殖浸潤、脈管侵襲して、その後も非常に複雑な過程を経て、転移巣（コロニー）形成へと成立していくと言われている。
【非特許文献１】斉木育夫.,1995 :癌転移の分子機構と治療への応用.Molecular Medicine,32(4).372-379
【００５０】
しかし、細胞レベルより癌細胞動態を考えると、浸潤（進入）能、移動（運動）能、増殖（適応）能が備わっていることが遠隔転移の必要条件となる。また、正常細胞による転移防止を考えると、癌細胞は正常細胞と基質の接着ならびに正常細胞と正常細胞の細胞間接着をいかに開離または崩壊して乗り越え、異なる組織環境において転移巣（コロニー）を形成するかである。発明者らはこの遠隔転移の後期過程である血管内再侵入と組織適応（増殖）に着目して、正常細胞由来の3細胞株(血管内皮細胞、線維芽細胞、電気抵抗を有するMDCK)が介在する2種類(8.0マイクロメーター細孔膜円筒型、 0.4マイクロメーター細孔膜円筒型)の細孔膜円筒型チャンバーを利用することで、in vitroによる遠隔転移モデルである三次元二重膜構造チャンバーモデルを発明した。本実験の対象となる転移モデルは、遠隔転移メカニズムの後期過程（毛細血管内皮への接着、血管外脱失、標的器官内組織での転移コロニー形成）の評価モデルと理解される。
【００５１】
MDCKと悪性細胞（癌細胞等）の共存（介在）培養における、MDCKのTEER値測定による電気抵抗減弱アッセイ（Electrical Resistance Breakdown Assay）はLudwigらにより既に考案されている。
【非特許文献９】Ludwig T et al.,2002 :The electrical resistance breakdown assay determines the role of proteinases in tumor cell invasion.Am J Physiol Renal Physiol,283.319-327
【非特許文献１０】Ludwig T et al.,2004 :Platinum complex cytotoxicity tested by the electrical resistance breakdown assay. Cell Physio Biochem,14.425-430
【非特許文献１１】Ludwig T et al.,2005 :Functional measurement of local proteolytic activity in living cells of invasive and non-invasive tumors. J Cell Physiol,202.690-697
【００５２】
彼らは1種類の細孔膜円筒型チャンバー(0.4マイクロメーターの 細孔径)の膜上面または下面にMDCKシートを作成し、膜上面に悪性細胞を播種することで、悪性細胞の悪性度ならびに抗癌剤感受性を、MDCKのTEER値の変動で評価しようとする試みが成されている。この実験系は癌細胞より分泌されるMatrix Metalloproteinases(MMPs)によるMDCKのTEER値変動から悪性度を評価するもので、転移能モデルではなく浸潤能モデルと理解される。
【非特許文献１１】Ludwig T et al.,2005 :Functional measurement of local proteolytic activity in living cells of invasive and non-invasive tumors. J Cell Physiol,202.690-697
【００５３】
発明者らのモデルは癌細胞が正常細胞間の接着を開離または崩壊し、さらに8.0マイクロメーターの細孔径を有する膜を移動し、さらに膜下面より遊離して、次の異なる正常細胞であるMDCKの存在する環境下でコロニーとして増殖することで、MDCKのTEER値を低下させる客観的評価モデルであり、Ludwigらの実験系とは明らかに異なる。
【００５４】
本モデルの構造上の特徴は正常細胞由来の細胞株の細胞選択と配置の理論といえる。今回使用した実験検体を例にして要約すると、
（１）ラット血管内皮由来細胞（GP8）：3422チャンバーの膜上面にシート状になるように配置した。これは癌細胞が血管内皮細胞と接着・再進入する転移後期過程を実験の初期段階とするためである。
（２）マウス線維芽由来細胞（NIH3T3）：3422チャンバーの下面に貼り付けた。その理由は癌細胞と血管内皮細胞の飼育層（Feeder layer）としての意義があり、
【非特許文献１２】Nishinakamura R et al.,2006 :Essential roles of Sall family genes in kidney development. J Physiol Sci, 56(2).131-136
【非特許文献１３】Gregoire L et al.,1998 :Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis.In vitro Cell Dev Biol Anim, 34(8). 636-639血管内皮細胞（GP8）が下面に移動するのを阻止する目的でもある。なお、転移好発部位である肺、肝臓、骨には線維芽細胞が存在している事実である。（３）イヌ腎上皮由来細胞(MDCK)：3460チャンバーの上面に敷いた。このMDCKは細胞間のタイトジャンクションが強く、安定した高い、電気抵抗であるTEER値を測定することができるためである。
【非特許文献９】Ludwig T et al.,2002 :The electrical resistance breakdown assay determines the role of proteinases in tumor cell invasion.Am J Physiol Renal Physiol,283.319-327さらに、癌細胞と異なる細胞であることより、MDCKの存在によりin vivoで認められる転移巣に類似したコロニー形成を期待したためである。また、MDCKの存在により正常細胞由来NIH3T3の増殖抑制が加わり(細胞・細胞接触抑制(Cell-Cell Contact Inhibition)による)、MDCKの電気抵抗値に影響を与えなかったことである。以上から、より生理的な三次元構造をもった後期転移過程の新規評価モデルを作成できた。
【００５５】
癌細胞株の選択に関して、HeLaを陽性コントロールとした理由は、コロニー形成能が認められる以外に、
【非特許文献５】Lue JY et al.,2003 :Establishment of red fluorescent protein-tagged HeLa tumor metastasis models:Determination of DsRed2 insertion effects and comparison of metastatic patterns after subcutaneous,intraperitoneal,or intravenous injection. Clin Exp Metastasis,20.121-133発明者らと同様に、Transwell（登録商標）の8.0マイクロメーター の細孔径膜を有するチャンバーを使用して、HeLaの遊走能が確認されているからである。
【非特許文献１４】Zhang L et al.,2007 :Effect of matrine on HeLa cell adhesion and migration. Euro J Pharmaco,563.69-76
【００５６】
なお、Transwellの0.4マイクロメーターの細孔径膜 チャンバー上において、MDCKとHeLaの共存培養がMDCKのTEER値を低下させる事実である。
【非特許文献１１】Ludwig T et al.,2005 :Functional measurement of local proteolytic activity in living cells of invasive and non-invasive tumors. J Cell Physiol,202.690-697
【００５７】
転移評価の実験検体として選択したSW480とSW680は、同一患者から樹立された貴重な原発巣と転移巣からの癌細胞株であり、両者は臨床でも明らかに悪性度が異なる。なお、in vivoの動物実験においても、低転移細胞株SW480はいずれの部位にも転移を認めず、高転移細胞株SW620は肝転移を認めた報告があるため、今回の実験に使用した。今回の実験結果では高転移細胞株SW620が低転移細胞株SW480よりもMDCKのTEER値を低下させた。
【非特許文献６】Hewitt RE et al.,2000 :Validation of a model of colon cancer progression.J Pathol,192.446-454
【００５８】
コロニー形成能のみの評価であれば、正常細胞である宿主細胞の介在しない軟寒天内コロニー形成法で十分であるが、
【非特許文献１６】Zhang RD et al.,1991 :Malignant potential of cells isolated from lymph node or brain metastasis of melanoma patients and implications for prognosis. Cancer Res, 51(8). 2029-2035転移モデルには宿主細胞の介在が要求される。本法は癌細胞にとって生物学的に障害物となる血管内皮細胞と線維芽細胞の細胞間接着を開離または崩壊し、チャンバーの細孔膜下面より落下した遊離癌細胞のコロニー形成能をMDCKのTEER値で客観的に評価するもので、従来の転移モデル(Nakayama et al 1998)より、生体に近似した三次元構造を呈しているといえる。
【非特許文献１７】Nakayama Y et al.,1998 :Alterative express of the collagenase and adhesion molecules in the highly metastatic clones of human colonic cancer cell lines. Clin Exp Metastasis,16(5).461-469
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本実施例で用いられるTranswell(登録商標) 3422チャンバーと3460チャンバーの写真である。
【図２】本実施例で用いられる三次元二膜構造チャンバーの構造を示す概略図である。
【図３】本実施例で用いられる電気抵抗測定器の構造を示す概略図である。
【図４Ａ】本発明に係る癌転移能評価方法の実施例手順を示す概略図である。
【図４Ｂ】本発明に係る癌転移能評価方法の実施例手順を示す概略図である。
【図５】本実施例における各種癌細胞株の電気抵抗（TEER）値に与える影響と癌転移評価を示すグラフである。
【図６】本実施例での、MDCK介在の各癌細胞培養下における、各癌細胞コロニーの同定を示す写真である。光学顕微鏡（左図）と蛍光顕微鏡（右図）の写真である（×１００）。
【符号の説明】
【００６０】
１ 第１のチャンバー
１ａ 細孔膜
１ｂ 膜上面
１ｃ 膜下面
２ 第２のチャンバー
２ａ 細孔膜
２ｂ 膜上面
２ｃ 膜下面
３ 培養プレート
４ 培養液
５ 電極
６ 電極
７ 電線コード
８ 電線コード
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌転移能評価方法に関する。また、本発明は癌転移能評価のための三次元二重膜構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の早期発見や新規抗癌剤の開発により、生存率の改善が少しずつ認められはじめた癌種も有る。しかし、大部分の固形癌は人類にとっていまだ難解な病気である。その大きな原因は手術で完全摘出されても、予防医学とは無縁の病態メカニズムで、再発・転移を起す。この忌まわしい転移巣に対し、化学療法、放射線療法、免疫療法、分子標的療法を試みるも、癌死する症例が後を絶たない。この癌の転移防止と対策のためには、生体に近似したin vitro系の転移実験モデルは有力な武器となる。
【０００３】
癌の転移形成は、癌細胞の原発巣から離脱および周辺組織への浸潤、脈管内への進入、移動、遠隔組織の微小血管への着床、脈管外への脱出および転移部位での増殖などの複雑な過程を経て成立している。
【非特許文献１】斉木育夫.,1995 :癌転移の分子機構と治療への応用.Molecular Medicine,32(4).372-379
【非特許文献２】村田 純.,1995 :細胞運動促進因子と癌転移. Molecular Medicine,32(4).392-397
【０００４】
このため、転移過程における正常細胞である宿主細胞の役割は原発巣での癌浸潤過程より複雑に関与し、転移メカニズムを解明するには、この正常細胞を除外して転移を語れないと指摘されている。
【非特許文献４】Brooks PC.,1996 :Cell adhesion molecules in angiogenesis.Can.Met.Rev,15.189-194
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の経過より、癌転移、特に遠隔転移モデルは複数の正常細胞の介在を除外しては成り立たたないものと理解される。そのため、in vivoによる動物での転移能研究が主流であり、
【０００６】
In vivoによる転移能研究には、ラットやマウスへの皮下移植、腹腔内移植、脾臓内注入、尾静脈などからの侵襲的癌細胞移入などがおこなわれている。また、その都度、屠殺するため経時的経過観察は困難である。
【非特許文献５】Lue JY et al.,2003 :Establishment of red fluorescent protein-tagged HeLa tumor metastasis models:Determination of DsRed2 insertion effects and comparison of metastatic patterns after subcutaneous,intraperitoneal,or intravenous injection. Clin Exp Metastasis,20.121-133
【０００７】
臨床における転移巣のComputed Tomography（CT）画像は多くの転移巣で円形陰影を呈し、動物実験における尾静脈からの移入による肺転移巣は肺内転移コロニーとして算出され評価される。
【非特許文献１】斉木育夫.,1995 :. 癌転移の分子機構と治療への応用. Molecular Medicine,32(4).372-379
【０００８】
したがって、本発明の第１の目的は実験に動物を使用しないin vitroにおける正常細胞の介在する、より生体に近似した癌転移能評価方法を提供することであり、また、本発明の第２の目的はin vitroにおける癌転移能評価方法のためのモデルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記第１の目的を達成するため、請求項１に記載の本発明に係る癌転移能評価方法、すなわち、（手順１） 癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーの膜下面に線維芽細胞を貼り付け、その後に、当該膜上面に血管内皮細胞を播種し、当該膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに当該膜上面に血管内皮細胞のシートを作製すること、
（手順２）次に、当該膜上面の血管内皮細胞のシート上に所定の細胞数の癌細胞を播種し、その後に、培養プレートの中に配置した、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーに、上方から、手順１で得た第１のチャンバーを挿入配置し、間隔を置いて重層した状態で所定時間静置培養すること、
（手順３）その後、重層した第１のチャンバーを取り出し、残った、癌細胞が通ることができない細孔膜第２のチャンバーの当該膜上に電気抵抗を有する細胞を所定数播種すること、
（手順４）その後、手順３で得た、当該第２のチャンバーを一定期間静置培養すること、
（手順５）続いて、手順４で得た、当該第２のチャンバーの電気抵抗（Transepithelial electrical resistance：TEERと略）値を電気抵抗測定器で測定すること、を順次行うことを特徴とする癌転移能評価方法によって、達成される。
本明細書において、「癌細胞が通ることができる細孔膜」の細孔の寸法は、癌細胞の種類によって異なるが、5.0〜12.0マイクロメーターである。すなわち、癌細胞によって、その細胞の寸法や変形能が異なるため、当該細孔寸法は異なる。また、「癌細胞が通ることができない細孔膜」の細孔の寸法は、おおよそ4.0マイクロメーター以下であり、好ましくは0.4マイクロメーター前後である。
【００１０】
上記第２の目的は、請求項２に記載の本発明に係る癌転移能評価方法のための三次元二重膜構造、すなわち、細孔を有する膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに、膜上面に血管内皮細胞のシートを作製した後に、当該血管内皮細胞のシートの上に、所定細胞数の癌細胞を播種した、癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーと、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーと、培養液を収納した培養プレートと、を含み、 当該培養プレートの中に当該第２のチャンバーを配置し、この当該第２のチャンバーの中に、上方から、当該第１のチャンバーを間隔を置いて重層配置して、また、培養プレートを第２のチャンバーとの間に間隔を置く、癌転移能評価のための三次元二重膜構造によって達成される。
本明細書において、第１のチャンバーの細孔膜と第２のチャンバーの細孔膜との間隔はおよそ0.8〜1.2ミリメーターであり、第２のチャンバーの細孔膜と培養プレートとの間隔は0.8〜1.2ミリメーターである。
【発明の効果】
【００１１】
In vitroの系において、癌細胞が三次元構築した血管内皮細胞や他の正常細胞の細胞接着間を開離または崩壊、移動し、この癌細胞の増殖活性を評価できる本発明に係るin vitroモデルによると、遠隔転移の予測は当然ながら、実験の便宜性、動物愛護、経済的効果の問題以外にも、in vivoで難解な基礎研究や経時的研究が容易に可能となる。このことは、さらに遠隔転移の生物学的機構解明や転移予防の臨床治療へと迅速に進展していくものと期待される。
【００１２】
本発明に係る癌移転評価方法によると、評価時間を大幅に短縮することができる。そのため、新薬開発において、動物実験の前に行なう大量・短時間の実験による評価として、本発明に係る癌転移評価方法や二重膜構造は利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について、添付図面を参照して詳細に説明する。
【００１４】
１．材料と方法
［細胞株と培養］
本実験に使用した細胞株は、正常細胞由来の細胞株として、ラット血管内皮細胞であるGP8、マウス線維芽細胞であるNIH3T3、電気抵抗を有するイヌ腎上皮細胞由来であるMDCKの３細胞株である。癌細胞由来の細胞株としては、SW480（ヒト大腸癌由来）、SW620（ヒト大腸癌由来）の２細胞株である。癌細胞株であるHeLa（ヒト子宮頚癌由来）は陽性コントロールとして採用した。計6種類の細胞株を利用した。
【００１５】
今回のin vitro転移実験に使用した２種類の癌細胞株は、同一患者の異なる部位から樹立された大腸癌細胞株を選択した。つまり、SW480は大腸癌の原発巣より樹立された癌細胞株で、SW620は同一患者のリンパ節転移巣より樹立された癌細胞株である。SW480は低転移細胞株、SW620は高転移細胞株である。
【非特許文献６】Hewitt RE et al.,2000 :Validation of a model of colon cancer progression.J Pathol,192.446-454
【００１６】
本実験における総ての細胞株の継代培養ならびに実験培地はDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEMと略: Sigma（商標）)に10%胎児牛血清(FBSと略: GIBCO（商標）)を添加した培養液（培地）を使用し、37℃の5%CO2インキュベータ内にて、25cm2 細胞培養フラスコ(Cornig社製)で継代培養した。GP8においてはG418 300μg/mlを培地に添加し継代培養した。培地交換は3日目にリン酸緩衝生理食塩水(PBSと略)で洗浄後、0.05%トリプシン-EDTA(GIBCO（商標）)で細胞を剥離し継代培養した。細胞数の調整は0.05%トリプシン-EDTAで細胞単離後、単個細胞になるように振盪、トリパンブルー染色による血球計算盤で生細胞数を計出した（トリパンブルー排出試験）。マイコプラズマ感染は不感染であることを確認し、実験に供した。
【００１７】
［材料］
三次元二重膜構造チャンバーのモデル作成は、12 穴培養プレート内に、2個の細孔膜円筒型チャンバーが組み合わされるように工夫した。今回使用した実験材料を紹介する。
【００１８】
図１は、本実施例で用いられるTranswell(登録商標) 3422チャンバーと3460チャンバーの写真である。3422チャンバーはポリカーボネイト 膜（白色を呈す）で8.0マイクロメーターの 細孔径を有する（図１の上部、左部）。3460チャンバーはポリエステル 膜（白色を呈す）で0.4マイクロメーターの 細孔径を有する（図１の上部、右部）。3422チャンバーは写真のごとく3460チャンバー内に的確に重層して挿入可能である（図１の下部）。
【００１９】
その作製のための2種類のチャンバーは、（１）直径6.5ミリメーター で8.0マイクロメーター の細孔径の膜(ポリカーボネイト膜)を有するTranswell 3422(登録商標)insert（Corning社製)のチャンバーと（２）直径12.0ミリメーターで0.4マイクロメーター の細孔径の膜(ポリエステル膜)を有するTranswell(登録商標)insert 3460(Corning社製)のチャンバーを使用した。3422チャンバーは24穴培養プレートに納められており、3460チャンバーは12 穴培養プレートに納められている。3422チャンバーは12 穴培養プレート内の3460チャンバー内に重層し的確に納まった。3422チャンバーを3460チャンバーの上に重ね合わせる時、両者の膜間隔は約1.0ミリメーターであった。また、3460チャンバー膜と12穴培養プレート底面までの間隔は1.0ミリメーターであった。3422チャンバーは本発明における「第1のチャンバー」の実施例であり、3460チャンバーは本発明における「第2のチャンバー」の実施例であり、12穴培養プレートは本発明における「培養プレート」の実施例である。
【００２０】
図2は本実施例で用いられる三次元二膜構造チャンバーモデルによる構造を示す概略図である。本実施例における3422チャンバー（第１のチャンバー１）を3460チャンバー（第２のチャンバー２）の上に重ね合わせたものを12穴培養プレート（培養プレート３）の中に収納した状態を示す概略断面図である。
【００２１】
100ミリメーター細胞培養皿(Falkon社製)は3422チャンバー１ｃの膜下面に細胞を貼り付け操作時、さらに、35ミリメーター 細胞培養皿(Falcon社製)は顕微鏡による形態観察の時に使用した。
【００２２】
他種類の細胞が介在（共存）する培養時の細胞コロニー同定のための蛍光染色液は、生細胞で染色でき、毒性の低いRhodamine123(Sigma（商標）)をDMEM+10%FBSで溶解して使用した。倒立顕微鏡はOlympus CK 40(オリンパス社製)を使用し、Olympus U-RFLT 50（オリンパス社製）にて蛍光励起を行い、細胞コロニーを観察した。写真はOlympus PM10SP（オリンパス社製）で撮影した。
【００２３】
TEER値測定はRecorder OutputのEVOM(商標)（World Precision Instruments社製)とENDOHM-12（World Precision Instruments社製)を使用した。TEER値の単位はΩ・cm2である。測定方法はマニュアルに従った。図3は本実施例で用いられる電気抵抗測定器の構造を示す概略図である。
【００２４】
［方法］
基礎実験1、2では1試料（ n = 1 ）とし、基礎実験3、本発明の実験は3試料（ n = 3 ）で行った。
【００２５】
１）基礎実験1（Rhodamine123排出時間）
MDCKの介在する培養下における癌細胞同定のために、前記００１４欄の6種類の細胞を35ミリメーター細胞培養皿に培養し、蛍光色素であるRhodamine123の完全に消退する時間を検討した。方法は、培養液にRhodamine123を滴下して、暗所にて30分間細胞培養・染色、30分後に、この検体をPBSで2回洗浄し、Rhodamine123を除去、新しい培地に交換、経時的に24時間まで蛍光顕微鏡で観察を行った。蛍光が蛍光顕微鏡で完全に見えなくなる時間を各細胞のRhodamine123排出時間とした。
【００２６】
２）基礎実験２（MDCKの癌細胞コロニー形成に与える影響）
癌細胞はMDCK介在下に存在することになる。そこで、MDCKの癌細胞コロニー形成にあたえる影響を検討した。MDCKと癌細胞HeLaを35ミリメーター細胞培養皿内で検討した。
【００２７】
当該培養皿へ、HeLaを1×104、5×103、1×103、5×102、1×102個播種した検体(HeLa 単独例)、24時間後に上記細胞数のHeLa存在下の細胞培養皿内へMDCKを播種した検体(HeLa+MDCK例)の2種類を作成し、培養7日目にRhodamine123染色を行い、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡にて形態観察し、比較した。
【００２８】
３）基礎実験3（NIH3T3、GP8がMDCKのTEER値に及ぼす影響）
3422チャンバーの膜下面１ｃと上面１ｂに敷き込むNIH3T3とGP8の細胞動態（行動）と電気抵抗を有するMDCKとの関係を検討した。
【００２９】
まず、3422チャンバー上面１ｂに1×105個のNIH3T3もしくはGP8を播種し、このチャンバーを12穴培養プレート（培養プレート３）の3460チャンバー内に重層し、2日後3422チャンバーを除去し、残った3460チャンバーの膜上面２ｂにMDCKを2×105個播種、7日間静置培養した。その間、培養液の交換は２回行った。MDCK播種後7日目に3460チャンバーのTEER値を測定し、Rhodamine123染色によるMDCK介在下のNIH3T3とGP8の細胞行動を観察した。
【００３０】
４）本発明の実験（三次元二重膜構造チャンバーモデルにおけるTEER値の変化と癌細胞コロニー観察）
図４Ａ，Ｂは本発明に係る今回の実験をモデルとした癌転移能評価方法の実施例手順を示す概略図である。また、本発明に係る三次元二重膜構造チャンバー構造の作成手順を示す概略図である。手順１から手順7は実験の経時的順序を示す。手順7の後に、3460チャンバーを取り出し、この3460チャンバーの電気抵抗を測定、評価をおこなった。また、癌細胞コロニーの観察を行った。
【００３１】
手順１
24穴培養プレートから3422チャンバーを取り出し、当該チャンバーを100ミリメーター細胞培養皿上に反転して置き、上になった3422チャンバー膜下面にNIH3T3を滴下（1×105個：50マイクロリットル）、4時間培養することで3422チャンバー膜下面にNIH3T3を貼り付けた。
【００３２】
手順２
この3422チャンバーを培養液の入った24穴培養プレートへ元のように戻し、24時間静置培養。次に、この3422チャンバーの膜上面にGP8を播種（2×10 5個：100マイクロリットル）した。
【００３３】
手順３
72時間静置培養後、3422チャンバーの膜を上下に挟み込ように、細胞が密着した状態のNIH3T3シート（膜下面）とGP8シート（膜上面）を作製した。
【００３４】
手順４
この24穴培養プレートにある3422チャンバー内上面に、調整した細胞数の癌細胞を播種した。
【００３５】
手順５
その直後、培養液の入った12穴培養プレート内にある3460チャンバー内に3422チャンバーを移し替え挿入することで、２つのチャンバーを重層した。
重層した状態で48時間静置培養した。
【００３６】
手順６
その後、3422チャンバーを3460チャンバーより除去し、残った3460チャンバーの膜上面に電気抵抗を有するMDCKを2×105個播種、培養液を追加した。
【００３７】
手順７
MDCKの細胞密着状態作製（ＭＤＣＫシート）と癌細胞コロニー形成のため、7日間静置培養した。その間、3460チャンバー内の培養液の1/2交換を２回行った。
【００３８】
この7日目に、3460チャンバーのTEER値を、図３に示す電気抵抗測定器を使用し、測定した。さらに、Rhodamine123染色による癌細胞コロニーの観察を行った。
【００３９】
［統計処理］
統計解析ソフトはStat.View Ver.4.0を使用し、統計処理はt検定で行った。統計学的有意差はP<0.05とした。
【００４０】
［結果］
・ 基礎実験1（Rhodamine123排出時間）
【表１】
表1は、基礎実験１で使用した6種類００１４欄の細胞株のRhodamine123蛍光色素排出時間を示す。縦は細胞株の種類、横は時間（ h ）の推移である（○：蛍光顕微鏡で細胞内に蛍光染色の確認ができた時間、×：蛍光顕微鏡で細胞内に蛍光染色の確認できなくなった時間を意味する）。
【００４１】
この結果より、MDCKの介在下における癌細胞コロニーの同定には、MDCKのRhodamine123蛍光が3時間以上経過した時点で完全に消失することより、癌細胞コロニーの蛍光観察ができることを明かとした。そのため、以後の癌細胞コロニー観察はRhodamine123染色除去より3〜４時間目とした。
【００４２】
2）基礎実験２（MDCKの癌細胞コロニー形成に与える影響）
癌細胞HeLa単独例とHeLa+MDCK例の10個以上で構成されるHeLaの癌細胞コロニー数は、それぞれ、1×104個播種で941個と1099個、5×103個播種で303個と366個、1×103個播種では76個と56個、5×102個播種では14個と10個であった。HeLa単独例の1×104個を播種した検体では癌細胞コロニーのお互いの癒合（重なり合い）が認められたが、MDCKを介在させたHeLa+MDCK例では癌細胞コロニー間の癒合は認められなかった。
【００４３】
以上の結果より、HeLaの癌細胞コロニー形成はMDCKの介在によって、コロニー形成数に影響されないこと、ならびにMDCKの介在によりHeLaのコロニーが癒合せず、明らかな癌細胞コロニー数の算出できることが判明した。
【００４４】
３）基礎実験3（NIH3T3、GP8がMDCKのTEER値に及ぼす影響）
電気抵抗を有するMDCKのみの検体と3422チャンバーより落下したNIH3T3介在のMDCK検体には、両検体の3460チャンバーにおけるTEER値に差を認めなかった。 同様の操作をGP8で行った。GP8は3422チャンバーから、落下し、MDCKの介在下で、Rhodamine123染色コロニーを形成した。ただし、コロニーは小さな構成細胞コロニーと樹枝状形態（コロニーを形成していない細胞群）であった。このことは、GP8は3460チャンバーのMDCKのTEER値に影響を及ぼした。
【００４５】
この結果より、GP8では3422チャンバーの8.0マイクロメーターの細孔径を通過するため、3460チャンバーへの進入を阻止する工夫が必要と考えられた。CP8を3422チャンバー膜上面に播種する前に、3422チャンバーの膜下面にNIH3T3を敷き込むことで、MDCKのTEER値は7540±319.1Ω・cm2（平均値±SE）を示した。3422チャンバーにいずれの細胞（NIH3T3、GP8）も播種しない時のMDCKのTEER値は7679±180.3Ω・cm2であり、上記と差を認めなかった。この結果はGP8の膜下面への移動をNIH3T3で阻止でき、GP8のMDCKに対する影響は解決した。
【００４６】
4）本発明の実験（三次元二重膜構造チャンバーモデルにおけるTEER値の変化と癌細胞コロニー観察）
NIH3T3、GP8、MDCKの正常細胞由来の細胞が存在する三次元二重膜構造チャンバーのモデルを使用して、2.5×105個の癌細胞による、電気抵抗を有すMDCK介在3460チャンバーのTEER値変化と癌細胞コロニー観察を行った。
【００４７】
3422チャンバーにNIH3T3シート（膜下面）とGP8シート（膜上面）を作製した後に、3422チャンバーに癌細胞を播種しなかった3460チャンバー（コントロール検体（白抜き星マーク））におけるMDCKのTEER値は7540±319.1Ω・cm2（平均値±SE）であった。3422チャンバーにいずれの細胞(NIH3T3、GP8)も存在しない状態での3460チャンバーにおけるMDCKのTEER値は7679±180.3Ω・cm2であり、コントロール検体（白抜き星マーク）と大差なかった。一方、NIH3T3とGP8の存在する3422チャンバーに癌細胞を播種した検体を測定すると、HeLa播種のMDCK 介在チャンバー(MDCK＋HeLa検体)では3507±1001Ω・cm2、SW480播種のMDCK介在チャンバー(MDCK＋SW480検体)では7643±602.0Ω・cm2、SW620播種のMDCK介在チャンバー(MDCK＋SW620検体)では4417±649.5Ω・cm2であった。コントロール検体とMDCK＋HeLa検体ならびにMDCK＋SW620検体との間に、P<0.05の統計学的有意差を認めた。なお、MDCK＋SW480検体とMDCK＋SW620検体の間にも統計学的有意差を認め、高転移細胞株であるSW620は、低転移細胞株であるSW480より、有意にMDCKのTEERの低値を示した（図５）。
【表２】
表2は、図５と同様の実験内容であるが、本発明モデルに使用した各々3試料の実験結果を詳細に示したものである。各癌細胞株による、MDCKのTEER値に与える影響と癌細胞コロニー形成の一覧表を示している。電気抵抗の測定は図３に示すごとく行った。癌細胞コロニーの数はRhodamine123染色除去後の3〜４時間目に蛍光顕微鏡で観察し算出した。（表２のコントロールは図５のコントロール（白抜き星マーク）と同じ条件である。ＴＥＥＲは電気抵抗値で、単位はΩ・cm2：コロニー細胞数は１つの癌細胞コロニーのコロニー構成細胞数２０〜４９個，５０個以上で2つに分け、その個数で表示している）。
【００４８】
MDCK介在3460チャンバー上で、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡で癌細胞コロニーを観察した。光顕顕微鏡では、MDCKの介在により癌細胞コロニーと紛らわしいMDCKの細胞塊（図６：赤矢印）が存在したが、Rhodamine123染色での蛍光顕微鏡では、明らかな癌細胞コロニーを捕らえることができた（図６：白矢印）。観察の結果は、HeLaとSW480癌細胞コロニーの細胞凝集はやや粗であり、HeLaにおいては50個以上構成コロニーと20個以上構成コロニーが認められ、SW480では50個以上構成コロニーは無く、20個以上構成コロニーも少なかった。一方、SW620癌細胞コロニーの細胞凝集は比較的密であり、50個以上構成コロニーはほとんど無く、20個以上構成コロニーが多数認められた（図６）。この観察結果は、高転移細胞株であるSW620が、低転移細胞株であるSW480より、有意にMDCKのTEERの低値を示した結果と矛盾するものではなかった。
【００４９】
［考察］
遠隔転移は、癌細胞が原発巣で増殖浸潤、脈管侵襲して、その後も非常に複雑な過程を経て、転移巣（コロニー）形成へと成立していくと言われている。
【非特許文献１】斉木育夫.,1995 :癌転移の分子機構と治療への応用.Molecular Medicine,32(4).372-379
【００５０】
しかし、細胞レベルより癌細胞動態を考えると、浸潤（進入）能、移動（運動）能、増殖（適応）能が備わっていることが遠隔転移の必要条件となる。また、正常細胞による転移防止を考えると、癌細胞は正常細胞と基質の接着ならびに正常細胞と正常細胞の細胞間接着をいかに開離または崩壊して乗り越え、異なる組織環境において転移巣（コロニー）を形成するかである。発明者らはこの遠隔転移の後期過程である血管内再侵入と組織適応（増殖）に着目して、正常細胞由来の3細胞株(血管内皮細胞、線維芽細胞、電気抵抗を有するMDCK)が介在する2種類(8.0マイクロメーター細孔膜円筒型、 0.4マイクロメーター細孔膜円筒型)の細孔膜円筒型チャンバーを利用することで、in vitroによる遠隔転移モデルである三次元二重膜構造チャンバーモデルを発明した。本実験の対象となる転移モデルは、遠隔転移メカニズムの後期過程（毛細血管内皮への接着、血管外脱失、標的器官内組織での転移コロニー形成）の評価モデルと理解される。
【００５１】
MDCKと悪性細胞（癌細胞等）の共存（介在）培養における、MDCKのTEER値測定による電気抵抗減弱アッセイ（Electrical Resistance Breakdown Assay）はLudwigらにより既に考案されている。
【非特許文献９】Ludwig T et al.,2002 :The electrical resistance breakdown assay determines the role of proteinases in tumor cell invasion.Am J Physiol Renal Physiol,283.319-327
【非特許文献１０】Ludwig T et al.,2004 :Platinum complex cytotoxicity tested by the electrical resistance breakdown assay. Cell Physio Biochem,14.425-430
【非特許文献１１】Ludwig T et al.,2005 :Functional measurement of local proteolytic activity in living cells of invasive and non-invasive tumors. J Cell Physiol,202.690-697
【００５２】
彼らは1種類の細孔膜円筒型チャンバー(0.4マイクロメーターの 細孔径)の膜上面または下面にMDCKシートを作成し、膜上面に悪性細胞を播種することで、悪性細胞の悪性度ならびに抗癌剤感受性を、MDCKのTEER値の変動で評価しようとする試みが成されている。この実験系は癌細胞より分泌されるMatrix Metalloproteinases(MMPs)によるMDCKのTEER値変動から悪性度を評価するもので、転移能モデルではなく浸潤能モデルと理解される。
【非特許文献１１】Ludwig T et al.,2005 :Functional measurement of local proteolytic activity in living cells of invasive and non-invasive tumors. J Cell Physiol,202.690-697
【００５３】
発明者らのモデルは癌細胞が正常細胞間の接着を開離または崩壊し、さらに8.0マイクロメーターの細孔径を有する膜を移動し、さらに膜下面より遊離して、次の異なる正常細胞であるMDCKの存在する環境下でコロニーとして増殖することで、MDCKのTEER値を低下させる客観的評価モデルであり、Ludwigらの実験系とは明らかに異なる。
【００５４】
本モデルの構造上の特徴は正常細胞由来の細胞株の細胞選択と配置の理論といえる。今回使用した実験検体を例にして要約すると、
（１）ラット血管内皮由来細胞（GP8）：3422チャンバーの膜上面にシート状になるように配置した。これは癌細胞が血管内皮細胞と接着・再進入する転移後期過程を実験の初期段階とするためである。
（２）マウス線維芽由来細胞（NIH3T3）：3422チャンバーの下面に貼り付けた。その理由は癌細胞と血管内皮細胞の飼育層（Feeder layer）としての意義があり、
【非特許文献１２】Nishinakamura R et al.,2006 :Essential roles of Sall family genes in kidney development. J Physiol Sci, 56(2).131-136
【非特許文献１３】Gregoire L et al.,1998 :Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis.In vitro Cell Dev Biol Anim, 34(8). 636-639血管内皮細胞（GP8）が下面に移動するのを阻止する目的でもある。なお、転移好発部位である肺、肝臓、骨には線維芽細胞が存在している事実である。（３）イヌ腎上皮由来細胞(MDCK)：3460チャンバーの上面に敷いた。このMDCKは細胞間のタイトジャンクションが強く、安定した高い、電気抵抗であるTEER値を測定することができるためである。
【非特許文献９】Ludwig T et al.,2002 :The electrical resistance breakdown assay determines the role of proteinases in tumor cell invasion.Am J Physiol Renal Physiol,283.319-327さらに、癌細胞と異なる細胞であることより、MDCKの存在によりin vivoで認められる転移巣に類似したコロニー形成を期待したためである。また、MDCKの存在により正常細胞由来NIH3T3の増殖抑制が加わり(細胞・細胞接触抑制(Cell-Cell Contact Inhibition)による)、MDCKの電気抵抗値に影響を与えなかったことである。以上から、より生理的な三次元構造をもった後期転移過程の新規評価モデルを作成できた。
【００５５】
癌細胞株の選択に関して、HeLaを陽性コントロールとした理由は、コロニー形成能が認められる以外に、
【非特許文献５】Lue JY et al.,2003 :Establishment of red fluorescent protein-tagged HeLa tumor metastasis models:Determination of DsRed2 insertion effects and comparison of metastatic patterns after subcutaneous,intraperitoneal,or intravenous injection. Clin Exp Metastasis,20.121-133発明者らと同様に、Transwell（登録商標）の8.0マイクロメーター の細孔径膜を有するチャンバーを使用して、HeLaの遊走能が確認されているからである。
【非特許文献１４】Zhang L et al.,2007 :Effect of matrine on HeLa cell adhesion and migration. Euro J Pharmaco,563.69-76
【００５６】
なお、Transwellの0.4マイクロメーターの細孔径膜 チャンバー上において、MDCKとHeLaの共存培養がMDCKのTEER値を低下させる事実である。
【非特許文献１１】Ludwig T et al.,2005 :Functional measurement of local proteolytic activity in living cells of invasive and non-invasive tumors. J Cell Physiol,202.690-697
【００５７】
転移評価の実験検体として選択したSW480とSW680は、同一患者から樹立された貴重な原発巣と転移巣からの癌細胞株であり、両者は臨床でも明らかに悪性度が異なる。なお、in vivoの動物実験においても、低転移細胞株SW480はいずれの部位にも転移を認めず、高転移細胞株SW620は肝転移を認めた報告があるため、今回の実験に使用した。今回の実験結果では高転移細胞株SW620が低転移細胞株SW480よりもMDCKのTEER値を低下させた。
【非特許文献６】Hewitt RE et al.,2000 :Validation of a model of colon cancer progression.J Pathol,192.446-454
【００５８】
コロニー形成能のみの評価であれば、正常細胞である宿主細胞の介在しない軟寒天内コロニー形成法で十分であるが、
【非特許文献１６】Zhang RD et al.,1991 :Malignant potential of cells isolated from lymph node or brain metastasis of melanoma patients and implications for prognosis. Cancer Res, 51(8). 2029-2035転移モデルには宿主細胞の介在が要求される。本法は癌細胞にとって生物学的に障害物となる血管内皮細胞と線維芽細胞の細胞間接着を開離または崩壊し、チャンバーの細孔膜下面より落下した遊離癌細胞のコロニー形成能をMDCKのTEER値で客観的に評価するもので、従来の転移モデル(Nakayama et al 1998)より、生体に近似した三次元構造を呈しているといえる。
【非特許文献１７】Nakayama Y et al.,1998 :Alterative express of the collagenase and adhesion molecules in the highly metastatic clones of human colonic cancer cell lines. Clin Exp Metastasis,16(5).461-469
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本実施例で用いられるTranswell(登録商標) 3422チャンバーと3460チャンバーの写真である。
【図２】本実施例で用いられる三次元二膜構造チャンバーの構造を示す概略図である。
【図３】本実施例で用いられる電気抵抗測定器の構造を示す概略図である。
【図４Ａ】本発明に係る癌転移能評価方法の実施例手順を示す概略図である。
【図４Ｂ】本発明に係る癌転移能評価方法の実施例手順を示す概略図である。
【図５】本実施例における各種癌細胞株の電気抵抗（TEER）値に与える影響と癌転移評価を示すグラフである。
【図６】本実施例での、MDCK介在の各癌細胞培養下における、各癌細胞コロニーの同定を示す写真である。光学顕微鏡（左図）と蛍光顕微鏡（右図）の写真である（×１００）。
【符号の説明】
【００６０】
１ 第１のチャンバー
１ａ 細孔膜
１ｂ 膜上面
１ｃ 膜下面
２ 第２のチャンバー
２ａ 細孔膜
２ｂ 膜上面
２ｃ 膜下面
３ 培養プレート
４ 培養液
５ 電極
６ 電極
７ 電線コード
８ 電線コード
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（手順１） 癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーの膜下面に線維芽細胞を貼り付け、その後に、当該膜上面に血管内皮細胞を播種し、当該膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに当該膜上面に血管内皮細胞のシートを作製すること、
（手順２）次に、手順１で得た当該膜上面の血管内皮細胞のシート上に所定の細胞数の癌細胞を播種し、その後に、培養プレートの中に配置した、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する、第２のチャンバーに、上方から、手順１で得た第1のチャンバーを配置し、間隔を置いて重層した状態で培養液中で培養すること、
（手順３）その後、重層した第１のチャンバーを取り出し、残った、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーの膜の上に電気抵抗を有する細胞を所定数播種すること、
（手順４）その後、手順３で得た、当該第２のチャンバーを一定期間培養すること、
（手順５）続いて、手順４で得た、当該第２のチャンバーの電気抵抗値を電気抵抗測定器で測定することを、順次行うことを特徴とする癌転移能評価方法。
【請求項２】
膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに、膜上面に血管内皮細胞のシートを作製した後に、当該血管内皮細胞シートの上に、所定細胞数の癌細胞を播種した、癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーと、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーと、培養液を収納した培養プレートを含み、
当該培養プレートの中に第２のチャンバーを配置し、この当該第２のチャンバーの中に、上方から、当該第１のチャンバーを第２のチャンバーと間隔を置いて重層配置して、また、培養プレートと第２のチャンバーとの間にも間隔を置く、癌転移能評価のための三次元二重膜構造。
【請求項１】
（手順１） 癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーの膜下面に線維芽細胞を貼り付け、その後に、当該膜上面に血管内皮細胞を播種し、当該膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに当該膜上面に血管内皮細胞のシートを作製すること、
（手順２）次に、手順１で得た当該膜上面の血管内皮細胞のシート上に所定の細胞数の癌細胞を播種し、その後に、培養プレートの中に配置した、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する、第２のチャンバーに、上方から、手順１で得た第1のチャンバーを配置し、間隔を置いて重層した状態で培養液中で培養すること、
（手順３）その後、重層した第１のチャンバーを取り出し、残った、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーの膜の上に電気抵抗を有する細胞を所定数播種すること、
（手順４）その後、手順３で得た、当該第２のチャンバーを一定期間培養すること、
（手順５）続いて、手順４で得た、当該第２のチャンバーの電気抵抗値を電気抵抗測定器で測定することを、順次行うことを特徴とする癌転移能評価方法。
【請求項２】
膜下面に線維芽細胞のシートを作製するとともに、膜上面に血管内皮細胞のシートを作製した後に、当該血管内皮細胞シートの上に、所定細胞数の癌細胞を播種した、癌細胞が通ることができる細孔膜を有する第１のチャンバーと、癌細胞が通ることができない細孔膜を有する第２のチャンバーと、培養液を収納した培養プレートを含み、
当該培養プレートの中に第２のチャンバーを配置し、この当該第２のチャンバーの中に、上方から、当該第１のチャンバーを第２のチャンバーと間隔を置いて重層配置して、また、培養プレートと第２のチャンバーとの間にも間隔を置く、癌転移能評価のための三次元二重膜構造。
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図１】
【図６】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図１】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２７９２８（Ｐ２００９−２７９２８Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９１８３７（Ｐ２００７−１９１８３７）
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５０７２４９７２０）
【出願人】（５０７２４８６２０）
【出願人】（３０５０１４８３６）ファーマコセル株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５０７２４９７２０）
【出願人】（５０７２４８６２０）
【出願人】（３０５０１４８３６）ファーマコセル株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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