発光アッセイ感度を高める方法
【課題】発光アッセイ測定の感度を高めること。
【解決手段】本発明は、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にてこのアッセイを実行する工程を包含する。本発明はまた、１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および２）有機化合物であって、この有機化合物は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、を含有する包装材料を含むアッセイキットを提供する。
【解決手段】本発明は、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にてこのアッセイを実行する工程を包含する。本発明はまた、１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および２）有機化合物であって、この有機化合物は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、を含有する包装材料を含むアッセイキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、細胞生物学および分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、発光アッセイ測定の感度を高める方法、組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
レポーター分子は、通常、生物学、生化学、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野において、分子事象をモニターするのに使用されている。例えば、レポーター分子は、そのレポーター分子のレベルがレポーター分子に結合した特定のプロモーターからの転写に起因するアッセイで使用されている。これらのアッセイは、真核生物の遺伝子発現、レセプタ活性、転写因子、細胞内情報伝達、ｍＲＮＡプロセシング、タンパク質折り畳みなどを研究するために使用できる。このようなアッセイで典型的に使用されるレポーター分子には、放射性同位元素、蛍光剤、酵素および発光剤が挙げられる。例えば、Ａｋｈａｖａｎ−ＴａｆｔｉらのＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを参照。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９４年９月、Ｃａｍｐｂｅｌ，Ｋｒｉｃｋａ，Ｓｔａｎｌｅｙ共著、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４。
【０００３】
アッセイシステムで特に有用な２種の発光酵素には、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）およびＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼがある。これらのルシフェラーゼ用の基質およびそれらを生成する反応は、図１および２で示されている。この反応で発生する光の量（すなわち、光子数）は、測定でき、この反応における発光酵素濃度を計算するのに使用できる。
【０００４】
ホタルルシフェラーゼは、６１ｋＤａの単量体タンパク質であり、これは、酵素活性のための翻訳後プロセッシングを必要としない。それゆえ、それは、翻訳するとすぐに遺伝子レポーターとして機能する。光子発光は、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋およびＯ２を必要とする反応でのコガネムシルシフェラーゼの酸化により、達成される（図１）。
【０００５】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、３６ｋＤａの単量体タンパク質であり、これは、その天然源であるＲｅｎｉｌｌａレニホルミス（ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から精製したとき、３％炭水化物から構成される。ホタルルシフェラーゼと同様に、その活性には、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの翻訳後修飾は必要ではなく、それは、翻訳直後、遺伝子レポーターとして機能する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼにより触媒される発光反応は、Ｏ２を利用し、腔腸動物−ルシフェラーゼもまた、セレンテラジンと呼ばれる（図２）。
【０００６】
発光反応は、非常に少量の特定の分析物を検出するのに使用でき、その基質は、分析において同定され測定される。例えば、発光反応は、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グリコシダーゼ、および種々の代謝物（例えば、ＡＴＰまたはＮＡＤＨ）を検出し定量するのに使用できる。発光反応はまた、結合相互作用（例えば、抗体およびヌクレオチドプローブにより媒介されるもの）により、分析物を検出し定量するのに使用できる。典型的には、発光反応は、試料中の１×１０−１６モル未満の分析物、しばしば、１×１０−１９モル未満の分析物を検出するのに使用できる。発光では、一般的に検出される分析物は、ルシフェラーゼ、特に、ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである。最も多くの場合、これらの分析物は、遺伝子発現およびタンパク質合成により、それらの作成に付随した現象を定量するのに使用される。分析物として使用される他の発光酵素には、エクオリン、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、および他の海洋ルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
分析物を測定する発光を使用するとき、この分析物の存在に依存しない反応により、殆どまたは全く光を生じないことが好ましい。これは、ホタルルシフェラーゼを使う場合である。典型的なホタルルシフェラーゼアッセイ条件下では、ルシフェラーゼは、このホタルルシフェラーゼが存在しないとき、検出できない。ホタルルシフェラーゼを使用するアッセイとは対照的に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼが存在しないとき、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイシステムでは、一般に、光は検出できない。発光酵素の触媒活性に依存しない発光は、自動発光と呼ぶ。例えば、自動発光は、発光源基質セレンテラジンの自然酸化により、引き起こすことができる。
【０００８】
分析物（例えば、自動発光）の存在に依存しない発光は、その分析物の活性から生じる光の量を正確に測定する性能を低下させることにより、分析的アッセイの有用性を制限できる。特に、セレンテラジンまたはその構造的アナログを含有する発光アッセイの感度は、自動発光により低下する。さらに、このアッセイシステムに種々の成分（例えば、脂質（特に、臨界ミセル濃度、すなわち、ＣＭＣを超えて）、疎水性タンパク質（特に、規定の三次元構造を備えたもの）、および疎水性微小環境を含む細胞または他の生体物質）を添加すると、自動発光を著しく高くできる。
【０００９】
アッセイ感度はまた、無関係の発光源分子から生じる発光により、低下し得る。無関係の発光源分子は、この分析用アッセイの汚染に起因して存在し得るか、または同じ反応混合物で実行される別個の分析用発光アッセイのために存在し得る。いずれの場合でも、分析用発光アッセイの感度は、その分析物の存在に依存しない発光を減少させることにより、改良できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
出願人は、分析物に依存しない発光を減少させる１種またはそれ以上の有機化合物の存在下でアッセイを実行することにより、発光アッセイの感度が改良できることを発見した。特に、出願人は、予想外なことに、この分析物に依存しない発光が、分析物に依存した発光を同様に減少させることなく、減少できることを発見した。好ましくは、この分析物に依存した発光は、この分析物に依存した発光よりも低い倍率だけ減少されるか、または、この分析物に依存した発光は、ほぼ同じままで留まるか、または増加する。従って、本発明は、発光アッセイの感度を高める方法であって、この方法は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、また、分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて生物発光反応を実行する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、アッセイの感度を高める方法であって、この方法は、酵素に結合していない発光源分子により発生した発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、また、酵素に結合した発光源分子により発生した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にてこのアッセイを実行する工程を包含する。
【００１２】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法であって、この方法は、発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、また、分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にてアッセイを実行する工程を包含する。
【００１３】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、セレン原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１４】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−セレン結合を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１５】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−セレン二重結合（Ｃ＝Ｓｅ）を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１６】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−セレン単結合（Ｃ−Ｓｅ）を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１７】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−イオウ二重結合（Ｃ＝Ｓ）を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１８】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、セレン原子および窒素原子の両方に結合した炭素原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１９】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、イオウ原子および窒素原子の両方に結合した炭素原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００２０】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、２個の炭素原子に結合したイオウ原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含し、ここで、その分析物に依存しない発光は、少なくとも約１０倍だけ減少する。好ましくは、この分析物に依存しない発光は、７倍未満だけ減少する。
【００２１】
本発明はまた、以下の１）および２）を含有する包装材料を含むアッセイキット：１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および２）発光アッセイの感度を高める有機化合物。好ましくは、この有機分子は、以下の１）、２）または３）ができる：１）分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍の倍率だけ減少させ、分析物に存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させること；２）酵素に結合していない発光源分子により発生した発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、酵素に結合した発光源分子により発生した発光を少なくとも約７倍だけ減少させること；または３）自動発光を少なくとも約１０倍減少させ、分析物の存在に依存しない発光を約７倍未満だけ減少させること。
【００２２】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高めるのに有用な本明細書で開示した新規化合物を提供する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１） 発光アッセイの感度を高める方法であって、該方法は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて該アッセイを実行する工程を包含する、方法。
（項目２） 発光アッセイの感度を高める方法であって、該方法は、酵素に結合していない発光源分子により発生する発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして酵素に結合した発光源分子により発生する発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて該アッセイを実行する工程を包含する、方法。
（項目３） 発光アッセイの感度を高める方法であって、該方法は、自動発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて該アッセイを実行する工程を包含する、方法。
（項目４） 上記発光アッセイが、ルシフェラーゼ酵素、エクオリン酵素またはオベリン酵素を使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５） 上記発光アッセイが、ホタルルシフェラーゼを使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６） 上記発光アッセイが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７） 上記発光アッセイが、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼを使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８） 上記有機化合物が、少なくとも０．１μＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９） 上記有機化合物が、少なくとも０．１ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０） 上記有機化合物が、約０．１μＭ〜約５００ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１） 上記有機化合物が、約１００μＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２） 上記有機化合物が、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３） 上記アッセイが、全細胞の存在下にて実行される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４） 上記アッセイが、少なくとも約１０重量％の水を含む溶媒中で実行される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５） 上記アッセイが、少なくとも約２５重量％の水を含む溶媒中で実行される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６） 分析物の存在に依存した上記発光が、約５倍未満だけ減少する、項目１に記載の方法。
（項目１７） 酵素に結合した発光源分子により発生する上記発光が、約５倍未満だけ減少する。項目２に記載の方法。
（項目１８） 分析物の存在に依存した上記発光が、約５倍未満だけ減少する、項目３に記載の方法。
（項目１９） 分析物の存在に依存した上記発光が、約２倍未満だけ減少するか、同じままであるか、または増加する、項目１に記載の方法。
（項目２０） 酵素に結合した発光源分子により発生する上記発光が、約２倍未満だけ減少するか、同じままであるか、または増加する、項目２に記載の方法。
（項目２１） 分析物の存在に依存した上記発光が、約２倍未満だけ減少するか、同じままであるか、または増加する、項目３に記載の方法。
（項目２２） アッセイキットであって、該アッセイキットは、以下：
１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および
２）有機化合物であって、該有機化合物は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、
を含有する包装材料を含む、アッセイキット。
（項目２３） アッセイキットであって、該アッセイキットは、以下：
１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および
２）有機化合物であって、該有機化合物は、酵素に結合していない発光源分子により発生する発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして生物発光酵素に結合した発光源分子により発生する発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、
を含有する包装材料を含む、アッセイキット。
（項目２４） アッセイキットであって、該アッセイキットは、以下：
１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および
２）有機化合物であって、該有機化合物は、自動発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、
を含有する包装材料を含む、アッセイキット。
（項目２５） 上記酵素基質および上記化合物が、それぞれ、別々の容器に含有されている、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目２６） 上記酵素基質および上記化合物が、単一の容器に含有されている、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目２７） さらに、発光アッセイで使用するのに適切な緩衝液を含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目２８） 上記酵素基質および上記緩衝液が、単一の容器に含有されている、項目２７に記載のキット。
（項目２９） 上記化合物および上記緩衝液が、単一の容器に含有されている、項目２７に記載のキット。
（項目３０） さらに、第二発光酵素用の基質を含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３１） さらに、発光酵素反応用の消光剤を含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３２） 上記基質が、ホタルルシフェラーゼまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ用の基質である、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３３） さらに、ＡＴＰを含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３４） 発光酵素の発光源基質、および発光源酵素の両方を含む、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ホタルルシフェラーゼで触媒した化学発光反応を図示している。
【図２】図２は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼで触媒した化学発光反応を図示している。
【図３】図３は、セレンテラジン自動発光経路でのジオキセタン中間体を図示している。
【図４】図４は、自動発光を減少させる代表的な化合物（１〜１１）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（詳細な説明）
本発明を詳細に記述し開示する前に、本発明は、特定のアッセイフォーマット、物質または試薬には限定されず、このようなものは、変わり得ることが理解できるはずである。本明細書中で使用する用語は、記述した特定の実施態様のみを記述する目的ではなく、限定するとは解釈されないことが理解できるはずである。
【００２５】
本明細書および添付の請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈で明らかに指示がなければ、複数の指示物を含む。本明細書およびそれに続く請求の範囲では、他に記述されていなければ、以下の意味を有するように定義した多数の用語が参照される。
【００２６】
本明細書中で使用する「ハロ」との用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを示す。
【００２７】
本明細書中で使用する「アルキル」、「アルコキシ」、「アルケニル」、「アルキニル」などの用語は、分枝基および非分枝基の両方を示す。しかし、「プロピル」のような個々の基の指示は、具体的に参照される直鎖基、分枝鎖基、分枝鎖異性体（例えば、「イソプロピル」）を包含する。
【００２８】
本明細書中で使用する「アリール」との用語は、６個〜３０個の炭素原子を含有する単環式または多環式炭化水素基を示し、ここで、少なくとも１個の環は、芳香族である。好ましくは、アリールは、フェニル基またはオルト縮合二環式炭素環基（これは、約９個〜１０個の環原子を有し、少なくとも１個の環は、芳香族である）を示す。「ヘテロアリール」とは、非過酸化物酸素、イオウおよびＮ（Ｘ）からなる群から選択される１個〜４個のヘテロ原子および炭素からなる５個〜６個の環原子を含有する単環式芳香環の基を包含し、ここで、Ｘは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニルまたはベンジルだけでなく、それから誘導した原子を８個〜３０個で含有する多環式の環基である。好ましくは、ヘテロアリールは、炭素および１個〜４個のヘテロ原子からなる５個〜６個の環原子を含有する単環式芳香環の環原子によって結合した基を包含し、各々は、非過酸化物酸素、イオウおよびＮ（Ｘ）からなる群から選択され、ここで、Ｘは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニルまたはベンジルだけでなく、それから誘導した原子を約８個〜１０個で含有するオルト縮合二環式複素環の基（特に、ベンズ誘導体、またはプロピレン、トリメチレンまたはテトラメチレンジラジカルをそこに縮合することにより誘導したもの）である。
【００２９】
本明細書中で使用する「分析物」との用語は、試験試料で検出される基質である。発光アッセイでは、通例検出される分析物には、ルシフェラーゼ、特に、ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼが挙げられる。分析物として使用する他の発光酵素には、エクオリン、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、および他の海洋ルシフェラーゼが挙げられる。さらに、発光反応は、分析物（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グリコシダーゼ、および種々の代謝物（例えば、ＡＴＰまたはＮＡＤＨ））を検出するのに使用できる。発光反応はまた、結合相互作用（例えば、抗体およびヌクレオチドプローブにより媒介されるもの）により、分析物を検出し定量するのに使用できる。ある場合、分析物に依存した発光は、発光酵素の活性に連関できる。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、ルシフェリンのホスホ誘導体を使用することにより、検出できる。この戦略により、ルシフェリンは、ＡＰの作用により発生し、これは、次いで、ルシフェラーゼとの反応により、光を生じる。本発明は、別個の西洋わさびペルオキシダーゼ／ルミノール反応後に、そのＡＰアッセイを実行することを可能にする。その分析物ＡＰに関して、本明細書中で記述した化合物は、西洋わさびペルオキシダーゼにより引き起こされる分析物に依存しない発光を減少させるために、添加できる。
【００３０】
本明細書中で使用する「自動発光」との用語は、発光源分子に対する酵素活性から生じない発光源分子からの光の放出を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用する「発光アッセイの感度を高める」との用語は、そのアッセイの精度を高めるかアッセイで少量の分析物の存在を測定する性能を改良することを意味する。例えば、発光アッセイの感度は、分析物に依存しない発光を減少することにより、高めることができる。好ましくは、分析物に依存しない発光は、この分析物に依存した発光の結果では、減少するか、最小量だけ減少するか、減少しないか、または増加する。さらに、分析物に依存しない発光は、好ましくは、分析物に依存した発光よりも大きい倍率だけ、減少する。
【００３２】
本明細書中で使用する「発光」との用語は、生物発光（すなわち、生きている生物により発生した光）、化学発光（化学反応が進行するときに発生した光）および電気化学発光を含む。関与している酵素が、光を発生する目的のために、自然な選択により生物中で進化したとき、または関与した酵素が、このような酵素の変異誘導体であるとき、これらの発光反応はまた、「生物発光反応」とも呼ばれ、関与した酵素はまた、「生物発光酵素」とも呼ばれる。例には、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ、Ａｅｑｕｏｒｉｎルシフェラーゼ、Ｏｂｅｌｉｎ発光タンパク質などがある。
【００３３】
「発光アッセイ」（「ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ａｓｓａｙ」）または「発光アッセイ」（「ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ」）との用語は、分析物の存在に基づいて光を発生する任意のアッセイを含む。このようなアッセイには、１種またはそれ以上のルシフェラーゼ酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼなど）を使用するアッセイが挙げられる。
【００３４】
本明細書中で使用する「発光源酵素」との用語には、光を発生するか光の発生を引き起こす反応を触媒する酵素が挙げられる。例えば、この用語は、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ、Ａｅｑｕｏｒｉｎ発光タンパク質、Ｏｂｅｌｉｎ発光タンパク質などが挙げられる。
【００３５】
本明細書中で使用する「発光源分子」との用語は、化学反応によって光を生じることができる分子（例えば、ルシフェリン、セレンテラジン、またはそれらの機能性アナログ）を意味する。一般に、発光源分子は、高エネルギー分子種（例えば、安定化ジオキセタン）であるか、または化学反応による高エネルギー分子種に形質転換されるか、いずれかである。この化学反応は、通常、酸素、超酸化物または過酸化物により酸化である。各場合、この発光源分子内のエネルギーは、この化学反応により放出される。このエネルギーの少なくとも一部は、光の光子として放出されるものの、このエネルギーはまた、他の形状（例えば、熱）で放出できる。光を生じない発光源分子は、代替様式（これは、しばしば、「暗黒経路」と呼ぶ）によって、それらのエネルギーを分散する。
【００３６】
本明細書中で使用する「酵素に結合していない発光源分子」との用語は、酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼなど）に結合していない発光源分子であって光を生じる反応を触媒するものを含む。
【００３７】
本明細書中で使用する「酵素に結合した発光源分子」との用語は、酵素に結合した発光源分子であって、光を発生する反応を触媒するものを含む。
【００３８】
本明細書中で使用する「分析物の存在に依存した発光」または「分析物に依存した発光」との用語は、分析物が関与した化学反応から生じる発光だけでなく、直接または間接のいずれかで分析物の存在に関連した発光を含む。
【００３９】
本明細書中で使用する「分析物に存在に依存しない発光」または「分析物に依存しない発光」との用語は、発光源基質の自動発光により生じる発光だけでなく、アッセイ混合物中に存在している無関係の発光源分子から生じる発光を含む。
【００４０】
本明細書中で使用する「クエンチ」との用語は、発光反応からの光子の収率を低下させることを意味する。この用語は、分析物が検出されるか検出できるのを防止することを含み、直接的または間接的のいずれかで起こり得る。反応をクエンチするのに使用できる試薬は、「クエンチ試薬」として知られている。
【００４１】
出願人は、分析物に依存しない発光を減少させる有機化合物の存在下にて発光アッセイを実行することにより、発光アッセイの感度を高めることが可能であることを発見した。この発見は、予想外である。本明細書中に記載される手順に類似した手順を使用すると、当業者は、発光アッセイの感度を高めるのに適当な化合物を同定できる。この化合物の構造は、発光アッセイの感度を高めることができるという条件で、重要ではない。
【００４２】
特に、出願人は、イオウ原子またはセレン原子を含有する化合物が発光アッセイの感度を高めるのに有用であることを発見した。セレン原子またはイオウ原子を含有する化合物の残りの構造は、その構造が化合物の機能を妨害しないという条件で、重要ではない。好ましい化合物は、本発明で使用する濃度で、低い毒性を有し、安価に保存、輸送または廃棄できる。
【００４３】
適当な化合物には、有機化合物（すなわち、１個またはそれ以上の炭素原子を含有する化合物）が挙げられる。適当な有機化合物は、炭素−イオウ結合または炭素−セレン結合を含有でき、例えば、適当な有機化合物は、炭素−イオウ二重結合（Ｃ＝Ｓ）、炭素−セレン二重結合（Ｃ＝Ｓｅ）、炭素−イオウ単結合（Ｃ−Ｓ）または炭素−セレン単結合（Ｃ−Ｓｅ）を含有できる。適当な有機化合物はまた、炭素が結合したメルカプト基（Ｃ−ＳＨ）または２個の炭素原子に結合したイオウ原子（Ｃ−Ｓ−Ｃ）を含有できる。好ましい化合物は、天然で親油性である。
【００４４】
炭素−イオウ二重結合または炭素−セレン二重結合を含有する適当な化合物には、式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、
【００４５】
【化３】
ここで、Ｘは、ＳまたはＳｅであり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲａＲｂであるか、またはＲ１またはＲ２は、それらが結合した炭素原子と一緒になって、５員、６員、７員または８員の飽和または不飽和環を形成し、この環は、炭素を含有し、必要に応じて、オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）または窒素（−ＮＲｃ−）から選択された１個、２個または３個のヘテロ原子を含有し、ここで、この環は、必要に応じて、１個、２個または３個のハロ、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールで置換され、そしてＲａ、ＲｂおよびＲｃは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃの（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルが、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１個、２個、３個または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、またはヘテロアリールで置換され；そして、ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、１個以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４６】
メルカプト基を含有する適当な化合物には、式Ｒ３ＳＨの化合物またはその塩が挙げられ、ここで、Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、Ｒ３の任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｄＲｅであり、ここで、ＲｄおよびＲｅは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールで置換され、ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上（１個、２個、３個または４個）のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４７】
他の適当な化合物には、例えば、式Ｒ４ＮＣＳの化合物またはその塩が挙げられ、ここで、Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、Ｒ４の任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｆＲｇで置換され、ここで、ＲｆおよびＲｇは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上（１個、２個、３個または４個）のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４８】
炭素−セレン単結合または炭素−イオウ単結合を含有する他の適当な化合物には、式Ｒ５−Ｘ−Ｒ６の化合物またはその塩が挙げられ、 Ｘは、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、 Ｒ５は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、そしてＲ６は、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであるか、 またはＲ５およびＲ６は、Ｘと一緒になって、ヘテロアリールを形成し、 ここで、Ｒ５またはＲ６の任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｋＲｍで置換され、
ここで、ＲｋおよびＲｍは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールであり、そして
ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４９】
基、置換基または範囲について以下で挙げた特定の好ましい値は、例示の目的のためのみである；それらは、これらの基および置換基について、規定した値とは別の値または規定した範囲外の値を除外するものではない。
【００５０】
具体的には、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級ブチル、ペンチル、３−ペンチルまたはヘキシルであり得る；（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルであり得る；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシとは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、第二級ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシまたはヘキシルオキシであり得る；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルは、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニルまたは５−ヘキセニルであり得る；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニルまたは５−ヘキシニルであり得る；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルは、アセチル、プロパノイルまたはブタノイルであり得る；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニルまたはヘキシルオキシカルボニルであり得る；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイルオキシは、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、イソブタノイルオキシ、ペンタイルオキシまたはヘキサノイルオキシであり得る；アリールは、フェニル、インデニルまたはナフチルであり得る；そしてヘテロアリールは、フリル、イミダゾリル、トリアゾリル、トリアジニル、オキサゾイル、イソキサゾイル、チアゾイル、イソチアゾイル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、テトラゾリル、ピリジル（またはそのＮ−酸化物）、チエニル、ピリミジニル（またはそのＮ−酸化物）、インドリル、イソキノリル（またはそのＮ−酸化物）またはキノリル（またはそのＮ−酸化物）であり得る。
【００５１】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲａＲｂであり得る；ここで、ＲａおよびＲｂは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである；ここで、Ｒ１、Ｒ２、ＲａおよびＲｂの任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個または２個のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールで置換される；ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００５２】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリールまたはＮＲａＲｂであり得る。
【００５３】
具体的には、Ｒ１またはＲ２は、それらが結合した炭素原子と一緒になって、５員または６員の飽和または不飽和環を形成し得、この環は、炭素を含有し、必要に応じて、オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）または窒素（−ＮＲｃ−）から選択された１個または２個のヘテロ原子を含有し、ここで、この環は、必要に応じて、１個、２個または３個のハロ、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールで置換される；ここで、Ｒｃは、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである；ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲｃの任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールで置換されている；そして任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換されている。
【００５４】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、ＮＲａＲｂであり得る；ここで、ＲａおよびＲｂは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールである；ここで、任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、アリールまたはヘテロアリールで置換されている；そして任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換されている。
【００５５】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノまたは４−チアゾイルアミノであり得る。
【００５６】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、アミノ、メチル、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノまたは４−チアゾイルアミノであり得る。
【００５７】
Ｒ３の特定の値は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルであり、これは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｄＲｅで置換されている。
【００５８】
Ｒ３の特定の値は、２−アミノエチル、２−アミノ−２−カルボキシエチルまたは２−アシルアミノ−２−カルボキシエチルである。
【００５９】
Ｒ４の特定の値は、アリールであり、これは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換されている。
【００６０】
具体的には、Ｒ５は、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである；そしてＲ６は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである。
【００６１】
具体的には、Ｒ５およびＲ６は、Ｘと一緒になって、ヘテロアリールを形成する。
【００６２】
好ましい有機化合物は、１個またはそれ以上のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含有するポリペプチドおよびタンパク質を含まない。
【００６３】
好ましい有機化合物は、１個またはそれ以上のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含有する化合物を含まない。
【００６４】
好ましい有機化合物は、図４で示すような式１〜１１の化合物である。好ましい化合物は、チオ尿素である。
【００６５】
上記化合物は、企業から入手できるか、または合成化学の分野で公知の手順を使用して、市販の出発物質から調製できる。例えば、Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４版、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２を参照せよ。
【００６６】
化合物が安定な塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合、本発明の方法で塩としてこれらの化合物を使用することは、適当であり得る。適当な塩の例には、有機酸付加塩、例えば、トシラート、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびα−グリセロリン酸塩が挙げられる。適当な無機塩もまた形成され得、これらは、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩および炭酸塩が挙げられる。
【００６７】
塩は、当該技術分野で周知の標準的な手順を使用して、例えば、十分な塩基性化合物を適当な酸と反応させることにより、得ることができる。アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩もまた、使用できる。
【００６８】
本明細書中で記述した化合物は、本発明の方法に従って使用するとき、このアッセイの感度を高める任意の濃度で、発光反応に存在できる。所定の化合物の最適濃度は、使用する発光試薬、および所定のアッセイを実行する特定の条件に依存している。しかしながら、適当な濃度は、当該技術分野で利用できる標準的な技術を使用して、決定できる。
【００６９】
具体的には、このアッセイの感度を高めることができる化合物は、少なくとも約０．１μＭの濃度、または少なくとも約０．１ｍＭの濃度で、発光反応に存在できる。さらに具体的には、この化合物は、約０．１μＭ〜約５００ｍＭ（これらの値を含めて）の範囲、または約１μＭ〜約２５０ｍＭ（これらの値を含めて）の範囲の濃度で、この発光反応に存在できる。好ましくは、この化合物は、約１０μＭ〜約１００ｍＭ（これらの値を含めて）の範囲の濃度で存在している。
【００７０】
具体的には、このアッセイは、細胞全体の存在下にて、実行できる。
【００７１】
具体的には、このアッセイは、少なくとも約１０％の水を含有する溶媒中にて、実行できる。さらに具体的には、本発明は、少なくとも約２５％の水、または少なくとも約４０％の水を含有する溶媒中にて、実行できる。
【００７２】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、分析物に依存しない発光は、ある化合物の存在下にて、少なくとも約１０倍だけ、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍だけ、少なくとも約５０倍だけ、または少なくとも約１００倍だけ減少するのに対して、分析物に依存した発光は、約７倍未満だけ、約５倍未満だけ、約３倍未満だけ、または約２倍未満だけ減少する。例えば、この化合物の存在下では、５の相対光ユニット値が生じたのに対して、この化合物の非存在下では、１００の相対光ユニット値が生じ、このことは、この化合物の存在下では、発光が２０倍だけ減少することを示している。
【００７３】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、酵素に結合していない発光源分子により発生した発光は、少なくとも約１０倍、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ減少するのに対して、酵素に結合した発光源分子により発生した発光は、約７倍未満、約５倍未満、約３倍未満または約２倍未満だけ、減少する。酵素に結合した発光源分子により発生した発光は、好ましくは、酵素に結合していない発光源分子により発生した発光での倍率減少よりも低い倍率だけ、減少する。
【００７４】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、内部ルミネセンスは、少なくとも約１０倍だけ、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍だけ、少なくとも約５０倍だけ、または少なくとも約１００倍だけ減少するのに対して、分析物の存在に依存した発光は、約７倍未満だけ、約５倍未満だけ、約３倍未満だけ、または約２倍未満だけ、減少する。分析物の存在に依存した発光は、好ましくは、内部ルミネセンスでの倍率減少よりも低い倍率だけ減少する。
【００７５】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、イオウ原子またはセレン原子を含有する化合物の存在下にてアッセイを実行するとき、分析物に依存していない発光は、少なくとも約１０倍だけ、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍だけ、少なくとも約５０倍だけ、または少なくとも約１００倍だけ、減少する。
【００７６】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、イオウ原子またはセレン原子を含有する化合物の存在下にてアッセイを実行するとき、分析物に依存した発光は、約７倍未満だけ、約５倍未満だけ、約３倍未満だけ、または約２倍未満だけ、減少する。
【００７７】
本発明のキットには、その酵素基質、酵素および化合物が、別個の容器に含有できるか、または単一容器に含有できる。このキットは、必要に応じて、発光アッセイで使用するのに適当な緩衝液、酵素基質または酵素を含有でき、この緩衝液は、必要に応じて、単一容器に含有できる。さらに、この化合物および緩衝液は、必要に応じて、単一容器に含有できる。これらのキットはまた、必要に応じて、第二基質（例えば、ホタルルシフェラーゼまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ用の基質）、または発光酵素反応用の消光試薬を含有できる。これらのキットはまた、必要に応じて、ＡＴＰを含有できるか、または必要に応じて、発光酵素用の発光源基質および発光源酵素の両方を含有できる。
【００７８】
ある化合物が発光アッセイの感度を高める性能は、当該技術分野で周知のアッセイを使用して、または以下の実施例で記述したアッセイを使用して、決定できる。
【００７９】
本明細書中で同定した化合物は、発光アッセイの感度を高めるのに有用であることが明らかとなった。これらの化合物は、中間体ジオキセタン環の分解から生じる発光を減少させるのに、特に有用である。それゆえ、発光アッセイ（例えば、生物発光アッセイ、化学発光アッセイまたは電場発光アッセイ）の感度を高めるのに有用であることに加えて、これらの化合物はまた、中間体オキセタン環などを含む他のシステムでの発光を減少するのに有用である。
【００８０】
本発明は、今ここで、以下の非限定的な実施例により説明する。化合物１〜１１（図４）は、企業から容易に入手できる。
【実施例】
【００８１】
（実施例１．アッセイ感度の改良）
代表的な有機化合物（「化合物」）が発光アッセイ感度を高める性能を評価する実験を、フォーマットＡおよびフォーマットＢで下記の条件下にて、実行した。発光アッセイ感度の改良は、これらの化合物が、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの存在下にて、分析物に依存した発光（すなわち、セレンテラジン）を少なくするか最小にしつつ、分析物に依存していない発光（これは、セレンテラジンの酸化により生じる）を減少する性能により、証明される。本明細書中では、その対象分析物が存在しているときの発光の倍率減少が、対象分析物が存在していないときの発光の倍率減少よりも低くなることが証明されている。その酵素発光測定は、内部ルミネセンス成分を有し得る。
【００８２】
実際、本明細書中で記述した実験の大部分では、試験される化合物が存在しているとき、この酵素発光測定の増加を観察した。内部ルミネセンスは、これらの化合物の内部ルミネセンスに対するさらに顕著な効果を観察するために、典型的には、非常に低いので、内部ルミネセンスは、清浄剤を添加することにより、そのｐＨを高めることにより、過酸化水素を添加することにより、ＤＭＳＯを添加することにより、ＢＳＡを添加することにより、または硫化水素ナトリウムを添加することにより、向上した。
【００８３】
（フォーマットＡ）
Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（ＳＧ）およびＳｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｓ＋Ｇ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の存在下にて、アッセイを実行した。１５０μｌの全反応容量は、以下からなっていた：
５０μｌのＦ−１２（Ｈａｍ）媒体＋１ｍｇ／ｍｌゼラチン（酵素１と共にまたは酵素なし）
５０μｌのＳ＋Ｇ（基質を含有する２）
５０μｌのＳＧ。
【００８４】
１約２．５ｎｇ／媒体５０μｌの濃度まで、１％ゼラチンを含有するＦ−１２細胞培地に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ酵素を添加した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼが存在しないときの反応により、この化合物の内部ルミネセンスに対する効果が明らかになるのに対して、酵素の存在下での反応により、この化合物のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ触媒発光に対する効果が明らかとなる。
【００８５】
２このＳ＋Ｇ試薬を、業者の説明書に従って調製したが、但し、これらの実験では、通常のものより３倍濃縮したＳ＋Ｇ溶媒を使用して、このＳ＋Ｇ基質を再懸濁した。これらの条件下にて、このＳ＋Ｇ中では、飽和状態に達するのに、基質に対して、さらに高い濃度のセレンテラジンが必要であった。
【００８６】
試験する化合物を、（１×）のＳＧまたはＳ＋Ｇの最終濃度まで、ＳＧまたはＳ＋Ｇのいずれかで、再懸濁した。この化合物を、１５０μｌの全容量での最終濃度が表１で列挙したものとなるように、この化合物を添加し、その試薬を、最終５０μｌまで、水で希釈した。対照として、このＳＧまたはＳ＋Ｇを、対象化合物を溶解するのに使用する溶媒または水で、５０μｌにした。例えば、もし、ある化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解する必要があったなら、その対照反応物に、等量のＤＭＳＯを添加した。他に指示がなければ、これらの化合物を、まず、水に溶解した。試験する化合物を、このＳＧまたはＳ＋Ｇの代わりに、この反応物の媒体部分に直接添加することにより、同じ結果を得ることができる。
【００８７】
特定の化合物の各濃度に対して、４つの反応に十分な量でこれらの成分の全て（すなわち、２００μｌの媒体、２００μｌのＳＧ、２００μｌのＳ＋Ｇ）を含有する混合物を構築した。この混合物から、９６ウェルプレート上の３つのウェルに、１５０μｌを分配した。あるいは、時には、５０μｌ部分の各々を添加して混合することにより、このプレートの各ウェルにおいて、反応物を構築した。このプレートを２２℃インキュベートし、５分後、Ｄｙｎｅｘプレート照度計を使用して、その発光を測定した（１ウェルあたり、１秒の測定）。
【００８８】
（フォーマットＢ）
下記のように、標準ＭＢ組成物または変性ＭＢ組成物のいずれかとして、１５０μｌのＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ（本明細書中では、ＭＢと呼ぶ）の反応容量で、実験を実行した。フォーマットＡと同様に、これらの有機化合物のアッセイ感度に対する効果を観察するために、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを使ってまたはそれなしでの反応を実行した。これらの反応成分（例えば、酵素、基質、清浄剤、および処理する化合物）を添加できるようにするために、この反応は、以下のようにして、３部分で構築した：
５０μｌのＭＢ（酵素３ありまたはそれなしで）
５０μｌのＭＢおよびセレンテラジン（清浄剤４ありまたはそれなしで）
５０μｌのＭＢ（化合物５ありまたはそれなしで）
３約２．５ｎｇ／緩衝液５０μｌの濃度まで、１×ＭＢに、酵素を添加した。
【００８９】
４清浄剤は、自動発光のレベルを高めることが知られている。完全性ついては、これらの化合物の自動発光および酵素発光に対する効果は、清浄剤の存在下および不在下で評価した。
【００９０】
１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９、１％消泡剤（最終反応物中で０．３３％）の濃度で、清浄剤を使ってまたはそれなしで、２×ＭＢを使用して１×ＭＢを作製した。この部分に、清浄剤を使ったバージョンでは１８０μＭの濃度で、そして清浄剤なしのバージョンでは６０μＭの濃度で、セレンテラジンを添加した。これらの基質レベルは、飽和状態に達するのに必要である。
【００９１】
注記：他の清浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−０８（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９を使って得たものと類似の効果があることが分かった。
【００９２】
５種々の濃度で試験する化合物および水を使って、２×ＭＢを使用して１×ＭＢを作製した。対照には、水だけを使うか、または水および試験する化合物を溶解するために使用する溶媒を添加して、１×ＭＢを作製した。例えば、試験する化合物をＤＭＳＯに溶解する場合、この対照ＭＢ試料には、同じ量のＤＭＳＯだけを添加した。
【００９３】
１×Ｍａｔｔｈｅｗ緩衝標準組成物は、以下からなる：
１００ｍＭのリン酸カリウム
５００ｍＭの塩化ナトリウム
１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
ｐＨ７．４。
【００９４】
このＢＳＡは、酵素安定剤として機能し、この標準ＭＢ組成物中では、セレンテラジンの自動発光を高めるが、清浄剤が存在しているときに発生する自動発光の程度までは高めない。この清浄剤だけで高められた自動発光を観察するために、大部分の実験には、０．１５ｍｇ／ｍｌまたは０．４５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、この酵素安定剤として、ＢＳＡの代わりにブタゼラチンを使用した。このフォーマットにこれらの改変物の全てを考慮すると、４つの異なるバージョンに再分割できる。
【００９５】
Ｂ１ ＢＳＡ／清浄剤
Ｂ２ ＢＳＡ／清浄剤なし
Ｂ３ ゼラチン／清浄剤
Ｂ４ ゼラチン／清浄剤なし。
【００９６】
これらの５０μｌ部分の各々をマイクロタイタープレートウェルに添加し、そして混合することによって、反応を３連で実行した。１ウェルあたりで得られる相対光ユニットを、直ちに、Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒／ウェル）を使用して測定したか、あるいは、このプレートを２２℃でインキュベートし、同じ様式で、５分後に読み取った。
【００９７】
以下の表１の結果は、以下のように示す：
ａ）この化合物の非存在と比較したときの、この化合物の存在下での非酵素的自動発光測定での減少倍率、および
ｂ）この化合物だけがない対照試料と比較したときの、この化合物の存在下での酵素的発光測定に対する化合物の効果。
【００９８】
例えば、「７．４倍減少した」結果とは、この化合物の存在下での発光測定値が、この化合物の非存在下での発光測定値よりも７．４倍少ないことを意味する。全ての場合、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの存在とは無関係の発光（自動発光）の減少倍率は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの存在と関連した発光での減少倍率よりも大きかった。それゆえ、これらの化合物は、その分析物の酵素活性とは無関係の発光を、この分析物の酵素活性と関連した発光よりも高い程度まで減少させる。
【００９９】
（表１.化合物の素性については図４を参照。）
フォーマットの概説：
Ａ 媒体：Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ：Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ
Ｂ１ ＢＳＡおよび清浄剤を含むＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂ２ ＢＳＡを含むが清浄剤を含まないＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂ３ ゼラチンおよび清浄剤を含むＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂ４ ゼラチンを含み清浄剤を含まないＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
【０１００】
【表１】
（実施例２．他の基質により発生した自動発光の減少）
天然セレンテラジン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から発生した自動発光に対する代表的な化合物の効果を見ることに加えて、他の基質により発生した自動発光に対する代表的な化合物の効果を研究した。セレンテラジン類似物Ｎ、Ｆ、Ｈ、ＨＰＣおよびＣＰは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｏｒｅｇｏｎから得た。Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼは、ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから得た。Ｂｅｅｔｌｅルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから得た。これらの化合物のさらに著しい効果を調べるために、Ｍａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ中のＤＭＳＯまたは清浄剤（１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９／１％ Ａｎｔｉｆｏａｍ（登録商標））を添加することにより、実施例１で記述したようにして、自動発光を高めた。また、Ｈ２Ｏ２を添加することにより、または天然セレンテラジンを含有する反応物のｐＨを高めることにより、自動発光を高めた。実験条件は、フォーマットＣ下で分類し、以下のようにして再分割した：
Ｃ１ ＤＭＳＯ中の代替基質
１ウェルあたり、以下からなる物質１００μｌ：
９４μｌのＤＭＳＯ
３ｍＭ（３０μＭの最終基質濃度）での基質１μｌ
水に溶解した化合物または対照としての水５μｌ
Ｃ２ 清浄剤を含むＭＢ中の代替基質
１ウェルあたり、以下からなる物質１００μｌ：
ＢＳＡおよび清浄剤に代えてゼラチンと共にＭＢ（９４μｌ）
３ｍＭ（３０μＭの最終基質濃度）での基質１μｌ
水に溶解した化合物または対照としての水５μｌ
Ｃ３ ＢＳＡを含むＭＢ（ｐＨ９）
１ウェルあたり、以下からなる物質１００μｌ：
ＭＢ（９０μｌ）（ｐＨ９、３０μＭのセレンテラジン、清浄剤は存在しな
いこと以外は標準組成）
３０．７％でのＨ２Ｏ２（５μｌ）（最終濃度１．５％）
水に溶解した化合物または対照としての水５μｌ。
【０１０１】
マイクロタイタープレートウェルに各成分を添加して混合することにより、反応を３連で実行した。その光の出力は、直ちに、Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒／ウェル）を使用して測定した。結果は、表２で示す。
【０１０２】
（表２）
【０１０３】
【表２】
（実施例３、化学発光基質ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびルミノールにより発生した発光の減少）
ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）またはルミノールを含有する化学発光反応物に対する代表的な化合物の効果を測定した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）は、安定化された１，２−ジオキセタン化学発光酵素基質（高エネルギー発光源分子）であり、溶液および膜ベースアッセイにおいて、アルカリホスファターゼおよびアルカリホスファターゼ結合体の検出において使用した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）は、Ｔｒｏｐｉｘ ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから得た。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）基質は、アルカリホスファターゼで活性化するとき、光信号を発生する。アルカリホスファターゼは、この基質を脱リン酸化して、アニオンが生じ、これは、その長寿命のために蓄積する。その最終的な光の発生には、このアニオンの分解が関与しているので、一定信号出力に先立って遅延が起こり、光の白熱が生じ、これは、数時間から数日にわたって続く。ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ（ｄｉｄｙｄｒｏ）−１，４−フタラジンジオン）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから得た。ルミノールは、広く使用されている化学発光試薬であり、これは、酸化が起きると発光する。実験条件は、フォーマットＤで分類し、以下のようにして再分割する：
（Ｄ１ ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋水中のチオ尿素）
マイクロタイタープレートウェルでは、以下で列挙した種々の量のＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）試薬を水中の代表的な化合物（または対照として水のみ）と混合し、先に記述したように、照度計で測定した（１秒／ウェル）。
【０１０４】
５０％ ５０μｌのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋５０μｌの０．５Ｍチオ尿素（２５０ｍＭのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）最終濃度）
７５％ ７５μｌのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋２５μｌの０．５Ｍチオ尿素（１２５ｍＭのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）最終濃度）
９５％ ９５μｌのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋５μｌの０．５Ｍチオ尿素（２５ｍＭのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）最終濃度）。
【０１０５】
（Ｄ２ 未希釈のＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標））
１０ｍＭの濃度で、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）試薬に、チオ尿素を直接溶解した。対照反応物は、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）試薬だけ（１ウェルあたり１００μｌ）を含有しており、ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒の読み／ウェル）で、光出力を測定した。
【０１０６】
０．２８ｐｇのアルカリホスファターゼを含有する平行ウェルもまた、測定して、そのＣＤＰ−Ｓｔａｒの完全性およびそれらの条件での活性をモニターした。
【０１０７】
（Ｄ３ ルミノール）
ルミノールを含有する溶液をＨ２Ｏ２と接触したとき、化学発光が起こる。このルミノール反応に対するチオ尿素の効果を、マイクロタイタープレートで構築した以下の反応物について、測定した：
５０μｌのルミノール溶液６
４５μｌの０．００１５％または０．０００１５％Ｈ２Ｏ２
５μｌの０．５Ｍチオ尿素（２５ｍＭの最終濃度）または対照としての水
６１００ｍｌあたりのルミノール溶液：
０．４ｇｍの炭酸ナトリウム
０．０２ｇｍのルミノール
２．４ｇｍの重炭酸ナトリウム
０．０５ｇｍの炭酸アンモニウム
０．０４ｇｍの硫酸銅（ＩＩ）５水和物
１００ｍｌまでの蒸留水
ｐＨ９．０
得られた発光を、直ちに、Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒の読み／ウェル）を使用して測定した。それらの結果は、表３で示す。このデータは、チオ尿素がＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびルミノールの両方の化学発光反応に作用して自動発光を減少させることを証明している。
【０１０８】
（表３）
【０１０９】
【表３】
＊アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含有させて平行反応を行い、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の安定性に対するチオ尿素の効果をモニターした。ＡＰを含有する反応物もまた、その発光出力を減少させたが、その規模は、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）だけのものよりも小さかった。このＡＰ反応物は、チオ尿素の存在下にて、１．４倍減少させた。
【０１１０】
（実施例４．セレンテラジンで誘導した発光に対するｐＨの効果）
以下の実験を実行して、チオ尿素が種々のｐＨ値で自動発光を減少させる能力を決定した。
【０１１１】
２×濃度（実施例１で記述した標準処方）で、Ｍａｔｔｈｅｗ緩衝液を作製し、数個のアリコートに分割した。アリコートを、１ｐＨ単位ずつ、ｐＨ４からｐＨ９まで調節した。各ｐＨに対して、１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９／１％消泡剤（「清浄剤」と呼ぶ）を使ってまたはそれなしで、および３ｍＭのチオ尿素を使ってまたはそれなしで、この緩衝液の異形を作製した。清浄剤を使うバージョンには、１８０ｍＭの濃度まで、そして清浄剤を使わないバージョンには、６０ｍＭの濃度まで、セレンテラジンを添加した。次いで、これらの緩衝液を、水で、１×の最終濃度にした。
【０１１２】
各反応物の１５０μｌアリコートを、３連でマイクロタイタープレートウェルに分配し、そのプレートを２２℃でインキュベートした。５分後、先に記述したように、プレート照度計を使用してその発光を測定し（１ウェルあたり１秒）、それらの結果を、以下の表に示す：
【０１１３】
【表４】
これらの結果は、この緩衝液のｐＨを上げることがセレンテラジン自動発光を高めることを証明している。３ｍＭのチオ尿素を添加すると、高いｐＨでも、自動発光を効果的に減少させる。
【０１１４】
（実施例５．全細胞アッセイでの自動発光の減少）
細胞生存度に対する有機化合物の効果を決定するために、そしてこのような化合物が生細胞の存在下にて自動発光を減少する能力を決定するために、以下の実験を実行した。ヒト胎児腎臓細胞（２９３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ＋）遺伝子を安定に発現する細胞株を発生させた。この安定な細胞株は、ｐＣｌ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用して、Ｌｕｃ＋遺伝子をＸｂａＩ部位とＳａｌＩ部位との間に挿入して作製した。標準的な方法を使用して、この安定な細胞株を調製し、１０％ＦＢＳおよび０．１５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ培地の存在下にて、マイクロタイタープレートのウェル中で形質転換した細胞を成長させた。実験目的のために、９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して、細胞の二連のプレートを調製した。一方のプレートを使用して生存度を検査し、他方のプレートを使用して自動発光に対する効果を試験した。
【０１１５】
これらの有機化合物の細胞生存度に対する効果を検査するために、この培地を細胞から除去して、ホタルルシフェラーゼ用の基質、コガネムシルシフェラーゼおよび有機化合物を種々の濃度で含有する培地で置き換えた。この細胞内に既に含有されたＡＴＰ酸素およびルシフェラーゼ酵素と共に、その細胞膜を横切るルシフェラーゼの受動拡散により、光が発生する。易感染性の細胞または損傷した細胞では、細胞内ＡＴＰ濃度は急速に枯渇するのに対して、そのホタル発光は減少する。その発光レベルを、ルシフェリンのみを含有する対照と比較して、細胞生存度の指標として、これらの化合物の光出力に対する効果（もしあれば）を確認した。
【０１１６】
これらの有機化合物が自動発光を減少させる能力を決定するために、これらの細胞から培地を除去し、種々の濃度の化合物およびセレンテラジンを含有する培地で置き換えた。これらの細胞中で発現しているＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ酵素は存在しないので、観察された唯一の発光は、自動発光である。自動発光のレベルを、セレンテラジンだけを含有する対照と比較して、これらの化合物が自動発光を減少させる効果を確認した。
【０１１７】
そのマイクロタイタープレートの半分は、細胞を含有していなかった。これらのウェルに、その細胞対応物に関して同じ試薬を添加して、細胞に依存していない発光（すなわち、背景発光）を測定した。これらの試薬（種々の濃度で化合物を使うかそれなしで、ルシフェリンまたはセレンテラジンを有する培地）を、以下のようにして調製した：
ａ）ホタル発光（細胞生存度）を検査する試薬
まず最初に、１００ｍＭストックとして、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡから入手可能なルシフェリン基質を調製した。このルシフェリンストックを使用して、２ｍＭルシフェリンの最終濃度を含むＤＭＥＭ溶液を作製した。
【０１１８】
この溶液（ＤＭＥＭ／ルシフェリン）に、３０ｍＭの最終濃度になるまで、チオ尿素および１−アリル−３−（２−ヒドロキシエチル）−２−チオ尿素を直接溶解した。これらを、引き続いて、１０ｍＭおよび１ｍＭの最終化合物濃度を含むように、希釈した。
【０１１９】
７５０ｍＭストックとして、ＤＭＳＯに、別の化合物である６−アザ−チオ−チミジンを溶解した。この６−アザ−チオ−チミジンを、引き続いて、３０ｍＭ、１０ｍＭおよび１ｍＭの最終濃度で、このＤＭＥＭ／ルシフェリン試薬に添加し、その間、４％の最終ＤＭＳＯ濃度を維持した。この化合物の効果と比較する対照として、ＤＭＥＭ／ルシフェリン試薬を使用し、そして４％の最終ＤＭＳＯ濃度を含むように作製した。
【０１２０】
ＤＭＳＯは、有機分子が細胞膜を浸透するのを助け得ると考えられているので、ＤＭＳＯ（４％）中で再構成したチオ尿素（１０ｍＭ）からなる追加対照を含有させた。
【０１２１】
ｂ）自動発光の減少を検査する試薬
まず最初に、３０ｍＭストックとして、Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｖｅｎｔに、セレンテラジン基質を溶解した（共に、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）。このセレンテラジンストックを使用して、その最終濃度として０．６ｍＭセレンテラジンを含有するＤＭＥＭ培地を作製した。ａ）で記述したＤＭＥＭ／ルシフェリン試薬と同じ様式で、ＤＭＥＭ／セレンテラジン試薬を作製した。
【０１２２】
その細胞培地を細胞から除去して、基質（＋／−化合物）を含有する培地で置き換え、直ちに、発光を測定した。細胞を含有するウェルから得られた全ての発光値を、対応する発光値を使用して、細胞を含有しないウェルから背景を差し引いた。マイナス化合物対照での背景控除自動発光を、これらの化合物を含有する背景控除自動発光で割ることにより、自動発光の減少倍率を計算した。代表的な化合物の結果を、以下の表で示す。
【０１２３】
【表５】
これらの結果は、これらの化合物が細胞の生存度を著しく低下させることなく全細胞を使用する発光アッセイでの自動酸化を減少するのに使用できることを証明している。
【０１２４】
全ての刊行物、特許および特許文献は、個々に参考として援用されているように、本明細書中で参考として援用されている。本発明は、種々の特定の好ましい実施形態および技術を参照して、記述されている。しかしながら、本発明の精神および範囲内に留めつつ、多くの変更および改良を行うことができることが理解できるはずである。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、細胞生物学および分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、発光アッセイ測定の感度を高める方法、組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
レポーター分子は、通常、生物学、生化学、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野において、分子事象をモニターするのに使用されている。例えば、レポーター分子は、そのレポーター分子のレベルがレポーター分子に結合した特定のプロモーターからの転写に起因するアッセイで使用されている。これらのアッセイは、真核生物の遺伝子発現、レセプタ活性、転写因子、細胞内情報伝達、ｍＲＮＡプロセシング、タンパク質折り畳みなどを研究するために使用できる。このようなアッセイで典型的に使用されるレポーター分子には、放射性同位元素、蛍光剤、酵素および発光剤が挙げられる。例えば、Ａｋｈａｖａｎ−ＴａｆｔｉらのＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを参照。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９９４年９月、Ｃａｍｐｂｅｌ，Ｋｒｉｃｋａ，Ｓｔａｎｌｅｙ共著、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４。
【０００３】
アッセイシステムで特に有用な２種の発光酵素には、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）およびＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼがある。これらのルシフェラーゼ用の基質およびそれらを生成する反応は、図１および２で示されている。この反応で発生する光の量（すなわち、光子数）は、測定でき、この反応における発光酵素濃度を計算するのに使用できる。
【０００４】
ホタルルシフェラーゼは、６１ｋＤａの単量体タンパク質であり、これは、酵素活性のための翻訳後プロセッシングを必要としない。それゆえ、それは、翻訳するとすぐに遺伝子レポーターとして機能する。光子発光は、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋およびＯ２を必要とする反応でのコガネムシルシフェラーゼの酸化により、達成される（図１）。
【０００５】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、３６ｋＤａの単量体タンパク質であり、これは、その天然源であるＲｅｎｉｌｌａレニホルミス（ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から精製したとき、３％炭水化物から構成される。ホタルルシフェラーゼと同様に、その活性には、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの翻訳後修飾は必要ではなく、それは、翻訳直後、遺伝子レポーターとして機能する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼにより触媒される発光反応は、Ｏ２を利用し、腔腸動物−ルシフェラーゼもまた、セレンテラジンと呼ばれる（図２）。
【０００６】
発光反応は、非常に少量の特定の分析物を検出するのに使用でき、その基質は、分析において同定され測定される。例えば、発光反応は、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グリコシダーゼ、および種々の代謝物（例えば、ＡＴＰまたはＮＡＤＨ）を検出し定量するのに使用できる。発光反応はまた、結合相互作用（例えば、抗体およびヌクレオチドプローブにより媒介されるもの）により、分析物を検出し定量するのに使用できる。典型的には、発光反応は、試料中の１×１０−１６モル未満の分析物、しばしば、１×１０−１９モル未満の分析物を検出するのに使用できる。発光では、一般的に検出される分析物は、ルシフェラーゼ、特に、ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼである。最も多くの場合、これらの分析物は、遺伝子発現およびタンパク質合成により、それらの作成に付随した現象を定量するのに使用される。分析物として使用される他の発光酵素には、エクオリン、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、および他の海洋ルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
分析物を測定する発光を使用するとき、この分析物の存在に依存しない反応により、殆どまたは全く光を生じないことが好ましい。これは、ホタルルシフェラーゼを使う場合である。典型的なホタルルシフェラーゼアッセイ条件下では、ルシフェラーゼは、このホタルルシフェラーゼが存在しないとき、検出できない。ホタルルシフェラーゼを使用するアッセイとは対照的に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼが存在しないとき、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイシステムでは、一般に、光は検出できない。発光酵素の触媒活性に依存しない発光は、自動発光と呼ぶ。例えば、自動発光は、発光源基質セレンテラジンの自然酸化により、引き起こすことができる。
【０００８】
分析物（例えば、自動発光）の存在に依存しない発光は、その分析物の活性から生じる光の量を正確に測定する性能を低下させることにより、分析的アッセイの有用性を制限できる。特に、セレンテラジンまたはその構造的アナログを含有する発光アッセイの感度は、自動発光により低下する。さらに、このアッセイシステムに種々の成分（例えば、脂質（特に、臨界ミセル濃度、すなわち、ＣＭＣを超えて）、疎水性タンパク質（特に、規定の三次元構造を備えたもの）、および疎水性微小環境を含む細胞または他の生体物質）を添加すると、自動発光を著しく高くできる。
【０００９】
アッセイ感度はまた、無関係の発光源分子から生じる発光により、低下し得る。無関係の発光源分子は、この分析用アッセイの汚染に起因して存在し得るか、または同じ反応混合物で実行される別個の分析用発光アッセイのために存在し得る。いずれの場合でも、分析用発光アッセイの感度は、その分析物の存在に依存しない発光を減少させることにより、改良できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
出願人は、分析物に依存しない発光を減少させる１種またはそれ以上の有機化合物の存在下でアッセイを実行することにより、発光アッセイの感度が改良できることを発見した。特に、出願人は、予想外なことに、この分析物に依存しない発光が、分析物に依存した発光を同様に減少させることなく、減少できることを発見した。好ましくは、この分析物に依存した発光は、この分析物に依存した発光よりも低い倍率だけ減少されるか、または、この分析物に依存した発光は、ほぼ同じままで留まるか、または増加する。従って、本発明は、発光アッセイの感度を高める方法であって、この方法は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、また、分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて生物発光反応を実行する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、アッセイの感度を高める方法であって、この方法は、酵素に結合していない発光源分子により発生した発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、また、酵素に結合した発光源分子により発生した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にてこのアッセイを実行する工程を包含する。
【００１２】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法であって、この方法は、発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、また、分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にてアッセイを実行する工程を包含する。
【００１３】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、セレン原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１４】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−セレン結合を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１５】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−セレン二重結合（Ｃ＝Ｓｅ）を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１６】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−セレン単結合（Ｃ−Ｓｅ）を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１７】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、炭素−イオウ二重結合（Ｃ＝Ｓ）を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１８】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、セレン原子および窒素原子の両方に結合した炭素原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００１９】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、イオウ原子および窒素原子の両方に結合した炭素原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含する。
【００２０】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高める方法を提供し、この方法は、２個の炭素原子に結合したイオウ原子を含有する有機化合物の存在下にて、このアッセイを実行する工程を包含し、ここで、その分析物に依存しない発光は、少なくとも約１０倍だけ減少する。好ましくは、この分析物に依存しない発光は、７倍未満だけ減少する。
【００２１】
本発明はまた、以下の１）および２）を含有する包装材料を含むアッセイキット：１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および２）発光アッセイの感度を高める有機化合物。好ましくは、この有機分子は、以下の１）、２）または３）ができる：１）分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍の倍率だけ減少させ、分析物に存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させること；２）酵素に結合していない発光源分子により発生した発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、酵素に結合した発光源分子により発生した発光を少なくとも約７倍だけ減少させること；または３）自動発光を少なくとも約１０倍減少させ、分析物の存在に依存しない発光を約７倍未満だけ減少させること。
【００２２】
本発明はまた、発光アッセイの感度を高めるのに有用な本明細書で開示した新規化合物を提供する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１） 発光アッセイの感度を高める方法であって、該方法は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて該アッセイを実行する工程を包含する、方法。
（項目２） 発光アッセイの感度を高める方法であって、該方法は、酵素に結合していない発光源分子により発生する発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして酵素に結合した発光源分子により発生する発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて該アッセイを実行する工程を包含する、方法。
（項目３） 発光アッセイの感度を高める方法であって、該方法は、自動発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる有機化合物の存在下にて該アッセイを実行する工程を包含する、方法。
（項目４） 上記発光アッセイが、ルシフェラーゼ酵素、エクオリン酵素またはオベリン酵素を使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５） 上記発光アッセイが、ホタルルシフェラーゼを使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６） 上記発光アッセイが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７） 上記発光アッセイが、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼを使用する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８） 上記有機化合物が、少なくとも０．１μＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９） 上記有機化合物が、少なくとも０．１ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０） 上記有機化合物が、約０．１μＭ〜約５００ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１） 上記有機化合物が、約１００μＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２） 上記有機化合物が、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在している、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３） 上記アッセイが、全細胞の存在下にて実行される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４） 上記アッセイが、少なくとも約１０重量％の水を含む溶媒中で実行される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５） 上記アッセイが、少なくとも約２５重量％の水を含む溶媒中で実行される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６） 分析物の存在に依存した上記発光が、約５倍未満だけ減少する、項目１に記載の方法。
（項目１７） 酵素に結合した発光源分子により発生する上記発光が、約５倍未満だけ減少する。項目２に記載の方法。
（項目１８） 分析物の存在に依存した上記発光が、約５倍未満だけ減少する、項目３に記載の方法。
（項目１９） 分析物の存在に依存した上記発光が、約２倍未満だけ減少するか、同じままであるか、または増加する、項目１に記載の方法。
（項目２０） 酵素に結合した発光源分子により発生する上記発光が、約２倍未満だけ減少するか、同じままであるか、または増加する、項目２に記載の方法。
（項目２１） 分析物の存在に依存した上記発光が、約２倍未満だけ減少するか、同じままであるか、または増加する、項目３に記載の方法。
（項目２２） アッセイキットであって、該アッセイキットは、以下：
１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および
２）有機化合物であって、該有機化合物は、分析物の存在に依存しない発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、
を含有する包装材料を含む、アッセイキット。
（項目２３） アッセイキットであって、該アッセイキットは、以下：
１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および
２）有機化合物であって、該有機化合物は、酵素に結合していない発光源分子により発生する発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして生物発光酵素に結合した発光源分子により発生する発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、
を含有する包装材料を含む、アッセイキット。
（項目２４） アッセイキットであって、該アッセイキットは、以下：
１）発光酵素の発光源基質、または発光源酵素；および
２）有機化合物であって、該有機化合物は、自動発光を少なくとも約１０倍だけ減少させ、そして分析物の存在に依存した発光を約７倍未満だけ減少させる、有機化合物、
を含有する包装材料を含む、アッセイキット。
（項目２５） 上記酵素基質および上記化合物が、それぞれ、別々の容器に含有されている、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目２６） 上記酵素基質および上記化合物が、単一の容器に含有されている、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目２７） さらに、発光アッセイで使用するのに適切な緩衝液を含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目２８） 上記酵素基質および上記緩衝液が、単一の容器に含有されている、項目２７に記載のキット。
（項目２９） 上記化合物および上記緩衝液が、単一の容器に含有されている、項目２７に記載のキット。
（項目３０） さらに、第二発光酵素用の基質を含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３１） さらに、発光酵素反応用の消光剤を含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３２） 上記基質が、ホタルルシフェラーゼまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ用の基質である、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３３） さらに、ＡＴＰを含有する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
（項目３４） 発光酵素の発光源基質、および発光源酵素の両方を含む、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ホタルルシフェラーゼで触媒した化学発光反応を図示している。
【図２】図２は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼで触媒した化学発光反応を図示している。
【図３】図３は、セレンテラジン自動発光経路でのジオキセタン中間体を図示している。
【図４】図４は、自動発光を減少させる代表的な化合物（１〜１１）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（詳細な説明）
本発明を詳細に記述し開示する前に、本発明は、特定のアッセイフォーマット、物質または試薬には限定されず、このようなものは、変わり得ることが理解できるはずである。本明細書中で使用する用語は、記述した特定の実施態様のみを記述する目的ではなく、限定するとは解釈されないことが理解できるはずである。
【００２５】
本明細書および添付の請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に文脈で明らかに指示がなければ、複数の指示物を含む。本明細書およびそれに続く請求の範囲では、他に記述されていなければ、以下の意味を有するように定義した多数の用語が参照される。
【００２６】
本明細書中で使用する「ハロ」との用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを示す。
【００２７】
本明細書中で使用する「アルキル」、「アルコキシ」、「アルケニル」、「アルキニル」などの用語は、分枝基および非分枝基の両方を示す。しかし、「プロピル」のような個々の基の指示は、具体的に参照される直鎖基、分枝鎖基、分枝鎖異性体（例えば、「イソプロピル」）を包含する。
【００２８】
本明細書中で使用する「アリール」との用語は、６個〜３０個の炭素原子を含有する単環式または多環式炭化水素基を示し、ここで、少なくとも１個の環は、芳香族である。好ましくは、アリールは、フェニル基またはオルト縮合二環式炭素環基（これは、約９個〜１０個の環原子を有し、少なくとも１個の環は、芳香族である）を示す。「ヘテロアリール」とは、非過酸化物酸素、イオウおよびＮ（Ｘ）からなる群から選択される１個〜４個のヘテロ原子および炭素からなる５個〜６個の環原子を含有する単環式芳香環の基を包含し、ここで、Ｘは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニルまたはベンジルだけでなく、それから誘導した原子を８個〜３０個で含有する多環式の環基である。好ましくは、ヘテロアリールは、炭素および１個〜４個のヘテロ原子からなる５個〜６個の環原子を含有する単環式芳香環の環原子によって結合した基を包含し、各々は、非過酸化物酸素、イオウおよびＮ（Ｘ）からなる群から選択され、ここで、Ｘは、存在しないか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニルまたはベンジルだけでなく、それから誘導した原子を約８個〜１０個で含有するオルト縮合二環式複素環の基（特に、ベンズ誘導体、またはプロピレン、トリメチレンまたはテトラメチレンジラジカルをそこに縮合することにより誘導したもの）である。
【００２９】
本明細書中で使用する「分析物」との用語は、試験試料で検出される基質である。発光アッセイでは、通例検出される分析物には、ルシフェラーゼ、特に、ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼが挙げられる。分析物として使用する他の発光酵素には、エクオリン、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、および他の海洋ルシフェラーゼが挙げられる。さらに、発光反応は、分析物（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グリコシダーゼ、および種々の代謝物（例えば、ＡＴＰまたはＮＡＤＨ））を検出するのに使用できる。発光反応はまた、結合相互作用（例えば、抗体およびヌクレオチドプローブにより媒介されるもの）により、分析物を検出し定量するのに使用できる。ある場合、分析物に依存した発光は、発光酵素の活性に連関できる。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、ルシフェリンのホスホ誘導体を使用することにより、検出できる。この戦略により、ルシフェリンは、ＡＰの作用により発生し、これは、次いで、ルシフェラーゼとの反応により、光を生じる。本発明は、別個の西洋わさびペルオキシダーゼ／ルミノール反応後に、そのＡＰアッセイを実行することを可能にする。その分析物ＡＰに関して、本明細書中で記述した化合物は、西洋わさびペルオキシダーゼにより引き起こされる分析物に依存しない発光を減少させるために、添加できる。
【００３０】
本明細書中で使用する「自動発光」との用語は、発光源分子に対する酵素活性から生じない発光源分子からの光の放出を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用する「発光アッセイの感度を高める」との用語は、そのアッセイの精度を高めるかアッセイで少量の分析物の存在を測定する性能を改良することを意味する。例えば、発光アッセイの感度は、分析物に依存しない発光を減少することにより、高めることができる。好ましくは、分析物に依存しない発光は、この分析物に依存した発光の結果では、減少するか、最小量だけ減少するか、減少しないか、または増加する。さらに、分析物に依存しない発光は、好ましくは、分析物に依存した発光よりも大きい倍率だけ、減少する。
【００３２】
本明細書中で使用する「発光」との用語は、生物発光（すなわち、生きている生物により発生した光）、化学発光（化学反応が進行するときに発生した光）および電気化学発光を含む。関与している酵素が、光を発生する目的のために、自然な選択により生物中で進化したとき、または関与した酵素が、このような酵素の変異誘導体であるとき、これらの発光反応はまた、「生物発光反応」とも呼ばれ、関与した酵素はまた、「生物発光酵素」とも呼ばれる。例には、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ、Ａｅｑｕｏｒｉｎルシフェラーゼ、Ｏｂｅｌｉｎ発光タンパク質などがある。
【００３３】
「発光アッセイ」（「ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ａｓｓａｙ」）または「発光アッセイ」（「ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ」）との用語は、分析物の存在に基づいて光を発生する任意のアッセイを含む。このようなアッセイには、１種またはそれ以上のルシフェラーゼ酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼなど）を使用するアッセイが挙げられる。
【００３４】
本明細書中で使用する「発光源酵素」との用語には、光を発生するか光の発生を引き起こす反応を触媒する酵素が挙げられる。例えば、この用語は、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ、Ａｅｑｕｏｒｉｎ発光タンパク質、Ｏｂｅｌｉｎ発光タンパク質などが挙げられる。
【００３５】
本明細書中で使用する「発光源分子」との用語は、化学反応によって光を生じることができる分子（例えば、ルシフェリン、セレンテラジン、またはそれらの機能性アナログ）を意味する。一般に、発光源分子は、高エネルギー分子種（例えば、安定化ジオキセタン）であるか、または化学反応による高エネルギー分子種に形質転換されるか、いずれかである。この化学反応は、通常、酸素、超酸化物または過酸化物により酸化である。各場合、この発光源分子内のエネルギーは、この化学反応により放出される。このエネルギーの少なくとも一部は、光の光子として放出されるものの、このエネルギーはまた、他の形状（例えば、熱）で放出できる。光を生じない発光源分子は、代替様式（これは、しばしば、「暗黒経路」と呼ぶ）によって、それらのエネルギーを分散する。
【００３６】
本明細書中で使用する「酵素に結合していない発光源分子」との用語は、酵素（例えば、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼなど）に結合していない発光源分子であって光を生じる反応を触媒するものを含む。
【００３７】
本明細書中で使用する「酵素に結合した発光源分子」との用語は、酵素に結合した発光源分子であって、光を発生する反応を触媒するものを含む。
【００３８】
本明細書中で使用する「分析物の存在に依存した発光」または「分析物に依存した発光」との用語は、分析物が関与した化学反応から生じる発光だけでなく、直接または間接のいずれかで分析物の存在に関連した発光を含む。
【００３９】
本明細書中で使用する「分析物に存在に依存しない発光」または「分析物に依存しない発光」との用語は、発光源基質の自動発光により生じる発光だけでなく、アッセイ混合物中に存在している無関係の発光源分子から生じる発光を含む。
【００４０】
本明細書中で使用する「クエンチ」との用語は、発光反応からの光子の収率を低下させることを意味する。この用語は、分析物が検出されるか検出できるのを防止することを含み、直接的または間接的のいずれかで起こり得る。反応をクエンチするのに使用できる試薬は、「クエンチ試薬」として知られている。
【００４１】
出願人は、分析物に依存しない発光を減少させる有機化合物の存在下にて発光アッセイを実行することにより、発光アッセイの感度を高めることが可能であることを発見した。この発見は、予想外である。本明細書中に記載される手順に類似した手順を使用すると、当業者は、発光アッセイの感度を高めるのに適当な化合物を同定できる。この化合物の構造は、発光アッセイの感度を高めることができるという条件で、重要ではない。
【００４２】
特に、出願人は、イオウ原子またはセレン原子を含有する化合物が発光アッセイの感度を高めるのに有用であることを発見した。セレン原子またはイオウ原子を含有する化合物の残りの構造は、その構造が化合物の機能を妨害しないという条件で、重要ではない。好ましい化合物は、本発明で使用する濃度で、低い毒性を有し、安価に保存、輸送または廃棄できる。
【００４３】
適当な化合物には、有機化合物（すなわち、１個またはそれ以上の炭素原子を含有する化合物）が挙げられる。適当な有機化合物は、炭素−イオウ結合または炭素−セレン結合を含有でき、例えば、適当な有機化合物は、炭素−イオウ二重結合（Ｃ＝Ｓ）、炭素−セレン二重結合（Ｃ＝Ｓｅ）、炭素−イオウ単結合（Ｃ−Ｓ）または炭素−セレン単結合（Ｃ−Ｓｅ）を含有できる。適当な有機化合物はまた、炭素が結合したメルカプト基（Ｃ−ＳＨ）または２個の炭素原子に結合したイオウ原子（Ｃ−Ｓ−Ｃ）を含有できる。好ましい化合物は、天然で親油性である。
【００４４】
炭素−イオウ二重結合または炭素−セレン二重結合を含有する適当な化合物には、式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、
【００４５】
【化３】
ここで、Ｘは、ＳまたはＳｅであり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲａＲｂであるか、またはＲ１またはＲ２は、それらが結合した炭素原子と一緒になって、５員、６員、７員または８員の飽和または不飽和環を形成し、この環は、炭素を含有し、必要に応じて、オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）または窒素（−ＮＲｃ−）から選択された１個、２個または３個のヘテロ原子を含有し、ここで、この環は、必要に応じて、１個、２個または３個のハロ、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールで置換され、そしてＲａ、ＲｂおよびＲｃは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃの（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルが、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１個、２個、３個または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、またはヘテロアリールで置換され；そして、ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、１個以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４６】
メルカプト基を含有する適当な化合物には、式Ｒ３ＳＨの化合物またはその塩が挙げられ、ここで、Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、Ｒ３の任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｄＲｅであり、ここで、ＲｄおよびＲｅは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールで置換され、ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上（１個、２個、３個または４個）のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４７】
他の適当な化合物には、例えば、式Ｒ４ＮＣＳの化合物またはその塩が挙げられ、ここで、Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、Ｒ４の任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｆＲｇで置換され、ここで、ＲｆおよびＲｇは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールであり、ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上（１個、２個、３個または４個）のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４８】
炭素−セレン単結合または炭素−イオウ単結合を含有する他の適当な化合物には、式Ｒ５−Ｘ−Ｒ６の化合物またはその塩が挙げられ、 Ｘは、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、 Ｒ５は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、そしてＲ６は、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであるか、 またはＲ５およびＲ６は、Ｘと一緒になって、ヘテロアリールを形成し、 ここで、Ｒ５またはＲ６の任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｋＲｍで置換され、
ここで、ＲｋおよびＲｍは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールであり、そして
ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３または４個）のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００４９】
基、置換基または範囲について以下で挙げた特定の好ましい値は、例示の目的のためのみである；それらは、これらの基および置換基について、規定した値とは別の値または規定した範囲外の値を除外するものではない。
【００５０】
具体的には、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第二級ブチル、ペンチル、３−ペンチルまたはヘキシルであり得る；（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルであり得る；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシとは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、第二級ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシまたはヘキシルオキシであり得る；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルは、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニルまたは５−ヘキセニルであり得る；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニルまたは５−ヘキシニルであり得る；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルは、アセチル、プロパノイルまたはブタノイルであり得る；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニルまたはヘキシルオキシカルボニルであり得る；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイルオキシは、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、イソブタノイルオキシ、ペンタイルオキシまたはヘキサノイルオキシであり得る；アリールは、フェニル、インデニルまたはナフチルであり得る；そしてヘテロアリールは、フリル、イミダゾリル、トリアゾリル、トリアジニル、オキサゾイル、イソキサゾイル、チアゾイル、イソチアゾイル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、テトラゾリル、ピリジル（またはそのＮ−酸化物）、チエニル、ピリミジニル（またはそのＮ−酸化物）、インドリル、イソキノリル（またはそのＮ−酸化物）またはキノリル（またはそのＮ−酸化物）であり得る。
【００５１】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲａＲｂであり得る；ここで、ＲａおよびＲｂは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである；ここで、Ｒ１、Ｒ２、ＲａおよびＲｂの任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個または２個のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールで置換される；ここで、任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換される。
【００５２】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリールまたはＮＲａＲｂであり得る。
【００５３】
具体的には、Ｒ１またはＲ２は、それらが結合した炭素原子と一緒になって、５員または６員の飽和または不飽和環を形成し得、この環は、炭素を含有し、必要に応じて、オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）または窒素（−ＮＲｃ−）から選択された１個または２個のヘテロ原子を含有し、ここで、この環は、必要に応じて、１個、２個または３個のハロ、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールで置換される；ここで、Ｒｃは、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである；ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲｃの任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリールまたはヘテロアリールで置換されている；そして任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換されている。
【００５４】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、ＮＲａＲｂであり得る；ここで、ＲａおよびＲｂは、それぞれ別個に、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールである；ここで、任意の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルまたは（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、アリールまたはヘテロアリールで置換されている；そして任意のアリールまたはヘテロアリールは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換されている。
【００５５】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノまたは４−チアゾイルアミノであり得る。
【００５６】
具体的には、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ別個に、アミノ、メチル、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノまたは４−チアゾイルアミノであり得る。
【００５７】
Ｒ３の特定の値は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルであり、これは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはＮＲｄＲｅで置換されている。
【００５８】
Ｒ３の特定の値は、２−アミノエチル、２−アミノ−２−カルボキシエチルまたは２−アシルアミノ−２−カルボキシエチルである。
【００５９】
Ｒ４の特定の値は、アリールであり、これは、必要に応じて、１個またはそれ以上のハロ、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルオキシ、スルホまたは（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで置換されている。
【００６０】
具体的には、Ｒ５は、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである；そしてＲ６は、水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリールまたはヘテロアリールである。
【００６１】
具体的には、Ｒ５およびＲ６は、Ｘと一緒になって、ヘテロアリールを形成する。
【００６２】
好ましい有機化合物は、１個またはそれ以上のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含有するポリペプチドおよびタンパク質を含まない。
【００６３】
好ましい有機化合物は、１個またはそれ以上のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含有する化合物を含まない。
【００６４】
好ましい有機化合物は、図４で示すような式１〜１１の化合物である。好ましい化合物は、チオ尿素である。
【００６５】
上記化合物は、企業から入手できるか、または合成化学の分野で公知の手順を使用して、市販の出発物質から調製できる。例えば、Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４版、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２を参照せよ。
【００６６】
化合物が安定な塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合、本発明の方法で塩としてこれらの化合物を使用することは、適当であり得る。適当な塩の例には、有機酸付加塩、例えば、トシラート、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびα−グリセロリン酸塩が挙げられる。適当な無機塩もまた形成され得、これらは、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩および炭酸塩が挙げられる。
【００６７】
塩は、当該技術分野で周知の標準的な手順を使用して、例えば、十分な塩基性化合物を適当な酸と反応させることにより、得ることができる。アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩もまた、使用できる。
【００６８】
本明細書中で記述した化合物は、本発明の方法に従って使用するとき、このアッセイの感度を高める任意の濃度で、発光反応に存在できる。所定の化合物の最適濃度は、使用する発光試薬、および所定のアッセイを実行する特定の条件に依存している。しかしながら、適当な濃度は、当該技術分野で利用できる標準的な技術を使用して、決定できる。
【００６９】
具体的には、このアッセイの感度を高めることができる化合物は、少なくとも約０．１μＭの濃度、または少なくとも約０．１ｍＭの濃度で、発光反応に存在できる。さらに具体的には、この化合物は、約０．１μＭ〜約５００ｍＭ（これらの値を含めて）の範囲、または約１μＭ〜約２５０ｍＭ（これらの値を含めて）の範囲の濃度で、この発光反応に存在できる。好ましくは、この化合物は、約１０μＭ〜約１００ｍＭ（これらの値を含めて）の範囲の濃度で存在している。
【００７０】
具体的には、このアッセイは、細胞全体の存在下にて、実行できる。
【００７１】
具体的には、このアッセイは、少なくとも約１０％の水を含有する溶媒中にて、実行できる。さらに具体的には、本発明は、少なくとも約２５％の水、または少なくとも約４０％の水を含有する溶媒中にて、実行できる。
【００７２】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、分析物に依存しない発光は、ある化合物の存在下にて、少なくとも約１０倍だけ、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍だけ、少なくとも約５０倍だけ、または少なくとも約１００倍だけ減少するのに対して、分析物に依存した発光は、約７倍未満だけ、約５倍未満だけ、約３倍未満だけ、または約２倍未満だけ減少する。例えば、この化合物の存在下では、５の相対光ユニット値が生じたのに対して、この化合物の非存在下では、１００の相対光ユニット値が生じ、このことは、この化合物の存在下では、発光が２０倍だけ減少することを示している。
【００７３】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、酵素に結合していない発光源分子により発生した発光は、少なくとも約１０倍、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍だけ減少するのに対して、酵素に結合した発光源分子により発生した発光は、約７倍未満、約５倍未満、約３倍未満または約２倍未満だけ、減少する。酵素に結合した発光源分子により発生した発光は、好ましくは、酵素に結合していない発光源分子により発生した発光での倍率減少よりも低い倍率だけ、減少する。
【００７４】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、内部ルミネセンスは、少なくとも約１０倍だけ、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍だけ、少なくとも約５０倍だけ、または少なくとも約１００倍だけ減少するのに対して、分析物の存在に依存した発光は、約７倍未満だけ、約５倍未満だけ、約３倍未満だけ、または約２倍未満だけ、減少する。分析物の存在に依存した発光は、好ましくは、内部ルミネセンスでの倍率減少よりも低い倍率だけ減少する。
【００７５】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、イオウ原子またはセレン原子を含有する化合物の存在下にてアッセイを実行するとき、分析物に依存していない発光は、少なくとも約１０倍だけ、またはさらに好ましくは、少なくとも約２０倍だけ、少なくとも約５０倍だけ、または少なくとも約１００倍だけ、減少する。
【００７６】
好ましくは、本発明の方法を実施する際に、イオウ原子またはセレン原子を含有する化合物の存在下にてアッセイを実行するとき、分析物に依存した発光は、約７倍未満だけ、約５倍未満だけ、約３倍未満だけ、または約２倍未満だけ、減少する。
【００７７】
本発明のキットには、その酵素基質、酵素および化合物が、別個の容器に含有できるか、または単一容器に含有できる。このキットは、必要に応じて、発光アッセイで使用するのに適当な緩衝液、酵素基質または酵素を含有でき、この緩衝液は、必要に応じて、単一容器に含有できる。さらに、この化合物および緩衝液は、必要に応じて、単一容器に含有できる。これらのキットはまた、必要に応じて、第二基質（例えば、ホタルルシフェラーゼまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ用の基質）、または発光酵素反応用の消光試薬を含有できる。これらのキットはまた、必要に応じて、ＡＴＰを含有できるか、または必要に応じて、発光酵素用の発光源基質および発光源酵素の両方を含有できる。
【００７８】
ある化合物が発光アッセイの感度を高める性能は、当該技術分野で周知のアッセイを使用して、または以下の実施例で記述したアッセイを使用して、決定できる。
【００７９】
本明細書中で同定した化合物は、発光アッセイの感度を高めるのに有用であることが明らかとなった。これらの化合物は、中間体ジオキセタン環の分解から生じる発光を減少させるのに、特に有用である。それゆえ、発光アッセイ（例えば、生物発光アッセイ、化学発光アッセイまたは電場発光アッセイ）の感度を高めるのに有用であることに加えて、これらの化合物はまた、中間体オキセタン環などを含む他のシステムでの発光を減少するのに有用である。
【００８０】
本発明は、今ここで、以下の非限定的な実施例により説明する。化合物１〜１１（図４）は、企業から容易に入手できる。
【実施例】
【００８１】
（実施例１．アッセイ感度の改良）
代表的な有機化合物（「化合物」）が発光アッセイ感度を高める性能を評価する実験を、フォーマットＡおよびフォーマットＢで下記の条件下にて、実行した。発光アッセイ感度の改良は、これらの化合物が、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの存在下にて、分析物に依存した発光（すなわち、セレンテラジン）を少なくするか最小にしつつ、分析物に依存していない発光（これは、セレンテラジンの酸化により生じる）を減少する性能により、証明される。本明細書中では、その対象分析物が存在しているときの発光の倍率減少が、対象分析物が存在していないときの発光の倍率減少よりも低くなることが証明されている。その酵素発光測定は、内部ルミネセンス成分を有し得る。
【００８２】
実際、本明細書中で記述した実験の大部分では、試験される化合物が存在しているとき、この酵素発光測定の増加を観察した。内部ルミネセンスは、これらの化合物の内部ルミネセンスに対するさらに顕著な効果を観察するために、典型的には、非常に低いので、内部ルミネセンスは、清浄剤を添加することにより、そのｐＨを高めることにより、過酸化水素を添加することにより、ＤＭＳＯを添加することにより、ＢＳＡを添加することにより、または硫化水素ナトリウムを添加することにより、向上した。
【００８３】
（フォーマットＡ）
Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（ＳＧ）およびＳｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｓ＋Ｇ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の存在下にて、アッセイを実行した。１５０μｌの全反応容量は、以下からなっていた：
５０μｌのＦ−１２（Ｈａｍ）媒体＋１ｍｇ／ｍｌゼラチン（酵素１と共にまたは酵素なし）
５０μｌのＳ＋Ｇ（基質を含有する２）
５０μｌのＳＧ。
【００８４】
１約２．５ｎｇ／媒体５０μｌの濃度まで、１％ゼラチンを含有するＦ−１２細胞培地に、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ酵素を添加した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼが存在しないときの反応により、この化合物の内部ルミネセンスに対する効果が明らかになるのに対して、酵素の存在下での反応により、この化合物のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ触媒発光に対する効果が明らかとなる。
【００８５】
２このＳ＋Ｇ試薬を、業者の説明書に従って調製したが、但し、これらの実験では、通常のものより３倍濃縮したＳ＋Ｇ溶媒を使用して、このＳ＋Ｇ基質を再懸濁した。これらの条件下にて、このＳ＋Ｇ中では、飽和状態に達するのに、基質に対して、さらに高い濃度のセレンテラジンが必要であった。
【００８６】
試験する化合物を、（１×）のＳＧまたはＳ＋Ｇの最終濃度まで、ＳＧまたはＳ＋Ｇのいずれかで、再懸濁した。この化合物を、１５０μｌの全容量での最終濃度が表１で列挙したものとなるように、この化合物を添加し、その試薬を、最終５０μｌまで、水で希釈した。対照として、このＳＧまたはＳ＋Ｇを、対象化合物を溶解するのに使用する溶媒または水で、５０μｌにした。例えば、もし、ある化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解する必要があったなら、その対照反応物に、等量のＤＭＳＯを添加した。他に指示がなければ、これらの化合物を、まず、水に溶解した。試験する化合物を、このＳＧまたはＳ＋Ｇの代わりに、この反応物の媒体部分に直接添加することにより、同じ結果を得ることができる。
【００８７】
特定の化合物の各濃度に対して、４つの反応に十分な量でこれらの成分の全て（すなわち、２００μｌの媒体、２００μｌのＳＧ、２００μｌのＳ＋Ｇ）を含有する混合物を構築した。この混合物から、９６ウェルプレート上の３つのウェルに、１５０μｌを分配した。あるいは、時には、５０μｌ部分の各々を添加して混合することにより、このプレートの各ウェルにおいて、反応物を構築した。このプレートを２２℃インキュベートし、５分後、Ｄｙｎｅｘプレート照度計を使用して、その発光を測定した（１ウェルあたり、１秒の測定）。
【００８８】
（フォーマットＢ）
下記のように、標準ＭＢ組成物または変性ＭＢ組成物のいずれかとして、１５０μｌのＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ（本明細書中では、ＭＢと呼ぶ）の反応容量で、実験を実行した。フォーマットＡと同様に、これらの有機化合物のアッセイ感度に対する効果を観察するために、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを使ってまたはそれなしでの反応を実行した。これらの反応成分（例えば、酵素、基質、清浄剤、および処理する化合物）を添加できるようにするために、この反応は、以下のようにして、３部分で構築した：
５０μｌのＭＢ（酵素３ありまたはそれなしで）
５０μｌのＭＢおよびセレンテラジン（清浄剤４ありまたはそれなしで）
５０μｌのＭＢ（化合物５ありまたはそれなしで）
３約２．５ｎｇ／緩衝液５０μｌの濃度まで、１×ＭＢに、酵素を添加した。
【００８９】
４清浄剤は、自動発光のレベルを高めることが知られている。完全性ついては、これらの化合物の自動発光および酵素発光に対する効果は、清浄剤の存在下および不在下で評価した。
【００９０】
１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９、１％消泡剤（最終反応物中で０．３３％）の濃度で、清浄剤を使ってまたはそれなしで、２×ＭＢを使用して１×ＭＢを作製した。この部分に、清浄剤を使ったバージョンでは１８０μＭの濃度で、そして清浄剤なしのバージョンでは６０μＭの濃度で、セレンテラジンを添加した。これらの基質レベルは、飽和状態に達するのに必要である。
【００９１】
注記：他の清浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−０８（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９を使って得たものと類似の効果があることが分かった。
【００９２】
５種々の濃度で試験する化合物および水を使って、２×ＭＢを使用して１×ＭＢを作製した。対照には、水だけを使うか、または水および試験する化合物を溶解するために使用する溶媒を添加して、１×ＭＢを作製した。例えば、試験する化合物をＤＭＳＯに溶解する場合、この対照ＭＢ試料には、同じ量のＤＭＳＯだけを添加した。
【００９３】
１×Ｍａｔｔｈｅｗ緩衝標準組成物は、以下からなる：
１００ｍＭのリン酸カリウム
５００ｍＭの塩化ナトリウム
１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
ｐＨ７．４。
【００９４】
このＢＳＡは、酵素安定剤として機能し、この標準ＭＢ組成物中では、セレンテラジンの自動発光を高めるが、清浄剤が存在しているときに発生する自動発光の程度までは高めない。この清浄剤だけで高められた自動発光を観察するために、大部分の実験には、０．１５ｍｇ／ｍｌまたは０．４５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で、この酵素安定剤として、ＢＳＡの代わりにブタゼラチンを使用した。このフォーマットにこれらの改変物の全てを考慮すると、４つの異なるバージョンに再分割できる。
【００９５】
Ｂ１ ＢＳＡ／清浄剤
Ｂ２ ＢＳＡ／清浄剤なし
Ｂ３ ゼラチン／清浄剤
Ｂ４ ゼラチン／清浄剤なし。
【００９６】
これらの５０μｌ部分の各々をマイクロタイタープレートウェルに添加し、そして混合することによって、反応を３連で実行した。１ウェルあたりで得られる相対光ユニットを、直ちに、Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒／ウェル）を使用して測定したか、あるいは、このプレートを２２℃でインキュベートし、同じ様式で、５分後に読み取った。
【００９７】
以下の表１の結果は、以下のように示す：
ａ）この化合物の非存在と比較したときの、この化合物の存在下での非酵素的自動発光測定での減少倍率、および
ｂ）この化合物だけがない対照試料と比較したときの、この化合物の存在下での酵素的発光測定に対する化合物の効果。
【００９８】
例えば、「７．４倍減少した」結果とは、この化合物の存在下での発光測定値が、この化合物の非存在下での発光測定値よりも７．４倍少ないことを意味する。全ての場合、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの存在とは無関係の発光（自動発光）の減少倍率は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの存在と関連した発光での減少倍率よりも大きかった。それゆえ、これらの化合物は、その分析物の酵素活性とは無関係の発光を、この分析物の酵素活性と関連した発光よりも高い程度まで減少させる。
【００９９】
（表１.化合物の素性については図４を参照。）
フォーマットの概説：
Ａ 媒体：Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ：Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ
Ｂ１ ＢＳＡおよび清浄剤を含むＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂ２ ＢＳＡを含むが清浄剤を含まないＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂ３ ゼラチンおよび清浄剤を含むＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂ４ ゼラチンを含み清浄剤を含まないＭａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ
【０１００】
【表１】
（実施例２．他の基質により発生した自動発光の減少）
天然セレンテラジン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から発生した自動発光に対する代表的な化合物の効果を見ることに加えて、他の基質により発生した自動発光に対する代表的な化合物の効果を研究した。セレンテラジン類似物Ｎ、Ｆ、Ｈ、ＨＰＣおよびＣＰは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｏｒｅｇｏｎから得た。Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼは、ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから得た。Ｂｅｅｔｌｅルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから得た。これらの化合物のさらに著しい効果を調べるために、Ｍａｔｔｈｅｗ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒ中のＤＭＳＯまたは清浄剤（１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９／１％ Ａｎｔｉｆｏａｍ（登録商標））を添加することにより、実施例１で記述したようにして、自動発光を高めた。また、Ｈ２Ｏ２を添加することにより、または天然セレンテラジンを含有する反応物のｐＨを高めることにより、自動発光を高めた。実験条件は、フォーマットＣ下で分類し、以下のようにして再分割した：
Ｃ１ ＤＭＳＯ中の代替基質
１ウェルあたり、以下からなる物質１００μｌ：
９４μｌのＤＭＳＯ
３ｍＭ（３０μＭの最終基質濃度）での基質１μｌ
水に溶解した化合物または対照としての水５μｌ
Ｃ２ 清浄剤を含むＭＢ中の代替基質
１ウェルあたり、以下からなる物質１００μｌ：
ＢＳＡおよび清浄剤に代えてゼラチンと共にＭＢ（９４μｌ）
３ｍＭ（３０μＭの最終基質濃度）での基質１μｌ
水に溶解した化合物または対照としての水５μｌ
Ｃ３ ＢＳＡを含むＭＢ（ｐＨ９）
１ウェルあたり、以下からなる物質１００μｌ：
ＭＢ（９０μｌ）（ｐＨ９、３０μＭのセレンテラジン、清浄剤は存在しな
いこと以外は標準組成）
３０．７％でのＨ２Ｏ２（５μｌ）（最終濃度１．５％）
水に溶解した化合物または対照としての水５μｌ。
【０１０１】
マイクロタイタープレートウェルに各成分を添加して混合することにより、反応を３連で実行した。その光の出力は、直ちに、Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒／ウェル）を使用して測定した。結果は、表２で示す。
【０１０２】
（表２）
【０１０３】
【表２】
（実施例３、化学発光基質ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびルミノールにより発生した発光の減少）
ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）またはルミノールを含有する化学発光反応物に対する代表的な化合物の効果を測定した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）は、安定化された１，２−ジオキセタン化学発光酵素基質（高エネルギー発光源分子）であり、溶液および膜ベースアッセイにおいて、アルカリホスファターゼおよびアルカリホスファターゼ結合体の検出において使用した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）は、Ｔｒｏｐｉｘ ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから得た。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）基質は、アルカリホスファターゼで活性化するとき、光信号を発生する。アルカリホスファターゼは、この基質を脱リン酸化して、アニオンが生じ、これは、その長寿命のために蓄積する。その最終的な光の発生には、このアニオンの分解が関与しているので、一定信号出力に先立って遅延が起こり、光の白熱が生じ、これは、数時間から数日にわたって続く。ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ（ｄｉｄｙｄｒｏ）−１，４−フタラジンジオン）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉから得た。ルミノールは、広く使用されている化学発光試薬であり、これは、酸化が起きると発光する。実験条件は、フォーマットＤで分類し、以下のようにして再分割する：
（Ｄ１ ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋水中のチオ尿素）
マイクロタイタープレートウェルでは、以下で列挙した種々の量のＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）試薬を水中の代表的な化合物（または対照として水のみ）と混合し、先に記述したように、照度計で測定した（１秒／ウェル）。
【０１０４】
５０％ ５０μｌのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋５０μｌの０．５Ｍチオ尿素（２５０ｍＭのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）最終濃度）
７５％ ７５μｌのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋２５μｌの０．５Ｍチオ尿素（１２５ｍＭのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）最終濃度）
９５％ ９５μｌのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）＋５μｌの０．５Ｍチオ尿素（２５ｍＭのＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）最終濃度）。
【０１０５】
（Ｄ２ 未希釈のＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標））
１０ｍＭの濃度で、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）試薬に、チオ尿素を直接溶解した。対照反応物は、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）試薬だけ（１ウェルあたり１００μｌ）を含有しており、ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒の読み／ウェル）で、光出力を測定した。
【０１０６】
０．２８ｐｇのアルカリホスファターゼを含有する平行ウェルもまた、測定して、そのＣＤＰ−Ｓｔａｒの完全性およびそれらの条件での活性をモニターした。
【０１０７】
（Ｄ３ ルミノール）
ルミノールを含有する溶液をＨ２Ｏ２と接触したとき、化学発光が起こる。このルミノール反応に対するチオ尿素の効果を、マイクロタイタープレートで構築した以下の反応物について、測定した：
５０μｌのルミノール溶液６
４５μｌの０．００１５％または０．０００１５％Ｈ２Ｏ２
５μｌの０．５Ｍチオ尿素（２５ｍＭの最終濃度）または対照としての水
６１００ｍｌあたりのルミノール溶液：
０．４ｇｍの炭酸ナトリウム
０．０２ｇｍのルミノール
２．４ｇｍの重炭酸ナトリウム
０．０５ｇｍの炭酸アンモニウム
０．０４ｇｍの硫酸銅（ＩＩ）５水和物
１００ｍｌまでの蒸留水
ｐＨ９．０
得られた発光を、直ちに、Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレート照度計またはＷａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘプレート照度計（１秒の読み／ウェル）を使用して測定した。それらの結果は、表３で示す。このデータは、チオ尿素がＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）およびルミノールの両方の化学発光反応に作用して自動発光を減少させることを証明している。
【０１０８】
（表３）
【０１０９】
【表３】
＊アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含有させて平行反応を行い、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の安定性に対するチオ尿素の効果をモニターした。ＡＰを含有する反応物もまた、その発光出力を減少させたが、その規模は、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）だけのものよりも小さかった。このＡＰ反応物は、チオ尿素の存在下にて、１．４倍減少させた。
【０１１０】
（実施例４．セレンテラジンで誘導した発光に対するｐＨの効果）
以下の実験を実行して、チオ尿素が種々のｐＨ値で自動発光を減少させる能力を決定した。
【０１１１】
２×濃度（実施例１で記述した標準処方）で、Ｍａｔｔｈｅｗ緩衝液を作製し、数個のアリコートに分割した。アリコートを、１ｐＨ単位ずつ、ｐＨ４からｐＨ９まで調節した。各ｐＨに対して、１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９／１％消泡剤（「清浄剤」と呼ぶ）を使ってまたはそれなしで、および３ｍＭのチオ尿素を使ってまたはそれなしで、この緩衝液の異形を作製した。清浄剤を使うバージョンには、１８０ｍＭの濃度まで、そして清浄剤を使わないバージョンには、６０ｍＭの濃度まで、セレンテラジンを添加した。次いで、これらの緩衝液を、水で、１×の最終濃度にした。
【０１１２】
各反応物の１５０μｌアリコートを、３連でマイクロタイタープレートウェルに分配し、そのプレートを２２℃でインキュベートした。５分後、先に記述したように、プレート照度計を使用してその発光を測定し（１ウェルあたり１秒）、それらの結果を、以下の表に示す：
【０１１３】
【表４】
これらの結果は、この緩衝液のｐＨを上げることがセレンテラジン自動発光を高めることを証明している。３ｍＭのチオ尿素を添加すると、高いｐＨでも、自動発光を効果的に減少させる。
【０１１４】
（実施例５．全細胞アッセイでの自動発光の減少）
細胞生存度に対する有機化合物の効果を決定するために、そしてこのような化合物が生細胞の存在下にて自動発光を減少する能力を決定するために、以下の実験を実行した。ヒト胎児腎臓細胞（２９３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ＋）遺伝子を安定に発現する細胞株を発生させた。この安定な細胞株は、ｐＣｌ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用して、Ｌｕｃ＋遺伝子をＸｂａＩ部位とＳａｌＩ部位との間に挿入して作製した。標準的な方法を使用して、この安定な細胞株を調製し、１０％ＦＢＳおよび０．１５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ培地の存在下にて、マイクロタイタープレートのウェル中で形質転換した細胞を成長させた。実験目的のために、９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して、細胞の二連のプレートを調製した。一方のプレートを使用して生存度を検査し、他方のプレートを使用して自動発光に対する効果を試験した。
【０１１５】
これらの有機化合物の細胞生存度に対する効果を検査するために、この培地を細胞から除去して、ホタルルシフェラーゼ用の基質、コガネムシルシフェラーゼおよび有機化合物を種々の濃度で含有する培地で置き換えた。この細胞内に既に含有されたＡＴＰ酸素およびルシフェラーゼ酵素と共に、その細胞膜を横切るルシフェラーゼの受動拡散により、光が発生する。易感染性の細胞または損傷した細胞では、細胞内ＡＴＰ濃度は急速に枯渇するのに対して、そのホタル発光は減少する。その発光レベルを、ルシフェリンのみを含有する対照と比較して、細胞生存度の指標として、これらの化合物の光出力に対する効果（もしあれば）を確認した。
【０１１６】
これらの有機化合物が自動発光を減少させる能力を決定するために、これらの細胞から培地を除去し、種々の濃度の化合物およびセレンテラジンを含有する培地で置き換えた。これらの細胞中で発現しているＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ酵素は存在しないので、観察された唯一の発光は、自動発光である。自動発光のレベルを、セレンテラジンだけを含有する対照と比較して、これらの化合物が自動発光を減少させる効果を確認した。
【０１１７】
そのマイクロタイタープレートの半分は、細胞を含有していなかった。これらのウェルに、その細胞対応物に関して同じ試薬を添加して、細胞に依存していない発光（すなわち、背景発光）を測定した。これらの試薬（種々の濃度で化合物を使うかそれなしで、ルシフェリンまたはセレンテラジンを有する培地）を、以下のようにして調製した：
ａ）ホタル発光（細胞生存度）を検査する試薬
まず最初に、１００ｍＭストックとして、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡから入手可能なルシフェリン基質を調製した。このルシフェリンストックを使用して、２ｍＭルシフェリンの最終濃度を含むＤＭＥＭ溶液を作製した。
【０１１８】
この溶液（ＤＭＥＭ／ルシフェリン）に、３０ｍＭの最終濃度になるまで、チオ尿素および１−アリル−３−（２−ヒドロキシエチル）−２−チオ尿素を直接溶解した。これらを、引き続いて、１０ｍＭおよび１ｍＭの最終化合物濃度を含むように、希釈した。
【０１１９】
７５０ｍＭストックとして、ＤＭＳＯに、別の化合物である６−アザ−チオ−チミジンを溶解した。この６−アザ−チオ−チミジンを、引き続いて、３０ｍＭ、１０ｍＭおよび１ｍＭの最終濃度で、このＤＭＥＭ／ルシフェリン試薬に添加し、その間、４％の最終ＤＭＳＯ濃度を維持した。この化合物の効果と比較する対照として、ＤＭＥＭ／ルシフェリン試薬を使用し、そして４％の最終ＤＭＳＯ濃度を含むように作製した。
【０１２０】
ＤＭＳＯは、有機分子が細胞膜を浸透するのを助け得ると考えられているので、ＤＭＳＯ（４％）中で再構成したチオ尿素（１０ｍＭ）からなる追加対照を含有させた。
【０１２１】
ｂ）自動発光の減少を検査する試薬
まず最初に、３０ｍＭストックとして、Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｖｅｎｔに、セレンテラジン基質を溶解した（共に、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）。このセレンテラジンストックを使用して、その最終濃度として０．６ｍＭセレンテラジンを含有するＤＭＥＭ培地を作製した。ａ）で記述したＤＭＥＭ／ルシフェリン試薬と同じ様式で、ＤＭＥＭ／セレンテラジン試薬を作製した。
【０１２２】
その細胞培地を細胞から除去して、基質（＋／−化合物）を含有する培地で置き換え、直ちに、発光を測定した。細胞を含有するウェルから得られた全ての発光値を、対応する発光値を使用して、細胞を含有しないウェルから背景を差し引いた。マイナス化合物対照での背景控除自動発光を、これらの化合物を含有する背景控除自動発光で割ることにより、自動発光の減少倍率を計算した。代表的な化合物の結果を、以下の表で示す。
【０１２３】
【表５】
これらの結果は、これらの化合物が細胞の生存度を著しく低下させることなく全細胞を使用する発光アッセイでの自動酸化を減少するのに使用できることを証明している。
【０１２４】
全ての刊行物、特許および特許文献は、個々に参考として援用されているように、本明細書中で参考として援用されている。本発明は、種々の特定の好ましい実施形態および技術を参照して、記述されている。しかしながら、本発明の精神および範囲内に留めつつ、多くの変更および改良を行うことができることが理解できるはずである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−６４６９０（Ｐ２０１１−６４６９０Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３４０６５（Ｐ２０１０−２３４０６５）
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【分割の表示】特願２００２−５１０９４１（Ｐ２００２−５１０９４１）の分割
【原出願日】平成１３年６月７日（２００１．６．７）
【出願人】（５００４３００８４）プロメガ・コーポレーション (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【分割の表示】特願２００２−５１０９４１（Ｐ２００２−５１０９４１）の分割
【原出願日】平成１３年６月７日（２００１．６．７）
【出願人】（５００４３００８４）プロメガ・コーポレーション (18)
【Ｆターム（参考）】
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