発現系
【課題】炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に対して防御的な免疫応答を生じる免疫原性試薬の提供。
【解決手段】炭疽菌の完全長防御抗原（ＰＡ）の３つまでのドメインを占める１又はそれ以上のポリペプチドあるいはこれらの変異体を含み、該ドメインの少なくとも１つがＰＡのドメイン１もしくはドメイン４又はその変異体を含む、免疫原性試薬。免疫原性試薬のポリペプチドならびに完全長ＰＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの発現によって生成される。上記方法により高収率のポリペプチドが得られる。
【解決手段】炭疽菌の完全長防御抗原（ＰＡ）の３つまでのドメインを占める１又はそれ以上のポリペプチドあるいはこれらの変異体を含み、該ドメインの少なくとも１つがＰＡのドメイン１もしくはドメイン４又はその変異体を含む、免疫原性試薬。免疫原性試薬のポリペプチドならびに完全長ＰＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの発現によって生成される。上記方法により高収率のポリペプチドが得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）による感染対して防御的な免疫応答を誘導するポリペプチド、これらを作製する方法、かかる方法において有用な組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞、及び使用する核酸と形質転換ベクターに関する。
【０００２】
ワクチン系のための防御抗原（ＰＡ）を発現する現在のシステムは、プロテアーゼ欠損枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を発現宿主として利用する。そのような系は生成物の量と純度に関しては許容されるが、重大な欠点がある。第一に、規制当局が概してこの宿主に不慣れであり、その結果として認可決定が遅れることがある。より重要な点として、現在使用されている枯草菌の菌株は、専用の生産プラントの使用を必要とする熱安定な胞子を生成する。
【０００３】
ＷＯ００／０２５２２号は特に、ＰＡ又はある種の免疫原性フラグメントを発現するＶＥＥウイルスレプリコンを記述している。
【０００４】
大腸菌は一連のヒトワクチンのための発現系として広く知られている。非常に高い細胞密度まで容易に増殖する大腸菌の能力が、この細菌を多くのタンパク質の発現のための理想的宿主にしているが、大腸菌サイトゾルから組換えＰＡを発現し、精製するためのこれまでの試みは、低いタンパク質収率とタンパク質分解作用によって妨げられてきた（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１１０９９−１１１０２、Ｖｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ（１９９３）３４；６９３−６９７及びＳｈａｒｍａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．ｐｕｒｉｆ．（１９９６）、７、３３−３８）。
【０００５】
大腸菌サイトゾルにおいてＰＡを安定な可溶性タンパク質として過剰発現するための戦略が最近記述された（Ｗｉｌｌｈｉｔｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（１９９８）、５；２７３−２７８）。採られた戦略は、ＰＡのＮ末端にアフィニティータグ配列を付加するもので、これは簡便な精製システムを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／００２５２２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１１０９９−１１１０２
【非特許文献２】Ｖｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ（１９９３）３４；６９３−６９７
【非特許文献３】Ｓｈａｒｍａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．ｐｕｒｉｆ．（１９９６）、７、３３−３８
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｈｉｔｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（１９９８）、５；２７３−２７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このシステムに関する問題は、ＰＡが使用できるようになる前にタグを除去するために、さらなる下流プロセシング段階を必要とすることである。
【０００９】
コドンの至適化は、現在既知であり、合成遺伝子の設計において使用される手法である。ほとんどのアミノ酸が２つ以上のコドン配列によってコードされることから、遺伝暗号のある程度の重複性が存在する。様々な生物がこれらの様々なコドンのいずれかを優先的に利用する。コドンを至適化することによって、一般に、特定タンパク質の発現レベルが上昇すると予想される。
【００１０】
これは一般に望ましいが、ＰＡの場合のように、より高い発現レベルがタンパク質分解及び／又は細胞毒性をもたらす場合を除く。そのような場合、発現レベルの上昇は反生産的であり、重大な細胞毒性をもたらしうる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
しかしながら意外にも、出願人は、これが大腸菌の場合には当てはまらず、この系では、菌株内にタンパク質分解酵素が存在するか否かに関わらず、コドンの至適化が組換えＰＡの予想外に高いレベルの発現をもたらすことを発見した。
【００１２】
さらに、ＰＡの防御ドメインの発現は大腸菌における発現を阻害しないと思われる。
【００１３】
天然ＰＡの結晶構造が明らかにされ（Ｐｅｔｏｓａ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８３３−８３８，１９９７）、かかる結晶構造は、ＰＡが４つの異なる、機能的に独立したドメインから成ることを示している：１ａ、１〜１６７アミノ酸と１ｂ、１６８〜２５８アミノ酸に分けられる、ドメイン１；２５９〜４８７アミノ酸のドメイン２；４８８〜５９５アミノ酸のドメイン３及び５９６〜７３５アミノ酸のドメイン４。
【００１４】
出願人は、一部のドメインが、単離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）、融合タンパク質又はこれらの相互の組合せとして使用したとき驚くほど良好な防御作用を生じるらしいことを確認した。
【００１５】
本発明によれば、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性試薬が提供され、かかる試薬は、共同して炭疽菌の完全長防御抗原（ＰＡ）の３つまでのドメインを占める１もしくはそれ以上のポリペプチド又はこれらの変異体を含み、該ドメインの少なくとも１つがＰＡのドメイン１もしくはドメイン４又はその変異体を含む。
【００１６】
具体的には、試薬は、個々のポリペプチドがＰＡの１又はそれ以上の個別ドメインを含む、ポリペプチドの混合物又は融合ペプチドを含む。
【００１７】
特に、試薬は、完全長ＰＡ以外の形態の、ＰＡのドメイン１もしくはドメイン４又はその変異体を含むポリペプチドを含む。存在する場合には、ドメインは適切に完全であり、特にドメイン１はその完全形態で存在する。
【００１８】
ここで使用するとき「ポリペプチド」の語はタンパク質及びペプチドを含む。
【００１９】
ここで使用するとき、「変異体」の表現は、配列内の１又はそれ以上のアミノ酸が欠失しているか又はタンパク質のアミノ酸に置換されているが、まだ炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する、基本配列とは異なるアミノ酸の配列を指す。アミノ酸置換は、アミノ酸が広い類似特性を持つ異なるアミノ酸で置き換えられている場合に「保存的」とみなしうる。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸で置き換えられている場合である。概して、ポリペプチドの生物活性を変化させない非保存的置換はほとんど起こりえない。適切な変異体は、ＰＡ配列と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一である。
【００２０】
特に、ＰＡ配列に対する個々の変異体配列の同一性は、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎ（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．（１９８５）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ ２２７、ｐ．１４３５−１４４１）が述べたマルチアラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）法を用いて評価することができる。「至適化」パーセンテージスコアは、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムのための次のパラメータに関して算定すべきである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップペナルティー＝４及びギャップペナルティー長＝１２。類似性を評価する配列を「試験配列」として使用すべきであり、これは、比較のための基本配列（配列番号１）を最初にアルゴリズムに組み入れねばならないことを意味する。
【００２１】
好ましくは、本発明の試薬は、野生型ＰＡのドメイン１及び／又はドメイン４の配列を持つポリペプチドを含む。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施形態は、炭疽菌のＰＡのドメイン４を含む。
【００２３】
これらのドメインは、下記の表１に示す次のような配列を含む。
【００２４】
【表１】
【００２５】
これらのアミノ酸番号はＷｅｌｋｏｓら、Ｇｅｎｅ ６９（１９８８）２８７−３００に示されているような配列を指し、下記にそれぞれ配列番号１５（図４）及び３（図３）として示している。
【００２６】
ドメイン１は、１ａ及び１ｂと称される２つの領域を含む。領域１ａはアミノ酸１−１６７を含み、領域１ｂはアミノ酸１６８−２５８である。領域１ａは良好な防御応答の誘導のために重要であると思われ、完全なドメインが好ましいと考えられる。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を惹起する免疫原性試薬として、ドメイン１もしくは４又はそれらの防御領域の組合せを使用する。この組合せは、例えば融合ペプチドとして、下記で概説するような本発明の発現系を使用して発現されうる。
【００２８】
ドメイン１を用いるときには、ＰＡ配列のドメイン２に適切に融合され、好ましくはドメイン２及びドメイン３に融合されうる。
【００２９】
そのような組合せ及び予防又は治療におけるそれらの使用は本発明のさらなる態様を構成する。
【００３０】
適切には上述したドメインは、好ましくはＮ−末端グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との、融合タンパク質の一部である。ＧＳＴはタンパク質の精製を助けるだけでなく、おそらくサイズを上昇させる結果として、アジュバント作用も提供しうる。
【００３１】
本発明のポリペプチドは従来の方法によって適切に調製される。例えば、それらは合成されるか、又は組換えＤＮＡテクノロジーを用いて調製されうる。特に、該ドメインをコードする核酸を発現ベクターに組み込み、それを使用して宿主細胞を形質転換する。宿主細胞の培養とそれに続く所望ポリペプチドの単離は、従来の方法を用いて実施することができる。これらの方法において使用される核酸、ベクター及び形質転換細胞は本発明のさらなる態様を構成する。
【００３２】
一般に、使用される宿主細胞は、枯草菌のようなＰＡの調製において慣例的に使用されるものである。
【００３３】
出願人は意外にも、単離又は組合せとしての該ドメインがある種の条件下で大腸菌において成功裏に発現されうることを発見した。
【００３４】
そこで、本発明は、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成するための方法であって、（ａ）防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体、あるいは（ｂ）上述したような防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の少なくとも１つの防御ドメイン又はその変異体を含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸で大腸菌宿主を形質転換し、形質転換した宿主を培養して、それからポリペプチドを回収することを含み、但し、ポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体である場合、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上であることを条件とする方法を提供する。
【００３５】
これらの選択肢を用いて、有利な発現宿主を使用して高い収率の生成物を得ることができる。
【００３６】
大腸菌及び炭疽菌のゲノム内のコドン及びそれらが出現する頻度を表わす表を図１に示す。グアニジン及びシトシンが炭疽菌よりも大腸菌においてはるかに高い頻度で出現することは明らかである。コドン使用頻度内容の分析は次のことを明らかにする：
【００３７】
【表２】
【００３８】
それ故、大腸菌によって優先的に選択されるコドンは、可能な場合にはグアニジン又はシトシンを含むものであると思われる。
【００３９】
免疫原性タンパク質をコードするために使用される配列において、グアニジン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージを野生型炭疽菌で通常認められるよりも高くすることにより、大腸菌における発現が改善されるようなコドン使用が実現される。
【００４０】
適切には、本発明において使用するコード核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージは、少なくともポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体である場合には、４０％以上、好ましくは４５％以上、最も好ましくは５０から５２％である。
【００４１】
これらのユニットをコードする野生型炭疽菌配列を使用して、防御ドメインの高いレベルの発現を実現することができる。しかし、上述したように核酸のＧＣ％を高めることによって収率をさらに改善することができる。
【００４２】
特定実施形態では、かかる方法は炭疽菌のＰＡの発現を含む。
【００４３】
さらに本発明に従えば、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸であって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞が提供される。
【００４４】
上述したように、適切には、コード核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージは４０％以上、好ましくは４５％以上、最も好ましくは５０から５２％である。
【００４５】
適切には、本発明の大腸菌細胞を形質転換するために使用する核酸は合成遺伝子である。特に、核酸は、図２に示すような配列番号１又はその修飾形態である。
【００４６】
「修飾形態」の表現は、本発明に従ったＧＣ含量パーセンテージの必要条件に合致することを条件として、防御免疫応答を誘導するが、何らかの異なるコドンを利用する、ＰＡあるいはそのフラグメント又は変異体をコードする他の核酸配列を指す。適切な修飾形態は、配列番号１に少なくとも８０％類似する、好ましくは９０％類似する、最も好ましくは少なくとも９５％類似する。特に、核酸は配列番号１を含む。
【００４７】
代替的実施形態では、本発明は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞を提供する。
【００４８】
好ましくは、核酸は炭疽菌のドメイン１又はドメイン４をコードする。
【００４９】
さらに本発明に従えば、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成する方法であって、上述したように細胞を培養し、培養から所望するポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。そのような方法は当該技術において周知である。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターであって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である、大腸菌形質転換ベクターを提供する。
【００５１】
本発明のさらにもう１つの態様は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターを包含する。
【００５２】
大腸菌の形質転換において使用するための適切なベクターは当該技術で周知である。例えば、Ｔ７発現系は良好な発現レベルを提供する。しかし、特に好ましいベクターは、Ａｖｅｃｉａ（ＵＫ）から入手しうるｐＡＧ１６３を含む。
【００５３】
ＰＡをコードし、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、最も好ましくは５０から５２％のＧＣ含量を有する配列番号１の核酸又はその変異体は本発明のさらなる態様を構成する。
【００５４】
所望する場合には、ＰＡ、変異体又はドメインは、もう１つ別のタンパク質への融合として、例えば異なる免疫を与えるタンパク質、産物の精製を助けるタンパク質、又は正しい翻訳の開始を保証する高度発現タンパク質（例えばチオレドキシン、ＧＳＴ）への融合として発現されうる。
【００５５】
場合によっては、系の抑制を改善するためにＴ７リゾチームのような付加的な系が発現系に加えられるが、本発明の場合には、細胞毒性に関連する問題は認められなかった。
【００５６】
本発明の工程ではいかなる適切な大腸菌株も使用できる。いくつかのプロテアーゼを欠損している菌株（例えばＩｏｎ−、ｏｍｐＴ−）が使用可能であり、それらはタンパク質分解を最小限に抑えると予想される。しかし、出願人は、生成物の良好な収率を達成するためにそのような菌株を使用する必要がないこと、そしてＫ１２のような他の既知の菌株が意外にも高い生成物収率をもたらすことを発見した。
【００５７】
菌株の発酵は一般に、当該技術において理解されているような従来の条件下で実施される。例えば、発酵は、プラスミドの維持のための抗生物質を含み、誘導のためのＩＰＴＧを添加した複合培地を使用して、好ましくは大きな振とうフラスコにおいて、回分培養として実施することができる。
【００５８】
適切には、培養物は回収され、精製のために必要なときまで−２０℃で保存する。
【００５９】
大腸菌ＰＡ（又は変異体又はドメイン）発現のための適切な精製スキームは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現において使用されるものから適合させることができる。使用する個々の精製段階は組換えＰＡの物理的特徴に依存する。典型的には、カラムへの結合の差別化を最大にする条件下でイオン交換クロマトグラフィー分離を実施し、その後浅い勾配から分画を採集する。一部の場合には、所望する特性を備えている産物を得るために単一のクロマトグラフィー段階で十分なこともある。
【００６０】
分画は、必要に応じてＳＤＳ ＰＡＧＥ又はウエスタンブロット法を使用して、生成物の存在に関して分析することができる。
【００６１】
下記に示すように、ｒＰＡの完全な又は部分的ドメインである一連の融合タンパク質を成功裏にクローニングし、発現することを達成した。ＳＴＩ胞子の攻撃に対するこれらの融合タンパク質の免疫原性と防御効果をＡ／Ｊマウスモデルにおいて評価した。
【００６２】
すべてのｒＰＡドメインタンパク質がＡ／Ｊマウスにおいて免疫原性であり、ＧＳＴ対照免疫マウスに比べ、攻撃に対して少なくとも部分的な防御を与えた。輸送タンパク質であるドメインタンパク質のＮ末端に結合したＧＳＴは、免疫動物において抗体反応が刺激されたことが示すようにインビボで、又はウエスタンブロットのあと抗ｒＰＡ抗血清で融合タンパク質が検出できたことからインビトロでも、融合タンパク質の免疫原性を損なわず、ＧＳＴタグがｒＰＡエピトープの認識を妨げないことを示唆した。より大きな融合タンパク質による免疫化が最も高い力価を生じた。特に、完全長ＧＳＴ１−４融合タンパク質で免疫したマウスは、ｒＰＡ免疫群の約８倍の平均血清抗ｒＰＡ濃度を生じた（図５）。開裂したＧＳＴを含むｒＰＡドメイン１−４でマウスを免疫すると、融合タンパク質での免疫によって生じる力価の約半分の力価を生じた。なぜこの融合タンパク質がはるかに免疫原性であるかは不明である。このタンパク質のサイズ上昇が免疫エフェクター細胞にアジュバント作用を及ぼしうることが考えられる。他の融合タンパク質ではサイズ上昇はこの応答を同じ程度には刺激せず、開裂したタンパク質はそれらの融合タンパク質相対物と同様に防御性であったので、ＧＳＴタグのアジュバント作用は攻撃に対する防御を増強しなかった。
【００６３】
良好な抗ｒＰＡ力価を持つにもかかわらず、ＧＳＴ１、開裂１、ＧＳＴ１ｂ−２、ＧＳＴ１ｂ−３及びＧＳＴ１−３で免疫した群においては、１０２ＭＬＤより低い攻撃レベルで防御にある種のブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ、突破、エスケープ）が起こり、これらのタンパク質による免疫は、ＧＳＴ対照免疫マウスと比較して、マウスの生存期間を延長させず、マウスは攻撃によって死亡に至った。これは、免疫応答が、感染に対して十分な抵抗性を達成するためにこれらのタンパク質によって適切にプライミングされていなかったことを示唆する。マウス及びモルモットにおける他の試験で示されたように（Ｌｉｔｔｌｅ Ｓ．Ｆ．ら、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５０９−５１２、Ｔｕｒｎｂｕｌｌ Ｐ．Ｃ．Ｂ．ら、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：３５６−３６３）、ＰＡに対する抗体力価と攻撃に対する防御の間に厳密な相関関係は存在しない。しかし、防御のためにはある程度の抗体の閾値が必要であり（Ｃｏｈｅｎ Ｓ．ら、２０００ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：４５４９−４５５８）、防御のために免疫応答の細胞媒介性成分も刺激される必要があることを示唆している（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ １９８９）。
【００６４】
おそらくドメイン３の不在下ではタンパク質がより一層分解を受けやすいために、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ及びウエスタンブロット法の結果が示すように、ＧＳＴ１、ＧＳＴ１ｂ−２及びＧＳＴ１−２は生成された最も安定でない融合タンパク質であり、この不安定性が防御エピトープの喪失をもたらしたと考えられる。
【００６５】
タンパク質の高次構造も防御免疫応答を刺激する上で重要であると考えられる。融合タンパク質からドメイン１ａを除去すると、それらの完全等価物ＧＳＴ１−２及びＧＳＴ１−３と比較したとき、低い抗体力価と攻撃に対する低い防御作用を生じた。同様に、ＧＳＴ１単独で免疫したマウスは攻撃に対して部分的に保護されたが、ＧＳＴ１−２融合タンパク質としてドメイン２と組み合わせたときには、１０２ＭＬＤ攻撃レベルで完全な防御が認められた。しかし、ＧＳＴ１−２融合タンパク質での免疫によって刺激された免疫応答はより高い１０３ＭＬＤ攻撃レベルに対して完全な防御を与えるには不十分であり、これはやはりタンパク質の分解による防御エピトープの喪失によるものであると考えられた。
【００６６】
ＧＳＴ４単独、開裂した４単独及び２つの個々に発現されたドメイン、ＧＳＴ１及びＧＳＴ４の混合物を含めて、ドメイン４を含むトランケートで免疫したすべての群が、１０３ＭＬＤのＳＴＩ胞子による攻撃に対して完全に防御された（表１）。Ｂｒｏｓｓｉｅｒらは、ドメイン４なしでＰＡを発現する炭疽菌の突然変異菌株で免疫したマウスにおける防御の低下を示し（Ｂｒｏｓｓｉｅｒ Ｆ．ら、２０００、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：１７８１−１７８６）、これは、ＧＳＴ１−３による免疫が良好な抗体力価にも関わらず防御のブレイクスルーをもたらした今回の試験において確認された。これらのデータは、ドメイン４がＰＡの免疫優性サブユニットであることを示している。ドメイン４はＰＡポリペプチドのカルボキシ末端の１３９アミノ酸である。ドメイン４は、アミノ酸残基６７９−６９３の間に位置する小さなループ内及びその近傍であると同定された（Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ Ｍ．ら、１９９９ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：１８６０−１８６５）、宿主細胞レセプタ結合領域を含む（Ｌｉｔｔｌｅ Ｓ．Ｆ．ら、１９９６ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２：７０７−７１５）。
【００６７】
それ故、ドメイン４の領域内に突然変異（Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ １９９９、前出）又は欠失（Ｂｒｏｓｓｉｅｒ １９９９、前出）を含んで発現されるＰＡの形態は無毒性であることが明らかにされたので、ドメイン４は宿主細胞の毒性にとって重要である。ＰＡの結晶構造は、ドメイン４、特にドメインの１９アミノ酸ループ（７０３−７２２）が、互いに密接に関連する他の３つのドメインよりも露出されていることを示す（Ｐｅｔｏｓａ １９９７、前出）。この構造配置がドメイン４を免疫エフェクター細胞による認識のために最も目立つエピトープにしていると考えられ、それ故ドメイン４を含む融合タンパク質は最も防御的な免疫応答を誘発する。
【００６８】
この研究は防御免疫応答の刺激におけるＰＡの役割をさらに明らかにし、炭疽感染に対する防御がＰＡの個々のドメインに帰せられることを示した。
【００６９】
ここからは、次のような添付の図面を参照しながら、実施例によって本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】大腸菌及び炭疽菌内で認められるコドン出現頻度の表である。
【図２】Ｗｅｌｋｏｓら、前出によって公表されたような炭疽菌のＰＡをコードする、本発明に従った核酸の配列を示す。
【図３−１】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−２】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−３】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−４】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−５】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−６】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図４】それぞれＰＡのドメイン４のアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号１５−１６を示す。
【図５】１日目と２８日目に、ＰＡフラグメントを含む融合タンパク質１０μｇを筋肉内注射して免疫したＡ／Ｊマウスからの、初期免疫後３７日目の抗ｒＰＡ ＩｇＧ濃度を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
結果は、処置群とで５匹のマウスから得たサンプルの平均士標準誤差で示した。
【実施例１】
【００７２】
大腸菌における発現の検討
ｒＰＡ発現プラスミドｐＡＧ１６３：：ｒＰＡを、もとのＴｃＲ遺伝子をＫｍＲマーカーに置き換えて改変した。このプラスミドを発現宿主である大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）に形質転換し、発現レベルと溶解度を評価した。この菌株は、細胞内プロテアーゼＬａ（Ｉｏｎ遺伝子産物）及び外膜プロテアーゼＯｍｐＴを欠損している。
【００７３】
発現試験は、しかしながら、Ｉｏｎ＋Ｋ１２宿主菌株と比較してこの菌株において可溶性タンパク質の蓄積の改善を示さなかった（すなわち過度のタンパク質分解により蓄積が妨げられる）。ｒＰＡの細胞内タンパク質分解はＬａプロテアーゼの作用によるものではないと結論された。
【実施例２】
【００７４】
発酵分析
Ｋ１２菌株ＵＴ５６００（ＤＥ３）ｐＡＧ１６３：：ｒＰＡを使用して発酵のさらなる分析を実施した。
【００７５】
この培養中のｒＰＡは可溶性分画と不溶性分画に分けられる（３５０ｍｇ／Ｌ不溶性、６５０ｍｇ／Ｌ完全長可溶性と推定された）ことが認められた。使用した条件（３７℃、誘導のための１ｍＭ ＩＰＴＧ）は振とうフラスコ培養において検出可能な可溶性ｒＰＡを生成せず、また上記の実施例１で述べた結果を考慮すると、多量の可溶性ｒＰＡの存在は意外である。それにもかかわらず、発酵、誘導及び回収時点の操作は大腸菌Ｋ１２発現菌株においてｒＰＡの安定な蓄積を可能にすると思われる。
【実施例３】
【００７６】
最初にＵＴ５６００（ＤＥ３）ｐＡＧ１６３：：ｒＰＡ発酵からの不溶性封入体として単離した物質から、ｒＰＡの試料を作製した。封入体を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８で２回洗い、同じ緩衝液＋２Ｍ尿素で１回洗った。次にそれらを緩衝液＋８Ｍ尿素に可溶化し、細胞破片をペレット化した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８に希釈し、４℃で一晩静置インキューベーションして尿素を除去した。希釈した試料をＱセファロースカラムにかけ、ＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶出した。最も高純度のｒＰＡを含む分画をプールし、等分して、−７０℃で冷凍した。４−１２％ＭＥＳ−ＳＤＳ ＮｕＰＡＧＥゲルを用いて既知の標準品に対してこの試料を試験すると、この試料が高純度であり、内毒素汚染が低いことを示した。
【実施例４】
【００７７】
生成物のさらなる特徴決定
生成物のＮ末端配列決定は、Ｎ末端配列が
ＭＥＶＫＱＥＮＲＬＬ（配列番号２）
から成ることを示した。
【００７８】
これは、予想されたように生成物が残存する開始メチオニンを含むことを確認した。
【００７９】
物質はウエスタンブロットにおいて反応することが認められた；試料に関するＭＡＬＤＩ−ＭＳは約８２，７００の質量（予想質量８２，９１５に比して）を示した。高い分子質量と使用した質量標準からの距離（６６ＫＤａ）を考慮すると、これは、物質が有意のトランケーションを有していないが、試料内での微小不均一性を排除しないことの示唆であると考えられる。
【実施例５】
【００８０】
ＰＡの個々のドメインの試験
ＰＡの個々のドメインを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐＧＥＸ−６Ｐ−３発現系を使用して、輸送タンパク質グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質の形態で大腸菌における組換えタンパク質として生成した。様々なドメインの配列及びそれらをコードするために使用されるＤＮＡ配列を図３として添付している。それぞれのアミノ酸及びＤＮＡ配列を下記の表２に示す。
【００８１】
これらの融合タンパク質を使用して、総容量１００μｌ中、２０％ｖ／ｖアルヒドロゲルに吸着させたそれぞれの融合タンパク質１０μｇの筋肉内注射によってＡ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｏｌａｃ）を免疫した。
【００８２】
動物を２回免疫し、指示されている用量レベルの炭疽菌（ＳＴＩ菌株）の胞子での攻撃誘発によってそれらの防御免疫の発現を調べた。下記の表は攻撃誘発後１４日目の生存動物を示す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
データは、ＧＳＴとの融合タンパク質の形態であるか否かに関わらず、ＰＡの４つのドメイン全部の組み合わせが高い攻撃レベルまで防御性であったことを示している。１＋２＋３を残してドメイン４を除くと、試験した最も高い攻撃レベル、９×１０５でブレイクスルーが生じた。ドメイン１＋２は、９×１０４胞子でドメイン１＋２＋３の組合せと同等に防御性であった。しかし、ドメイン１ｂ＋２とのＧＳＴ融合を残してドメイン１ａを除去すると、試験した最高攻撃誘発レベル（９×１０４）で防御にブレイクスルーが生じ、これはドメイン３を付加することによってわずかだけ改善された。
【００８５】
データは、ＰＡによって誘導される防御免疫が個々のドメイン（完全なドメイン１及びドメイン４）又は４つのドメイン全部からの順列として得られるドメインの組合せに帰せられることを示している。
【００８６】
ドメイン４についてのアミノ酸配列及びＤＮＡコード配列を、それぞれ配列番号１５及び１６として図４に示している。
【実施例６】
【００８７】
ワクチンとしてのドメインのさらなる試験
ＰＡドメイン、アミノ酸１−２５９、１６８−４８８、１−４８８、１６８−５９６、１−５９６、２６０−７３５、４８９−７３５、５９７−７３５及び１−７３５（それぞれトランケートＧＳＴ１、ＧＳＴ１ｂ−２、ＧＳＴ１−２、ＧＳＴ１ｂ−３、ＧＳＴ１−３、ＧＳＴ２−４、ＧＳＴ３−４、ＧＳＴ４及びＧＳＴ１−４）をコードするＤＮＡを炭疽菌Ｓｔｅｒｎｅ ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｌａｃプロモーターの下流のフレーム内で、発現ベクターｐＧＥＸ−６−Ｐ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この系を使用して産生されるタンパク質は、Ｎ末端グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼタンパク質（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現された。次にタンパク質発現試験のために、ＰＡドメインをコードするＤＮＡを内包する組換えプラスミドＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。
【００８８】
組換えｐＧＥＸ−６−Ｐ３プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び１％ｗ／ｖグルコースを含むＬ−ブロス中で培養した。培養を振とうしながら（１７０回転／分）３０℃でＡ６００ｎｍ０．４にインキュベートした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。培養をさらに４時間インキュベートし、その後１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離して回収した。
【００８９】
ＰＡトランケート−融合タンパク質の初期抽出は、それらが封入体として産生されたことを示した。細胞ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、氷冷水浴中４×２０秒間音波破砕した。懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次に室温で１時間、攪拌しながら８Ｍ尿素に懸濁することによって細胞ペレットを尿素抽出した。懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を、４００ｍＭ Ｌ−アルギニン及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８に対して透析したあと、ＰＢＳに透析した。
【００９０】
ＰＡトランケート−融合タンパク質のリフォールディングの成功により、グルタチオンセファロースＣＬ−４Ｂアフィニティーカラムで精製することができた。すべての抽出物（トランケートＧＳＴ１ｂ−２、アミノ酸残基１６８−４８７を除く）を、あらかじめＰＢＳで平衡させた１５ｍｌグルタチオンセファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。カラムをＰＢＳで洗い、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０ｍＭ還元グルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７で融合タンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定したＰＡトランケートを含む分画をプールし、ＰＢＳに対して透析した。ＢＣＡ（Ｐｅｒｂｉｏ）を用いてタンパク質濃度を測定した。
【００９１】
しかし、トランケートＧＳＴ１ｂ−２は、還元グルタチオンを使用したグルタチオンセファロースＣＬ−４Ｂアフィニティーカラムからは溶出することができず、そのためイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。明細には、トランケートＧＳＴ１ｂ−２を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８に対して透析した後、同じ緩衝液で平衡させたＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中、０−１Ｍの漸増ＮａＣｌ勾配で融合タンパク質を溶出した。ＧＳＴ−タンパク質を含む分画をプールし、濃縮して、あらかじめＰＢＳで平衡させたＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。融合タンパク質を含む分画をプールし、ＢＣＡ（Ｐｅｒｂｉｏ）によってタンパク質濃度を測定した。収率は培養１リットル当り１から４３ｍｇであった。
【００９２】
フラグメントの分子量及びＰＡに対する抗体によるそれらの認識を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法を用いて確認した。ＳＤＳ Ｐａｇｅ及びウエスタンブロット法によるｒＰＡトランケートの分析は予想されたサイズのタンパク質バンドを示した。検討したすべてのｒＰＡトランケートにおいてある程度の分解が明らかであり、枯草菌で発現される組換えＰＡとの類似性を示した。ｒＰＡトランケート、ＧＳＴ１、ＧＳＴ１ｂ−２及びＧＳＴ１−２は、ドメイン３の不在下で特に分解を受けやすかった。これはドメイン３内に突然変異を含むｒＰＡ構築物についても同様に報告されており、かかるｒＰＡ構築物は炭疽菌培養上清から精製することができず（Ｂｒｏｓｓｉｅｒ １９９９）、ドメイン３がドメイン１及び２を安定化しうることを示唆している。
【００９３】
この試験では、雌性ＳＰＦ（特定病原菌不在）Ａ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ ＵＫ）を使用した。これらの動物が炭疽感染についての安定したモデルであるためである（Ｗｅｌｋｏｓ １９８６）。マウスは週齢を一致させ、試験開始時点で７週齢であった。
【００９４】
Ａ／Ｊマウスを試験の１日目と２８日目に、総容量１００μｌのＰＢＳ中２０％の１．３％ｖ／ｖアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（ＨＣＩ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた１０μｇの融合タンパク質で免疫した。枯草菌からのｒＰＡ（Ｍｉｌｌｅｒ １９９８）、組換えＧＳＴ対照タンパク質、又はＧＳＴタグを除去したドメイン１、４及び１−４を含む融合タンパク質で免疫した群も含めた。免疫用量を後足の２部位に筋肉内投与した。酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）による血清抗体分析のために、初期免疫後３７日目にマウスから採血した。
【００９５】
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１プレートにつき２列を除いて、枯草菌から発現させた５μｇ／ｍｌのｒＰＡ（Ｍｉｌｌｅｒ １９９８）によって４℃で一晩被覆し、前記の２列については５μｇ／ｍｌの抗マウスＦａｂ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ）で被覆した。１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗い、ＰＢＳ中５％ｗ／ｖ脱脂粉乳（ｂｌｏｔｔｏ）により３７℃で２時間遮断した。１％ｂｌｏｔｔｏ中で２倍希釈した血清をｒＰＡ被覆ウエルに加え、抗Ｆａｂ被覆ウエルに加えて４℃で一晩インキュベートしたマウスＩｇＧ標準品（Ｓｉｇｍａ）と共に２回分析した。洗浄後、ＰＢＳ中で１：２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．）をすべてのウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。再びプレートを洗ったあと、基質２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸）（１．０９ｍＭ ＡＢＴＳ、Ｓｉｇｍａ）を加えた。室温で２０分間インキュベートした後、４１４ｎｍでウエルの吸光度を測定した（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ，ＩＣＮ Ｆｌｏｗ）。Ｔｉｔｅｒｓｏｆｔバージョン３．１ｃソフトウエアを使用して標準曲線を算定した。力価をμｇＩｇＧ／ｍｌ血清で表わし、群平均±平均の標準誤差（ｓｅｍ）を算定した。結果を図５に示す。
【００９６】
作製したすべてのｒＰＡトランケートが免疫原性であり、ＧＳＴ１ｂ−２トランケートで免疫した群についての６μｇ／ｍｌから、ＧＳＴ１−４トランケートで免疫した群における１４８８μｇ／ｍｌまでの範囲で、Ａ／Ｊマウスにおける平均血清抗ｒＰＡ ＩｇＧ濃度を刺激した（図５）。ＧＳＴ対照免疫マウスは、ｒＰＡに対する検出可能な抗体を有していなかった。
【００９７】
免疫計画の７０日目に炭疽菌ＳＴＩ胞子でマウスを攻撃した。攻撃誘発に十分なＳＴＩ胞子を株から取り出し、滅菌蒸留水で洗って、１×１０７及び１×１０６胞子／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳに再懸濁した。それぞれ１×１０７及び１×１０６胞子／マウスを含む０．１ｍｌ容量を腹腔内投与してマウスを攻撃誘発し、誘発後１４日間モニターしてマウスの防御状態を調べた。人道的エンドポイント（ｈｕｍａｎｅ ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔｓ）を厳密に遵守し、致死的感染を有していることを示唆する一連の臨床徴候を示した動物は別により分けた。攻撃誘発後１４日間生存した免疫マウスの数を表３に示す。
【００９８】
【表４】
【００９９】
１０３ＭＬＤのＳＴＩ胞子で攻撃誘発した群は、ＧＳＴ１、ＧＳＴ１−２及び開裂１で免疫した群及びＧＳＴ単独で免疫した対照群を除いて、すべて完全に防御された。ＧＳＴ１、ＧＳＴ１−２及び開裂１で免疫した群においては防御に何らかのブレイクスルーが存在し、また対照群はすべて感染のために死亡し、死亡までの平均期間（ＭＴＴＤ）は２．４±０．２日であった。１０２ＭＬＤのより低い攻撃誘発レベルでは、ＧＳＴ１−２、ＧＳＴ４及び開裂４で免疫した群はすべて完全に防御されたが、他の群では防御に何らかのブレイクスルーが存在した。これらの群において死亡したマウスは平均４．５±０．２日のＭＴＴＤであり、４±０．４日のＭＴＴＤですべて死亡したＧＳＴ対照免疫群と有意に異ならなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）による感染対して防御的な免疫応答を誘導するポリペプチド、これらを作製する方法、かかる方法において有用な組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞、及び使用する核酸と形質転換ベクターに関する。
【０００２】
ワクチン系のための防御抗原（ＰＡ）を発現する現在のシステムは、プロテアーゼ欠損枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を発現宿主として利用する。そのような系は生成物の量と純度に関しては許容されるが、重大な欠点がある。第一に、規制当局が概してこの宿主に不慣れであり、その結果として認可決定が遅れることがある。より重要な点として、現在使用されている枯草菌の菌株は、専用の生産プラントの使用を必要とする熱安定な胞子を生成する。
【０００３】
ＷＯ００／０２５２２号は特に、ＰＡ又はある種の免疫原性フラグメントを発現するＶＥＥウイルスレプリコンを記述している。
【０００４】
大腸菌は一連のヒトワクチンのための発現系として広く知られている。非常に高い細胞密度まで容易に増殖する大腸菌の能力が、この細菌を多くのタンパク質の発現のための理想的宿主にしているが、大腸菌サイトゾルから組換えＰＡを発現し、精製するためのこれまでの試みは、低いタンパク質収率とタンパク質分解作用によって妨げられてきた（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１１０９９−１１１０２、Ｖｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ（１９９３）３４；６９３−６９７及びＳｈａｒｍａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．ｐｕｒｉｆ．（１９９６）、７、３３−３８）。
【０００５】
大腸菌サイトゾルにおいてＰＡを安定な可溶性タンパク質として過剰発現するための戦略が最近記述された（Ｗｉｌｌｈｉｔｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（１９９８）、５；２７３−２７８）。採られた戦略は、ＰＡのＮ末端にアフィニティータグ配列を付加するもので、これは簡便な精製システムを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／００２５２２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１１０９９−１１１０２
【非特許文献２】Ｖｏｄｋｉｎら、Ｃｅｌｌ（１９９３）３４；６９３−６９７
【非特許文献３】Ｓｈａｒｍａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．ｐｕｒｉｆ．（１９９６）、７、３３−３８
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｈｉｔｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（１９９８）、５；２７３−２７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このシステムに関する問題は、ＰＡが使用できるようになる前にタグを除去するために、さらなる下流プロセシング段階を必要とすることである。
【０００９】
コドンの至適化は、現在既知であり、合成遺伝子の設計において使用される手法である。ほとんどのアミノ酸が２つ以上のコドン配列によってコードされることから、遺伝暗号のある程度の重複性が存在する。様々な生物がこれらの様々なコドンのいずれかを優先的に利用する。コドンを至適化することによって、一般に、特定タンパク質の発現レベルが上昇すると予想される。
【００１０】
これは一般に望ましいが、ＰＡの場合のように、より高い発現レベルがタンパク質分解及び／又は細胞毒性をもたらす場合を除く。そのような場合、発現レベルの上昇は反生産的であり、重大な細胞毒性をもたらしうる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
しかしながら意外にも、出願人は、これが大腸菌の場合には当てはまらず、この系では、菌株内にタンパク質分解酵素が存在するか否かに関わらず、コドンの至適化が組換えＰＡの予想外に高いレベルの発現をもたらすことを発見した。
【００１２】
さらに、ＰＡの防御ドメインの発現は大腸菌における発現を阻害しないと思われる。
【００１３】
天然ＰＡの結晶構造が明らかにされ（Ｐｅｔｏｓａ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８３３−８３８，１９９７）、かかる結晶構造は、ＰＡが４つの異なる、機能的に独立したドメインから成ることを示している：１ａ、１〜１６７アミノ酸と１ｂ、１６８〜２５８アミノ酸に分けられる、ドメイン１；２５９〜４８７アミノ酸のドメイン２；４８８〜５９５アミノ酸のドメイン３及び５９６〜７３５アミノ酸のドメイン４。
【００１４】
出願人は、一部のドメインが、単離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）、融合タンパク質又はこれらの相互の組合せとして使用したとき驚くほど良好な防御作用を生じるらしいことを確認した。
【００１５】
本発明によれば、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性試薬が提供され、かかる試薬は、共同して炭疽菌の完全長防御抗原（ＰＡ）の３つまでのドメインを占める１もしくはそれ以上のポリペプチド又はこれらの変異体を含み、該ドメインの少なくとも１つがＰＡのドメイン１もしくはドメイン４又はその変異体を含む。
【００１６】
具体的には、試薬は、個々のポリペプチドがＰＡの１又はそれ以上の個別ドメインを含む、ポリペプチドの混合物又は融合ペプチドを含む。
【００１７】
特に、試薬は、完全長ＰＡ以外の形態の、ＰＡのドメイン１もしくはドメイン４又はその変異体を含むポリペプチドを含む。存在する場合には、ドメインは適切に完全であり、特にドメイン１はその完全形態で存在する。
【００１８】
ここで使用するとき「ポリペプチド」の語はタンパク質及びペプチドを含む。
【００１９】
ここで使用するとき、「変異体」の表現は、配列内の１又はそれ以上のアミノ酸が欠失しているか又はタンパク質のアミノ酸に置換されているが、まだ炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する、基本配列とは異なるアミノ酸の配列を指す。アミノ酸置換は、アミノ酸が広い類似特性を持つ異なるアミノ酸で置き換えられている場合に「保存的」とみなしうる。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸で置き換えられている場合である。概して、ポリペプチドの生物活性を変化させない非保存的置換はほとんど起こりえない。適切な変異体は、ＰＡ配列と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一である。
【００２０】
特に、ＰＡ配列に対する個々の変異体配列の同一性は、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎ（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．（１９８５）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ ２２７、ｐ．１４３５−１４４１）が述べたマルチアラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）法を用いて評価することができる。「至適化」パーセンテージスコアは、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムのための次のパラメータに関して算定すべきである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップペナルティー＝４及びギャップペナルティー長＝１２。類似性を評価する配列を「試験配列」として使用すべきであり、これは、比較のための基本配列（配列番号１）を最初にアルゴリズムに組み入れねばならないことを意味する。
【００２１】
好ましくは、本発明の試薬は、野生型ＰＡのドメイン１及び／又はドメイン４の配列を持つポリペプチドを含む。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施形態は、炭疽菌のＰＡのドメイン４を含む。
【００２３】
これらのドメインは、下記の表１に示す次のような配列を含む。
【００２４】
【表１】
【００２５】
これらのアミノ酸番号はＷｅｌｋｏｓら、Ｇｅｎｅ ６９（１９８８）２８７−３００に示されているような配列を指し、下記にそれぞれ配列番号１５（図４）及び３（図３）として示している。
【００２６】
ドメイン１は、１ａ及び１ｂと称される２つの領域を含む。領域１ａはアミノ酸１−１６７を含み、領域１ｂはアミノ酸１６８−２５８である。領域１ａは良好な防御応答の誘導のために重要であると思われ、完全なドメインが好ましいと考えられる。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を惹起する免疫原性試薬として、ドメイン１もしくは４又はそれらの防御領域の組合せを使用する。この組合せは、例えば融合ペプチドとして、下記で概説するような本発明の発現系を使用して発現されうる。
【００２８】
ドメイン１を用いるときには、ＰＡ配列のドメイン２に適切に融合され、好ましくはドメイン２及びドメイン３に融合されうる。
【００２９】
そのような組合せ及び予防又は治療におけるそれらの使用は本発明のさらなる態様を構成する。
【００３０】
適切には上述したドメインは、好ましくはＮ−末端グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との、融合タンパク質の一部である。ＧＳＴはタンパク質の精製を助けるだけでなく、おそらくサイズを上昇させる結果として、アジュバント作用も提供しうる。
【００３１】
本発明のポリペプチドは従来の方法によって適切に調製される。例えば、それらは合成されるか、又は組換えＤＮＡテクノロジーを用いて調製されうる。特に、該ドメインをコードする核酸を発現ベクターに組み込み、それを使用して宿主細胞を形質転換する。宿主細胞の培養とそれに続く所望ポリペプチドの単離は、従来の方法を用いて実施することができる。これらの方法において使用される核酸、ベクター及び形質転換細胞は本発明のさらなる態様を構成する。
【００３２】
一般に、使用される宿主細胞は、枯草菌のようなＰＡの調製において慣例的に使用されるものである。
【００３３】
出願人は意外にも、単離又は組合せとしての該ドメインがある種の条件下で大腸菌において成功裏に発現されうることを発見した。
【００３４】
そこで、本発明は、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成するための方法であって、（ａ）防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体、あるいは（ｂ）上述したような防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の少なくとも１つの防御ドメイン又はその変異体を含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸で大腸菌宿主を形質転換し、形質転換した宿主を培養して、それからポリペプチドを回収することを含み、但し、ポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体である場合、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上であることを条件とする方法を提供する。
【００３５】
これらの選択肢を用いて、有利な発現宿主を使用して高い収率の生成物を得ることができる。
【００３６】
大腸菌及び炭疽菌のゲノム内のコドン及びそれらが出現する頻度を表わす表を図１に示す。グアニジン及びシトシンが炭疽菌よりも大腸菌においてはるかに高い頻度で出現することは明らかである。コドン使用頻度内容の分析は次のことを明らかにする：
【００３７】
【表２】
【００３８】
それ故、大腸菌によって優先的に選択されるコドンは、可能な場合にはグアニジン又はシトシンを含むものであると思われる。
【００３９】
免疫原性タンパク質をコードするために使用される配列において、グアニジン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージを野生型炭疽菌で通常認められるよりも高くすることにより、大腸菌における発現が改善されるようなコドン使用が実現される。
【００４０】
適切には、本発明において使用するコード核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージは、少なくともポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体である場合には、４０％以上、好ましくは４５％以上、最も好ましくは５０から５２％である。
【００４１】
これらのユニットをコードする野生型炭疽菌配列を使用して、防御ドメインの高いレベルの発現を実現することができる。しかし、上述したように核酸のＧＣ％を高めることによって収率をさらに改善することができる。
【００４２】
特定実施形態では、かかる方法は炭疽菌のＰＡの発現を含む。
【００４３】
さらに本発明に従えば、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸であって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞が提供される。
【００４４】
上述したように、適切には、コード核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージは４０％以上、好ましくは４５％以上、最も好ましくは５０から５２％である。
【００４５】
適切には、本発明の大腸菌細胞を形質転換するために使用する核酸は合成遺伝子である。特に、核酸は、図２に示すような配列番号１又はその修飾形態である。
【００４６】
「修飾形態」の表現は、本発明に従ったＧＣ含量パーセンテージの必要条件に合致することを条件として、防御免疫応答を誘導するが、何らかの異なるコドンを利用する、ＰＡあるいはそのフラグメント又は変異体をコードする他の核酸配列を指す。適切な修飾形態は、配列番号１に少なくとも８０％類似する、好ましくは９０％類似する、最も好ましくは少なくとも９５％類似する。特に、核酸は配列番号１を含む。
【００４７】
代替的実施形態では、本発明は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞を提供する。
【００４８】
好ましくは、核酸は炭疽菌のドメイン１又はドメイン４をコードする。
【００４９】
さらに本発明に従えば、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成する方法であって、上述したように細胞を培養し、培養から所望するポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。そのような方法は当該技術において周知である。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターであって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である、大腸菌形質転換ベクターを提供する。
【００５１】
本発明のさらにもう１つの態様は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターを包含する。
【００５２】
大腸菌の形質転換において使用するための適切なベクターは当該技術で周知である。例えば、Ｔ７発現系は良好な発現レベルを提供する。しかし、特に好ましいベクターは、Ａｖｅｃｉａ（ＵＫ）から入手しうるｐＡＧ１６３を含む。
【００５３】
ＰＡをコードし、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、最も好ましくは５０から５２％のＧＣ含量を有する配列番号１の核酸又はその変異体は本発明のさらなる態様を構成する。
【００５４】
所望する場合には、ＰＡ、変異体又はドメインは、もう１つ別のタンパク質への融合として、例えば異なる免疫を与えるタンパク質、産物の精製を助けるタンパク質、又は正しい翻訳の開始を保証する高度発現タンパク質（例えばチオレドキシン、ＧＳＴ）への融合として発現されうる。
【００５５】
場合によっては、系の抑制を改善するためにＴ７リゾチームのような付加的な系が発現系に加えられるが、本発明の場合には、細胞毒性に関連する問題は認められなかった。
【００５６】
本発明の工程ではいかなる適切な大腸菌株も使用できる。いくつかのプロテアーゼを欠損している菌株（例えばＩｏｎ−、ｏｍｐＴ−）が使用可能であり、それらはタンパク質分解を最小限に抑えると予想される。しかし、出願人は、生成物の良好な収率を達成するためにそのような菌株を使用する必要がないこと、そしてＫ１２のような他の既知の菌株が意外にも高い生成物収率をもたらすことを発見した。
【００５７】
菌株の発酵は一般に、当該技術において理解されているような従来の条件下で実施される。例えば、発酵は、プラスミドの維持のための抗生物質を含み、誘導のためのＩＰＴＧを添加した複合培地を使用して、好ましくは大きな振とうフラスコにおいて、回分培養として実施することができる。
【００５８】
適切には、培養物は回収され、精製のために必要なときまで−２０℃で保存する。
【００５９】
大腸菌ＰＡ（又は変異体又はドメイン）発現のための適切な精製スキームは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現において使用されるものから適合させることができる。使用する個々の精製段階は組換えＰＡの物理的特徴に依存する。典型的には、カラムへの結合の差別化を最大にする条件下でイオン交換クロマトグラフィー分離を実施し、その後浅い勾配から分画を採集する。一部の場合には、所望する特性を備えている産物を得るために単一のクロマトグラフィー段階で十分なこともある。
【００６０】
分画は、必要に応じてＳＤＳ ＰＡＧＥ又はウエスタンブロット法を使用して、生成物の存在に関して分析することができる。
【００６１】
下記に示すように、ｒＰＡの完全な又は部分的ドメインである一連の融合タンパク質を成功裏にクローニングし、発現することを達成した。ＳＴＩ胞子の攻撃に対するこれらの融合タンパク質の免疫原性と防御効果をＡ／Ｊマウスモデルにおいて評価した。
【００６２】
すべてのｒＰＡドメインタンパク質がＡ／Ｊマウスにおいて免疫原性であり、ＧＳＴ対照免疫マウスに比べ、攻撃に対して少なくとも部分的な防御を与えた。輸送タンパク質であるドメインタンパク質のＮ末端に結合したＧＳＴは、免疫動物において抗体反応が刺激されたことが示すようにインビボで、又はウエスタンブロットのあと抗ｒＰＡ抗血清で融合タンパク質が検出できたことからインビトロでも、融合タンパク質の免疫原性を損なわず、ＧＳＴタグがｒＰＡエピトープの認識を妨げないことを示唆した。より大きな融合タンパク質による免疫化が最も高い力価を生じた。特に、完全長ＧＳＴ１−４融合タンパク質で免疫したマウスは、ｒＰＡ免疫群の約８倍の平均血清抗ｒＰＡ濃度を生じた（図５）。開裂したＧＳＴを含むｒＰＡドメイン１−４でマウスを免疫すると、融合タンパク質での免疫によって生じる力価の約半分の力価を生じた。なぜこの融合タンパク質がはるかに免疫原性であるかは不明である。このタンパク質のサイズ上昇が免疫エフェクター細胞にアジュバント作用を及ぼしうることが考えられる。他の融合タンパク質ではサイズ上昇はこの応答を同じ程度には刺激せず、開裂したタンパク質はそれらの融合タンパク質相対物と同様に防御性であったので、ＧＳＴタグのアジュバント作用は攻撃に対する防御を増強しなかった。
【００６３】
良好な抗ｒＰＡ力価を持つにもかかわらず、ＧＳＴ１、開裂１、ＧＳＴ１ｂ−２、ＧＳＴ１ｂ−３及びＧＳＴ１−３で免疫した群においては、１０２ＭＬＤより低い攻撃レベルで防御にある種のブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ、突破、エスケープ）が起こり、これらのタンパク質による免疫は、ＧＳＴ対照免疫マウスと比較して、マウスの生存期間を延長させず、マウスは攻撃によって死亡に至った。これは、免疫応答が、感染に対して十分な抵抗性を達成するためにこれらのタンパク質によって適切にプライミングされていなかったことを示唆する。マウス及びモルモットにおける他の試験で示されたように（Ｌｉｔｔｌｅ Ｓ．Ｆ．ら、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：５０９−５１２、Ｔｕｒｎｂｕｌｌ Ｐ．Ｃ．Ｂ．ら、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：３５６−３６３）、ＰＡに対する抗体力価と攻撃に対する防御の間に厳密な相関関係は存在しない。しかし、防御のためにはある程度の抗体の閾値が必要であり（Ｃｏｈｅｎ Ｓ．ら、２０００ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：４５４９−４５５８）、防御のために免疫応答の細胞媒介性成分も刺激される必要があることを示唆している（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ １９８９）。
【００６４】
おそらくドメイン３の不在下ではタンパク質がより一層分解を受けやすいために、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ及びウエスタンブロット法の結果が示すように、ＧＳＴ１、ＧＳＴ１ｂ−２及びＧＳＴ１−２は生成された最も安定でない融合タンパク質であり、この不安定性が防御エピトープの喪失をもたらしたと考えられる。
【００６５】
タンパク質の高次構造も防御免疫応答を刺激する上で重要であると考えられる。融合タンパク質からドメイン１ａを除去すると、それらの完全等価物ＧＳＴ１−２及びＧＳＴ１−３と比較したとき、低い抗体力価と攻撃に対する低い防御作用を生じた。同様に、ＧＳＴ１単独で免疫したマウスは攻撃に対して部分的に保護されたが、ＧＳＴ１−２融合タンパク質としてドメイン２と組み合わせたときには、１０２ＭＬＤ攻撃レベルで完全な防御が認められた。しかし、ＧＳＴ１−２融合タンパク質での免疫によって刺激された免疫応答はより高い１０３ＭＬＤ攻撃レベルに対して完全な防御を与えるには不十分であり、これはやはりタンパク質の分解による防御エピトープの喪失によるものであると考えられた。
【００６６】
ＧＳＴ４単独、開裂した４単独及び２つの個々に発現されたドメイン、ＧＳＴ１及びＧＳＴ４の混合物を含めて、ドメイン４を含むトランケートで免疫したすべての群が、１０３ＭＬＤのＳＴＩ胞子による攻撃に対して完全に防御された（表１）。Ｂｒｏｓｓｉｅｒらは、ドメイン４なしでＰＡを発現する炭疽菌の突然変異菌株で免疫したマウスにおける防御の低下を示し（Ｂｒｏｓｓｉｅｒ Ｆ．ら、２０００、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：１７８１−１７８６）、これは、ＧＳＴ１−３による免疫が良好な抗体力価にも関わらず防御のブレイクスルーをもたらした今回の試験において確認された。これらのデータは、ドメイン４がＰＡの免疫優性サブユニットであることを示している。ドメイン４はＰＡポリペプチドのカルボキシ末端の１３９アミノ酸である。ドメイン４は、アミノ酸残基６７９−６９３の間に位置する小さなループ内及びその近傍であると同定された（Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ Ｍ．ら、１９９９ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：１８６０−１８６５）、宿主細胞レセプタ結合領域を含む（Ｌｉｔｔｌｅ Ｓ．Ｆ．ら、１９９６ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４２：７０７−７１５）。
【００６７】
それ故、ドメイン４の領域内に突然変異（Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ １９９９、前出）又は欠失（Ｂｒｏｓｓｉｅｒ １９９９、前出）を含んで発現されるＰＡの形態は無毒性であることが明らかにされたので、ドメイン４は宿主細胞の毒性にとって重要である。ＰＡの結晶構造は、ドメイン４、特にドメインの１９アミノ酸ループ（７０３−７２２）が、互いに密接に関連する他の３つのドメインよりも露出されていることを示す（Ｐｅｔｏｓａ １９９７、前出）。この構造配置がドメイン４を免疫エフェクター細胞による認識のために最も目立つエピトープにしていると考えられ、それ故ドメイン４を含む融合タンパク質は最も防御的な免疫応答を誘発する。
【００６８】
この研究は防御免疫応答の刺激におけるＰＡの役割をさらに明らかにし、炭疽感染に対する防御がＰＡの個々のドメインに帰せられることを示した。
【００６９】
ここからは、次のような添付の図面を参照しながら、実施例によって本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】大腸菌及び炭疽菌内で認められるコドン出現頻度の表である。
【図２】Ｗｅｌｋｏｓら、前出によって公表されたような炭疽菌のＰＡをコードする、本発明に従った核酸の配列を示す。
【図３−１】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−２】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−３】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−４】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−５】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図３−６】下記で詳述するようなＰＡの様々なドメイン又はドメインの組合せをコードするために使用されるアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号３−１４を示す。
【図４】それぞれＰＡのドメイン４のアミノ酸及びＤＮＡ配列である、配列番号１５−１６を示す。
【図５】１日目と２８日目に、ＰＡフラグメントを含む融合タンパク質１０μｇを筋肉内注射して免疫したＡ／Ｊマウスからの、初期免疫後３７日目の抗ｒＰＡ ＩｇＧ濃度を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
結果は、処置群とで５匹のマウスから得たサンプルの平均士標準誤差で示した。
【実施例１】
【００７２】
大腸菌における発現の検討
ｒＰＡ発現プラスミドｐＡＧ１６３：：ｒＰＡを、もとのＴｃＲ遺伝子をＫｍＲマーカーに置き換えて改変した。このプラスミドを発現宿主である大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）に形質転換し、発現レベルと溶解度を評価した。この菌株は、細胞内プロテアーゼＬａ（Ｉｏｎ遺伝子産物）及び外膜プロテアーゼＯｍｐＴを欠損している。
【００７３】
発現試験は、しかしながら、Ｉｏｎ＋Ｋ１２宿主菌株と比較してこの菌株において可溶性タンパク質の蓄積の改善を示さなかった（すなわち過度のタンパク質分解により蓄積が妨げられる）。ｒＰＡの細胞内タンパク質分解はＬａプロテアーゼの作用によるものではないと結論された。
【実施例２】
【００７４】
発酵分析
Ｋ１２菌株ＵＴ５６００（ＤＥ３）ｐＡＧ１６３：：ｒＰＡを使用して発酵のさらなる分析を実施した。
【００７５】
この培養中のｒＰＡは可溶性分画と不溶性分画に分けられる（３５０ｍｇ／Ｌ不溶性、６５０ｍｇ／Ｌ完全長可溶性と推定された）ことが認められた。使用した条件（３７℃、誘導のための１ｍＭ ＩＰＴＧ）は振とうフラスコ培養において検出可能な可溶性ｒＰＡを生成せず、また上記の実施例１で述べた結果を考慮すると、多量の可溶性ｒＰＡの存在は意外である。それにもかかわらず、発酵、誘導及び回収時点の操作は大腸菌Ｋ１２発現菌株においてｒＰＡの安定な蓄積を可能にすると思われる。
【実施例３】
【００７６】
最初にＵＴ５６００（ＤＥ３）ｐＡＧ１６３：：ｒＰＡ発酵からの不溶性封入体として単離した物質から、ｒＰＡの試料を作製した。封入体を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８で２回洗い、同じ緩衝液＋２Ｍ尿素で１回洗った。次にそれらを緩衝液＋８Ｍ尿素に可溶化し、細胞破片をペレット化した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８に希釈し、４℃で一晩静置インキューベーションして尿素を除去した。希釈した試料をＱセファロースカラムにかけ、ＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶出した。最も高純度のｒＰＡを含む分画をプールし、等分して、−７０℃で冷凍した。４−１２％ＭＥＳ−ＳＤＳ ＮｕＰＡＧＥゲルを用いて既知の標準品に対してこの試料を試験すると、この試料が高純度であり、内毒素汚染が低いことを示した。
【実施例４】
【００７７】
生成物のさらなる特徴決定
生成物のＮ末端配列決定は、Ｎ末端配列が
ＭＥＶＫＱＥＮＲＬＬ（配列番号２）
から成ることを示した。
【００７８】
これは、予想されたように生成物が残存する開始メチオニンを含むことを確認した。
【００７９】
物質はウエスタンブロットにおいて反応することが認められた；試料に関するＭＡＬＤＩ−ＭＳは約８２，７００の質量（予想質量８２，９１５に比して）を示した。高い分子質量と使用した質量標準からの距離（６６ＫＤａ）を考慮すると、これは、物質が有意のトランケーションを有していないが、試料内での微小不均一性を排除しないことの示唆であると考えられる。
【実施例５】
【００８０】
ＰＡの個々のドメインの試験
ＰＡの個々のドメインを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐＧＥＸ−６Ｐ−３発現系を使用して、輸送タンパク質グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質の形態で大腸菌における組換えタンパク質として生成した。様々なドメインの配列及びそれらをコードするために使用されるＤＮＡ配列を図３として添付している。それぞれのアミノ酸及びＤＮＡ配列を下記の表２に示す。
【００８１】
これらの融合タンパク質を使用して、総容量１００μｌ中、２０％ｖ／ｖアルヒドロゲルに吸着させたそれぞれの融合タンパク質１０μｇの筋肉内注射によってＡ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｏｌａｃ）を免疫した。
【００８２】
動物を２回免疫し、指示されている用量レベルの炭疽菌（ＳＴＩ菌株）の胞子での攻撃誘発によってそれらの防御免疫の発現を調べた。下記の表は攻撃誘発後１４日目の生存動物を示す。
【００８３】
【表３】
【００８４】
データは、ＧＳＴとの融合タンパク質の形態であるか否かに関わらず、ＰＡの４つのドメイン全部の組み合わせが高い攻撃レベルまで防御性であったことを示している。１＋２＋３を残してドメイン４を除くと、試験した最も高い攻撃レベル、９×１０５でブレイクスルーが生じた。ドメイン１＋２は、９×１０４胞子でドメイン１＋２＋３の組合せと同等に防御性であった。しかし、ドメイン１ｂ＋２とのＧＳＴ融合を残してドメイン１ａを除去すると、試験した最高攻撃誘発レベル（９×１０４）で防御にブレイクスルーが生じ、これはドメイン３を付加することによってわずかだけ改善された。
【００８５】
データは、ＰＡによって誘導される防御免疫が個々のドメイン（完全なドメイン１及びドメイン４）又は４つのドメイン全部からの順列として得られるドメインの組合せに帰せられることを示している。
【００８６】
ドメイン４についてのアミノ酸配列及びＤＮＡコード配列を、それぞれ配列番号１５及び１６として図４に示している。
【実施例６】
【００８７】
ワクチンとしてのドメインのさらなる試験
ＰＡドメイン、アミノ酸１−２５９、１６８−４８８、１−４８８、１６８−５９６、１−５９６、２６０−７３５、４８９−７３５、５９７−７３５及び１−７３５（それぞれトランケートＧＳＴ１、ＧＳＴ１ｂ−２、ＧＳＴ１−２、ＧＳＴ１ｂ−３、ＧＳＴ１−３、ＧＳＴ２−４、ＧＳＴ３−４、ＧＳＴ４及びＧＳＴ１−４）をコードするＤＮＡを炭疽菌Ｓｔｅｒｎｅ ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｌａｃプロモーターの下流のフレーム内で、発現ベクターｐＧＥＸ−６−Ｐ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この系を使用して産生されるタンパク質は、Ｎ末端グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼタンパク質（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現された。次にタンパク質発現試験のために、ＰＡドメインをコードするＤＮＡを内包する組換えプラスミドＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。
【００８８】
組換えｐＧＥＸ−６−Ｐ３プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１を、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び１％ｗ／ｖグルコースを含むＬ−ブロス中で培養した。培養を振とうしながら（１７０回転／分）３０℃でＡ６００ｎｍ０．４にインキュベートした後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。培養をさらに４時間インキュベートし、その後１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離して回収した。
【００８９】
ＰＡトランケート−融合タンパク質の初期抽出は、それらが封入体として産生されたことを示した。細胞ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、氷冷水浴中４×２０秒間音波破砕した。懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次に室温で１時間、攪拌しながら８Ｍ尿素に懸濁することによって細胞ペレットを尿素抽出した。懸濁液を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を、４００ｍＭ Ｌ−アルギニン及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８に対して透析したあと、ＰＢＳに透析した。
【００９０】
ＰＡトランケート−融合タンパク質のリフォールディングの成功により、グルタチオンセファロースＣＬ−４Ｂアフィニティーカラムで精製することができた。すべての抽出物（トランケートＧＳＴ１ｂ−２、アミノ酸残基１６８−４８７を除く）を、あらかじめＰＢＳで平衡させた１５ｍｌグルタチオンセファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。カラムをＰＢＳで洗い、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０ｍＭ還元グルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７で融合タンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定したＰＡトランケートを含む分画をプールし、ＰＢＳに対して透析した。ＢＣＡ（Ｐｅｒｂｉｏ）を用いてタンパク質濃度を測定した。
【００９１】
しかし、トランケートＧＳＴ１ｂ−２は、還元グルタチオンを使用したグルタチオンセファロースＣＬ−４Ｂアフィニティーカラムからは溶出することができず、そのためイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。明細には、トランケートＧＳＴ１ｂ−２を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８に対して透析した後、同じ緩衝液で平衡させたＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８中、０−１Ｍの漸増ＮａＣｌ勾配で融合タンパク質を溶出した。ＧＳＴ−タンパク質を含む分画をプールし、濃縮して、あらかじめＰＢＳで平衡させたＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。融合タンパク質を含む分画をプールし、ＢＣＡ（Ｐｅｒｂｉｏ）によってタンパク質濃度を測定した。収率は培養１リットル当り１から４３ｍｇであった。
【００９２】
フラグメントの分子量及びＰＡに対する抗体によるそれらの認識を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法を用いて確認した。ＳＤＳ Ｐａｇｅ及びウエスタンブロット法によるｒＰＡトランケートの分析は予想されたサイズのタンパク質バンドを示した。検討したすべてのｒＰＡトランケートにおいてある程度の分解が明らかであり、枯草菌で発現される組換えＰＡとの類似性を示した。ｒＰＡトランケート、ＧＳＴ１、ＧＳＴ１ｂ−２及びＧＳＴ１−２は、ドメイン３の不在下で特に分解を受けやすかった。これはドメイン３内に突然変異を含むｒＰＡ構築物についても同様に報告されており、かかるｒＰＡ構築物は炭疽菌培養上清から精製することができず（Ｂｒｏｓｓｉｅｒ １９９９）、ドメイン３がドメイン１及び２を安定化しうることを示唆している。
【００９３】
この試験では、雌性ＳＰＦ（特定病原菌不在）Ａ／Ｊマウス（Ｈａｒｌａｎ ＵＫ）を使用した。これらの動物が炭疽感染についての安定したモデルであるためである（Ｗｅｌｋｏｓ １９８６）。マウスは週齢を一致させ、試験開始時点で７週齢であった。
【００９４】
Ａ／Ｊマウスを試験の１日目と２８日目に、総容量１００μｌのＰＢＳ中２０％の１．３％ｖ／ｖアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（ＨＣＩ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた１０μｇの融合タンパク質で免疫した。枯草菌からのｒＰＡ（Ｍｉｌｌｅｒ １９９８）、組換えＧＳＴ対照タンパク質、又はＧＳＴタグを除去したドメイン１、４及び１−４を含む融合タンパク質で免疫した群も含めた。免疫用量を後足の２部位に筋肉内投与した。酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）による血清抗体分析のために、初期免疫後３７日目にマウスから採血した。
【００９５】
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１プレートにつき２列を除いて、枯草菌から発現させた５μｇ／ｍｌのｒＰＡ（Ｍｉｌｌｅｒ １９９８）によって４℃で一晩被覆し、前記の２列については５μｇ／ｍｌの抗マウスＦａｂ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ）で被覆した。１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗い、ＰＢＳ中５％ｗ／ｖ脱脂粉乳（ｂｌｏｔｔｏ）により３７℃で２時間遮断した。１％ｂｌｏｔｔｏ中で２倍希釈した血清をｒＰＡ被覆ウエルに加え、抗Ｆａｂ被覆ウエルに加えて４℃で一晩インキュベートしたマウスＩｇＧ標準品（Ｓｉｇｍａ）と共に２回分析した。洗浄後、ＰＢＳ中で１：２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．）をすべてのウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。再びプレートを洗ったあと、基質２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸）（１．０９ｍＭ ＡＢＴＳ、Ｓｉｇｍａ）を加えた。室温で２０分間インキュベートした後、４１４ｎｍでウエルの吸光度を測定した（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ，ＩＣＮ Ｆｌｏｗ）。Ｔｉｔｅｒｓｏｆｔバージョン３．１ｃソフトウエアを使用して標準曲線を算定した。力価をμｇＩｇＧ／ｍｌ血清で表わし、群平均±平均の標準誤差（ｓｅｍ）を算定した。結果を図５に示す。
【００９６】
作製したすべてのｒＰＡトランケートが免疫原性であり、ＧＳＴ１ｂ−２トランケートで免疫した群についての６μｇ／ｍｌから、ＧＳＴ１−４トランケートで免疫した群における１４８８μｇ／ｍｌまでの範囲で、Ａ／Ｊマウスにおける平均血清抗ｒＰＡ ＩｇＧ濃度を刺激した（図５）。ＧＳＴ対照免疫マウスは、ｒＰＡに対する検出可能な抗体を有していなかった。
【００９７】
免疫計画の７０日目に炭疽菌ＳＴＩ胞子でマウスを攻撃した。攻撃誘発に十分なＳＴＩ胞子を株から取り出し、滅菌蒸留水で洗って、１×１０７及び１×１０６胞子／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳに再懸濁した。それぞれ１×１０７及び１×１０６胞子／マウスを含む０．１ｍｌ容量を腹腔内投与してマウスを攻撃誘発し、誘発後１４日間モニターしてマウスの防御状態を調べた。人道的エンドポイント（ｈｕｍａｎｅ ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔｓ）を厳密に遵守し、致死的感染を有していることを示唆する一連の臨床徴候を示した動物は別により分けた。攻撃誘発後１４日間生存した免疫マウスの数を表３に示す。
【００９８】
【表４】
【００９９】
１０３ＭＬＤのＳＴＩ胞子で攻撃誘発した群は、ＧＳＴ１、ＧＳＴ１−２及び開裂１で免疫した群及びＧＳＴ単独で免疫した対照群を除いて、すべて完全に防御された。ＧＳＴ１、ＧＳＴ１−２及び開裂１で免疫した群においては防御に何らかのブレイクスルーが存在し、また対照群はすべて感染のために死亡し、死亡までの平均期間（ＭＴＴＤ）は２．４±０．２日であった。１０２ＭＬＤのより低い攻撃誘発レベルでは、ＧＳＴ１−２、ＧＳＴ４及び開裂４で免疫した群はすべて完全に防御されたが、他の群では防御に何らかのブレイクスルーが存在した。これらの群において死亡したマウスは平均４．５±０．２日のＭＴＴＤであり、４±０．４日のＭＴＴＤですべて死亡したＧＳＴ対照免疫群と有意に異ならなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成するための方法であって、（ａ）防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体、または（ｂ）防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体のいずれかをコードする核酸で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を形質転換し、形質転換した宿主を培養して、それからポリペプチドを回収することを含み、但し、ポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体である場合、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上であることを条件とする方法。
【請求項２】
該核酸が、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが４５％以上である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが５０から５２％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該核酸が、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ドメインが炭疽菌のＰＡのドメイン１及び／又はドメイン４である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸で形質転換した、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞であって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である組換え大腸菌細胞。
【請求項８】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが４５％以上である、請求項７に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項９】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが５０％から５２％である、請求項８に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１０】
該核酸が、図２に示すような配列番号１又はその修飾形態である、請求項７に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１１】
該核酸が配列番号１である、請求項１０に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１２】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞。
【請求項１３】
核酸が炭疽菌のＰＡのドメイン１又はドメイン４をコードする、請求項１２に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１４】
炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導するポリペプチドを生成する方法であって、請求項７から１３のいずれか一項に記載の細胞を培養し、培養物から防御ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項１５】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターであって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である大腸菌形質転換ベクター。
【請求項１６】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクター。
【請求項１７】
防御免疫を誘導し、且つ少なくとも３５％のＧＣ含量を有するＰＡ又はその変異体をコードする、配列番号１の核酸又はその修飾形態。
【請求項１８】
配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
配列番号１を含む、請求項１８に記載の核酸。
【請求項１】
炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成するための方法であって、（ａ）防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体、または（ｂ）防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体のいずれかをコードする核酸で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を形質転換し、形質転換した宿主を培養して、それからポリペプチドを回収することを含み、但し、ポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体である場合、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上であることを条件とする方法。
【請求項２】
該核酸が、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが４５％以上である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが５０から５２％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該核酸が、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ドメインが炭疽菌のＰＡのドメイン１及び／又はドメイン４である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸で形質転換した、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞であって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である組換え大腸菌細胞。
【請求項８】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが４５％以上である、請求項７に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項９】
該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが５０％から５２％である、請求項８に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１０】
該核酸が、図２に示すような配列番号１又はその修飾形態である、請求項７に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１１】
該核酸が配列番号１である、請求項１０に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１２】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞。
【請求項１３】
核酸が炭疽菌のＰＡのドメイン１又はドメイン４をコードする、請求項１２に記載の組換え大腸菌細胞。
【請求項１４】
炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導するポリペプチドを生成する方法であって、請求項７から１３のいずれか一項に記載の細胞を培養し、培養物から防御ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項１５】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターであって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが３５％以上である大腸菌形質転換ベクター。
【請求項１６】
防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）の防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクター。
【請求項１７】
防御免疫を誘導し、且つ少なくとも３５％のＧＣ含量を有するＰＡ又はその変異体をコードする、配列番号１の核酸又はその修飾形態。
【請求項１８】
配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
配列番号１を含む、請求項１８に記載の核酸。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１０７０６（Ｐ２０１２−１０７０６Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８０２９３（Ｐ２０１１−１８０２９３）
【出願日】平成２３年８月２２日（２０１１．８．２２）
【分割の表示】特願２００２−５０９５００（Ｐ２００２−５０９５００）の分割
【原出願日】平成１３年７月６日（２００１．７．６）
【出願人】（３９００４０６０４）イギリス国 (58)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ ＯＦ ＳＴＡＴＥ ＦＯＲ ＤＥＦＥＮＣＥ ＩＮ ＨＥＲ ＢＲＩＴＡＮＮＩＣ ＭＡＪＥＳＴＹ’Ｓ ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＥＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ ＯＦ ＧＲＥＡＴ ＢＲＩＴＡＩＮ ＡＮＤ ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＩＲＥＬＡＮＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２２日（２０１１．８．２２）
【分割の表示】特願２００２−５０９５００（Ｐ２００２−５０９５００）の分割
【原出願日】平成１３年７月６日（２００１．７．６）
【出願人】（３９００４０６０４）イギリス国 (58)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ ＯＦ ＳＴＡＴＥ ＦＯＲ ＤＥＦＥＮＣＥ ＩＮ ＨＥＲ ＢＲＩＴＡＮＮＩＣ ＭＡＪＥＳＴＹ’Ｓ ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＥＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ ＯＦ ＧＲＥＡＴ ＢＲＩＴＡＩＮ ＡＮＤ ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＩＲＥＬＡＮＤ
【Ｆターム（参考）】
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