皮膚ＡＧＥの非侵襲的鑑別法
【課題】皮膚における蛍光を用いた皮膚ＡＧＥの鑑別法であって、メラニン等の吸光物質による測定精度の低下を受けない、精度の高い皮膚ＡＧＥの定量的測定技術を提供する。
【解決手段】励起光に対する蛍光のピーク強度を測定し、予め用意した皮膚三層光学モデルから導かれピーク強度の補正式を用いて補正を行って皮膚ＡＧＥを鑑別するか、又は、前記ＡＧＥと表色系のＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*等の指標との関係を表す回帰式を用いて皮膚ＡＧＥを鑑別する方法。
【解決手段】励起光に対する蛍光のピーク強度を測定し、予め用意した皮膚三層光学モデルから導かれピーク強度の補正式を用いて補正を行って皮膚ＡＧＥを鑑別するか、又は、前記ＡＧＥと表色系のＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*等の指標との関係を表す回帰式を用いて皮膚ＡＧＥを鑑別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物（以下ＡＧＥ：advanced glycation endproducts)の鑑別法に関する。さらに詳しくは、皮膚のＡＧＥの非侵襲的な鑑別法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質糖化反応(メイラード反応)は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基と、ケトンやアルデヒド（特に還元糖）との非酵素的反応であり、前期段階と後期段階の２つの反応に分けられる。後期段階の反応は不可逆反応であり、前期段階で生成されたアマドリ化合物が、さらに転移や縮合などの複雑な反応過程を経て、後期糖化反応生成物(ＡＧＥ)と呼ばれる安定な物質を形成する反応である。前記ＡＧＥとしては、例えば、カルボキシメチルリジン、ペントシジン、ピラリン、クロスリン等が知られているが、生体内には構造が明らかにされていない未知のＡＧＥが多種存在していると考えられている。
【０００３】
近年、前記メイラード反応の生成物は、医学領域で注目されており、様々な病気、疾患、老化との関連性が発表されている。中でも、公知のＡＧＥは、タンパク質の機能を低下させるのみならず、細胞障害性や炎症反応を誘発する事が知られており、さらに、ＡＧＥの形成によって、タンパク質が凝集、不溶化して組織中に異常蓄積し、これにより組織を変性させているとも考えられている。また、糖尿病患者におけるヘモグロビンA1C(前期反応のアマドリ化合物)の上昇、糖尿病性腎症や慢性腎不全の腎臓や、動脈硬化病変部におけるＡＧＥの蓄積は、生体内におけるタンパク糖化反応の代表的な例として知られ、老化現象の解明、老化の予防・改善のために、ＡＧＥに対して極めて高い関心が集まっている。
【０００４】
かようなＡＧＥの測定には、その褐色変化や蛍光特性を利用した吸光光度計や蛍光分光光度計による定量法、生体組織を加水分解してＨＰＬＣやＧＣ／ＭＳによる分析等が知られている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。また、簡便且つ特殊な分析機器を必要としない等の理由により、免疫学的検出方法、具体的には、免疫組織学的方法、酵素免疫学的測定方法等が、医学分野における研究や臨床診断で広く使われており、このため、糖化タンパク質やＡＧＥに特異的に反応する抗体が各種作製され利用されている（例えば、特許文献５、特許文献６、特許文献７、非特許文献１）。
【０００５】
このような状況下において、生体中のＡＧＥの非侵襲的な鑑別法の中でも、吸光分析法に比べて、紫外光励起に伴って発生する蛍光のスペクトルと強度を測定する蛍光分析法は、高感度であることから大きな注目を集めている。しかし、測定が紫外光線〜可視光線を利用するために、メラニンなど皮膚中に存在する吸光物質により、励起・吸光が影響を受けやすく、皮膚色（メラニン量）によってＡＧＥを正確に測定できない問題が存した。このための対処としては、かような阻害要因の影響を取り除く補正方法が考えられ、例えば、別の分光反射率測定器を用いてメラニン等に関する影響を取り除く補正式（非特許文献２）が開示されている。しかし、かような補正を用いても、測定対象物に関係するその他の要因である、例えば、カロチン、ビルビリン、ヘモグロビン等による皮膚の吸光物質による蛍光強度の減衰による測定精度の低下が生じ、より精度の高い補正手段が切望されていた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−０９９８３８号公報
【特許文献２】特開２００１−０２１５４９号公報
【特許文献３】特開２００１−０５９８４３号公報
【特許文献４】特開平０７−０９８３１７号公報
【特許文献５】特開２００４−３２３５１５号公報
【特許文献６】特開２００６−３１２６２１号公報
【特許文献７】特開２００１−０２１５５９号公報
【非特許文献１】Takeuchi, M., et al, Mol Med, 6:114-125,2000
【非特許文献２】Renhua Na. et al, J Invest Dermatol,116:536-540,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような状況下で為されたものであり、非侵襲的且つ精度の高いＡＧＥの鑑別法に関する。さらに詳細には、皮膚における蛍光を用いたＡＧＥの鑑別法であって、メラニンなどの吸光物質による測定精度の低下を受けない、精度の高いＡＧＥの定量的測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような状況を鑑みて、本発明者らは、鋭意研究努力を重ねた結果、励起光に対して、発生する蛍光検出波長をセットし、セットされた蛍光波長での励起光のピーク強度を測定し、予め用意した皮膚三層光学モデルから導かれた励起光のピーク強度波長および検出蛍光波長の入射光強度の補正式を用いて補正を行うことで精度の高いＡＧＥの鑑別法を提供できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す技術に関するものである。
【０００９】
（１）皮膚における蛍光を用いたＡＧＥの鑑別法であって、励起光に対して、発生する蛍光検出波長をセットし、セットされた蛍光波長での励起光のピーク強度を測定し、該ピーク強度を、予め用意した励起光のピーク強度波長および検出蛍光波長の入射光強度の補正式を用いて補正することを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（２）前記補正式が、主要な光吸光層、AGEが含まれる層、光を反射する真皮層から構成された皮膚三層光学モデルから導かれることを特徴とする、（１）に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（３）前記ＡＧＥと、表色系のＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*、Ｌ*ｃ*ｈ表色系のｃ*、又はハンターＬａｂ表色系のｂから選択される指標との関係を表す回帰式を用いることを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（４）前記ＡＧＥの値が、大きいほど老化の度合いが大きく、小さいほど老化の度合いが小さいと判断することを特徴とする、（１）〜（３）に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（５）（１）〜（４）の何れかに記載のＡＧＥの鑑別法を用い、経時的な皮膚の変化を時系列的に捉えていくことを特徴とする、皮膚の変化のモニタリング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、吸光物質による影響を受けることなく、高精度に皮膚のＡＧＥを測定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、皮膚、特に真皮のＡＧＥの鑑別法であって、蛍光を用い、メラニン、カロチン、ビルビリン、ヘモグロビン等などの吸光物質による影響を受けないように補正を行うことを特徴とする。
【００１２】
皮膚は、身体の表面を覆い、外界との境界機能を果たす器官であり、表皮、真皮及び皮下組織より構成されている。かような皮膚に於いて、ＡＧＥが存することで、タンパク質の機能低下、さらには組織中での異常蓄積や組織変性の可能性が考えられ、黄味よりの肌色や透明感の喪失等、美肌を損なっており、皮膚ＡＧＥの存在の有無やその定量化が極めて重要な課題である。
【００１３】
かような皮膚ＡＧＥの測定は、非侵襲的な測定法である蛍光分析法を用いればよく、その原理は、分子に光を照射すると、その光を吸収した後そのエネルギーを蛍光として放出されるので、その蛍光のスペクトルと強度を測定し分析する（図１参照）。かような蛍光分析法の機器である蛍光光度計は、光源、励起側分光器、試料室、蛍光側分光器、検出器及び信号処理装置等から構成されており、例えば、株式会社日立ハイテクノロジーズ、株式会社島津製作所、株式会社堀場製作所等の市販の蛍光光度計を使用できる。
【００１４】
前記蛍光光度計を用いて、皮膚ＡＧＥを測定した結果を図２に示す。図２において、ＡＧＥの測定で用いられる標準的な条件である、励起光２４０〜３８０ｎｍに蛍光を３９０ｎｍにセットした場合、３３５ｎｍ近辺に現れる皮膚ＡＧＥの励起光のピーク強度が認められる。本発明においては、このピーク強度の実測値を、予め、励起および蛍光に用いる波長を含んだ２４０〜６５０ｎｍのシンクロ測定（入射した波長の光と同じ波長での反射強度を測定）を測定対象部位で行っておき、後述する補正理論（補正式）を用いて補正を行って皮膚ＡＧＥ（本条件で求められるＡＧＥをＡＧＥ１と定義）を鑑別する。
【００１５】
前述した市販の蛍光光度計を用いることで、容易にＡＧＥを測定できるが、皮膚、特に真皮中のＡＧＥの測定に於いて、以下の理由よる測定精度の低下が大きな問題となっている。即ち、励起させる紫外光は真皮に到達する過程に於いて、メラニン、カロチン、ビルリビン、ヘモグロビン等の皮膚の吸光物質により減衰し、対象とする真皮ＡＧＥに十分な励起光を照射できない。また、照射によって真皮ＡＧＥより励起によって発生した蛍光も、同様の現象により蛍光が減衰するために、さらに精度の低下を生じる。
【００１６】
＜本願発明の皮膚三層光学モデルと補正式＞
かような問題を解決するために、本発明者は、皮膚に吸光物質が存在したときに励起光を照射させ、発生する蛍光が皮膚表面に戻ってくる過程において、メラニン等の吸光物質が存在する層、ＡＧＥが存在する層、及び、Fflが反射する真皮層という三層構造の、皮膚三層光学モデルを構築した。本モデルに基づいて、以下に示すような皮膚ＡＧＥを精度良く鑑別する補正式を算出した。
【００１７】
補正式の算出におけるパラメータは、以下の通りである。
λ：波長
I1:入射させる励起光強度
I2:I1が吸光物質(Fa)によって吸光された後の残りの励起光強度
I3:I2がＡＧＥ層を励起させ、発生した蛍光強度
I4:I3が真皮によって反射した蛍光強度
I5:I4が吸光物質(Fa)によって吸光された残りの蛍光強度（ＡＧＥを反映）
ex:励起の意味
em:蛍光の意味
Fa:メラニン等の吸光物質が存在する層における吸光係数(Fa=I2/I1)
Ffl：ＡＧＥが存在する層における係数(Ffl=I3/I2)
Fs：Fflが反射する真皮層における反射係数(Fs=I4/I3)
【００１８】
補正式は、以下に示すようにして作製できる。皮膚ＡＧＥを測定するために、励起波長（λex）で入射し、波長λemで計測したとき、得られる蛍光強度は式（１）で示される。
I5 = Fa(em)＊Fs(em)＊Ffl＊Fa(ex)＊I1(ex) ・・・・（１）
波長λemで入射し、ＡＧＥ層が真皮と同等の吸収率・散乱率であると仮定したとき、ＡＧＥを検出する蛍光波長λemで得られる入射光の強度は、式（２）で示される。
I5(em)= Fa(em)＊Fs(em)＊Fa(em)＊I1(em) ・・・・（２）
式（１）及び式（２）より式（３）、（４）となる。
I5 / I5(em) = Ffl＊Fa(ex)／Fa(em)＊I1(ex)／ I1(em) ・・・・（３）
Ffl＝(I5／I5(em))＊（Fa(em)／Fa(ex)）＊（I1(em)／ I1(ex)） ・・・・（４）
波長によらず入射光の強さが同じ、つまり（I1(em)／I1(ex)）＝1と仮定すれば、式（５）となる。
Ffl＝(I5／I5(em))＊（Fa(em)／Fa(ex)） ・・・・（５）
ここで、波長λexで入射し、ＡＧＥ層が真皮と同等の吸収率・散乱率であると仮定したとき、ＡＧＥを検出する励起波長λexで得られる入射光の強度は、
I5(ex)＝I1(ex)＊（Fa(ex)）２＊Fs(ex) 、
I5(em)＝I1(em)＊（Fa(em)）２＊Fs(em)で、
真皮が白色と仮定することで、Fs(ex)＝Fs(em)となり、式（６）が示される。
Fa(em)／Fa(ex)＝(I5(em)／I5(ex))１／２ ・・・・（６）
式（５）及び（６）より、式（７）が算出される。
Ffl＝(I5／I5(em))＊(I5(em)／I5(ex))１／２＝I5／(I5(em)＊I5(ex)) １／２ ・（７）
式（７）の補正式を用いれば、メラニン等の吸光物質の影響を受けずに、ＡＧＥを精度良く測定できることが分かる。
【００１９】
＜皮膚ＡＧＥと表色系との関係＞
前記ＡＧＥの存する皮膚は、黄味よりの肌色や透明感の喪失等の美肌を損なっており、黄味よりの肌色を示す表色系の指標と関係することが考えられる。実施例にて詳細に記すが、本発明によって鑑別された皮膚ＡＧＥと表色系であるＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*とは有意で高い相関関係（相関係数ｒ＝０．５３３，ｐ＜０．００１）を示す。このことから、皮膚ＡＧＥと皮膚ＡＧＥと相関する表色系の指標との関係を示す回帰式を用いることで、容易に皮膚ＡＧＥを鑑別することができる。例えば、コニカミノルタセンシング株式会社等の市販の測色計を用いて測色を行い、測色で得られたｂ*を前記回帰式に代入し、皮膚ＡＧＥをより簡易・迅速に算出することが例示できる。
【００２０】
前記ＡＧＥの値が、大きいほど老化の度合いが大きく、小さいほど老化の度合いが小さいことは、既に様々な病気、疾患、老化、年齢との関連性での発表等より、周知で明らかである。実施例にて詳細に記すが、従来の補正なしの方法での皮膚ＡＧＥと実年齢との間に相関関係を認めなかったが、本発明の皮膚ＡＧＥの鑑別法を用いた結果、良好な相関関係（相関係数ｒ＝０．６３８）を認めた。これより、本発明の皮膚ＡＧＥの鑑別法が老化の度合いを精度良く鑑別できることが分かる。
【００２１】
かような皮膚ＡＧＥの鑑別法を用いることで、皮膚の変化を時系列的に捉えるモニタリングとして汎用的に利用できる。例えば、抗老化化粧料や紫外線防御化粧料等を数週間〜数ヶ月間使用する時系列モニタリングを行い、皮膚ＡＧＥの変化を評価し、これらの化粧料の効果を鑑別することが例示できる。
【００２２】
以下に実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定されないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００２３】
健常な日本人女性４２名（２２〜５９歳）を対象に、年齢分布やＡＧＥの値が同等になるように２群に分け、対照群にはＡＧＥ分解素材を含有した化粧料を、コントロール群には非配合の化粧料を、１日２回、６ヶ月間顔面に連用させた後、皮膚ＡＧＥの変化を指標に有効性試験を行った。ＡＧＥ分解素材は、バラ科シモツケソウ属シモツケソウの植物の植物体を極性溶剤で抽出し、分画・精製したものを用い、下記に示す処方の化粧料に配合した。計測は、連用開始前と６ヶ月連用後、頬部を対象に、洗顔後３０分後に、SPEX Skin Skan spectrofluorimeter(JY Horiba,Edison,NJ,U.S.A.)を用いて、下記に示す方法にて皮膚ＡＧＥを測定した。統計解析により得られた結果を表１に示す。
【００２４】
表１より、対照群はコントロール群に比べて、皮膚ＡＧＥ１（ＡＧＥ２のデータは略、ＡＧＥ１と結果は同じ）は有意に低下し、対照群での皮膚ＡＧＥの改善を認めた。これより本願の鑑別法がＡＧＥのモニタリングや化粧料の効果の鑑別に有効であることが分かる。
【００２５】
【表１】
【００２６】
＜計測条件＞
測定は、皮膚ＡＧＥ１として、励起光を２４０〜３８０ｎｍに蛍光を３９０ｎｍにセットした場合の３３５±１０ｎｍと、皮膚ＡＧＥ２として、励起光を２４０〜４１０ｎｍに蛍光４６０ｎｍにセットした場合の３７０±１０ｎｍの２種類とした。
【００２７】
＜製造法＞
以下の処方成分を８０℃で攪拌可溶化し、攪拌冷却して化粧水を得た。
＜処方成分＞
ＡＧＥ分解素材 ０．０００１質量％
ＰＯＥ（６０）硬化ヒマシ油 ０．１ 質量％
１，２−ペンタンジオール ５．０ 質量％
グリセリン ５．０ 質量％
エタノール ５．０ 質量％
クエン酸 ０．１ 質量％
クエン酸２ナトリウム ０．１ 質量％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．００９ 質量％
水 残量
【実施例２】
【００２８】
健常な日本人女性４０名（２０〜５６歳）を対象に、皮膚ＡＧＥ（ＡＧＥ１及び２）と一般的に加齢に伴って現れる黄味よりの色を示す指標である、Ｌ*ａ*ｂ*表色系のｂ*との関連を検討した。健常な日本人女性４０名（２０〜５９歳）の頬部を対象に、洗顔３０分後に、皮膚ＡＧＥは実施例１と同じ蛍光光度計で、表色系のｂ*は、コニカミノルタセンシング株式会社製の分光測色計ＣＭ-２６００ｄを用いて、計測した。皮膚ＡＧＥ１についての結果を図３に示す。
【００２９】
図３より、本発明によって鑑別された皮膚ＡＧＥと表色系であるＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*とは有意で高い相関関係（相関係数ｒ＝０．５３３，ｐ＜０．００１，皮膚ＡＧＥ１＝０．０３３７＊ｂ*−０．０００９）を示すことが分かる（ＡＧＥ２も同じ結果）。このことから、皮膚ＡＧＥと黄味よりの色を表す表色系の指標との関係を示す回帰式を用いることで、容易に皮膚ＡＧＥを鑑別することができる。即ち、かようにｂ*のような指標を用いることで、皮膚ＡＧＥをより簡易・迅速に算出できることが分かる。
【実施例３】
【００３０】
実施例２において、ｂ*に代えて、実年齢との関係を検討した。結果を図４(a)に示すが、皮膚ＡＧＥ１と実年齢とは高い相関関係（相関係数ｒ＝０．６３８、ｐ＜０．０００１）にある。図４(b)には本発明の補正を行なわなかった時の両者の関係（相関係数ｒ＝０．１６１、ｎ．ｓ．）を示す。皮膚ＡＧＥは加齢と共に増加することが一般的に知られているが、本発明の補正によってこのことがより明確であり、本発明が高精度に皮膚ＡＧＥを鑑別できることが分かる。
【実施例４】
【００３１】
実施例２において、ｂ*に代えて、メラニン指数（ＭＩと略）との関係を検討した。本発明の課題である、皮膚ＡＧＥがメラニン等の吸光物質によって測定精度が低下することを前述したが、かようなメラニン量を示すメラニン指数は、分光測色計ＣＭ-２６００ｄから算出した吸光度をFeatherの公式※１に代入して、定量的に測定できる。図５(a)に、皮膚ＡＧＥとメラニン指数との関係を示すが、両者は相関関係（相関係数ｒ＝０．３０７、ｎ．ｓ．）を示さない。一方、図５(b)に本発明の補正を行なわなかった時の両者の相関関係（相関係数ｒ＝０．７２４、ｐ＜０．０００１）を示す。これより、本発明においては、メラニン（皮膚色）の影響に影響を受けずに、高精度に皮膚ＡＧＥを鑑別できることが分かる。
※１ Feather JW, Hajizadeh-Saffer M,Leslie G, Dawson J B.A portable scanning reflectance spectrophotometer using visible wavelengths for the rapid measurement of skin pigments. Phys Med Biol 1989; 34: 807-820.
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によって、皮膚のＡＧＥを非侵襲的に精度良く鑑別することができ、その結果、肌状態に適した抗老化や紫外線カット効果等の化粧料・医薬品の選択、肌のカウンセリング、或いは化粧品・医薬品の有効性評価・モニタリング等、多面的に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】蛍光光度計による計測の原理を示す図である。
【図２】皮膚ＡＧＥの測定結果を示す図である。
【図３】皮膚ＡＧＥと表色系のｂ*との相関関係を示す図である。
【図４】皮膚ＡＧＥと実年齢との相関関係を示す図である。
【図５】皮膚ＡＧＥとメラニンインデックスとの関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物（以下ＡＧＥ：advanced glycation endproducts)の鑑別法に関する。さらに詳しくは、皮膚のＡＧＥの非侵襲的な鑑別法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質糖化反応(メイラード反応)は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基と、ケトンやアルデヒド（特に還元糖）との非酵素的反応であり、前期段階と後期段階の２つの反応に分けられる。後期段階の反応は不可逆反応であり、前期段階で生成されたアマドリ化合物が、さらに転移や縮合などの複雑な反応過程を経て、後期糖化反応生成物(ＡＧＥ)と呼ばれる安定な物質を形成する反応である。前記ＡＧＥとしては、例えば、カルボキシメチルリジン、ペントシジン、ピラリン、クロスリン等が知られているが、生体内には構造が明らかにされていない未知のＡＧＥが多種存在していると考えられている。
【０００３】
近年、前記メイラード反応の生成物は、医学領域で注目されており、様々な病気、疾患、老化との関連性が発表されている。中でも、公知のＡＧＥは、タンパク質の機能を低下させるのみならず、細胞障害性や炎症反応を誘発する事が知られており、さらに、ＡＧＥの形成によって、タンパク質が凝集、不溶化して組織中に異常蓄積し、これにより組織を変性させているとも考えられている。また、糖尿病患者におけるヘモグロビンA1C(前期反応のアマドリ化合物)の上昇、糖尿病性腎症や慢性腎不全の腎臓や、動脈硬化病変部におけるＡＧＥの蓄積は、生体内におけるタンパク糖化反応の代表的な例として知られ、老化現象の解明、老化の予防・改善のために、ＡＧＥに対して極めて高い関心が集まっている。
【０００４】
かようなＡＧＥの測定には、その褐色変化や蛍光特性を利用した吸光光度計や蛍光分光光度計による定量法、生体組織を加水分解してＨＰＬＣやＧＣ／ＭＳによる分析等が知られている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。また、簡便且つ特殊な分析機器を必要としない等の理由により、免疫学的検出方法、具体的には、免疫組織学的方法、酵素免疫学的測定方法等が、医学分野における研究や臨床診断で広く使われており、このため、糖化タンパク質やＡＧＥに特異的に反応する抗体が各種作製され利用されている（例えば、特許文献５、特許文献６、特許文献７、非特許文献１）。
【０００５】
このような状況下において、生体中のＡＧＥの非侵襲的な鑑別法の中でも、吸光分析法に比べて、紫外光励起に伴って発生する蛍光のスペクトルと強度を測定する蛍光分析法は、高感度であることから大きな注目を集めている。しかし、測定が紫外光線〜可視光線を利用するために、メラニンなど皮膚中に存在する吸光物質により、励起・吸光が影響を受けやすく、皮膚色（メラニン量）によってＡＧＥを正確に測定できない問題が存した。このための対処としては、かような阻害要因の影響を取り除く補正方法が考えられ、例えば、別の分光反射率測定器を用いてメラニン等に関する影響を取り除く補正式（非特許文献２）が開示されている。しかし、かような補正を用いても、測定対象物に関係するその他の要因である、例えば、カロチン、ビルビリン、ヘモグロビン等による皮膚の吸光物質による蛍光強度の減衰による測定精度の低下が生じ、より精度の高い補正手段が切望されていた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−０９９８３８号公報
【特許文献２】特開２００１−０２１５４９号公報
【特許文献３】特開２００１−０５９８４３号公報
【特許文献４】特開平０７−０９８３１７号公報
【特許文献５】特開２００４−３２３５１５号公報
【特許文献６】特開２００６−３１２６２１号公報
【特許文献７】特開２００１−０２１５５９号公報
【非特許文献１】Takeuchi, M., et al, Mol Med, 6:114-125,2000
【非特許文献２】Renhua Na. et al, J Invest Dermatol,116:536-540,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような状況下で為されたものであり、非侵襲的且つ精度の高いＡＧＥの鑑別法に関する。さらに詳細には、皮膚における蛍光を用いたＡＧＥの鑑別法であって、メラニンなどの吸光物質による測定精度の低下を受けない、精度の高いＡＧＥの定量的測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような状況を鑑みて、本発明者らは、鋭意研究努力を重ねた結果、励起光に対して、発生する蛍光検出波長をセットし、セットされた蛍光波長での励起光のピーク強度を測定し、予め用意した皮膚三層光学モデルから導かれた励起光のピーク強度波長および検出蛍光波長の入射光強度の補正式を用いて補正を行うことで精度の高いＡＧＥの鑑別法を提供できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す技術に関するものである。
【０００９】
（１）皮膚における蛍光を用いたＡＧＥの鑑別法であって、励起光に対して、発生する蛍光検出波長をセットし、セットされた蛍光波長での励起光のピーク強度を測定し、該ピーク強度を、予め用意した励起光のピーク強度波長および検出蛍光波長の入射光強度の補正式を用いて補正することを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（２）前記補正式が、主要な光吸光層、AGEが含まれる層、光を反射する真皮層から構成された皮膚三層光学モデルから導かれることを特徴とする、（１）に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（３）前記ＡＧＥと、表色系のＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*、Ｌ*ｃ*ｈ表色系のｃ*、又はハンターＬａｂ表色系のｂから選択される指標との関係を表す回帰式を用いることを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（４）前記ＡＧＥの値が、大きいほど老化の度合いが大きく、小さいほど老化の度合いが小さいと判断することを特徴とする、（１）〜（３）に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
（５）（１）〜（４）の何れかに記載のＡＧＥの鑑別法を用い、経時的な皮膚の変化を時系列的に捉えていくことを特徴とする、皮膚の変化のモニタリング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、吸光物質による影響を受けることなく、高精度に皮膚のＡＧＥを測定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、皮膚、特に真皮のＡＧＥの鑑別法であって、蛍光を用い、メラニン、カロチン、ビルビリン、ヘモグロビン等などの吸光物質による影響を受けないように補正を行うことを特徴とする。
【００１２】
皮膚は、身体の表面を覆い、外界との境界機能を果たす器官であり、表皮、真皮及び皮下組織より構成されている。かような皮膚に於いて、ＡＧＥが存することで、タンパク質の機能低下、さらには組織中での異常蓄積や組織変性の可能性が考えられ、黄味よりの肌色や透明感の喪失等、美肌を損なっており、皮膚ＡＧＥの存在の有無やその定量化が極めて重要な課題である。
【００１３】
かような皮膚ＡＧＥの測定は、非侵襲的な測定法である蛍光分析法を用いればよく、その原理は、分子に光を照射すると、その光を吸収した後そのエネルギーを蛍光として放出されるので、その蛍光のスペクトルと強度を測定し分析する（図１参照）。かような蛍光分析法の機器である蛍光光度計は、光源、励起側分光器、試料室、蛍光側分光器、検出器及び信号処理装置等から構成されており、例えば、株式会社日立ハイテクノロジーズ、株式会社島津製作所、株式会社堀場製作所等の市販の蛍光光度計を使用できる。
【００１４】
前記蛍光光度計を用いて、皮膚ＡＧＥを測定した結果を図２に示す。図２において、ＡＧＥの測定で用いられる標準的な条件である、励起光２４０〜３８０ｎｍに蛍光を３９０ｎｍにセットした場合、３３５ｎｍ近辺に現れる皮膚ＡＧＥの励起光のピーク強度が認められる。本発明においては、このピーク強度の実測値を、予め、励起および蛍光に用いる波長を含んだ２４０〜６５０ｎｍのシンクロ測定（入射した波長の光と同じ波長での反射強度を測定）を測定対象部位で行っておき、後述する補正理論（補正式）を用いて補正を行って皮膚ＡＧＥ（本条件で求められるＡＧＥをＡＧＥ１と定義）を鑑別する。
【００１５】
前述した市販の蛍光光度計を用いることで、容易にＡＧＥを測定できるが、皮膚、特に真皮中のＡＧＥの測定に於いて、以下の理由よる測定精度の低下が大きな問題となっている。即ち、励起させる紫外光は真皮に到達する過程に於いて、メラニン、カロチン、ビルリビン、ヘモグロビン等の皮膚の吸光物質により減衰し、対象とする真皮ＡＧＥに十分な励起光を照射できない。また、照射によって真皮ＡＧＥより励起によって発生した蛍光も、同様の現象により蛍光が減衰するために、さらに精度の低下を生じる。
【００１６】
＜本願発明の皮膚三層光学モデルと補正式＞
かような問題を解決するために、本発明者は、皮膚に吸光物質が存在したときに励起光を照射させ、発生する蛍光が皮膚表面に戻ってくる過程において、メラニン等の吸光物質が存在する層、ＡＧＥが存在する層、及び、Fflが反射する真皮層という三層構造の、皮膚三層光学モデルを構築した。本モデルに基づいて、以下に示すような皮膚ＡＧＥを精度良く鑑別する補正式を算出した。
【００１７】
補正式の算出におけるパラメータは、以下の通りである。
λ：波長
I1:入射させる励起光強度
I2:I1が吸光物質(Fa)によって吸光された後の残りの励起光強度
I3:I2がＡＧＥ層を励起させ、発生した蛍光強度
I4:I3が真皮によって反射した蛍光強度
I5:I4が吸光物質(Fa)によって吸光された残りの蛍光強度（ＡＧＥを反映）
ex:励起の意味
em:蛍光の意味
Fa:メラニン等の吸光物質が存在する層における吸光係数(Fa=I2/I1)
Ffl：ＡＧＥが存在する層における係数(Ffl=I3/I2)
Fs：Fflが反射する真皮層における反射係数(Fs=I4/I3)
【００１８】
補正式は、以下に示すようにして作製できる。皮膚ＡＧＥを測定するために、励起波長（λex）で入射し、波長λemで計測したとき、得られる蛍光強度は式（１）で示される。
I5 = Fa(em)＊Fs(em)＊Ffl＊Fa(ex)＊I1(ex) ・・・・（１）
波長λemで入射し、ＡＧＥ層が真皮と同等の吸収率・散乱率であると仮定したとき、ＡＧＥを検出する蛍光波長λemで得られる入射光の強度は、式（２）で示される。
I5(em)= Fa(em)＊Fs(em)＊Fa(em)＊I1(em) ・・・・（２）
式（１）及び式（２）より式（３）、（４）となる。
I5 / I5(em) = Ffl＊Fa(ex)／Fa(em)＊I1(ex)／ I1(em) ・・・・（３）
Ffl＝(I5／I5(em))＊（Fa(em)／Fa(ex)）＊（I1(em)／ I1(ex)） ・・・・（４）
波長によらず入射光の強さが同じ、つまり（I1(em)／I1(ex)）＝1と仮定すれば、式（５）となる。
Ffl＝(I5／I5(em))＊（Fa(em)／Fa(ex)） ・・・・（５）
ここで、波長λexで入射し、ＡＧＥ層が真皮と同等の吸収率・散乱率であると仮定したとき、ＡＧＥを検出する励起波長λexで得られる入射光の強度は、
I5(ex)＝I1(ex)＊（Fa(ex)）２＊Fs(ex) 、
I5(em)＝I1(em)＊（Fa(em)）２＊Fs(em)で、
真皮が白色と仮定することで、Fs(ex)＝Fs(em)となり、式（６）が示される。
Fa(em)／Fa(ex)＝(I5(em)／I5(ex))１／２ ・・・・（６）
式（５）及び（６）より、式（７）が算出される。
Ffl＝(I5／I5(em))＊(I5(em)／I5(ex))１／２＝I5／(I5(em)＊I5(ex)) １／２ ・（７）
式（７）の補正式を用いれば、メラニン等の吸光物質の影響を受けずに、ＡＧＥを精度良く測定できることが分かる。
【００１９】
＜皮膚ＡＧＥと表色系との関係＞
前記ＡＧＥの存する皮膚は、黄味よりの肌色や透明感の喪失等の美肌を損なっており、黄味よりの肌色を示す表色系の指標と関係することが考えられる。実施例にて詳細に記すが、本発明によって鑑別された皮膚ＡＧＥと表色系であるＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*とは有意で高い相関関係（相関係数ｒ＝０．５３３，ｐ＜０．００１）を示す。このことから、皮膚ＡＧＥと皮膚ＡＧＥと相関する表色系の指標との関係を示す回帰式を用いることで、容易に皮膚ＡＧＥを鑑別することができる。例えば、コニカミノルタセンシング株式会社等の市販の測色計を用いて測色を行い、測色で得られたｂ*を前記回帰式に代入し、皮膚ＡＧＥをより簡易・迅速に算出することが例示できる。
【００２０】
前記ＡＧＥの値が、大きいほど老化の度合いが大きく、小さいほど老化の度合いが小さいことは、既に様々な病気、疾患、老化、年齢との関連性での発表等より、周知で明らかである。実施例にて詳細に記すが、従来の補正なしの方法での皮膚ＡＧＥと実年齢との間に相関関係を認めなかったが、本発明の皮膚ＡＧＥの鑑別法を用いた結果、良好な相関関係（相関係数ｒ＝０．６３８）を認めた。これより、本発明の皮膚ＡＧＥの鑑別法が老化の度合いを精度良く鑑別できることが分かる。
【００２１】
かような皮膚ＡＧＥの鑑別法を用いることで、皮膚の変化を時系列的に捉えるモニタリングとして汎用的に利用できる。例えば、抗老化化粧料や紫外線防御化粧料等を数週間〜数ヶ月間使用する時系列モニタリングを行い、皮膚ＡＧＥの変化を評価し、これらの化粧料の効果を鑑別することが例示できる。
【００２２】
以下に実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定されないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００２３】
健常な日本人女性４２名（２２〜５９歳）を対象に、年齢分布やＡＧＥの値が同等になるように２群に分け、対照群にはＡＧＥ分解素材を含有した化粧料を、コントロール群には非配合の化粧料を、１日２回、６ヶ月間顔面に連用させた後、皮膚ＡＧＥの変化を指標に有効性試験を行った。ＡＧＥ分解素材は、バラ科シモツケソウ属シモツケソウの植物の植物体を極性溶剤で抽出し、分画・精製したものを用い、下記に示す処方の化粧料に配合した。計測は、連用開始前と６ヶ月連用後、頬部を対象に、洗顔後３０分後に、SPEX Skin Skan spectrofluorimeter(JY Horiba,Edison,NJ,U.S.A.)を用いて、下記に示す方法にて皮膚ＡＧＥを測定した。統計解析により得られた結果を表１に示す。
【００２４】
表１より、対照群はコントロール群に比べて、皮膚ＡＧＥ１（ＡＧＥ２のデータは略、ＡＧＥ１と結果は同じ）は有意に低下し、対照群での皮膚ＡＧＥの改善を認めた。これより本願の鑑別法がＡＧＥのモニタリングや化粧料の効果の鑑別に有効であることが分かる。
【００２５】
【表１】
【００２６】
＜計測条件＞
測定は、皮膚ＡＧＥ１として、励起光を２４０〜３８０ｎｍに蛍光を３９０ｎｍにセットした場合の３３５±１０ｎｍと、皮膚ＡＧＥ２として、励起光を２４０〜４１０ｎｍに蛍光４６０ｎｍにセットした場合の３７０±１０ｎｍの２種類とした。
【００２７】
＜製造法＞
以下の処方成分を８０℃で攪拌可溶化し、攪拌冷却して化粧水を得た。
＜処方成分＞
ＡＧＥ分解素材 ０．０００１質量％
ＰＯＥ（６０）硬化ヒマシ油 ０．１ 質量％
１，２−ペンタンジオール ５．０ 質量％
グリセリン ５．０ 質量％
エタノール ５．０ 質量％
クエン酸 ０．１ 質量％
クエン酸２ナトリウム ０．１ 質量％
コンドロイチン硫酸ナトリウム ０．００９ 質量％
水 残量
【実施例２】
【００２８】
健常な日本人女性４０名（２０〜５６歳）を対象に、皮膚ＡＧＥ（ＡＧＥ１及び２）と一般的に加齢に伴って現れる黄味よりの色を示す指標である、Ｌ*ａ*ｂ*表色系のｂ*との関連を検討した。健常な日本人女性４０名（２０〜５９歳）の頬部を対象に、洗顔３０分後に、皮膚ＡＧＥは実施例１と同じ蛍光光度計で、表色系のｂ*は、コニカミノルタセンシング株式会社製の分光測色計ＣＭ-２６００ｄを用いて、計測した。皮膚ＡＧＥ１についての結果を図３に示す。
【００２９】
図３より、本発明によって鑑別された皮膚ＡＧＥと表色系であるＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*とは有意で高い相関関係（相関係数ｒ＝０．５３３，ｐ＜０．００１，皮膚ＡＧＥ１＝０．０３３７＊ｂ*−０．０００９）を示すことが分かる（ＡＧＥ２も同じ結果）。このことから、皮膚ＡＧＥと黄味よりの色を表す表色系の指標との関係を示す回帰式を用いることで、容易に皮膚ＡＧＥを鑑別することができる。即ち、かようにｂ*のような指標を用いることで、皮膚ＡＧＥをより簡易・迅速に算出できることが分かる。
【実施例３】
【００３０】
実施例２において、ｂ*に代えて、実年齢との関係を検討した。結果を図４(a)に示すが、皮膚ＡＧＥ１と実年齢とは高い相関関係（相関係数ｒ＝０．６３８、ｐ＜０．０００１）にある。図４(b)には本発明の補正を行なわなかった時の両者の関係（相関係数ｒ＝０．１６１、ｎ．ｓ．）を示す。皮膚ＡＧＥは加齢と共に増加することが一般的に知られているが、本発明の補正によってこのことがより明確であり、本発明が高精度に皮膚ＡＧＥを鑑別できることが分かる。
【実施例４】
【００３１】
実施例２において、ｂ*に代えて、メラニン指数（ＭＩと略）との関係を検討した。本発明の課題である、皮膚ＡＧＥがメラニン等の吸光物質によって測定精度が低下することを前述したが、かようなメラニン量を示すメラニン指数は、分光測色計ＣＭ-２６００ｄから算出した吸光度をFeatherの公式※１に代入して、定量的に測定できる。図５(a)に、皮膚ＡＧＥとメラニン指数との関係を示すが、両者は相関関係（相関係数ｒ＝０．３０７、ｎ．ｓ．）を示さない。一方、図５(b)に本発明の補正を行なわなかった時の両者の相関関係（相関係数ｒ＝０．７２４、ｐ＜０．０００１）を示す。これより、本発明においては、メラニン（皮膚色）の影響に影響を受けずに、高精度に皮膚ＡＧＥを鑑別できることが分かる。
※１ Feather JW, Hajizadeh-Saffer M,Leslie G, Dawson J B.A portable scanning reflectance spectrophotometer using visible wavelengths for the rapid measurement of skin pigments. Phys Med Biol 1989; 34: 807-820.
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によって、皮膚のＡＧＥを非侵襲的に精度良く鑑別することができ、その結果、肌状態に適した抗老化や紫外線カット効果等の化粧料・医薬品の選択、肌のカウンセリング、或いは化粧品・医薬品の有効性評価・モニタリング等、多面的に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】蛍光光度計による計測の原理を示す図である。
【図２】皮膚ＡＧＥの測定結果を示す図である。
【図３】皮膚ＡＧＥと表色系のｂ*との相関関係を示す図である。
【図４】皮膚ＡＧＥと実年齢との相関関係を示す図である。
【図５】皮膚ＡＧＥとメラニンインデックスとの関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚における蛍光を用いたＡＧＥの鑑別法であって、励起光に対して、発生する蛍光検出波長をセットし、セットされた蛍光波長での励起光のピーク強度を測定し、該ピーク強度を、予め用意した励起光のピーク強度波長および検出蛍光波長の入射光強度の補正式を用いて補正することを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項２】
前記補正式が、主要な光吸光層、ＡＧＥが含まれる層、光を反射する真皮層から構成された皮膚三層光学モデルから導かれることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項３】
前記ＡＧＥと、表色系のＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*、Ｌ*ｃ*ｈ表色系のｃ*、又はハンターＬａｂ表色系のｂから選択される指標との関係を表す回帰式を用いることを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項４】
前記ＡＧＥの値が、大きいほど老化の度合いが大きく、小さいほど老化の度合いが小さいと判断することを特徴とする、請求項１〜３に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載のＡＧＥの鑑別法を用い、経時的な皮膚の変化を時系列的に捉えていくことを特徴とする、皮膚の変化のモニタリング方法。
【請求項１】
皮膚における蛍光を用いたＡＧＥの鑑別法であって、励起光に対して、発生する蛍光検出波長をセットし、セットされた蛍光波長での励起光のピーク強度を測定し、該ピーク強度を、予め用意した励起光のピーク強度波長および検出蛍光波長の入射光強度の補正式を用いて補正することを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項２】
前記補正式が、主要な光吸光層、ＡＧＥが含まれる層、光を反射する真皮層から構成された皮膚三層光学モデルから導かれることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項３】
前記ＡＧＥと、表色系のＬ*ａ*ｂ*表色系のｂ*、Ｌ*ｃ*ｈ表色系のｃ*、又はハンターＬａｂ表色系のｂから選択される指標との関係を表す回帰式を用いることを特徴とする、皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項４】
前記ＡＧＥの値が、大きいほど老化の度合いが大きく、小さいほど老化の度合いが小さいと判断することを特徴とする、請求項１〜３に記載の皮膚のＡＧＥの鑑別法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載のＡＧＥの鑑別法を用い、経時的な皮膚の変化を時系列的に捉えていくことを特徴とする、皮膚の変化のモニタリング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−２４７４３０（Ｐ２００９−２４７４３０Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９６０８７（Ｐ２００８−９６０８７）
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
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