真核細胞における化合物の生成方法
本発明は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合できる、ペルオキシソームを含む真核細胞に関する。このようにして、真核細胞は、ペルオキシソーム内容物を細胞外に放出できる。本発明はまた、前記真核細胞における目的の化合物の生成方法に関し、ここで前記目的の化合物は細胞のペルオキシソーム中に存在する。前記目的の化合物は、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルによってペルオキシソーム中に蓄積する。好ましい宿主細胞は、糸状菌細胞である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組み換えDNA技術に関する。特に、本発明は、真核細胞における化合物の生成方法に関し、ここで化合物は細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができるペルオキシソーム中に存在し、細胞外への化合物の放出を引き起こす。
【背景技術】
【0002】
真核細胞による培地へのタンパク質の分泌は、分泌経路を構成する種々の膜で包まれた区画を介したタンパク質の運搬を含む。まず、タンパク質は、小胞体(ER)の内腔に輸送される。そこから、タンパク質は膜小胞中でゴルジ複合体へ、およびゴルジ複合体から細胞膜へと輸送される。分泌経路は、分泌タンパク質を含む小胞が供与膜からくびれ切れ、受容膜に標的化および融合する、いくつかのステップを含む。これらのステップのそれぞれで、糖鎖付加およびジスルフィド架橋形成を含むタンパク質の十分な成熟が行われるために、シャペロンまたは折りたたみ酵素等のいくつかのタンパク質の機能が必要である。細胞外タンパク質は、ERの酸化環境で成熟し、コア糖鎖付加されるようになり、この糖鎖付加プロセスは、続いてゴルジ複合体中で完了する。
【0003】
真核生物におけるタンパク質分泌を増大させるために、いくつかの試みがなされている。異種タンパク質の分泌を増大させる一般的なアプローチは、シグナル配列を使用することである(例えばEP0215594号明細書参照)。真核細胞における従来の分泌経路は、上記で概説したように、定義により、細胞外タンパク質の成熟に適合している。細胞内タンパク質の成熟は、特定のシャペロンおよび折りたたみタンパク質を有する細胞質の還元環境で実現される。産業環境における、タンパク質、特に細胞内タンパク質の生成は、分泌および下流のプロセシングの両方が不十分なことによってタンパク質の収率が低いために、依然として困難な課題である(ホプキンズ(Hpkins)TR.細胞内タンパク質の回収のための物理的および化学的細胞崩壊(Physical and chemical cell disruption for the recovery of intracellular proteins.)バイオプロセス・テクノロジー(Bioprocess Technol.)1991年、12:57−83頁)。
【0004】
タンパク質を生成する産業上の重要性が高まっているため、ならびに分泌および下流のプロセシング経路の効率が不十分であるため、依然として、真核細胞におけるタンパク質の生成の、向上したプロセスを得る必要がある。本発明は、高い効率でタンパク質を生成する、新規の方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【0005】
第一の態様において、本発明は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができる、ペルオキシソームを含む真核細胞に関する。このようにして、本発明は、ペルオキシソームの内容物を細胞外に放出することができるという点で、真核細胞の新規の能力を提供する。このようにして、真核細胞によって他の状態では分泌されないであろう化合物が、今やペルオキシソーム経路を介して有利に放出され得る。
【0006】
本発明によると、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、ペルオキシソーム膜の、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合と同等である。融合は、一体化された全体を形成する、多様な要素の溶け込みを意味する。ある要素が、ここではペルオキシソーム膜であり、他の要素は細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造由来の膜である。ペルオキシソーム脂質二重層膜の、分泌経路の膜構造の脂質二重層膜との融合は、本明細書中では、2つの脂質二重層膜が、ペルオキシソームおよび分泌経路の膜構造の両方の内容物を囲む1つの単一の連続した脂質二重層膜を形成することを意味すると理解される。ペルオキシソーム脂質二重層膜が細胞膜と融合して1つの単一の連続した脂質二重層膜を形成する場合、新しく形成された単一の膜はペルオキシソーム内容物を囲まず、むしろペルオキシソーム内容物が細胞外環境へ放出されると理解される。例えば、ペルオキシソームの、細胞膜との融合が起こる場合、ペルオキシソーム内容物は、細胞外に直接輸送される。別の例において、ペルオキシソームの、ゴルジ複合体および/またはERとの融合が起こる場合、ペルオキシソーム内容物はゴルジ複合体および/またはERに輸送され、それによって、細胞の内在性分泌経路を介して間接的に細胞外へ輸送される。
【0007】
ペルオキシソーム(マイクロボディとも呼ばれる)は、真核細胞に遍在して見られる種々の代謝プロセスに関係する単一の膜で包まれた細胞器官として定義される(阪井(Sakai)ら、イースト(Yeast)14、1175−1187頁、1998年)。真核細胞において、ペルオキシソームは、通常は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合しないが、単一の膜に包まれた細胞器官として細胞質内に維持されている。
【0008】
本発明の関係において、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造は、細胞によるポリペプチドの分泌に関係する任意の膜構造であり得る。本発明全体で、用語「細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造」および用語「膜構造」は、同義的に使用される。好ましくは、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造は、細胞膜、ゴルジ複合体および小胞体(ER)からなる群より選択される。ゴルジ複合体は、互いに結合して層板を形成する、最低3つ(シス、中間およびトランスゴルジ)の別個の扁平な、膜に包まれた区画(槽)を含むと定義される(プファイファー(Pfeffer)SR、ゴルジ複合体の構築(Constructing a Golgi complex)。ジャーナル・オブ・セルバイオロジー(J Cell Biol.)2001年12月10日、155(6):873−5頁)。
【0009】
分泌経路内の膜融合のプロセスは、全ての真核種において高度に保存されている。当該分野の現状によると、膜融合を推進する中心的構成要素は、SNARE(可溶性N−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体)と呼ばれるポリペプチドである。相補的SNAREが供与(v−SNARE)および受容膜(t−SNARE)上に存在し、保存配列モチーフ(SNAREモチーフ)によって区別される。膜融合を媒介するために、4つのSNAREモチーフが束になって、SNAREpinと呼ばれる平行なコイルドコイル構造を形成する。SNAREpinは、受容膜構造上の少なくとも1つの膜アンカー型SNAREおよび供与膜構造上の少なくとも1つの膜アンカー型SNAREで構成される。1つまたは2つのSNAREモチーフ(例えばSec9)を含む、可溶性、またはあるいは膜結合型SNAREは、SNAREpin形成を補完し得る。供与:受容膜構造におけるSNAREpin構成要素の組み合わせ方は1:3であり得るが、2:2でもあり得る(ブーリ(Burri)L、リスゴウ(Lithgow)T.酵母におけるSNAREの完全な組(A complete set of SNAREs in yeast.)トラフィック(Traffic.)2004年1月、5(1):45−52頁)。
【0010】
本発明によると、ペルオキシソーム膜の、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、単独または組み合わせで用いられ得る、いくつかの様式で実現され得る。
【0011】
本発明は、ペルオキシソームの、真核細胞の細胞膜(または分泌経路の別の膜)との融合を得るために、ある好ましい選択肢は、ペルオキシソームの表面で融合ポリペプチドまたはその一部を露出させることであることを開示する。本発明によると、融合ポリペプチドは、供与膜構造の、受容膜構造との融合に関係するポリペプチドであり、通常は供与膜構造の表面で露出している。表面で露出するとは、本明細書中では、内腔側の反対の、供与膜の細胞質側で露出していることを意味すると理解される。供与膜構造は、受容膜構造と融合することができる小胞を生じることができる膜構造として定義される。好ましくは、供与および受容膜構造は、分泌経路の膜である。より好ましくは、供与膜構造は、ゴルジ複合体およびERからなる群より選択される。
【0012】
融合ポリペプチドは、典型的には、供与膜構造、例えばゴルジ複合体またはERの表面で露出した部分、および膜貫通ドメインを含む。好ましい実施形態において、通常供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのその部分、すなわち表面露出ドメインは、ペルオキシソームの表面での露出に用いられる。
【0013】
好ましい実施形態において、供与膜構造はゴルジ複合体であり、すなわち、融合ポリペプチドは、通常ゴルジ複合体の小胞の表面で露出しているポリペプチドであり、ゴルジ小胞の、細胞膜との融合に関係することが公知である。
【0014】
好ましい融合ポリペプチドは、v−SNAREポリペプチドのファミリー、またはベシクル−SNARE(vesicle−SNAREs)、ヤーン(Jahn)ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu Rev.Biochem.)(1999年)863−911頁、ブーリ(Burri)ら、上掲に記載されているv−SNAREのポリペプチドである。好ましいSNAREは、配列番号13への配列同一性によって、本明細書中で下記にさらに定義される。
【0015】
ゴルジ複合体の小胞の表面で発現されるいくつかのv−SNAREは、すでに記載されており、例えばSnc1およびSnc2である(ブーリ(Burri)ら、上掲)。ERの表面で発現されるv−SNAREの例は、Sec22およびYkt6である(ブーリ(Burri)ら、上掲)。本発明の好ましい実施形態において、v−SNARE Snc1もしくはSnc2、またはそれらのホモログの少なくとも1つが用いられる。Snc1/Snc2ホモログの例は、本発明によって提供されるような、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)SncAポリペプチドである。
【0016】
本発明は、特定の参照種、通常酵母(S.セレヴィシエ(S.cerevisiae))由来の起源を参照しながら本発明に記載される任意のポリペプチド(またはそのコード遺伝子)のホモログの使用を包含する。したがって、ホモログは参照種で用いられる名前と異なる名前を有し得るが、ホモログ(またはホモログ配列)は、参照種のポリペプチドと実質的に同じ機能を発揮する、参照種とは別の種由来のポリペプチドとして定義される。典型的には、かかるホモログは、少なくとも50%の、参照種のポリペプチドとの同一性の程度を有し得る。かかるホモログは、好ましくは、本発明に従って修飾された真核細胞と同じ真核生物種から生じる。
【0017】
ペルオキシソーム表面でのv−SNARE等の融合ポリペプチドの露出を得るために、受容膜上の相補的SNAREとの機能相互作用が可能である、融合ポリペプチドまたは少なくともその一部がペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に、操作可能に結合、好ましくは融合する。このようにして、融合ポリペプチド部分または構成要素およびペルオキシソーム膜ポリペプチド部分または構成要素を含んで、キメラポリペプチドが得られる。
【0018】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、キメラポリペプチドの構成要素として、好ましくは、ペルオキシソーム膜へのキメラポリペプチドの標的化を媒介することができ、より好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、キメラポリペプチドをペルオキシソーム膜へアンカーすることができる。最も好ましくは、キメラポリペプチドをペルオキシソーム膜にアンカーすることは、膜貫通セグメントにわたる少なくとも1つの膜の、ペルオキシソーム膜への統合によって、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部によって遂げられる。好ましくは、ペルオキシソーム膜中のキメラポリペプチド全体の局在化は、膜アンカーとして機能し、同時にペルオキシソームの(細胞質側)表面上のキメラポリペプチドの融合ポリペプチド部分を露出させるものである。好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドは、N末端部分でトリミングされて、結果として、キメラ融合ポリペプチドのペルオキシソーム標的化を排除することなく、ペルオキシソーム膜に可能な限り近い融合ポリペプチドの露出を生じる。
【0019】
好ましくは、v−SNARE等の、融合ポリペプチドのその部分は、少なくとも、通常はゴルジ小胞等の供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのドメインを含む、キメラポリペプチドの構成要素として用いられる。融合ポリペプチドの膜貫通ドメインは、部分的または完全にのいずれかで、キメラポリペプチドに存在しなくてもよい。
【0020】
ペルオキシソーム膜アンカーとして機能するのに適した任意のペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、(細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と相互作用できるように)ペルオキシソームの細胞質側(または表面)に位置する融合ポリペプチド部分を含むキメラポリペプチドが結果として生じる限りは、少なくとも融合ポリペプチドの表面露出ドメインとの、操作可能な結合、好ましくは融合に用いられるのに適している。好ましくは、融合ポリペプチド部分は、キメラポリペプチドのN末端部分に位置し、そのため、好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドは、N末端が天然にペルオキシソームの細胞質側に露出した、または天然の配向がセグメントのN末端が細胞質の方に向くように方向付けられたものである少なくとも1つの膜貫通セグメントを有するポリペプチドである。
【0021】
好ましいペルオキシソーム膜ポリペプチドの例は、ペルオキシソーム膜ポリペプチド22(Pmp22)またはそのホモログである(ブロシアス(Brosius)U、デーメル(Dehmel)T、ガートナー(Gartner)J.2つの異なる標的化シグナルがヒトペルオキシソーム膜タンパク質22をペルオキシソームに方向付ける(Two different targeting signals direct human peroxisomal membrane protein 22 to peroxisomes.)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)2002年1月4日、277(1):774−84頁)。Pmp22ホモログの例は、本発明によって提供されるようなアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)Pmp22である。ブロシアス(Brosius)ら(2002年、上掲)は、ヒトおよびラットPmp22タンパク質は4つの膜貫通ドメイン(1つはNからC末端の方向で通る)ならびに第一および第二の膜貫通ドメインのN末端に位置する2つの独立したペルオキシソーム標的化シグナルを有することを示した。好ましい実施形態によると、キメラポリペプチドの構成要素として用いられる、Pmp22ポリペプチドの一部は、そのため、少なくとも、Pmp22のペルオキシソーム膜貫通ドメイン3および4、より好ましくはPmp22の4つ全てのペルオキシソーム膜貫通ドメインを含む。好ましくは、Pmp22のペルオキシソーム膜貫通ドメイン3および4のみを含むキメラポリペプチドの構成要素として用いられるPmp22ポリペプチドの一部は、さらに、膜貫通ドメイン3のN末端側の、機能的ペルオキシソーム標的化シグナルを含むのに十分なアミノ酸を含む。好ましくは、ブロシアス(Brosius)ら(2002年、上掲)によって定義されるような膜貫通ドメイン3のN末端側の少なくとも15、12、10、8または7アミノ酸が含まれる。
【0022】
少なくとも融合ポリペプチドの表面露出ドメインへの、操作可能な結合、好ましくは融合に用いられるのに適した、他の適したペルオキシソーム膜タンパク質(またはペルオキシソーム膜アンカーとして機能するのに適したその一部)としては、例えばPMP34、PMP47、PMP70、PEX3、PEX11、PEX14およびPEX22が挙げられるが、これらに限定されない(エッカート(Eckert)JHおよびアードマン(Erdmann)R.、ペルオキシソームバイオジェネシス(Peroxisome biogenesis.)レビュース・オブ・フィジオロジー、バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー(Rev Physiol Biochem Pharmacol.)2003年、147:75−121頁において総説されている)。
【0023】
好ましくは、Pmp22または別のペルオキシソーム膜タンパク質は、上述のように、N末端部分でトリミングされる。前記トリミングは、少なくとも第一のメチオニンの消失を含む。N末端部分でのトリミングは、さらにN末端の1〜50、例えば48アミノ酸、好ましくはN末端の1〜35、例えば33アミノ酸、より好ましくはN末端の1〜20、例えば18アミノ酸の消失を含み得る。好ましくは、ペルオキシソーム膜タンパク質のN末端は、天然の配向がセグメントのN末端が細胞質側向きに方向付けられたものである(NからC末端の方向で)第一の膜貫通ドメインのN末端側である少なくとも15、12、10、8、7、5または3アミノ酸が残るようにトリミングされる。好ましくは、ペルオキシソーム膜タンパク質のN末端のトリミングは、ペルオキシソーム標的化に必要なアミノ酸配列を消失または崩壊させない。
【0024】
好ましい実施形態によると、通常供与膜構造の表面で露出しているv−SNAREのドメイン(例えばSnc1、Snc2またはSncA)は、ペルオキシソーム膜ポリペプチドPmp22に操作可能に結合(融合)して、v−SNAREの対応する部分、例えばSnc1、Snc2またはSncAで、ペルオキシソームを装飾している。より好ましくは、SncAの表面露出ドメインが用いられる。さらにより好ましくは、キメラポリペプチドは配列番号24のアミノ酸配列を有する。当業者は、配列番号24に関して記載されるのと同じ原理に従って、どのようにして他の生物由来のPmp22ポリペプチドオルソログおよびv−SNAREオルソログからキメラポリペプチドを構築するかを知るであろう。
【0025】
本発明のある実施形態において、ペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドの露出は、細胞の受容膜構造、例えば細胞膜またはゴルジ複合体での、補完融合ポリペプチドの過剰発現を伴う。「補完融合ポリペプチド」は、本発明によると、供与膜構造、例えばゴルジ複合体の小胞またはERと、受容膜構造、例えば細胞膜またはゴルジ複合体との、融合の促進に関係するポリペプチドである。
【0026】
補完融合ポリペプチドは、好ましくは、標的SNAREまたはt−SNAREである(ヤーン(Jahn)ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu.Rev.Biochem.)863−911頁(1999年))。好ましいt−SNAREポリペプチドは、例えば、細胞膜に位置するSso1もしくはSso2、またはそれらのホモログ、またはゴルジ複合体に位置するSed5またはそのホモログである(ブーリ(Burri)ら、上掲)。他の好ましい補完融合ポリペプチドは、細胞膜での融合に関係するSec9、またはゴルジ複合体での融合に関係するBos1、Gos1、Bet1もしくはそれらのホモログである(ブーリ(Burri)ら、上掲)。
【0027】
好ましい実施形態によると、融合および補完融合ポリペプチドは、化学量論的量で露出または過剰発現され、融合および補完融合ポリペプチドの間のポリペプチド相互作用が可能な限り生理学的速度または天然の化学量論に近いことを意味する(ブーリ(Burri)Lら、上掲)。化学量論的同時露出は、ペルオキシソームの、受容膜構造、例えば細胞膜との融合を、さらに促進すると期待される。この化学量論的同時露出は、好ましくは、実質的に同じコピー数で同一な発現カセットを用いることによって達成される。好ましくは、t−SNARE遺伝子の内在性コピーは、内在性コピーに由来するt−SNAREの量が分泌経路の天然の小胞との融合に利用できるように、変化しないままである。
【0028】
本発明のある実施形態によると、真核細胞は、細胞膜ならびに細胞のゴルジ複合体と融合することができるペルオキシソームを含む。
【0029】
好ましい実施形態によると、全ての選択された融合および任意の補完融合ポリペプチド、ならびに発現されるペルオキシソーム膜ポリペプチドは、適した真核宿主細胞にとって天然である。
【0030】
本発明はさらに、真核細胞が本発明の活性を、増大した効率で達成することができるような、本発明の真核細胞の改良を構想する。
【0031】
例えば、細胞膜へのペルオキシソームの標的化およびそれに続く膜融合が、ゴルジ由来小胞の標的化機構を用いることによって、促進され得る。改変によって、この機構がペルオキシソームに対して効果的になることが可能になり得る。
【0032】
この機構をペルオキシソームに対して効果的に改変する例は、Sec4またはそのホモログを、操作可能にペルオキシソームと結合するように、操作することである。これにより、結果として細胞膜中の分泌複合体へのペルオキシソームの標的化が生じ(エキソシスト(exocyst))、さらに、SNAREpin形成を増大させて、細胞膜とのペルオキシソーム融合の効率を促進させる。通常Sec4は、GDP可溶性状態、およびGTP結合型分泌小胞膜付着状態の間で循環する。永続的に付着したSec4は生物学的に活性があることが示されている(オシッヒ(Ossig)ら1995年、EMBOジャーナル(EMBO Journal)3645−3653頁)。Sec4の膜付着は、通常は、2つのC末端システイン残基のゲラニルゲラニル化によって達成される。ペルオキシソーム膜へのSec4の永続的な付着を可能にするために、Sec4の2つのC末端システイン残基は消失、または異なるアミノ酸と置換され得、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部を含むキメラポリペプチドが、すでに記載した融合ポリペプチドおよびペルオキシソーム膜ポリペプチドを含むキメラポリペプチドに類似するように操作され得る。
【0033】
また、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造とのペルオキシソームの融合は、融合ポリペプチドとの相互作用に対する補完融合ポリペプチドの感受性をより高くすることによって、改良され得る。これは、後述されるように、種々の方法で行われ得る。
【0034】
融合ポリペプチドの構成的に活性のある変異体、および任意に補完融合ポリペプチドは、ペルオキシソーム、および任意に受容膜構造、例えば細胞膜の表面で、調製および(過剰)露出され得る。構成的に活性のある変異体の例は、補完融合ポリペプチド、好ましくはt−SNARE、より好ましくはSso1またはそのホモログの、脱リン酸化変異体である(マラシュ(Marash)M、ガースト(Gerst)JE、t−SNARE脱リン酸化は酵母におけるSNARE集合およびエキソサイトーシスを促進する(t-SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast.)EMBOジャーナル(EMBO J.)2001年2月1日、20(3):411−21頁)。
【0035】
当業者に公知の技術によって、SNAREの調節遺伝子を不活性化することも可能である。かかる調節因子は、例えば、リン酸化Sso1に結合して、Sso1の閉鎖した不活性なコンフォメーションを安定化させる、v−SNAREマスター(VSM−1またはそのホモログ)である(マラシュ(Marash)M、ガースト(Gerst)JE.モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル(Mol Biol Cell.)2003年8月、14(8):3114−25頁)。
【0036】
SNARE相互作用を活性化することが公知である酵素を過剰発現することも可能である。好ましくは、セラミド活性化ホスファターゼタンパク質(CAPP)またはそのホモログが過剰発現される(フィッシュバイン(Fishbein)JD、ドブロフスキー(Dobrowsky)RT、ビエラウスカ(Bielawska)A、ガレット(Garrett)S、ハヌン(Hunnun)YA.セラミド媒介増殖阻害およびCAPPはサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)で保存されている(Ceramide−mediated growth inhibition and CAPP are conserved in Saccharomyces cerevisiae)。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)1993年5月5日、268(13):9255−61頁)。
【0037】
ペルオキシソームの恒常性が影響を受けるように真核細胞を改変することも可能である。かかる改変は、本発明の真核細胞を生じる親細胞のペルオキシソームバイオジェネシスおよび/または分解と比較して、ペルオキシソームバイオジェネシスの速度を向上させることおよび/またはペルオキシソーム分解の速度を減少させることを含み得る。
【0038】
より好ましい実施形態によると、真核細胞は、
(a)ペルオキシソームバイオジェネシスに関係する遺伝子、例えばpex11および/もしくはpex3またはそれらのホモログを過剰発現させること、ならびに/または
(b)ペルオキシソーム分解に関係する遺伝子、例えばvps15および/もしくはpdd1および/もしくはAPGまたはそれらのホモログの発現を下方制御すること
によって、遺伝学的に改変されている(国際公開第00/71579号パンフレットに記載されている)。
【0039】
ペルオキシソームバイオジェネシスにおけるpex3およびpex11ポリペプチドの役割は、すでに記載されている(ベーレンツ(Baerends)RJら、イースト(Yeast.)1997年12月、13(15):1449−63頁および国際公開第00/71579号パンフレット)。ペルオキシソームの分解におけるApgおよびVps15ポリペプチドの役割もまた、記載されている(ワン(Wang)CWら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)2001年8月10日、276(32):30442−51頁およびハッチンス(Hutchins)MUら、ジャーナル・オブ・セル・サイエンス(J Cell Sci.)1999年11月、112(22号):4079−87頁)。
【0040】
上述の方法の代わりに、または上述の方法と組み合わせて、適切なスクリーニング方法を用いた典型的な菌株改良によって、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができるペルオキシソームを含む真核細胞を得ることができる。好ましいスクリーニング方法は、後で記載するように、好ましくは、モデルタンパク質のペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを用い、細胞外のモデルポリペプチドの存在を測定して、細胞のペルオキシソームにおいてGFPのようなモデルポリペプチドの発現を用いる。細胞外のGFPの存在は、蛍光および/またはウェスタンブロッティングによって測定され得るが、これらに限定されない。
【0041】
本発明の真核細胞は、遺伝学的に改変されて、野生型細胞と比較してより低いプロテアーゼ発現および/または分泌を示す表現型を得ることができる。かかる表現型は、プロテアーゼの発現の転写調節因子の欠失および/または修飾および/または不活性化によって得ることができる。かかる転写調節因子は、例えばprtTである。prtTを調節することによってプロテアーゼの発現を低下させる技術は、米国特許出願公開第2004/0191864A1号明細書に記載されている。
【0042】
本発明に従って改変される宿主細胞の選択は、大部分は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の供給源、または生成される代謝産物の同一性に依存する。好ましくは、真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、菌類または藻類細胞である。好ましい哺乳動物細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、293細胞、PerC6細胞およびハイブリドーマが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、例えばSf9およびSf21細胞およびそれらの派生物が挙げられる。より好ましくは、真核細胞は菌類細胞、すなわちK.ラクティス(K.lactis)もしくはS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)またはハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の酵母細胞、または糸状菌細胞である。最も好ましい実施形態によると、真核細胞は糸状菌細胞である。
【0043】
「糸状菌」としては、亜門、真菌(Eumycota)および卵菌(Oomycota)の全ての糸状形態が挙げられる(ホークスワーク(Hawksworth)ら、1995年、上掲に定義されるように)。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複合多糖類で構成される菌糸壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸長により、炭素異化は絶対的に好気性である。糸状菌株としては、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、オーレオバシジウム(Aureobasidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、ヒュミコーラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロミセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ピロミセス(Piromyces)、シゾフィラム(Schizophyllum)、タラロミセス(Talaromyces)、サーモアスクス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)およびトリコデルマ(Trichoderma)の株が挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
好ましい糸状菌細胞は、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)またはトリコデルマ(Trichoderma)属の種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ソヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)またはペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)の種に属する。
【0045】
いくつかの菌株の糸状菌が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)、ドイッチュ・ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥレンGmbH(Deutsche Sammulung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、菌株保存機関(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)およびアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション、ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター(Agricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center)(NRRL)等の多くのカルチャーコレクションにおいてすでに公に容易に入手可能であり、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)CBS513.88、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)ATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488〜14491、ATCC11601、ATCC12892、P.クリソゲナム(P.chrysogenum)CBS455.95、ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)ATCC38065、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)P2、アクレモニウム クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)ATCC36225またはATCC48272、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)ATCC26921またはATCC56765またはATCC26921、アスペルギルス・ソヤ(Aspergillus sojae)ATCC11906、クリソスポリウム・ルクノウエンセ(Chrysosporium lucknowense)ATCC44006およびそれらの派生物である。
【0046】
ポリペプチド
第二の態様において、本発明は、第一の態様の真核細胞の調製に用いられる新規のポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、本明細書中上記で定義するような、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドがペルオキシソーム膜ポリペプチドに操作可能に結合しているキメラポリペプチド、ペルオキシソーム膜ポリペプチドおよび補完融合ポリペプチドを提供する。
【0047】
ある実施形態において、本発明は、(a)配列番号13のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号13のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、v−SNARE機能を示すポリペプチドを提供する。
【0048】
別の実施形態において、本発明は、(a)配列番号16のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号16のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ペルオキシソーム膜ポリペプチドを提供する。
【0049】
さらに別の実施形態において、本発明は、キメラポリペプチドが、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部を含む、供与膜構造の表面で露出した融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のペルオキシソームの表面での露出を得るのに適したキメラポリペプチドを提供する。
【0050】
好ましくは、キメラポリペプチドの融合ポリペプチド構成要素は、N末端から第一の(最もN末端側)膜貫通ドメインまでの、v−SNAREポリペプチドのアミノ酸を含む。より好ましくは、融合ポリペプチド構成要素は、(a)配列番号13の1〜95位に対応する配列、および(b)(a)で定義される配列に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0051】
同様に好ましくは、キメラポリペプチドのペルオキシソーム膜タンパク質構成要素は、(a)配列番号16の2〜224位に対応する配列、好ましくは3または4または5または6または7または8または9または10または11または12または13または14または15または16または17または18または19または20または21または22または23または24または25または26または27または28または29または30または31または32または33または34または35または36または37または38または39または40〜224位に対応する配列、および(b)(a)で定義される配列に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0052】
より好ましくは、キメラポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
【0053】
したがって、本発明の好ましいキメラポリペプチドは、(a)分泌経路の供与膜の細胞質側表面で露出した融合ポリペプチドのドメイン、および(b)ペルオキシソーム膜に標的化され、結合するドメインを含み、ここでドメイン(a)および(b)は操作可能に結合されており、ペルオキシソームを含む宿主細胞におけるキメラポリペプチドの発現によって、ペルオキシソームに、宿主細胞の分泌経路の受容膜と融合する能力が与えられる。好ましくは、ドメイン(a)および(b)は、単一のオープンリーディングフレーム中に存在し、ドメイン(a)は、ドメイン(b)よりもポリペプチドのN末端に近い。好ましくは、ドメイン(a)はv−SNARE由来である。より好ましくは、ドメイン(a)は、v−SNAREの、N末端から、第一の膜貫通ドメインまで、または第一の膜貫通ドメインを含む範囲にわたる、v−SNARE由来の断片を含む。本発明の好ましいキメラポリペプチドにおいて、ドメイン(a)における断片は、配列番号13、または配列番号13に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列の、1〜95位に対応する配列を含む。断片は、v−SNAREのN末端から第一の膜貫通ドメインまでのアミノ酸の、少なくとも70%、80%、90%または95%にわたり得る。
【0054】
本発明の好ましいキメラポリペプチドにおいて、ドメイン(b)は、膜貫通ドメイン、およびドメインをペルオキシソーム膜に標的化する配列を含む。好ましくは、ドメイン(a)に最も近位の膜貫通ドメインのN末端は、細胞質側向きに方向付けられている。好ましくは、ドメイン(b)は、ペルオキシソーム膜タンパク質由来の配列を含む。より好ましくは、ドメイン(b)は、N末端が天然にペルオキシソームの細胞質側に露出しているペルオキシソーム膜ポリペプチド由来、または細胞質側向きに方向付けられたN末端を有する少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である。最も好ましくは、ドメイン(b)は、N末端が細胞質側向きに方向付けられた最もN末端側の膜貫通ドメインから少なくとも10アミノ酸までN末端アミノ酸が除かれている、ペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である。ドメイン(b)は、Pmp22、Pmp34、Pmp47、Pmp70、Pex3、Pex11、Pex14およびPex22から選択されるペルオキシソーム膜ポリペプチドから得ることができる。好ましい実施形態において、本発明のキメラタンパク質ドメイン(b)は、配列番号16の2〜224位に対応する配列、好ましくは3もしくは4もしくは5もしくは6もしくは7もしくは8もしくは9もしくは10もしくは11もしくは12もしくは13もしくは14もしくは15もしくは16もしくは17もしくは18もしくは19もしくは20もしくは21もしくは22もしくは23もしくは24もしくは25もしくは26もしくは27もしくは28もしくは29もしくは30もしくは31もしくは32もしくは33もしくは34もしくは35もしくは36もしくは37もしくは38もしくは39もしくは40〜224位に対応する配列、または配列番号16に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列である。最も好ましくは、キメラタンパク質は、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
【0055】
本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列の間の相同性の程度は、2つの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージをいう。まず、相同なポリペプチド配列は、ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)アルゴリズムを用いて検索され、これはアルチュール(Altschul)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)215:403−410頁(1990年)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公に入手可能である。BLASTアルゴリズムパラメータW、BおよびEは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして3の文字列長(W)、BLOSUM62スコア行列(ヘニコフ(Henikoff)およびヘニコフ(Henikoff)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・USA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:10915頁(1989年)参照)50のアラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=−4を使用する。
【0056】
次に、相同な配列の(上記で定義したような)同一性の程度を、以下のパラメータ、ギャップサイズ:5、ギャップオープン:11、ギャップ延長:1、ミスマッチ:−15、文字列サイズ:3を用いたCLUSTALWアラインメントアルゴリズム(ヒギンズ(Higgins)Dら(1994年)ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)22:4673−4680頁)を用いて決定する。
【0057】
ポリヌクレオチド
第三の態様において、本発明は、第二の態様のポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【0058】
本発明は、本明細書中で定義されるような、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドがペルオキシソーム膜ポリペプチドに操作可能に結合したキメラポリペプチド、ペルオキシソーム膜ポリペプチドおよび補完融合ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。
【0059】
本発明に従って改変される真核細胞を選択した後、融合ポリペプチドの本体(供給源)、ペルオキシソーム膜アンカーとして機能するポリペプチド、および任意に補完融合ポリペプチドが樹立され得る。例えば、第二の態様のポリペプチドをコードする核酸配列の供給源は、適した真核細胞の本体に依存し得る。好ましくは、第二の態様のポリペプチドをコードする核酸配列は、本発明に従って改変される真核細胞にとって内在性である。
【0060】
本発明はさらに、適した宿主におけるポリペプチドの発現を指示する1つ以上の制御配列に操作可能に結合された、上記で定義されるようなポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを提供する。
【0061】
発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関係する任意のステップを含むと理解されよう。
【0062】
「核酸コンストラクト」は、本明細書中では、天然に存在する遺伝子から単離された、または天然に他に存在しないように組み合わせおよび並置された核酸のセグメントを含むよう修飾された、単鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子として定義される。用語核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な制御配列全てを含む場合、用語発現カセットまたはベクターと同義である。
【0063】
用語「制御配列」は、本明細書中では、一般にポリペプチドの発現に必要または有利である全ての構成要素を含むよう定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然または外来であり得る。かかる制御配列としては、プロモーター、リーダー、最適な翻訳開始配列(コザック(Kozak)、1991年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)266:19867−19870頁に記載されるような)、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低限、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。
【0064】
用語「操作可能に結合された」は、本明細書中では、制御配列がDNA配列のコード配列に関する位置に、制御配列がポリペプチドの発現を指示するように適切に配置された配置として定義される。
【0065】
制御配列は、変異、トランケートおよびハイブリッドプロモーターを含む、細胞において転写活性を示す、任意の適切なプロモーター配列であり得、細胞にとって相同(天然)または異種(外来性)のいずれかの、細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【0066】
プロモーターは、発現されるコード配列と天然に結合しているプロモーターであり得る。プロモーターはまた、発現されるコード配列にとって外来性の、構成的または誘導性プロモーターであり得る。哺乳動物細胞における使用に適したプロモーターの例は、例えば、サンブルック(Sambrook)およびラッセル(Russel)(2001年)「モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版)」ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York)に記載されている。酵母における使用に適したプロモーターの例としては、例えば、解糖プロモーターが挙げられる。
【0067】
使用され得る好ましい誘導性プロモーターの例は、デンプン、銅、オレイン酸誘導性プロモーターである。
【0068】
別の好ましい実施形態によると、本発明の宿主細胞において、CAPP等の遺伝子が過剰発現されなければならない場合、A.ニゲル(A.niger)のグルコアミラーゼプロモーターまたはA.オリザエ(A.oryzae)のTAKAアミラーゼプロモーター等の強力な誘導性プロモーターが用いられる。
【0069】
制御配列はまた、転写を終了するよう細胞によって認識される配列である、適した転写ターミネーター配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に、動作可能に連結される。細胞において機能的である、任意のターミネーターが、本発明において用いられ得る。
【0070】
糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、A.オリザエ(A.oryzae)TAKAアミラーゼ、A.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼ、A.ニードランス(A.nidulans)アントラニル酸シンターゼ、A.ニゲル(A.niger)α−グルコシダーゼ、trpC遺伝子およびフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0071】
制御配列はまた、糸状菌細胞による翻訳に重要なmRNAの非翻訳領域である、適したリーダー配列であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に、動作可能に連結される。細胞において機能的である任意のリーダー配列が、本発明において用いられ得る。
【0072】
糸状菌細胞のための好ましいリーダーは、A.オリザエ(A.oryzae)TAKAアミラーゼおよびA.ニードランス(A.nidulans)トリオースホスフェートイソメラーゼおよびA.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0073】
制御配列はまた、核酸配列の3’末端に動作可能に連結された、転写された場合に糸状菌細胞によって、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される配列である、ポリアデニル化配列であり得る。細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本発明において用いられ得る。
【0074】
糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、A.オリザエ(A.oryzae)TAKAアミラーゼ、A.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼ、A.ニードランス(A.nidulans)アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシポラム(Fusarium oxyporum)トリプシン様プロテアーゼおよびA.ニゲル(A.niger)α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0075】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする、プロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド(またはいくつかの場合においてはチモーゲン)として公知である。
【0076】
核酸コンストラクトは、ベクターもしくは発現ベクターと同一、またはベクターもしくは発現ベクター中でクローニングされ得る。
【0077】
組み換え発現ベクターは、組み換えDNA手順に簡便に供され得、融合ポリペプチド(または補完融合ポリペプチド)をコードする核酸配列の発現引き起こし得る、任意のベクター(例えばプラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される真核細胞との、ベクターの適合性に依存する。ベクターは、直鎖状または閉環プラスミドであり得る。ベクターは、自律増殖ベクター、すなわち複製が染色体複製から独立した染色体外の実体として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム、または人工染色体であり得る。糸状菌細胞中で用いられ得る自律維持クローニングベクターは、AMA1−配列を含む(例えばアレクセンコ(Aleksenko)およびクラッターバック(Clutterbuck)(1997年)フンガル・ジェネティクス・アンド・バイオロジー(Fungal Genet.Biol.)21:373−397頁参照)。
【0078】
あるいは、ベクターは、細胞に導入された場合にゲノムに統合され、統合された染色体とともに複製されるものであり得る。組み込みベクターは、宿主細胞の染色体中、ランダムに、または予め決定された標的遺伝子座で統合し得る。
【0079】
本発明の好ましい実施形態において、組み込みベクターは、予め決定された遺伝子座に、ベクターを標的化するために宿主細胞のゲノム中の予め決定された標的遺伝子座におけるDNA配列に相同なDNA断片を含む。標的化された統合を促進するために、ベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方、好ましくは両端で、標的遺伝子座に相同な配列が側面に並ぶように行われる。標的遺伝子座が側面に並ぶ相同な配列の長さは、宿主細胞の本体に依存している。菌類に関して、長さは、好ましくは少なくとも30bp、好ましくは少なくとも50bp、さらに好ましくは少なくとも0.1kb、さらに好ましくは少なくとも0.2kb、より好ましくは少なくとも0.5kb、さらにより好ましくは少なくとも1kb、最も好ましくは少なくとも2kbである。好ましくは、標的遺伝子座に相同な、ベクター中のDNA配列は、高度に発現される遺伝子座に由来し、宿主細胞において高い発現レベルが可能な遺伝子に由来することを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高度に発現される遺伝子は、本明細書中では、例えば誘導条件下でmRNAが全細胞mRNAの少なくとも0.5%(w/w)を占め得る遺伝子、または、あるいは遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも1%(w/w)を占め得る遺伝子(EP357127号明細書に記載されるように)として定義される。多くの好ましい高度に発現される菌類遺伝子が、例によって示される。アスペルギルス(Aspergilli)またはトリコデルマ(Trichoderma)由来のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼまたはセロビオヒロドロラーゼ遺伝子。これらの目的のための、最も好ましい、高度に発現される遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくはA.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼ遺伝子、A.オリザエ(A.oryzae)TAKA−アミラーゼ遺伝子、A.ニードランス(A.nidulans)gpdA遺伝子またはトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼ遺伝子である。この型の発現ベクターは、CAPPまたは融合ポリペプチドもしくは補完融合ポリペプチドの野生型もしくは構成的に活性のある変異体(sso1)等の所定の遺伝子を本発明真核細胞中で過剰発現するのに高度に適している。
【0080】
あるいは、遺伝子の修飾または不活性化は、遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を用いる確立されたアンチセンス技術によって行われ得る。より具体的には、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、細胞中で転写され得、細胞中で生成されるmRNAにハイブリダイズすることができる、核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することによって、減少または排除され得る。mRNAへの相補的アンチセンスヌクレオチド配列のハイブリダイズが可能な条件下で、翻訳されるタンパク質の量は、したがって、減少または排除される。アンチセンスRNAを発現することの例は、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー(Appl Environ Microbiol.)2000年2月、66(2):775−82頁に示されている。(アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)のタンパク質分泌経路における、フォルダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼAの特徴付け(Characterization of a foldase,protein disulfide isomerase A,in the protein secretory pathway of Aspergillus niger)ニャム(Ngiam)C、ジェーネス(Jeenes)DJ、プント(Punt)PJ、ヴァンデンホンデル(Van Den Hondel)CA、アーチャー(Archer)DB)または(ズレンナー(Zrenner)R、ウィルミツアー(Willmitzer)L、ゾンネンワルド(Sonnewald)U、ジャガイモウリジン二リン酸−グルコースピロホスホリラーゼの発現およびアンチセンスRNAによるその阻害の解析(Analysis of the expression of potato uridinediphosphate−glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA)プランタ(Planta.)(1993年)、190(2):247−52頁)。
【0081】
さらに、遺伝子の修飾、下方制御または不活性化は、RNA干渉(RNAi)技術を介して得ることができる(FEMSマイクロバイオロジー・レターズ(FEMS Microb.Lett.)237(2004年):317−324頁)。この方法において、発現が影響を受けるヌクレオチド配列の同一のセンスおよびアンチセンス部分が、間のヌクレオチドスペーサーとともに互いの後ろにクローニングされ、発現ベクターに挿入される。その後、分子が転写され、小さい(21〜23)ヌクレオチド断片の形成によって、影響を受けるmRNAの、標的化された分解につながる。特定のmRNAの排除は、種々の程度であり得る。国際公開第2005/05672A1号パンフレットおよび/または国際公開第2005/026356A1号パンフレットに記載されているRNA干渉技術を、遺伝子の下方制御、修飾または不活性化に用い得る。
【0082】
VSM1等の宿主の遺伝子が不活性化されなければならない場合、これは、好ましくは、EP635574号明細書に記載される技術に従って不活性化ベクターを設計することおよびベクターを不活性化される遺伝子の遺伝子座で標的化することによって行われる。
【0083】
1つより多いコピーの、融合(任意に補完融合)ポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の生成を増大させ得る。これは、好ましくは、DNA配列をそのゲノムコピーに組み込むこと、より好ましくはDNA配列の組み込みを高度に発現される遺伝子座、好ましくはグルコアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子座で標的化することによって、行われ得る。あるいは、これは、選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それによってさらなるコピーの核酸配列を含む細胞が適切な選択可能因子の存在下で細胞を培養することによって選択され得る核酸配列を有する、増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含むことによって行われ得る。過剰発現されるDNA配列のコピーの数をさらに多く増大させるために、国際公開第98/46772号パンフレットに記載されるような遺伝子変換の技術が用いられ得る。この型の発現ベクターはまた、本発明の宿主細胞中でCAPP等の所定の遺伝子を過剰発現するのに高度に適している。
【0084】
糸状菌細胞における使用のための選択可能マーカーは、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノ−スリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびに他の種由来の同等物を含むがこれらに限定されない群より選択され得る。A.ニードランス(A.nidulans)またはA.オリザエ(A.oryzae)のamdS(欧州特許第635574B1号明細書、国際公開第97/06261号パンフレット)およびpyrG遺伝子ならびにストレプトミセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)のbar遺伝子が、アスペルギルス(Aspergillus)細胞における使用に好ましい。より好ましくは、amdS遺伝子が用いられ、さらにより好ましくは、A.ニードランス(A.nidulans)またはA.ニゲル(A.niger)のamdS遺伝子が用いられる。最も好ましい選択マーカー遺伝子は、A.ニードランス(A.nidulans)gpdAプロモーターに融合したA.ニードランス(A.nidulans)amdSコード配列である(欧州特許第635574B号明細書に開示されるように)。他の糸状菌由来のamdS遺伝子もまた、用いられ得る(国際公開第97/06261号パンフレット)。ストレプトアロテイチャス・ヒンドゥスタナス(Streptoalloteichus hindustanus)由来のブレオマイシン遺伝子もまた、フレオマイシン耐性への下等および高等真核生物の形質転換のためのストレプトアロテイチャス・ヒンドゥスタナス(Streptoalloteichus hindustanus)ble遺伝子のカセット(Cassetets of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance)。ドロコート(Drocourt)D、カルメル(Calmels)T、レイネス(Reynes)JP、バロン(Baron)M、ティラビ(Tiraby)G.ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)1990年7月11日、18(13):4009頁に記載されているように、用いられ得る。
【0085】
本発明の組み換え発現ベクターを構築するための、上述の要素をライゲートするために用いられる手順は、当業者に周知である(例えば、サンブルック(Sambrook)ら、1989年、上掲参照)。
【0086】
ベクター系は、ともに細胞のゲノムに導入される全DNAを含む、単一のベクターまたは2つ以上のベクターであり得る。ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、1つ以上の選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、生成物が生命崩壊剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株への原栄養性等を提供する、遺伝子である。
【0087】
細胞への発現ベクターまたは核酸コンストラクトの導入は、一般に公知の技術を用いて行われる。これは、それ自体公知の様式で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生からなるプロセスを含み得る。アスペルギルス(Aspergillus)細胞の形質転換に適した手順は、EP238023号明細書およびエルトン(Yelton)ら、1984年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ USA(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)81:1470−1474頁に記載されている。フザリウム(Fusarium)種を形質転換する、適した方法は、マラーディーら、1989年、ジーン(Gene)78:147156頁または国際公開第96/00787号パンフレットによって記載されている。真正植物病原菌エリシフェ・グラミニスホルデイ亜種の微粒子銃形質転換(Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus,Erysiphe graminis f.sp.hordei.)クリスチャンセン(Christiansen)SK、クヌートセン(Knudsen)S、ギーゼ(Giese)H.カレント・ジェネティクス(Curr.Genet.)1995年12月、29(1):100−2頁に記載されるような微粒子銃形質転換を用いる方法等の他の方法が適用され得る。選択された形質転換細胞は、次いでペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する膜構造、例えば細胞膜に融合する能力について、解析される。
【0088】
細胞が、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合の能力を得たかどうかを解析する、いくつかの方法が利用可能である。
【0089】
ある実施形態によると、細胞の形態が、ペルオキシソーム特異的標識を用いて、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合を可視化する、電子または蛍光顕微鏡下で研究される。ペルオキシソーム特異的標識の例は、
・サイモン(Simon)M、ビンダー(Binder)M、アダム(Adam)G、ハルティヒ(Hertig)A、ルイス(Ruis)H ADR1、SNF1(CAT1、CCR1)およびSNF4(CAT3)によるサッカロミセス・セレヴィシエにおけるペルオキシソーム増殖の制御(Control of peroxisome proliferation in Saccharomyces cerevisiae by ADR1,SNF1(CAT1,CCR1)and SNF4(CAT3).)イースト(Yeast)1992年4月、8(4):303−9頁によって記載されているようなチオール酸標識、または
・モノソフ(Monosov)EZ、ワンツェル(Wenzel)TJ、ルアーズ(Luers)GH、ハイマン(Heyman)JA、サブラマニ(Subramani)S 生きたP.パストリス細胞における緑色蛍光タンパク質でのペルオキシソームの標識(Labeling of peroxisomes with green fluorescent protein in living P.pastoris cells.)ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー(J Histochem Cytochem.)1996年6月、44(6):581−9頁によって記載されているようなGFP標識、または
・クンシュ(Kunce)CM、トレリース(Trelease)RN、ターリー(Turley)RB.綿実(ゴシピウム・ヒルスツム・L.)カタラーゼの精製および生合成(Purification and biosynthesis of cottonseed(Gossypium hirsutum L.)catalase.)バイオケミカル・ジャーナル(Biochem J.)1988年4月1日、251(1):147−55頁に記載されているようなカタラーゼ標識
である。
【0090】
別の実施形態によると、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、好ましくはモデルポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを用い、培地中のモデルポリペプチドの存在を測定して、細胞のペルオキシソームにおいてモデルポリペプチドを発現することによってモニタリングされる。好ましいモデルポリペプチドは、発酵培地中の存在が蛍光によって可視化され得、ウェスタンブロットによってモニタリングされ得るために、緑色蛍光タンパク質(GFP)である。他のモデルポリペプチドは、アセトアミダーゼ等のペルオキシソーム局在化シグナルまたはカタラーゼ、アマドリアーゼもしくはチオラーゼ等の天然にペルオキシソームに局在するタンパク質と、操作可能に結合された、酵素活性のある細胞内タンパク質であり得る。
【0091】
好ましくは、第一の態様の真核細胞は、生成されたポリペプチドの合計量の少なくとも10%が培養中の所定の時点で培地中に分泌される程度まで、より好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも40%が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも60%が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも70%が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも80%が分泌される程度まで、最も好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも90%が分泌される程度まで、ペルオキシソーム融合効率を示す。生成されたポリペプチドの合計量は、培地がバイオマス画分および培地画分からなると定義される場合、培地中に存在するポリペプチドの量として定義される。分泌されたポリペプチドの量は、モデルポリペプチドを用いて推定され得る。このモデルポリペプチドは、後に定義されるように、PTS−1等の操作された、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを有する緑色蛍光タンパク質(GFP)(例えばGFP−SKL)であり得る。培地画分内のGFP−SKLの濃度は、当業者に公知の技術(例えば蛍光測定、吸光度測定、ウェスタンブロット)を用いて決定され得る。決定された、モデルポリペプチドの濃度を用いて、分泌されたモデルポリペプチドの画分を、生成されたモデルポリペプチドの合計量のパーセンテージとして計算し得る。
【0092】
目的の化合物の生成
本発明はさらに、目的の化合物が細胞のペルオキシソーム中に存在する、第一の態様の真核細胞における目的の化合物の生成の方法に関する。この方法は、
(a)目的の化合物の発現に伝導性のある条件下、所定の培地中で第一の態様の真核細胞を培養する工程および
(b)任意に、目的の化合物を精製する工程
を含む。
【0093】
好ましい実施形態によると、目的の化合物は、培地から回収され、任意に精製される。
【0094】
別の好ましい実施形態によると、目的の化合物はポリペプチドである。
【0095】
より好ましくは、第一の態様の真核細胞は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、目的のポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードする核酸配列と操作可能に結合された核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む。
【0096】
ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、ペルオキシソームの内側の結合したポリペプチドの局在化および/または蓄積を可能にする限りは、任意のシグナルであり得る。
【0097】
好ましくは、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、
(a)NからC末端方向の第一のアミノ酸がA、C、H、K、N、P、SまたはTであり、NからC末端方向の第二のアミノ酸がH、K、N、Q、RまたはSであり、NからC末端方向の第三のアミノ酸がA、F、I、L、MまたはVであるトリペプチド、および
(b)(R/K)(L/V/I/Q)XX(L/V/I/H/Q)(L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F)として定義され、Xが任意のアミノ酸であり得るペプチド
からなる群より選択される。
【0098】
より好ましくは、PTS−1とも呼ばれる、(a)で定義されるトリペプチドは、ペルオキシソームにおいて生成されるポリペプチドのC末端延長部分として存在する。したがって、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードするDNA配列は、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の下流でクローニングされ、目的のポリペプチドをコードするDNA配列と、操作可能に結合される。
【0099】
好ましい実施形態によると、(a)で定義されるトリペプチドは、菌類、植物および動物におけるペルオキシソームプロテオームのコンピュータでの予測(In silico prediction of the peroxisomal proteome in fungi,plants and animals.)オロフ・エマニュエルソン(Olof Emanuelsson)、アルネ・エロフソン(Arne Elofsson)、グンナー・フォン・エジュン(Gunner von Heijne)およびスサーナ・クリストーバル(Susana Cristobal)ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)(2003年)330、443−456頁に記載されるような、[PAS]−[HKR]−[L]のバリアントである。より好ましい実施形態によると、(a)で定義されるトリペプチドは、SKLまたはPRLである。
【0100】
別の好ましい実施形態によると、(a)で定義されるトリペプチドPTS−1)は、一旦細胞外にポリペプチドが分泌されると、目的のポリペプチドのC末端から、トリペプチド配列の除去を可能にする配列、またはトリペプチド配列の前の配列とともにトリペプチド配列の除去を可能にする配列に、先行される。かかる配列は、例えば、適した配列特異的プロテアーゼまたはペプチダーゼの、認識配列であり得る。
【0101】
(b)で定義されるペプチドはまた、PTS2シグナルと呼ばれる(スウィンケルス(Swinkels)Bら、1991年EMBOジャーナル(EMBO Journal)3255−3262頁、ペトリフ(Petriv)O.I.ら、2004年ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(The Joural of molecular Biology)119−134頁)。好ましくは、これらはポリペプチドのN末端部分に存在する。
【0102】
目的のポリペプチドがすでにペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを含む場合、好ましくは、この天然のシグナルを用いて、ペルオキシソーム局在化が促進される。あるいは、ペルオキシソーム局在化を促進する天然のシグナルを異なるものによって置換することを選択し得る。あるいは、ペルオキシソーム局在化を促進する天然のDNA配列を、上記で定義されたペルオキシソーム局在化を促進する配列をコードするDNA配列の1つによって置換することを選択し得る。
【0103】
ある実施形態において、本発明は、ペルオキシソームにおける目的のポリペプチドの段階的細胞外生成を構想する。第一段階において、目的のポリペプチドがペルオキシソーム中に蓄積し、第二段階において、本発明のキメラポリペプチド(任意に補完融合ポリペプチド)の発現を推進する誘導性プロモーターが、特異的誘導因子を培地に加えることによって誘導され、これは次にペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合につながる。これにより、結果として目的のポリペプチドの細胞外生成が生じる。
【0104】
あるいは、他の型の段階的生成が可能である。第一に、目的のポリペプチドの生成、次いでペルオキシソーム増殖の誘導、および最後のステップとして、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合。
【0105】
ポリペプチドは、宿主細胞にとって天然または外来性の任意のポリペプチドであり得る。用語「外来性ポリペプチド」は、本明細書中では、所定の細胞によって天然に生成されないポリペプチドとして定義される。用語「ポリペプチド」は、本明細書中では、特定の長さの、生成される、コードされるポリペプチドをいうよう意図されず、そのため、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。
【0106】
第一の態様の真核細胞は、成熟に還元環境を必要とするポリペプチド、例えば細胞内ポリペプチドの生成に高度に適している。したがって、好ましい実施形態によると、目的のポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。したがって、第一の態様の真核細胞を用いる本発明の方法は、産業規模で培地中で細胞内ポリペプチドを生成することができる最初のものである。
【0107】
好ましいポリペプチドは、アマドリアーゼ、カタラーゼ、アシル−CoAオキシダーゼ、リノール酸イソメラーゼ、トランス−2−エノイル−ACPレダクターゼ、トリコテセン、3−O−アセチルトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、カルニチンラセマーゼ、D−マンデル酸デヒドロゲナーゼ、エノイルCoAヒドラターゼ、フルクトシルアミン酸素オキシドレダクターゼ、2−ヒドロキシヘプタ−2,4−ジエン−1,7−ジオエートイソメラーゼ、NADP依存性マレイン酸デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、キノンレダクターゼ等のペルオキシソーム中で天然に生成される酵素である。これらの酵素は全てC末端のSKL配列を含む。
【0108】
他の細胞内酵素は、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼアミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼである。
【0109】
別の実施形態において、ポリペプチドは、抗体もしくはその一部、抗原、凝固因子、細胞外酵素、ホルモンもしくはホルモンバリアント、受容体もしくはその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーターまたは輸送タンパク質である。
【0110】
別の実施形態によると、生成されるポリペプチドは、組み換え体である。第一の態様の真核細胞が、ペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列を含む、生成されるポリペプチドをコードするDNA配列に操作可能に結合された核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトで形質転換されている。
【0111】
それによって、本発明は、細胞の通常の分泌経路において困難に遭遇するポリペプチドの細胞外生成を、有利に可能にする。一例として、生成される目的のポリペプチドは細胞外ポリペプチドであり、20個より多いシステイン、10個以下のシステイン、6個以下のシステインまたは2個以下のシステインを含んではならない。かかるポリペプチドは、宿主細胞にとって天然または異種であり得る。これらのポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞にとって組み換え体である。かかるポリペプチドの例は、以下の通りである。システインを含まない、アスペルギルス・フォエニシス(Aspergillus phoenicis)由来のシュウ酸デカルボキシラーゼ(APOXD、特許出願国際公開第9842827−A2号パンフレットに記載されている)、システインを含まない、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)由来のアスペルギロペプシンII(アスペルギルス・ニゲル酸性プロテイナーゼAのチモーゲンの遺伝子および推論されるタンパク質配列(The gene and deduced ptorein sequences of the zymogen of Aspergillus niger acid proteinase A)、イノウエ(Inoue)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)1991年10月15日、266(29):19484−19489頁)、システインを含まない、リーシュマニア・メキシカナ(Leishmania mexicana)由来の分泌された酸性ホスファターゼ2(リーシュマニア・メキシカナ分泌酸性ホスファターゼにおけるホスホグリカン修飾の標的としてのSer/Thrに富んだ反復モチーフ(Ser/Thr−rich repetitive motifs as targets for phosphoglycan modifications in Leishmania mexicana secreted acid phosphatase)ヴィーゼ(Wiese)ら、EMBOジャーナル(EMBO J.)1995年3月15日、14(6):1067−1074頁)、システインを含まない、スクレロティニア・スクレロティオラム(Sclerotinia sclerotiorum)由来の非アスパルチル酸性プロテアーゼ(スクレロティニア・スクレロティオラムの病因の間に発現される非アスパルチル酸性プロテアーゼをコードするacp1の調節(Regulation of acp1,encoding a non−aspartyl acid protease expressed during pathogenesis of Sclerotinia sclerotiorum)、プスロー(Poussereau)ら、マイクロバイオロジー(Microbiology)2001年3月、147(3号):717−726頁)、1個のシステインを含む、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)由来のキシラナーゼA(特許出願国際公開第200068396−A2号パンフレットに記載されるxynA)、2個のシステインを含む、ムス・ムスクルス(Mus musculus)由来のスルファミダーゼ(マウススルファミダーゼをコードする遺伝子:cDNAクローニング、構造および染色体マッピング(Gene encoding the mouse sulphamidase:cDNA cloning,structure,and chromosomal mapping)、コンスタンツィ(Constanzi)ら、マンマリアン・ゲノム(Mamm.Genome)2000年6月、11(6):436−439頁)。目的のポリペプチドはさらに、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼであり得る。目的のポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の原核、真核、または他の供給源から得ることができる。本発明の目的のために、用語「から得る」は、所定の供給源と関連して本明細書中で使用される場合、ポリペプチドが供給源によって、または供給源由来の遺伝子が挿入された細胞によって生成されることを意味するものとする。
【0112】
本発明の方法は、培養プロセスの最後に少なくとも0.01g/lの目的のポリペプチドの生成を、有利に可能にする。好ましくは少なくとも0.05g/lのポリペプチドが生成され、より好ましくは少なくとも0.1g/l、さらにより好ましくは少なくとも0.5g/l、最も好ましくは少なくとも1g/lのポリペプチドが生成される。
【0113】
別の好ましい実施形態によると、目的の化合物は代謝産物である。好ましい代謝産物は、タキソール、カロチノイドを含むイソプレノイド、アルカロイドを含むペニシリン、セファロスポリン、ロバスタチンを含むスタチン、および抗酸化物質である。第一の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞は、内在性ペルオキシソーム代謝産物の生成に用いられている。内在性ペルオキシソーム代謝産物の例は、イソ酪酸、イソ吉草酸およびa−メチル酪酸である。第二の好ましい実施形態によると、代謝産物は、第一の態様の真核細胞を宿主細胞として用いて生成され、ここで真核細胞はさらに、代謝産物合成に関係する酵素をコードする核酸配列を含む、代謝産物合成に関係する酵素のペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードする核酸配列と操作可能に結合された、核酸コンストラクトまたは発現ベクターを含む。ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、すでに前述したようにペルオキシソームの内側の結合したポリペプチドの局在化および/または蓄積を可能にする限りは、任意のシグナルであり得る。代謝産物合成に関係する酵素の例は、以下の通りである。
−カロチノイド合成:フィトエン−βカロチンシンターゼcrtYBおよびcrtE、crtI、crtY、crtBおよびcrtZ。
−タキソール生合成:タキサン13α−ヒドロキシラーゼおよびタキサジエンシンターゼ。
−ペニシリン合成:アシルトランスフェラーゼ。
−セファロスポリン合成:エクスパンダーゼ。
−アルカロイド合成:S)−ノルコクラウリンシンターゼ(NCS)。
−スタチンポリケチドシンターゼ:ゲラニオール10−ヒドロキシラーゼ。
【0114】
さらに別の実施形態によると、本発明は、ペルオキシソーム中に存在する代謝産物の段階的細胞外生成を構想する。第一段階において、ペルオキシソーム中に代謝産物が蓄積し、第二段階において、融合ポリペプチド(任意に補完融合ポリペプチド)の発現を推進する誘導性プロモーターが、培地に特異的誘導因子を加えることによって誘導され、これは次に、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合につながる。これにより、結果として、代謝産物の細胞外生成が生じる。
【0115】
あるいは、他の型の段階的生成が可能である。まず、代謝産物の生成、次いでペルオキシソーム増殖の誘導、および最後のステップとして、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合の誘導。
【0116】
培養条件
第一の態様の宿主細胞は、当業者に公知の方法を用いて、目的の化合物の生成に適した栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、適した培地中および目的の化合物の発現および/または単離を可能にする条件下で行われる実験室または産業的発酵槽における、振とうフラスコ培養、小規模または大規模培養(連続、回分、流加または固体培養を含む)によって、培養され得る。培養は、当該分野で公知の手順を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む、適した栄養培地中で行われる(例えば、ベネット(Bennett)J.W.およびラシュール(LaSure)L.編、カリフォルニア州アカデミック・プレスのモア・ジーン・マニピュレーションズ・イン・フンギ(More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press、CA)1991年参照)。適した培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、または公開された組成物を用いて調製され得る(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)のカタログにおいて)。
【0117】
本発明はさらに、目的の化合物の生成のための、向上した生成方法を提供する。第一の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞は、培養物が酸素制限の条件下で維持されるように適した量の酸素が供給される培地中で培養される。より好ましくは、酸素制限の培養条件は、少なくとも培養期間の一部にわたって全ての栄養素が過剰に提供される培地中で行われる。さらにより好ましくは、培養期間の少なくとも一部は、培養期間の半分、より好ましくは培養期間の2/3、さらにより好ましくは培養期間の4/5、さらにより好ましくは培養期間の5/6、最も好ましくは培養期間全体を意味する。
【0118】
特徴によって、「過剰に提供される」は、全ての栄養素が、培養の間の本発明の宿主細胞の増殖の制限を確立を避けるのに十分な量供給されることを意味する。明らかに、栄養素は、阻害または毒性の効果を引き起こすような量で供給されるべきではない。
【0119】
適した量の酸素が培養物に供給され、培養物が酸素制限の条件下で維持される。したがって、本発明の関係において、適した量の酸素は、培養の間の酸素制限の条件を実現する量の酸素として定義される。酸素制限下で培地を維持するために、培地に供給される酸素の量は、宿主細胞によって消費される酸素の量を超えるべきではない。言い換えれば、OTRは、OURに実質的に同一であるべきである。OTR(酸素消費速度)は、酸素が培地の気相から液相に輸送される速度として定義される。OTRは、時間の単位あたりの酸素量として表される(例えばモル/時間)。OTRは、培養装置に入る酸素の量と気体出口で測定される酸素の量との間の差から簡便に測定される。OUR(酸素摂取速度)は、宿主細胞が、培地に供給される酸素を消費する速度として定義される。「実質的に同一」は、OTRが、+または−5%の偏差でOURに同一であることを意味する。好ましくは、OTRは、宿主細胞が酸素を直ちに消費することができるとすると、可能な限り、すなわち、例えば培養装置の配置および/または気体供給における酸素濃度によって可能な限り高い。しかしながら、到達し得る最大OTRよりも低いOTR、例えば最大OTR値の80または90%で酸素制限の条件下で培養プロセスを行うことも可能であることは、当業者に明らかになろう。
【0120】
OTRがOURに実質的に同一である状況において、培地中の溶存酸素濃度は、典型的には一定であり、酸素制限が培養を制御する場合、溶存酸素はゼロ、またはゼロに近くなる。培養プロセス中に酸素制限が存在するか否かを決定する簡便な方法は、OTRに対する、撹拌速度のわずかな増大(例えば5%)の効果を試験することである。OTRもまた減少する場合、酸素制限が実際に存在する。OTRが減少しないおよび/または溶存酸素濃度のみが減少する場合、酸素制限が存在する。代替的方法は、OTRに対する、栄養素供給の増大の効果を測定することである。栄養素供給の増大がOTRの増大を伴わない場合、酸素制限が存在する。
【0121】
第二の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞を培養することは、培養プロセスの間に培地のpHを変化させて目的の化合物の段階的細胞外生成を実現することを含む。第一の態様の宿主細胞の培養は、典型的には、宿主細胞および目的の化合物の両方に伝導性のある任意のpHで行われ得る。段階的細胞外生成は、プロセスの全体的収量を増大させ得る。第一段階において、第一の態様の宿主細胞に最も伝導性のあるpHで、目的の化合物がペルオキシソーム中に蓄積する。第二段階において、培地のpHが変えられる。より好ましくは、pHは、第一の態様の宿主細胞の培養の段階1と2の間の遷移段階の間に線形の過程で変えられる。第一の態様の宿主細胞の培養プロセスの全持続時間は、等式Tc=a+t+bによって定義され、式中
Tc=時間で表した培養プロセスの合計時間、
a=時間で表した培養の第一段階の持続時間、
t=時間で表した遷移段階の持続時間、
b=時間で表した培養の第二段階の持続時間。
【0122】
さらにより好ましい実施形態によると、等式は、以下の基準を満たす。
97≦Tc=a+t+b≦240、式中、
72≦a≦120、
1≦t≦24、
24≦b≦96
【0123】
さらにより好ましくは、等式は、以下の基準を満たす。
128≦Tc=a+t+b≦216、式中、
72≦a≦96、
8≦t≦24、
48≦b≦96
【0124】
なおさらにより好ましくは、等式は、以下の基準を満たす。
160≦Tc=a+t+b≦216、式中、
72≦a≦96、
16≦t≦24、
72≦b≦96
【0125】
最も好ましくは、等式は以下の基準を満たす。
Tc=a+t+b≦192、式中、
a≦72、
t≦24、
b≦96
【0126】
好ましくは、宿主細胞は、第一の段階において4.5〜6.0の間の範囲のpHで、および第二段階において5.5〜7.0の間の範囲のpHで培養される。最も好ましくは、宿主細胞は、第一段階において(a)pH6.0、および第二段階において(b)pH6.7で培養される。
【0127】
第三の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞の培養は、培養プロセスに間に培地の温度を変化させて目的の化合物の段階的細胞外生成を実現することを含む。第一の態様の宿主細胞の培養は、典型的には、宿主細胞および目的の化合物の両方に伝導性のある任意の温度で行われ得る。段階的細胞外生成は、プロセスの全体的収量を増大させ得る。第一段階において、第一の態様の宿主細胞に最も伝導性のある温度で、目的の化合物がペルオキシソーム中に蓄積する。第二段階において、培地の温度が変えられる。好ましくは、宿主細胞は、第一段階において30℃〜37°の間の範囲の温度で、および第二段階において34℃〜38℃の間の範囲の温度で培養される。最も好ましくは、宿主細胞は、第一段階において30℃で、および第二段階において36℃で培養される。
【0128】
あるいは、およびさらにより好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞の培養が行われ、ここで
・培養プロセスの少なくとも一部の間、適した量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下で維持される、および/または
・培地のpHが培養プロセスの間に変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現される、および/または
・培養プロセスの間に培地の温度が変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現される、および/または
・第一の態様の宿主細胞がアスペルギルス(Aspergillus)種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)の菌株である。
【0129】
最も好ましくは、第一の態様の宿主細胞の培養が行なわれ、ここで
・培養プロセスの少なくとも一部の間、適した量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下で維持される、および/または
・培地のpHが培養プロセスの間に変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現され、上述したような全培養時間の等式が以下の基準、Tc=a+t+b≦168(式中a≦72、t≦24、b≦96)を満たし、第一段階のpHが6.0で第二段階のpHが6.7である、および/または
・培養プロセスの間に培地の温度が変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現され、第一段階の温度が30℃であり、第二段階の温度が36℃である、および/または
・第一の態様の宿主細胞がアスペルギルス(Aspergillus)種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)の菌株である。
【0130】
培地は、生成される目的の化合物および選択された真核細胞に適合され得る。
【0131】
好ましい実施形態によると、培地は、セラミド活性化ホスファターゼタンパク質(CAPP)の活性化因子を含む。このホスファターゼは、t−SNAREを脱リン酸化することによってSNARE相互作用を活性化することが公知である(マラシュ(Marash)M、ゲルスト(Gerst)JE、t−SNARE脱リン酸化によって酵母におけるSNARE集合およびエキソサイトーシスが促進される(t−SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast.)EMBOジャーナル(EMBO J.)2001年2月1日、20(3):411−21頁)。CAPPの活性化因子の例は、セラミド、例えばジヒドロ−C2セラミドまたは別のC2−セラミドである(カルビオケム(Calbiochem)、シグマ(SIGMA))。好ましくは、培養の初めに、培地中に1〜100μMセラミドが存在する。より好ましくは、培養の初めに、培地中に5〜50μMセラミドが存在する。さらにより好ましくは、培養の初めに培地中に約10μMセラミドが存在する。最も好ましい実施形態によると、セラミドの濃度は、培養プロセス全体の間中、かかる値に維持されるようモニタリングされる。必要に応じて、培養プロセスの間に新鮮なセラミドが継続的に加えられ得る。
【0132】
別の好ましい実施形態によると、培地は、これまでに記載されているような、通常ペルオキシソーム中に位置する少なくとも1つの酵素を介して代謝される物質、好ましくは脂肪酸、より好ましくはオレイン酸等の、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質を含む(阪井康能ら、メチルトローフ酵母カンジダ・ボイジニにおける複数の炭素源によるペルオキシソームタンパク質および細胞器官増殖の調節(Regulation of Peroxisomal Proteins and Organelle Proliferation by Multiple Carbon Sources in the Methylotrophic Yeast,Candida boidinii)、イースト(Yeast)14、1175−1187頁(1998年))。脂肪酸を用いて、これまでに記載されているようにペルオキシソーム増殖を得ることもできる(イントラスクスリ(Intrasuksri)Uら、ペルフルオロオクタン酸および内在性脂肪酸によるペルオキシソーム増殖の機構(Mechanisms of peroxisome proliferation by perfluorooctanoic acid and endogenous fatty acids.)ジェネラル・ファーマコロジー(Gen Pharmacol.)1998年8月、31(2):187−97頁)。ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地中で利用可能な炭素のパーセンテージとして定義される(例えば、培地の炭素源は10%ペルオキシソーム増殖誘導物質+90%グルコースで構成される)。好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の0.1%〜100%の間の範囲である。より好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の1%〜50%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の2%〜40%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の3%〜30%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の4%〜25%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の5%〜20%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の6%〜18%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の7%〜15%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の8%〜13%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の9%〜12%の間の範囲である。最も好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の10%に等しい。最も好ましい実施形態によると、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質は、オレイン酸Naおよび/またはオレイン酸であり、培地中に存在するオレイン酸Naおよび/またはオレイン酸の量は、培地の炭素源の10%に等しい。
【0133】
より好ましい実施形態によると、培地は、CAPPの活性化因子およびペルオキシソーム誘導物質の両方を、両方ともこれまでの段落に記載されているような好ましい量で、含む。
【0134】
得られる目的の化合物は、当該分野で公知の方法によって培地から単離され得る。例えば、目的の化合物は、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって、培地から単離され得る。単離されたポリペプチドは、次いで、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除)、電気泳動手順(例えば、調製的等電点電気泳動)、異なる溶解度(例えば、硫安塩析)、または抽出(例えば、プロウティーン・ピューリフィケーション(Protein Purification)、J.−C.ジャンソン(Janson)およびラーズ・ライデン(Lars Ryden)編者、ニューヨークのVCHパブリッシャーズ(VCH Publishers、New York)、1989年参照)を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の種々の手順によって、さらに精製され得る。
【0135】
ペルオキシソーム中の目的の化合物の蓄積
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞が核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトを含み、前記コンストラクトがペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列を含み、生成されるポリペプチドをコードするDNA配列に操作可能に結合されている、宿主細胞、好ましくは糸状菌細胞における、目的のポリペプチドの、生成および任意に精製の方法を提供する。別の態様において、本発明は、宿主細胞が核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトを含み、前記コンストラクトがペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列を含み、代謝産物合成に関係する酵素をコードするDNA配列に操作可能に結合されている、宿主細胞、好ましくは糸状菌細胞における、代謝産物の、生成および任意に精製の方法を提供する。これらの要素の全ては、これまでに定義されている。これらの最後の2つの態様において、前記宿主細胞のペルオキシソームの恒常性は、好ましくは、上記で定義したように影響を受ける。これらの最後の2つの態様において、培地は、好ましくは、上記で定義されたようなペルオキシソーム誘導物質を含む。これらの最後の2つの態様において、目的の化合物は、続いて、細胞溶解物のペルオキシソームから回収され得る。目的の化合物の回収は、好ましくは、すでに記載されているように行われる(酵母ペルオキシソームの可視化および精製(Visualization and purification of yeast peroxisomes.)アードマン(Erdmann)R、グールド(Gould)SJ、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)2002年、351:365−81頁)。これらの最後の2つの態様において、前記宿主細胞の培養条件(酸素制限および/または培地のpH値および/または培地の温度)は、好ましくは、明細書において上記で定義された通りである。
【0136】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【0137】
実施例1
実施例1:C末端SKLタグを用いた、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)およびクルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)におけるペルオキシソーム中のアセトアミダーゼ(amdS)タンパク質の標的化
用いたアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)株(CBS513.88)およびK.ラクティス(K.lactis)株(CBS685.97)は、すでに寄託されている。これらの菌株において、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて、以下に記載するように、いくつかの遺伝子を過剰発現し、コードされるタンパク質の活性を測定した。
【0138】
1.1.A.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼ遺伝子の、SKLタグありおよびなしでのクローニング、ならびにA.ニゲル(A.niger)およびK.ラクティス(K.lactis)における発現
配列番号1および配列番号2を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号4として示されるコード配列を生じた。また、配列番号1および配列番号3を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号5として示されるコード配列を生じた。全てのPCR反応、cDNA合成、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング(Molecular Cloning)で上述したように行った。製造業者の使用説明書に従って、得られたPCR断片(配列番号4および配列番号5)をPacIおよびAscIで切断し、図1に表されるPacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにおいて個々にライゲートし、結果として、各アセトアミダーゼ遺伝子(SKLありおよびなし)がglaAプロモーターの制御下に置かれた2つのコンストラクトを生じた。発現ベクターを用いて、A.ニゲル(A.niger)を形質転換した。
【0139】
また、配列番号6および配列番号7を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号9として示されるコード配列を生じた。さらに、配列番号6および配列番号8を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号10として示されるコード配列を生じた。製造業者の使用説明書に従って、得られたPCR断片(配列番号9および配列番号10)をPacIおよびAscIで切断し、図2に表されるPacI、AscI線状化K.ラクティス(K.lactis)発現ベクターにおいて個々にライゲートし、結果として、各A.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼ遺伝子(−SKLありおよびなし、それぞれ配列番号9および配列番号10)がlac4プロモーターの制御下に置かれた2つのコンストラクトを生じた。発現ベクターを用いて、K.ラクティス(K.lactis)を形質転換した。
【0140】
得られたプラスミドを、それぞれA.ニゲル(A.niger)CBS513.88またはK.ラクティス(K.lactis)CBS685.97に形質転換した。A.ニゲル(A.niger)の形質転換を(ケリー(Kelly)JM、ハインス(Hynes)MJ、アスペルギルス・ニードランスのamdS遺伝子によるアスペルギルス・ニゲルの形質転換(Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans)EMBOジャーナル(EMBO J.)1985年2月、4(2):475−9頁)に従って行い、K ラクティス(K lactis)の形質転換を(シュリークリシュナ(Sreekrishna)K、ウェブスター(Webster)TD、ディクソン(Dickson)RC、Tn903のカナマイシン(G418)耐性遺伝子でのクルイベロマイセス・ラクティスの形質転換(Transformation of Kluyveromyces lactis with the kanamycin(G418)resistance gene of Tn903)ジーン(Gene)1984年4月、28(1):73−81頁)に従って行った。
【0141】
1.2.A.ニゲル(A.niger)およびK.ラクティス(K.lactis)形質転換体の培養ならびに細胞内アセトアミダーゼ活性の測定
A.ニゲル(A.niger)形質転換体の発現カセットの存在を、PCRによって調査した。選択した形質転換体を、5日間、30℃、250rpmで、バッフルを有する500ml三角振とうフラスコ中、100mlの以下の培地中で培養した。150g/lマルトース、60g/lバクトソイトン、1g/l NaH2PO4、15g/l (NH4)2SO4、1g/l MgSO4・4H2O、0.08g/l tween−80、0.02g/lバシルドン、20g/lモルフォリノエタンスルホン酸(MES)、1g/l L−アルギニン。細胞を採取し、液体窒素下、粉砕によって破砕した。25mgの粉砕したバイオマスを0.5mlリン酸緩衝D2O(重水素H2O、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories)、重水素pD7.0)に再懸濁することによって、細胞溶解物を得た。続いて、0.5mlのD2O中10mg/ml基質(プロピオンアミド)を加え、37℃で4日間インキュベートし、遠心分離した(最終濃度5mg/mL基質および25mg/mL抽出物)。対照細胞CBS513.88中および形質転換細胞中のアセトアミダーゼ活性の測定を、製造業者の使用説明書に記載されるように、核磁気共鳴によって行った(図3)。600MHzのプロトン周波数で稼動するブルカー(Bruker)DRX−600で、300Kのプローブ温度で1H NMRスペクトルを記録した。セルフシールドグラジエントを有する5mm三重共鳴プローブを用いた。関係する全ての化合物が、それらが同定および定量され得る独特のNMRシグナルを有することを示すために、全ての参照化合物の1H NMRスペクトルを獲得した(データ示さず)。全ての関連する化合物の完全な参照スペクトルを作成するために、D2O中で、各化合物のストック溶液を調製した。基質または参照化合物を計量することおよびD2Oを添加することによって、10mg/mLの濃度でストック溶液を調製した。これらのストック溶液から、500μLを、500μLの0.5Mリン酸バッファーpH6.96(KH2PO4/K2HPO4)と混合した。各化合物、すなわちアクリルアミド、アクリル酸、アセトアミド、酢酸、プロピオンアミドおよびプロピオン酸の1H−NMRスペクトルを、続いて、600MHz、D2O中27℃で収集した(D2O中最終濃度5mg/mL基質または参照化合物)。他の化合物によって引き起こされるシグナルと重複しなかった独特の化学シフトを、各化合物に関して同定した。また、各参照の純度を調査し、可能性のある混入物の非存在を確認した。
【0142】
化合物は、以下の特徴的なシグナルを有していた。
・アクリルアミド(カタログ番号8.00830、ロット4202056、アメリカ合衆国ニュージャージー州のメルク(Merck NJ USA)):5.82(dd、Hb、J=10.3Hz、1.2Hz)、6.22(dd、Hc、J=17.2Hz、1.2Hz)、6.28(d、Ha、J=10.3Hz)、6.31(d、Ha、J=10.3Hz)ppm。
・アクリル酸(カタログ番号14,723−0、ロットS17163−034、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ(Aldrich、WI、USA)):5.65(dd、Hb、J=10.4Hz、1.6Hz)、6.01(dd、Hc、J=17.4Hz、1.6Hz)、6.11(d、CH2=CH、3J=10.3Hz)、6.14(d、CH2=CH、3J=10.3Hz)。
・アセトアミダーゼ(カタログ番号12,263−7、ロット16813BA−453、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ(Aldrich、WI USA)):1.99(s、CH3)ppm。
・酢酸(カタログ番号1.00063、ロットK31668363、アメリカ合衆国ニュージャージー州のメルク(Merck NJ USA)):1.90(s、CH3)ppm。
・プロピオンアミド(カタログ番号14,393−6、ロット25009JB−413、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ(Aldrich、WI USA)):1.10(t、CH3)、2.27(q、CH2)ppm。
・プロピオン酸(カタログ番号P−1386、ロット083 K3404、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ(Sigma、St Louis Mo USA)):1.09(t、CH3)、2.37(q、CH2)ppm。
【0143】
得られたK.ラクティス(K.lactis)形質転換体(PCRによって調査した)を、3日間、100ml YEPD(イーストエクストラクト10g/l、ペプトン20g/l、右旋糖20g/l)中、30℃、250rpmで、バッフルを有する500ml三角振とうフラスコ中で培養した。細胞を採取し、窒素下で粉砕することによって破砕した。粉砕したバイオマスを、プロテアーゼ阻害剤(ロシュ(Roche)のコンプリート、カタログ番号1873580)を含む20mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4、1mM EDTA、2mM DTT中に再懸濁することによって、細胞溶解物を得た。スクルブリ(Skouloubris)ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー(Molecular Microbiology)(2001年)40(3)、596−609頁に従って、対照K ラクティス(K lactis)細胞中および形質転換細胞中で、アセトアミダーゼ活性を測定した(図4)。
【0144】
図3および4に明らかに示されるように、アセトアミダーゼタンパク質のペルオキシソーム局在化を促進するC末端SKLタグの付加によって、A.ニゲル(A.niger)およびK.ラクティス(K.lactis)における細胞内アセトアミダーゼ酵素活性が増大する。
【0145】
実施例2:ペルオキシソーム増幅を増大させるための、発酵培地へのオレイン酸の添加
A.ニゲル(A.niger)における、細胞あたりのペルオキシソームの数の増大、したがってペルオキシソーム貯蔵体積の増大は、培地にオレイン酸Na(カタログ番号26125、ドイツ、ハノーファーのリーデル・デ・ハエン(Riedel−de Haen、Hannover、Germany))およびTween−40(カタログ番号93775、スイス、ブーフスのフルカ(Fluka、Buchs、Switzerland))を補充することによって媒介された。ペルオキシソームの数の増大を、操作されたC末端SKLタグを有する緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いた蛍光顕微鏡法によって示した(チャルフィ(Chalfie),Mら、サイエンス(Science)(1994年)263(5148):802−805頁)。C末端−SKLタグを、実施例1に記載されているようなPCR法を用いて、広く使用されていて十分特徴付けられているGFP遺伝子に操作した。実施例1に記載されているような方法論を用いて、得られたGFP−SKL遺伝子を、A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにクローニングし、A.ニゲル(A.niger)CBS513.88に形質転換した。
【0146】
得られた、C末端連結−SKLペプチドを有するGFPを過剰発現するA.ニゲル(A.niger)株を、30℃、250RPMで、最小強化アスペルギルス(Aspergillus)培地(MEAM、特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに記載されている)中でオービタルシェイカーを用いて、振とうフラスコ中で培養した。48時間の前培養後、菌糸を採取し、洗浄し、続いて、0.18%(w/v)オレイン酸Naおよび0.02%(w/v)Tween−40を補充した新鮮な培地(MEAM)に移した。オレイン酸NaおよびTween−40の補充なしで、対照培養物をMEAM中で培養した。26時間の培養後、青色光励起(490nm)を用いたツァイス(Zeiss)蛍光顕微鏡を用いて試料を解析した。代表的な試料を、フジカラー(Fujicolor)800ASAカラーフィルムを用いた蛍光写真撮影に用いた。
【0147】
図5で見ることができるように、オレイン酸NaおよびTween−40を含まない培地中でのGFP−SKL過剰発現株の培養は、結果として、細胞あたりの少ないペルオキシソームを生じた。図6で明らかに示されるように、オレイン酸NaおよびTween−40を補充した発酵培地中で同じ細胞を培養することは、ペルオキシソーム増殖を誘導し、結果として、細胞あたりの増大した数のペルオキシソームを生じた。
【0148】
実施例3:ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物(GFP−SKL)の放出
3.1 ペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドのクローニングおよび発現
膜貫通ドメインなしの、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号11、12および13として示されるA.ニゲル(A.niger)v−SNARE SncAを、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号14、15および16として示されるペルオキシソーム膜タンパク質22(Pmp22)に融合させた。配列番号17および配列番号18を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号19を生じた。また、配列番号20および配列番号21を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号22を生じた。続いて、配列番号17および配列番号21を用いたPCR反応において、配列番号19および配列番号22を鋳型として用い、結果として、配列番号23を生じた。得られたPCR断片(配列番号23)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に表されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有する融合ポリペプチドをコードする遺伝子(SncA/Pmp−22)がglaAプロモーター制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号24に示されるような、ペルオキシソーム膜アンカーを含むキメラタンパク質を生じた。SncA/Pmp−22発現ベクターとGFP−SKL発現ベクターをともに用いて、A.ニゲル(A.niger)を同時形質転換した。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【0149】
3.2 ペルオキシソーム内容物の放出の解析のための同時形質転換体の培養
前の段落で得られたGFP−SKLおよびSncA/Pmp−22を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)株のいくつかのクローンの間で、各遺伝子の単一コピーを含むクローンに関して、PCRを用いて選択を行った。選択したクローンを、10μM C2−セラミド(N−アセチル−D−スフィンゴシン:カタログ番号A7191、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ(Sigma、St.Louis Missouri USA))ありまたはなしで、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPM、MEAMバッファー(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。単一遺伝子コピーを含むGFP−SKL過剰発現株(実施例2に記載されている構成)および空の宿主株(CBS513.88)を対照として用いた。試料を24時間および48時間の時点で採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。
【0150】
3.3 細胞外のペルオキシソーム内容物の放出のSDS−PAGE解析、放出促進因子としてのC2−セラミドの解析
3.2の上清試料を、SDS−PAGEによって解析した。製造業者の使用説明書に従って、ヌーページ・ノベックス(NuPAGE Novex)高性能プレキャストゲル(4〜12%ビス−トリスグラジエントゲル、イギリス、ペーズリーのインビトロジェン(Invitrogen、Paisley、UK))を用いてSDS−PAGEを行った。製造業者の使用説明書に従って、試料(20μl)を、2.0μl還元剤および6.0μl試料バッファーと混合し、続いて、ゲルにロードする前に10分間70℃で加熱した。電気泳動後、製造業者の使用説明書に従って、シンプリー・ブルー・セーフ(Simply Blue Safe)ステイン(イギリス、ペーズリーのインビトロジェン(Invitrogen、Paisley、UK))を用いてゲルを染色した。
【0151】
図7において、細胞外のGFP−SKLの放出が、明らかに観察され得る。全ての試料は、54kDの内在性バンドによって見られるように、等量の内在性タンパク質を含む。対照的に、レーン4、5、6および7は、対照レーン1、2および3と比較して、有意により多いGFP−SKLを含む。さらに、C2−セラミドが、細胞外の、ペルオキシソーム内容物、すなわちGFP−SKLの放出をさらに誘導することが示される。レーン5および7(MEAM+C2−セラミド)は、それぞれレーン4および6と比較して、より多くのGFP−SKLを含む。
【0152】
3.4 細胞外のペルオキシソーム内容物の放出のウェスタンブロット解析、放出促進因子としてのC2−セラミドの解析
3.2の上清試料を、ウェスタンブロットによって解析した。SDS−PAGEを3.3のように行い、製造業者の使用説明書(イギリス、ペーズリーのインビトロジェン(Invitrogen、Paisley、UK))に従って、エクセルIIブロットモジュール(XCell II Blot Module)を用いてウェスタンブロットを行った。電気泳動後、ヌーページ(NuPage)ゲルを1時間、30ボルトで、プレカットニトロセルロースメンブレン(インビトロジェン(Invitrogen))上でブロットした。室温(rT)で1時間、トリス緩衝生理食塩水(TBS、20mMトリス−HCl pH7.4、0.9%w/v NaCl、カタログ番号T5912、シグマ(Sigma))+2%スキムミルク中でブロットをブロックした。市販の抗GFP抗体(抗GFP、ベルギーのユーロジェンテック(Enrogentec、Belgium)カタログ番号MMS−118P)を1/10.000に希釈し、ブロットを1時間、この抗体とともにインキュベートした。続いて、ブロットを3回、ミリQ(MilliQ)水およびTBS+0.2%スキムミルクで5分間洗浄した。洗浄後、ブロットを1時間室温で、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ(カタログ番号31460、アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォードのピアス(Pierce、Rock Ford Illinois USA))の1/5000希釈物とともにインキュベートした。ブロットを再び洗浄し、検出液(ECL直接核酸標識検出システム、イギリス、バッキンガムシアのアマシャム・バイオサイエンス(Amersham biosciences、Buckinghamshire、UK))に浸漬した。最後に、ブロットをアグフア・キュリックス・ブルー(AGFA Curix Blue)HC−Sプラスフィルム(ベルギー、モルトセルのアグフア(AGFA、Mortsel、Belgium))に曝露した。
【0153】
図8において、細胞外のGFP−SKLの放出が、明らかに観察され得る。レーン5、6、7および8において、GFP−SKLが存在する。対照的に、レーン3、4および9、10においては、細胞外GFP−SKLが存在しない。
【0154】
3.5 A.ニゲル(A.niger)培養物の非特異的溶解の解析
3.1〜3.4に記載されるような観察されたペルオキシソーム内容物の放出が非特異的溶解に媒介されていないことを示すために、培養上清中の細胞内酵素アセトアミダーゼ(amdS)の活性の測定によって、培養物の溶解の程度を決定した。スクルブリ(Skouloubris)ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー(Molecular Microbiology)(2001年)40(3)、596−609頁に従って、アセトアミダーゼ測定を行った。培養物由来の10μlの上清を、リン酸EDTAバッファー(PEB、100mM リン酸Na、pH7.4、10mM EDTA)中100mMアセトアミダーゼ(カタログ番号A0500、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ(Sigma Missouri USA))に加えた。90分間37℃でのインキュベーション後、400μlフェノールニトロプルシド(カタログ番号P6994、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ(Sigma Missouri USA))および400μlアルカリ性次亜塩素酸溶液(0.2%、カタログ番号A1727、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ(Sigma Missouri USA))を加え、混合した。混合物を、55℃で6分間インキュベートした。続いて、製造業者の使用説明書に従って、ウルトラスペック(Ultraspec)2000UV/VIS分光光度計(スウェーデンのファルマシア・バイオテク(Pharmacia Biotech、Sweden))中で、吸光度を635nmで測定した。試料中のamdSの量を、標準曲線から計算し、相対的単位/ml培養上清と呼んだ。
【0155】
結果を図10に示し、24時間の培養後培養上清中にamdS活性が存在しないことが明らかに観察され、溶解が起こっていないことが示される。48時間の培養後、全ての試料は等量のamdS活性を含み、全ての培養物における溶解の程度が同じであることを示す。これらの結果は、3.1〜3.4の、培養上清中の観察されたGFP−SKLの存在が、細胞外のペルオキシソーム内容物の活発な放出によって媒介されており、細胞の非特異的溶解によって媒介されていないことを明らかに示す。
【0156】
実施例4.Pmp22を利用して組み換え(ポリ)ペプチドでペルオキシソームを装飾し得る
Pmp22をペルオキシソーム膜アンカーとして利用し得ることを示すために、緑色蛍光タンパク質(GFP)がPmp22のN末端に融合したキメラ遺伝子を構築し、A.ニゲル(A.niger)中で発現させた。蛍光顕微鏡観察から、強い緑色の球状の形状の細胞内マイクロボディが明らかになった。
【0157】
4.1 GFP/Pmp22キメラコンストラクトのクローニングおよび発現
配列番号25および26として示されるGFPを、配列番号14、15および16として示されるペルオキシソーム膜タンパク質22(Pmp22)に融合させた。
【0158】
配列番号27および配列番号28を用いたPCR反応において、GFP DNA(配列番号25)を鋳型として用い、結果として、配列番号29を生じた。また、配列番号30および配列番号31を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号32を生じた。続いて、配列番号27および配列番号31を用いたPCR反応において、配列番号29および配列番号32を鋳型として用い、結果として、配列番号33を生じた。得られたPCR断片(配列番号33)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に表されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有するGFPをコードする遺伝子(GFP/Pmp−22)がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号34として示される、ペルオキシソーム膜アンカーを有するGFPを生じた。GFP/Pmp−22発現ベクターを用いて、A.ニゲル(A.niger)を形質転換した。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【0159】
得られた、GFP/Pmp−22を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)株のクローンを、オービタルシェイカーを用いた振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、最小強化アスペルギルス(Aspergillus)培地(MEAM、特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。C末端連結−SKLありまたはなしで(実施例2に記載されているように)GFPを過剰発現している対照培養物を、同一の培養条件を用いて培養した。18時間の培養後、青色光励起(490nm)を用いたツァイス(Zeiss)蛍光顕微鏡を用いて試料を解析した。代表的な試料を、フジカラー(Fujicolor)800ASAカラーフィルムを用いた蛍光写真撮影のために用いた。
【0160】
図9Aで観察され得るように、GFP/Pmp22キメラタンパク質を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)は、GFP−SKLがC末端SKLによってペルオキシソームに標的化されているGFP−SKL(図9B)を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)と同じ、強い緑色の球状の形状の細胞内マイクロボディの断続パターンを示す。対照的に、野生型GFPを過剰発現している(すなわち、C末端SKLがない)A.ニゲル(A.niger)は、細胞の細胞質全体で、一般的な緑色蛍光を示す(図9C)。
【0161】
組み合わせた結果から、Pmp−22をペルオキシソーム膜アンカーとして利用して、GFPまたは本発明において記載されるような融合ペプチドのような組み換え(ポリ)ペプチドでペルオキシソームを装飾し得ることが、明らかに示される。
【0162】
実施例5.融合ポリペプチドで装飾されたペルオキシソームを用いることによって細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞の構築
5.1 A.ニゲル(A.niger)宿主細胞のペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドのクローニングおよび発現
膜貫通ドメインなしの、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号11、配列番号12および配列番号13として示されるA.ニゲル(A.niger)v−SNARE SncAを、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号14、配列番号15および配列番号16として示されるペルオキシソーム膜タンパク質22(Pmp22)に融合させた。配列番号18および配列番号35を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号36を生じた。また、配列番号20および配列番号37を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号38を生じた。続いて、配列番号35および配列番号37を用いたPCR反応において、配列番号36および配列番号38を鋳型として用い、結果として、配列番号39を生じた。得られたPCR断片(配列番号39)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図11に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした(pGBFIN−5)。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有する融合ポリペプチドをコードする遺伝子(SncA/Pmp−22)がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号40に示されるような、ペルオキシソーム膜アンカーを含むキメラタンパク質を生じた(SncA/Pmp22タンパク質)。実施例2に記載されているように、SncA/Pmp−22発現ベクターを用いて、GFP−SKLを過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)CBS513.88を形質転換した。得られたA.ニゲル(A.niger)形質転換体を、発現コンストラクトSncA/Pmp22およびGFP−SKLの両方の存在に関して、PCRによって解析した。実施例3.2および3.3に記載されているように、培養およびSDS−PAGEによって、両方の発現コンストラクトを含むいくつかのクローンを、ペルオキシソーム内容物の放出に関して解析した。最も機能したクローンを、実施例6および7においてさらに解析した。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【0163】
5.2 細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞の矯正
前の段落で得られた、実施例6および7においてさらに解析される最も機能したクローンを選択し、GFP−SKL発現を矯正した。得られた、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞を、実施例8および9において、細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主として用いた。
【0164】
選択したクローンを、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、MEAM緩衝培地(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。自発的組み換え事象におけるGFP−SKL発現ベクターを失うために、このクローンの培養物を、PDA培地(フランスのディフコ(Difco、France))を含むプレートにプレーティングした。ゲルドック(Geldoc)2000システム(イタリアのバイオラッド(Bio−Rad、Italy))で315nmのUV照明を用いて、合計100.000個のコロニーを、GFP−SKLの発現に関して解析した。最小のGFP発現を示すコロニーを、もう一度培養およびプレーティングに供した。2回の選択後、最小のGFP−SKL発現を有するクローンを選択した。PCRから、菌株が、少なくとも1コピーのGFP−SKL発現カセットを保持しながら依然としてSncA/Pmp22発現ベクターを含んでいたことが示された。得られた、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞を、実施例8および9において、細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主として用いた。
【0165】
実施例6.10Lスケール発酵槽における細胞外GFP−SKL生成
菌株:
GFP−SKLおよびSncA/Pmp22を過剰発現するA.ニゲル(A.niger)CBS513.88株の構築は、実施例5.1に記載した。菌株の胞子を−80℃で保存した(5×107個の生存可能な胞子/バイアル)。
【0166】
接種手順:
1つの胞子−バイアルの内容物を、バッフル2L振とうフラスコ中の前培養培地(20g/Lイーストエクストラクト、20g/Lグルコース、pH6.8(KOHで)、300mL培地、20分121℃で蒸気滅菌)に加えた。この前培養物を、30℃、220rpmで40時間培養した。
【0167】
流加発酵:
当該分野で公知の手順(国際公開第93/37179号パンフレットに記載されている)を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適した栄養培地中で培養を行った。適用した増殖条件は、以下の通りであった。プロセスpHを、増殖の最初の72時間は6.0で制御し、次いで24時間以内に徐々に6.7まで上げ、この値で維持した。温度を30℃で制御した。作業体積は10Lであり、総発酵時間は192時間であった。培地の供給の制御によって、酸素制限を課した。酸素摂取速度を、0.025時間−1の速度増加の指数関数的プロフィールに従った撹拌によって制御した。グルコースを含有した供給を調節して、培地中のグルコース濃度を10g/Lより多く維持した。必要な場合、停止を行った。分光学的解析を用いて、GFP−SKLに関して上清試料を解析した。200μlの試料を用い、室温で、490nmの励起、510nmの発光、495nmのカットオフ、自動増幅率、および488nmで61000M−1cm−1のeFGPのモル吸光係数で相対的蛍光を測定した。蛍光測定のための試料を、5mM Na2EDTA pH8.0を含む5mMトリスHClバッファー中で希釈した。期待されるeGFP濃度に依存して、ろ液を2〜640倍に希釈した。
【0168】
図12に表されるように、継続的な培地の供給によって生じた希釈効果のために、培養の最初の72時間の間(pH6.0)、バイオマス濃度は急速に増大し、次いで発酵の最後まで、殆ど一定に保たれた。この時間において、(最初の72時間)、非常に低いレベルのGFP−SKLが細胞外で見られた(およそ0.25g/L)。6.0から6.7へのpH変化(72〜96時間の間に実現される)の後、細胞外GFP−SKL濃度は、発行の最後まで継続的に増大し、192時間目に3.3g/Lの値に達した。これにより、記載されたプロセス条件を用いて、10Lスケール流加培養プロセスにおいて、3.0g/Lより多い収量でGFP−SKLが生成および分泌されたこと明らかに示された。
【0169】
実施例7.同じ増殖プロフィールを有するグルコースおよび酸素制限条件下での細胞内GFP−SKL生成
菌株:
GFP−SKLおよびSncA/Pmp22を過剰発現するA.ニゲル(A.niger)CBS513.88株の構築は、実施例5.1に記載した。菌株の胞子を−80℃で保存した(5×107個の生存可能な胞子/バイアル)。
【0170】
接種手順:
1つの胞子−バイアルの内容物を、バッフル2L振とうフラスコ中の前培養培地(20g/Lイーストエクストラクト、20g/Lグルコース、pH6.8(KOHで)、300mL培地、20分121℃で蒸気滅菌)に加えた。この前培養物を、30℃、220rpmで40時間培養した。
【0171】
流加発酵:
当該分野で公知の手順(国際公開第93/37179号パンフレットに記載されている)を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適した培地中で培養を行った。
【0172】
適用した増殖条件は、以下の通りであった。プロセスpHを5.5で、温度を30℃で制御した。作業体積は10Lであり、総発酵時間は144時間であった。空気流は1vvm(1分あたりの培地体積あたりの空気体積)であった。グルコース制限培養のために、速度増加が0.025時間−1の指数関数的供給プロフィールを適用した。酸素制限発酵のために、酸素摂取速度を、速度増加が0.025時間−1の指数関数的プロフィールに従った撹拌によって制御した。グルコースを含有した供給を調節して、培地中のグルコース濃度を10g/Lより多く維持した。
【0173】
必要な場合、停止を行った。試料を採取し、細胞を含まない抽出物を調製した。実施例6に記載される方法に従って、GFP−SKLに関して試料を解析した。
【0174】
図13に表されるように、細胞内GFP−SKL生成は、グルコース制限条件下よりも酸素制限条件下の方が、かなり高かった。発酵の最後(144時間)に、細胞内GFP−SKL生成は、酸素制限条件が用いられた場合に、グルコース制限条件と比較して、およそ20倍高かった。この特定の実施例は、酸素制限条件が10Lスケール流加培養プロセスにおけるGFP−SKLのペルオキシソーム/細胞内蓄積に望ましいことを明らかに示す。
【0175】
実施例8.ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物(アセトアミダーゼ)の放出
8.1 A.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼのクローニングおよび発現
それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号41、配列番号42および配列番号43として示されるA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼAmdSを用いた。配列番号44および配列番号45を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号46を生じた。得られたPCR断片(配列番号46)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果としてA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。
【0176】
また、配列番号44および配列番号47を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号48を生じた。得られたPCR断片(配列番号48)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、操作されたC末端SKL尾部を有するA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。このコンストラクトの発現により、結果として、配列番号49に表されるようなポリペプチドを生じた。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られた、C末端−SKLありまたはなしのA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88を形質転換した。形質転換体を、SncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼコンストラクトの両方の存在、それぞれSncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼ−SKLコンストラクトの両方に関して、PCRによって解析した。選択したクローンを、実施例8.3においてさらに解析した。
【0177】
実施例8.2 A.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼのクローニングおよび発現
この実験のために、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号50、配列番号51および配列番号52として示される周知のA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼ遺伝子を用いた(ティルバーン(Tilburn)ら、1983年、ジーン(Gene)26:205−221頁)。配列番号53および配列番号54を用いたPCR反応において、A.ニードランス(A.nidulans)AmdS(EP13211523号明細書に記載されている)を含む発現ベクター由来のプラスミドDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号55を生じた。得られたPCR断片(配列番号55)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、A.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。
【0178】
また、配列番号53および配列番号56を用いたPCR反応において、A.ニードランス(A.nidulans)AmdS(EP13211523号明細書に記載されている)を含む発現ベクター由来のプラスミドDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号57を生じた。得られたPCR断片(配列番号57)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、操作されたSKL尾部を有するA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。このコンストラクトの発現により、結果として、配列番号58で表されるポリペプチドを生じた。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られた、C末端−SKLありまたはなしのA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88を形質転換した。形質転換体を、SncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼコンストラクトの両方の存在、それぞれSncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼSKLコンストラクトの両方に関して、PCRによって解析した。選択したクローンを、実施例8.3においてさらに解析した。
【0179】
8.3 細胞内アセトアミダーゼの放出の解析のための実施例8.1および8.2の形質転換体の培養
−SKLありもしくはなしのA.ニゲル(A.niger)AmdSまたは−SKLありもしくはなしのA.ニードランス(A.nidulans)Amdsを、細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主(実施例5.2で構築した)および陰性対照としてのCBS513.88の両方に形質転換した。PCRを用いて、単一コピーのアセトアミダーゼ発現カセットを含む形質転換体を選択した。8つの型のクローンを、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、MEAM緩衝培地(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。培養の開始後120および144時間の時点で上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。実施例8.4において、アセトアミダーゼ活性に関して上清試料を解析した。
【0180】
8.4 アセトアミダーゼ酵素アッセイ
試料中の遊離アンモニアを測定することによって、アセトアミダーゼ活性に関して8.3の上清試料を解析した。遊離アンモニアは、アセトアミダーゼ活性の指標である(スクルブリ(Skouloubris)ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー(Molecular Microbiology)(2001年)40(3)、596−609頁によって記載されているように)。CBS513.88の、全ての選択および解析された形質転換クローンは、検出可能な遊離アンモニアを生じなかった(データ示さず)。図14において、実施例5.2の菌株の4つの型の形質転換体によって生じた遊離アンモニアを表す。図14で明らかに示されるように、C末端SKL延長部分を含むコンストラクト(すなわち、ペルオキシソームに標的化されている)は、結果として、C末端SKL延長部分を含まないコンストラクトと比較して、より高い細胞内アセトアミダーゼ活性を生じた。この、より高いアセトアミダーゼ活性は、ペルオキシソーム内容物の放出によって引き起こされた。図14において、ブロック2(SKLありのAニゲル(A niger)アセトアミダーゼ)および4(SKLありのAニードランス(A nidulans)アセトアミダーゼ)をブロック1(SKLなしのA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼ)および3(SKLなしのA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼ)と比較すると、細胞外にSKLありまたはなしの分泌されたアセトアミダーゼの間の差が明らかに観察され、SKLを有する上清アセトアミダーゼにおいて、かなりより多くのアセトアミダーゼ活性が存在した。
【0181】
実施例9.ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物(アマドリアーゼ)の放出
9.1 A.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLのクローニングおよび発現
それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号59、配列番号60および配列番号61として示されるA.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLを用いた。配列番号62および配列番号63を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号64を生じた。得られたPCR断片(配列番号64)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図11に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、アマドリアーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。得られたプラスミドDNAを、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られたA.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88(陰性対照として)を形質転換した。形質転換体を、SncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアマドリアーゼ−SRLコンストラクトの存在に関して、PCRによって解析した。選択したクローンを、実施例9.2においてさらに解析した。
【0182】
9.2 細胞内アマドリアーゼの放出の解析のための実施例9.1の形質転換体の培養
A.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLを、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88(陰性対照として)に形質転換した。PCRを用いて、単一コピーのアマドリアーゼ発現カセットを含むクローンに関して選択を行った。2つの型の形質転換体(それぞれアマドリアーゼ−SRLを含む、実施例5.2のA.ニゲル(A.niger)およびCBS513.88)の代表的なクローンを選択し、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、MEAM緩衝培地(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。培養の開始後96時間の時点で上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。実施例9.3において、アマドリアーゼ活性に関して上清試料を解析した。
【0183】
9.3 アマドリアーゼ酵素アッセイ
9.2の上清試料を、酵素アッセイによって解析した。アマドリアーゼ活性アッセイは、モニエ(Monnier)VMら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)1997年2月7日、272(6):3437−43頁によって記載されている。フルクトシルプロピルアミン(モニエ(Monnier)教授の厚意より提供された)を基質として用いてオルトフェニレンジアミン(OPD)との比色反応によって測定されるグルコソンの放出によって、酵素活性をモニタリングした。このアッセイは、120分の反応時間の後に形成されたグルコソンの終点測定に基づく。反応混合物は、1mlの最終体積中、20mMリン酸ナトリウム、pH7.4、10mMOPD、10mMフルクトシルプロピルアミン、および実施例9.3の上清試料を含んだ。37℃で2時間のインキュベーション後、320nmでの吸光度を測定した。結果を図15に表す。結果から、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主が、アマドリアーゼ−SRL遺伝子で形質転換した対照株CBS513.88よりも、少なくとも3倍多くアマドリアーゼ−SRLを培地中で生成することができることが、明らかに示される。
【0184】
実施例10.ペルオキシソーム代謝産物の排出の増大
実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主が陰性対照株CBS513.88と比較して増大したペルオキシソーム代謝産物の分泌を示すことを示すために、実験を行った。
【0185】
実施例6に従って、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88を培養した。培養の開始後138時間目に上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。続いて、1H NMRによって、ペルオキシソームβ−酸化代謝産物(デービッド・E・ミッツラー(David E Metzler)、バイオケミストリー(Biochemistry)第2版、アカデミック・プレス(Academic Press)2001年)に関して試料を解析した。
【0186】
2mlの上清を、4N HClでpH2に酸性化し、4mlクロロホルムで抽出した。澄んだクロロホルム層(遠心分離後)から、3mlを2ml水にpH7.5(0.01N NaOHで調節)で逆抽出した。遠心分離後の1.5mlの水層を凍結乾燥し、0.5ml D2O(重水素H2O、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories))に再懸濁した。1H NMRスペクトルを、ブルカー・アバンス(Bruker Avance)600分光光度計で、600MHZで測定した。2倍の濃度の増大を示す化合物を、二次元NMR分光学によって、分枝脂肪酸、イソ酪酸(a)、イソ吉草酸(b)およびa−メチル酪酸(c)であると同定した。これらは、それぞれa+bおよびcに関する分枝イソ−およびアンテイソ脂肪酸のβ−酸化から生じることが公知である(デービッド・E・ミッツラー(David E Metzler)、バイオケミストリー(Biochemistry)、第2版、アカデミック・プレス(Academic Press)2001年)。
【0187】
これらの酸の間の量的比較を、NMRスペクトルにおけるこれらの特徴的なメチル共鳴の統合によって行った(aは1.114ppm、bは0.928、ならびにcは0.885および1.089ppm)。3つ全ての代謝産物に関して、2倍の増大が、陰性対照株CBS513.88と比較して、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主に関して測定された。結果から、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主を目的のペルオキシソーム代謝産物の細胞外生成の宿主株として用い得ることが、明らかに示された。
【0188】
本明細書中に記載および特許請求される発明は、実施形態が本発明のいくつかの態様の例示として意図されているために、本明細書中に開示される特定の実施形態によって範囲に限定されるものではない。任意の同等な実施形態が、本発明の範囲内にあると意図される。実際、本発明に示され、記載されたもの以外の本発明の種々の変更は、上記の記載から、当業者に明らかになろう。かかる変更はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると意図される。争議の場合には、定義を含む本開示が制御する。
【図面の簡単な説明】
【0189】
【図1】A.ニゲル(A.niger)発現ベクターpGBFIN−32を表す。
【図2】K.ラクティス(K.lactis)発現ベクターpGBK−20を表す。
【図3】アセトアミダーゼ遺伝子で形質転換された対照A.ニゲル(A.niger)細胞またはSKL配列に融合したアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されたA.ニゲル(A.niger)細胞で測定されたアセトアミダーゼ活性を表す。
【図4】アセトアミダーゼ遺伝子で形質転換された対照K.ラクティス(K.lactis)細胞またはSKL配列に融合したアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されたK.ラクティス(K.lactis)細胞で測定されたアセトアミダーゼ活性を表す。
【図5】GFP−SKLで形質転換されたA.ニゲル(A.niger)のペルオキシソームを示す。
【図6】GFP−SKLで形質転換され、ペルオキシソーム増殖の媒介物質であるオレイン酸Naとともに培養された、A.ニゲル(A.niger)のペルオキシソームを示す。
【図7】上清中のGFP−SKLの放出を示すいくつかの形質転換A.ニゲル(A.niger)株の培養上清を含む、SDS−PAGEゲルを示す。
【図8】上清中のGFP−SKLの放出を示すいくつかの形質転換A.ニゲル(A.niger)株の培養上清を含む、ウェスタンブロットを示す。
【図9】GFP(パネルC)、GFP−SKL(パネルB)またはGFP/Pmp22(パネルA)を発現しているA.ニゲル(A.niger)株を示す。
【図10】アセトアミダーゼ(amdS)/ml培養上清の相対的な量として表された、細胞の非特異的溶解の程度を示す。
【図11】A.ニゲル(A.niger)発現ベクターpGBFIN−5を表す。
【図12】10Lスケール発酵におけるA.ニゲル(A.niger)中のバイオマス濃度および細胞外GFP−SKL生成を示す。
【図13】A.ニゲル(A.niger)における細胞内GFP−SKL生成に関するグルコースおよび酸素制限条件発酵条件の間の差を示す。
【図14】培養上清中の、C末端SKLのある分泌されたアセトアミダーゼの存在を示す。ブロック2および4は、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞における、SKLのあるアセトアミダーゼを表す。ブロック1および3は、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞における、SKLがないアセトアミダーゼを表す。
【図15】培養物上清中の、C末端SRLのある分泌されたアセトアミダーゼの存在を示す。
【技術分野】
【0001】
本発明は、組み換えDNA技術に関する。特に、本発明は、真核細胞における化合物の生成方法に関し、ここで化合物は細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができるペルオキシソーム中に存在し、細胞外への化合物の放出を引き起こす。
【背景技術】
【0002】
真核細胞による培地へのタンパク質の分泌は、分泌経路を構成する種々の膜で包まれた区画を介したタンパク質の運搬を含む。まず、タンパク質は、小胞体(ER)の内腔に輸送される。そこから、タンパク質は膜小胞中でゴルジ複合体へ、およびゴルジ複合体から細胞膜へと輸送される。分泌経路は、分泌タンパク質を含む小胞が供与膜からくびれ切れ、受容膜に標的化および融合する、いくつかのステップを含む。これらのステップのそれぞれで、糖鎖付加およびジスルフィド架橋形成を含むタンパク質の十分な成熟が行われるために、シャペロンまたは折りたたみ酵素等のいくつかのタンパク質の機能が必要である。細胞外タンパク質は、ERの酸化環境で成熟し、コア糖鎖付加されるようになり、この糖鎖付加プロセスは、続いてゴルジ複合体中で完了する。
【0003】
真核生物におけるタンパク質分泌を増大させるために、いくつかの試みがなされている。異種タンパク質の分泌を増大させる一般的なアプローチは、シグナル配列を使用することである(例えばEP0215594号明細書参照)。真核細胞における従来の分泌経路は、上記で概説したように、定義により、細胞外タンパク質の成熟に適合している。細胞内タンパク質の成熟は、特定のシャペロンおよび折りたたみタンパク質を有する細胞質の還元環境で実現される。産業環境における、タンパク質、特に細胞内タンパク質の生成は、分泌および下流のプロセシングの両方が不十分なことによってタンパク質の収率が低いために、依然として困難な課題である(ホプキンズ(Hpkins)TR.細胞内タンパク質の回収のための物理的および化学的細胞崩壊(Physical and chemical cell disruption for the recovery of intracellular proteins.)バイオプロセス・テクノロジー(Bioprocess Technol.)1991年、12:57−83頁)。
【0004】
タンパク質を生成する産業上の重要性が高まっているため、ならびに分泌および下流のプロセシング経路の効率が不十分であるため、依然として、真核細胞におけるタンパク質の生成の、向上したプロセスを得る必要がある。本発明は、高い効率でタンパク質を生成する、新規の方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【0005】
第一の態様において、本発明は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができる、ペルオキシソームを含む真核細胞に関する。このようにして、本発明は、ペルオキシソームの内容物を細胞外に放出することができるという点で、真核細胞の新規の能力を提供する。このようにして、真核細胞によって他の状態では分泌されないであろう化合物が、今やペルオキシソーム経路を介して有利に放出され得る。
【0006】
本発明によると、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、ペルオキシソーム膜の、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合と同等である。融合は、一体化された全体を形成する、多様な要素の溶け込みを意味する。ある要素が、ここではペルオキシソーム膜であり、他の要素は細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造由来の膜である。ペルオキシソーム脂質二重層膜の、分泌経路の膜構造の脂質二重層膜との融合は、本明細書中では、2つの脂質二重層膜が、ペルオキシソームおよび分泌経路の膜構造の両方の内容物を囲む1つの単一の連続した脂質二重層膜を形成することを意味すると理解される。ペルオキシソーム脂質二重層膜が細胞膜と融合して1つの単一の連続した脂質二重層膜を形成する場合、新しく形成された単一の膜はペルオキシソーム内容物を囲まず、むしろペルオキシソーム内容物が細胞外環境へ放出されると理解される。例えば、ペルオキシソームの、細胞膜との融合が起こる場合、ペルオキシソーム内容物は、細胞外に直接輸送される。別の例において、ペルオキシソームの、ゴルジ複合体および/またはERとの融合が起こる場合、ペルオキシソーム内容物はゴルジ複合体および/またはERに輸送され、それによって、細胞の内在性分泌経路を介して間接的に細胞外へ輸送される。
【0007】
ペルオキシソーム(マイクロボディとも呼ばれる)は、真核細胞に遍在して見られる種々の代謝プロセスに関係する単一の膜で包まれた細胞器官として定義される(阪井(Sakai)ら、イースト(Yeast)14、1175−1187頁、1998年)。真核細胞において、ペルオキシソームは、通常は、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合しないが、単一の膜に包まれた細胞器官として細胞質内に維持されている。
【0008】
本発明の関係において、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造は、細胞によるポリペプチドの分泌に関係する任意の膜構造であり得る。本発明全体で、用語「細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造」および用語「膜構造」は、同義的に使用される。好ましくは、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造は、細胞膜、ゴルジ複合体および小胞体(ER)からなる群より選択される。ゴルジ複合体は、互いに結合して層板を形成する、最低3つ(シス、中間およびトランスゴルジ)の別個の扁平な、膜に包まれた区画(槽)を含むと定義される(プファイファー(Pfeffer)SR、ゴルジ複合体の構築(Constructing a Golgi complex)。ジャーナル・オブ・セルバイオロジー(J Cell Biol.)2001年12月10日、155(6):873−5頁)。
【0009】
分泌経路内の膜融合のプロセスは、全ての真核種において高度に保存されている。当該分野の現状によると、膜融合を推進する中心的構成要素は、SNARE(可溶性N−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体)と呼ばれるポリペプチドである。相補的SNAREが供与(v−SNARE)および受容膜(t−SNARE)上に存在し、保存配列モチーフ(SNAREモチーフ)によって区別される。膜融合を媒介するために、4つのSNAREモチーフが束になって、SNAREpinと呼ばれる平行なコイルドコイル構造を形成する。SNAREpinは、受容膜構造上の少なくとも1つの膜アンカー型SNAREおよび供与膜構造上の少なくとも1つの膜アンカー型SNAREで構成される。1つまたは2つのSNAREモチーフ(例えばSec9)を含む、可溶性、またはあるいは膜結合型SNAREは、SNAREpin形成を補完し得る。供与:受容膜構造におけるSNAREpin構成要素の組み合わせ方は1:3であり得るが、2:2でもあり得る(ブーリ(Burri)L、リスゴウ(Lithgow)T.酵母におけるSNAREの完全な組(A complete set of SNAREs in yeast.)トラフィック(Traffic.)2004年1月、5(1):45−52頁)。
【0010】
本発明によると、ペルオキシソーム膜の、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、単独または組み合わせで用いられ得る、いくつかの様式で実現され得る。
【0011】
本発明は、ペルオキシソームの、真核細胞の細胞膜(または分泌経路の別の膜)との融合を得るために、ある好ましい選択肢は、ペルオキシソームの表面で融合ポリペプチドまたはその一部を露出させることであることを開示する。本発明によると、融合ポリペプチドは、供与膜構造の、受容膜構造との融合に関係するポリペプチドであり、通常は供与膜構造の表面で露出している。表面で露出するとは、本明細書中では、内腔側の反対の、供与膜の細胞質側で露出していることを意味すると理解される。供与膜構造は、受容膜構造と融合することができる小胞を生じることができる膜構造として定義される。好ましくは、供与および受容膜構造は、分泌経路の膜である。より好ましくは、供与膜構造は、ゴルジ複合体およびERからなる群より選択される。
【0012】
融合ポリペプチドは、典型的には、供与膜構造、例えばゴルジ複合体またはERの表面で露出した部分、および膜貫通ドメインを含む。好ましい実施形態において、通常供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのその部分、すなわち表面露出ドメインは、ペルオキシソームの表面での露出に用いられる。
【0013】
好ましい実施形態において、供与膜構造はゴルジ複合体であり、すなわち、融合ポリペプチドは、通常ゴルジ複合体の小胞の表面で露出しているポリペプチドであり、ゴルジ小胞の、細胞膜との融合に関係することが公知である。
【0014】
好ましい融合ポリペプチドは、v−SNAREポリペプチドのファミリー、またはベシクル−SNARE(vesicle−SNAREs)、ヤーン(Jahn)ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu Rev.Biochem.)(1999年)863−911頁、ブーリ(Burri)ら、上掲に記載されているv−SNAREのポリペプチドである。好ましいSNAREは、配列番号13への配列同一性によって、本明細書中で下記にさらに定義される。
【0015】
ゴルジ複合体の小胞の表面で発現されるいくつかのv−SNAREは、すでに記載されており、例えばSnc1およびSnc2である(ブーリ(Burri)ら、上掲)。ERの表面で発現されるv−SNAREの例は、Sec22およびYkt6である(ブーリ(Burri)ら、上掲)。本発明の好ましい実施形態において、v−SNARE Snc1もしくはSnc2、またはそれらのホモログの少なくとも1つが用いられる。Snc1/Snc2ホモログの例は、本発明によって提供されるような、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)SncAポリペプチドである。
【0016】
本発明は、特定の参照種、通常酵母(S.セレヴィシエ(S.cerevisiae))由来の起源を参照しながら本発明に記載される任意のポリペプチド(またはそのコード遺伝子)のホモログの使用を包含する。したがって、ホモログは参照種で用いられる名前と異なる名前を有し得るが、ホモログ(またはホモログ配列)は、参照種のポリペプチドと実質的に同じ機能を発揮する、参照種とは別の種由来のポリペプチドとして定義される。典型的には、かかるホモログは、少なくとも50%の、参照種のポリペプチドとの同一性の程度を有し得る。かかるホモログは、好ましくは、本発明に従って修飾された真核細胞と同じ真核生物種から生じる。
【0017】
ペルオキシソーム表面でのv−SNARE等の融合ポリペプチドの露出を得るために、受容膜上の相補的SNAREとの機能相互作用が可能である、融合ポリペプチドまたは少なくともその一部がペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に、操作可能に結合、好ましくは融合する。このようにして、融合ポリペプチド部分または構成要素およびペルオキシソーム膜ポリペプチド部分または構成要素を含んで、キメラポリペプチドが得られる。
【0018】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、キメラポリペプチドの構成要素として、好ましくは、ペルオキシソーム膜へのキメラポリペプチドの標的化を媒介することができ、より好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、キメラポリペプチドをペルオキシソーム膜へアンカーすることができる。最も好ましくは、キメラポリペプチドをペルオキシソーム膜にアンカーすることは、膜貫通セグメントにわたる少なくとも1つの膜の、ペルオキシソーム膜への統合によって、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部によって遂げられる。好ましくは、ペルオキシソーム膜中のキメラポリペプチド全体の局在化は、膜アンカーとして機能し、同時にペルオキシソームの(細胞質側)表面上のキメラポリペプチドの融合ポリペプチド部分を露出させるものである。好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドは、N末端部分でトリミングされて、結果として、キメラ融合ポリペプチドのペルオキシソーム標的化を排除することなく、ペルオキシソーム膜に可能な限り近い融合ポリペプチドの露出を生じる。
【0019】
好ましくは、v−SNARE等の、融合ポリペプチドのその部分は、少なくとも、通常はゴルジ小胞等の供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのドメインを含む、キメラポリペプチドの構成要素として用いられる。融合ポリペプチドの膜貫通ドメインは、部分的または完全にのいずれかで、キメラポリペプチドに存在しなくてもよい。
【0020】
ペルオキシソーム膜アンカーとして機能するのに適した任意のペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部は、(細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と相互作用できるように)ペルオキシソームの細胞質側(または表面)に位置する融合ポリペプチド部分を含むキメラポリペプチドが結果として生じる限りは、少なくとも融合ポリペプチドの表面露出ドメインとの、操作可能な結合、好ましくは融合に用いられるのに適している。好ましくは、融合ポリペプチド部分は、キメラポリペプチドのN末端部分に位置し、そのため、好ましくは、ペルオキシソーム膜ポリペプチドは、N末端が天然にペルオキシソームの細胞質側に露出した、または天然の配向がセグメントのN末端が細胞質の方に向くように方向付けられたものである少なくとも1つの膜貫通セグメントを有するポリペプチドである。
【0021】
好ましいペルオキシソーム膜ポリペプチドの例は、ペルオキシソーム膜ポリペプチド22(Pmp22)またはそのホモログである(ブロシアス(Brosius)U、デーメル(Dehmel)T、ガートナー(Gartner)J.2つの異なる標的化シグナルがヒトペルオキシソーム膜タンパク質22をペルオキシソームに方向付ける(Two different targeting signals direct human peroxisomal membrane protein 22 to peroxisomes.)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)2002年1月4日、277(1):774−84頁)。Pmp22ホモログの例は、本発明によって提供されるようなアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)Pmp22である。ブロシアス(Brosius)ら(2002年、上掲)は、ヒトおよびラットPmp22タンパク質は4つの膜貫通ドメイン(1つはNからC末端の方向で通る)ならびに第一および第二の膜貫通ドメインのN末端に位置する2つの独立したペルオキシソーム標的化シグナルを有することを示した。好ましい実施形態によると、キメラポリペプチドの構成要素として用いられる、Pmp22ポリペプチドの一部は、そのため、少なくとも、Pmp22のペルオキシソーム膜貫通ドメイン3および4、より好ましくはPmp22の4つ全てのペルオキシソーム膜貫通ドメインを含む。好ましくは、Pmp22のペルオキシソーム膜貫通ドメイン3および4のみを含むキメラポリペプチドの構成要素として用いられるPmp22ポリペプチドの一部は、さらに、膜貫通ドメイン3のN末端側の、機能的ペルオキシソーム標的化シグナルを含むのに十分なアミノ酸を含む。好ましくは、ブロシアス(Brosius)ら(2002年、上掲)によって定義されるような膜貫通ドメイン3のN末端側の少なくとも15、12、10、8または7アミノ酸が含まれる。
【0022】
少なくとも融合ポリペプチドの表面露出ドメインへの、操作可能な結合、好ましくは融合に用いられるのに適した、他の適したペルオキシソーム膜タンパク質(またはペルオキシソーム膜アンカーとして機能するのに適したその一部)としては、例えばPMP34、PMP47、PMP70、PEX3、PEX11、PEX14およびPEX22が挙げられるが、これらに限定されない(エッカート(Eckert)JHおよびアードマン(Erdmann)R.、ペルオキシソームバイオジェネシス(Peroxisome biogenesis.)レビュース・オブ・フィジオロジー、バイオケミストリー・アンド・ファーマコロジー(Rev Physiol Biochem Pharmacol.)2003年、147:75−121頁において総説されている)。
【0023】
好ましくは、Pmp22または別のペルオキシソーム膜タンパク質は、上述のように、N末端部分でトリミングされる。前記トリミングは、少なくとも第一のメチオニンの消失を含む。N末端部分でのトリミングは、さらにN末端の1〜50、例えば48アミノ酸、好ましくはN末端の1〜35、例えば33アミノ酸、より好ましくはN末端の1〜20、例えば18アミノ酸の消失を含み得る。好ましくは、ペルオキシソーム膜タンパク質のN末端は、天然の配向がセグメントのN末端が細胞質側向きに方向付けられたものである(NからC末端の方向で)第一の膜貫通ドメインのN末端側である少なくとも15、12、10、8、7、5または3アミノ酸が残るようにトリミングされる。好ましくは、ペルオキシソーム膜タンパク質のN末端のトリミングは、ペルオキシソーム標的化に必要なアミノ酸配列を消失または崩壊させない。
【0024】
好ましい実施形態によると、通常供与膜構造の表面で露出しているv−SNAREのドメイン(例えばSnc1、Snc2またはSncA)は、ペルオキシソーム膜ポリペプチドPmp22に操作可能に結合(融合)して、v−SNAREの対応する部分、例えばSnc1、Snc2またはSncAで、ペルオキシソームを装飾している。より好ましくは、SncAの表面露出ドメインが用いられる。さらにより好ましくは、キメラポリペプチドは配列番号24のアミノ酸配列を有する。当業者は、配列番号24に関して記載されるのと同じ原理に従って、どのようにして他の生物由来のPmp22ポリペプチドオルソログおよびv−SNAREオルソログからキメラポリペプチドを構築するかを知るであろう。
【0025】
本発明のある実施形態において、ペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドの露出は、細胞の受容膜構造、例えば細胞膜またはゴルジ複合体での、補完融合ポリペプチドの過剰発現を伴う。「補完融合ポリペプチド」は、本発明によると、供与膜構造、例えばゴルジ複合体の小胞またはERと、受容膜構造、例えば細胞膜またはゴルジ複合体との、融合の促進に関係するポリペプチドである。
【0026】
補完融合ポリペプチドは、好ましくは、標的SNAREまたはt−SNAREである(ヤーン(Jahn)ら、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー(Annu.Rev.Biochem.)863−911頁(1999年))。好ましいt−SNAREポリペプチドは、例えば、細胞膜に位置するSso1もしくはSso2、またはそれらのホモログ、またはゴルジ複合体に位置するSed5またはそのホモログである(ブーリ(Burri)ら、上掲)。他の好ましい補完融合ポリペプチドは、細胞膜での融合に関係するSec9、またはゴルジ複合体での融合に関係するBos1、Gos1、Bet1もしくはそれらのホモログである(ブーリ(Burri)ら、上掲)。
【0027】
好ましい実施形態によると、融合および補完融合ポリペプチドは、化学量論的量で露出または過剰発現され、融合および補完融合ポリペプチドの間のポリペプチド相互作用が可能な限り生理学的速度または天然の化学量論に近いことを意味する(ブーリ(Burri)Lら、上掲)。化学量論的同時露出は、ペルオキシソームの、受容膜構造、例えば細胞膜との融合を、さらに促進すると期待される。この化学量論的同時露出は、好ましくは、実質的に同じコピー数で同一な発現カセットを用いることによって達成される。好ましくは、t−SNARE遺伝子の内在性コピーは、内在性コピーに由来するt−SNAREの量が分泌経路の天然の小胞との融合に利用できるように、変化しないままである。
【0028】
本発明のある実施形態によると、真核細胞は、細胞膜ならびに細胞のゴルジ複合体と融合することができるペルオキシソームを含む。
【0029】
好ましい実施形態によると、全ての選択された融合および任意の補完融合ポリペプチド、ならびに発現されるペルオキシソーム膜ポリペプチドは、適した真核宿主細胞にとって天然である。
【0030】
本発明はさらに、真核細胞が本発明の活性を、増大した効率で達成することができるような、本発明の真核細胞の改良を構想する。
【0031】
例えば、細胞膜へのペルオキシソームの標的化およびそれに続く膜融合が、ゴルジ由来小胞の標的化機構を用いることによって、促進され得る。改変によって、この機構がペルオキシソームに対して効果的になることが可能になり得る。
【0032】
この機構をペルオキシソームに対して効果的に改変する例は、Sec4またはそのホモログを、操作可能にペルオキシソームと結合するように、操作することである。これにより、結果として細胞膜中の分泌複合体へのペルオキシソームの標的化が生じ(エキソシスト(exocyst))、さらに、SNAREpin形成を増大させて、細胞膜とのペルオキシソーム融合の効率を促進させる。通常Sec4は、GDP可溶性状態、およびGTP結合型分泌小胞膜付着状態の間で循環する。永続的に付着したSec4は生物学的に活性があることが示されている(オシッヒ(Ossig)ら1995年、EMBOジャーナル(EMBO Journal)3645−3653頁)。Sec4の膜付着は、通常は、2つのC末端システイン残基のゲラニルゲラニル化によって達成される。ペルオキシソーム膜へのSec4の永続的な付着を可能にするために、Sec4の2つのC末端システイン残基は消失、または異なるアミノ酸と置換され得、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部を含むキメラポリペプチドが、すでに記載した融合ポリペプチドおよびペルオキシソーム膜ポリペプチドを含むキメラポリペプチドに類似するように操作され得る。
【0033】
また、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造とのペルオキシソームの融合は、融合ポリペプチドとの相互作用に対する補完融合ポリペプチドの感受性をより高くすることによって、改良され得る。これは、後述されるように、種々の方法で行われ得る。
【0034】
融合ポリペプチドの構成的に活性のある変異体、および任意に補完融合ポリペプチドは、ペルオキシソーム、および任意に受容膜構造、例えば細胞膜の表面で、調製および(過剰)露出され得る。構成的に活性のある変異体の例は、補完融合ポリペプチド、好ましくはt−SNARE、より好ましくはSso1またはそのホモログの、脱リン酸化変異体である(マラシュ(Marash)M、ガースト(Gerst)JE、t−SNARE脱リン酸化は酵母におけるSNARE集合およびエキソサイトーシスを促進する(t-SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast.)EMBOジャーナル(EMBO J.)2001年2月1日、20(3):411−21頁)。
【0035】
当業者に公知の技術によって、SNAREの調節遺伝子を不活性化することも可能である。かかる調節因子は、例えば、リン酸化Sso1に結合して、Sso1の閉鎖した不活性なコンフォメーションを安定化させる、v−SNAREマスター(VSM−1またはそのホモログ)である(マラシュ(Marash)M、ガースト(Gerst)JE.モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル(Mol Biol Cell.)2003年8月、14(8):3114−25頁)。
【0036】
SNARE相互作用を活性化することが公知である酵素を過剰発現することも可能である。好ましくは、セラミド活性化ホスファターゼタンパク質(CAPP)またはそのホモログが過剰発現される(フィッシュバイン(Fishbein)JD、ドブロフスキー(Dobrowsky)RT、ビエラウスカ(Bielawska)A、ガレット(Garrett)S、ハヌン(Hunnun)YA.セラミド媒介増殖阻害およびCAPPはサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)で保存されている(Ceramide−mediated growth inhibition and CAPP are conserved in Saccharomyces cerevisiae)。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)1993年5月5日、268(13):9255−61頁)。
【0037】
ペルオキシソームの恒常性が影響を受けるように真核細胞を改変することも可能である。かかる改変は、本発明の真核細胞を生じる親細胞のペルオキシソームバイオジェネシスおよび/または分解と比較して、ペルオキシソームバイオジェネシスの速度を向上させることおよび/またはペルオキシソーム分解の速度を減少させることを含み得る。
【0038】
より好ましい実施形態によると、真核細胞は、
(a)ペルオキシソームバイオジェネシスに関係する遺伝子、例えばpex11および/もしくはpex3またはそれらのホモログを過剰発現させること、ならびに/または
(b)ペルオキシソーム分解に関係する遺伝子、例えばvps15および/もしくはpdd1および/もしくはAPGまたはそれらのホモログの発現を下方制御すること
によって、遺伝学的に改変されている(国際公開第00/71579号パンフレットに記載されている)。
【0039】
ペルオキシソームバイオジェネシスにおけるpex3およびpex11ポリペプチドの役割は、すでに記載されている(ベーレンツ(Baerends)RJら、イースト(Yeast.)1997年12月、13(15):1449−63頁および国際公開第00/71579号パンフレット)。ペルオキシソームの分解におけるApgおよびVps15ポリペプチドの役割もまた、記載されている(ワン(Wang)CWら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)2001年8月10日、276(32):30442−51頁およびハッチンス(Hutchins)MUら、ジャーナル・オブ・セル・サイエンス(J Cell Sci.)1999年11月、112(22号):4079−87頁)。
【0040】
上述の方法の代わりに、または上述の方法と組み合わせて、適切なスクリーニング方法を用いた典型的な菌株改良によって、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することができるペルオキシソームを含む真核細胞を得ることができる。好ましいスクリーニング方法は、後で記載するように、好ましくは、モデルタンパク質のペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを用い、細胞外のモデルポリペプチドの存在を測定して、細胞のペルオキシソームにおいてGFPのようなモデルポリペプチドの発現を用いる。細胞外のGFPの存在は、蛍光および/またはウェスタンブロッティングによって測定され得るが、これらに限定されない。
【0041】
本発明の真核細胞は、遺伝学的に改変されて、野生型細胞と比較してより低いプロテアーゼ発現および/または分泌を示す表現型を得ることができる。かかる表現型は、プロテアーゼの発現の転写調節因子の欠失および/または修飾および/または不活性化によって得ることができる。かかる転写調節因子は、例えばprtTである。prtTを調節することによってプロテアーゼの発現を低下させる技術は、米国特許出願公開第2004/0191864A1号明細書に記載されている。
【0042】
本発明に従って改変される宿主細胞の選択は、大部分は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の供給源、または生成される代謝産物の同一性に依存する。好ましくは、真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、菌類または藻類細胞である。好ましい哺乳動物細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、293細胞、PerC6細胞およびハイブリドーマが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、例えばSf9およびSf21細胞およびそれらの派生物が挙げられる。より好ましくは、真核細胞は菌類細胞、すなわちK.ラクティス(K.lactis)もしくはS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)またはハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の酵母細胞、または糸状菌細胞である。最も好ましい実施形態によると、真核細胞は糸状菌細胞である。
【0043】
「糸状菌」としては、亜門、真菌(Eumycota)および卵菌(Oomycota)の全ての糸状形態が挙げられる(ホークスワーク(Hawksworth)ら、1995年、上掲に定義されるように)。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複合多糖類で構成される菌糸壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸長により、炭素異化は絶対的に好気性である。糸状菌株としては、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、オーレオバシジウム(Aureobasidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、ヒュミコーラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロミセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ピロミセス(Piromyces)、シゾフィラム(Schizophyllum)、タラロミセス(Talaromyces)、サーモアスクス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)およびトリコデルマ(Trichoderma)の株が挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
好ましい糸状菌細胞は、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)またはトリコデルマ(Trichoderma)属の種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ソヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)またはペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)の種に属する。
【0045】
いくつかの菌株の糸状菌が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)、ドイッチュ・ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥレンGmbH(Deutsche Sammulung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、菌株保存機関(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)およびアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション、ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター(Agricultural Research Service Patent Culture Collection、Northern Regional Research Center)(NRRL)等の多くのカルチャーコレクションにおいてすでに公に容易に入手可能であり、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)CBS513.88、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)ATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488〜14491、ATCC11601、ATCC12892、P.クリソゲナム(P.chrysogenum)CBS455.95、ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)ATCC38065、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)P2、アクレモニウム クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)ATCC36225またはATCC48272、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)ATCC26921またはATCC56765またはATCC26921、アスペルギルス・ソヤ(Aspergillus sojae)ATCC11906、クリソスポリウム・ルクノウエンセ(Chrysosporium lucknowense)ATCC44006およびそれらの派生物である。
【0046】
ポリペプチド
第二の態様において、本発明は、第一の態様の真核細胞の調製に用いられる新規のポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、本明細書中上記で定義するような、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドがペルオキシソーム膜ポリペプチドに操作可能に結合しているキメラポリペプチド、ペルオキシソーム膜ポリペプチドおよび補完融合ポリペプチドを提供する。
【0047】
ある実施形態において、本発明は、(a)配列番号13のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号13のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、v−SNARE機能を示すポリペプチドを提供する。
【0048】
別の実施形態において、本発明は、(a)配列番号16のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号16のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ペルオキシソーム膜ポリペプチドを提供する。
【0049】
さらに別の実施形態において、本発明は、キメラポリペプチドが、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部を含む、供与膜構造の表面で露出した融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列のペルオキシソームの表面での露出を得るのに適したキメラポリペプチドを提供する。
【0050】
好ましくは、キメラポリペプチドの融合ポリペプチド構成要素は、N末端から第一の(最もN末端側)膜貫通ドメインまでの、v−SNAREポリペプチドのアミノ酸を含む。より好ましくは、融合ポリペプチド構成要素は、(a)配列番号13の1〜95位に対応する配列、および(b)(a)で定義される配列に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0051】
同様に好ましくは、キメラポリペプチドのペルオキシソーム膜タンパク質構成要素は、(a)配列番号16の2〜224位に対応する配列、好ましくは3または4または5または6または7または8または9または10または11または12または13または14または15または16または17または18または19または20または21または22または23または24または25または26または27または28または29または30または31または32または33または34または35または36または37または38または39または40〜224位に対応する配列、および(b)(a)で定義される配列に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0052】
より好ましくは、キメラポリペプチドは、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
【0053】
したがって、本発明の好ましいキメラポリペプチドは、(a)分泌経路の供与膜の細胞質側表面で露出した融合ポリペプチドのドメイン、および(b)ペルオキシソーム膜に標的化され、結合するドメインを含み、ここでドメイン(a)および(b)は操作可能に結合されており、ペルオキシソームを含む宿主細胞におけるキメラポリペプチドの発現によって、ペルオキシソームに、宿主細胞の分泌経路の受容膜と融合する能力が与えられる。好ましくは、ドメイン(a)および(b)は、単一のオープンリーディングフレーム中に存在し、ドメイン(a)は、ドメイン(b)よりもポリペプチドのN末端に近い。好ましくは、ドメイン(a)はv−SNARE由来である。より好ましくは、ドメイン(a)は、v−SNAREの、N末端から、第一の膜貫通ドメインまで、または第一の膜貫通ドメインを含む範囲にわたる、v−SNARE由来の断片を含む。本発明の好ましいキメラポリペプチドにおいて、ドメイン(a)における断片は、配列番号13、または配列番号13に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列の、1〜95位に対応する配列を含む。断片は、v−SNAREのN末端から第一の膜貫通ドメインまでのアミノ酸の、少なくとも70%、80%、90%または95%にわたり得る。
【0054】
本発明の好ましいキメラポリペプチドにおいて、ドメイン(b)は、膜貫通ドメイン、およびドメインをペルオキシソーム膜に標的化する配列を含む。好ましくは、ドメイン(a)に最も近位の膜貫通ドメインのN末端は、細胞質側向きに方向付けられている。好ましくは、ドメイン(b)は、ペルオキシソーム膜タンパク質由来の配列を含む。より好ましくは、ドメイン(b)は、N末端が天然にペルオキシソームの細胞質側に露出しているペルオキシソーム膜ポリペプチド由来、または細胞質側向きに方向付けられたN末端を有する少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である。最も好ましくは、ドメイン(b)は、N末端が細胞質側向きに方向付けられた最もN末端側の膜貫通ドメインから少なくとも10アミノ酸までN末端アミノ酸が除かれている、ペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である。ドメイン(b)は、Pmp22、Pmp34、Pmp47、Pmp70、Pex3、Pex11、Pex14およびPex22から選択されるペルオキシソーム膜ポリペプチドから得ることができる。好ましい実施形態において、本発明のキメラタンパク質ドメイン(b)は、配列番号16の2〜224位に対応する配列、好ましくは3もしくは4もしくは5もしくは6もしくは7もしくは8もしくは9もしくは10もしくは11もしくは12もしくは13もしくは14もしくは15もしくは16もしくは17もしくは18もしくは19もしくは20もしくは21もしくは22もしくは23もしくは24もしくは25もしくは26もしくは27もしくは28もしくは29もしくは30もしくは31もしくは32もしくは33もしくは34もしくは35もしくは36もしくは37もしくは38もしくは39もしくは40〜224位に対応する配列、または配列番号16に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列である。最も好ましくは、キメラタンパク質は、配列番号24のアミノ酸配列を有する。
【0055】
本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列の間の相同性の程度は、2つの配列の間で同一であるアミノ酸のパーセンテージをいう。まず、相同なポリペプチド配列は、ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST)アルゴリズムを用いて検索され、これはアルチュール(Altschul)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)215:403−410頁(1990年)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公に入手可能である。BLASTアルゴリズムパラメータW、BおよびEは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして3の文字列長(W)、BLOSUM62スコア行列(ヘニコフ(Henikoff)およびヘニコフ(Henikoff)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・USA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:10915頁(1989年)参照)50のアラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=−4を使用する。
【0056】
次に、相同な配列の(上記で定義したような)同一性の程度を、以下のパラメータ、ギャップサイズ:5、ギャップオープン:11、ギャップ延長:1、ミスマッチ:−15、文字列サイズ:3を用いたCLUSTALWアラインメントアルゴリズム(ヒギンズ(Higgins)Dら(1994年)ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)22:4673−4680頁)を用いて決定する。
【0057】
ポリヌクレオチド
第三の態様において、本発明は、第二の態様のポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【0058】
本発明は、本明細書中で定義されるような、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドがペルオキシソーム膜ポリペプチドに操作可能に結合したキメラポリペプチド、ペルオキシソーム膜ポリペプチドおよび補完融合ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。
【0059】
本発明に従って改変される真核細胞を選択した後、融合ポリペプチドの本体(供給源)、ペルオキシソーム膜アンカーとして機能するポリペプチド、および任意に補完融合ポリペプチドが樹立され得る。例えば、第二の態様のポリペプチドをコードする核酸配列の供給源は、適した真核細胞の本体に依存し得る。好ましくは、第二の態様のポリペプチドをコードする核酸配列は、本発明に従って改変される真核細胞にとって内在性である。
【0060】
本発明はさらに、適した宿主におけるポリペプチドの発現を指示する1つ以上の制御配列に操作可能に結合された、上記で定義されるようなポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを提供する。
【0061】
発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関係する任意のステップを含むと理解されよう。
【0062】
「核酸コンストラクト」は、本明細書中では、天然に存在する遺伝子から単離された、または天然に他に存在しないように組み合わせおよび並置された核酸のセグメントを含むよう修飾された、単鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子として定義される。用語核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な制御配列全てを含む場合、用語発現カセットまたはベクターと同義である。
【0063】
用語「制御配列」は、本明細書中では、一般にポリペプチドの発現に必要または有利である全ての構成要素を含むよう定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然または外来であり得る。かかる制御配列としては、プロモーター、リーダー、最適な翻訳開始配列(コザック(Kozak)、1991年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)266:19867−19870頁に記載されるような)、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低限、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。
【0064】
用語「操作可能に結合された」は、本明細書中では、制御配列がDNA配列のコード配列に関する位置に、制御配列がポリペプチドの発現を指示するように適切に配置された配置として定義される。
【0065】
制御配列は、変異、トランケートおよびハイブリッドプロモーターを含む、細胞において転写活性を示す、任意の適切なプロモーター配列であり得、細胞にとって相同(天然)または異種(外来性)のいずれかの、細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【0066】
プロモーターは、発現されるコード配列と天然に結合しているプロモーターであり得る。プロモーターはまた、発現されるコード配列にとって外来性の、構成的または誘導性プロモーターであり得る。哺乳動物細胞における使用に適したプロモーターの例は、例えば、サンブルック(Sambrook)およびラッセル(Russel)(2001年)「モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版)」ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York)に記載されている。酵母における使用に適したプロモーターの例としては、例えば、解糖プロモーターが挙げられる。
【0067】
使用され得る好ましい誘導性プロモーターの例は、デンプン、銅、オレイン酸誘導性プロモーターである。
【0068】
別の好ましい実施形態によると、本発明の宿主細胞において、CAPP等の遺伝子が過剰発現されなければならない場合、A.ニゲル(A.niger)のグルコアミラーゼプロモーターまたはA.オリザエ(A.oryzae)のTAKAアミラーゼプロモーター等の強力な誘導性プロモーターが用いられる。
【0069】
制御配列はまた、転写を終了するよう細胞によって認識される配列である、適した転写ターミネーター配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に、動作可能に連結される。細胞において機能的である、任意のターミネーターが、本発明において用いられ得る。
【0070】
糸状菌細胞のための好ましいターミネーターは、A.オリザエ(A.oryzae)TAKAアミラーゼ、A.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼ、A.ニードランス(A.nidulans)アントラニル酸シンターゼ、A.ニゲル(A.niger)α−グルコシダーゼ、trpC遺伝子およびフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0071】
制御配列はまた、糸状菌細胞による翻訳に重要なmRNAの非翻訳領域である、適したリーダー配列であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に、動作可能に連結される。細胞において機能的である任意のリーダー配列が、本発明において用いられ得る。
【0072】
糸状菌細胞のための好ましいリーダーは、A.オリザエ(A.oryzae)TAKAアミラーゼおよびA.ニードランス(A.nidulans)トリオースホスフェートイソメラーゼおよびA.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0073】
制御配列はまた、核酸配列の3’末端に動作可能に連結された、転写された場合に糸状菌細胞によって、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される配列である、ポリアデニル化配列であり得る。細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本発明において用いられ得る。
【0074】
糸状菌細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、A.オリザエ(A.oryzae)TAKAアミラーゼ、A.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼ、A.ニードランス(A.nidulans)アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシポラム(Fusarium oxyporum)トリプシン様プロテアーゼおよびA.ニゲル(A.niger)α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【0075】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする、プロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド(またはいくつかの場合においてはチモーゲン)として公知である。
【0076】
核酸コンストラクトは、ベクターもしくは発現ベクターと同一、またはベクターもしくは発現ベクター中でクローニングされ得る。
【0077】
組み換え発現ベクターは、組み換えDNA手順に簡便に供され得、融合ポリペプチド(または補完融合ポリペプチド)をコードする核酸配列の発現引き起こし得る、任意のベクター(例えばプラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される真核細胞との、ベクターの適合性に依存する。ベクターは、直鎖状または閉環プラスミドであり得る。ベクターは、自律増殖ベクター、すなわち複製が染色体複製から独立した染色体外の実体として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム、または人工染色体であり得る。糸状菌細胞中で用いられ得る自律維持クローニングベクターは、AMA1−配列を含む(例えばアレクセンコ(Aleksenko)およびクラッターバック(Clutterbuck)(1997年)フンガル・ジェネティクス・アンド・バイオロジー(Fungal Genet.Biol.)21:373−397頁参照)。
【0078】
あるいは、ベクターは、細胞に導入された場合にゲノムに統合され、統合された染色体とともに複製されるものであり得る。組み込みベクターは、宿主細胞の染色体中、ランダムに、または予め決定された標的遺伝子座で統合し得る。
【0079】
本発明の好ましい実施形態において、組み込みベクターは、予め決定された遺伝子座に、ベクターを標的化するために宿主細胞のゲノム中の予め決定された標的遺伝子座におけるDNA配列に相同なDNA断片を含む。標的化された統合を促進するために、ベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方、好ましくは両端で、標的遺伝子座に相同な配列が側面に並ぶように行われる。標的遺伝子座が側面に並ぶ相同な配列の長さは、宿主細胞の本体に依存している。菌類に関して、長さは、好ましくは少なくとも30bp、好ましくは少なくとも50bp、さらに好ましくは少なくとも0.1kb、さらに好ましくは少なくとも0.2kb、より好ましくは少なくとも0.5kb、さらにより好ましくは少なくとも1kb、最も好ましくは少なくとも2kbである。好ましくは、標的遺伝子座に相同な、ベクター中のDNA配列は、高度に発現される遺伝子座に由来し、宿主細胞において高い発現レベルが可能な遺伝子に由来することを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高度に発現される遺伝子は、本明細書中では、例えば誘導条件下でmRNAが全細胞mRNAの少なくとも0.5%(w/w)を占め得る遺伝子、または、あるいは遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも1%(w/w)を占め得る遺伝子(EP357127号明細書に記載されるように)として定義される。多くの好ましい高度に発現される菌類遺伝子が、例によって示される。アスペルギルス(Aspergilli)またはトリコデルマ(Trichoderma)由来のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼまたはセロビオヒロドロラーゼ遺伝子。これらの目的のための、最も好ましい、高度に発現される遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくはA.ニゲル(A.niger)グルコアミラーゼ遺伝子、A.オリザエ(A.oryzae)TAKA−アミラーゼ遺伝子、A.ニードランス(A.nidulans)gpdA遺伝子またはトリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼ遺伝子である。この型の発現ベクターは、CAPPまたは融合ポリペプチドもしくは補完融合ポリペプチドの野生型もしくは構成的に活性のある変異体(sso1)等の所定の遺伝子を本発明真核細胞中で過剰発現するのに高度に適している。
【0080】
あるいは、遺伝子の修飾または不活性化は、遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を用いる確立されたアンチセンス技術によって行われ得る。より具体的には、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、細胞中で転写され得、細胞中で生成されるmRNAにハイブリダイズすることができる、核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することによって、減少または排除され得る。mRNAへの相補的アンチセンスヌクレオチド配列のハイブリダイズが可能な条件下で、翻訳されるタンパク質の量は、したがって、減少または排除される。アンチセンスRNAを発現することの例は、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー(Appl Environ Microbiol.)2000年2月、66(2):775−82頁に示されている。(アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)のタンパク質分泌経路における、フォルダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼAの特徴付け(Characterization of a foldase,protein disulfide isomerase A,in the protein secretory pathway of Aspergillus niger)ニャム(Ngiam)C、ジェーネス(Jeenes)DJ、プント(Punt)PJ、ヴァンデンホンデル(Van Den Hondel)CA、アーチャー(Archer)DB)または(ズレンナー(Zrenner)R、ウィルミツアー(Willmitzer)L、ゾンネンワルド(Sonnewald)U、ジャガイモウリジン二リン酸−グルコースピロホスホリラーゼの発現およびアンチセンスRNAによるその阻害の解析(Analysis of the expression of potato uridinediphosphate−glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA)プランタ(Planta.)(1993年)、190(2):247−52頁)。
【0081】
さらに、遺伝子の修飾、下方制御または不活性化は、RNA干渉(RNAi)技術を介して得ることができる(FEMSマイクロバイオロジー・レターズ(FEMS Microb.Lett.)237(2004年):317−324頁)。この方法において、発現が影響を受けるヌクレオチド配列の同一のセンスおよびアンチセンス部分が、間のヌクレオチドスペーサーとともに互いの後ろにクローニングされ、発現ベクターに挿入される。その後、分子が転写され、小さい(21〜23)ヌクレオチド断片の形成によって、影響を受けるmRNAの、標的化された分解につながる。特定のmRNAの排除は、種々の程度であり得る。国際公開第2005/05672A1号パンフレットおよび/または国際公開第2005/026356A1号パンフレットに記載されているRNA干渉技術を、遺伝子の下方制御、修飾または不活性化に用い得る。
【0082】
VSM1等の宿主の遺伝子が不活性化されなければならない場合、これは、好ましくは、EP635574号明細書に記載される技術に従って不活性化ベクターを設計することおよびベクターを不活性化される遺伝子の遺伝子座で標的化することによって行われる。
【0083】
1つより多いコピーの、融合(任意に補完融合)ポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の生成を増大させ得る。これは、好ましくは、DNA配列をそのゲノムコピーに組み込むこと、より好ましくはDNA配列の組み込みを高度に発現される遺伝子座、好ましくはグルコアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子座で標的化することによって、行われ得る。あるいは、これは、選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それによってさらなるコピーの核酸配列を含む細胞が適切な選択可能因子の存在下で細胞を培養することによって選択され得る核酸配列を有する、増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含むことによって行われ得る。過剰発現されるDNA配列のコピーの数をさらに多く増大させるために、国際公開第98/46772号パンフレットに記載されるような遺伝子変換の技術が用いられ得る。この型の発現ベクターはまた、本発明の宿主細胞中でCAPP等の所定の遺伝子を過剰発現するのに高度に適している。
【0084】
糸状菌細胞における使用のための選択可能マーカーは、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノ−スリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびに他の種由来の同等物を含むがこれらに限定されない群より選択され得る。A.ニードランス(A.nidulans)またはA.オリザエ(A.oryzae)のamdS(欧州特許第635574B1号明細書、国際公開第97/06261号パンフレット)およびpyrG遺伝子ならびにストレプトミセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)のbar遺伝子が、アスペルギルス(Aspergillus)細胞における使用に好ましい。より好ましくは、amdS遺伝子が用いられ、さらにより好ましくは、A.ニードランス(A.nidulans)またはA.ニゲル(A.niger)のamdS遺伝子が用いられる。最も好ましい選択マーカー遺伝子は、A.ニードランス(A.nidulans)gpdAプロモーターに融合したA.ニードランス(A.nidulans)amdSコード配列である(欧州特許第635574B号明細書に開示されるように)。他の糸状菌由来のamdS遺伝子もまた、用いられ得る(国際公開第97/06261号パンフレット)。ストレプトアロテイチャス・ヒンドゥスタナス(Streptoalloteichus hindustanus)由来のブレオマイシン遺伝子もまた、フレオマイシン耐性への下等および高等真核生物の形質転換のためのストレプトアロテイチャス・ヒンドゥスタナス(Streptoalloteichus hindustanus)ble遺伝子のカセット(Cassetets of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance)。ドロコート(Drocourt)D、カルメル(Calmels)T、レイネス(Reynes)JP、バロン(Baron)M、ティラビ(Tiraby)G.ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)1990年7月11日、18(13):4009頁に記載されているように、用いられ得る。
【0085】
本発明の組み換え発現ベクターを構築するための、上述の要素をライゲートするために用いられる手順は、当業者に周知である(例えば、サンブルック(Sambrook)ら、1989年、上掲参照)。
【0086】
ベクター系は、ともに細胞のゲノムに導入される全DNAを含む、単一のベクターまたは2つ以上のベクターであり得る。ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、1つ以上の選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、生成物が生命崩壊剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株への原栄養性等を提供する、遺伝子である。
【0087】
細胞への発現ベクターまたは核酸コンストラクトの導入は、一般に公知の技術を用いて行われる。これは、それ自体公知の様式で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生からなるプロセスを含み得る。アスペルギルス(Aspergillus)細胞の形質転換に適した手順は、EP238023号明細書およびエルトン(Yelton)ら、1984年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ USA(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)81:1470−1474頁に記載されている。フザリウム(Fusarium)種を形質転換する、適した方法は、マラーディーら、1989年、ジーン(Gene)78:147156頁または国際公開第96/00787号パンフレットによって記載されている。真正植物病原菌エリシフェ・グラミニスホルデイ亜種の微粒子銃形質転換(Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus,Erysiphe graminis f.sp.hordei.)クリスチャンセン(Christiansen)SK、クヌートセン(Knudsen)S、ギーゼ(Giese)H.カレント・ジェネティクス(Curr.Genet.)1995年12月、29(1):100−2頁に記載されるような微粒子銃形質転換を用いる方法等の他の方法が適用され得る。選択された形質転換細胞は、次いでペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する膜構造、例えば細胞膜に融合する能力について、解析される。
【0088】
細胞が、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合の能力を得たかどうかを解析する、いくつかの方法が利用可能である。
【0089】
ある実施形態によると、細胞の形態が、ペルオキシソーム特異的標識を用いて、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合を可視化する、電子または蛍光顕微鏡下で研究される。ペルオキシソーム特異的標識の例は、
・サイモン(Simon)M、ビンダー(Binder)M、アダム(Adam)G、ハルティヒ(Hertig)A、ルイス(Ruis)H ADR1、SNF1(CAT1、CCR1)およびSNF4(CAT3)によるサッカロミセス・セレヴィシエにおけるペルオキシソーム増殖の制御(Control of peroxisome proliferation in Saccharomyces cerevisiae by ADR1,SNF1(CAT1,CCR1)and SNF4(CAT3).)イースト(Yeast)1992年4月、8(4):303−9頁によって記載されているようなチオール酸標識、または
・モノソフ(Monosov)EZ、ワンツェル(Wenzel)TJ、ルアーズ(Luers)GH、ハイマン(Heyman)JA、サブラマニ(Subramani)S 生きたP.パストリス細胞における緑色蛍光タンパク質でのペルオキシソームの標識(Labeling of peroxisomes with green fluorescent protein in living P.pastoris cells.)ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー(J Histochem Cytochem.)1996年6月、44(6):581−9頁によって記載されているようなGFP標識、または
・クンシュ(Kunce)CM、トレリース(Trelease)RN、ターリー(Turley)RB.綿実(ゴシピウム・ヒルスツム・L.)カタラーゼの精製および生合成(Purification and biosynthesis of cottonseed(Gossypium hirsutum L.)catalase.)バイオケミカル・ジャーナル(Biochem J.)1988年4月1日、251(1):147−55頁に記載されているようなカタラーゼ標識
である。
【0090】
別の実施形態によると、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造との融合は、好ましくはモデルポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを用い、培地中のモデルポリペプチドの存在を測定して、細胞のペルオキシソームにおいてモデルポリペプチドを発現することによってモニタリングされる。好ましいモデルポリペプチドは、発酵培地中の存在が蛍光によって可視化され得、ウェスタンブロットによってモニタリングされ得るために、緑色蛍光タンパク質(GFP)である。他のモデルポリペプチドは、アセトアミダーゼ等のペルオキシソーム局在化シグナルまたはカタラーゼ、アマドリアーゼもしくはチオラーゼ等の天然にペルオキシソームに局在するタンパク質と、操作可能に結合された、酵素活性のある細胞内タンパク質であり得る。
【0091】
好ましくは、第一の態様の真核細胞は、生成されたポリペプチドの合計量の少なくとも10%が培養中の所定の時点で培地中に分泌される程度まで、より好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも40%が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも60%が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも70%が分泌される程度まで、さらにより好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも80%が分泌される程度まで、最も好ましくは生成されたポリペプチドの少なくとも90%が分泌される程度まで、ペルオキシソーム融合効率を示す。生成されたポリペプチドの合計量は、培地がバイオマス画分および培地画分からなると定義される場合、培地中に存在するポリペプチドの量として定義される。分泌されたポリペプチドの量は、モデルポリペプチドを用いて推定され得る。このモデルポリペプチドは、後に定義されるように、PTS−1等の操作された、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを有する緑色蛍光タンパク質(GFP)(例えばGFP−SKL)であり得る。培地画分内のGFP−SKLの濃度は、当業者に公知の技術(例えば蛍光測定、吸光度測定、ウェスタンブロット)を用いて決定され得る。決定された、モデルポリペプチドの濃度を用いて、分泌されたモデルポリペプチドの画分を、生成されたモデルポリペプチドの合計量のパーセンテージとして計算し得る。
【0092】
目的の化合物の生成
本発明はさらに、目的の化合物が細胞のペルオキシソーム中に存在する、第一の態様の真核細胞における目的の化合物の生成の方法に関する。この方法は、
(a)目的の化合物の発現に伝導性のある条件下、所定の培地中で第一の態様の真核細胞を培養する工程および
(b)任意に、目的の化合物を精製する工程
を含む。
【0093】
好ましい実施形態によると、目的の化合物は、培地から回収され、任意に精製される。
【0094】
別の好ましい実施形態によると、目的の化合物はポリペプチドである。
【0095】
より好ましくは、第一の態様の真核細胞は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、目的のポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードする核酸配列と操作可能に結合された核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む。
【0096】
ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、ペルオキシソームの内側の結合したポリペプチドの局在化および/または蓄積を可能にする限りは、任意のシグナルであり得る。
【0097】
好ましくは、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、
(a)NからC末端方向の第一のアミノ酸がA、C、H、K、N、P、SまたはTであり、NからC末端方向の第二のアミノ酸がH、K、N、Q、RまたはSであり、NからC末端方向の第三のアミノ酸がA、F、I、L、MまたはVであるトリペプチド、および
(b)(R/K)(L/V/I/Q)XX(L/V/I/H/Q)(L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F)として定義され、Xが任意のアミノ酸であり得るペプチド
からなる群より選択される。
【0098】
より好ましくは、PTS−1とも呼ばれる、(a)で定義されるトリペプチドは、ペルオキシソームにおいて生成されるポリペプチドのC末端延長部分として存在する。したがって、ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードするDNA配列は、目的のポリペプチドをコードするDNA配列の下流でクローニングされ、目的のポリペプチドをコードするDNA配列と、操作可能に結合される。
【0099】
好ましい実施形態によると、(a)で定義されるトリペプチドは、菌類、植物および動物におけるペルオキシソームプロテオームのコンピュータでの予測(In silico prediction of the peroxisomal proteome in fungi,plants and animals.)オロフ・エマニュエルソン(Olof Emanuelsson)、アルネ・エロフソン(Arne Elofsson)、グンナー・フォン・エジュン(Gunner von Heijne)およびスサーナ・クリストーバル(Susana Cristobal)ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)(2003年)330、443−456頁に記載されるような、[PAS]−[HKR]−[L]のバリアントである。より好ましい実施形態によると、(a)で定義されるトリペプチドは、SKLまたはPRLである。
【0100】
別の好ましい実施形態によると、(a)で定義されるトリペプチドPTS−1)は、一旦細胞外にポリペプチドが分泌されると、目的のポリペプチドのC末端から、トリペプチド配列の除去を可能にする配列、またはトリペプチド配列の前の配列とともにトリペプチド配列の除去を可能にする配列に、先行される。かかる配列は、例えば、適した配列特異的プロテアーゼまたはペプチダーゼの、認識配列であり得る。
【0101】
(b)で定義されるペプチドはまた、PTS2シグナルと呼ばれる(スウィンケルス(Swinkels)Bら、1991年EMBOジャーナル(EMBO Journal)3255−3262頁、ペトリフ(Petriv)O.I.ら、2004年ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(The Joural of molecular Biology)119−134頁)。好ましくは、これらはポリペプチドのN末端部分に存在する。
【0102】
目的のポリペプチドがすでにペルオキシソーム局在化を促進するシグナルを含む場合、好ましくは、この天然のシグナルを用いて、ペルオキシソーム局在化が促進される。あるいは、ペルオキシソーム局在化を促進する天然のシグナルを異なるものによって置換することを選択し得る。あるいは、ペルオキシソーム局在化を促進する天然のDNA配列を、上記で定義されたペルオキシソーム局在化を促進する配列をコードするDNA配列の1つによって置換することを選択し得る。
【0103】
ある実施形態において、本発明は、ペルオキシソームにおける目的のポリペプチドの段階的細胞外生成を構想する。第一段階において、目的のポリペプチドがペルオキシソーム中に蓄積し、第二段階において、本発明のキメラポリペプチド(任意に補完融合ポリペプチド)の発現を推進する誘導性プロモーターが、特異的誘導因子を培地に加えることによって誘導され、これは次にペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合につながる。これにより、結果として目的のポリペプチドの細胞外生成が生じる。
【0104】
あるいは、他の型の段階的生成が可能である。第一に、目的のポリペプチドの生成、次いでペルオキシソーム増殖の誘導、および最後のステップとして、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合。
【0105】
ポリペプチドは、宿主細胞にとって天然または外来性の任意のポリペプチドであり得る。用語「外来性ポリペプチド」は、本明細書中では、所定の細胞によって天然に生成されないポリペプチドとして定義される。用語「ポリペプチド」は、本明細書中では、特定の長さの、生成される、コードされるポリペプチドをいうよう意図されず、そのため、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。
【0106】
第一の態様の真核細胞は、成熟に還元環境を必要とするポリペプチド、例えば細胞内ポリペプチドの生成に高度に適している。したがって、好ましい実施形態によると、目的のポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。したがって、第一の態様の真核細胞を用いる本発明の方法は、産業規模で培地中で細胞内ポリペプチドを生成することができる最初のものである。
【0107】
好ましいポリペプチドは、アマドリアーゼ、カタラーゼ、アシル−CoAオキシダーゼ、リノール酸イソメラーゼ、トランス−2−エノイル−ACPレダクターゼ、トリコテセン、3−O−アセチルトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、カルニチンラセマーゼ、D−マンデル酸デヒドロゲナーゼ、エノイルCoAヒドラターゼ、フルクトシルアミン酸素オキシドレダクターゼ、2−ヒドロキシヘプタ−2,4−ジエン−1,7−ジオエートイソメラーゼ、NADP依存性マレイン酸デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、キノンレダクターゼ等のペルオキシソーム中で天然に生成される酵素である。これらの酵素は全てC末端のSKL配列を含む。
【0108】
他の細胞内酵素は、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼアミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼである。
【0109】
別の実施形態において、ポリペプチドは、抗体もしくはその一部、抗原、凝固因子、細胞外酵素、ホルモンもしくはホルモンバリアント、受容体もしくはその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーターまたは輸送タンパク質である。
【0110】
別の実施形態によると、生成されるポリペプチドは、組み換え体である。第一の態様の真核細胞が、ペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列を含む、生成されるポリペプチドをコードするDNA配列に操作可能に結合された核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトで形質転換されている。
【0111】
それによって、本発明は、細胞の通常の分泌経路において困難に遭遇するポリペプチドの細胞外生成を、有利に可能にする。一例として、生成される目的のポリペプチドは細胞外ポリペプチドであり、20個より多いシステイン、10個以下のシステイン、6個以下のシステインまたは2個以下のシステインを含んではならない。かかるポリペプチドは、宿主細胞にとって天然または異種であり得る。これらのポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞にとって組み換え体である。かかるポリペプチドの例は、以下の通りである。システインを含まない、アスペルギルス・フォエニシス(Aspergillus phoenicis)由来のシュウ酸デカルボキシラーゼ(APOXD、特許出願国際公開第9842827−A2号パンフレットに記載されている)、システインを含まない、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)由来のアスペルギロペプシンII(アスペルギルス・ニゲル酸性プロテイナーゼAのチモーゲンの遺伝子および推論されるタンパク質配列(The gene and deduced ptorein sequences of the zymogen of Aspergillus niger acid proteinase A)、イノウエ(Inoue)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)1991年10月15日、266(29):19484−19489頁)、システインを含まない、リーシュマニア・メキシカナ(Leishmania mexicana)由来の分泌された酸性ホスファターゼ2(リーシュマニア・メキシカナ分泌酸性ホスファターゼにおけるホスホグリカン修飾の標的としてのSer/Thrに富んだ反復モチーフ(Ser/Thr−rich repetitive motifs as targets for phosphoglycan modifications in Leishmania mexicana secreted acid phosphatase)ヴィーゼ(Wiese)ら、EMBOジャーナル(EMBO J.)1995年3月15日、14(6):1067−1074頁)、システインを含まない、スクレロティニア・スクレロティオラム(Sclerotinia sclerotiorum)由来の非アスパルチル酸性プロテアーゼ(スクレロティニア・スクレロティオラムの病因の間に発現される非アスパルチル酸性プロテアーゼをコードするacp1の調節(Regulation of acp1,encoding a non−aspartyl acid protease expressed during pathogenesis of Sclerotinia sclerotiorum)、プスロー(Poussereau)ら、マイクロバイオロジー(Microbiology)2001年3月、147(3号):717−726頁)、1個のシステインを含む、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)由来のキシラナーゼA(特許出願国際公開第200068396−A2号パンフレットに記載されるxynA)、2個のシステインを含む、ムス・ムスクルス(Mus musculus)由来のスルファミダーゼ(マウススルファミダーゼをコードする遺伝子:cDNAクローニング、構造および染色体マッピング(Gene encoding the mouse sulphamidase:cDNA cloning,structure,and chromosomal mapping)、コンスタンツィ(Constanzi)ら、マンマリアン・ゲノム(Mamm.Genome)2000年6月、11(6):436−439頁)。目的のポリペプチドはさらに、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼであり得る。目的のポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の原核、真核、または他の供給源から得ることができる。本発明の目的のために、用語「から得る」は、所定の供給源と関連して本明細書中で使用される場合、ポリペプチドが供給源によって、または供給源由来の遺伝子が挿入された細胞によって生成されることを意味するものとする。
【0112】
本発明の方法は、培養プロセスの最後に少なくとも0.01g/lの目的のポリペプチドの生成を、有利に可能にする。好ましくは少なくとも0.05g/lのポリペプチドが生成され、より好ましくは少なくとも0.1g/l、さらにより好ましくは少なくとも0.5g/l、最も好ましくは少なくとも1g/lのポリペプチドが生成される。
【0113】
別の好ましい実施形態によると、目的の化合物は代謝産物である。好ましい代謝産物は、タキソール、カロチノイドを含むイソプレノイド、アルカロイドを含むペニシリン、セファロスポリン、ロバスタチンを含むスタチン、および抗酸化物質である。第一の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞は、内在性ペルオキシソーム代謝産物の生成に用いられている。内在性ペルオキシソーム代謝産物の例は、イソ酪酸、イソ吉草酸およびa−メチル酪酸である。第二の好ましい実施形態によると、代謝産物は、第一の態様の真核細胞を宿主細胞として用いて生成され、ここで真核細胞はさらに、代謝産物合成に関係する酵素をコードする核酸配列を含む、代謝産物合成に関係する酵素のペルオキシソーム局在化を促進するシグナルをコードする核酸配列と操作可能に結合された、核酸コンストラクトまたは発現ベクターを含む。ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルは、すでに前述したようにペルオキシソームの内側の結合したポリペプチドの局在化および/または蓄積を可能にする限りは、任意のシグナルであり得る。代謝産物合成に関係する酵素の例は、以下の通りである。
−カロチノイド合成:フィトエン−βカロチンシンターゼcrtYBおよびcrtE、crtI、crtY、crtBおよびcrtZ。
−タキソール生合成:タキサン13α−ヒドロキシラーゼおよびタキサジエンシンターゼ。
−ペニシリン合成:アシルトランスフェラーゼ。
−セファロスポリン合成:エクスパンダーゼ。
−アルカロイド合成:S)−ノルコクラウリンシンターゼ(NCS)。
−スタチンポリケチドシンターゼ:ゲラニオール10−ヒドロキシラーゼ。
【0114】
さらに別の実施形態によると、本発明は、ペルオキシソーム中に存在する代謝産物の段階的細胞外生成を構想する。第一段階において、ペルオキシソーム中に代謝産物が蓄積し、第二段階において、融合ポリペプチド(任意に補完融合ポリペプチド)の発現を推進する誘導性プロモーターが、培地に特異的誘導因子を加えることによって誘導され、これは次に、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合につながる。これにより、結果として、代謝産物の細胞外生成が生じる。
【0115】
あるいは、他の型の段階的生成が可能である。まず、代謝産物の生成、次いでペルオキシソーム増殖の誘導、および最後のステップとして、ペルオキシソームの、細胞の分泌経路に関係する細胞の受容膜構造との融合の誘導。
【0116】
培養条件
第一の態様の宿主細胞は、当業者に公知の方法を用いて、目的の化合物の生成に適した栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、適した培地中および目的の化合物の発現および/または単離を可能にする条件下で行われる実験室または産業的発酵槽における、振とうフラスコ培養、小規模または大規模培養(連続、回分、流加または固体培養を含む)によって、培養され得る。培養は、当該分野で公知の手順を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む、適した栄養培地中で行われる(例えば、ベネット(Bennett)J.W.およびラシュール(LaSure)L.編、カリフォルニア州アカデミック・プレスのモア・ジーン・マニピュレーションズ・イン・フンギ(More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press、CA)1991年参照)。適した培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、または公開された組成物を用いて調製され得る(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)のカタログにおいて)。
【0117】
本発明はさらに、目的の化合物の生成のための、向上した生成方法を提供する。第一の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞は、培養物が酸素制限の条件下で維持されるように適した量の酸素が供給される培地中で培養される。より好ましくは、酸素制限の培養条件は、少なくとも培養期間の一部にわたって全ての栄養素が過剰に提供される培地中で行われる。さらにより好ましくは、培養期間の少なくとも一部は、培養期間の半分、より好ましくは培養期間の2/3、さらにより好ましくは培養期間の4/5、さらにより好ましくは培養期間の5/6、最も好ましくは培養期間全体を意味する。
【0118】
特徴によって、「過剰に提供される」は、全ての栄養素が、培養の間の本発明の宿主細胞の増殖の制限を確立を避けるのに十分な量供給されることを意味する。明らかに、栄養素は、阻害または毒性の効果を引き起こすような量で供給されるべきではない。
【0119】
適した量の酸素が培養物に供給され、培養物が酸素制限の条件下で維持される。したがって、本発明の関係において、適した量の酸素は、培養の間の酸素制限の条件を実現する量の酸素として定義される。酸素制限下で培地を維持するために、培地に供給される酸素の量は、宿主細胞によって消費される酸素の量を超えるべきではない。言い換えれば、OTRは、OURに実質的に同一であるべきである。OTR(酸素消費速度)は、酸素が培地の気相から液相に輸送される速度として定義される。OTRは、時間の単位あたりの酸素量として表される(例えばモル/時間)。OTRは、培養装置に入る酸素の量と気体出口で測定される酸素の量との間の差から簡便に測定される。OUR(酸素摂取速度)は、宿主細胞が、培地に供給される酸素を消費する速度として定義される。「実質的に同一」は、OTRが、+または−5%の偏差でOURに同一であることを意味する。好ましくは、OTRは、宿主細胞が酸素を直ちに消費することができるとすると、可能な限り、すなわち、例えば培養装置の配置および/または気体供給における酸素濃度によって可能な限り高い。しかしながら、到達し得る最大OTRよりも低いOTR、例えば最大OTR値の80または90%で酸素制限の条件下で培養プロセスを行うことも可能であることは、当業者に明らかになろう。
【0120】
OTRがOURに実質的に同一である状況において、培地中の溶存酸素濃度は、典型的には一定であり、酸素制限が培養を制御する場合、溶存酸素はゼロ、またはゼロに近くなる。培養プロセス中に酸素制限が存在するか否かを決定する簡便な方法は、OTRに対する、撹拌速度のわずかな増大(例えば5%)の効果を試験することである。OTRもまた減少する場合、酸素制限が実際に存在する。OTRが減少しないおよび/または溶存酸素濃度のみが減少する場合、酸素制限が存在する。代替的方法は、OTRに対する、栄養素供給の増大の効果を測定することである。栄養素供給の増大がOTRの増大を伴わない場合、酸素制限が存在する。
【0121】
第二の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞を培養することは、培養プロセスの間に培地のpHを変化させて目的の化合物の段階的細胞外生成を実現することを含む。第一の態様の宿主細胞の培養は、典型的には、宿主細胞および目的の化合物の両方に伝導性のある任意のpHで行われ得る。段階的細胞外生成は、プロセスの全体的収量を増大させ得る。第一段階において、第一の態様の宿主細胞に最も伝導性のあるpHで、目的の化合物がペルオキシソーム中に蓄積する。第二段階において、培地のpHが変えられる。より好ましくは、pHは、第一の態様の宿主細胞の培養の段階1と2の間の遷移段階の間に線形の過程で変えられる。第一の態様の宿主細胞の培養プロセスの全持続時間は、等式Tc=a+t+bによって定義され、式中
Tc=時間で表した培養プロセスの合計時間、
a=時間で表した培養の第一段階の持続時間、
t=時間で表した遷移段階の持続時間、
b=時間で表した培養の第二段階の持続時間。
【0122】
さらにより好ましい実施形態によると、等式は、以下の基準を満たす。
97≦Tc=a+t+b≦240、式中、
72≦a≦120、
1≦t≦24、
24≦b≦96
【0123】
さらにより好ましくは、等式は、以下の基準を満たす。
128≦Tc=a+t+b≦216、式中、
72≦a≦96、
8≦t≦24、
48≦b≦96
【0124】
なおさらにより好ましくは、等式は、以下の基準を満たす。
160≦Tc=a+t+b≦216、式中、
72≦a≦96、
16≦t≦24、
72≦b≦96
【0125】
最も好ましくは、等式は以下の基準を満たす。
Tc=a+t+b≦192、式中、
a≦72、
t≦24、
b≦96
【0126】
好ましくは、宿主細胞は、第一の段階において4.5〜6.0の間の範囲のpHで、および第二段階において5.5〜7.0の間の範囲のpHで培養される。最も好ましくは、宿主細胞は、第一段階において(a)pH6.0、および第二段階において(b)pH6.7で培養される。
【0127】
第三の好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞の培養は、培養プロセスに間に培地の温度を変化させて目的の化合物の段階的細胞外生成を実現することを含む。第一の態様の宿主細胞の培養は、典型的には、宿主細胞および目的の化合物の両方に伝導性のある任意の温度で行われ得る。段階的細胞外生成は、プロセスの全体的収量を増大させ得る。第一段階において、第一の態様の宿主細胞に最も伝導性のある温度で、目的の化合物がペルオキシソーム中に蓄積する。第二段階において、培地の温度が変えられる。好ましくは、宿主細胞は、第一段階において30℃〜37°の間の範囲の温度で、および第二段階において34℃〜38℃の間の範囲の温度で培養される。最も好ましくは、宿主細胞は、第一段階において30℃で、および第二段階において36℃で培養される。
【0128】
あるいは、およびさらにより好ましい実施形態によると、第一の態様の宿主細胞の培養が行われ、ここで
・培養プロセスの少なくとも一部の間、適した量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下で維持される、および/または
・培地のpHが培養プロセスの間に変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現される、および/または
・培養プロセスの間に培地の温度が変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現される、および/または
・第一の態様の宿主細胞がアスペルギルス(Aspergillus)種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)の菌株である。
【0129】
最も好ましくは、第一の態様の宿主細胞の培養が行なわれ、ここで
・培養プロセスの少なくとも一部の間、適した量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下で維持される、および/または
・培地のpHが培養プロセスの間に変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現され、上述したような全培養時間の等式が以下の基準、Tc=a+t+b≦168(式中a≦72、t≦24、b≦96)を満たし、第一段階のpHが6.0で第二段階のpHが6.7である、および/または
・培養プロセスの間に培地の温度が変えられて、目的の化合物の段階的細胞外生成が実現され、第一段階の温度が30℃であり、第二段階の温度が36℃である、および/または
・第一の態様の宿主細胞がアスペルギルス(Aspergillus)種、最も好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)の菌株である。
【0130】
培地は、生成される目的の化合物および選択された真核細胞に適合され得る。
【0131】
好ましい実施形態によると、培地は、セラミド活性化ホスファターゼタンパク質(CAPP)の活性化因子を含む。このホスファターゼは、t−SNAREを脱リン酸化することによってSNARE相互作用を活性化することが公知である(マラシュ(Marash)M、ゲルスト(Gerst)JE、t−SNARE脱リン酸化によって酵母におけるSNARE集合およびエキソサイトーシスが促進される(t−SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast.)EMBOジャーナル(EMBO J.)2001年2月1日、20(3):411−21頁)。CAPPの活性化因子の例は、セラミド、例えばジヒドロ−C2セラミドまたは別のC2−セラミドである(カルビオケム(Calbiochem)、シグマ(SIGMA))。好ましくは、培養の初めに、培地中に1〜100μMセラミドが存在する。より好ましくは、培養の初めに、培地中に5〜50μMセラミドが存在する。さらにより好ましくは、培養の初めに培地中に約10μMセラミドが存在する。最も好ましい実施形態によると、セラミドの濃度は、培養プロセス全体の間中、かかる値に維持されるようモニタリングされる。必要に応じて、培養プロセスの間に新鮮なセラミドが継続的に加えられ得る。
【0132】
別の好ましい実施形態によると、培地は、これまでに記載されているような、通常ペルオキシソーム中に位置する少なくとも1つの酵素を介して代謝される物質、好ましくは脂肪酸、より好ましくはオレイン酸等の、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質を含む(阪井康能ら、メチルトローフ酵母カンジダ・ボイジニにおける複数の炭素源によるペルオキシソームタンパク質および細胞器官増殖の調節(Regulation of Peroxisomal Proteins and Organelle Proliferation by Multiple Carbon Sources in the Methylotrophic Yeast,Candida boidinii)、イースト(Yeast)14、1175−1187頁(1998年))。脂肪酸を用いて、これまでに記載されているようにペルオキシソーム増殖を得ることもできる(イントラスクスリ(Intrasuksri)Uら、ペルフルオロオクタン酸および内在性脂肪酸によるペルオキシソーム増殖の機構(Mechanisms of peroxisome proliferation by perfluorooctanoic acid and endogenous fatty acids.)ジェネラル・ファーマコロジー(Gen Pharmacol.)1998年8月、31(2):187−97頁)。ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地中で利用可能な炭素のパーセンテージとして定義される(例えば、培地の炭素源は10%ペルオキシソーム増殖誘導物質+90%グルコースで構成される)。好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の0.1%〜100%の間の範囲である。より好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の1%〜50%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の2%〜40%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の3%〜30%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の4%〜25%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の5%〜20%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の6%〜18%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の7%〜15%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の8%〜13%の間の範囲である。さらにより好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の9%〜12%の間の範囲である。最も好ましくは、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質の量は、培地の炭素源の10%に等しい。最も好ましい実施形態によると、ペルオキシソーム増殖を誘導する物質は、オレイン酸Naおよび/またはオレイン酸であり、培地中に存在するオレイン酸Naおよび/またはオレイン酸の量は、培地の炭素源の10%に等しい。
【0133】
より好ましい実施形態によると、培地は、CAPPの活性化因子およびペルオキシソーム誘導物質の両方を、両方ともこれまでの段落に記載されているような好ましい量で、含む。
【0134】
得られる目的の化合物は、当該分野で公知の方法によって培地から単離され得る。例えば、目的の化合物は、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって、培地から単離され得る。単離されたポリペプチドは、次いで、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除)、電気泳動手順(例えば、調製的等電点電気泳動)、異なる溶解度(例えば、硫安塩析)、または抽出(例えば、プロウティーン・ピューリフィケーション(Protein Purification)、J.−C.ジャンソン(Janson)およびラーズ・ライデン(Lars Ryden)編者、ニューヨークのVCHパブリッシャーズ(VCH Publishers、New York)、1989年参照)を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の種々の手順によって、さらに精製され得る。
【0135】
ペルオキシソーム中の目的の化合物の蓄積
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞が核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトを含み、前記コンストラクトがペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列を含み、生成されるポリペプチドをコードするDNA配列に操作可能に結合されている、宿主細胞、好ましくは糸状菌細胞における、目的のポリペプチドの、生成および任意に精製の方法を提供する。別の態様において、本発明は、宿主細胞が核酸コンストラクトまたは発現コンストラクトを含み、前記コンストラクトがペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列を含み、代謝産物合成に関係する酵素をコードするDNA配列に操作可能に結合されている、宿主細胞、好ましくは糸状菌細胞における、代謝産物の、生成および任意に精製の方法を提供する。これらの要素の全ては、これまでに定義されている。これらの最後の2つの態様において、前記宿主細胞のペルオキシソームの恒常性は、好ましくは、上記で定義したように影響を受ける。これらの最後の2つの態様において、培地は、好ましくは、上記で定義されたようなペルオキシソーム誘導物質を含む。これらの最後の2つの態様において、目的の化合物は、続いて、細胞溶解物のペルオキシソームから回収され得る。目的の化合物の回収は、好ましくは、すでに記載されているように行われる(酵母ペルオキシソームの可視化および精製(Visualization and purification of yeast peroxisomes.)アードマン(Erdmann)R、グールド(Gould)SJ、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)2002年、351:365−81頁)。これらの最後の2つの態様において、前記宿主細胞の培養条件(酸素制限および/または培地のpH値および/または培地の温度)は、好ましくは、明細書において上記で定義された通りである。
【0136】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【0137】
実施例1
実施例1:C末端SKLタグを用いた、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)およびクルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)におけるペルオキシソーム中のアセトアミダーゼ(amdS)タンパク質の標的化
用いたアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)株(CBS513.88)およびK.ラクティス(K.lactis)株(CBS685.97)は、すでに寄託されている。これらの菌株において、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて、以下に記載するように、いくつかの遺伝子を過剰発現し、コードされるタンパク質の活性を測定した。
【0138】
1.1.A.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼ遺伝子の、SKLタグありおよびなしでのクローニング、ならびにA.ニゲル(A.niger)およびK.ラクティス(K.lactis)における発現
配列番号1および配列番号2を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号4として示されるコード配列を生じた。また、配列番号1および配列番号3を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号5として示されるコード配列を生じた。全てのPCR反応、cDNA合成、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング(Molecular Cloning)で上述したように行った。製造業者の使用説明書に従って、得られたPCR断片(配列番号4および配列番号5)をPacIおよびAscIで切断し、図1に表されるPacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにおいて個々にライゲートし、結果として、各アセトアミダーゼ遺伝子(SKLありおよびなし)がglaAプロモーターの制御下に置かれた2つのコンストラクトを生じた。発現ベクターを用いて、A.ニゲル(A.niger)を形質転換した。
【0139】
また、配列番号6および配列番号7を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号9として示されるコード配列を生じた。さらに、配列番号6および配列番号8を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号10として示されるコード配列を生じた。製造業者の使用説明書に従って、得られたPCR断片(配列番号9および配列番号10)をPacIおよびAscIで切断し、図2に表されるPacI、AscI線状化K.ラクティス(K.lactis)発現ベクターにおいて個々にライゲートし、結果として、各A.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼ遺伝子(−SKLありおよびなし、それぞれ配列番号9および配列番号10)がlac4プロモーターの制御下に置かれた2つのコンストラクトを生じた。発現ベクターを用いて、K.ラクティス(K.lactis)を形質転換した。
【0140】
得られたプラスミドを、それぞれA.ニゲル(A.niger)CBS513.88またはK.ラクティス(K.lactis)CBS685.97に形質転換した。A.ニゲル(A.niger)の形質転換を(ケリー(Kelly)JM、ハインス(Hynes)MJ、アスペルギルス・ニードランスのamdS遺伝子によるアスペルギルス・ニゲルの形質転換(Transformation of Aspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans)EMBOジャーナル(EMBO J.)1985年2月、4(2):475−9頁)に従って行い、K ラクティス(K lactis)の形質転換を(シュリークリシュナ(Sreekrishna)K、ウェブスター(Webster)TD、ディクソン(Dickson)RC、Tn903のカナマイシン(G418)耐性遺伝子でのクルイベロマイセス・ラクティスの形質転換(Transformation of Kluyveromyces lactis with the kanamycin(G418)resistance gene of Tn903)ジーン(Gene)1984年4月、28(1):73−81頁)に従って行った。
【0141】
1.2.A.ニゲル(A.niger)およびK.ラクティス(K.lactis)形質転換体の培養ならびに細胞内アセトアミダーゼ活性の測定
A.ニゲル(A.niger)形質転換体の発現カセットの存在を、PCRによって調査した。選択した形質転換体を、5日間、30℃、250rpmで、バッフルを有する500ml三角振とうフラスコ中、100mlの以下の培地中で培養した。150g/lマルトース、60g/lバクトソイトン、1g/l NaH2PO4、15g/l (NH4)2SO4、1g/l MgSO4・4H2O、0.08g/l tween−80、0.02g/lバシルドン、20g/lモルフォリノエタンスルホン酸(MES)、1g/l L−アルギニン。細胞を採取し、液体窒素下、粉砕によって破砕した。25mgの粉砕したバイオマスを0.5mlリン酸緩衝D2O(重水素H2O、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories)、重水素pD7.0)に再懸濁することによって、細胞溶解物を得た。続いて、0.5mlのD2O中10mg/ml基質(プロピオンアミド)を加え、37℃で4日間インキュベートし、遠心分離した(最終濃度5mg/mL基質および25mg/mL抽出物)。対照細胞CBS513.88中および形質転換細胞中のアセトアミダーゼ活性の測定を、製造業者の使用説明書に記載されるように、核磁気共鳴によって行った(図3)。600MHzのプロトン周波数で稼動するブルカー(Bruker)DRX−600で、300Kのプローブ温度で1H NMRスペクトルを記録した。セルフシールドグラジエントを有する5mm三重共鳴プローブを用いた。関係する全ての化合物が、それらが同定および定量され得る独特のNMRシグナルを有することを示すために、全ての参照化合物の1H NMRスペクトルを獲得した(データ示さず)。全ての関連する化合物の完全な参照スペクトルを作成するために、D2O中で、各化合物のストック溶液を調製した。基質または参照化合物を計量することおよびD2Oを添加することによって、10mg/mLの濃度でストック溶液を調製した。これらのストック溶液から、500μLを、500μLの0.5Mリン酸バッファーpH6.96(KH2PO4/K2HPO4)と混合した。各化合物、すなわちアクリルアミド、アクリル酸、アセトアミド、酢酸、プロピオンアミドおよびプロピオン酸の1H−NMRスペクトルを、続いて、600MHz、D2O中27℃で収集した(D2O中最終濃度5mg/mL基質または参照化合物)。他の化合物によって引き起こされるシグナルと重複しなかった独特の化学シフトを、各化合物に関して同定した。また、各参照の純度を調査し、可能性のある混入物の非存在を確認した。
【0142】
化合物は、以下の特徴的なシグナルを有していた。
・アクリルアミド(カタログ番号8.00830、ロット4202056、アメリカ合衆国ニュージャージー州のメルク(Merck NJ USA)):5.82(dd、Hb、J=10.3Hz、1.2Hz)、6.22(dd、Hc、J=17.2Hz、1.2Hz)、6.28(d、Ha、J=10.3Hz)、6.31(d、Ha、J=10.3Hz)ppm。
・アクリル酸(カタログ番号14,723−0、ロットS17163−034、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ(Aldrich、WI、USA)):5.65(dd、Hb、J=10.4Hz、1.6Hz)、6.01(dd、Hc、J=17.4Hz、1.6Hz)、6.11(d、CH2=CH、3J=10.3Hz)、6.14(d、CH2=CH、3J=10.3Hz)。
・アセトアミダーゼ(カタログ番号12,263−7、ロット16813BA−453、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ(Aldrich、WI USA)):1.99(s、CH3)ppm。
・酢酸(カタログ番号1.00063、ロットK31668363、アメリカ合衆国ニュージャージー州のメルク(Merck NJ USA)):1.90(s、CH3)ppm。
・プロピオンアミド(カタログ番号14,393−6、ロット25009JB−413、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のオールドリッチ(Aldrich、WI USA)):1.10(t、CH3)、2.27(q、CH2)ppm。
・プロピオン酸(カタログ番号P−1386、ロット083 K3404、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ(Sigma、St Louis Mo USA)):1.09(t、CH3)、2.37(q、CH2)ppm。
【0143】
得られたK.ラクティス(K.lactis)形質転換体(PCRによって調査した)を、3日間、100ml YEPD(イーストエクストラクト10g/l、ペプトン20g/l、右旋糖20g/l)中、30℃、250rpmで、バッフルを有する500ml三角振とうフラスコ中で培養した。細胞を採取し、窒素下で粉砕することによって破砕した。粉砕したバイオマスを、プロテアーゼ阻害剤(ロシュ(Roche)のコンプリート、カタログ番号1873580)を含む20mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4、1mM EDTA、2mM DTT中に再懸濁することによって、細胞溶解物を得た。スクルブリ(Skouloubris)ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー(Molecular Microbiology)(2001年)40(3)、596−609頁に従って、対照K ラクティス(K lactis)細胞中および形質転換細胞中で、アセトアミダーゼ活性を測定した(図4)。
【0144】
図3および4に明らかに示されるように、アセトアミダーゼタンパク質のペルオキシソーム局在化を促進するC末端SKLタグの付加によって、A.ニゲル(A.niger)およびK.ラクティス(K.lactis)における細胞内アセトアミダーゼ酵素活性が増大する。
【0145】
実施例2:ペルオキシソーム増幅を増大させるための、発酵培地へのオレイン酸の添加
A.ニゲル(A.niger)における、細胞あたりのペルオキシソームの数の増大、したがってペルオキシソーム貯蔵体積の増大は、培地にオレイン酸Na(カタログ番号26125、ドイツ、ハノーファーのリーデル・デ・ハエン(Riedel−de Haen、Hannover、Germany))およびTween−40(カタログ番号93775、スイス、ブーフスのフルカ(Fluka、Buchs、Switzerland))を補充することによって媒介された。ペルオキシソームの数の増大を、操作されたC末端SKLタグを有する緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いた蛍光顕微鏡法によって示した(チャルフィ(Chalfie),Mら、サイエンス(Science)(1994年)263(5148):802−805頁)。C末端−SKLタグを、実施例1に記載されているようなPCR法を用いて、広く使用されていて十分特徴付けられているGFP遺伝子に操作した。実施例1に記載されているような方法論を用いて、得られたGFP−SKL遺伝子を、A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにクローニングし、A.ニゲル(A.niger)CBS513.88に形質転換した。
【0146】
得られた、C末端連結−SKLペプチドを有するGFPを過剰発現するA.ニゲル(A.niger)株を、30℃、250RPMで、最小強化アスペルギルス(Aspergillus)培地(MEAM、特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに記載されている)中でオービタルシェイカーを用いて、振とうフラスコ中で培養した。48時間の前培養後、菌糸を採取し、洗浄し、続いて、0.18%(w/v)オレイン酸Naおよび0.02%(w/v)Tween−40を補充した新鮮な培地(MEAM)に移した。オレイン酸NaおよびTween−40の補充なしで、対照培養物をMEAM中で培養した。26時間の培養後、青色光励起(490nm)を用いたツァイス(Zeiss)蛍光顕微鏡を用いて試料を解析した。代表的な試料を、フジカラー(Fujicolor)800ASAカラーフィルムを用いた蛍光写真撮影に用いた。
【0147】
図5で見ることができるように、オレイン酸NaおよびTween−40を含まない培地中でのGFP−SKL過剰発現株の培養は、結果として、細胞あたりの少ないペルオキシソームを生じた。図6で明らかに示されるように、オレイン酸NaおよびTween−40を補充した発酵培地中で同じ細胞を培養することは、ペルオキシソーム増殖を誘導し、結果として、細胞あたりの増大した数のペルオキシソームを生じた。
【0148】
実施例3:ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物(GFP−SKL)の放出
3.1 ペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドのクローニングおよび発現
膜貫通ドメインなしの、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号11、12および13として示されるA.ニゲル(A.niger)v−SNARE SncAを、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号14、15および16として示されるペルオキシソーム膜タンパク質22(Pmp22)に融合させた。配列番号17および配列番号18を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号19を生じた。また、配列番号20および配列番号21を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号22を生じた。続いて、配列番号17および配列番号21を用いたPCR反応において、配列番号19および配列番号22を鋳型として用い、結果として、配列番号23を生じた。得られたPCR断片(配列番号23)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に表されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有する融合ポリペプチドをコードする遺伝子(SncA/Pmp−22)がglaAプロモーター制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号24に示されるような、ペルオキシソーム膜アンカーを含むキメラタンパク質を生じた。SncA/Pmp−22発現ベクターとGFP−SKL発現ベクターをともに用いて、A.ニゲル(A.niger)を同時形質転換した。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【0149】
3.2 ペルオキシソーム内容物の放出の解析のための同時形質転換体の培養
前の段落で得られたGFP−SKLおよびSncA/Pmp−22を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)株のいくつかのクローンの間で、各遺伝子の単一コピーを含むクローンに関して、PCRを用いて選択を行った。選択したクローンを、10μM C2−セラミド(N−アセチル−D−スフィンゴシン:カタログ番号A7191、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ(Sigma、St.Louis Missouri USA))ありまたはなしで、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPM、MEAMバッファー(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。単一遺伝子コピーを含むGFP−SKL過剰発現株(実施例2に記載されている構成)および空の宿主株(CBS513.88)を対照として用いた。試料を24時間および48時間の時点で採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。
【0150】
3.3 細胞外のペルオキシソーム内容物の放出のSDS−PAGE解析、放出促進因子としてのC2−セラミドの解析
3.2の上清試料を、SDS−PAGEによって解析した。製造業者の使用説明書に従って、ヌーページ・ノベックス(NuPAGE Novex)高性能プレキャストゲル(4〜12%ビス−トリスグラジエントゲル、イギリス、ペーズリーのインビトロジェン(Invitrogen、Paisley、UK))を用いてSDS−PAGEを行った。製造業者の使用説明書に従って、試料(20μl)を、2.0μl還元剤および6.0μl試料バッファーと混合し、続いて、ゲルにロードする前に10分間70℃で加熱した。電気泳動後、製造業者の使用説明書に従って、シンプリー・ブルー・セーフ(Simply Blue Safe)ステイン(イギリス、ペーズリーのインビトロジェン(Invitrogen、Paisley、UK))を用いてゲルを染色した。
【0151】
図7において、細胞外のGFP−SKLの放出が、明らかに観察され得る。全ての試料は、54kDの内在性バンドによって見られるように、等量の内在性タンパク質を含む。対照的に、レーン4、5、6および7は、対照レーン1、2および3と比較して、有意により多いGFP−SKLを含む。さらに、C2−セラミドが、細胞外の、ペルオキシソーム内容物、すなわちGFP−SKLの放出をさらに誘導することが示される。レーン5および7(MEAM+C2−セラミド)は、それぞれレーン4および6と比較して、より多くのGFP−SKLを含む。
【0152】
3.4 細胞外のペルオキシソーム内容物の放出のウェスタンブロット解析、放出促進因子としてのC2−セラミドの解析
3.2の上清試料を、ウェスタンブロットによって解析した。SDS−PAGEを3.3のように行い、製造業者の使用説明書(イギリス、ペーズリーのインビトロジェン(Invitrogen、Paisley、UK))に従って、エクセルIIブロットモジュール(XCell II Blot Module)を用いてウェスタンブロットを行った。電気泳動後、ヌーページ(NuPage)ゲルを1時間、30ボルトで、プレカットニトロセルロースメンブレン(インビトロジェン(Invitrogen))上でブロットした。室温(rT)で1時間、トリス緩衝生理食塩水(TBS、20mMトリス−HCl pH7.4、0.9%w/v NaCl、カタログ番号T5912、シグマ(Sigma))+2%スキムミルク中でブロットをブロックした。市販の抗GFP抗体(抗GFP、ベルギーのユーロジェンテック(Enrogentec、Belgium)カタログ番号MMS−118P)を1/10.000に希釈し、ブロットを1時間、この抗体とともにインキュベートした。続いて、ブロットを3回、ミリQ(MilliQ)水およびTBS+0.2%スキムミルクで5分間洗浄した。洗浄後、ブロットを1時間室温で、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ(カタログ番号31460、アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォードのピアス(Pierce、Rock Ford Illinois USA))の1/5000希釈物とともにインキュベートした。ブロットを再び洗浄し、検出液(ECL直接核酸標識検出システム、イギリス、バッキンガムシアのアマシャム・バイオサイエンス(Amersham biosciences、Buckinghamshire、UK))に浸漬した。最後に、ブロットをアグフア・キュリックス・ブルー(AGFA Curix Blue)HC−Sプラスフィルム(ベルギー、モルトセルのアグフア(AGFA、Mortsel、Belgium))に曝露した。
【0153】
図8において、細胞外のGFP−SKLの放出が、明らかに観察され得る。レーン5、6、7および8において、GFP−SKLが存在する。対照的に、レーン3、4および9、10においては、細胞外GFP−SKLが存在しない。
【0154】
3.5 A.ニゲル(A.niger)培養物の非特異的溶解の解析
3.1〜3.4に記載されるような観察されたペルオキシソーム内容物の放出が非特異的溶解に媒介されていないことを示すために、培養上清中の細胞内酵素アセトアミダーゼ(amdS)の活性の測定によって、培養物の溶解の程度を決定した。スクルブリ(Skouloubris)ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー(Molecular Microbiology)(2001年)40(3)、596−609頁に従って、アセトアミダーゼ測定を行った。培養物由来の10μlの上清を、リン酸EDTAバッファー(PEB、100mM リン酸Na、pH7.4、10mM EDTA)中100mMアセトアミダーゼ(カタログ番号A0500、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ(Sigma Missouri USA))に加えた。90分間37℃でのインキュベーション後、400μlフェノールニトロプルシド(カタログ番号P6994、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ(Sigma Missouri USA))および400μlアルカリ性次亜塩素酸溶液(0.2%、カタログ番号A1727、アメリカ合衆国ミズーリ州のシグマ(Sigma Missouri USA))を加え、混合した。混合物を、55℃で6分間インキュベートした。続いて、製造業者の使用説明書に従って、ウルトラスペック(Ultraspec)2000UV/VIS分光光度計(スウェーデンのファルマシア・バイオテク(Pharmacia Biotech、Sweden))中で、吸光度を635nmで測定した。試料中のamdSの量を、標準曲線から計算し、相対的単位/ml培養上清と呼んだ。
【0155】
結果を図10に示し、24時間の培養後培養上清中にamdS活性が存在しないことが明らかに観察され、溶解が起こっていないことが示される。48時間の培養後、全ての試料は等量のamdS活性を含み、全ての培養物における溶解の程度が同じであることを示す。これらの結果は、3.1〜3.4の、培養上清中の観察されたGFP−SKLの存在が、細胞外のペルオキシソーム内容物の活発な放出によって媒介されており、細胞の非特異的溶解によって媒介されていないことを明らかに示す。
【0156】
実施例4.Pmp22を利用して組み換え(ポリ)ペプチドでペルオキシソームを装飾し得る
Pmp22をペルオキシソーム膜アンカーとして利用し得ることを示すために、緑色蛍光タンパク質(GFP)がPmp22のN末端に融合したキメラ遺伝子を構築し、A.ニゲル(A.niger)中で発現させた。蛍光顕微鏡観察から、強い緑色の球状の形状の細胞内マイクロボディが明らかになった。
【0157】
4.1 GFP/Pmp22キメラコンストラクトのクローニングおよび発現
配列番号25および26として示されるGFPを、配列番号14、15および16として示されるペルオキシソーム膜タンパク質22(Pmp22)に融合させた。
【0158】
配列番号27および配列番号28を用いたPCR反応において、GFP DNA(配列番号25)を鋳型として用い、結果として、配列番号29を生じた。また、配列番号30および配列番号31を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、配列番号32を生じた。続いて、配列番号27および配列番号31を用いたPCR反応において、配列番号29および配列番号32を鋳型として用い、結果として、配列番号33を生じた。得られたPCR断片(配列番号33)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に表されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有するGFPをコードする遺伝子(GFP/Pmp−22)がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号34として示される、ペルオキシソーム膜アンカーを有するGFPを生じた。GFP/Pmp−22発現ベクターを用いて、A.ニゲル(A.niger)を形質転換した。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【0159】
得られた、GFP/Pmp−22を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)株のクローンを、オービタルシェイカーを用いた振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、最小強化アスペルギルス(Aspergillus)培地(MEAM、特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。C末端連結−SKLありまたはなしで(実施例2に記載されているように)GFPを過剰発現している対照培養物を、同一の培養条件を用いて培養した。18時間の培養後、青色光励起(490nm)を用いたツァイス(Zeiss)蛍光顕微鏡を用いて試料を解析した。代表的な試料を、フジカラー(Fujicolor)800ASAカラーフィルムを用いた蛍光写真撮影のために用いた。
【0160】
図9Aで観察され得るように、GFP/Pmp22キメラタンパク質を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)は、GFP−SKLがC末端SKLによってペルオキシソームに標的化されているGFP−SKL(図9B)を過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)と同じ、強い緑色の球状の形状の細胞内マイクロボディの断続パターンを示す。対照的に、野生型GFPを過剰発現している(すなわち、C末端SKLがない)A.ニゲル(A.niger)は、細胞の細胞質全体で、一般的な緑色蛍光を示す(図9C)。
【0161】
組み合わせた結果から、Pmp−22をペルオキシソーム膜アンカーとして利用して、GFPまたは本発明において記載されるような融合ペプチドのような組み換え(ポリ)ペプチドでペルオキシソームを装飾し得ることが、明らかに示される。
【0162】
実施例5.融合ポリペプチドで装飾されたペルオキシソームを用いることによって細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞の構築
5.1 A.ニゲル(A.niger)宿主細胞のペルオキシソームの表面での融合ポリペプチドのクローニングおよび発現
膜貫通ドメインなしの、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号11、配列番号12および配列番号13として示されるA.ニゲル(A.niger)v−SNARE SncAを、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号14、配列番号15および配列番号16として示されるペルオキシソーム膜タンパク質22(Pmp22)に融合させた。配列番号18および配列番号35を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号36を生じた。また、配列番号20および配列番号37を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号38を生じた。続いて、配列番号35および配列番号37を用いたPCR反応において、配列番号36および配列番号38を鋳型として用い、結果として、配列番号39を生じた。得られたPCR断片(配列番号39)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図11に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした(pGBFIN−5)。これにより、結果として、ペルオキシソーム膜アンカーを有する融合ポリペプチドをコードする遺伝子(SncA/Pmp−22)がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。遺伝子の発現により、結果として、配列番号40に示されるような、ペルオキシソーム膜アンカーを含むキメラタンパク質を生じた(SncA/Pmp22タンパク質)。実施例2に記載されているように、SncA/Pmp−22発現ベクターを用いて、GFP−SKLを過剰発現しているA.ニゲル(A.niger)CBS513.88を形質転換した。得られたA.ニゲル(A.niger)形質転換体を、発現コンストラクトSncA/Pmp22およびGFP−SKLの両方の存在に関して、PCRによって解析した。実施例3.2および3.3に記載されているように、培養およびSDS−PAGEによって、両方の発現コンストラクトを含むいくつかのクローンを、ペルオキシソーム内容物の放出に関して解析した。最も機能したクローンを、実施例6および7においてさらに解析した。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。
【0163】
5.2 細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞の矯正
前の段落で得られた、実施例6および7においてさらに解析される最も機能したクローンを選択し、GFP−SKL発現を矯正した。得られた、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞を、実施例8および9において、細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主として用いた。
【0164】
選択したクローンを、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、MEAM緩衝培地(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。自発的組み換え事象におけるGFP−SKL発現ベクターを失うために、このクローンの培養物を、PDA培地(フランスのディフコ(Difco、France))を含むプレートにプレーティングした。ゲルドック(Geldoc)2000システム(イタリアのバイオラッド(Bio−Rad、Italy))で315nmのUV照明を用いて、合計100.000個のコロニーを、GFP−SKLの発現に関して解析した。最小のGFP発現を示すコロニーを、もう一度培養およびプレーティングに供した。2回の選択後、最小のGFP−SKL発現を有するクローンを選択した。PCRから、菌株が、少なくとも1コピーのGFP−SKL発現カセットを保持しながら依然としてSncA/Pmp22発現ベクターを含んでいたことが示された。得られた、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞を、実施例8および9において、細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主として用いた。
【0165】
実施例6.10Lスケール発酵槽における細胞外GFP−SKL生成
菌株:
GFP−SKLおよびSncA/Pmp22を過剰発現するA.ニゲル(A.niger)CBS513.88株の構築は、実施例5.1に記載した。菌株の胞子を−80℃で保存した(5×107個の生存可能な胞子/バイアル)。
【0166】
接種手順:
1つの胞子−バイアルの内容物を、バッフル2L振とうフラスコ中の前培養培地(20g/Lイーストエクストラクト、20g/Lグルコース、pH6.8(KOHで)、300mL培地、20分121℃で蒸気滅菌)に加えた。この前培養物を、30℃、220rpmで40時間培養した。
【0167】
流加発酵:
当該分野で公知の手順(国際公開第93/37179号パンフレットに記載されている)を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適した栄養培地中で培養を行った。適用した増殖条件は、以下の通りであった。プロセスpHを、増殖の最初の72時間は6.0で制御し、次いで24時間以内に徐々に6.7まで上げ、この値で維持した。温度を30℃で制御した。作業体積は10Lであり、総発酵時間は192時間であった。培地の供給の制御によって、酸素制限を課した。酸素摂取速度を、0.025時間−1の速度増加の指数関数的プロフィールに従った撹拌によって制御した。グルコースを含有した供給を調節して、培地中のグルコース濃度を10g/Lより多く維持した。必要な場合、停止を行った。分光学的解析を用いて、GFP−SKLに関して上清試料を解析した。200μlの試料を用い、室温で、490nmの励起、510nmの発光、495nmのカットオフ、自動増幅率、および488nmで61000M−1cm−1のeFGPのモル吸光係数で相対的蛍光を測定した。蛍光測定のための試料を、5mM Na2EDTA pH8.0を含む5mMトリスHClバッファー中で希釈した。期待されるeGFP濃度に依存して、ろ液を2〜640倍に希釈した。
【0168】
図12に表されるように、継続的な培地の供給によって生じた希釈効果のために、培養の最初の72時間の間(pH6.0)、バイオマス濃度は急速に増大し、次いで発酵の最後まで、殆ど一定に保たれた。この時間において、(最初の72時間)、非常に低いレベルのGFP−SKLが細胞外で見られた(およそ0.25g/L)。6.0から6.7へのpH変化(72〜96時間の間に実現される)の後、細胞外GFP−SKL濃度は、発行の最後まで継続的に増大し、192時間目に3.3g/Lの値に達した。これにより、記載されたプロセス条件を用いて、10Lスケール流加培養プロセスにおいて、3.0g/Lより多い収量でGFP−SKLが生成および分泌されたこと明らかに示された。
【0169】
実施例7.同じ増殖プロフィールを有するグルコースおよび酸素制限条件下での細胞内GFP−SKL生成
菌株:
GFP−SKLおよびSncA/Pmp22を過剰発現するA.ニゲル(A.niger)CBS513.88株の構築は、実施例5.1に記載した。菌株の胞子を−80℃で保存した(5×107個の生存可能な胞子/バイアル)。
【0170】
接種手順:
1つの胞子−バイアルの内容物を、バッフル2L振とうフラスコ中の前培養培地(20g/Lイーストエクストラクト、20g/Lグルコース、pH6.8(KOHで)、300mL培地、20分121℃で蒸気滅菌)に加えた。この前培養物を、30℃、220rpmで40時間培養した。
【0171】
流加発酵:
当該分野で公知の手順(国際公開第93/37179号パンフレットに記載されている)を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適した培地中で培養を行った。
【0172】
適用した増殖条件は、以下の通りであった。プロセスpHを5.5で、温度を30℃で制御した。作業体積は10Lであり、総発酵時間は144時間であった。空気流は1vvm(1分あたりの培地体積あたりの空気体積)であった。グルコース制限培養のために、速度増加が0.025時間−1の指数関数的供給プロフィールを適用した。酸素制限発酵のために、酸素摂取速度を、速度増加が0.025時間−1の指数関数的プロフィールに従った撹拌によって制御した。グルコースを含有した供給を調節して、培地中のグルコース濃度を10g/Lより多く維持した。
【0173】
必要な場合、停止を行った。試料を採取し、細胞を含まない抽出物を調製した。実施例6に記載される方法に従って、GFP−SKLに関して試料を解析した。
【0174】
図13に表されるように、細胞内GFP−SKL生成は、グルコース制限条件下よりも酸素制限条件下の方が、かなり高かった。発酵の最後(144時間)に、細胞内GFP−SKL生成は、酸素制限条件が用いられた場合に、グルコース制限条件と比較して、およそ20倍高かった。この特定の実施例は、酸素制限条件が10Lスケール流加培養プロセスにおけるGFP−SKLのペルオキシソーム/細胞内蓄積に望ましいことを明らかに示す。
【0175】
実施例8.ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物(アセトアミダーゼ)の放出
8.1 A.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼのクローニングおよび発現
それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号41、配列番号42および配列番号43として示されるA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼAmdSを用いた。配列番号44および配列番号45を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号46を生じた。得られたPCR断片(配列番号46)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果としてA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。
【0176】
また、配列番号44および配列番号47を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号48を生じた。得られたPCR断片(配列番号48)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、操作されたC末端SKL尾部を有するA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。このコンストラクトの発現により、結果として、配列番号49に表されるようなポリペプチドを生じた。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られた、C末端−SKLありまたはなしのA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88を形質転換した。形質転換体を、SncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼコンストラクトの両方の存在、それぞれSncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼ−SKLコンストラクトの両方に関して、PCRによって解析した。選択したクローンを、実施例8.3においてさらに解析した。
【0177】
実施例8.2 A.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼのクローニングおよび発現
この実験のために、それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号50、配列番号51および配列番号52として示される周知のA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼ遺伝子を用いた(ティルバーン(Tilburn)ら、1983年、ジーン(Gene)26:205−221頁)。配列番号53および配列番号54を用いたPCR反応において、A.ニードランス(A.nidulans)AmdS(EP13211523号明細書に記載されている)を含む発現ベクター由来のプラスミドDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号55を生じた。得られたPCR断片(配列番号55)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、A.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。
【0178】
また、配列番号53および配列番号56を用いたPCR反応において、A.ニードランス(A.nidulans)AmdS(EP13211523号明細書に記載されている)を含む発現ベクター由来のプラスミドDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号57を生じた。得られたPCR断片(配列番号57)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、操作されたSKL尾部を有するA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。このコンストラクトの発現により、結果として、配列番号58で表されるポリペプチドを生じた。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られた、C末端−SKLありまたはなしのA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88を形質転換した。形質転換体を、SncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼコンストラクトの両方の存在、それぞれSncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアセトアミダーゼSKLコンストラクトの両方に関して、PCRによって解析した。選択したクローンを、実施例8.3においてさらに解析した。
【0179】
8.3 細胞内アセトアミダーゼの放出の解析のための実施例8.1および8.2の形質転換体の培養
−SKLありもしくはなしのA.ニゲル(A.niger)AmdSまたは−SKLありもしくはなしのA.ニードランス(A.nidulans)Amdsを、細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主(実施例5.2で構築した)および陰性対照としてのCBS513.88の両方に形質転換した。PCRを用いて、単一コピーのアセトアミダーゼ発現カセットを含む形質転換体を選択した。8つの型のクローンを、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、MEAM緩衝培地(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。培養の開始後120および144時間の時点で上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。実施例8.4において、アセトアミダーゼ活性に関して上清試料を解析した。
【0180】
8.4 アセトアミダーゼ酵素アッセイ
試料中の遊離アンモニアを測定することによって、アセトアミダーゼ活性に関して8.3の上清試料を解析した。遊離アンモニアは、アセトアミダーゼ活性の指標である(スクルブリ(Skouloubris)ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー(Molecular Microbiology)(2001年)40(3)、596−609頁によって記載されているように)。CBS513.88の、全ての選択および解析された形質転換クローンは、検出可能な遊離アンモニアを生じなかった(データ示さず)。図14において、実施例5.2の菌株の4つの型の形質転換体によって生じた遊離アンモニアを表す。図14で明らかに示されるように、C末端SKL延長部分を含むコンストラクト(すなわち、ペルオキシソームに標的化されている)は、結果として、C末端SKL延長部分を含まないコンストラクトと比較して、より高い細胞内アセトアミダーゼ活性を生じた。この、より高いアセトアミダーゼ活性は、ペルオキシソーム内容物の放出によって引き起こされた。図14において、ブロック2(SKLありのAニゲル(A niger)アセトアミダーゼ)および4(SKLありのAニードランス(A nidulans)アセトアミダーゼ)をブロック1(SKLなしのA.ニゲル(A.niger)アセトアミダーゼ)および3(SKLなしのA.ニードランス(A.nidulans)アセトアミダーゼ)と比較すると、細胞外にSKLありまたはなしの分泌されたアセトアミダーゼの間の差が明らかに観察され、SKLを有する上清アセトアミダーゼにおいて、かなりより多くのアセトアミダーゼ活性が存在した。
【0181】
実施例9.ペルオキシソームの、細胞膜との融合による、細胞外のペルオキシソーム内容物(アマドリアーゼ)の放出
9.1 A.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLのクローニングおよび発現
それぞれゲノム、cDNAおよびタンパク質配列である配列番号59、配列番号60および配列番号61として示されるA.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLを用いた。配列番号62および配列番号63を用いたPCR反応において、CBS513.88由来のゲノムDNAを鋳型として用い、結果として、コード配列番号64を生じた。得られたPCR断片(配列番号64)を、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図11に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。これにより、結果として、アマドリアーゼをコードする遺伝子がglaAプロモーターの制御下に置かれたコンストラクトを生じた。得られたプラスミドDNAを、製造業者の使用説明書に従って制限酵素PacIおよびAscIで消化し、図1に示されるように、PacI、AscI線状化A.ニゲル(A.niger)発現ベクターにライゲートした。全てのPCR反応、ライゲーションおよび形質転換は、モレキュラークローニング:ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、サンブルック(Sambrook)ら、ニューヨーク(New York)、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1989年に記載されているように、典型的な分子生物学技術を用いて行った。得られたA.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLをコードする発現コンストラクトを用いて、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88(陰性対照として)を形質転換した。形質転換体を、SncA/Pmp22発現コンストラクトならびにアマドリアーゼ−SRLコンストラクトの存在に関して、PCRによって解析した。選択したクローンを、実施例9.2においてさらに解析した。
【0182】
9.2 細胞内アマドリアーゼの放出の解析のための実施例9.1の形質転換体の培養
A.ニゲル(A.niger)アマドリアーゼ−SRLを、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88(陰性対照として)に形質転換した。PCRを用いて、単一コピーのアマドリアーゼ発現カセットを含むクローンに関して選択を行った。2つの型の形質転換体(それぞれアマドリアーゼ−SRLを含む、実施例5.2のA.ニゲル(A.niger)およびCBS513.88)の代表的なクローンを選択し、オービタルシェイカー中の振とうフラスコ中、30℃、250RPMで、MEAM緩衝培地(特許出願国際公開第98/46772号パンフレットに広範に記載されている)中で培養した。培養の開始後96時間の時点で上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。実施例9.3において、アマドリアーゼ活性に関して上清試料を解析した。
【0183】
9.3 アマドリアーゼ酵素アッセイ
9.2の上清試料を、酵素アッセイによって解析した。アマドリアーゼ活性アッセイは、モニエ(Monnier)VMら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem.)1997年2月7日、272(6):3437−43頁によって記載されている。フルクトシルプロピルアミン(モニエ(Monnier)教授の厚意より提供された)を基質として用いてオルトフェニレンジアミン(OPD)との比色反応によって測定されるグルコソンの放出によって、酵素活性をモニタリングした。このアッセイは、120分の反応時間の後に形成されたグルコソンの終点測定に基づく。反応混合物は、1mlの最終体積中、20mMリン酸ナトリウム、pH7.4、10mMOPD、10mMフルクトシルプロピルアミン、および実施例9.3の上清試料を含んだ。37℃で2時間のインキュベーション後、320nmでの吸光度を測定した。結果を図15に表す。結果から、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主が、アマドリアーゼ−SRL遺伝子で形質転換した対照株CBS513.88よりも、少なくとも3倍多くアマドリアーゼ−SRLを培地中で生成することができることが、明らかに示される。
【0184】
実施例10.ペルオキシソーム代謝産物の排出の増大
実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主が陰性対照株CBS513.88と比較して増大したペルオキシソーム代謝産物の分泌を示すことを示すために、実験を行った。
【0185】
実施例6に従って、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主およびCBS513.88を培養した。培養の開始後138時間目に上清試料を採取した。上清試料を遠心分離によって澄ませ、0.45μmフィルター(カタログ番号4614、アメリカ合衆国ミズーリ州アナーバーのポール(Pall、Ann Arbor、Mo USA))を通した限外ろ過によって残りの細胞残屑から分離した。続いて、1H NMRによって、ペルオキシソームβ−酸化代謝産物(デービッド・E・ミッツラー(David E Metzler)、バイオケミストリー(Biochemistry)第2版、アカデミック・プレス(Academic Press)2001年)に関して試料を解析した。
【0186】
2mlの上清を、4N HClでpH2に酸性化し、4mlクロロホルムで抽出した。澄んだクロロホルム層(遠心分離後)から、3mlを2ml水にpH7.5(0.01N NaOHで調節)で逆抽出した。遠心分離後の1.5mlの水層を凍結乾燥し、0.5ml D2O(重水素H2O、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories))に再懸濁した。1H NMRスペクトルを、ブルカー・アバンス(Bruker Avance)600分光光度計で、600MHZで測定した。2倍の濃度の増大を示す化合物を、二次元NMR分光学によって、分枝脂肪酸、イソ酪酸(a)、イソ吉草酸(b)およびa−メチル酪酸(c)であると同定した。これらは、それぞれa+bおよびcに関する分枝イソ−およびアンテイソ脂肪酸のβ−酸化から生じることが公知である(デービッド・E・ミッツラー(David E Metzler)、バイオケミストリー(Biochemistry)、第2版、アカデミック・プレス(Academic Press)2001年)。
【0187】
これらの酸の間の量的比較を、NMRスペクトルにおけるこれらの特徴的なメチル共鳴の統合によって行った(aは1.114ppm、bは0.928、ならびにcは0.885および1.089ppm)。3つ全ての代謝産物に関して、2倍の増大が、陰性対照株CBS513.88と比較して、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主に関して測定された。結果から、実施例5.2の細胞内化合物を分泌することができる包括的なA.ニゲル(A.niger)宿主を目的のペルオキシソーム代謝産物の細胞外生成の宿主株として用い得ることが、明らかに示された。
【0188】
本明細書中に記載および特許請求される発明は、実施形態が本発明のいくつかの態様の例示として意図されているために、本明細書中に開示される特定の実施形態によって範囲に限定されるものではない。任意の同等な実施形態が、本発明の範囲内にあると意図される。実際、本発明に示され、記載されたもの以外の本発明の種々の変更は、上記の記載から、当業者に明らかになろう。かかる変更はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると意図される。争議の場合には、定義を含む本開示が制御する。
【図面の簡単な説明】
【0189】
【図1】A.ニゲル(A.niger)発現ベクターpGBFIN−32を表す。
【図2】K.ラクティス(K.lactis)発現ベクターpGBK−20を表す。
【図3】アセトアミダーゼ遺伝子で形質転換された対照A.ニゲル(A.niger)細胞またはSKL配列に融合したアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されたA.ニゲル(A.niger)細胞で測定されたアセトアミダーゼ活性を表す。
【図4】アセトアミダーゼ遺伝子で形質転換された対照K.ラクティス(K.lactis)細胞またはSKL配列に融合したアセトアミダーゼ遺伝子で形質転換されたK.ラクティス(K.lactis)細胞で測定されたアセトアミダーゼ活性を表す。
【図5】GFP−SKLで形質転換されたA.ニゲル(A.niger)のペルオキシソームを示す。
【図6】GFP−SKLで形質転換され、ペルオキシソーム増殖の媒介物質であるオレイン酸Naとともに培養された、A.ニゲル(A.niger)のペルオキシソームを示す。
【図7】上清中のGFP−SKLの放出を示すいくつかの形質転換A.ニゲル(A.niger)株の培養上清を含む、SDS−PAGEゲルを示す。
【図8】上清中のGFP−SKLの放出を示すいくつかの形質転換A.ニゲル(A.niger)株の培養上清を含む、ウェスタンブロットを示す。
【図9】GFP(パネルC)、GFP−SKL(パネルB)またはGFP/Pmp22(パネルA)を発現しているA.ニゲル(A.niger)株を示す。
【図10】アセトアミダーゼ(amdS)/ml培養上清の相対的な量として表された、細胞の非特異的溶解の程度を示す。
【図11】A.ニゲル(A.niger)発現ベクターpGBFIN−5を表す。
【図12】10Lスケール発酵におけるA.ニゲル(A.niger)中のバイオマス濃度および細胞外GFP−SKL生成を示す。
【図13】A.ニゲル(A.niger)における細胞内GFP−SKL生成に関するグルコースおよび酸素制限条件発酵条件の間の差を示す。
【図14】培養上清中の、C末端SKLのある分泌されたアセトアミダーゼの存在を示す。ブロック2および4は、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞における、SKLのあるアセトアミダーゼを表す。ブロック1および3は、細胞内化合物を分泌することができるA.ニゲル(A.niger)宿主細胞における、SKLがないアセトアミダーゼを表す。
【図15】培養物上清中の、C末端SRLのある分泌されたアセトアミダーゼの存在を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することのできるペルオキシソームを含む、真核細胞。
【請求項2】
細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造が、細胞膜、ゴルジ複合体および小胞体からなる群より選択される、請求項1に記載の真核細胞。
【請求項3】
融合ポリペプチドまたはその一部がペルオキシソームの表面で露出している、請求項1または2に記載の真核細胞。
【請求項4】
通常供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドの一部が露出している、請求項3に記載の真核細胞。
【請求項5】
融合ポリペプチドまたはその一部がペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に融合、または操作可能に結合している、請求項3または4に記載の真核細胞。
【請求項6】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドの一部が少なくとも1つの膜貫通ドメインを含む、請求項5に記載の真核細胞。
【請求項7】
融合ポリペプチドがv−SNAREである、請求項3〜7のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項8】
v−SNAREがSnc1、Snc2またはそれらのホモログ、好ましくはSncAである、請求項7に記載の真核細胞。
【請求項9】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドがPmp22またはそのホモログである、請求項5または6に記載の真核細胞。
【請求項10】
補完融合ポリペプチドまたはその一部が受容膜構造で過剰発現されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項11】
受容膜構造が細胞膜である、請求項10に記載の真核細胞。
【請求項12】
補完融合ポリペプチドがt−SNAREである、請求項10または11に記載の真核細胞。
【請求項13】
細胞が、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部と操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを含む、請求項3〜12のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項14】
核酸コンストラクトが、配列番号24のアミノ酸配列とのキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含み、好ましくは配列番号23の核酸配列である、請求項13に記載の真核細胞。
【請求項15】
細胞が、目的のポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列に操作可能に結合された、目的のポリペプチドをコードするDNA配列を含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項16】
ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルが、(a)NからC末端方向の第一のアミノ酸がA、C、H、K、N、P、SまたはTであり、NからC末端方向の第二のアミノ酸がH、K、N、Q、RまたはSであり、NからC末端方向の第三のアミノ酸がA、F、I、L、MまたはVであるトリペプチド配列、および(b)(R/K)(L/V/I/Q)XX(L/V/I/H/Q)(L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F)として定義され、ここでXが任意のアミノ酸であり得るペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項15に記載の真核細胞。
【請求項17】
真核細胞が哺乳動物、昆虫、植物、菌類または藻類細胞である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項18】
菌類細胞が酵母細胞、好ましくはK.ラクティス(K.lactis)またはS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)である、請求項17に記載の真核細胞。
【請求項19】
菌類細胞が糸状菌細胞、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)またはトリコデルマ(Trichoderma)属の種に属する細胞である、請求項17に記載の真核細胞。
【請求項20】
糸状菌細胞がアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus orizae)、アスペルギルス・ソヤ(Aspergillus sojae)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)またはペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)に属する、請求項19に記載の真核細胞。
【請求項21】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の真核細胞における、目的のポリペプチドの生成方法であって、前記目的のポリペプチドが細胞のペルオキシソーム中に存在し、前記方法が所定の培地中で真核細胞を培養する工程、および任意にポリペプチドを精製する工程を含む、方法。
【請求項22】
培地がCAPPの活性化因子、好ましくはセラミドおよび/またはペルオキシソーム増殖を誘導する物質、好ましくはオレイン酸塩を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
少なくとも0.01g/lの目的のポリペプチドが生成される、請求項21または22に記載の方法。
【請求項24】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の真核細胞における、代謝産物の生成方法であって、前記代謝産物が細胞のペルオキシソーム中に存在し、前記方法が所定の培地中で真核細胞を培養する工程、および任意に代謝産物を精製する工程を含む、方法。
【請求項25】
真核が、酵素のペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列に操作可能に結合された代謝産物合成に関係する酵素をコードするDNA配列を含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む、請求項24に記載の代謝産物の生成方法。
【請求項26】
真核細胞が培養され、適量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下に維持される、請求項21〜25のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項27】
培地のpHが培養プロセスの間に変えられる、請求項21〜26のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項28】
培養プロセスの全保持時間が、192時間であり、
・培地のpHが6.0である72時間の第一段階、
・培地のpHが線形の過程で6.0から6.7に変えられる、24時間の遷移段階、および
・培地のpHが6.7である、96時間の第二段階
からなる、請求項21〜27のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項29】
培地の温度が培養プロセスの間に変えられる、請求項21〜28のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項30】
培養プロセスの間に培地の温度が30℃から36℃に変えられる、請求項21〜29のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項31】
真核細胞が糸状菌、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)種、より好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)株である、請求項26〜30のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項32】
(a)配列番号13のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号13のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、v−SNARE機能を示すポリペプチド。
【請求項33】
(a)配列番号16のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号16のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ペルオキシソーム膜ポリペプチド。
【請求項34】
キメラポリペプチドが、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部を含む、供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列の、ペルオキシソームの表面での露出を得るのに適したキメラポリペプチド。
【請求項35】
(a)分泌経路の供与膜の細胞質側表面に露出した融合ポリペプチドのドメイン、および
(b)ペルオキシソーム膜に標的化および結合したドメイン
を含み、ドメイン(a)および(b)が操作可能に結合し、ペルオキシソームを含む宿主細胞におけるキメラポリペプチドの発現によってペルオキシソームに宿主細胞の分泌経路の受容膜と融合する能力が与えられる、キメラポリペプチド。
【請求項36】
ドメイン(a)および(b)が単一のオープンリーディングフレーム中に存在し、ドメイン(a)がドメイン(b)よりもポリペプチドのN末端に近い、請求項35に記載のキメラポリペプチド。
【請求項37】
ドメイン(a)がv−SNARE由来である、請求項35または36に記載のキメラポリペプチド。
【請求項38】
ドメイン(a)が、v−SNAREのN末端から、第一の膜貫通ドメインまで、または第一の膜貫通ドメインを含む範囲にわたる、v−SNARE由来の断片を含む、請求項37に記載のキメラポリペプチド。
【請求項39】
ドメイン(a)の断片が、配列番号13の1〜95位、または配列番号13に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列に対応する配列を含む、請求項38に記載のキメラポリペプチド。
【請求項40】
断片がv−SNAREのN末端から第一の膜貫通ドメインまでのアミノ酸の少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%にわたる、請求項38または39に記載のキメラポリペプチド。
【請求項41】
ドメイン(b)が、膜貫通ドメイン、およびドメインをペルオキシソーム膜に標的化させる配列を含む、請求項35〜40のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項42】
ドメイン(a)に最も近位の膜貫通ドメインのN末端が細胞質側向きに方向付けられている、請求項41に記載のキメラポリペプチド。
【請求項43】
ドメイン(b)がペルオキシソーム膜タンパク質由来の配列を含む、請求項42または43に記載のキメラポリペプチド。
【請求項44】
ドメイン(b)が、N末端が元々ペルオキシソームの細胞質側に露出したペルオキシソーム膜ポリペプチド由来であるか、またはN末端が細胞質側向きに方向付けられた少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項43に記載のキメラポリペプチド。
【請求項45】
ドメイン(b)が、N末端が細胞質側向きに方向付けられた最もN末端側の膜貫通ドメインから少なくとも10アミノ酸までN末端アミノ酸が除かれたペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項44に記載のキメラポリペプチド。
【請求項46】
ドメイン(b)が、Pmp22、Pmp34、Pmp47、Pmp70、Pex3、Pex11、Pex14およびPex22から選択されるペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項45に記載のキメラポリペプチド。
【請求項47】
ドメイン(b)が、配列番号16の2〜224位に対応する配列、好ましくは3もしくは4もしくは5もしくは6もしくは7もしくは8もしくは9もしくは10もしくは11もしくは12もしくは13もしくは14もしくは15もしくは16もしくは17もしくは18もしくは19もしくは20もしくは21もしくは22もしくは23もしくは24もしくは25もしくは26もしくは27もしくは28もしくは29もしくは30もしくは31もしくは32もしくは33もしくは34もしくは35もしくは36もしくは37もしくは38もしくは39もしくは40〜224位または配列番号16に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列に対応する配列である、請求項46に記載のキメラタンパク質。
【請求項48】
配列番号24のアミノ酸配列を有する、請求項47に記載のキメラタンパク質。
【請求項49】
請求項35〜48のいずれか一項に記載のキメラタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項50】
プロモーターに動作可能に連結された請求項49に記載のヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
【請求項1】
細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造と融合することのできるペルオキシソームを含む、真核細胞。
【請求項2】
細胞の分泌経路に関係する細胞の膜構造が、細胞膜、ゴルジ複合体および小胞体からなる群より選択される、請求項1に記載の真核細胞。
【請求項3】
融合ポリペプチドまたはその一部がペルオキシソームの表面で露出している、請求項1または2に記載の真核細胞。
【請求項4】
通常供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドの一部が露出している、請求項3に記載の真核細胞。
【請求項5】
融合ポリペプチドまたはその一部がペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に融合、または操作可能に結合している、請求項3または4に記載の真核細胞。
【請求項6】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドの一部が少なくとも1つの膜貫通ドメインを含む、請求項5に記載の真核細胞。
【請求項7】
融合ポリペプチドがv−SNAREである、請求項3〜7のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項8】
v−SNAREがSnc1、Snc2またはそれらのホモログ、好ましくはSncAである、請求項7に記載の真核細胞。
【請求項9】
ペルオキシソーム膜ポリペプチドがPmp22またはそのホモログである、請求項5または6に記載の真核細胞。
【請求項10】
補完融合ポリペプチドまたはその一部が受容膜構造で過剰発現されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項11】
受容膜構造が細胞膜である、請求項10に記載の真核細胞。
【請求項12】
補完融合ポリペプチドがt−SNAREである、請求項10または11に記載の真核細胞。
【請求項13】
細胞が、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部と操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを含む、請求項3〜12のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項14】
核酸コンストラクトが、配列番号24のアミノ酸配列とのキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含み、好ましくは配列番号23の核酸配列である、請求項13に記載の真核細胞。
【請求項15】
細胞が、目的のポリペプチドのペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列に操作可能に結合された、目的のポリペプチドをコードするDNA配列を含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項16】
ペルオキシソーム局在化を促進するシグナルが、(a)NからC末端方向の第一のアミノ酸がA、C、H、K、N、P、SまたはTであり、NからC末端方向の第二のアミノ酸がH、K、N、Q、RまたはSであり、NからC末端方向の第三のアミノ酸がA、F、I、L、MまたはVであるトリペプチド配列、および(b)(R/K)(L/V/I/Q)XX(L/V/I/H/Q)(L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F)として定義され、ここでXが任意のアミノ酸であり得るペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項15に記載の真核細胞。
【請求項17】
真核細胞が哺乳動物、昆虫、植物、菌類または藻類細胞である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項18】
菌類細胞が酵母細胞、好ましくはK.ラクティス(K.lactis)またはS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)である、請求項17に記載の真核細胞。
【請求項19】
菌類細胞が糸状菌細胞、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)またはトリコデルマ(Trichoderma)属の種に属する細胞である、請求項17に記載の真核細胞。
【請求項20】
糸状菌細胞がアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus orizae)、アスペルギルス・ソヤ(Aspergillus sojae)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)またはペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)に属する、請求項19に記載の真核細胞。
【請求項21】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の真核細胞における、目的のポリペプチドの生成方法であって、前記目的のポリペプチドが細胞のペルオキシソーム中に存在し、前記方法が所定の培地中で真核細胞を培養する工程、および任意にポリペプチドを精製する工程を含む、方法。
【請求項22】
培地がCAPPの活性化因子、好ましくはセラミドおよび/またはペルオキシソーム増殖を誘導する物質、好ましくはオレイン酸塩を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
少なくとも0.01g/lの目的のポリペプチドが生成される、請求項21または22に記載の方法。
【請求項24】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の真核細胞における、代謝産物の生成方法であって、前記代謝産物が細胞のペルオキシソーム中に存在し、前記方法が所定の培地中で真核細胞を培養する工程、および任意に代謝産物を精製する工程を含む、方法。
【請求項25】
真核が、酵素のペルオキシソーム局在化を促進するDNA配列に操作可能に結合された代謝産物合成に関係する酵素をコードするDNA配列を含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターをさらに含む、請求項24に記載の代謝産物の生成方法。
【請求項26】
真核細胞が培養され、適量の酸素が培養物に供給されて培養物が酸素制限の条件下に維持される、請求項21〜25のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項27】
培地のpHが培養プロセスの間に変えられる、請求項21〜26のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項28】
培養プロセスの全保持時間が、192時間であり、
・培地のpHが6.0である72時間の第一段階、
・培地のpHが線形の過程で6.0から6.7に変えられる、24時間の遷移段階、および
・培地のpHが6.7である、96時間の第二段階
からなる、請求項21〜27のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項29】
培地の温度が培養プロセスの間に変えられる、請求項21〜28のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項30】
培養プロセスの間に培地の温度が30℃から36℃に変えられる、請求項21〜29のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項31】
真核細胞が糸状菌、好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)種、より好ましくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)株である、請求項26〜30のいずれか一項に記載の真核細胞における目的の化合物の生成方法。
【請求項32】
(a)配列番号13のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号13のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、v−SNARE機能を示すポリペプチド。
【請求項33】
(a)配列番号16のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)配列番号16のアミノ酸配列に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも95%さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、さらにより好ましくは少なくとも99%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、および(c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの機能的断片からなる群より選択される、ペルオキシソーム膜ポリペプチド。
【請求項34】
キメラポリペプチドが、ペルオキシソーム膜ポリペプチドまたはその一部に操作可能に結合した融合ポリペプチドまたはその一部を含む、供与膜構造の表面で露出している融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列の、ペルオキシソームの表面での露出を得るのに適したキメラポリペプチド。
【請求項35】
(a)分泌経路の供与膜の細胞質側表面に露出した融合ポリペプチドのドメイン、および
(b)ペルオキシソーム膜に標的化および結合したドメイン
を含み、ドメイン(a)および(b)が操作可能に結合し、ペルオキシソームを含む宿主細胞におけるキメラポリペプチドの発現によってペルオキシソームに宿主細胞の分泌経路の受容膜と融合する能力が与えられる、キメラポリペプチド。
【請求項36】
ドメイン(a)および(b)が単一のオープンリーディングフレーム中に存在し、ドメイン(a)がドメイン(b)よりもポリペプチドのN末端に近い、請求項35に記載のキメラポリペプチド。
【請求項37】
ドメイン(a)がv−SNARE由来である、請求項35または36に記載のキメラポリペプチド。
【請求項38】
ドメイン(a)が、v−SNAREのN末端から、第一の膜貫通ドメインまで、または第一の膜貫通ドメインを含む範囲にわたる、v−SNARE由来の断片を含む、請求項37に記載のキメラポリペプチド。
【請求項39】
ドメイン(a)の断片が、配列番号13の1〜95位、または配列番号13に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列に対応する配列を含む、請求項38に記載のキメラポリペプチド。
【請求項40】
断片がv−SNAREのN末端から第一の膜貫通ドメインまでのアミノ酸の少なくとも70%、好ましくは80%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%にわたる、請求項38または39に記載のキメラポリペプチド。
【請求項41】
ドメイン(b)が、膜貫通ドメイン、およびドメインをペルオキシソーム膜に標的化させる配列を含む、請求項35〜40のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項42】
ドメイン(a)に最も近位の膜貫通ドメインのN末端が細胞質側向きに方向付けられている、請求項41に記載のキメラポリペプチド。
【請求項43】
ドメイン(b)がペルオキシソーム膜タンパク質由来の配列を含む、請求項42または43に記載のキメラポリペプチド。
【請求項44】
ドメイン(b)が、N末端が元々ペルオキシソームの細胞質側に露出したペルオキシソーム膜ポリペプチド由来であるか、またはN末端が細胞質側向きに方向付けられた少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項43に記載のキメラポリペプチド。
【請求項45】
ドメイン(b)が、N末端が細胞質側向きに方向付けられた最もN末端側の膜貫通ドメインから少なくとも10アミノ酸までN末端アミノ酸が除かれたペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項44に記載のキメラポリペプチド。
【請求項46】
ドメイン(b)が、Pmp22、Pmp34、Pmp47、Pmp70、Pex3、Pex11、Pex14およびPex22から選択されるペルオキシソーム膜ポリペプチド由来である、請求項45に記載のキメラポリペプチド。
【請求項47】
ドメイン(b)が、配列番号16の2〜224位に対応する配列、好ましくは3もしくは4もしくは5もしくは6もしくは7もしくは8もしくは9もしくは10もしくは11もしくは12もしくは13もしくは14もしくは15もしくは16もしくは17もしくは18もしくは19もしくは20もしくは21もしくは22もしくは23もしくは24もしくは25もしくは26もしくは27もしくは28もしくは29もしくは30もしくは31もしくは32もしくは33もしくは34もしくは35もしくは36もしくは37もしくは38もしくは39もしくは40〜224位または配列番号16に少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%の同一性の程度を示す相同な配列に対応する配列である、請求項46に記載のキメラタンパク質。
【請求項48】
配列番号24のアミノ酸配列を有する、請求項47に記載のキメラタンパク質。
【請求項49】
請求項35〜48のいずれか一項に記載のキメラタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項50】
プロモーターに動作可能に連結された請求項49に記載のヌクレオチド配列を含む、発現コンストラクト。
【図1】
【図2】
【図5】
【図6】
【図9】
【図11】
【図3】
【図4】
【図7】
【図8】
【図10】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図2】
【図5】
【図6】
【図9】
【図11】
【図3】
【図4】
【図7】
【図8】
【図10】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【公表番号】特表2008−516592(P2008−516592A)
【公表日】平成20年5月22日(2008.5.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−536177(P2007−536177)
【出願日】平成17年10月13日(2005.10.13)
【国際出願番号】PCT/EP2005/055229
【国際公開番号】WO2006/040340
【国際公開日】平成18年4月20日(2006.4.20)
【出願人】(503220392)ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. (873)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成20年5月22日(2008.5.22)
【国際特許分類】
【出願日】平成17年10月13日(2005.10.13)
【国際出願番号】PCT/EP2005/055229
【国際公開番号】WO2006/040340
【国際公開日】平成18年4月20日(2006.4.20)
【出願人】(503220392)ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. (873)
【Fターム(参考)】
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