硫酸基の脱離を抑えた硫酸化多糖の低分子化物およびその製造方法
【課題】安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、低分子化後の硫酸基保持率が高い、低分子化フコイダンの製造方法、およびかかる方法により得られる低分子化フコイダンを提供する。
【解決手段】硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法であって、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法、フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調整後、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法、ならびにこれらの方法により得ることのできる低分子化フコイダン。
【解決手段】硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法であって、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法、フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調整後、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法、ならびにこれらの方法により得ることのできる低分子化フコイダン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化フコイダンの製造方法に関する。詳細には、水熱反応を用いることにより硫酸基の脱離を伴わずにフコイダンを低分子化させることを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物質であるフコイダンは、オキナワモズク、モズク、ワカメ、昆布などの褐藻海草類に含まれる「ぬめり」成分であり、癌細胞の死滅、免疫系の調節、組織再生の促進など、様々な生物活性を有することが明らかになっている。また、フコイダンは肌を引き締める作用を有していたり、保湿作用を有していたりすることから、化粧品にも利用されている。このように、フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの原料あるいは成分として需要が増大している。
【０００３】
このようにフコイダンは有用な活性を示すが、高分子であるため粘度が高く、取り扱いの点で問題があった。また高分子のままでは体内に摂取された場合に吸収が悪いことが多い。さらに、天然物質であるフコイダンは分子量が不均一なために生理活性が一定でなく、健康食品、機能性食品、サプリメントおよび医薬品などに使用した場合に、効果にばらつきが出てしまう。さらに分子量が不均一で分布が広いと、他の夾雑物質を除去して純度を上げることも難しくなる。このような欠点をなくすために酵素処理、酸加水分解などにより低分子化させる試みがなされてきた（特許文献１等参照）。粘度が低く体内への吸収が良い低分子化フコイダンの分子量は数百〜数万の範囲といわれている。しかも、低分子化フコイダンがその生理活性を発揮するためには硫酸基が保持されていることが必要である。しかしながら、上記のような性質の低分子化フコイダンを得るために、酵素処理では反応時間が長くなりコストも高くつく、酸加水分解では硫酸基の保持率が低い、あるいはこれらの方法では生成物の分子量の制御が困難である等の欠点があった。
【０００４】
また、水熱処理により多糖類を低分子化させる試みもあったが（特許文献２等参照）、硫酸基の脱離に関して検討したものではなく、ましてやフコイダンの硫酸基の脱離が伴わない水熱処理に言及した例はない。
【特許文献１】特開平７−２１５９９０号公報
【特許文献２】特開２００５−１１０６７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、低分子化後の硫酸基の脱離が伴わない低分子化フコイダンの製造方法を提供することが、本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ねた。そして、水熱反応を用いることにより硫酸基の脱離を伴わずにフコイダンを低分子化できることを見出した。さらに本発明者らは、フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近に調整後、水熱反応に供することで低分子化を抑制することにより、分子量制御が格段に容易になることも見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は：
（１）硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法であって、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法；
（２）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（３）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１５０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約４０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（４）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約６０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（５）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１５０℃の水熱条件下に約５分ないし約２０分保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（６）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃の水熱条件下に約５分ないし約４０分保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（７）水熱処理前にフコイダンの水溶液のｐＨを約５．５〜約１２に調節し、フコイダンの低分子化を抑制しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法；
（８）該水熱反応が、硫酸基が脱離しない水熱条件下で行われることを特徴とする（７）記載の方法；
（９）約５．５よりも高いｐＨないしｐＨ１２に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分保つことを特徴とする（８）記載の方法；
（１０）ｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分未満保つことを特徴とする（８）の方法；
（１１）ｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約６０分保つことを特徴とする（８）記載の方法；
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法により得ることのできる低分子化フコイダン
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、低分子化後の硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法が提供される。本発明の方法により得られる低分子化フコイダンは、生物学的活性に必要な硫酸基が脱離しておらず分子量も揃っている。それゆえ、本発明により得られる低分子化フコイダンは活性が保持されていて、そのばらつきが少なく、しかも低分子であるので吸収がよい。しかも不快な風味を有しない。したがって、本発明により得られる低分子化フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などにおける使用に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、フコイダンを水熱処理に付して加水分解することにより低分子化させる方法を提供するものである。さらに本発明は、フコイダンの水溶液を水熱処理に付す前に、水溶液のｐＨを中性付近に調整することにより低分子化を抑制して、低分子化フコイダンの分子量制御を容易ならしめる方法も提供する。水熱処理を用いることにより、あるいはそれに加えて水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを調節することにより、他の方法に伴う欠点、例えば、酵素処理では反応時間が長くなりコストも高くつく、酸加水分解では硫酸基の保持率が低い、あるいはこれらの方法では生成物の分子量の制御が困難である等の欠点が克服される。換言すれば、本発明の方法は、安価かつ短時間の処理にて低分子化フコイダンが得られ、しかも低分子化フコイダンの分子量制御が容易で、低分子化後の硫酸基の脱離が伴わないという優れた方法である。
【００１０】
本発明の方法において、フコイダンは精製品であってもよく、粗精製品または部分精製品であってもよく、蛋白類、脂質類、他の糖類などの夾雑物質を含むものであってもよい。例えば、もずくなどの海草類をそのまま、あるいはそれらの粗抽出物をフコイダンとして本発明の方法に使用してもよい。本発明において、フコイダンは水溶液として処理される。フコイダンを水だけに溶解させてフコイダン水溶液としてもよく、フコイダンを塩類などの他の物質が含まれている水に溶解させてフコイダン水溶液を調製してもよい。
【００１１】
一般に、水熱処理は亜臨界水（１００℃ないし３７４℃の温度で、１気圧ないし２２ＭＰａの圧力）を用いて行われるものであるが、本発明の方法においては、水熱処理による低分子化の際にフコイダンの硫酸基の脱離が伴わないような温度範囲（圧力範囲）および処理時間の範囲とすることが必要である。本発明の方法においてフコイダンを有意に低分子化させるためには、以下に述べる各温度には約５分以上保持することが好ましい。フコイダンの低分子化を確認するには、例えばゲルろ過カラムクロマトグラフィー法などを用いることができる。
【００１２】
水熱処理によるフコイダンの低分子化において、水熱処理温度が高いほど、そして水熱処理時間が長いほど、フコイダンの低分子化が促進され、得られる低分子化フコイダンの分子量が小さくなる。しかし、水熱処理温度が高いほど、そして水熱処理時間が長いほど、硫酸基の脱離が起こりやすくなる。また、水熱処理温度が低いほど、そして水熱処理時間が短いほど、フコイダンの低分子化が進まず、得られる低分子化フコイダンの分子量が大きくなる。当業者は、所望の分子量の、硫酸基が脱離していない低分子化フコイダンを得るための水熱条件を通常の実験によって、容易に定めうる。
【００１３】
一般的には、フコイダンの硫酸基の量は元素分析またはバリウム沈殿法などの公知の方法にて測定することができる。元素分析またはバリウム沈殿法で測定した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が実質的に脱離しない（約９５％以上の硫酸基が残存している）水熱処理条件（水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを調節しない）としては、例えば、１００℃ないし約１８０で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１６０℃で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分保持する条件等が例示されるが、これらの条件に限定されない。
【００１４】
さらに好ましくは、そしてさらに厳密には、本発明の水熱処理にて得られた低分子化フコイダンの赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを調べ、ピラノース環由来のＩＲ吸収スペクトル（１１００ｃｍ−１）のパターンが水熱処理前後で変化しなければ、糖の骨格構造に変化がないと判断し、吸収スペクトルのパターンが変化していればフコイダンの化学構造の可能性があると判断する。さらに、イオウの結合に関連した吸収スペクトルのパターン（１３００ｃｍ−１）のピーク変化も観察することが好ましい。本発明において、ＩＲ吸収スペクトルのパターンの変化で判断した場合に、低分子化フコイダンの構造変化を伴わない水熱処理の条件（水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを調節しない）としては、１００℃ないし約１６０℃未満で約５分ないし約２０分未満保持する条件、１００℃ないし１５０℃未満で約５分ないし約４０分未満保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分未満保持する条件、１００℃ないし約１２０℃で約５分ないし１２０分未満保持する条件が挙げられ、さらに好ましくは、１００℃ないし約１５０℃で約５分ないし約２０分保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約４０分保持する条件が挙げられるが、これらの条件に限定されない。
【００１５】
さらに本発明は、フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調節し、次いで、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法を提供する。フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調節してから水熱処理に付すことによって、フコイダンの低分子化を抑制しつつ、反応を行うことができる。これにより、得られる低分子化フコイダンの分子量の制御が容易になり、所望の分子量のものをより確実に得ることができる。
【００１６】
フコイダンの水溶液のｐＨは、調節しない場合は弱酸性領域（典型的には約５〜約５．５付近）にあるのが通常である。本発明においてフコイダンの水溶液のｐＨを中性付近に調節する場合において、中性付近〜アルカリ性のｐＨは約５．５〜約１２であり、好ましくはｐＨ７付近、例えばｐＨ約６〜約８、さらに好ましくはｐＨ約６．５〜約７．５に調節して水熱処理を行う。この場合、低分子化の著しい遅延は認められず、処理速度をある程度早く保ちながらも上手く分子量を制御できる。水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨが酸性側（約５未満、例えばｐＨ４）だと、フコイダンの低分子化速度が大きくなる。しかし、ｐＨ４未満（例えばｐＨ約３．４あるいはそれ以下）だと、フコイダンが溶けにくくなり、沈殿が生じる、あるいは水熱処理により着色する、フコイダンが分解する等の弊害が生じる。また、水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨがアルカリ性側（例えばｐＨ約９あるいはそれ以上）の場合には、フコイダンの低分子化速度の抑制効果が顕著となる。しかし、ｐＨ９〜１２の範囲では、フコイダンの低分子化速度にあまり差はない。
【００１７】
フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近にするには塩基を水溶液に添加するのが通常である、塩基は当業者によく知られており、適宜選択することができる。典型的には塩基の水溶液を用意し、ｐＨをモニターしながら除々にフコイダン水溶液に滴下して所望のｐＨにすることができる。塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの金属炭酸水素塩などが挙げられるが、食品や医薬品に適用することを考慮すると、フコイダンと不要な反応をしない、毒性や着色の問題がない、風味を損なわないものが好ましく、このような塩基の例として水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられる。
【００１８】
フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調節してから水熱処理に付す場合において、元素分析またはバリウム沈殿法で測定した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が実質的に脱離しない（約９５％以上の硫酸基が残存している）条件、ならびにＩＲ吸収スペクトルのパターンの変化で判断した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が脱離していない水熱処理の条件は、ｐＨ無調整の場合とほぼ同じである。そのような低分子化フコイダンを得るための水熱条件としては、約５．５よりも高いｐＨないしｐＨ約１２に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分保つ条件、ｐＨ７付近、例えばｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分未満保つ条件、あるいはｐＨ７付近、例えばｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃の水熱条件下に５分ないし６０分保つ条件が挙げられるが、これらの条件に限定されない。
【００１９】
本発明の水熱処理に用いる装置は、試料を上記温度範囲に上記時間保持できるものであればいずれの装置であってもよい。例えば、各種のオートクレーブ用装置や圧力釜のように加圧下で試料を一定温度に保持できる装置が公知であり、市販されているので、それらを用いてもよい。このような装置はあまり高価なものではなく、ランニングコストも比較的安い。また、このような装置は大型化も容易であるので、本発明によれば、安価かつ大量に低分子化フコイダンを得ることができる。また、上記以外の装置として温度調節が可能なプレッシャークッカーなどの装置を本発明の方法に用いてもよい。
【００２０】
上述のように、本発明の方法においては、水熱処理温度および／または水熱処理時間を変化させることにより、あるいはそれに加えて水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを中性付近に調節することにより、得られるフコイダンの分子量を容易に調節・制御することができる。水熱処理温度が高いほど得られるフコイダンが低分子化し、水熱処理時間が長いほど得られるフコイダンが低分子化する。本発明の方法によれば、上記条件を適宜選択することによって、平均分子量約１万以上約３０万未満の範囲の低分子化フコイダンを容易に得ることができる。しかも、本発明の方法により得られる低分子化フコイダンは不快な味、臭いがなく、しかもフコイダンとしての諸活性を保持しているので、食品（特に機能性食品、健康食品など）や医薬品に好適である。したがって、本発明は、上記低分子化方法により得られた低分子化フコイダンを含む飲食物および医薬品も提供する。
【００２１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２２】
実施例１ 分子量に及ぼす処理温度の影響
フコイダン（海産物のきむらや製）８００ｍｇを水８０ｍｌに溶解してフコイダン水溶液を調製し（ｐＨ無調整、ｐＨ５．２であった）、処理温度を１２０℃、１４０℃、１６０℃、１８０℃として、各温度に２０分保持した。水熱処理装置としてＨＴＰ−５０／２５０（日阪製作所製）を用いた。低分子化したフコイダン試料をＨＰＬＣによるゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）にて分析した。分析条件は以下のとおり。カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ５２０＋ＧＳ３２０＋ＧＳ２２０、溶出液：０．１Ｍ ＮａＮＯ３、流速：１．０ｍｌ／分、検出：ＲＩＤ、カラム温度：４０℃、検量線標品：プルランスタンダード。
【００２３】
結果を図１および表１に示す。処理温度が高くなるにつれ、フコイダンの分子量が低下した。処理温度と分子量の関係はなめらかであった。本発明の方法によれば処理温度を変化させることによって所望の分子量のフコイダンが容易に得られることがわかった。また、いずれの反応系においてもＧＰＣチャートのベースラインが低く平坦であり、ピークの形が左右対称に近く、クロマトグラフィー装置等を用いて所望の分子量のフコイダンを分取できることもわかった。データは示していないが、処理時間を変化させることによっても所望の分子量のフコイダンを分取できる。
【表１】
表中、Ｍｗは重量平均分子量を、Ｍｎは数平均分子量を示す。処理温度を上昇させるにつれ、ＭｗおよびＭｎの値が小さくなり、平均分子量が減少していることが示された。
【実施例２】
【００２４】
実施例２ 硫酸基の置換度に及ぼす処理温度の影響
実施例と同じフコイダン水溶液および水熱処理装置を用いて、処理温度を１４０℃、１６０℃、１８０℃とし、各温度に２０分保持した後、元素分析法にて分析を行い、低分子化フコイダンの硫酸基の置換度（ＤＳ）を調べた。結果を表２に示す。
【００２５】
再沈殿はアセトンまたはエタノール添加により行ったものである。透析は分画分子量５００の透析膜を用いて得られたものである。表２からわかるように、いずれの温度で処理を行った場合でも、そして、いずれの画分においても、低分子化フコイダンのＤＳと未処理フコイダンのＤＳとの間で有意な差異は認められなかった。したがって、元素分析法を用いて調べた場合、上記の水熱処理条件下では、水熱処理による低分子化フコイダンの硫酸基の脱離は認められなかったといえる。
【表２】
【００２６】
さらに、元素分析法に加えてバリウム沈殿法によっても、本発明の方法による低分子化フコイダンの硫酸基の量を調べた。水熱処理条件は１４０℃に６０分保持であった。実験を２系で行った。結果を表３に示す。元素分析法、バリウム沈殿法にいずれの分析方法を用いても、上記の水熱処理条件下では、ＤＳおよび硫酸基含有率に有意な差異は認められなかった。
【表３】
【００２７】
したがって、元素分析および／またはバリウム沈殿法で測定した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が実質的に脱離しない条件の例としては、例えば、１００℃ないし約１８０で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１６０℃で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分保持する条件を挙げることができる。
【実施例３】
【００２８】
実施例３ ＩＲ吸収スペクトル法による硫酸基脱離の有無の検討
水熱処理温度がフコイダンの硫酸基に及ぼす影響について、赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを測定することにより調べた。フコイダン水溶液および水熱処理装置は実施例１および２と同じものであった。１２０℃、１４０℃、１６０℃および１８０℃の各温度に試料を２０分保持して、得られた低分子化フコイダンのＩＲスペクトルを取り、Ｓ＝Ｏ伸縮振動に関連する吸収パターンの変化を調べた。結果を図２に示す。
【００２９】
処理温度１４０℃まではＩＲ吸収スペクトルのパターンに変化が見られなかったが、処理温度１６０℃以上では図２中矢印で示す糖骨格であるピラノース環およびＳ＝Ｏ伸縮振動の吸収スペクトルのパターン（および破線で示す領域の吸収スペクトルのパターン）に変化が認められた。これらの結果から、低分子化フコイダンの硫酸基の脱離を含む構造変化がない上限温度は、２０分保持の場合には１４０℃以上１６０℃未満であることがわかった。したがって、ＩＲ吸収スペクトルのパターンにて確認される硫酸基の脱離を含む構造変化がない処理条件としては１００℃ないし約１６０℃未満、好ましくは１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約２０分保持する条件が挙げられる。
【００３０】
次に、水熱処理時間がフコイダンの硫酸基に及ぼす影響について、赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを測定することにより調べた。フコイダン水溶液および水熱処理装置は実施例１および２と同じものであった。処理温度１２０℃で５分保持、ならびに処理温度１４０℃で１０分、２０分、４０分および６０分保持して、得られた低分子化フコイダンのＩＲスペクトルを取り、Ｓ＝Ｏ伸縮振動に関連する吸収パターンの変化を調べた。結果を図３に示す。
【００３１】
処理時間４０分（１４０℃）まではＩＲ吸収スペクトルのパターンに変化が見られなかったが、処理時間６０分以上（１４０℃）では図３中矢印で示すＳ＝Ｏ伸縮振動の吸収パターン（および破線で示す領域の吸収スペクトルのパターン）に変化が認められた。これらの結果から、低分子化フコイダンの硫酸基の脱離を含む構造変化がない処理時間の上限は、処理温度が１４０℃の場合には４０分以上６０分未満であることがわかった。したがって、ＩＲ吸収スペクトルのパターンにて確認される硫酸基の脱離を含む構造変化がないもう１つの処理条件としては１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分未満、好ましくは約５分ないし約４０分保持する条件が挙げられる。
【００３２】
上と同じフコイダン水溶液（ｐＨ無調整、ｐＨ５．２）について、水熱処理温度と処理時間を変えて実験を行った場合のＭｗ、Ｍｎ、Ｍｗ／Ｍｎ、ＤＳ、ＩＲスペクトルの変化を表４に、ＭｗおよびＩＲスペクトルのパターンの変化を図４にまとめた。１４０℃で６０分、１５０℃で４０分、１６０℃で２０分および１８０℃で２０分の水熱処理でＩＲ吸収パターンに変化が見え始め（わずかな変化、＋−）、あるいは観察された（＋）。
【表４】
【００３３】
これらの結果をまとめると、ｐＨ無調整で水熱処理して得られた低分子化フコイダンのＩＲ吸収スペクトルのパターンの変化およびＤＳ値から判断した場合に、低分子化フコイダンの構造変化と硫酸基の脱離を伴わない水熱処理の条件としては、１００℃ないし約１６０℃未満で約５分ないし約２０分未満保持する条件、１００℃ないし１５０℃未満で約５分ないし約４０分未満保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分未満保持する条件、１００℃ないし約１２０℃で約５分ないし１２０分未満保持する条件が挙げられ、さらに好ましくは、１００℃ないし約１５０℃で約５分ないし約２０分保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約４０分保持する条件を挙げることができる。したがって、例えば、上記水熱条件によりＭｗ、Ｍｎが数万〜数千の、硫酸基が脱離していない低分子化フコイダンが得られる。
【実施例４】
【００３４】
実施例４ 水熱反応前にｐＨ調節をした場合
水熱処理前に酢酸水溶液（ｐＨ５．２未満のｐＨに調節）または水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ５．２よりも高いｐＨに調節）でｐＨを３．２〜１２に調節した。ｐＨ調節後１４０℃で２０分水熱処理を行った場合のＭｗ、Ｍｎ、Ｍｗ／Ｍｎ、ＤＳ、ＩＲスペクトルの変化を表５に、ｐＨとＭｗの関係を図５に示す。
【表５】
【００３５】
ｐＨ３．４および３．２の条件で水熱処理した場合、溶液中に不溶部が認められた。ｐＨ７前後ではフコイダンの低分子化の著しい遅延は認められず、処理速度をある程度早く保ちながらも上手く分子量を制御できることがわかった。水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨが酸性側（４、３．４、３．２）の場合、フコイダンの低分子化速度が大きくなる。しかし、ｐＨ３．４および３．２では処理後の水溶液に不溶部が生じた。また、水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨがアルカリ性側（例えばｐＨ９、１０、１１、１２）の場合には、フコイダンの低分子化速度の抑制効果が顕著となったが、ｐＨ９〜１２の範囲では、フコイダンの低分子化速度にあまり差はなかった。上記の実験においてｐＨ５．２〜１２では、低分子化フコイダンのＩＲ吸収スペクトルの変化は認められなかった。ｐＨ４以下のものはＩＲスペクトルのわずかな変化が見られた。
【実施例５】
【００３６】
実施例５ 水熱反応前にｐＨ７に調節した場合
実施例４におけるｐＨ７の条件での水熱反応について、水熱処理温度と処理時間を変えて実験を行った場合のＭｗ、Ｍｎ、Ｍｗ／Ｍｎ、ＤＳ、ＩＲスペクトルの変化を表６および図６にまとめた。
【表６】
【００３７】
ｐＨ７での水熱処理では１４０℃で６０分の処理によってもＩＲ吸収スペクトルのパターンに変化は見られなかった。ＤＳ値もほぼ同じであった。したがって、例えば、ｐＨ７で水熱処理を約１４０℃、約５分〜約６０分行うことによって、Ｍｗ約９９０００〜約１３０００、Ｍｎ約２５０００〜約６０００の、硫酸基が脱離していない低分子化フコイダンが得られる。ｐＨ７での１６０℃で２０分、および１８０℃で２０分の水熱処理により、低分子化フコイダンのＩＲ吸収パターンに変化が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法を提供する。したがって、本発明の方法ならびにそれにより得られる低分子化フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、水熱処理温度と得られる低分子化フコイダンの分子量の関係を示す。
【図２】図２は、水熱処理温度による低分子化フコイダンのＩＲスペクトルの変化を示す。
【図３】図３は、水熱処理時間による低分子化フコイダンのＩＲスペクトルの変化を示す。
【図４】図４は、水熱処理前にｐＨを調節せずに（水熱処理前のｐＨ５．２）水熱処理温度および水熱処理時間を変化させて水熱処理を行った場合の低分子化フコイダンのＭｗおよびＩＲスペクトルのパターンの変化を示す。
【図５】図５は、１４０℃で２０分水熱処理を行った場合のｐＨとＭｗの関係を示す。
【図６】図６は、水熱処理前にｐＨを７．０に調節して水熱処理温度および水熱処理時間を変化させて水熱処理を行った場合の低分子化フコイダンのＭｗおよびＩＲスペクトルのパターンの変化を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化フコイダンの製造方法に関する。詳細には、水熱反応を用いることにより硫酸基の脱離を伴わずにフコイダンを低分子化させることを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物質であるフコイダンは、オキナワモズク、モズク、ワカメ、昆布などの褐藻海草類に含まれる「ぬめり」成分であり、癌細胞の死滅、免疫系の調節、組織再生の促進など、様々な生物活性を有することが明らかになっている。また、フコイダンは肌を引き締める作用を有していたり、保湿作用を有していたりすることから、化粧品にも利用されている。このように、フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの原料あるいは成分として需要が増大している。
【０００３】
このようにフコイダンは有用な活性を示すが、高分子であるため粘度が高く、取り扱いの点で問題があった。また高分子のままでは体内に摂取された場合に吸収が悪いことが多い。さらに、天然物質であるフコイダンは分子量が不均一なために生理活性が一定でなく、健康食品、機能性食品、サプリメントおよび医薬品などに使用した場合に、効果にばらつきが出てしまう。さらに分子量が不均一で分布が広いと、他の夾雑物質を除去して純度を上げることも難しくなる。このような欠点をなくすために酵素処理、酸加水分解などにより低分子化させる試みがなされてきた（特許文献１等参照）。粘度が低く体内への吸収が良い低分子化フコイダンの分子量は数百〜数万の範囲といわれている。しかも、低分子化フコイダンがその生理活性を発揮するためには硫酸基が保持されていることが必要である。しかしながら、上記のような性質の低分子化フコイダンを得るために、酵素処理では反応時間が長くなりコストも高くつく、酸加水分解では硫酸基の保持率が低い、あるいはこれらの方法では生成物の分子量の制御が困難である等の欠点があった。
【０００４】
また、水熱処理により多糖類を低分子化させる試みもあったが（特許文献２等参照）、硫酸基の脱離に関して検討したものではなく、ましてやフコイダンの硫酸基の脱離が伴わない水熱処理に言及した例はない。
【特許文献１】特開平７−２１５９９０号公報
【特許文献２】特開２００５−１１０６７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、低分子化後の硫酸基の脱離が伴わない低分子化フコイダンの製造方法を提供することが、本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ねた。そして、水熱反応を用いることにより硫酸基の脱離を伴わずにフコイダンを低分子化できることを見出した。さらに本発明者らは、フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近に調整後、水熱反応に供することで低分子化を抑制することにより、分子量制御が格段に容易になることも見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は：
（１）硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法であって、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法；
（２）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（３）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１５０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約４０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（４）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約６０分未満保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（５）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１５０℃の水熱条件下に約５分ないし約２０分保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（６）ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃の水熱条件下に約５分ないし約４０分保つことを特徴とする（１）記載の方法；
（７）水熱処理前にフコイダンの水溶液のｐＨを約５．５〜約１２に調節し、フコイダンの低分子化を抑制しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法；
（８）該水熱反応が、硫酸基が脱離しない水熱条件下で行われることを特徴とする（７）記載の方法；
（９）約５．５よりも高いｐＨないしｐＨ１２に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分保つことを特徴とする（８）記載の方法；
（１０）ｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約２０分未満保つことを特徴とする（８）の方法；
（１１）ｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に約５分ないし約６０分保つことを特徴とする（８）記載の方法；
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法により得ることのできる低分子化フコイダン
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、低分子化後の硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法が提供される。本発明の方法により得られる低分子化フコイダンは、生物学的活性に必要な硫酸基が脱離しておらず分子量も揃っている。それゆえ、本発明により得られる低分子化フコイダンは活性が保持されていて、そのばらつきが少なく、しかも低分子であるので吸収がよい。しかも不快な風味を有しない。したがって、本発明により得られる低分子化フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などにおける使用に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、フコイダンを水熱処理に付して加水分解することにより低分子化させる方法を提供するものである。さらに本発明は、フコイダンの水溶液を水熱処理に付す前に、水溶液のｐＨを中性付近に調整することにより低分子化を抑制して、低分子化フコイダンの分子量制御を容易ならしめる方法も提供する。水熱処理を用いることにより、あるいはそれに加えて水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを調節することにより、他の方法に伴う欠点、例えば、酵素処理では反応時間が長くなりコストも高くつく、酸加水分解では硫酸基の保持率が低い、あるいはこれらの方法では生成物の分子量の制御が困難である等の欠点が克服される。換言すれば、本発明の方法は、安価かつ短時間の処理にて低分子化フコイダンが得られ、しかも低分子化フコイダンの分子量制御が容易で、低分子化後の硫酸基の脱離が伴わないという優れた方法である。
【００１０】
本発明の方法において、フコイダンは精製品であってもよく、粗精製品または部分精製品であってもよく、蛋白類、脂質類、他の糖類などの夾雑物質を含むものであってもよい。例えば、もずくなどの海草類をそのまま、あるいはそれらの粗抽出物をフコイダンとして本発明の方法に使用してもよい。本発明において、フコイダンは水溶液として処理される。フコイダンを水だけに溶解させてフコイダン水溶液としてもよく、フコイダンを塩類などの他の物質が含まれている水に溶解させてフコイダン水溶液を調製してもよい。
【００１１】
一般に、水熱処理は亜臨界水（１００℃ないし３７４℃の温度で、１気圧ないし２２ＭＰａの圧力）を用いて行われるものであるが、本発明の方法においては、水熱処理による低分子化の際にフコイダンの硫酸基の脱離が伴わないような温度範囲（圧力範囲）および処理時間の範囲とすることが必要である。本発明の方法においてフコイダンを有意に低分子化させるためには、以下に述べる各温度には約５分以上保持することが好ましい。フコイダンの低分子化を確認するには、例えばゲルろ過カラムクロマトグラフィー法などを用いることができる。
【００１２】
水熱処理によるフコイダンの低分子化において、水熱処理温度が高いほど、そして水熱処理時間が長いほど、フコイダンの低分子化が促進され、得られる低分子化フコイダンの分子量が小さくなる。しかし、水熱処理温度が高いほど、そして水熱処理時間が長いほど、硫酸基の脱離が起こりやすくなる。また、水熱処理温度が低いほど、そして水熱処理時間が短いほど、フコイダンの低分子化が進まず、得られる低分子化フコイダンの分子量が大きくなる。当業者は、所望の分子量の、硫酸基が脱離していない低分子化フコイダンを得るための水熱条件を通常の実験によって、容易に定めうる。
【００１３】
一般的には、フコイダンの硫酸基の量は元素分析またはバリウム沈殿法などの公知の方法にて測定することができる。元素分析またはバリウム沈殿法で測定した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が実質的に脱離しない（約９５％以上の硫酸基が残存している）水熱処理条件（水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを調節しない）としては、例えば、１００℃ないし約１８０で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１６０℃で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分保持する条件等が例示されるが、これらの条件に限定されない。
【００１４】
さらに好ましくは、そしてさらに厳密には、本発明の水熱処理にて得られた低分子化フコイダンの赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを調べ、ピラノース環由来のＩＲ吸収スペクトル（１１００ｃｍ−１）のパターンが水熱処理前後で変化しなければ、糖の骨格構造に変化がないと判断し、吸収スペクトルのパターンが変化していればフコイダンの化学構造の可能性があると判断する。さらに、イオウの結合に関連した吸収スペクトルのパターン（１３００ｃｍ−１）のピーク変化も観察することが好ましい。本発明において、ＩＲ吸収スペクトルのパターンの変化で判断した場合に、低分子化フコイダンの構造変化を伴わない水熱処理の条件（水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを調節しない）としては、１００℃ないし約１６０℃未満で約５分ないし約２０分未満保持する条件、１００℃ないし１５０℃未満で約５分ないし約４０分未満保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分未満保持する条件、１００℃ないし約１２０℃で約５分ないし１２０分未満保持する条件が挙げられ、さらに好ましくは、１００℃ないし約１５０℃で約５分ないし約２０分保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約４０分保持する条件が挙げられるが、これらの条件に限定されない。
【００１５】
さらに本発明は、フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調節し、次いで、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法を提供する。フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調節してから水熱処理に付すことによって、フコイダンの低分子化を抑制しつつ、反応を行うことができる。これにより、得られる低分子化フコイダンの分子量の制御が容易になり、所望の分子量のものをより確実に得ることができる。
【００１６】
フコイダンの水溶液のｐＨは、調節しない場合は弱酸性領域（典型的には約５〜約５．５付近）にあるのが通常である。本発明においてフコイダンの水溶液のｐＨを中性付近に調節する場合において、中性付近〜アルカリ性のｐＨは約５．５〜約１２であり、好ましくはｐＨ７付近、例えばｐＨ約６〜約８、さらに好ましくはｐＨ約６．５〜約７．５に調節して水熱処理を行う。この場合、低分子化の著しい遅延は認められず、処理速度をある程度早く保ちながらも上手く分子量を制御できる。水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨが酸性側（約５未満、例えばｐＨ４）だと、フコイダンの低分子化速度が大きくなる。しかし、ｐＨ４未満（例えばｐＨ約３．４あるいはそれ以下）だと、フコイダンが溶けにくくなり、沈殿が生じる、あるいは水熱処理により着色する、フコイダンが分解する等の弊害が生じる。また、水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨがアルカリ性側（例えばｐＨ約９あるいはそれ以上）の場合には、フコイダンの低分子化速度の抑制効果が顕著となる。しかし、ｐＨ９〜１２の範囲では、フコイダンの低分子化速度にあまり差はない。
【００１７】
フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近にするには塩基を水溶液に添加するのが通常である、塩基は当業者によく知られており、適宜選択することができる。典型的には塩基の水溶液を用意し、ｐＨをモニターしながら除々にフコイダン水溶液に滴下して所望のｐＨにすることができる。塩基としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの金属炭酸水素塩などが挙げられるが、食品や医薬品に適用することを考慮すると、フコイダンと不要な反応をしない、毒性や着色の問題がない、風味を損なわないものが好ましく、このような塩基の例として水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられる。
【００１８】
フコイダンの水溶液のｐＨを中性付近〜アルカリ性に調節してから水熱処理に付す場合において、元素分析またはバリウム沈殿法で測定した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が実質的に脱離しない（約９５％以上の硫酸基が残存している）条件、ならびにＩＲ吸収スペクトルのパターンの変化で判断した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が脱離していない水熱処理の条件は、ｐＨ無調整の場合とほぼ同じである。そのような低分子化フコイダンを得るための水熱条件としては、約５．５よりも高いｐＨないしｐＨ約１２に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分保つ条件、ｐＨ７付近、例えばｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１６０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分未満保つ条件、あるいはｐＨ７付近、例えばｐＨ約６〜約８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし約１４０℃の水熱条件下に５分ないし６０分保つ条件が挙げられるが、これらの条件に限定されない。
【００１９】
本発明の水熱処理に用いる装置は、試料を上記温度範囲に上記時間保持できるものであればいずれの装置であってもよい。例えば、各種のオートクレーブ用装置や圧力釜のように加圧下で試料を一定温度に保持できる装置が公知であり、市販されているので、それらを用いてもよい。このような装置はあまり高価なものではなく、ランニングコストも比較的安い。また、このような装置は大型化も容易であるので、本発明によれば、安価かつ大量に低分子化フコイダンを得ることができる。また、上記以外の装置として温度調節が可能なプレッシャークッカーなどの装置を本発明の方法に用いてもよい。
【００２０】
上述のように、本発明の方法においては、水熱処理温度および／または水熱処理時間を変化させることにより、あるいはそれに加えて水熱処理前にフコイダン水溶液のｐＨを中性付近に調節することにより、得られるフコイダンの分子量を容易に調節・制御することができる。水熱処理温度が高いほど得られるフコイダンが低分子化し、水熱処理時間が長いほど得られるフコイダンが低分子化する。本発明の方法によれば、上記条件を適宜選択することによって、平均分子量約１万以上約３０万未満の範囲の低分子化フコイダンを容易に得ることができる。しかも、本発明の方法により得られる低分子化フコイダンは不快な味、臭いがなく、しかもフコイダンとしての諸活性を保持しているので、食品（特に機能性食品、健康食品など）や医薬品に好適である。したがって、本発明は、上記低分子化方法により得られた低分子化フコイダンを含む飲食物および医薬品も提供する。
【００２１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２２】
実施例１ 分子量に及ぼす処理温度の影響
フコイダン（海産物のきむらや製）８００ｍｇを水８０ｍｌに溶解してフコイダン水溶液を調製し（ｐＨ無調整、ｐＨ５．２であった）、処理温度を１２０℃、１４０℃、１６０℃、１８０℃として、各温度に２０分保持した。水熱処理装置としてＨＴＰ−５０／２５０（日阪製作所製）を用いた。低分子化したフコイダン試料をＨＰＬＣによるゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）にて分析した。分析条件は以下のとおり。カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ５２０＋ＧＳ３２０＋ＧＳ２２０、溶出液：０．１Ｍ ＮａＮＯ３、流速：１．０ｍｌ／分、検出：ＲＩＤ、カラム温度：４０℃、検量線標品：プルランスタンダード。
【００２３】
結果を図１および表１に示す。処理温度が高くなるにつれ、フコイダンの分子量が低下した。処理温度と分子量の関係はなめらかであった。本発明の方法によれば処理温度を変化させることによって所望の分子量のフコイダンが容易に得られることがわかった。また、いずれの反応系においてもＧＰＣチャートのベースラインが低く平坦であり、ピークの形が左右対称に近く、クロマトグラフィー装置等を用いて所望の分子量のフコイダンを分取できることもわかった。データは示していないが、処理時間を変化させることによっても所望の分子量のフコイダンを分取できる。
【表１】
表中、Ｍｗは重量平均分子量を、Ｍｎは数平均分子量を示す。処理温度を上昇させるにつれ、ＭｗおよびＭｎの値が小さくなり、平均分子量が減少していることが示された。
【実施例２】
【００２４】
実施例２ 硫酸基の置換度に及ぼす処理温度の影響
実施例と同じフコイダン水溶液および水熱処理装置を用いて、処理温度を１４０℃、１６０℃、１８０℃とし、各温度に２０分保持した後、元素分析法にて分析を行い、低分子化フコイダンの硫酸基の置換度（ＤＳ）を調べた。結果を表２に示す。
【００２５】
再沈殿はアセトンまたはエタノール添加により行ったものである。透析は分画分子量５００の透析膜を用いて得られたものである。表２からわかるように、いずれの温度で処理を行った場合でも、そして、いずれの画分においても、低分子化フコイダンのＤＳと未処理フコイダンのＤＳとの間で有意な差異は認められなかった。したがって、元素分析法を用いて調べた場合、上記の水熱処理条件下では、水熱処理による低分子化フコイダンの硫酸基の脱離は認められなかったといえる。
【表２】
【００２６】
さらに、元素分析法に加えてバリウム沈殿法によっても、本発明の方法による低分子化フコイダンの硫酸基の量を調べた。水熱処理条件は１４０℃に６０分保持であった。実験を２系で行った。結果を表３に示す。元素分析法、バリウム沈殿法にいずれの分析方法を用いても、上記の水熱処理条件下では、ＤＳおよび硫酸基含有率に有意な差異は認められなかった。
【表３】
【００２７】
したがって、元素分析および／またはバリウム沈殿法で測定した場合に低分子化フコイダンの硫酸基が実質的に脱離しない条件の例としては、例えば、１００℃ないし約１８０で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１６０℃で約５分ないし約２０分、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分保持する条件を挙げることができる。
【実施例３】
【００２８】
実施例３ ＩＲ吸収スペクトル法による硫酸基脱離の有無の検討
水熱処理温度がフコイダンの硫酸基に及ぼす影響について、赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを測定することにより調べた。フコイダン水溶液および水熱処理装置は実施例１および２と同じものであった。１２０℃、１４０℃、１６０℃および１８０℃の各温度に試料を２０分保持して、得られた低分子化フコイダンのＩＲスペクトルを取り、Ｓ＝Ｏ伸縮振動に関連する吸収パターンの変化を調べた。結果を図２に示す。
【００２９】
処理温度１４０℃まではＩＲ吸収スペクトルのパターンに変化が見られなかったが、処理温度１６０℃以上では図２中矢印で示す糖骨格であるピラノース環およびＳ＝Ｏ伸縮振動の吸収スペクトルのパターン（および破線で示す領域の吸収スペクトルのパターン）に変化が認められた。これらの結果から、低分子化フコイダンの硫酸基の脱離を含む構造変化がない上限温度は、２０分保持の場合には１４０℃以上１６０℃未満であることがわかった。したがって、ＩＲ吸収スペクトルのパターンにて確認される硫酸基の脱離を含む構造変化がない処理条件としては１００℃ないし約１６０℃未満、好ましくは１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約２０分保持する条件が挙げられる。
【００３０】
次に、水熱処理時間がフコイダンの硫酸基に及ぼす影響について、赤外吸収（ＩＲ）スペクトルを測定することにより調べた。フコイダン水溶液および水熱処理装置は実施例１および２と同じものであった。処理温度１２０℃で５分保持、ならびに処理温度１４０℃で１０分、２０分、４０分および６０分保持して、得られた低分子化フコイダンのＩＲスペクトルを取り、Ｓ＝Ｏ伸縮振動に関連する吸収パターンの変化を調べた。結果を図３に示す。
【００３１】
処理時間４０分（１４０℃）まではＩＲ吸収スペクトルのパターンに変化が見られなかったが、処理時間６０分以上（１４０℃）では図３中矢印で示すＳ＝Ｏ伸縮振動の吸収パターン（および破線で示す領域の吸収スペクトルのパターン）に変化が認められた。これらの結果から、低分子化フコイダンの硫酸基の脱離を含む構造変化がない処理時間の上限は、処理温度が１４０℃の場合には４０分以上６０分未満であることがわかった。したがって、ＩＲ吸収スペクトルのパターンにて確認される硫酸基の脱離を含む構造変化がないもう１つの処理条件としては１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分未満、好ましくは約５分ないし約４０分保持する条件が挙げられる。
【００３２】
上と同じフコイダン水溶液（ｐＨ無調整、ｐＨ５．２）について、水熱処理温度と処理時間を変えて実験を行った場合のＭｗ、Ｍｎ、Ｍｗ／Ｍｎ、ＤＳ、ＩＲスペクトルの変化を表４に、ＭｗおよびＩＲスペクトルのパターンの変化を図４にまとめた。１４０℃で６０分、１５０℃で４０分、１６０℃で２０分および１８０℃で２０分の水熱処理でＩＲ吸収パターンに変化が見え始め（わずかな変化、＋−）、あるいは観察された（＋）。
【表４】
【００３３】
これらの結果をまとめると、ｐＨ無調整で水熱処理して得られた低分子化フコイダンのＩＲ吸収スペクトルのパターンの変化およびＤＳ値から判断した場合に、低分子化フコイダンの構造変化と硫酸基の脱離を伴わない水熱処理の条件としては、１００℃ないし約１６０℃未満で約５分ないし約２０分未満保持する条件、１００℃ないし１５０℃未満で約５分ないし約４０分未満保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約６０分未満保持する条件、１００℃ないし約１２０℃で約５分ないし１２０分未満保持する条件が挙げられ、さらに好ましくは、１００℃ないし約１５０℃で約５分ないし約２０分保持する条件、１００℃ないし約１４０℃で約５分ないし約４０分保持する条件を挙げることができる。したがって、例えば、上記水熱条件によりＭｗ、Ｍｎが数万〜数千の、硫酸基が脱離していない低分子化フコイダンが得られる。
【実施例４】
【００３４】
実施例４ 水熱反応前にｐＨ調節をした場合
水熱処理前に酢酸水溶液（ｐＨ５．２未満のｐＨに調節）または水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ５．２よりも高いｐＨに調節）でｐＨを３．２〜１２に調節した。ｐＨ調節後１４０℃で２０分水熱処理を行った場合のＭｗ、Ｍｎ、Ｍｗ／Ｍｎ、ＤＳ、ＩＲスペクトルの変化を表５に、ｐＨとＭｗの関係を図５に示す。
【表５】
【００３５】
ｐＨ３．４および３．２の条件で水熱処理した場合、溶液中に不溶部が認められた。ｐＨ７前後ではフコイダンの低分子化の著しい遅延は認められず、処理速度をある程度早く保ちながらも上手く分子量を制御できることがわかった。水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨが酸性側（４、３．４、３．２）の場合、フコイダンの低分子化速度が大きくなる。しかし、ｐＨ３．４および３．２では処理後の水溶液に不溶部が生じた。また、水熱処理前のフコイダンの水溶液のｐＨがアルカリ性側（例えばｐＨ９、１０、１１、１２）の場合には、フコイダンの低分子化速度の抑制効果が顕著となったが、ｐＨ９〜１２の範囲では、フコイダンの低分子化速度にあまり差はなかった。上記の実験においてｐＨ５．２〜１２では、低分子化フコイダンのＩＲ吸収スペクトルの変化は認められなかった。ｐＨ４以下のものはＩＲスペクトルのわずかな変化が見られた。
【実施例５】
【００３６】
実施例５ 水熱反応前にｐＨ７に調節した場合
実施例４におけるｐＨ７の条件での水熱反応について、水熱処理温度と処理時間を変えて実験を行った場合のＭｗ、Ｍｎ、Ｍｗ／Ｍｎ、ＤＳ、ＩＲスペクトルの変化を表６および図６にまとめた。
【表６】
【００３７】
ｐＨ７での水熱処理では１４０℃で６０分の処理によってもＩＲ吸収スペクトルのパターンに変化は見られなかった。ＤＳ値もほぼ同じであった。したがって、例えば、ｐＨ７で水熱処理を約１４０℃、約５分〜約６０分行うことによって、Ｍｗ約９９０００〜約１３０００、Ｍｎ約２５０００〜約６０００の、硫酸基が脱離していない低分子化フコイダンが得られる。ｐＨ７での１６０℃で２０分、および１８０℃で２０分の水熱処理により、低分子化フコイダンのＩＲ吸収パターンに変化が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、安価かつ短時間の処理で済み、しかも分子量制御が容易で、硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法を提供する。したがって、本発明の方法ならびにそれにより得られる低分子化フコイダンは、健康食品、機能性食品、サプリメント、化粧品および医薬品などの分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、水熱処理温度と得られる低分子化フコイダンの分子量の関係を示す。
【図２】図２は、水熱処理温度による低分子化フコイダンのＩＲスペクトルの変化を示す。
【図３】図３は、水熱処理時間による低分子化フコイダンのＩＲスペクトルの変化を示す。
【図４】図４は、水熱処理前にｐＨを調節せずに（水熱処理前のｐＨ５．２）水熱処理温度および水熱処理時間を変化させて水熱処理を行った場合の低分子化フコイダンのＭｗおよびＩＲスペクトルのパターンの変化を示す。
【図５】図５は、１４０℃で２０分水熱処理を行った場合のｐＨとＭｗの関係を示す。
【図６】図６は、水熱処理前にｐＨを７．０に調節して水熱処理温度および水熱処理時間を変化させて水熱処理を行った場合の低分子化フコイダンのＭｗおよびＩＲスペクトルのパターンの変化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法であって、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法。
【請求項２】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１６０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１５０℃未満の水熱条件下に５分ないし４０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし６０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１５０℃の水熱条件下に５分ないし２０分保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃の水熱条件下に５分ないし４０分保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
水熱処理前にフコイダンの水溶液のｐＨを５．５〜１２に調節し、フコイダンの低分子化を抑制しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法。
【請求項８】
該水熱反応が、硫酸基が脱離しない水熱条件下で行われることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
５．５よりも高いｐＨないしｐＨ１２に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分保つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ｐＨ６〜８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし１６０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分未満保つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ６〜８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし６０分保つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により得ることのできる低分子化フコイダン。
【請求項１】
硫酸基の脱離を伴わない低分子化フコイダンの製造方法であって、硫酸基が脱離しない水熱条件下にフコイダンの水溶液を保持することを特徴とする方法。
【請求項２】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１６０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１５０℃未満の水熱条件下に５分ないし４０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし６０分未満保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１５０℃の水熱条件下に５分ないし２０分保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
ｐＨ無調節のフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃の水熱条件下に５分ないし４０分保つことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
水熱処理前にフコイダンの水溶液のｐＨを５．５〜１２に調節し、フコイダンの低分子化を抑制しつつ水熱反応を行うことを特徴とする、低分子化フコイダンの製造方法。
【請求項８】
該水熱反応が、硫酸基が脱離しない水熱条件下で行われることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
５．５よりも高いｐＨないしｐＨ１２に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分保つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ｐＨ６〜８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし１６０℃未満の水熱条件下に５分ないし２０分未満保つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ６〜８に調節したフコイダンの水溶液を１００℃ないし１４０℃未満の水熱条件下に５分ないし６０分保つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により得ることのできる低分子化フコイダン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２６６２９９（Ｐ２００８−２６６２９９Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０５３４（Ｐ２００８−５０５３４）
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学省都市エリア産学官連携促進事業「染色体工学技術等による生活習慣病予防食品評価システムの構築と食品等の開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【出願人】（３０７０１６１８０）地方独立行政法人鳥取県産業技術センター (32)
【出願人】（３９００１６９５３）株式会社海産物のきむらや (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２９日（２００８．２．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、文部科学省都市エリア産学官連携促進事業「染色体工学技術等による生活習慣病予防食品評価システムの構築と食品等の開発」に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【出願人】（３０７０１６１８０）地方独立行政法人鳥取県産業技術センター (32)
【出願人】（３９００１６９５３）株式会社海産物のきむらや (9)
【Ｆターム（参考）】
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