磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体及びその製造方法
【課題】酵素固定化用担体としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能なキトサン系酵素固定化用担体、及びこれを効率よく製造する方法を提供する。
【解決手段】第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子が、ある範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させてなる、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体であって、そして、粒状多孔質架橋キトサンを、第一鉄イオンと第二鉄イオンを含む鉄イオン溶液中に添加混合した後、アルカリ水溶液により処理し、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させることを特徴とする磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体の製造方法。
【解決手段】第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子が、ある範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させてなる、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体であって、そして、粒状多孔質架橋キトサンを、第一鉄イオンと第二鉄イオンを含む鉄イオン溶液中に添加混合した後、アルカリ水溶液により処理し、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させることを特徴とする磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素固定化用担体としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能な磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素をバイオリアクターやバイオセンサーに利用する場合、酵素を繰り返し利用すべく、溶媒不溶性にする固定化技術が用いられる。固定化法としては、酵素を直接架橋し、不溶化する方法もあるが、ガラス、アルミナ、シリカゲル、セルロース及びその誘導体、キトサン及びその誘導体、合成イオン交換樹脂などの酵素固定化用担体と複合化する系が主流である。特にキトサン及びその誘導体は、分子内に多様な官能基を有するため、酵素が静電的、あるいは物理的に吸着、固定化しやすく、しかも、変性や失活が起こりにくいので、近年、その利用例が増えつつある。中でも、本出願人らが開示している粒状多孔質化し架橋化したキトサン系の担体(特許文献１参照)は、粒子内での物質拡散性、および物理的強度にも優れたものとして、広く使用されている。
【０００３】
他方、固定化酵素と反応生成物の分離・回収を、迅速かつ容易に行いたいという要望が、スケールアップや実用化における使い勝手の面からあり、磁力により回収すべく、磁性を付与した酵素固定化用担体を用いる方法が開示されている（特許文献２、３参照）。キトサンに磁性を付与し、酵素固定化用担体とする方法については、キトサンを酸性水溶液に溶解し、このキトサン溶液に磁性を有する粒子を分散させ、この分散液を塩基性溶液により中和して成形するといった提案がいくつかなされている（特許文献４、５参照）。
【特許文献１】特公昭６３-５４２８５号公報
【特許文献２】特開平５−２６８９６１号公報
【特許文献３】特開平１０−７５７８０号公報
【特許文献４】特公平６−５１１１４号公報
【特許文献５】特開平１７−２９６９４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の背景技術において、キトサン溶液に磁性を有する粒子を分散させ、この分散液を塩基性溶液により中和して成形したキトサン系酵素固定化用担体は、磁性を有する粒子が担体内部に埋もれて、捕集性能を改善しにくいという欠点がある。しかし、磁性を有する粒子の配合量を上げると、露出した粒子が脱離する、あるいはキトサンが剥離するという問題が生じ、更には、酵素の固定化部位減少や、それに伴う活性低下が起こるといった欠点がある。
したがって、本発明は、酵素固定化用担体等としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能なキトサン系酵素固定化用担体、及びこれを効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の問題点を解決するために、本発明者は、鋭意検討した結果、粒状多孔質架橋キトサンに第一鉄イオンおよび第二鉄イオンの存在下でアルカリ処理する事で、酵素固定化用担体としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能な磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体が得られる事を見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して鉄塩の総モル数が０．４×１０-2ｍｏｌから３．０×１０-2ｍｏｌの範囲で接触させた後、アルカリ溶液で処理して、第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が２％〜２３％の範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させてなる、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体およびその製造方法に係るものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、固定化酵素活性に優れた粒状多孔質架橋キトサンをベースに用いているので、良好な酵素反応を得ることができる上、磁性化を後処理により付与している為、磁性体が系全体に均一且つ微細に分散しており、磁力による捕集能にも優れた性能を発揮できるので、様々なバイオリアクター、バイオセンサーへの応用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明における粒状多孔質架橋キトサンは、例えば、キトサンを酸性水溶液に溶解した後、該溶液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多孔質キトサンを、エポキシ系やイソシアネート系等の架橋剤により架橋したものであれば、特に限定されない。ここで用いられる架橋剤としては、例えば、ヘキサメチレンビス−（２，３−エポキシプロピルジメチルアンモニウムクロライド）、ヘキサメチレンビス−（２，３−エポキシプロピルジエチルアンモニウムクロライド）、プロピレンビス−（２，３−エポキシプロピルジメチルアンモニウムクロライド）、プロピレンビス−（２，３−エポキシプロピルジエチルアンモニウムクロライド）、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリメチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ヘキサメチレングリコールジグリシジルエーテル、エピクロロヒドリン等のエポキシ系架橋剤や、ヘキサメチレンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、１，４−フェニレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソフォロンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤、などが挙げられる。
【０００８】
また、粒状多孔質架橋キトサンの粒子径は特に限定されるものではないが、大きすぎると表面積が小さくなるので、酵素反応の効率が悪くなり、小さすぎると、処理が困難になることから、７０〜３０００μｍの粒子径であることが好ましく、１２０〜１２００μｍが特に好ましい。
孔径についても大きすぎると表面積が小さくなってしまい酵素反応の効率が悪くなり、小さすぎると、酵素反応における物質の多孔質内拡散速度が低下し、みかけの酵素活性が低下してしまう事から、１００〜７５００オングストロームが好ましく、１０００〜２０００オングストロームが特に好ましい。
【０００９】
本発明における鉄イオン溶液中の、第一鉄イオン、および、第二鉄イオンのイオン源としては、塩酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、および、酢酸塩など、それぞれに相当する汎用、市販の塩であれば、何れも使用できるが、コストや入手簡便性、廃物利用（鋼板の酸洗浄工程で発生する）の観点から、それぞれの塩化物であることが好ましい。
本発明における鉄イオン溶液は、第一鉄イオンと第二鉄イオンの混合水溶液であり、第一鉄イオンと第二鉄イオンの比率としては、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が、３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある事が好ましく、４５ｍｏｌ％〜８０ｍｏｌ％の範囲にあることがより好ましい。第一鉄イオンが３０ｍｏｌ％に満たないと十分な磁力が得られず、磁石に近付けてもその捕集は出来ない。逆に、第一鉄イオンの割合が８０ｍｏｌ％より大きいと磁石で捕集は出来ても酵素の固定化量が減少する。
【００１０】
本発明における塩化第一鉄イオンと塩化第二鉄イオンの混合物の仕込み量は、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して、０．４×１０-2ｍｏｌ以上３×１０-2ｍｏｌ以下の範囲にあり、さらに、灰分率が２％以上２３％以内の範囲にあることが必要である。鉄イオンの総モル量が０．４×１０-2ｍｏｌに満たない場合、若しくは、灰分の増分が２％に満たない場合は、酵素固定化量や固定化酵素活性には問題ないが、磁石を近付けても捕集する性能が不十分となる。また、鉄イオンの総モル量が３×１０-2ｍｏｌを超える場合、若しくは、灰分の増分が２３％を超えた場合は、磁性体の生成斑により、磁性体が脱離しやすくなり、好ましくない。尚、本発明に於ける灰分率とは、後述のように絶乾した磁性化粒子を形成させたキトサン系酵素固定化用担体の重量と、該キトサン系酵素固定化用担体の焼成後残分重量とを測定して得られた値である。
【００１１】
本発明は、上記の粒状多孔質架橋キトサンを、第一鉄イオンと第二鉄イオンを含む鉄イオン溶液中に添加混合するが、添加混合の方法は特に制限されず、鉄イオンが十分に、粒状多孔質架橋キトサンの内部に浸透するようにすればよい。一例を挙げれば、３０〜８０℃位で１００〜３００ストローク／分で振とうしながら１〜６時間程度処理すれば良い。なお、当該処理において、共沈鉄の凝集に伴う沈殿等を抑制するため、保護コロイドとしての役割を担うデキストラン等を系内に加えても良い。
次に、本発明では、上記の添加、混合処理の後、アルカリ水溶液を加え、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させる。このとき用いるアルカリ水溶液としては、従来既存の塩基性物質の水溶液であれば何れも使用できるが、中でも、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液を使用することが好ましい。なお、アルカリ水溶液の量は、反応系のｐＨが８以上になるように適宜選択すればよいが、過度に用いると、粒状多孔質架橋キトサンの架橋基や改質基の脱離、および、孔の収縮が起こり、酵素固定化量が減少することがあるため好ましくない。
アルカリ水溶液を加えた後の処理についても、先の通り、３０〜８０℃位で１００〜３００ストロークで振とうしながら１〜６時間程度処理すれば良い。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。なお、実施例、および、比較例において、反応斑、磁性、キトサン系酵素固定化用担体の形態、灰分率、タンパク質吸着率、および、固定化酵素の固定化率、発現力価、発現率については、以下の方法より測定、または、評価した。
【００１３】
（１） 反応斑（外観評価）
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体の色調を目視観察し、その色斑から反応斑を評価した。色斑が無く均質性に優れる場合は○、色斑はあるが品質的に許容できる範囲内である場合は△、色斑が大きく、品質的に許容できない場合は×として評価した。
（２） 磁石への付着（外観評価）
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体をガラスシャーレに移し、キトサン系酵素固定化用担体が水没するまでＲＯ水を加えた後、磁束密度０．３Ｔの回転子取り出し棒（アズワン社製）を系中に挿入して磁石への付着状況、および、引き寄せられる状況を目視観察により評価した。評価結果は、付着する場合は○、付着しない、あるいは、系外に取り出すことが出来ない場合は×で示した。
（３） 走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体をＲＯ水、メタノール、エタノール、そして、ｔ−ブチルアルコールの順に洗浄、溶媒交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、表面に金をスパッタリングし、日本電子製ＪＳＭ６０６０ＬＶを用いて、５０００倍で観察した。
【００１４】
（４） 灰分率測定
熱風循環式乾燥器中、１０５℃、４時間の条件で絶乾した試料を風袋重量既知のセラミックるつぼに入れた後、電気炉中で６００℃、５時間の条件で灰化した。灰化後は、速やかにデシケータに入れ、デシケータ中で室温まで放冷後、重量を計測し、下式から灰分率を求めた。
灰分率（％）＝焼成残分重量（ｇ）／絶乾試料重量（ｇ）×１００
（５） アルブミンの吸着
０．０１Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．０１Ｍリン酸二水素ナトリウムより調製した０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で置換した各酵素固定化用担体５ｍｌをプラスチック製の密閉容器に量り取り、１％のウシ血清アルブミン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.製）の０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液５０ｍｌを加え、恒温ロータリーシェーカーを使用して、２５℃で４時間振とう（振とう速度：１２５ｒｐｍ）した。
（６） ヘモグロビンの吸着
０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で置換した各酵素固定化用担体５ｍｌをプラスチック製の密閉容器に量り取り、１％のウシ血液由来ヘモグロビン（和光純薬製、試薬特級） の０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液５０ｍｌを加え、恒温ロータリーシェーカーを使用して、２５℃で４時間振とう（振とう速度：１２５ｒｐｍ）した。
（７） タンパク質吸着率の測定
アルブミン、あるいは、ヘモグロビンを所定時間、各酵素固定化用担体に吸着させた後、反応液５ｍLを１０倍に希釈し、分光光度計（島津製作所製ＵＶ-２４５０）を用いて、２８０ｎｍの吸光度より吸着量を測定し、下記の式１に基づいて算出した。
【００１５】
【数１】
【００１６】
〔実施例１〕
粒径８４０〜１，１９０μm、比表面積１１０〜１３０ｍ2／ｇのキトサン系酵素固定化用担体（富士紡ホールディングス社製キトパールＢＣＷ−２５１０）２５ｍＬをプラスチック製の密閉容器に量り取り、スポイトで水分を軽く除去した。ここに、あらかじめ調製しておいた磁性化溶液（塩化第一鉄・四水和物２．７８ｇ（１．４０×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物４．１７ｇ（１．５４×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン１．８１ｇを４０．０ｇのＲＯ水に溶解させた溶液）を全量投入し、良く混合した。次いで、反応系を振とう恒温水槽を用いて６０℃に昇温し、１２５ストローク／分で２時間、浸とう、混合した。所定時間経過後、反応系に２８％アンモニア水（和光純薬製）５．７５ｇを４３．６１ｇのＲＯ水で希釈した溶液を添加し、良く混合した。なお、この時点で系は褐色化した。その後、再び、振とう恒温水槽を用いて反応系を６０℃に昇温し、１２５ストローク／分で１時間、浸とう、混合した。所定時間経過後、系を濾別、水洗して目的物を得た。目的物は、ＲＯ水中、５℃で保管した。
【００１７】
処理前のキトサン系酵素固定化用担体をＳＥＭ観察した様子を図１、得られた目的物をＳＥＭ観察した様子を図２に示す。図１、図２のＳＥＭ写真から分かる様に、処理後もキトサン系酵素固定化用担体が元来有する多孔質構造が、そのまま保持されていた。目的物を焼成、灰化し、灰分率を評価すると２２．４％であった。なお、磁性化前の灰分率はほぼ０であった。このるつぼ残存成分をＳＥＭ観察した様子が図３であるが、焼成により細孔の収縮、消失が起こったものの、その構造は、元の酵素固定化用担体の形状をトレースしていた。磁性化処理後の湿潤にあるキトサン系酵素固定化用担体に磁石を近づけると、担体粒子は図４に示すように磁石に引き寄せられ、付着した。よって、本願の目的の一つである、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体が得られた。
アルブミン、および、ヘモグロビンの吸着率を評価したところ、それぞれ４６．９ｍｇ／ｍｌ、２２．８ｍｇ／ｍｌであり、酵素固定化用担体としての性能を十分に保持していた。よって、本願の目的である磁性と酵素固定可能の同時具備が達せられたといえる。実施例１〜３及び比較例１〜３による磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の性状及び評価結果を、表１にまとめた。
【００１８】
【表１】
【００１９】
尚、アルブミン、および、ヘモグロビンの吸着率は、以下のようにして測定した。
磁性化酵素固定化用担体５ｍｌに対し、ＲＯ水に１５０Ｕの力価を持つように溶解、調製した水溶液（天野エンザイム株式会社製アシラーゼアマノ水溶液）１０ｍｌを加え、室温で２時間振とうしてアシラーゼを固定化した。反応液５ｍｌを系から量り取り、１０倍に希釈した後、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。磁性化酵素固定化用担体を入れずに同様の操作を行ったものをブランクとし、ブランク吸光度との差から固定化アシラーゼ量を求めた。
【００２０】
次に、固定化アシラーゼの活性を調べるために下記の操作を行った。
上記操作により調製したアシラーゼ固定化担体を２８０ｎｍにおける吸光度が０．０２５以下になるまで充分に洗浄し未反応の酵素を除去した。得られた磁性化担体、あるいは、非磁性化担体１ｍｌをスクリュー管に入れ、クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）２ｍｌ、０．５ｍＭ塩化コバルト水溶液１ｍｌを加え、３７℃で５分間反応させた。続いて、基質溶液として、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン溶液１ｍｌを系に加え、試験管ミキサーで攪拌後、３７℃で１５分間反応させた。反応混合物をろ過した後、ろ液から１ｍｌを分取し、３分間８０℃の湯浴中で加熱することにより反応を停止させた。反応液を流水で冷却後、後述する方法で調製したニンヒドリン溶液１ｍｌ、および、第一塩化スズ溶液０．０５ｍｌを加え、９０℃の湯浴中で２０分間強熱した。流水で冷却後、５０％２−プロパノール水溶液を５ｍｌ加え、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素固定化用担体を入れないで同様の操作を行った系をブランクとして用意し、吸光度を測定した。なお、反応に使用したＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、ニンヒドリン溶液、および、第一塩化スズ水溶液は以下の様に調製した。
Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン溶液：Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン（和光純薬工業株式会社製試薬特級、ＭＷ＝１９１．２５）０．４７８ｇを量り、ＲＯ水１０ｍｌと１Ｎ−水酸化ナトリウム液２ｍｌを加え、溶解した。その後、系中にＮ／１０−水酸化ナトリウム液を加えることによって、ｐＨを８．０に調整し、さらにＲＯ水を加え２５ｍｌとした。
ニンヒドリン溶液：ニンヒドリン（和光純薬工業株式会社製アミノ酸自動分析用、８．１４）１．０ｇを量り、２５ｍｌのエチレングリコールモノメチルエーテル（和光純薬工業株式会社製試薬特級、ＭＷ＝７６．１）を加え、溶解した後、クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を２５ｍｌ加えて振とうした。
第一塩化スズ水溶液：塩化第一スズ（和光純薬工業株式会社製試薬特級、ＭＷ＝２２５．６３）０．１ｇを量り、クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を６．２ｍｌ加えて溶解した。
【００２１】
〔実施例２〕
塩化第一鉄・四水和物１．３９ｇ（０．７０×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物２．０９ｇ（０．７７×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン０．９０ｇを４２．５ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。表１に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２２】
〔実施例３〕
塩化第一鉄・四水和物０．７０ｇ（０．３５×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物１．０４ｇ（０．３８×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン０．４５ｇを４３．８ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。表１に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２３】
〔実施例４〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を１．２７ｇ（０．６４×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物を０．４３ｇ（０．１６×１０-2ｍｏｌ）使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行い、本発明の目的を満足する担体を得た。実施例４〜６及び比較例４，５による磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の性状及び評価結果を、表２にまとめた。
【００２４】
【表２】
【００２５】
〔実施例５〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を０．８５ｇ（０．４３×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物を０．８５ｇ（１．２７×１０-2ｍｏｌ）使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。表２に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２６】
〔実施例６〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を０．４３ｇ（０．２２×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物を１．２７ｇ（０．４７×１０-2ｍｏｌ）使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。表２に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２７】
〔実施例７〕
キトサン系酵素固定化用担体として、粒径８４０〜１，１９０μm、比表面積１２０〜１５０ｍ2／ｇのキトサン系酵素固定化用担体（富士紡ホールディングス社製キトパールＢＣＷ−３０１０）を用いた以外、実施例１と同様にして磁性化酵素固定化用担体を作製した。
【００２８】
上記実施例7及び実施例８の方法により得た磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の測定した固定化アシラーゼの活性について、下式に基づき担体試料の固定化率、固定化力価、および発現力化、さらに発現率を数２〜４により算出した。結果、表３から明らかなように、本発明による磁性化担体は、磁性化していない担体と各種性能が同程度であり、磁性化による性能低下がないことが示された。
【００２９】
【数２】
なお、上記式中の各種ファクターは、以下の通りである。
３３０．９４：Ｌ−メチオニンで作成した検量線より求めた吸光度差１．０００となるＬ−メチオニン量
１４９：Ｌ−メチオニン１μｍｏｌに対する重量（μｇ）
１６：試料希釈倍数×単位換算係数
Ｗ：活性測定に用いた固定化酵素担体量（ｇ）
【数３】
【数４】
【００３０】
【表３】
【００３１】
〔実施例８〕
キトサン系酵素固定化用担体として、粒径８４０〜１，１９０μm、比表面積１５０〜２００ｍ2／ｇ）のキトサン系酵素固定化用担体（富士紡ホールディングス社製キトパールＢＣＷ−３５１０）を用いた以外は、実施例７と同様の操作を行い磁性化アシラーゼ固定化担体の性能を評価した。結果、表３から明らかなように、本発明による磁性化担体は、磁性化していない担体と各種性能が同程度であり、磁性化による性能低下がないことが示された。
【００３２】
〔比較例１〕
塩化第一鉄・四水和物１１．１ｇ（５．５８×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物１６．７ｇ（６．１８×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン７．２３ｇを２５．０ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。結果、表１に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３３】
〔比較例２〕
塩化第一鉄・四水和物５．５６ｇ（２．８０×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物８．３５ｇ（３．０９×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン３．６２ｇを３５．０ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。結果、表１に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３４】
〔比較例３〕
塩化第一鉄・四水和物０．３５ｇ（０．１８×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物０．５０ｇ（０．１８×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン０．２３ｇを４４．４ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。結果、表１に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３５】
〔比較例４〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物１．７０ｇ（０．８６×１０-2ｍｏｌ）のみ使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。結果、表２に示す様に、磁性化は可能であったが、ヘモグロビンの吸着率が低下し、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３６】
〔比較例５〕
鉄イオン源として、塩化第二鉄・六水和物１．７０ｇ（０．６３×１０-2ｍｏｌ）のみ使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。結果、表２に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
キトサン系酵素固定化用担体には様々な官能基を導入させることが出来るため、性質の異なる個々の酵素に対応させることが可能である。さらに、酵素の固定化方法も吸着法、架橋法、活性化法の３種より適宜選択することができ、糖質、タンパク質関連酵素の固定化などにおいて、安定性の高い固定化方法を選択可能である。本発明によって得られた担体は、上述したキトサンの酵素固定化能を持ちつつ、磁力による反応生成物との分離、および、固定化酵素の回収が容易であり、酵素反応を必要とする様々な用途に使用、応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】処理前のキトサン系酵素固定化用担体の断面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】本発明によるキトサン系酵素固定化用担体の断面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】本発明によるキトサン系酵素固定化用担体を焼成、灰化した後のるつぼ残存成分の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】本発明によるキトサン系酵素固定化用担体が磁石に引き寄せられ、付着する様子を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素固定化用担体としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能な磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素をバイオリアクターやバイオセンサーに利用する場合、酵素を繰り返し利用すべく、溶媒不溶性にする固定化技術が用いられる。固定化法としては、酵素を直接架橋し、不溶化する方法もあるが、ガラス、アルミナ、シリカゲル、セルロース及びその誘導体、キトサン及びその誘導体、合成イオン交換樹脂などの酵素固定化用担体と複合化する系が主流である。特にキトサン及びその誘導体は、分子内に多様な官能基を有するため、酵素が静電的、あるいは物理的に吸着、固定化しやすく、しかも、変性や失活が起こりにくいので、近年、その利用例が増えつつある。中でも、本出願人らが開示している粒状多孔質化し架橋化したキトサン系の担体(特許文献１参照)は、粒子内での物質拡散性、および物理的強度にも優れたものとして、広く使用されている。
【０００３】
他方、固定化酵素と反応生成物の分離・回収を、迅速かつ容易に行いたいという要望が、スケールアップや実用化における使い勝手の面からあり、磁力により回収すべく、磁性を付与した酵素固定化用担体を用いる方法が開示されている（特許文献２、３参照）。キトサンに磁性を付与し、酵素固定化用担体とする方法については、キトサンを酸性水溶液に溶解し、このキトサン溶液に磁性を有する粒子を分散させ、この分散液を塩基性溶液により中和して成形するといった提案がいくつかなされている（特許文献４、５参照）。
【特許文献１】特公昭６３-５４２８５号公報
【特許文献２】特開平５−２６８９６１号公報
【特許文献３】特開平１０−７５７８０号公報
【特許文献４】特公平６−５１１１４号公報
【特許文献５】特開平１７−２９６９４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の背景技術において、キトサン溶液に磁性を有する粒子を分散させ、この分散液を塩基性溶液により中和して成形したキトサン系酵素固定化用担体は、磁性を有する粒子が担体内部に埋もれて、捕集性能を改善しにくいという欠点がある。しかし、磁性を有する粒子の配合量を上げると、露出した粒子が脱離する、あるいはキトサンが剥離するという問題が生じ、更には、酵素の固定化部位減少や、それに伴う活性低下が起こるといった欠点がある。
したがって、本発明は、酵素固定化用担体等としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能なキトサン系酵素固定化用担体、及びこれを効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の問題点を解決するために、本発明者は、鋭意検討した結果、粒状多孔質架橋キトサンに第一鉄イオンおよび第二鉄イオンの存在下でアルカリ処理する事で、酵素固定化用担体としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能な磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体が得られる事を見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して鉄塩の総モル数が０．４×１０-2ｍｏｌから３．０×１０-2ｍｏｌの範囲で接触させた後、アルカリ溶液で処理して、第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が２％〜２３％の範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させてなる、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体およびその製造方法に係るものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、固定化酵素活性に優れた粒状多孔質架橋キトサンをベースに用いているので、良好な酵素反応を得ることができる上、磁性化を後処理により付与している為、磁性体が系全体に均一且つ微細に分散しており、磁力による捕集能にも優れた性能を発揮できるので、様々なバイオリアクター、バイオセンサーへの応用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明における粒状多孔質架橋キトサンは、例えば、キトサンを酸性水溶液に溶解した後、該溶液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多孔質キトサンを、エポキシ系やイソシアネート系等の架橋剤により架橋したものであれば、特に限定されない。ここで用いられる架橋剤としては、例えば、ヘキサメチレンビス−（２，３−エポキシプロピルジメチルアンモニウムクロライド）、ヘキサメチレンビス−（２，３−エポキシプロピルジエチルアンモニウムクロライド）、プロピレンビス−（２，３−エポキシプロピルジメチルアンモニウムクロライド）、プロピレンビス−（２，３−エポキシプロピルジエチルアンモニウムクロライド）、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリメチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ヘキサメチレングリコールジグリシジルエーテル、エピクロロヒドリン等のエポキシ系架橋剤や、ヘキサメチレンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、１，４−フェニレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソフォロンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤、などが挙げられる。
【０００８】
また、粒状多孔質架橋キトサンの粒子径は特に限定されるものではないが、大きすぎると表面積が小さくなるので、酵素反応の効率が悪くなり、小さすぎると、処理が困難になることから、７０〜３０００μｍの粒子径であることが好ましく、１２０〜１２００μｍが特に好ましい。
孔径についても大きすぎると表面積が小さくなってしまい酵素反応の効率が悪くなり、小さすぎると、酵素反応における物質の多孔質内拡散速度が低下し、みかけの酵素活性が低下してしまう事から、１００〜７５００オングストロームが好ましく、１０００〜２０００オングストロームが特に好ましい。
【０００９】
本発明における鉄イオン溶液中の、第一鉄イオン、および、第二鉄イオンのイオン源としては、塩酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、および、酢酸塩など、それぞれに相当する汎用、市販の塩であれば、何れも使用できるが、コストや入手簡便性、廃物利用（鋼板の酸洗浄工程で発生する）の観点から、それぞれの塩化物であることが好ましい。
本発明における鉄イオン溶液は、第一鉄イオンと第二鉄イオンの混合水溶液であり、第一鉄イオンと第二鉄イオンの比率としては、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が、３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある事が好ましく、４５ｍｏｌ％〜８０ｍｏｌ％の範囲にあることがより好ましい。第一鉄イオンが３０ｍｏｌ％に満たないと十分な磁力が得られず、磁石に近付けてもその捕集は出来ない。逆に、第一鉄イオンの割合が８０ｍｏｌ％より大きいと磁石で捕集は出来ても酵素の固定化量が減少する。
【００１０】
本発明における塩化第一鉄イオンと塩化第二鉄イオンの混合物の仕込み量は、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して、０．４×１０-2ｍｏｌ以上３×１０-2ｍｏｌ以下の範囲にあり、さらに、灰分率が２％以上２３％以内の範囲にあることが必要である。鉄イオンの総モル量が０．４×１０-2ｍｏｌに満たない場合、若しくは、灰分の増分が２％に満たない場合は、酵素固定化量や固定化酵素活性には問題ないが、磁石を近付けても捕集する性能が不十分となる。また、鉄イオンの総モル量が３×１０-2ｍｏｌを超える場合、若しくは、灰分の増分が２３％を超えた場合は、磁性体の生成斑により、磁性体が脱離しやすくなり、好ましくない。尚、本発明に於ける灰分率とは、後述のように絶乾した磁性化粒子を形成させたキトサン系酵素固定化用担体の重量と、該キトサン系酵素固定化用担体の焼成後残分重量とを測定して得られた値である。
【００１１】
本発明は、上記の粒状多孔質架橋キトサンを、第一鉄イオンと第二鉄イオンを含む鉄イオン溶液中に添加混合するが、添加混合の方法は特に制限されず、鉄イオンが十分に、粒状多孔質架橋キトサンの内部に浸透するようにすればよい。一例を挙げれば、３０〜８０℃位で１００〜３００ストローク／分で振とうしながら１〜６時間程度処理すれば良い。なお、当該処理において、共沈鉄の凝集に伴う沈殿等を抑制するため、保護コロイドとしての役割を担うデキストラン等を系内に加えても良い。
次に、本発明では、上記の添加、混合処理の後、アルカリ水溶液を加え、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させる。このとき用いるアルカリ水溶液としては、従来既存の塩基性物質の水溶液であれば何れも使用できるが、中でも、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液を使用することが好ましい。なお、アルカリ水溶液の量は、反応系のｐＨが８以上になるように適宜選択すればよいが、過度に用いると、粒状多孔質架橋キトサンの架橋基や改質基の脱離、および、孔の収縮が起こり、酵素固定化量が減少することがあるため好ましくない。
アルカリ水溶液を加えた後の処理についても、先の通り、３０〜８０℃位で１００〜３００ストロークで振とうしながら１〜６時間程度処理すれば良い。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。なお、実施例、および、比較例において、反応斑、磁性、キトサン系酵素固定化用担体の形態、灰分率、タンパク質吸着率、および、固定化酵素の固定化率、発現力価、発現率については、以下の方法より測定、または、評価した。
【００１３】
（１） 反応斑（外観評価）
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体の色調を目視観察し、その色斑から反応斑を評価した。色斑が無く均質性に優れる場合は○、色斑はあるが品質的に許容できる範囲内である場合は△、色斑が大きく、品質的に許容できない場合は×として評価した。
（２） 磁石への付着（外観評価）
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体をガラスシャーレに移し、キトサン系酵素固定化用担体が水没するまでＲＯ水を加えた後、磁束密度０．３Ｔの回転子取り出し棒（アズワン社製）を系中に挿入して磁石への付着状況、および、引き寄せられる状況を目視観察により評価した。評価結果は、付着する場合は○、付着しない、あるいは、系外に取り出すことが出来ない場合は×で示した。
（３） 走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体をＲＯ水、メタノール、エタノール、そして、ｔ−ブチルアルコールの順に洗浄、溶媒交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、表面に金をスパッタリングし、日本電子製ＪＳＭ６０６０ＬＶを用いて、５０００倍で観察した。
【００１４】
（４） 灰分率測定
熱風循環式乾燥器中、１０５℃、４時間の条件で絶乾した試料を風袋重量既知のセラミックるつぼに入れた後、電気炉中で６００℃、５時間の条件で灰化した。灰化後は、速やかにデシケータに入れ、デシケータ中で室温まで放冷後、重量を計測し、下式から灰分率を求めた。
灰分率（％）＝焼成残分重量（ｇ）／絶乾試料重量（ｇ）×１００
（５） アルブミンの吸着
０．０１Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．０１Ｍリン酸二水素ナトリウムより調製した０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で置換した各酵素固定化用担体５ｍｌをプラスチック製の密閉容器に量り取り、１％のウシ血清アルブミン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ.製）の０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液５０ｍｌを加え、恒温ロータリーシェーカーを使用して、２５℃で４時間振とう（振とう速度：１２５ｒｐｍ）した。
（６） ヘモグロビンの吸着
０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で置換した各酵素固定化用担体５ｍｌをプラスチック製の密閉容器に量り取り、１％のウシ血液由来ヘモグロビン（和光純薬製、試薬特級） の０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液５０ｍｌを加え、恒温ロータリーシェーカーを使用して、２５℃で４時間振とう（振とう速度：１２５ｒｐｍ）した。
（７） タンパク質吸着率の測定
アルブミン、あるいは、ヘモグロビンを所定時間、各酵素固定化用担体に吸着させた後、反応液５ｍLを１０倍に希釈し、分光光度計（島津製作所製ＵＶ-２４５０）を用いて、２８０ｎｍの吸光度より吸着量を測定し、下記の式１に基づいて算出した。
【００１５】
【数１】
【００１６】
〔実施例１〕
粒径８４０〜１，１９０μm、比表面積１１０〜１３０ｍ2／ｇのキトサン系酵素固定化用担体（富士紡ホールディングス社製キトパールＢＣＷ−２５１０）２５ｍＬをプラスチック製の密閉容器に量り取り、スポイトで水分を軽く除去した。ここに、あらかじめ調製しておいた磁性化溶液（塩化第一鉄・四水和物２．７８ｇ（１．４０×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物４．１７ｇ（１．５４×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン１．８１ｇを４０．０ｇのＲＯ水に溶解させた溶液）を全量投入し、良く混合した。次いで、反応系を振とう恒温水槽を用いて６０℃に昇温し、１２５ストローク／分で２時間、浸とう、混合した。所定時間経過後、反応系に２８％アンモニア水（和光純薬製）５．７５ｇを４３．６１ｇのＲＯ水で希釈した溶液を添加し、良く混合した。なお、この時点で系は褐色化した。その後、再び、振とう恒温水槽を用いて反応系を６０℃に昇温し、１２５ストローク／分で１時間、浸とう、混合した。所定時間経過後、系を濾別、水洗して目的物を得た。目的物は、ＲＯ水中、５℃で保管した。
【００１７】
処理前のキトサン系酵素固定化用担体をＳＥＭ観察した様子を図１、得られた目的物をＳＥＭ観察した様子を図２に示す。図１、図２のＳＥＭ写真から分かる様に、処理後もキトサン系酵素固定化用担体が元来有する多孔質構造が、そのまま保持されていた。目的物を焼成、灰化し、灰分率を評価すると２２．４％であった。なお、磁性化前の灰分率はほぼ０であった。このるつぼ残存成分をＳＥＭ観察した様子が図３であるが、焼成により細孔の収縮、消失が起こったものの、その構造は、元の酵素固定化用担体の形状をトレースしていた。磁性化処理後の湿潤にあるキトサン系酵素固定化用担体に磁石を近づけると、担体粒子は図４に示すように磁石に引き寄せられ、付着した。よって、本願の目的の一つである、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体が得られた。
アルブミン、および、ヘモグロビンの吸着率を評価したところ、それぞれ４６．９ｍｇ／ｍｌ、２２．８ｍｇ／ｍｌであり、酵素固定化用担体としての性能を十分に保持していた。よって、本願の目的である磁性と酵素固定可能の同時具備が達せられたといえる。実施例１〜３及び比較例１〜３による磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の性状及び評価結果を、表１にまとめた。
【００１８】
【表１】
【００１９】
尚、アルブミン、および、ヘモグロビンの吸着率は、以下のようにして測定した。
磁性化酵素固定化用担体５ｍｌに対し、ＲＯ水に１５０Ｕの力価を持つように溶解、調製した水溶液（天野エンザイム株式会社製アシラーゼアマノ水溶液）１０ｍｌを加え、室温で２時間振とうしてアシラーゼを固定化した。反応液５ｍｌを系から量り取り、１０倍に希釈した後、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。磁性化酵素固定化用担体を入れずに同様の操作を行ったものをブランクとし、ブランク吸光度との差から固定化アシラーゼ量を求めた。
【００２０】
次に、固定化アシラーゼの活性を調べるために下記の操作を行った。
上記操作により調製したアシラーゼ固定化担体を２８０ｎｍにおける吸光度が０．０２５以下になるまで充分に洗浄し未反応の酵素を除去した。得られた磁性化担体、あるいは、非磁性化担体１ｍｌをスクリュー管に入れ、クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）２ｍｌ、０．５ｍＭ塩化コバルト水溶液１ｍｌを加え、３７℃で５分間反応させた。続いて、基質溶液として、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン溶液１ｍｌを系に加え、試験管ミキサーで攪拌後、３７℃で１５分間反応させた。反応混合物をろ過した後、ろ液から１ｍｌを分取し、３分間８０℃の湯浴中で加熱することにより反応を停止させた。反応液を流水で冷却後、後述する方法で調製したニンヒドリン溶液１ｍｌ、および、第一塩化スズ溶液０．０５ｍｌを加え、９０℃の湯浴中で２０分間強熱した。流水で冷却後、５０％２−プロパノール水溶液を５ｍｌ加え、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素固定化用担体を入れないで同様の操作を行った系をブランクとして用意し、吸光度を測定した。なお、反応に使用したＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、ニンヒドリン溶液、および、第一塩化スズ水溶液は以下の様に調製した。
Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン溶液：Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン（和光純薬工業株式会社製試薬特級、ＭＷ＝１９１．２５）０．４７８ｇを量り、ＲＯ水１０ｍｌと１Ｎ−水酸化ナトリウム液２ｍｌを加え、溶解した。その後、系中にＮ／１０−水酸化ナトリウム液を加えることによって、ｐＨを８．０に調整し、さらにＲＯ水を加え２５ｍｌとした。
ニンヒドリン溶液：ニンヒドリン（和光純薬工業株式会社製アミノ酸自動分析用、８．１４）１．０ｇを量り、２５ｍｌのエチレングリコールモノメチルエーテル（和光純薬工業株式会社製試薬特級、ＭＷ＝７６．１）を加え、溶解した後、クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を２５ｍｌ加えて振とうした。
第一塩化スズ水溶液：塩化第一スズ（和光純薬工業株式会社製試薬特級、ＭＷ＝２２５．６３）０．１ｇを量り、クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を６．２ｍｌ加えて溶解した。
【００２１】
〔実施例２〕
塩化第一鉄・四水和物１．３９ｇ（０．７０×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物２．０９ｇ（０．７７×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン０．９０ｇを４２．５ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。表１に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２２】
〔実施例３〕
塩化第一鉄・四水和物０．７０ｇ（０．３５×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物１．０４ｇ（０．３８×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン０．４５ｇを４３．８ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。表１に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２３】
〔実施例４〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を１．２７ｇ（０．６４×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物を０．４３ｇ（０．１６×１０-2ｍｏｌ）使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行い、本発明の目的を満足する担体を得た。実施例４〜６及び比較例４，５による磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の性状及び評価結果を、表２にまとめた。
【００２４】
【表２】
【００２５】
〔実施例５〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を０．８５ｇ（０．４３×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物を０．８５ｇ（１．２７×１０-2ｍｏｌ）使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。表２に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２６】
〔実施例６〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を０．４３ｇ（０．２２×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物を１．２７ｇ（０．４７×１０-2ｍｏｌ）使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。表２に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
【００２７】
〔実施例７〕
キトサン系酵素固定化用担体として、粒径８４０〜１，１９０μm、比表面積１２０〜１５０ｍ2／ｇのキトサン系酵素固定化用担体（富士紡ホールディングス社製キトパールＢＣＷ−３０１０）を用いた以外、実施例１と同様にして磁性化酵素固定化用担体を作製した。
【００２８】
上記実施例7及び実施例８の方法により得た磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の測定した固定化アシラーゼの活性について、下式に基づき担体試料の固定化率、固定化力価、および発現力化、さらに発現率を数２〜４により算出した。結果、表３から明らかなように、本発明による磁性化担体は、磁性化していない担体と各種性能が同程度であり、磁性化による性能低下がないことが示された。
【００２９】
【数２】
なお、上記式中の各種ファクターは、以下の通りである。
３３０．９４：Ｌ−メチオニンで作成した検量線より求めた吸光度差１．０００となるＬ−メチオニン量
１４９：Ｌ−メチオニン１μｍｏｌに対する重量（μｇ）
１６：試料希釈倍数×単位換算係数
Ｗ：活性測定に用いた固定化酵素担体量（ｇ）
【数３】
【数４】
【００３０】
【表３】
【００３１】
〔実施例８〕
キトサン系酵素固定化用担体として、粒径８４０〜１，１９０μm、比表面積１５０〜２００ｍ2／ｇ）のキトサン系酵素固定化用担体（富士紡ホールディングス社製キトパールＢＣＷ−３５１０）を用いた以外は、実施例７と同様の操作を行い磁性化アシラーゼ固定化担体の性能を評価した。結果、表３から明らかなように、本発明による磁性化担体は、磁性化していない担体と各種性能が同程度であり、磁性化による性能低下がないことが示された。
【００３２】
〔比較例１〕
塩化第一鉄・四水和物１１．１ｇ（５．５８×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物１６．７ｇ（６．１８×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン７．２３ｇを２５．０ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。結果、表１に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３３】
〔比較例２〕
塩化第一鉄・四水和物５．５６ｇ（２．８０×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物８．３５ｇ（３．０９×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン３．６２ｇを３５．０ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。結果、表１に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３４】
〔比較例３〕
塩化第一鉄・四水和物０．３５ｇ（０．１８×１０-2ｍｏｌ）、塩化第二鉄・六水和物０．５０ｇ（０．１８×１０-2ｍｏｌ）、および、デキストラン０．２３ｇを４４．４ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例１と同様の作業を行った。結果、表１に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３５】
〔比較例４〕
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物１．７０ｇ（０．８６×１０-2ｍｏｌ）のみ使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。結果、表２に示す様に、磁性化は可能であったが、ヘモグロビンの吸着率が低下し、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【００３６】
〔比較例５〕
鉄イオン源として、塩化第二鉄・六水和物１．７０ｇ（０．６３×１０-2ｍｏｌ）のみ使用し、デキストラン０．４５ｇを４２．９ｇのＲＯ水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例１と同様の作業を行った。結果、表２に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
キトサン系酵素固定化用担体には様々な官能基を導入させることが出来るため、性質の異なる個々の酵素に対応させることが可能である。さらに、酵素の固定化方法も吸着法、架橋法、活性化法の３種より適宜選択することができ、糖質、タンパク質関連酵素の固定化などにおいて、安定性の高い固定化方法を選択可能である。本発明によって得られた担体は、上述したキトサンの酵素固定化能を持ちつつ、磁力による反応生成物との分離、および、固定化酵素の回収が容易であり、酵素反応を必要とする様々な用途に使用、応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】処理前のキトサン系酵素固定化用担体の断面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】本発明によるキトサン系酵素固定化用担体の断面を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】本発明によるキトサン系酵素固定化用担体を焼成、灰化した後のるつぼ残存成分の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】本発明によるキトサン系酵素固定化用担体が磁石に引き寄せられ、付着する様子を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して鉄塩の総モル数が０．４×１０-2ｍｏｌから３．０×１０-2ｍｏｌの範囲で接触、析出させて得られる第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が２％〜２３％の範囲である磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体。
【請求項２】
粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して鉄塩の総モル数が０．４×１０-2ｍｏｌから３．０×１０-2ｍｏｌの範囲で接触させた後、アルカリ溶液で処理して、第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が２％〜２３％の範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させることを特徴とする磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体の製造方法。
【請求項１】
粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して鉄塩の総モル数が０．４×１０-2ｍｏｌから３．０×１０-2ｍｏｌの範囲で接触、析出させて得られる第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が２％〜２３％の範囲である磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体。
【請求項２】
粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が３０ｍｏｌ％から８０ｍｏｌ％の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン２５ｍＬに対して鉄塩の総モル数が０．４×１０-2ｍｏｌから３．０×１０-2ｍｏｌの範囲で接触させた後、アルカリ溶液で処理して、第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が２％〜２３％の範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させることを特徴とする磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２２１６９（Ｐ２００９−２２１６９Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８５６８３（Ｐ２００７−１８５６８３）
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【出願人】（０００００５３５９）富士紡ホールディングス株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【出願人】（０００００５３５９）富士紡ホールディングス株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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