神経前駆細胞の移動を導く方法と組成物
細胞をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露することを含む哺乳動物の神経前駆細胞の移動を調節する方法。ＦＧＦ-２の存在下で哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することにより神経学的障害を治療する方法もまた提供される。ＦＧＦ-２に関連する生体適合性マトリックスを含む組成物も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経前駆細胞の移動を調節するための方法と組成物、及び神経細胞の消失又は傷害に関与する症状の治療方法、及び神経細胞移動障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発生中の未成熟ニューロンの移動は、神経系の正しい構成に必須である。哺乳動物の脳ではほとんどのニューロンが脳室の周辺の増殖領域内で生成され、そこから未成熟前駆体が大脳壁（cerebral wall)の特異的部位に移動する。種々の臨床的症状(種々の型の脳回欠損を含む)は、神経細胞の移動の欠陥に関連する。これらの形成異常の結果は、精神遅滞、てんかん、麻痺、及び失明がある。これらの障害の一部の遺伝的研究によりニューロン移動の制御がある程度理解され、これは過去１０年間に急速に進展した。
【０００３】
早期発生で重要な役割を果たす以外に、ニューロン移動はまた成体脳にとっても重要である。例えば鳴禽類の脳では、成人期の構造の可塑性と学習にニューロン発生とニューロン移動が必要である。最近の証拠により、未分化多能性前駆細胞が、成体哺乳動物の脳において、及び成体の神経発生の間、並びに吻側脳室下帯-嗅球系と歯状回の特異的部位で起きる連続的ニューロン交換の間にも存在することが示唆される。
【０００４】
最後に、細胞の移動は創傷治癒で中心的な役割を果たす。消失又は傷害されたニューロンを交換する成体哺乳動物脳の固有の能力は非常に限定されているが、種々の因子の投与後に神経前駆細胞の移動と細胞交換が報告されている。
【０００５】
その最終目的地への未成熟ニューロンの進路決定に関与する因子や機構を理解するために、最近多くの試みがなされている。ニューロンをその最終目的地に導くために、誘引性及び反発性分子の高度に保存されたファミリーが連係して制御されている。これらの分子には、ネトリン類(ｎｅｔｒｉｎｓ)、セマホリン類(ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ)、エフリン類(ｅｐｈｒｉｎｓ)、スリット類(Ｓｌｉｔｓ)及び種々の神経栄養因子がある。分裂後の未成熟ニューロンの移動に比較して、神経幹細胞や未分化神経前駆細胞の移動を導く因子や機構についてはほとんど不明である。ある研究では、経膜移動測定法（transfilter migration assay)において、胎盤由来増殖因子(ＰＤＧＦ)が、ＦＧＦ-２刺激された神経前駆細胞を誘引することが示された。
【０００６】
神経前駆細胞移動においてある役割を果たす候補分子を同定することは、発生の間における正しい組織形成の理解のみならず、構造的脳修復を行うように未分化神経前駆細胞を指令する方法の開発において決定的に重要である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
ある実施態様において本発明は、細胞をＦＧＦ-２及びＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、哺乳動物をＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露して神経消失又は傷害部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む、神経細胞の消失又は傷害が関与する障害を有する哺乳動物の治療方法を提供する。
【０００８】
別の実施態様において本発明は、神経組織部位を有する哺乳動物を欠陥神経集団を用いて治療する方法を提供する。この方法は、哺乳動物をＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露して、神経組織部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む。
【０００９】
別の実施態様において本発明は、細胞上のＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか又は維持することができる化合物に細胞を暴露し、そして細胞をＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む、神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。
【００１０】
別の実施態様において本発明は、ＶＥＧＦＲ-２リガンド、ＦＧＦ-２、及び担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
別の実施態様において本発明は、ＦＧＦ-２を含む生体適合性マトリックスを含む組成物を提供する。好ましくは生体適合性マトリックスはまた、ＶＥＧＦＲ-２リガンドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明において血管内皮増殖因子-２(ＶＥＧＦＲ-２)リガンド(例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔC)は、ＶＥＧＦＲ-２を発現する神経前駆細胞の化学誘引物質であり、ここでＶＥＧＦＲ-２リガンドに応答した神経前駆細胞の移動は繊維芽細胞増殖因子-２(ＦＧＦ-２)への細胞の暴露に依存する。本発明は、細胞をＦＧＦ-２とＶＥＧＦＲ-２リガンドとに暴露することにより神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。理論に拘束はされないがＦＧＦ-２は、内因性又は外因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドが結合する神経前駆細胞上のＶＥＧＦＲ-２の発現を維持するか及び／又は上昇させると考えられる。細胞は外因性又は内因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することができる。例えば内因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドがアップレギュレートされていない時、又は哺乳動物中で神経前駆細胞の移動を刺激するには不充分な量で存在する時、細胞を外因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することができる。細胞は、ＦＧＦ-２に暴露する前、後、又は同時にＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することができる。
【００１３】
ＶＥＧＦＲ-２を発現する以外に、本発明の神経前駆細胞はネスチンを発現し、ニューロン-もしくはグリア-制限前駆細胞の抗原性マーカー(例えば、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮＥｕＮ、ＮＧ２、又はＡ２Ｂ５)及び内皮細胞マーカー(例えば、フォンウィルブラント因子及びＲＥＣＡ-１)を示さない。神経前駆細胞はまたＶＥＧＦＲ-１を発現し、好ましくはＶＥＧＦＲ-３を発現しない。
【００１４】
本発明はまた、神経前駆細胞上のＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか又は維持することができる化合物に細胞を暴露し、かつ細胞をＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む、神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。ＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか維持することができる化合物の非限定例はＦＧＦ-２を含む。他の化合物は、ＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか又は維持することができる化合物についてスクリーニングすることにより決定することができる。かかるスクリーニングは、神経前駆細胞を試験化合物に暴露し、次にＶＥＧＦＲ-２発現のレベルについて測定することにより行われる。かかる発現はＶＥＧＦＲ-２抗体又は標識リガンドを使用して検出される。
【００１５】
本発明はまた、有効量のＦＧＦ-２とＶＥＧＦＲ-２及び薬剤学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。この実施態様では薬剤学的に許容されるとは、連邦政府又は州政府の監督官庁により認可されているか、又はアメリカ合衆国薬局方又は動物さらに好ましくはヒトでの使用について他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。担体という用語は、ＦＧＦ-２やＶＥＧＦＲ-２と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを示す。適当な担体の例は、Ｅ.Ｗ. Ｍａｒｔｉｎによる「レミントンの薬剤科学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)」に記載されている。
【００１６】
本発明はまた、ＦＧＦ-２及び好ましくはまたＶＥＧＦＲ-２リガンドを含む生体適合性マトリックスを含む組成物を提供する。生体適合性マトリックスは、哺乳動物に投与された時副作用やアレルギー反応を生成せず、神経系に投与することができる限り、天然材料から又は合成材料からも作成することができる。マトリックスは非生体分解性又は生体分解性ポリマーから作成してもよい。非生体分解性ポリマーの非限定例には、エチレン酢酸ビニル、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリアミド、これらのコポリマー及び混合物がある。生体分解性材料の非限定例には、ポリエステル、例えばポリグリコリド、ポリラクチド、及びポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー(「ＰＬＧＡ」)；ポリエーテル、例えばポリカプロラクトン(「ＰＣＬ」)；ポリ無水物；ポリアルキルシアノクリレート、例えばｎ-ブチルシアノアクリレート及びイソプロピルシアノアクリレート；ポリアクリルアミド；ポリ(オルトエステル)；ポリホスファゼン；ポリペプチド；ポリウレタン；及びかかるポリマーの混合物がある。マトリックスは、スポンジ、インプラント、チューブ、凍結乾燥成分、ゲル、パッチ、粉末、もしくはナノ粒子、又は神経系に投与できる任意の他の形がある。ＶＥＧＦＲ-２リガンドがマトリックスに加えられる時、好ましくはマトリックスはＶＥＧＦＲ-２リガンドの濃度勾配の生成を可能にする。マトリックスはさらに１つ以上の他の適当な化学走化性又は神経栄養因子、例えば増殖因子(例えば、ＰＤＧＦ、ＮＦＧ)、ネトリン、セマホリン、エフリン、スリットがある。生体適合性マトリックスを含む組成物はまた、組成物を投与される哺乳動物への外因性神経前駆細胞の移植のための神経前駆細胞を含む。神経前駆細胞は、治療される哺乳動物又は他の供給源に由来してもよい。
【００１７】
本発明はまた、ある神経障害又は症状を有する哺乳動物の治療法を提供する。例えばある実施態様において本発明は、神経細胞(ニューロンとグリア細胞の両方を含む)の消失又は傷害を含む症状を有する哺乳動物の治療法を提供する。この方法は、哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露して、神経細胞消失又は傷害の部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む。神経細胞の消失又は傷害を含む症状の非限定例は、例えば脳卒中、虚血、酸素欠乏又は頭部外傷がある。
【００１８】
別の実施態様において本発明は、哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露して欠陥神経組織部位への神経前駆細胞の移動を刺激することにより、欠陥神経集団を用いて神経組織部位を有する哺乳動物の障害を治療する方法を提供する。欠陥神経集団を有するある神経組織を特徴とするかかる障害には、発生している神経系中のニューロンの異常な移動により引き起こされる出産時欠損に至るものがある。ニューロンのかかる異常な移動はニューロンの正しくない配置を引き起こし、必要なニューロン集団が欠如したある神経組織部位ができる。これらの障害は、脳(例えば、大脳半球、小脳、脳幹、又は海馬)の構造異常又は欠失した領域を引き起こす。かかる異常な移動の結果としての構造異常は、例えば分裂脳症(ｓｃｈｉｚｏｃｅｐｈａｌｙ)、孔脳症、無脳回、脳回欠損、大脳回、脳回肥厚、小脳回、小多脳回、神経異所的形成、脳梁非形成、及び脳神経非形成がある。本発明は、神経前駆細胞を発生中の神経系の正しい部位に向けることにより、かかる障害を治療する方法を提供する。例えば、もしニューロンが小脳へ移動せず、ニューロン集団が欠如した小脳になると、本発明の方法は小脳への神経前駆細胞の移動を刺激するための手段を提供する。
【００１９】
本発明の神経障害又は症状を治療する方法は、内因性神経前駆細胞を刺激するために、及び／又は哺乳動物に移植される外因性神経前駆細胞を刺激するために使用される。本発明の方法に従って哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露することは、神経前駆細胞を内因性又は外因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドと内因性又は外因性ＦＧＦ-２とに暴露することを含む。もし内因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドがアップレギュレートされていないか、又は哺乳動物中で神経前駆細胞の移動を刺激するには不充分な量で存在するなら、例えば外因性ＶＥＧＦＲ-２を哺乳動物に積極的に投与することができる。ＶＥＧＦＲ-２リガンドは、ＦＧＦ-２に暴露する前、後、又は同時に投与することができる。病変の場合は、内因性ＶＥＧＦは哺乳動物中ではアップレギュレートされているため、ＶＥＧＦＲ-２リガンドの投与は不要なことがある。同様に内因性ＦＧＦ-２が神経前駆細胞の移動を刺激するには不充分な量で存在するなら、外因性ＦＧＦ-２を哺乳動物に積極的に投与することができる。
【００２０】
哺乳動物は、当該分野で公知の任意の方法により、ＦＧＦ-２、ＶＥＧＦＲ-２リガンド及び／又は神経前駆細胞に暴露することができる。例えば哺乳動物は、神経前駆細胞が必要な神経部位への、又は内因性神経前駆細胞の移動を刺激する場合は、内因性神経前駆細胞が位置する神経部位への、カテーテルを介する直接投与により、これらの物質に暴露することができる。好適な実施形態において、ＦＧＦ-２、ＶＥＧＦＲ-２リガンド、及び／又は内因性神経前駆細胞は、上記したように生体適合性マトリックスを含む組成物の一部として投与される。さらにこの方法は、１つ以上の他の適当な化学走化性又は神経栄養性因子、例えば増殖因子(例えば、ＰＤＧＦ、ＮＦＧ)、ネトリン、セマホリン、エフリン、スリットを哺乳動物に投与することをさらに含む。
【００２１】
本発明の方法により治療可能な神経障害の同定は、当業者の能力と知識の範囲内である。例えば当該分野の臨床家は、例えば臨床試験、診断法、及び物理的観察により、個体が神経傷害もしくは喪失又は神経移動障害に罹っているかどうか、そうして本発明のＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２への暴露の候補であるかどうかを容易に決定することができる。
【００２２】
哺乳動物は神経前駆細胞の移動を指令するのに充分な量のＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露することができる。細胞培養測定法と動物試験から得られるデータは、哺乳動物(例えばヒトを含む)で使用するための用量範囲を剤形する際に利用することができる。具体的な障害又は症状の治療に有効な量は、障害又は症状の性質に依存し、標準的な臨床的方法により決定することができる。さらに最適な用量範囲を画定するのを助けるために、インビトロ測定法を使用してもよい。この用途に有効な量は例えば障害の重症度に依存する。投与スケジュールはまた、疾患状態と患者の状態により変化し、典型的には単回の大量投与か又は連続的注入から１日当たり複数回の投与があり、又は担当医師及び患者の状態により示される。しかし本発明は決してこれらの特定の投与法に限定されないことを理解されたい。
【００２３】
本発明はまた、ＦＧＦ-２及び／又はＶＥＧＦＲ-２を充填した１つ以上の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。
【００２４】
神経前駆細胞が哺乳動物に移植される実施態様において、神経前駆細胞の集団は当該分野で公知の方法により哺乳動物ドナーから単離することができる。例えば神経前駆細胞は、インビボで分裂細胞(例えば、成体脳の脳室下帯(ＳＶＺ)又は海馬、及び発生中の脳の種々の構造体、例えば海馬、脳皮質、小脳、神経冠、及び基底前脳)を含有することが証明されている胎児又は成体の神経組織の領域を解剖することにより、インビトロで単離することができる。次に神経組織はばらばらにされ、分離した細胞は、結合のための基質としてのマトリックス上の規定培地又は補足培地中の高濃度のＦＧＦ-２又は表皮増殖因子-２(ＥＧＦ)のような分裂促進因子に暴露される(かかる方法は、Ｍ. Ａｌｉｓｏｎら、Ｊ. Ｈｅｐａｔｏｌ. ２６, ３４３ (１９９７) 及びＪ.Ｍ.Ｗ. Ｓｌａｃｋ, Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ, １２１, １５６９ (１９９５)に記載されている、いずれも本明細書に援用される)。次に、分離した細胞は、本発明の神経前駆細胞に特徴的な抗原マーカー(例えばネスチン又はＶＥＧＦＲ-２)に特異的に結合する分子に暴露することができる。これらの抗原マーカーを発現する細胞は結合分子に結合して、神経前駆細胞の単離を可能にする。神経前駆細胞が当該分子を取り込まない場合、分子は当該分野で公知の方法により細胞から分離される。例えば抗体は、低ｐＨを有する溶液又はキモトリプシンのようなプロテアーゼに短時間暴露することにより細胞から分離される。
【００２５】
神経前駆細胞の集団を単離するのに使用される分子は、神経前駆細胞の同定と分離を促進する標識物と結合してもよい。かかる標識物の例には磁性ビーズとビオチンがあり、これはアビジン又はストレプトアビジンと蛍光物質に対する親和性を利用して同定又は分離される。
【００２６】
陰性選択により好ましくない細胞を除去する方法もまた使用できる。例えば細胞は本発明の神経前駆細胞に特徴的ではない抗原マーカー(例えば、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、Ａ２Ｂ５)に暴露され、これらの分子に結合する細胞は除去することができる。
【００２７】
神経前駆細胞がいったん単離されると、これらはＦｌａｘら、「移植可能なヒト神経幹細胞は発生のてがかりに応答し、ニューロンを交換し、外来遺伝子を発現する」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ., １６：１０３３-１０３９ (１９９８)；ＵｃｈｉｄａとＢｕｃｋ、「ヒト中枢神経系幹細胞の直接単離」、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ９７：１４７２０-１４７２５ (２０００)；Ｂｒｕｓｔｌｅら、「ラット胚への胎児ヒト脳細胞の脳室内移植により作成されたキメラ脳」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ., １６：１０４０-１０４４ (１９９８)；及びＦｒｉｃｋｅｒら、「成体脳への移植後のヒト神経前駆細胞の部位特異的移動とニューロン分化」、Ｊ. Ｎｅｕｒｏｓｃｉ. １９：５９９０-６００５ (１９９９)(これらのすべては、本明細書に援用される)に記載のような当該分野で公知の方法により哺乳動物の神経系の所望の部位に移植される。
【実施例】
【００２８】
実施例１：神経前駆細胞の単離と培養
新生児ラットの脳の冠状切片からＳＶＺを解剖し、機械的に分離し、当該分野で公知の方法に従ってトリプシン処理した(Ｌｉｍら、Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis、Neuron, 28:713-726 (2000)を参照のこと、当該文献は本明細書に援用される)。当該分野で公知の方法(Ｌｉｍら、２０００参照)に従ってパーコール勾配遠心分離を使用してＳＶＺ前駆体を精製し、マトリゲル(０.２４ｍｇ／ｃｍ2)又はラミニン被覆カバーガラス上に蒔いた。単離した細胞は、２０ｎｇ／ｍｌ・ＦＧＦ-２、１×Ｂ２７、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ・Ｎ-アセチル-システイン、及び１％ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた神経基礎培地(Neurobasal medium)で増殖させた。培養物に３日毎に２０ｎｇ／ｍｌ・ＦＧＦ-２を含有する新鮮な培地を与えた。
【００２９】
培養物の免疫染色を当該分野で公知の方法に従って行った(Wangら、"Functional N-methyl-D-aspartate receptors in O-2A glial precursor cells: a critical role in regulating polysialic acid-neural cell adhesion molecule expression and cell migration,"J. cell Biol., 135:1565-1581 (1996)；Vutskitsら"PSA-NCAMmodulates BDNF-dependent survival and differentiation of cortical neurons,Eur. J. Neurosci., 13:1391-1402 (2001)参照のこと。いずれの文献も本明細書に援用される)。以下の一次抗体と希釈率を使用した：ネスチンに対するマウスモノクローナル抗体(バイオジェネシス(Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)、英国、１：３００希釈)；Ａ２Ｂ５に対するマウスモノクローナル抗体(Eisenbarthら"Monoclonal antibody to a plasma membrane antigen of neurons,"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4913-4917 (1979)に記載されている、これは本明細書に援用される；ハイブリドーマ上清(ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州、１：５希釈)；１２残基以上の鎖長を有するα２-８結合ＰＳＡを特異的に認識するＭｅｎ Ｂ(髄膜炎菌Ｂ群(Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒｏｕｐ Ｂ))マウスＩｇＭモノクローナル抗体(１：５００希釈)(Rougonら、"Amonoclonal antibody to a plasma membrane antigen of neurons"J. Cell. Biol., 103:2429-2437 (1986)に記載されている。当該文献は、本明細書に援用されている)；抗ＧａｌＣ(Ranschtら"Development of oligodendrocytes and Schwaqnn cells studies with a monoclonal antibody againstgalactocerebroside"、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2709-2713 (1982)に記載される。当該文献は、本明細書に援用される)、マウスＩｇＭモノクローナル抗体(培養上清、１：５希釈)；β-チューブリンイソタイプＩＩＩに対するＴｕｊマウスモノクローナル抗体(１：４００希釈)(シグマ(Ｓｉｇｍａ)、セントルイス、ミズーリ州)；ＧＦＡＰに対するウサギポリクローナル抗体(ダコパッツ(Dakopatts)、コペンハーゲン、デンマーク、１：２００希釈)；ＮＧ２に対するウサギポリクローナル抗体(ケミコンインターナショナル(Chemicon International)、カリフォルニア州、１：４００希釈)；ダブルコルチン(Doublecortin)に対するヤギポリクローナル抗体(サンタクルズ・バイオテクノロジー(Santa Cruz Biotechnology)、１：３００希釈)；ＮｅｕＮに対するマウスｍＡｂ(ケミコンインターナショナル(Chemicon International)、カリフォルニア州、１：１００希釈)。ＮＣＡＭタンパク質コアに対するウサギ抗血清は、ＮＣＡＭ(１：１０００希釈)の７つのＮＨ-２-末端残基を認識する部位特異的抗体であった(RougonとMarshak、「哺乳動物神経細胞接着分子のアミノ末端ドメインの構造的及び免疫学的特徴解析」、J. Biol. Chem., 261:3396-3401 (1986)参照、これは本明細書に援用される)。未分化乏突起神経膠細胞を同定するためにＯ４モノクローナル抗体(ハイブリドーマ上清、１：５希釈)(Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、１９７９に記載されている)を使用した。ある場合にはヘキスト３３２５８を使用して細胞核を対比染色した。蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察した(アイシオフォト(Ａｘｉｏｐｈｏｔ)；ツァイス(Ｚｅｉｓｓ)、オベロチェン(Ｏｂｅｒｌｏｃｈｅｎ)、ドイツ)。非特異的マウスＩｇＭ又はＩｇＧ免疫前血清又は二次抗体のみで処理した対照は、染色を示さなかった。２重免疫標識実験では、１つの一次抗体のみを使用して、次に抗マウスＦＩＴＣ結合二次抗体と抗ウサギＴＲＩＴＣ結合二次抗体を加えると、１つのみが標識された。ＢｒｄＵの２０時間取り込み後にＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体(ベーリンガー(Boehringer)、１：５０希釈)を用いて、増殖している細胞を同定した。
【００３０】
細胞を蒔いた４日後、図１Ａに見られるように細胞は未成熟な丸い又は二極性の形態を有した。分裂し密ではないコロニーを形成する細胞を毎日観察し、６日目までには図１Ｂに示すように単層を形成した。単層により、細胞はより均一にＦＧＦ-２に暴露され、未分化前駆細胞の均一な集団の形成が促進される。この段階で大多数(９８％)の細胞は、図１Ｃに見られるように抗ネスチン抗体で染色された。ネスチンは神経前駆細胞のマーカーと見なされる。神経マーカーＴｕｊを発現した細胞は３.２％未満であった。図１Ｄに見られるように、ＰＳＡ-ＮＣＡＭとＢｒｄＵ取り込みはこれらの細胞が分裂しないことを示した。ＧＦＡＰ又はＧａｌＣ(それぞれ星状細胞と乏突起神経膠細胞のマーカー)に対する免疫反応性を示した細胞はほとんどないか全くなかった。これらの存在はおそらく、前駆体の単離と精製後の初期細胞集団における汚染のためであろう。いくつかの分化細胞は例外として、ＦＧＦ-２の存在下で維持された前駆細胞はＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、又はＡ２Ｂ５を含む神経-又はグリア-制限前駆細胞の抗原マーカーを示さなかった(データは示していない)。さらにネスチン陽性細胞は、フォンウィルブラント因子やＲＥＣＡ-１のような内皮細胞マーカーは陰性であった(データは示していない)。これらの結果により、培養物が、ニューロン又はグリア細胞に対する細胞系統特異的マーカーを未だ持たない未成熟細胞であることが示された。
【００３１】
ニューロン及びグリア分化の両方を刺激することがすでに証明されている条件下で培養物を分化させると(Palmerら、"The adult hippocampus contains primordial neural stem cells"Mol. Cell. Neurosci., 8:389-404 (1997)に記載されている)、図１Ｅに見られるように集団の９６％以上が神経及び星状細胞マーカーに対する免疫反応性を示した(Ｔｕｊ＋、２１％、ＧＦＡＰ＋、７５％)。残りの集団は、図１Ｆに見られるように乏突起神経膠細胞マーカーＡ２Ｂ５又はＧｒａｌＣに対して免疫反応性であった。これらの観察結果はＦＧＦ-２で育てた細胞が、ニューロン、星状細胞、及び乏突起神経膠細胞(中枢神経系の３つの主要な細胞の種類)を発生させる多能性神経前駆細胞であることを示す。
【００３２】
実施例２：ＦＧＦ-２刺激神経前駆細胞の移動はＶＥＧＦＲ-２リガンドにより調節される
ダン(Dunn)化学走化性チャンバー(ウェーバーサイエンティフックインターナショナル社(Weber Scientific International Ltd.)、テディントン(teddington)、英国)(Zichaら、"A new direct viewing chemotaxis"J. Cell Sci., 99:769-775 (1991)；Allenら、"A role for Cdc42 in macrophag chemotaxis," J. Cell. Biol. 141:1147-1157 (1998)に記載されている、いずれの文献も本明細書に援用される)を使用して、ＶＥＧＦ(ヒト組み換え体、１６５アミノ酸のホモダイマー型、ペプロテック社(Peprotec Inc.)、ロッキーヒル(Rochy Hill)、ニュージャージー州、から購入)の安定な濃度勾配中で、神経前駆細胞の化学走化性を直接観察し記録した。ある実験では組換えヒトＶＥＧＦ-ＣΔNΔC(Ｍ. Ｓｋｏｂｅ博士、癌センター(Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ)、マウントサイナイメディカルセンター(Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ)、ニューヨーク)を使用した。ダンチャンバーは、ヘルバー(Ｈｅｌｂｅｒ)細菌計数チャンバーから中央のプラットフォームに円形のウェルを削りだして、内側のウェルと外側のウェルの間に１ｍｍの幅の環状ブリッジを残すことにより作成される。装置の外側のウェルに加えられた化学走化性物質はブリッジを介して分散して、チャンバーの内側のブラインドウェルに達し勾配を形成する。この装置は、勾配の方向に関して移動の方向を決定することを可能にする。
【００３３】
細胞を有するカバーガラスをチャンバー上に逆さにして、同心円の内側のウェルと外側のウェルの間の環状ブリッジを通過する細胞移動を記録し、細胞の移動を評価するのに２時間を選択した。これらの試験で体系的サンプリングを適用し、チャンバーの移動領域内のすべての細胞を記録し分析した。データは、ハママツ(ＨＡＭＡＭＡＴＳＵ)ＣＣＤビデオカメラでツァイス(Ｚｅｉｓｓ)１０×対物レンズを使用してオープンラボ(Ｏｐｅｎｌａｂ)ソフトウェアを使用して１０分毎に記録した。
【００３４】
これらの化学走化性実験では、ダンチャンバーの外側のウェルに２００ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦと２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ-２とを含有する培地で満たし、同心円の内側のウェルに培地とＦＧＦ-２のみで満たした。化学運動性実験のために、ＶＥＧＦ(２０ｎｇ／ｍｌ)又はＦＧＦ-２(２０ｎｇ／ｍｌ)をダンチャンバーの外側のウェルと内側のウェルの両方に加えた。
【００３５】
細胞移動の散布図を使用して細胞運動の方向性を分析した。当該散布図は、チャンバーの外側のウェルの位置が垂直に上を向く(ｙ方向)ように配置させた。各点は記録時間の最後の細胞の最終的位置であり、移動の出発点は２つの軸の交点に固定される。
【００３６】
２時間の記録時間中の前進移動の効率を測定するために、各細胞の前進移動指数(ＦＭＩ)を総経路長(細胞がフィールド中を移動した総距離)に対する前進移動距離(細胞がＶＥＧＦ源の方向に移動した正味の距離)の比として計算した(Ｆｏｘｍａｎら、１９９９)。細胞がＶＥＧＦ源から離れて移動する時ＦＭＩ値はマイナスである。２時間の間に記録された各経過時間間隔について細胞の速度を計算した。
【００３７】
図２Ａと２Ｂに示すように、ダンチャンバーの外側のウェルに加えられた化学誘引物質はブリッジを介して内側のウェルに拡散し、チャンバーの設置の３０分以内に線形の呈上勾配を生成する。勾配は以後約３０時間安定なままである。ＦＧＦ-２の存在下で維持され、そして２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを用いて樹立した濃度勾配に暴露された６日目の前駆細胞は、図２Ｃに示すように強い陽性の化学走化性を示した。図２Ｃの細胞移動の散布図は、ＶＥＧＦ源への強く偏った移動を示す。これに対してＶＥＧＦを内側のウェルと外側のウェルの両方に加えた時(化学運動性条件下)、集団全体として運動性を維持した細胞は図２Ｄに示されるように移動の明らかな嗜好性は示さなかった。これらの実験では、神経前駆体化学走化性又は化学運動性の記録中に２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ-２を体系的に培地に含めた。しかしＦＧＦ-２はこれらの細胞に対して、図２ＥやＦに示すようにＶＥＧＦの存在とは無関係に、化学走化性作用は無かった。ＦＧＦ-２勾配に暴露された細胞(図２Ｅに示す)とＦＧＦ-２の均一な濃度に暴露された細胞(図２Ｆに示す)の間には移動挙動に差は検出されなかった。
【００３８】
これらの観察結果は、個々の細胞の軌跡を調べることにより確認された。図３に示すようにＶＥＧＦ勾配に暴露された神経前駆細胞は、図３Ａと３Ｂに示すようにＶＥＧＦ源に向かって効率的に移動し、一方図３ＣとＤに示した化学運動性の条件下又はＦＧＦ-２勾配に暴露した細胞は、移動中にランダムに方向転換した。
【００３９】
図４ＡとＢについて細胞の定量的分析により、ＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦに暴露した細胞の移動速度(図４Ａ)とＦＭＩ(図４Ｂ)の両方が、ＦＧＦ-２勾配又はＶＥＧＦもしくはＦＧＦ０-２の均一な濃度勾配に暴露した細胞の移動速度とＦＭＩより有意に大きいことを明らかになった(化学運動性)。ＶＥＧＦの誘引作用はラミニン-、ポリ-Ｌ-リジン-、マトリゲル-被覆カバーガラスに対して同様であった。これらのデータは、ＶＥＧＦがＦＧＦ-２で刺激された神経前駆細胞の誘因物質であり、この作用がマトリックスに非依存性であるということを示す。
ＶＥＧＦ-ＣΔNΔCについて同様の結果が得られた。
【００４０】
実施例３：神経前駆細胞はＶＥＧＦを発現する
ＲＮＡ精製とＲＮａｓｅ保護アッセイ
ＦＧＦ-２中で培養６日目の又はＦＧＦ-２を１２時間枯渇後の神経前駆細胞をＲＮＡ調製に使用した。総細胞ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬(インビトロゲン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ))を使用して精製した。Ｐｅｐｐｅｒら(２０００)が記載したようにｃＲＮＡプローブを使用して、ラットＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２についてＲＮａｓｅ保護アッセイを行った。
【００４１】
免疫沈降とウェスタンブロッティング
ＦＧＦ-２中の通常のカルチャーから得た神経前駆細胞、又はＦＧＦ-２を１２時間枯渇後のカルチャーから得た神経前駆細胞を溶解させ、マウスＶＥＧＦＲ２カルボキシ末端中のアミノ酸１１５８〜１３４５を認識するポリクローナル抗体(ｓｃ-５０４；サンタクルツバイオケミカルズ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ)、サンタクルツ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ)、カリホルニア州)を用いて、細胞溶解物からＶＥＧＦＲ-２タンパク質を免疫沈降させた。マウスカルボキシ末端アミノ酸１３４８〜１３６７を認識するポリクローナル抗ＶＥＧＦＲ-２抗体(ｓｃ-３１５；サンタクルツバイオケミカルズ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ))を用いてウェスタンブロットを行った。
【００４２】
ＦＧＦ-２刺激した神経前駆細胞はＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２とを発現した。図５Ａに見られるようにこれらの培養物中でＶＥＧＦＲ-３のｍＲＮＡは検出されなかった。ＦＧＦ-２を１２時間枯渇後、図５ＡとＢに示すように、ＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２転写体レベルの顕著な５倍の低下があった。これらの結果は、ＦＧＦ-２刺激した神経前駆細胞はＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２の両方のｍＲＮＡを発現するが、ＶＥＧＦＲ-３は発現せず、この発現にはＦＧＦ-２が必要であることを証明する。
【００４３】
ＶＥＧＦ受容体発現のダウンレギュレーション及び化学走化性応答の欠如が、ＦＧＦ-２の非存在下における細胞の死滅又は傷害のため生じる可能性は低く、これは以下により証明される：１)ＦＧＦ-２を１２時間除去後も、Ｂ２７を加えた神経基礎培地で維持した細胞は対照培養物と比較して形態の差を示さなかった；２)細胞核のヘキスト３３２５８染色は、ＦＧＦ-２の存在下又は非存在下で維持した培養物間で差を示さなかった；３)ビデオ分析は、ＦＧＦ-２の非存在下の細胞がＦＧＦ-２存在下の対照細胞と同じ移動速度でランダムな移動を示すことを明らかにした；４)ＦＧＦ-２枯渇は、酸性リボゾームホスホタンパク質(Ｐ０)の発現を変化させなかった。インビトロでＦＧＦ-２は、前駆細胞の有糸分裂活性を刺激し、これらの細胞を未分化状態で維持することが知られている(Ｐａｌｍｅｒら、1997；Tropepeら、１９９９)。培養物からのＦＧＦ-２の除去は、ＦＧＦ-２刺激前駆体の分化を誘導するのに使用される標準的方法(Palmerら、1997；Tropepeら、１９９９)であるため、より分化した前駆体はＶＥＧＦＲ発現とＶＥＧＦに応答する能力とを喪失するかも知れない。しかしＦＧＦ-２除去の作用は８時間後の培地へＦＧＦ-２を再適用することにより可逆的であった。ＶＥＧＦ受容体発現もまた、分化ニューロン中でＦＧＦ-２により誘導されうる。
【００４４】
実施例４：ＶＥＧＦＲ-２リガンド誘導性の化学走化性はＶＥＧＦＲ-２により仲介される
実施例２の工程後の神経前駆細胞にＭＦ１(ＶＥＧＦＲ-１阻止抗体)とＤＣ１０１(ＶＥＧＦＲ-２阻止抗体)(イムクローンシステムズ社(ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ)、ニューヨーク)の両方を２０μｇ／ｍｌで加え、対応するＶＥＧＦ受容体の機能を阻止するのに使用した。ポリシアル酸阻止抗体を対照として使用した。
【００４５】
図６ＡとＣに示すように、ＶＥＧＦに対する細胞の化学走化性応答はＤＣ１０１により完全に無くなった。これに対して、図６Ａに示すようにＭＦ１は化学走化性に影響を与えなかった。これらの観察結果は図６Ｂに記載のように速度とＦＭＩの測定により確認された。ＶＥＧＦ勾配の非存在下では抗ＶＥＧＦＲ-２の添加は神経前駆細胞移動に大きな影響を与えなかった。これらの実験は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ-２を介した前駆細胞の化学走化性を刺激することを証明する。
【００４６】
この結論は、化学走化性を誘導するのにＶＥＧＦ-ＣΔNΔCの濃度を使用した実験によりさらに支持された。ＶＥＧＦ-ＣΔNΔCは前駆細胞の化学走化性を効率的に誘導し、この作用がＶＥＧＦＲ２阻止抗体により妨害される(データは示していない)ことが観察された。さらにＶＥＧＦ-ＣΔNΔCはＶＥＧＦＲ-２及びＶＥＧＦＲ-３を介してその機能を果たすため、及びＶＥＧＦＲ３はＦＧＦ-２刺激神経前駆細胞により発現されないため、これらの結果は、ＶＥＧＦＲ-２を介したシグナル伝達がＶＥＧＦによる前駆細胞の化学誘引を仲介するという結論を強化する。
【００４７】
実施例５：ＶＥＧＦ-２リガンドが神経前駆細胞の化学走化性を刺激するのにＦＧＦ-２が必要である
ＦＧＦ-２の非存在下でのＶＥＧＦに対する前駆体の移動応答を調べた。培養５日目の細胞は、１２時間ＦＧＦ２を枯渇させ、次にＶＥＧＦ勾配に暴露した(実施例３を参照)。図７Ｂに示すように、ＦＧＦ２が枯渇した細胞はＶＥＧＦに応答する化学走化性を受けなかった。細胞は均一な濃度のＶＥＧＦに暴露された時のようにランダムに移動した。これらの結果に一致して、及びＲＮａｓｅ保護アッセイのデータ(図５と実施例３に示す)を追認して、ウェスタンブロット解析はＦＧＦ-２の非存在下でＶＥＧＦＲ-２タンパク質の発現をほとんど又は全く示さず、一方図７Ｅに示すようにＦＧＦ-２の存在下では大きな発現が検出された。
【００４８】
ＦＧＦ-２除去の作用が可逆的かどうか及び培養物へのＦＧＦ-２の再適用によりＶＥＧＦに対して細胞が化学走化性に応答するかどうかを調べるために、ＦＧＦ-２を１２時間枯渇後に培地に含め、細胞をさらに８時間培養した。図７Ｃに示す運動性細胞の移動の散布図及び図７Ｄに示す前進移動指数と速度の定量的分析は、化学走化性の喪失がＦＧＦ-２で８時間再インキュベートした後に回復されることを証明した。まとめるとこれらのデータは、ＶＥＧＦＲ２の発現とＶＥＧＦの濃度勾配に対する前駆体の充分な移動応答にＦＧＦ-２が必要であることを証明する。
【００４９】
実施例６：ＶＥＧＦ-２リガンドは脳室下帯からの神経前駆細胞の移動に影響を与える
１日齢のスプラーグ-ドーレイ(Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ)ラットの子(シズブ(Ｓｉｚｖ)、チューリヒ、スイス)の脳の前頭葉を単離し、マキルワイン(ＭｃＩｌｌｗａｉｎ)組織チョッパーを用いて３００μｍの厚さの冠状切片に切断した。これらの切片から、脳室下帯(ＳＶＺ)の前部を顕微解剖した。ＳＶＺ外植片をコラーゲンマトリックスに包埋し、無血清の化学基礎培地(５０％ダルベッコー改変イーグル培地［ギブコ(Ｇｉｂｃｏ)、ベルリン、ドイツ］、５０％ Ｆ１２、ヘペス、トリス塩酸、及びヒト・トランスフェリン２０μｇ／ｍｌ、プトレスシン１００μＭ、セレン酸ナトリウム３０ｎＭ、トリヨードサイロニン １ｎＭ、ドコサヘキサエン酸 ０.５μｇ／ｍｌ、アラキドン酸 １μｇ／ｍｌ、インスリン ６０Ｕ／ｌを加えた)中で５％ＣＯ2下で７日間培養した。培地を３日毎に交換した。同時培養実験のために、ＶＥＧＦを分泌するように操作したマウスＣ2Ｃ12筋原細胞の存在下でＳＶＺ外植片を培養した(Rinschら、２００１)。Ｃ2Ｃ12細胞を、ＳＶＺ外植片から約１,０００μｍの距離に置いたコラーゲンマトリックスの液滴中に懸濁した。対照として同じ起源の擬似トランスフェクト細胞を、同様の方法で同じ距離で、しかし外植片の反対側でコラーゲンマトリックスに入れた。
【００５０】
培養７日目の最後に細胞移動を評価した。３つの分類を作成した：１、移動無し：外植片から出ていった細胞が全く無いか又はほんの数個である；２、対称移動：多くの細胞が外植片から離れ、細胞の移動前線の距離は５０μｍを超え、移動の方向性は無かった：３、非対称又は指向性移動：移動前線の距離が反対側の少なくとも２倍であり、５０μｍを超えた。
【００５１】
図８Ｂと８Ｄに示すように、外植片をＦＧＦ-２(２０ｎｇ／ｍｌ)の存在下でモックトランスフェクト細胞の凝集物と同時培養すると、移動細胞は暴露の周りに対称に分布した(１０／１０外植片)。図８Ａと８Ｅに示すように、ＶＥＧＦ発現細胞を片側に置き、モックトランスフェクト細胞を反対側に置いて、ＳＶＺ外植片をＦＧＦ-２の存在下で同時培養すると、細胞移動は非対称性が高かった(１０／２０外植片は細胞が主にＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞に向かって移動し、１０／２０外植片は対称的移動パターンを有した)。これに対して図８Ｃに示すように、外植片をＦＧＦ-２の非存在下で対照又はＶＥＧＦ発現細胞と同時培養すると、ＳＹＺ外植片からの大きな細胞移動は観察されなかった(１０／１０外植片)。ＦＧＦ-２の非存在下でＶＥＧＦを適用した後も同様の結果が得られた(４／４外植片)。ＶＥＧＦとＦＧＦ-２を一緒に又はＦＧＦ-２単独で適用すると対称的移動が得られた(１２／１２)。ＶＥＧＦに応答して移動する細胞が未成熟前駆体であるかどうかを調べるために、抗ネスチン抗体を用いる免疫細胞化学染色を行った。図８Ｆに見られるように、移動する細胞はネスチンに対して陽性に染色され、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ(未成熟ニューロンのマーカー、示していない)については陰性であり、これらが確かに未成熟前駆細胞であることが確認された。まとめるとこれらの結果は、未成熟前駆細胞がＶＥＧＦ勾配に応答して移動し、この作用にはＦＧＦ-２が必要であることを示す。
【００５２】
前記説明と例は本発明を例示するためのみに提供されたものであり、決して本発明を限定するものではない。本発明の開示された態様及び実施態様のそれぞれは、個別に又は本発明の他の態様、実施態様、及び変更態様とともに考慮される。さらに特に明記しない場合は、本発明の工程のいずれも特定の実施順序に限定されない。本発明の精神と本質を取り込んだ開示された実施態様の修飾は当業者には明らかであるが、かかる修飾は本発明の範囲内である。さらに引用されたすべての文献はその全体が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、ＦＧＦ-２の存在下で培養した神経前駆細胞の形態的及び免疫細胞化学的特徴を示す。図１Ａは、４日目の細胞の位相差顕微鏡画像を示し、図１Ｂは６日目の位相差顕微鏡画像を示す。図１Ｃは、培養６日目以後に細胞の大半がネスチンに対して免疫陽性であり、これらが未分化神経前駆細胞であることを示す。図１Ｄは、ＢｒｄＵの取り込みにより大半の細胞が増殖していることが示唆されることを示す。神経マーカー(ＴｕＪ、矢印)に陽性のまれな細胞は非増殖性である。図１Ｅと１Ｆは、ＦＧＦ-２除去の５日後に細胞がＧＦＡＰ含有星状細胞(図１Ｅ)、Ｔｕｊ陽性ニューロン(図１Ｅ)、及びＧａｌＣ陽性乏突起神経膠細胞(図１Ｆ)に分化していることを示す。細胞核を図１Ｃ、１Ｅ、及び１Ｆにおいてヘキスト(Ｈｏｅｃｈｓｔ)３３３４２で対比染色した。スケールバーは、図１Ａと１Ｂでは８０μｍ、図１Ｃでは３０μｍ；図１Ｄでは１９μｍ；図１Ｅと１Ｆでは３０μｍである。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、ＶＥＧＦにより刺激された神経前駆細胞の化学走化性を示す。図２Ａは、カバーガラスが重なったダンチャンバー(Ｄｕｎｎ ｃｈａｍｂｅｒ)の模式図(上面図)であり、内側のウェル、ブリッジ、及び外側のウェルの位置を示す。図２Ｂでは、チャンバーの内側のウェルと外側のウェルとの間の環状ブリッジ上の細胞を位相差光学顕微鏡下で観察することができる。経時的フレーム取得により細胞の移動を連続的に記録し、移動軌跡を図２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、及び２Ｆに示す分散図にプロットした。各細胞の出発点は、Ｘ軸とＹ軸の交点(０,０)であり、データ点は２時間の記録時間の最後における個々の細胞の最終位置を示す。ＶＥＧＦ(図２Ｃ)又はＦＧＦ-２(図２Ｅ)を外側のウェルに入れて化学走化性を試験した。勾配の方向は垂直上方向である。図２Ｃと図２Ｅに示すように、神経前駆細胞は化学走化性を受け、ＶＥＧＦの存在下で移動の明確な指向性を示す(図２Ｃ)が、ＦＧＦ-２(図２Ｅ)勾配では指向性を示さない。化学運動性について(図２Ｄと２Ｆ)について、等量のＶＥＧＦ又はＦＧＦ-２をチャンバーの内側のウェルと外側のウェルの両方に加えた。図２Ｂの矢印は、ダンチャンバーの外側のウェルの方向を示す。スケール棒、５０μｍ。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、神経前駆細胞の移動軌跡を示す。図３Ａは、ＶＥＧＦ勾配を登る代表的細胞(＊)を示す位相差顕微鏡写真を与える。矢印はＶＥＧＦ源を示す。図３Ｂは、ＶＥＧＦ濃度勾配の存在下での４つの代表的細胞の移動軌跡を示す。各細胞の出発点はＸ軸とＹ軸の交点(０,０)であり、ＶＥＧＦ源は上である。図３Ｃは、ＶＥＧＦの均一な濃度でランダムに移動する神経前駆細胞を示す位相差顕微鏡写真である。図３Ｄは、均一なＶＥＧＦ分布の条件下でランダムに移動する４つの代表的細胞の移動軌跡を示す。各細胞の出発点はＸ軸とＹ軸の交点(０,０)である。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、異なる条件下での移動速度(μｍ／時間)(図４Ａ)と前進移動指数(ＦＭＩ)値(図４Ｂ)とを示す。細胞移動速度は各時間経過間隔について計算し、平均速度は２時間について得た。データは少なくとも３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして示す。ＦＭＩ値は、細胞が移動する方向によりプラスか又はマイナスである。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であり、これは化学運動性又はＦＧＦ-２勾配とは大きく異なることを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、神経前駆細胞におけるＶＥＧＦ受容体発現を示す。図５Ａでは総細胞ＲＮＡが単離され、ＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡの発現がＲＮａｓｅ保護分析により評価された。精製された32Ｐ標識ラットｃＲＮＡプローブは、ＦＧＦ-２存在下又はＦＧＦ-２枯渇下で１２時間増殖させた細胞からのハイブリダイゼーションミックス(プローブ＋ｈ.ｍ.)、酵母ｔＲＮＡ、又は総ＲＮＡにハイブリダイズされた。内部対照としてラット酸性リボゾームタンパク質Ｐ０を使用し、陽性対照はラット肺であった。図５Ｂでは、ＦＧＦ-２存在下又はＦＧＦ-２枯渇下で１２時間培養した細胞中のＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２発現の定量分析を示す。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であり、これはＦＧＦ-２中の細胞とは大きく異なる(ｎ＝３ 実験)。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、神経前駆細胞〜ＶＥＧＦＲ-２のＶＥＧＦ刺激化学走化性を示す。図６Ａは、対照条件下又はＶＥＧＦ受容体ブロッカーの存在下での神経前駆細胞の移動パターンを示す。ＶＥＧＦＲ-２阻止抗体(ＤＣ１０１)を用いて処理した細胞は、ＶＥＧＦに対する化学走化性応答を喪失した。これに対してＶＥＧＦＲ-１阻止抗体(ＭＦ１)は、前駆体移動に影響を与えなかった。図６Ｂは、異なる移動条件下での速度とＦＭＩを示す。図６Ｃと６Ｄは、ＶＥＧＦＲ-２阻止抗体(図６Ｃ)又は対照(ポリシアル酸阻止)抗体(図６Ｄ)の存在下で、ＶＥＧＦ濃度勾配に暴露した代表的細胞(各条件４個)の移動軌跡を示す。各細胞の出発点はＸ軸とＹ軸の交点(０,０)であり、ＶＥＧＦ源は濃度勾配の上である。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であり、これはＤＣ１０１処理細胞とは大きく異なる。
【図７】図７Ａ〜Ｅは、ＶＥＧＦ勾配に化学走化性的に応答する神経前駆細胞の能力であって、ＦＧＦ-２により増強された能力を示す。図７Ａでは第１の群について５日目に１２時間ＦＧＦ-２を除去し、次に細胞をＶＥＧＦ勾配に暴露した。図７Ｂでは１２時間枯渇後にＦＧＦ-２の存在下で第２の群を８時間さらに培養し、次にＶＥＧＦ勾配で試験した。図７Ｃは２時間移動後の細胞の最終位置を示し、各細胞の出発点は(０,０)でありＶＥＧＦ源は上である。図７Ｄは速度とＦＭＩとを示す。データは４つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして示す。１２時間のＦＧＦ-２枯渇後、細胞はＶＥＧＦ勾配に対する化学走化性応答を喪失する。枯渇した神経前駆細胞は、培養物にＦＧＦ-２を８時間再添加後にＶＥＧＦに対する化学走化性応答を再開する(図７Ｃ)。図７Ｅは、ＦＧＦ-２で培養したか又はＦＧＦ-２を１２時間枯渇させて培養した神経前駆細胞中のＶＥＧＦＲ-２発現を示す。抗ＶＥＧＦＲ-２抗体を用いて免疫沈殿物についてウェスタンブロット解析を行った。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であった。
【図８】図８Ａ〜Ｆは、脳室下帯(ＳＶＺ)外植片から移動する神経前駆細胞に対するＶＥＧＦの作用を示す。ＳＶＺ外植片は、コラーゲンゲルマトリックス中でＦＧＦ-２の存在下(図８Ａ、８Ｂ、８Ｄ、８Ｅ、及び８Ｆ)又は非存在下(図８Ｃ)でＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞及び／又は擬似トランスフェクトＣ2Ｃ12細胞と同時培養した。図８ＡではＦＧＦ-２の存在下で、神経前駆細胞は非対称的にＳＶＺ外植片から出ていき、より多くの細胞が対照のＣ2Ｃ12細胞よりＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞の側にあった。図８Ｂでは両側で対照Ｃ2Ｃ12細胞とともに培養した時、神経前駆細胞は非対称的にＳＶＺ外植片から出ていく。図８Ｃでは、ＦＧＦ-２の存在下でＳＶＺ外植片から出ていく細胞はほとんどないか全く無い。図８Ｄは、対照Ｃ2Ｃ12細胞の側でＳＶＺ外植片を示す高倍率顕微鏡写真である。図８Ｅは、ＳＶＺ外植片を出てＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞へ向かう多くの神経前駆細胞を示す高倍率顕微鏡写真である。図８Ｆでは、ＳＶＺ外植片を出ていく細胞はネスチン(未分化神経前駆細胞のマーカー)陽性である。スケールバーは、図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃでは７００μｍ；図８Ｄと８Ｅでは１００μｍ；図８Ｆでは５０μｍである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経前駆細胞の移動を調節するための方法と組成物、及び神経細胞の消失又は傷害に関与する症状の治療方法、及び神経細胞移動障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発生中の未成熟ニューロンの移動は、神経系の正しい構成に必須である。哺乳動物の脳ではほとんどのニューロンが脳室の周辺の増殖領域内で生成され、そこから未成熟前駆体が大脳壁（cerebral wall)の特異的部位に移動する。種々の臨床的症状(種々の型の脳回欠損を含む)は、神経細胞の移動の欠陥に関連する。これらの形成異常の結果は、精神遅滞、てんかん、麻痺、及び失明がある。これらの障害の一部の遺伝的研究によりニューロン移動の制御がある程度理解され、これは過去１０年間に急速に進展した。
【０００３】
早期発生で重要な役割を果たす以外に、ニューロン移動はまた成体脳にとっても重要である。例えば鳴禽類の脳では、成人期の構造の可塑性と学習にニューロン発生とニューロン移動が必要である。最近の証拠により、未分化多能性前駆細胞が、成体哺乳動物の脳において、及び成体の神経発生の間、並びに吻側脳室下帯-嗅球系と歯状回の特異的部位で起きる連続的ニューロン交換の間にも存在することが示唆される。
【０００４】
最後に、細胞の移動は創傷治癒で中心的な役割を果たす。消失又は傷害されたニューロンを交換する成体哺乳動物脳の固有の能力は非常に限定されているが、種々の因子の投与後に神経前駆細胞の移動と細胞交換が報告されている。
【０００５】
その最終目的地への未成熟ニューロンの進路決定に関与する因子や機構を理解するために、最近多くの試みがなされている。ニューロンをその最終目的地に導くために、誘引性及び反発性分子の高度に保存されたファミリーが連係して制御されている。これらの分子には、ネトリン類(ｎｅｔｒｉｎｓ)、セマホリン類(ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｓ)、エフリン類(ｅｐｈｒｉｎｓ)、スリット類(Ｓｌｉｔｓ)及び種々の神経栄養因子がある。分裂後の未成熟ニューロンの移動に比較して、神経幹細胞や未分化神経前駆細胞の移動を導く因子や機構についてはほとんど不明である。ある研究では、経膜移動測定法（transfilter migration assay)において、胎盤由来増殖因子(ＰＤＧＦ)が、ＦＧＦ-２刺激された神経前駆細胞を誘引することが示された。
【０００６】
神経前駆細胞移動においてある役割を果たす候補分子を同定することは、発生の間における正しい組織形成の理解のみならず、構造的脳修復を行うように未分化神経前駆細胞を指令する方法の開発において決定的に重要である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
ある実施態様において本発明は、細胞をＦＧＦ-２及びＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、哺乳動物をＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露して神経消失又は傷害部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む、神経細胞の消失又は傷害が関与する障害を有する哺乳動物の治療方法を提供する。
【０００８】
別の実施態様において本発明は、神経組織部位を有する哺乳動物を欠陥神経集団を用いて治療する方法を提供する。この方法は、哺乳動物をＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露して、神経組織部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む。
【０００９】
別の実施態様において本発明は、細胞上のＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか又は維持することができる化合物に細胞を暴露し、そして細胞をＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む、神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。
【００１０】
別の実施態様において本発明は、ＶＥＧＦＲ-２リガンド、ＦＧＦ-２、及び担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
別の実施態様において本発明は、ＦＧＦ-２を含む生体適合性マトリックスを含む組成物を提供する。好ましくは生体適合性マトリックスはまた、ＶＥＧＦＲ-２リガンドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明において血管内皮増殖因子-２(ＶＥＧＦＲ-２)リガンド(例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔC)は、ＶＥＧＦＲ-２を発現する神経前駆細胞の化学誘引物質であり、ここでＶＥＧＦＲ-２リガンドに応答した神経前駆細胞の移動は繊維芽細胞増殖因子-２(ＦＧＦ-２)への細胞の暴露に依存する。本発明は、細胞をＦＧＦ-２とＶＥＧＦＲ-２リガンドとに暴露することにより神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。理論に拘束はされないがＦＧＦ-２は、内因性又は外因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドが結合する神経前駆細胞上のＶＥＧＦＲ-２の発現を維持するか及び／又は上昇させると考えられる。細胞は外因性又は内因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することができる。例えば内因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドがアップレギュレートされていない時、又は哺乳動物中で神経前駆細胞の移動を刺激するには不充分な量で存在する時、細胞を外因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することができる。細胞は、ＦＧＦ-２に暴露する前、後、又は同時にＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することができる。
【００１３】
ＶＥＧＦＲ-２を発現する以外に、本発明の神経前駆細胞はネスチンを発現し、ニューロン-もしくはグリア-制限前駆細胞の抗原性マーカー(例えば、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮＥｕＮ、ＮＧ２、又はＡ２Ｂ５)及び内皮細胞マーカー(例えば、フォンウィルブラント因子及びＲＥＣＡ-１)を示さない。神経前駆細胞はまたＶＥＧＦＲ-１を発現し、好ましくはＶＥＧＦＲ-３を発現しない。
【００１４】
本発明はまた、神経前駆細胞上のＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか又は維持することができる化合物に細胞を暴露し、かつ細胞をＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む、神経前駆細胞の移動を調節する方法を提供する。ＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか維持することができる化合物の非限定例はＦＧＦ-２を含む。他の化合物は、ＶＥＧＦＲ-２の発現を上昇させるか又は維持することができる化合物についてスクリーニングすることにより決定することができる。かかるスクリーニングは、神経前駆細胞を試験化合物に暴露し、次にＶＥＧＦＲ-２発現のレベルについて測定することにより行われる。かかる発現はＶＥＧＦＲ-２抗体又は標識リガンドを使用して検出される。
【００１５】
本発明はまた、有効量のＦＧＦ-２とＶＥＧＦＲ-２及び薬剤学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。この実施態様では薬剤学的に許容されるとは、連邦政府又は州政府の監督官庁により認可されているか、又はアメリカ合衆国薬局方又は動物さらに好ましくはヒトでの使用について他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。担体という用語は、ＦＧＦ-２やＶＥＧＦＲ-２と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを示す。適当な担体の例は、Ｅ.Ｗ. Ｍａｒｔｉｎによる「レミントンの薬剤科学(Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)」に記載されている。
【００１６】
本発明はまた、ＦＧＦ-２及び好ましくはまたＶＥＧＦＲ-２リガンドを含む生体適合性マトリックスを含む組成物を提供する。生体適合性マトリックスは、哺乳動物に投与された時副作用やアレルギー反応を生成せず、神経系に投与することができる限り、天然材料から又は合成材料からも作成することができる。マトリックスは非生体分解性又は生体分解性ポリマーから作成してもよい。非生体分解性ポリマーの非限定例には、エチレン酢酸ビニル、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリアミド、これらのコポリマー及び混合物がある。生体分解性材料の非限定例には、ポリエステル、例えばポリグリコリド、ポリラクチド、及びポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー(「ＰＬＧＡ」)；ポリエーテル、例えばポリカプロラクトン(「ＰＣＬ」)；ポリ無水物；ポリアルキルシアノクリレート、例えばｎ-ブチルシアノアクリレート及びイソプロピルシアノアクリレート；ポリアクリルアミド；ポリ(オルトエステル)；ポリホスファゼン；ポリペプチド；ポリウレタン；及びかかるポリマーの混合物がある。マトリックスは、スポンジ、インプラント、チューブ、凍結乾燥成分、ゲル、パッチ、粉末、もしくはナノ粒子、又は神経系に投与できる任意の他の形がある。ＶＥＧＦＲ-２リガンドがマトリックスに加えられる時、好ましくはマトリックスはＶＥＧＦＲ-２リガンドの濃度勾配の生成を可能にする。マトリックスはさらに１つ以上の他の適当な化学走化性又は神経栄養因子、例えば増殖因子(例えば、ＰＤＧＦ、ＮＦＧ)、ネトリン、セマホリン、エフリン、スリットがある。生体適合性マトリックスを含む組成物はまた、組成物を投与される哺乳動物への外因性神経前駆細胞の移植のための神経前駆細胞を含む。神経前駆細胞は、治療される哺乳動物又は他の供給源に由来してもよい。
【００１７】
本発明はまた、ある神経障害又は症状を有する哺乳動物の治療法を提供する。例えばある実施態様において本発明は、神経細胞(ニューロンとグリア細胞の両方を含む)の消失又は傷害を含む症状を有する哺乳動物の治療法を提供する。この方法は、哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露して、神経細胞消失又は傷害の部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む。神経細胞の消失又は傷害を含む症状の非限定例は、例えば脳卒中、虚血、酸素欠乏又は頭部外傷がある。
【００１８】
別の実施態様において本発明は、哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露して欠陥神経組織部位への神経前駆細胞の移動を刺激することにより、欠陥神経集団を用いて神経組織部位を有する哺乳動物の障害を治療する方法を提供する。欠陥神経集団を有するある神経組織を特徴とするかかる障害には、発生している神経系中のニューロンの異常な移動により引き起こされる出産時欠損に至るものがある。ニューロンのかかる異常な移動はニューロンの正しくない配置を引き起こし、必要なニューロン集団が欠如したある神経組織部位ができる。これらの障害は、脳(例えば、大脳半球、小脳、脳幹、又は海馬)の構造異常又は欠失した領域を引き起こす。かかる異常な移動の結果としての構造異常は、例えば分裂脳症(ｓｃｈｉｚｏｃｅｐｈａｌｙ)、孔脳症、無脳回、脳回欠損、大脳回、脳回肥厚、小脳回、小多脳回、神経異所的形成、脳梁非形成、及び脳神経非形成がある。本発明は、神経前駆細胞を発生中の神経系の正しい部位に向けることにより、かかる障害を治療する方法を提供する。例えば、もしニューロンが小脳へ移動せず、ニューロン集団が欠如した小脳になると、本発明の方法は小脳への神経前駆細胞の移動を刺激するための手段を提供する。
【００１９】
本発明の神経障害又は症状を治療する方法は、内因性神経前駆細胞を刺激するために、及び／又は哺乳動物に移植される外因性神経前駆細胞を刺激するために使用される。本発明の方法に従って哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露することは、神経前駆細胞を内因性又は外因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドと内因性又は外因性ＦＧＦ-２とに暴露することを含む。もし内因性ＶＥＧＦＲ-２リガンドがアップレギュレートされていないか、又は哺乳動物中で神経前駆細胞の移動を刺激するには不充分な量で存在するなら、例えば外因性ＶＥＧＦＲ-２を哺乳動物に積極的に投与することができる。ＶＥＧＦＲ-２リガンドは、ＦＧＦ-２に暴露する前、後、又は同時に投与することができる。病変の場合は、内因性ＶＥＧＦは哺乳動物中ではアップレギュレートされているため、ＶＥＧＦＲ-２リガンドの投与は不要なことがある。同様に内因性ＦＧＦ-２が神経前駆細胞の移動を刺激するには不充分な量で存在するなら、外因性ＦＧＦ-２を哺乳動物に積極的に投与することができる。
【００２０】
哺乳動物は、当該分野で公知の任意の方法により、ＦＧＦ-２、ＶＥＧＦＲ-２リガンド及び／又は神経前駆細胞に暴露することができる。例えば哺乳動物は、神経前駆細胞が必要な神経部位への、又は内因性神経前駆細胞の移動を刺激する場合は、内因性神経前駆細胞が位置する神経部位への、カテーテルを介する直接投与により、これらの物質に暴露することができる。好適な実施形態において、ＦＧＦ-２、ＶＥＧＦＲ-２リガンド、及び／又は内因性神経前駆細胞は、上記したように生体適合性マトリックスを含む組成物の一部として投与される。さらにこの方法は、１つ以上の他の適当な化学走化性又は神経栄養性因子、例えば増殖因子(例えば、ＰＤＧＦ、ＮＦＧ)、ネトリン、セマホリン、エフリン、スリットを哺乳動物に投与することをさらに含む。
【００２１】
本発明の方法により治療可能な神経障害の同定は、当業者の能力と知識の範囲内である。例えば当該分野の臨床家は、例えば臨床試験、診断法、及び物理的観察により、個体が神経傷害もしくは喪失又は神経移動障害に罹っているかどうか、そうして本発明のＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２への暴露の候補であるかどうかを容易に決定することができる。
【００２２】
哺乳動物は神経前駆細胞の移動を指令するのに充分な量のＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露することができる。細胞培養測定法と動物試験から得られるデータは、哺乳動物(例えばヒトを含む)で使用するための用量範囲を剤形する際に利用することができる。具体的な障害又は症状の治療に有効な量は、障害又は症状の性質に依存し、標準的な臨床的方法により決定することができる。さらに最適な用量範囲を画定するのを助けるために、インビトロ測定法を使用してもよい。この用途に有効な量は例えば障害の重症度に依存する。投与スケジュールはまた、疾患状態と患者の状態により変化し、典型的には単回の大量投与か又は連続的注入から１日当たり複数回の投与があり、又は担当医師及び患者の状態により示される。しかし本発明は決してこれらの特定の投与法に限定されないことを理解されたい。
【００２３】
本発明はまた、ＦＧＦ-２及び／又はＶＥＧＦＲ-２を充填した１つ以上の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。
【００２４】
神経前駆細胞が哺乳動物に移植される実施態様において、神経前駆細胞の集団は当該分野で公知の方法により哺乳動物ドナーから単離することができる。例えば神経前駆細胞は、インビボで分裂細胞(例えば、成体脳の脳室下帯(ＳＶＺ)又は海馬、及び発生中の脳の種々の構造体、例えば海馬、脳皮質、小脳、神経冠、及び基底前脳)を含有することが証明されている胎児又は成体の神経組織の領域を解剖することにより、インビトロで単離することができる。次に神経組織はばらばらにされ、分離した細胞は、結合のための基質としてのマトリックス上の規定培地又は補足培地中の高濃度のＦＧＦ-２又は表皮増殖因子-２(ＥＧＦ)のような分裂促進因子に暴露される(かかる方法は、Ｍ. Ａｌｉｓｏｎら、Ｊ. Ｈｅｐａｔｏｌ. ２６, ３４３ (１９９７) 及びＪ.Ｍ.Ｗ. Ｓｌａｃｋ, Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ, １２１, １５６９ (１９９５)に記載されている、いずれも本明細書に援用される)。次に、分離した細胞は、本発明の神経前駆細胞に特徴的な抗原マーカー(例えばネスチン又はＶＥＧＦＲ-２)に特異的に結合する分子に暴露することができる。これらの抗原マーカーを発現する細胞は結合分子に結合して、神経前駆細胞の単離を可能にする。神経前駆細胞が当該分子を取り込まない場合、分子は当該分野で公知の方法により細胞から分離される。例えば抗体は、低ｐＨを有する溶液又はキモトリプシンのようなプロテアーゼに短時間暴露することにより細胞から分離される。
【００２５】
神経前駆細胞の集団を単離するのに使用される分子は、神経前駆細胞の同定と分離を促進する標識物と結合してもよい。かかる標識物の例には磁性ビーズとビオチンがあり、これはアビジン又はストレプトアビジンと蛍光物質に対する親和性を利用して同定又は分離される。
【００２６】
陰性選択により好ましくない細胞を除去する方法もまた使用できる。例えば細胞は本発明の神経前駆細胞に特徴的ではない抗原マーカー(例えば、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、Ａ２Ｂ５)に暴露され、これらの分子に結合する細胞は除去することができる。
【００２７】
神経前駆細胞がいったん単離されると、これらはＦｌａｘら、「移植可能なヒト神経幹細胞は発生のてがかりに応答し、ニューロンを交換し、外来遺伝子を発現する」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ., １６：１０３３-１０３９ (１９９８)；ＵｃｈｉｄａとＢｕｃｋ、「ヒト中枢神経系幹細胞の直接単離」、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ９７：１４７２０-１４７２５ (２０００)；Ｂｒｕｓｔｌｅら、「ラット胚への胎児ヒト脳細胞の脳室内移植により作成されたキメラ脳」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ., １６：１０４０-１０４４ (１９９８)；及びＦｒｉｃｋｅｒら、「成体脳への移植後のヒト神経前駆細胞の部位特異的移動とニューロン分化」、Ｊ. Ｎｅｕｒｏｓｃｉ. １９：５９９０-６００５ (１９９９)(これらのすべては、本明細書に援用される)に記載のような当該分野で公知の方法により哺乳動物の神経系の所望の部位に移植される。
【実施例】
【００２８】
実施例１：神経前駆細胞の単離と培養
新生児ラットの脳の冠状切片からＳＶＺを解剖し、機械的に分離し、当該分野で公知の方法に従ってトリプシン処理した(Ｌｉｍら、Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis、Neuron, 28:713-726 (2000)を参照のこと、当該文献は本明細書に援用される)。当該分野で公知の方法(Ｌｉｍら、２０００参照)に従ってパーコール勾配遠心分離を使用してＳＶＺ前駆体を精製し、マトリゲル(０.２４ｍｇ／ｃｍ2)又はラミニン被覆カバーガラス上に蒔いた。単離した細胞は、２０ｎｇ／ｍｌ・ＦＧＦ-２、１×Ｂ２７、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ・Ｎ-アセチル-システイン、及び１％ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた神経基礎培地(Neurobasal medium)で増殖させた。培養物に３日毎に２０ｎｇ／ｍｌ・ＦＧＦ-２を含有する新鮮な培地を与えた。
【００２９】
培養物の免疫染色を当該分野で公知の方法に従って行った(Wangら、"Functional N-methyl-D-aspartate receptors in O-2A glial precursor cells: a critical role in regulating polysialic acid-neural cell adhesion molecule expression and cell migration,"J. cell Biol., 135:1565-1581 (1996)；Vutskitsら"PSA-NCAMmodulates BDNF-dependent survival and differentiation of cortical neurons,Eur. J. Neurosci., 13:1391-1402 (2001)参照のこと。いずれの文献も本明細書に援用される)。以下の一次抗体と希釈率を使用した：ネスチンに対するマウスモノクローナル抗体(バイオジェネシス(Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ)、英国、１：３００希釈)；Ａ２Ｂ５に対するマウスモノクローナル抗体(Eisenbarthら"Monoclonal antibody to a plasma membrane antigen of neurons,"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4913-4917 (1979)に記載されている、これは本明細書に援用される；ハイブリドーマ上清(ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州、１：５希釈)；１２残基以上の鎖長を有するα２-８結合ＰＳＡを特異的に認識するＭｅｎ Ｂ(髄膜炎菌Ｂ群(Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒｏｕｐ Ｂ))マウスＩｇＭモノクローナル抗体(１：５００希釈)(Rougonら、"Amonoclonal antibody to a plasma membrane antigen of neurons"J. Cell. Biol., 103:2429-2437 (1986)に記載されている。当該文献は、本明細書に援用されている)；抗ＧａｌＣ(Ranschtら"Development of oligodendrocytes and Schwaqnn cells studies with a monoclonal antibody againstgalactocerebroside"、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:2709-2713 (1982)に記載される。当該文献は、本明細書に援用される)、マウスＩｇＭモノクローナル抗体(培養上清、１：５希釈)；β-チューブリンイソタイプＩＩＩに対するＴｕｊマウスモノクローナル抗体(１：４００希釈)(シグマ(Ｓｉｇｍａ)、セントルイス、ミズーリ州)；ＧＦＡＰに対するウサギポリクローナル抗体(ダコパッツ(Dakopatts)、コペンハーゲン、デンマーク、１：２００希釈)；ＮＧ２に対するウサギポリクローナル抗体(ケミコンインターナショナル(Chemicon International)、カリフォルニア州、１：４００希釈)；ダブルコルチン(Doublecortin)に対するヤギポリクローナル抗体(サンタクルズ・バイオテクノロジー(Santa Cruz Biotechnology)、１：３００希釈)；ＮｅｕＮに対するマウスｍＡｂ(ケミコンインターナショナル(Chemicon International)、カリフォルニア州、１：１００希釈)。ＮＣＡＭタンパク質コアに対するウサギ抗血清は、ＮＣＡＭ(１：１０００希釈)の７つのＮＨ-２-末端残基を認識する部位特異的抗体であった(RougonとMarshak、「哺乳動物神経細胞接着分子のアミノ末端ドメインの構造的及び免疫学的特徴解析」、J. Biol. Chem., 261:3396-3401 (1986)参照、これは本明細書に援用される)。未分化乏突起神経膠細胞を同定するためにＯ４モノクローナル抗体(ハイブリドーマ上清、１：５希釈)(Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、１９７９に記載されている)を使用した。ある場合にはヘキスト３３２５８を使用して細胞核を対比染色した。蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察した(アイシオフォト(Ａｘｉｏｐｈｏｔ)；ツァイス(Ｚｅｉｓｓ)、オベロチェン(Ｏｂｅｒｌｏｃｈｅｎ)、ドイツ)。非特異的マウスＩｇＭ又はＩｇＧ免疫前血清又は二次抗体のみで処理した対照は、染色を示さなかった。２重免疫標識実験では、１つの一次抗体のみを使用して、次に抗マウスＦＩＴＣ結合二次抗体と抗ウサギＴＲＩＴＣ結合二次抗体を加えると、１つのみが標識された。ＢｒｄＵの２０時間取り込み後にＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体(ベーリンガー(Boehringer)、１：５０希釈)を用いて、増殖している細胞を同定した。
【００３０】
細胞を蒔いた４日後、図１Ａに見られるように細胞は未成熟な丸い又は二極性の形態を有した。分裂し密ではないコロニーを形成する細胞を毎日観察し、６日目までには図１Ｂに示すように単層を形成した。単層により、細胞はより均一にＦＧＦ-２に暴露され、未分化前駆細胞の均一な集団の形成が促進される。この段階で大多数(９８％)の細胞は、図１Ｃに見られるように抗ネスチン抗体で染色された。ネスチンは神経前駆細胞のマーカーと見なされる。神経マーカーＴｕｊを発現した細胞は３.２％未満であった。図１Ｄに見られるように、ＰＳＡ-ＮＣＡＭとＢｒｄＵ取り込みはこれらの細胞が分裂しないことを示した。ＧＦＡＰ又はＧａｌＣ(それぞれ星状細胞と乏突起神経膠細胞のマーカー)に対する免疫反応性を示した細胞はほとんどないか全くなかった。これらの存在はおそらく、前駆体の単離と精製後の初期細胞集団における汚染のためであろう。いくつかの分化細胞は例外として、ＦＧＦ-２の存在下で維持された前駆細胞はＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、又はＡ２Ｂ５を含む神経-又はグリア-制限前駆細胞の抗原マーカーを示さなかった(データは示していない)。さらにネスチン陽性細胞は、フォンウィルブラント因子やＲＥＣＡ-１のような内皮細胞マーカーは陰性であった(データは示していない)。これらの結果により、培養物が、ニューロン又はグリア細胞に対する細胞系統特異的マーカーを未だ持たない未成熟細胞であることが示された。
【００３１】
ニューロン及びグリア分化の両方を刺激することがすでに証明されている条件下で培養物を分化させると(Palmerら、"The adult hippocampus contains primordial neural stem cells"Mol. Cell. Neurosci., 8:389-404 (1997)に記載されている)、図１Ｅに見られるように集団の９６％以上が神経及び星状細胞マーカーに対する免疫反応性を示した(Ｔｕｊ＋、２１％、ＧＦＡＰ＋、７５％)。残りの集団は、図１Ｆに見られるように乏突起神経膠細胞マーカーＡ２Ｂ５又はＧｒａｌＣに対して免疫反応性であった。これらの観察結果はＦＧＦ-２で育てた細胞が、ニューロン、星状細胞、及び乏突起神経膠細胞(中枢神経系の３つの主要な細胞の種類)を発生させる多能性神経前駆細胞であることを示す。
【００３２】
実施例２：ＦＧＦ-２刺激神経前駆細胞の移動はＶＥＧＦＲ-２リガンドにより調節される
ダン(Dunn)化学走化性チャンバー(ウェーバーサイエンティフックインターナショナル社(Weber Scientific International Ltd.)、テディントン(teddington)、英国)(Zichaら、"A new direct viewing chemotaxis"J. Cell Sci., 99:769-775 (1991)；Allenら、"A role for Cdc42 in macrophag chemotaxis," J. Cell. Biol. 141:1147-1157 (1998)に記載されている、いずれの文献も本明細書に援用される)を使用して、ＶＥＧＦ(ヒト組み換え体、１６５アミノ酸のホモダイマー型、ペプロテック社(Peprotec Inc.)、ロッキーヒル(Rochy Hill)、ニュージャージー州、から購入)の安定な濃度勾配中で、神経前駆細胞の化学走化性を直接観察し記録した。ある実験では組換えヒトＶＥＧＦ-ＣΔNΔC(Ｍ. Ｓｋｏｂｅ博士、癌センター(Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ)、マウントサイナイメディカルセンター(Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ)、ニューヨーク)を使用した。ダンチャンバーは、ヘルバー(Ｈｅｌｂｅｒ)細菌計数チャンバーから中央のプラットフォームに円形のウェルを削りだして、内側のウェルと外側のウェルの間に１ｍｍの幅の環状ブリッジを残すことにより作成される。装置の外側のウェルに加えられた化学走化性物質はブリッジを介して分散して、チャンバーの内側のブラインドウェルに達し勾配を形成する。この装置は、勾配の方向に関して移動の方向を決定することを可能にする。
【００３３】
細胞を有するカバーガラスをチャンバー上に逆さにして、同心円の内側のウェルと外側のウェルの間の環状ブリッジを通過する細胞移動を記録し、細胞の移動を評価するのに２時間を選択した。これらの試験で体系的サンプリングを適用し、チャンバーの移動領域内のすべての細胞を記録し分析した。データは、ハママツ(ＨＡＭＡＭＡＴＳＵ)ＣＣＤビデオカメラでツァイス(Ｚｅｉｓｓ)１０×対物レンズを使用してオープンラボ(Ｏｐｅｎｌａｂ)ソフトウェアを使用して１０分毎に記録した。
【００３４】
これらの化学走化性実験では、ダンチャンバーの外側のウェルに２００ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦと２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ-２とを含有する培地で満たし、同心円の内側のウェルに培地とＦＧＦ-２のみで満たした。化学運動性実験のために、ＶＥＧＦ(２０ｎｇ／ｍｌ)又はＦＧＦ-２(２０ｎｇ／ｍｌ)をダンチャンバーの外側のウェルと内側のウェルの両方に加えた。
【００３５】
細胞移動の散布図を使用して細胞運動の方向性を分析した。当該散布図は、チャンバーの外側のウェルの位置が垂直に上を向く(ｙ方向)ように配置させた。各点は記録時間の最後の細胞の最終的位置であり、移動の出発点は２つの軸の交点に固定される。
【００３６】
２時間の記録時間中の前進移動の効率を測定するために、各細胞の前進移動指数(ＦＭＩ)を総経路長(細胞がフィールド中を移動した総距離)に対する前進移動距離(細胞がＶＥＧＦ源の方向に移動した正味の距離)の比として計算した(Ｆｏｘｍａｎら、１９９９)。細胞がＶＥＧＦ源から離れて移動する時ＦＭＩ値はマイナスである。２時間の間に記録された各経過時間間隔について細胞の速度を計算した。
【００３７】
図２Ａと２Ｂに示すように、ダンチャンバーの外側のウェルに加えられた化学誘引物質はブリッジを介して内側のウェルに拡散し、チャンバーの設置の３０分以内に線形の呈上勾配を生成する。勾配は以後約３０時間安定なままである。ＦＧＦ-２の存在下で維持され、そして２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを用いて樹立した濃度勾配に暴露された６日目の前駆細胞は、図２Ｃに示すように強い陽性の化学走化性を示した。図２Ｃの細胞移動の散布図は、ＶＥＧＦ源への強く偏った移動を示す。これに対してＶＥＧＦを内側のウェルと外側のウェルの両方に加えた時(化学運動性条件下)、集団全体として運動性を維持した細胞は図２Ｄに示されるように移動の明らかな嗜好性は示さなかった。これらの実験では、神経前駆体化学走化性又は化学運動性の記録中に２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ-２を体系的に培地に含めた。しかしＦＧＦ-２はこれらの細胞に対して、図２ＥやＦに示すようにＶＥＧＦの存在とは無関係に、化学走化性作用は無かった。ＦＧＦ-２勾配に暴露された細胞(図２Ｅに示す)とＦＧＦ-２の均一な濃度に暴露された細胞(図２Ｆに示す)の間には移動挙動に差は検出されなかった。
【００３８】
これらの観察結果は、個々の細胞の軌跡を調べることにより確認された。図３に示すようにＶＥＧＦ勾配に暴露された神経前駆細胞は、図３Ａと３Ｂに示すようにＶＥＧＦ源に向かって効率的に移動し、一方図３ＣとＤに示した化学運動性の条件下又はＦＧＦ-２勾配に暴露した細胞は、移動中にランダムに方向転換した。
【００３９】
図４ＡとＢについて細胞の定量的分析により、ＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦに暴露した細胞の移動速度(図４Ａ)とＦＭＩ(図４Ｂ)の両方が、ＦＧＦ-２勾配又はＶＥＧＦもしくはＦＧＦ０-２の均一な濃度勾配に暴露した細胞の移動速度とＦＭＩより有意に大きいことを明らかになった(化学運動性)。ＶＥＧＦの誘引作用はラミニン-、ポリ-Ｌ-リジン-、マトリゲル-被覆カバーガラスに対して同様であった。これらのデータは、ＶＥＧＦがＦＧＦ-２で刺激された神経前駆細胞の誘因物質であり、この作用がマトリックスに非依存性であるということを示す。
ＶＥＧＦ-ＣΔNΔCについて同様の結果が得られた。
【００４０】
実施例３：神経前駆細胞はＶＥＧＦを発現する
ＲＮＡ精製とＲＮａｓｅ保護アッセイ
ＦＧＦ-２中で培養６日目の又はＦＧＦ-２を１２時間枯渇後の神経前駆細胞をＲＮＡ調製に使用した。総細胞ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬(インビトロゲン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ))を使用して精製した。Ｐｅｐｐｅｒら(２０００)が記載したようにｃＲＮＡプローブを使用して、ラットＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２についてＲＮａｓｅ保護アッセイを行った。
【００４１】
免疫沈降とウェスタンブロッティング
ＦＧＦ-２中の通常のカルチャーから得た神経前駆細胞、又はＦＧＦ-２を１２時間枯渇後のカルチャーから得た神経前駆細胞を溶解させ、マウスＶＥＧＦＲ２カルボキシ末端中のアミノ酸１１５８〜１３４５を認識するポリクローナル抗体(ｓｃ-５０４；サンタクルツバイオケミカルズ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ)、サンタクルツ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ)、カリホルニア州)を用いて、細胞溶解物からＶＥＧＦＲ-２タンパク質を免疫沈降させた。マウスカルボキシ末端アミノ酸１３４８〜１３６７を認識するポリクローナル抗ＶＥＧＦＲ-２抗体(ｓｃ-３１５；サンタクルツバイオケミカルズ(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ))を用いてウェスタンブロットを行った。
【００４２】
ＦＧＦ-２刺激した神経前駆細胞はＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２とを発現した。図５Ａに見られるようにこれらの培養物中でＶＥＧＦＲ-３のｍＲＮＡは検出されなかった。ＦＧＦ-２を１２時間枯渇後、図５ＡとＢに示すように、ＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２転写体レベルの顕著な５倍の低下があった。これらの結果は、ＦＧＦ-２刺激した神経前駆細胞はＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２の両方のｍＲＮＡを発現するが、ＶＥＧＦＲ-３は発現せず、この発現にはＦＧＦ-２が必要であることを証明する。
【００４３】
ＶＥＧＦ受容体発現のダウンレギュレーション及び化学走化性応答の欠如が、ＦＧＦ-２の非存在下における細胞の死滅又は傷害のため生じる可能性は低く、これは以下により証明される：１)ＦＧＦ-２を１２時間除去後も、Ｂ２７を加えた神経基礎培地で維持した細胞は対照培養物と比較して形態の差を示さなかった；２)細胞核のヘキスト３３２５８染色は、ＦＧＦ-２の存在下又は非存在下で維持した培養物間で差を示さなかった；３)ビデオ分析は、ＦＧＦ-２の非存在下の細胞がＦＧＦ-２存在下の対照細胞と同じ移動速度でランダムな移動を示すことを明らかにした；４)ＦＧＦ-２枯渇は、酸性リボゾームホスホタンパク質(Ｐ０)の発現を変化させなかった。インビトロでＦＧＦ-２は、前駆細胞の有糸分裂活性を刺激し、これらの細胞を未分化状態で維持することが知られている(Ｐａｌｍｅｒら、1997；Tropepeら、１９９９)。培養物からのＦＧＦ-２の除去は、ＦＧＦ-２刺激前駆体の分化を誘導するのに使用される標準的方法(Palmerら、1997；Tropepeら、１９９９)であるため、より分化した前駆体はＶＥＧＦＲ発現とＶＥＧＦに応答する能力とを喪失するかも知れない。しかしＦＧＦ-２除去の作用は８時間後の培地へＦＧＦ-２を再適用することにより可逆的であった。ＶＥＧＦ受容体発現もまた、分化ニューロン中でＦＧＦ-２により誘導されうる。
【００４４】
実施例４：ＶＥＧＦＲ-２リガンド誘導性の化学走化性はＶＥＧＦＲ-２により仲介される
実施例２の工程後の神経前駆細胞にＭＦ１(ＶＥＧＦＲ-１阻止抗体)とＤＣ１０１(ＶＥＧＦＲ-２阻止抗体)(イムクローンシステムズ社(ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ)、ニューヨーク)の両方を２０μｇ／ｍｌで加え、対応するＶＥＧＦ受容体の機能を阻止するのに使用した。ポリシアル酸阻止抗体を対照として使用した。
【００４５】
図６ＡとＣに示すように、ＶＥＧＦに対する細胞の化学走化性応答はＤＣ１０１により完全に無くなった。これに対して、図６Ａに示すようにＭＦ１は化学走化性に影響を与えなかった。これらの観察結果は図６Ｂに記載のように速度とＦＭＩの測定により確認された。ＶＥＧＦ勾配の非存在下では抗ＶＥＧＦＲ-２の添加は神経前駆細胞移動に大きな影響を与えなかった。これらの実験は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ-２を介した前駆細胞の化学走化性を刺激することを証明する。
【００４６】
この結論は、化学走化性を誘導するのにＶＥＧＦ-ＣΔNΔCの濃度を使用した実験によりさらに支持された。ＶＥＧＦ-ＣΔNΔCは前駆細胞の化学走化性を効率的に誘導し、この作用がＶＥＧＦＲ２阻止抗体により妨害される(データは示していない)ことが観察された。さらにＶＥＧＦ-ＣΔNΔCはＶＥＧＦＲ-２及びＶＥＧＦＲ-３を介してその機能を果たすため、及びＶＥＧＦＲ３はＦＧＦ-２刺激神経前駆細胞により発現されないため、これらの結果は、ＶＥＧＦＲ-２を介したシグナル伝達がＶＥＧＦによる前駆細胞の化学誘引を仲介するという結論を強化する。
【００４７】
実施例５：ＶＥＧＦ-２リガンドが神経前駆細胞の化学走化性を刺激するのにＦＧＦ-２が必要である
ＦＧＦ-２の非存在下でのＶＥＧＦに対する前駆体の移動応答を調べた。培養５日目の細胞は、１２時間ＦＧＦ２を枯渇させ、次にＶＥＧＦ勾配に暴露した(実施例３を参照)。図７Ｂに示すように、ＦＧＦ２が枯渇した細胞はＶＥＧＦに応答する化学走化性を受けなかった。細胞は均一な濃度のＶＥＧＦに暴露された時のようにランダムに移動した。これらの結果に一致して、及びＲＮａｓｅ保護アッセイのデータ(図５と実施例３に示す)を追認して、ウェスタンブロット解析はＦＧＦ-２の非存在下でＶＥＧＦＲ-２タンパク質の発現をほとんど又は全く示さず、一方図７Ｅに示すようにＦＧＦ-２の存在下では大きな発現が検出された。
【００４８】
ＦＧＦ-２除去の作用が可逆的かどうか及び培養物へのＦＧＦ-２の再適用によりＶＥＧＦに対して細胞が化学走化性に応答するかどうかを調べるために、ＦＧＦ-２を１２時間枯渇後に培地に含め、細胞をさらに８時間培養した。図７Ｃに示す運動性細胞の移動の散布図及び図７Ｄに示す前進移動指数と速度の定量的分析は、化学走化性の喪失がＦＧＦ-２で８時間再インキュベートした後に回復されることを証明した。まとめるとこれらのデータは、ＶＥＧＦＲ２の発現とＶＥＧＦの濃度勾配に対する前駆体の充分な移動応答にＦＧＦ-２が必要であることを証明する。
【００４９】
実施例６：ＶＥＧＦ-２リガンドは脳室下帯からの神経前駆細胞の移動に影響を与える
１日齢のスプラーグ-ドーレイ(Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ)ラットの子(シズブ(Ｓｉｚｖ)、チューリヒ、スイス)の脳の前頭葉を単離し、マキルワイン(ＭｃＩｌｌｗａｉｎ)組織チョッパーを用いて３００μｍの厚さの冠状切片に切断した。これらの切片から、脳室下帯(ＳＶＺ)の前部を顕微解剖した。ＳＶＺ外植片をコラーゲンマトリックスに包埋し、無血清の化学基礎培地(５０％ダルベッコー改変イーグル培地［ギブコ(Ｇｉｂｃｏ)、ベルリン、ドイツ］、５０％ Ｆ１２、ヘペス、トリス塩酸、及びヒト・トランスフェリン２０μｇ／ｍｌ、プトレスシン１００μＭ、セレン酸ナトリウム３０ｎＭ、トリヨードサイロニン １ｎＭ、ドコサヘキサエン酸 ０.５μｇ／ｍｌ、アラキドン酸 １μｇ／ｍｌ、インスリン ６０Ｕ／ｌを加えた)中で５％ＣＯ2下で７日間培養した。培地を３日毎に交換した。同時培養実験のために、ＶＥＧＦを分泌するように操作したマウスＣ2Ｃ12筋原細胞の存在下でＳＶＺ外植片を培養した(Rinschら、２００１)。Ｃ2Ｃ12細胞を、ＳＶＺ外植片から約１,０００μｍの距離に置いたコラーゲンマトリックスの液滴中に懸濁した。対照として同じ起源の擬似トランスフェクト細胞を、同様の方法で同じ距離で、しかし外植片の反対側でコラーゲンマトリックスに入れた。
【００５０】
培養７日目の最後に細胞移動を評価した。３つの分類を作成した：１、移動無し：外植片から出ていった細胞が全く無いか又はほんの数個である；２、対称移動：多くの細胞が外植片から離れ、細胞の移動前線の距離は５０μｍを超え、移動の方向性は無かった：３、非対称又は指向性移動：移動前線の距離が反対側の少なくとも２倍であり、５０μｍを超えた。
【００５１】
図８Ｂと８Ｄに示すように、外植片をＦＧＦ-２(２０ｎｇ／ｍｌ)の存在下でモックトランスフェクト細胞の凝集物と同時培養すると、移動細胞は暴露の周りに対称に分布した(１０／１０外植片)。図８Ａと８Ｅに示すように、ＶＥＧＦ発現細胞を片側に置き、モックトランスフェクト細胞を反対側に置いて、ＳＶＺ外植片をＦＧＦ-２の存在下で同時培養すると、細胞移動は非対称性が高かった(１０／２０外植片は細胞が主にＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞に向かって移動し、１０／２０外植片は対称的移動パターンを有した)。これに対して図８Ｃに示すように、外植片をＦＧＦ-２の非存在下で対照又はＶＥＧＦ発現細胞と同時培養すると、ＳＹＺ外植片からの大きな細胞移動は観察されなかった(１０／１０外植片)。ＦＧＦ-２の非存在下でＶＥＧＦを適用した後も同様の結果が得られた(４／４外植片)。ＶＥＧＦとＦＧＦ-２を一緒に又はＦＧＦ-２単独で適用すると対称的移動が得られた(１２／１２)。ＶＥＧＦに応答して移動する細胞が未成熟前駆体であるかどうかを調べるために、抗ネスチン抗体を用いる免疫細胞化学染色を行った。図８Ｆに見られるように、移動する細胞はネスチンに対して陽性に染色され、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ(未成熟ニューロンのマーカー、示していない)については陰性であり、これらが確かに未成熟前駆細胞であることが確認された。まとめるとこれらの結果は、未成熟前駆細胞がＶＥＧＦ勾配に応答して移動し、この作用にはＦＧＦ-２が必要であることを示す。
【００５２】
前記説明と例は本発明を例示するためのみに提供されたものであり、決して本発明を限定するものではない。本発明の開示された態様及び実施態様のそれぞれは、個別に又は本発明の他の態様、実施態様、及び変更態様とともに考慮される。さらに特に明記しない場合は、本発明の工程のいずれも特定の実施順序に限定されない。本発明の精神と本質を取り込んだ開示された実施態様の修飾は当業者には明らかであるが、かかる修飾は本発明の範囲内である。さらに引用されたすべての文献はその全体が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、ＦＧＦ-２の存在下で培養した神経前駆細胞の形態的及び免疫細胞化学的特徴を示す。図１Ａは、４日目の細胞の位相差顕微鏡画像を示し、図１Ｂは６日目の位相差顕微鏡画像を示す。図１Ｃは、培養６日目以後に細胞の大半がネスチンに対して免疫陽性であり、これらが未分化神経前駆細胞であることを示す。図１Ｄは、ＢｒｄＵの取り込みにより大半の細胞が増殖していることが示唆されることを示す。神経マーカー(ＴｕＪ、矢印)に陽性のまれな細胞は非増殖性である。図１Ｅと１Ｆは、ＦＧＦ-２除去の５日後に細胞がＧＦＡＰ含有星状細胞(図１Ｅ)、Ｔｕｊ陽性ニューロン(図１Ｅ)、及びＧａｌＣ陽性乏突起神経膠細胞(図１Ｆ)に分化していることを示す。細胞核を図１Ｃ、１Ｅ、及び１Ｆにおいてヘキスト(Ｈｏｅｃｈｓｔ)３３３４２で対比染色した。スケールバーは、図１Ａと１Ｂでは８０μｍ、図１Ｃでは３０μｍ；図１Ｄでは１９μｍ；図１Ｅと１Ｆでは３０μｍである。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、ＶＥＧＦにより刺激された神経前駆細胞の化学走化性を示す。図２Ａは、カバーガラスが重なったダンチャンバー(Ｄｕｎｎ ｃｈａｍｂｅｒ)の模式図(上面図)であり、内側のウェル、ブリッジ、及び外側のウェルの位置を示す。図２Ｂでは、チャンバーの内側のウェルと外側のウェルとの間の環状ブリッジ上の細胞を位相差光学顕微鏡下で観察することができる。経時的フレーム取得により細胞の移動を連続的に記録し、移動軌跡を図２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、及び２Ｆに示す分散図にプロットした。各細胞の出発点は、Ｘ軸とＹ軸の交点(０,０)であり、データ点は２時間の記録時間の最後における個々の細胞の最終位置を示す。ＶＥＧＦ(図２Ｃ)又はＦＧＦ-２(図２Ｅ)を外側のウェルに入れて化学走化性を試験した。勾配の方向は垂直上方向である。図２Ｃと図２Ｅに示すように、神経前駆細胞は化学走化性を受け、ＶＥＧＦの存在下で移動の明確な指向性を示す(図２Ｃ)が、ＦＧＦ-２(図２Ｅ)勾配では指向性を示さない。化学運動性について(図２Ｄと２Ｆ)について、等量のＶＥＧＦ又はＦＧＦ-２をチャンバーの内側のウェルと外側のウェルの両方に加えた。図２Ｂの矢印は、ダンチャンバーの外側のウェルの方向を示す。スケール棒、５０μｍ。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、神経前駆細胞の移動軌跡を示す。図３Ａは、ＶＥＧＦ勾配を登る代表的細胞(＊)を示す位相差顕微鏡写真を与える。矢印はＶＥＧＦ源を示す。図３Ｂは、ＶＥＧＦ濃度勾配の存在下での４つの代表的細胞の移動軌跡を示す。各細胞の出発点はＸ軸とＹ軸の交点(０,０)であり、ＶＥＧＦ源は上である。図３Ｃは、ＶＥＧＦの均一な濃度でランダムに移動する神経前駆細胞を示す位相差顕微鏡写真である。図３Ｄは、均一なＶＥＧＦ分布の条件下でランダムに移動する４つの代表的細胞の移動軌跡を示す。各細胞の出発点はＸ軸とＹ軸の交点(０,０)である。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、異なる条件下での移動速度(μｍ／時間)(図４Ａ)と前進移動指数(ＦＭＩ)値(図４Ｂ)とを示す。細胞移動速度は各時間経過間隔について計算し、平均速度は２時間について得た。データは少なくとも３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして示す。ＦＭＩ値は、細胞が移動する方向によりプラスか又はマイナスである。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であり、これは化学運動性又はＦＧＦ-２勾配とは大きく異なることを示す。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、神経前駆細胞におけるＶＥＧＦ受容体発現を示す。図５Ａでは総細胞ＲＮＡが単離され、ＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡの発現がＲＮａｓｅ保護分析により評価された。精製された32Ｐ標識ラットｃＲＮＡプローブは、ＦＧＦ-２存在下又はＦＧＦ-２枯渇下で１２時間増殖させた細胞からのハイブリダイゼーションミックス(プローブ＋ｈ.ｍ.)、酵母ｔＲＮＡ、又は総ＲＮＡにハイブリダイズされた。内部対照としてラット酸性リボゾームタンパク質Ｐ０を使用し、陽性対照はラット肺であった。図５Ｂでは、ＦＧＦ-２存在下又はＦＧＦ-２枯渇下で１２時間培養した細胞中のＶＥＧＦＲ-１とＶＥＧＦＲ-２発現の定量分析を示す。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であり、これはＦＧＦ-２中の細胞とは大きく異なる(ｎ＝３ 実験)。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、神経前駆細胞〜ＶＥＧＦＲ-２のＶＥＧＦ刺激化学走化性を示す。図６Ａは、対照条件下又はＶＥＧＦ受容体ブロッカーの存在下での神経前駆細胞の移動パターンを示す。ＶＥＧＦＲ-２阻止抗体(ＤＣ１０１)を用いて処理した細胞は、ＶＥＧＦに対する化学走化性応答を喪失した。これに対してＶＥＧＦＲ-１阻止抗体(ＭＦ１)は、前駆体移動に影響を与えなかった。図６Ｂは、異なる移動条件下での速度とＦＭＩを示す。図６Ｃと６Ｄは、ＶＥＧＦＲ-２阻止抗体(図６Ｃ)又は対照(ポリシアル酸阻止)抗体(図６Ｄ)の存在下で、ＶＥＧＦ濃度勾配に暴露した代表的細胞(各条件４個)の移動軌跡を示す。各細胞の出発点はＸ軸とＹ軸の交点(０,０)であり、ＶＥＧＦ源は濃度勾配の上である。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であり、これはＤＣ１０１処理細胞とは大きく異なる。
【図７】図７Ａ〜Ｅは、ＶＥＧＦ勾配に化学走化性的に応答する神経前駆細胞の能力であって、ＦＧＦ-２により増強された能力を示す。図７Ａでは第１の群について５日目に１２時間ＦＧＦ-２を除去し、次に細胞をＶＥＧＦ勾配に暴露した。図７Ｂでは１２時間枯渇後にＦＧＦ-２の存在下で第２の群を８時間さらに培養し、次にＶＥＧＦ勾配で試験した。図７Ｃは２時間移動後の細胞の最終位置を示し、各細胞の出発点は(０,０)でありＶＥＧＦ源は上である。図７Ｄは速度とＦＭＩとを示す。データは４つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして示す。１２時間のＦＧＦ-２枯渇後、細胞はＶＥＧＦ勾配に対する化学走化性応答を喪失する。枯渇した神経前駆細胞は、培養物にＦＧＦ-２を８時間再添加後にＶＥＧＦに対する化学走化性応答を再開する(図７Ｃ)。図７Ｅは、ＦＧＦ-２で培養したか又はＦＧＦ-２を１２時間枯渇させて培養した神経前駆細胞中のＶＥＧＦＲ-２発現を示す。抗ＶＥＧＦＲ-２抗体を用いて免疫沈殿物についてウェスタンブロット解析を行った。対応の無い両側ｔ検定でＰは０.０１未満であった。
【図８】図８Ａ〜Ｆは、脳室下帯(ＳＶＺ)外植片から移動する神経前駆細胞に対するＶＥＧＦの作用を示す。ＳＶＺ外植片は、コラーゲンゲルマトリックス中でＦＧＦ-２の存在下(図８Ａ、８Ｂ、８Ｄ、８Ｅ、及び８Ｆ)又は非存在下(図８Ｃ)でＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞及び／又は擬似トランスフェクトＣ2Ｃ12細胞と同時培養した。図８ＡではＦＧＦ-２の存在下で、神経前駆細胞は非対称的にＳＶＺ外植片から出ていき、より多くの細胞が対照のＣ2Ｃ12細胞よりＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞の側にあった。図８Ｂでは両側で対照Ｃ2Ｃ12細胞とともに培養した時、神経前駆細胞は非対称的にＳＶＺ外植片から出ていく。図８Ｃでは、ＦＧＦ-２の存在下でＳＶＺ外植片から出ていく細胞はほとんどないか全く無い。図８Ｄは、対照Ｃ2Ｃ12細胞の側でＳＶＺ外植片を示す高倍率顕微鏡写真である。図８Ｅは、ＳＶＺ外植片を出てＶＥＧＦ分泌Ｃ2Ｃ12細胞へ向かう多くの神経前駆細胞を示す高倍率顕微鏡写真である。図８Ｆでは、ＳＶＺ外植片を出ていく細胞はネスチン(未分化神経前駆細胞のマーカー)陽性である。スケールバーは、図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃでは７００μｍ；図８Ｄと８Ｅでは１００μｍ；図８Ｆでは５０μｍである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をＦＧＦ-２及びＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む、神経前駆細胞の移動を調節する方法。
【請求項２】
前記細胞を、ＦＧＦ-２に暴露させた後に、ＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔCよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
神経細胞の消失又は傷害に関与する障害を有する哺乳動物の治療方法であって、当該哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露させて、神経細胞の消失又は傷害部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む、前記方法。
【請求項５】
前記哺乳動物のＶＥＧＦＲ-２リガンドへの暴露が、当該哺乳動物にＶＥＧＦＲ-２リガンドを投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔCよりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＧＦ-２、ＶＥＧＦＲ-２リガンド、又はその両方が、神経細胞の消失又は傷害部位に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記神経前駆細胞が、前記哺乳動物に移植される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、ＶＥＧＦＲ-１及びＶＥＧＦＲ-２を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、Ａ２Ｂ５、フォンウィルブラント因子、ＲＥＣＡ-１、又はこれらの任意の組合せを発現しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
神経細胞の消失又は傷害に関与する前記障害が、脳傷害である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記脳傷害が、頭部外傷、脳卒中、酸素欠乏、又は虚血により生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＦＧＦ-２が、生体適合性マトリックスに関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、生体適合性マトリックスに関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
欠陥神経集団を有する神経組織部位を有する哺乳動物の治療方法であって、当該哺乳動物を、ＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露して、神経組織部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物のＶＥＧＦＲ-２リガンドへの暴露が、当該哺乳動物にＶＥＧＦＲ-２リガンドを投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔCよりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
神経前駆細胞の移動を調節する方法であって、当該細胞を、ＶＥＧＦＲ-２リガンド及び当該細胞上にＶＥＧＦＲ-２の発現を増加できる化合物に暴露することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記化合物がＦＧＦ-２である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＧＦ-２を含有する生体適合性マトリックスを含む組成物。
【請求項２１】
前記生体適合性マトリックスが、ＶＥＧＦＲ-２リガンドをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
神経前駆細胞をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞が、ＶＥＧＦＲ-１及びＶＥＧＦＲ-２を発現する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記細胞が、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、Ａ２Ｂ５、フォン・ウィルブラント因子、ＲＥＣＡ-１、又はこれらの任意の組合せを発現しない、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
ＶＥＧＦＲ-２リガンド、ＦＧＦ-２、及び担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
神経前駆細胞をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項１】
細胞をＦＧＦ-２及びＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露することを含む、神経前駆細胞の移動を調節する方法。
【請求項２】
前記細胞を、ＦＧＦ-２に暴露させた後に、ＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔCよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
神経細胞の消失又は傷害に関与する障害を有する哺乳動物の治療方法であって、当該哺乳動物をＶＥＧＦＲ-２リガンド及びＦＧＦ-２に暴露させて、神経細胞の消失又は傷害部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む、前記方法。
【請求項５】
前記哺乳動物のＶＥＧＦＲ-２リガンドへの暴露が、当該哺乳動物にＶＥＧＦＲ-２リガンドを投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔCよりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＧＦ-２、ＶＥＧＦＲ-２リガンド、又はその両方が、神経細胞の消失又は傷害部位に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記神経前駆細胞が、前記哺乳動物に移植される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、ＶＥＧＦＲ-１及びＶＥＧＦＲ-２を発現する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、Ａ２Ｂ５、フォンウィルブラント因子、ＲＥＣＡ-１、又はこれらの任意の組合せを発現しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
神経細胞の消失又は傷害に関与する前記障害が、脳傷害である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記脳傷害が、頭部外傷、脳卒中、酸素欠乏、又は虚血により生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＦＧＦ-２が、生体適合性マトリックスに関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、生体適合性マトリックスに関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
欠陥神経集団を有する神経組織部位を有する哺乳動物の治療方法であって、当該哺乳動物を、ＦＧＦ-２の存在下でＶＥＧＦＲ-２リガンドに暴露して、神経組織部位への神経前駆細胞の移動を刺激することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物のＶＥＧＦＲ-２リガンドへの暴露が、当該哺乳動物にＶＥＧＦＲ-２リガンドを投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＶＥＧＦＲ-２リガンドが、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｅ、及びＶＥＧＦ-Ｃ／ＤΔNΔCよりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
神経前駆細胞の移動を調節する方法であって、当該細胞を、ＶＥＧＦＲ-２リガンド及び当該細胞上にＶＥＧＦＲ-２の発現を増加できる化合物に暴露することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記化合物がＦＧＦ-２である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＧＦ-２を含有する生体適合性マトリックスを含む組成物。
【請求項２１】
前記生体適合性マトリックスが、ＶＥＧＦＲ-２リガンドをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
神経前駆細胞をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞が、ＶＥＧＦＲ-１及びＶＥＧＦＲ-２を発現する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記細胞が、ＰＳＡ-ＮＣＡＭ、ダブルコルチン、ＮｅｕＮ、ＮＧ２、Ａ２Ｂ５、フォン・ウィルブラント因子、ＲＥＣＡ-１、又はこれらの任意の組合せを発現しない、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
ＶＥＧＦＲ-２リガンド、ＦＧＦ-２、及び担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
神経前駆細胞をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５１５１７１（Ｐ２００７−５１５１７１Ａ）
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４５６１３（Ｐ２００６−５４５６１３）
【出願日】平成１６年１２月２０日（２００４．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４３４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６２９６２
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５００５８１０２１）イムクローン システムズ インコーポレイティド (7)
【出願人】（５０６２１０１９６）ユニバーシティー オブ ジェネバ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２０日（２００４．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４３４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６２９６２
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【出願人】（５００５８１０２１）イムクローン システムズ インコーポレイティド (7)
【出願人】（５０６２１０１９６）ユニバーシティー オブ ジェネバ (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]