移植片対宿主病の検査方法、検査用試薬ならびに予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法
【課題】
移植後のＧＶＨＤについて、組織生検によらず効果的な検査方法および試薬を提供することを課題とする。さらには、免疫抑制剤ではなく、副作用が軽減化された予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
ＧＶＨＤ発症レシピエントの患者組織中にケモカインの一種であるフラクタルカイン（Fractalkine/ＣＸ３ＣＬ１）が強発現しており、ＣＤ１４陽性単球ではフラクタルカインの受容体ＣＸ３ＣＲ１の発現が低下していることを見出した。フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとすることで、移植後ＧＶＨＤを検査することができる。さらに、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動を検出することにより、ＧＶＨＤに対する予防および／または治療のための薬剤をスクリーニングすることができる。
移植後のＧＶＨＤについて、組織生検によらず効果的な検査方法および試薬を提供することを課題とする。さらには、免疫抑制剤ではなく、副作用が軽減化された予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
ＧＶＨＤ発症レシピエントの患者組織中にケモカインの一種であるフラクタルカイン（Fractalkine/ＣＸ３ＣＬ１）が強発現しており、ＣＤ１４陽性単球ではフラクタルカインの受容体ＣＸ３ＣＲ１の発現が低下していることを見出した。フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとすることで、移植後ＧＶＨＤを検査することができる。さらに、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動を検出することにより、ＧＶＨＤに対する予防および／または治療のための薬剤をスクリーニングすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植後の移植片対宿主病（graft versus host disease：以下「ＧＶＨＤ」という。）の検査方法、検査用試薬ならびに予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
同種造血幹細胞移植は、悪性造血器腫瘍やその他の難治性血液疾患、また一部の非血液難治性疾患に対して治癒を望める治療法であり、現在世界中で広く行われている。同種移植に伴う重篤な合併症にはさまざまなものがあるが、その中で特に、慢性ＧＶＨＤはコントロールが難しく、病変が多臓器に及び、移植後のquality of life（ＱＯＬ）を著しく悪化させる主因である。移植後１００日前後以降に発症し、自己免疫疾患に類似した病態を示し、また感染症の合併などによる死亡も多い。軽度のものを含めると、報告によって４０〜８０％の同種移植レシピエントに発症するといわれている。免疫抑制剤の投与で病勢のコントロールを試みるものの、効果が低いことが少なくない。近年では、肺の慢性ＧＶＨＤにて呼吸不全に陥り、肺移植術が施される例も散見される。
【０００３】
造血器移植は、ヒトの主要組織適合抗原であるＨＬＡの一致した同胞がドナーとして通常選定されるが、移植造血細胞中にＴリンパ球やその前駆細胞が含まれているため、ＨＬＡ以外のいわゆるｎｏｎ ＨＬＡ抗原を標的としてリンパ球が認識すると、種々の移植免疫反応が生じる場合がある。これによって惹起される特異な症候が臨床的にＧＶＨＤと呼ばれる。
【０００４】
同種造血幹細胞移植におけるＧＶＨＤの予防薬または治療薬として、ステロイド剤、サイクロスポリン（ＣｓＡ）、タクロリムス（ＦＫ５０６）などの免疫抑制剤が長期投与される。同種造血幹細胞移植においては、生着までに好中球減少状態だけでなく、ＧＶＨＤに対する強力な免疫抑制療法が細胞性免疫能の回復を遅延させ、日和見感染などの問題が生じている。近年では、強い免疫抑制状態に置かれる症例が増えているため、従来の抗真菌剤の予防的投与下で発熱などの症状が改善せず、新たな抗真菌剤の導入が望まれる例が報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
ＧＶＨＤの予防または治療のために、免疫抑制剤ではなく、他の薬剤を使用することができれば感染などの副作用が軽減され、新たな治療効果が期待できるが、慢性ＧＶＨＤについては、すぐれたマウスモデルが存在せず、その発症メカニズムは殆ど不明であるため、新たな薬剤については殆ど開発されていないのが現状である。
【０００６】
また、ＧＶＨＤの診断は、皮膚生検、肝生検、口唇生検など、各組織において病理学的に行われる。各病変組織における初期の炎症性変化としては、上皮組織や外分泌、内分泌腺へのリンパ球浸潤が主体であるが、進行すると繊維化や狭窄化、閉塞、萎縮が認められる。しかし、生検によらないＧＶＨＤの診断方法については、殆ど報告されていない。生検によらず、症状が進行する前にＧＶＨＤの診断ができれば患者の負担は軽減され、治療計画もたてやすい。
【０００７】
ケモカインの一種であるフラクタルカイン（Fractalkine/ＣＸ３ＣＬ１）の受容体であるＣＸ３ＣＲ１は、リンパ球や単球全般に発現している。フラクタルカインまたはフラクタルカイン受容体であるＣＸ３ＣＲ１のノックアウトマウスにて、単球の局所浸潤がその主な病因と考えられている動脈の粥状硬化症が起こりにくいことが示され、単球の関与する病態においてフラクタルカインが、単球を局所に呼び寄せる重要な因子であることが報告されている（非特許文献２〜４）。しかしながら、フラクタルカインと移植後ＧＶＨＤの関係については、報告されていない。
【０００８】
【非特許文献１】Jpn. J. Med. Mycol. 2003; 44: 187-191
【非特許文献２】J. Exp Med. 2003; 197: 1701-1707
【非特許文献３】Mol. Cell Biol. 2001; 21: 3159-3165
【非特許文献４】J. Clin. Invest. 2003; 111: 333-340
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、組織生検によらず効果的なＧＶＨＤの診断方法を提供することを課題とする。さらには、ＧＶＨＤに関し、副作用が軽減化された効果的な予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、細胞障害性免疫細胞のうち、特にＣＤ１４陽性単球・マクロファージと、それらを特に効果的に局所に呼び寄せるケモカインに注目し、鋭意研究を重ねた結果、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの末梢血単球（ＣＤ１４陽性単球）においてフラクタルカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ１）の発現率が低下していること、また、組織中にフラクタルカインの強発現とＣＤ１４陽性細胞の高度な浸潤を明らかにし、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することを特徴とする、移植片対宿主病の検査方法。
２．移植レシピエントの組織上のフラクタルカインの発現強度を検出することを特徴とする前項１に記載の移植片対宿主病の検査方法。
３．移植レシピエントの末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度を検出することを特徴とする前項１または２に記載の移植片対宿主病の検査方法。
４．前項１〜３のいずれか１に記載の移植片対宿主病の検査方法に使用する検査用試薬。
５．フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする移植片対宿主病に対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法。
６．フラクタルカインの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする前項５に記載のスクリーニング方法。
７．末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動を指標とすることを特徴とする前項５または６に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、移植レシピエントについて、患者組織に大きな侵襲なく採取可能な病変、例えば皮膚においてフラクタルカインの発現、または末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上において、フラクタルカインのレセプターであるＣＸ３ＣＲ１の発現の低下を検出することで、移植レシピエントがＧＶＨＤを発症しているか、または将来的に発症しうるかについて診断することができる。
さらに、ＧＶＨＤに対し、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤に比べ、副作用が少なく、効果的な予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明が適用される移植は、特に限定されず、あらゆる移植が考えられる。具体的には組織（皮膚、角膜および骨などの組織）または臓器（肝臓、心臓、腎臓、肺、膵臓など）や、血液関係（造血幹細胞、リンパ球輸中）の移植などが挙げられ、特にＧＶＨＤの発症が問題となりうる移植に適用され、より好適には血液関係の移植において適用される。
【００１４】
本発明の検査方法、検査試薬、本発明のスクリーニング方法により得られる予防および／または治療用薬剤は急性ＧＶＨＤまたは慢性ＧＶＨＤのいずれにも適用され得るが、より好適には慢性ＧＶＨＤの場合が好ましい。
【００１５】
例えば、フラクタルカインは正常肺組織では強く発現しているが、正常皮膚では、弱く発現しているのみである。慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの肺組織でのフラクタルカインの発現量は正常肺組織に比べて殆ど変わらないものの、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚では強く発現することが観察された（図３−１、図４−１参照）。急性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚にもフラクタルカインの発現を認めたが、急性ＧＶＨＤの特徴を示す部位の一部で認めたのみである。これに比べて慢性ＧＶＨＤの場合には、より広範囲でフラクタルカインの発現を認めた。
【００１６】
また、健常人の場合はフラクタルカインの受容体であるＣＸ３ＣＲ１の発現は、末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上に認められるが、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントのＣＸ３ＣＲ１は、かなり低い発現量であった。一方、移植レシピエントのうち、慢性ＧＶＨＤでない者のＣＸ３ＣＲ１の発現量は、健常人のそれとほぼ同等である（図１参照）。一方、リンパ球では、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントと健常人もしくは慢性ＧＶＨＤを発症していないレシピエントとの間でＣＸ３ＣＲ１の発現に関し、相関関係は認められていない（図２参照）。このことから、末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動が、慢性ＧＶＨＤの発症のマーカーとなりうる。
【００１７】
上記により、本発明はより好適には慢性ＧＶＨＤの場合に適用される。ここで、慢性ＧＶＨＤの重症度の目安となるスコアリングシステムを次に示す。
【００１８】
慢性移植片対宿主病（重症度分類）
（一般全身状態）
０：症状なし(ECOGによる分類では０。ECOG:Eeastern Cooperative Oncology group)
１：症状あり(ECOGによる分類では１)
２：症状あり(ECOGによる分類では２)
３：症状あり(ECOGによる分類では３)
【００１９】
（皮膚）
０：慢性移植片対宿主病による皮膚症状なし。
１：体表面積の１８％未満の皮疹または皮膚硬化。
２：体表面積の１８〜５０％の皮疹または皮膚硬化。
３：体表面積の５０％を越える皮疹または皮膚硬化。
【００２０】
（口）
０：症状、理学所見なし。
１：口腔の症状（乾燥、味覚異常、口腔内の痛み）または所見（発赤、過角化、苔癬化または潰瘍形成）。
２：経口摂取を部分的に妨げる口腔の症状または所見。
３：経口摂取を大部分妨げる口腔の症状または所見。
【００２１】
（眼）
０：症状、角膜炎なし
１：症状のない角膜炎、または軽度の乾燥症状（保湿のための点眼の使用は１日３回まで）。
２：角結膜炎による症状はあるが視覚障害はない、または保湿のため１日に４回以上の点眼が必要である。
３：偽膜形成を伴う角膜潰瘍による視力障害、または鼻涙管の結紮を行っても痛みや不快感の軽減のための特殊な眼鏡を必要とする、または眼の症状のみが原因で就労不能である。
【００２２】
（消化器）
０：消化器症状なし
１：消化器症状はあるが、経静脈的な補液、栄養を必要としない。
２：消化器症状があり、部分的に経静脈的な補液、栄養による補助を必要とする。
３：消化器症状があり、経静脈栄養に全面的に依存している、または１５％を超える体重減少、または食道の拡張を認める。
【００２３】
（肝）
０：総ビリルビンとアルカリフォスファターゼ ≦１×基準値。
１：総ビリルビンもしくはアルカリフォスファターゼ ＞１×基準値かつ≦２×基準値
２：総ビリルビンもしくはアルカリフォスファターゼ ＞２×基準値かつ≦４×基準値
３：総ビリルビンもしくはアルカリフォスファターゼ ＞４×基準値、ＡＳＴ、ＡＬＴ ＞３×基準値
【００２４】
（肺）
０：症状なし
１：ＦＥＶ１．０が正常の５１〜５７％、ＦＥＶ１．０／ＦＶＣが正常の＜６５％、または１年間に１２％以上のＤＬＣＯの低下、または中等度運動時の呼吸困難。
２：ＦＥＶ１．０が正常の２５〜５０％、または軽度運動時の呼吸困難、または運動時の酸素飽和度の低下。
３：ＦＥＶ１．０が正常の＜２５％、または安静時呼吸困難、または運動時や安静時に酸素吸入を必要とする。
【００２５】
（関節と筋膜）
０：可動域制限なし
１：腕もしくは足に限局する運動制限。
２：ＡＤＬ（日常生活における活動性）に影響しない拘縮、または上下肢の両方に及ぶ運動制限。
３：ＡＤＬ（日常生活における活動性）を低下させる拘縮。
【００２６】
（生殖器）
０：症状なし
１：ＡＤＬ（日常生活における活動性）もしくは性交に影響を及ぼさない症候（萎縮、発赤、苔癬化、浮腫）
２：ＡＤＬ（日常生活における活動性）には影響しないが、性交困難の原因となる症候。
３：ＡＤＬ（日常生活における活動性）には影響する症候。
【００２７】
本発明は、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することによる、ＧＶＨＤの検査方法を提供する。
例えば、本発明における移植後の患者組織、特に好ましくは皮膚組織のフラクタルカインの発現量を調べることにより、ＧＶＨＤの発症を検査することができる。フラクタルカインの発現量は、自体公知の方法によることができ、組織細胞を取得したものを染色などにより検出することができる。その他、今後開発されるフラクタルカインの発現量を調べるあらゆる手段を採用することができる。例えば、フラクタルカイン特異的な遺伝子の発現を調べることにより検査することも可能である。
【００２８】
他の検査方法として、移植レシピエントから末梢血を採取し、末梢血中のＣＤ１４陽性単球に発現するＣＸ３ＣＲ１を検出することで、ＧＶＨＤを検査することができる。末梢血中のＣＤ１４陽性単球を定期的に採取し、ＣＸ３ＣＲ１の変動を観察することで、生検によらずともＧＶＨＤの発症を予測することができ、早期に治療計画をたてることも可能である。ＣＸ３ＣＲ１の変動の観察は、自体公知の方法によることができ、例えばフローサイトメトリーによる手法、あるいは今後開発されるあらゆる手法を採用することができる。例えば、ＣＸ３ＣＲ１特異的な遺伝子の発現を調べることにより検査することも可能である。
【００２９】
本発明は、上記検査方法に使用しうる試薬にもおよぶ。例えば、フラクタルカインおよび／またはＣＸ３ＣＲ１の抗原、抗体あるいはこれらのタンパク質に関連する遺伝子を検出しうるプローブ、プライマーなどを試薬として提供することができる。
【００３０】
本発明は、またフラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とするＧＶＨＤに対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法にもおよぶ。本発明において、初めて移植後ＧＶＨＤと、フラクタルカイン、その受容体ＣＸ３ＣＲ１との関係が見出された。これにより、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１の発現強度に変動を及ぼすメカニズムが、移植後ＧＶＨＤの発症に関係していることが示唆される。そこで、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を起こしうる物質を、候補化合物、候補物質から選定することで、移植後ＧＶＨＤの発症を予防または治療しうる物質の選定を行うことができる。
【００３１】
従来は、移植後ＧＶＨＤ、特に慢性ＧＶＨＤに対しては、効果的な治療方法はなく、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤投与を行うことが主流であった。しかし、本発明において、リンパ球上のＣＸ３ＣＲ１発現量と慢性ＧＶＨＤとの相関関係が認められなかったことから、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤の投与では慢性ＧＶＨＤの予防および／または治療について十分に効果を発揮し得ないことが示唆された。移植後ＧＶＨＤ、特に慢性ＧＶＨＤに特異的な発症メカニズムに応じた薬剤を用いることにより、副作用が軽減され、効果的な予防、治療効果を得ることができる。
【実施例】
【００３２】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは明らかである。
【００３３】
（実施例１）フローサイトメトリーによる分析
１）血液試料
同種造血幹細胞移植後のレシピエント１７名から末梢血を採取し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１４陽性単球表面およびリンパ球に発現しているＣＸ３ＣＲ１（フラクタルカイン受容体）の発現強度を調べた。
各レシピエントは、男性が８名、女性が９名、年齢は２０〜６４歳、中央値は４５歳、移植後の日数は、９７〜２７８６日、中央値は６８１日であった。
【００３４】
２）臨床評価
慢性ＧＶＨＤの臨床症状（重症度）の評価は、"GVHD Morbidity Assessment"を変更して行った。各レシピエントの症状は、上述のスコアリングシステムに従って評価し、各スコアの合計を慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）スコアとして使用した。
【００３５】
３）フローサイトメトリー
血液試料を、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４抗体（CALTAG社）で、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＸ３ＣＲ１抗体（MBL社）またはＦＩＴＣ結合のアイソタイプの一致した対照（MBL社）とともに染色し、続いて、溶解溶液（BD Pharmingen社）で赤血球の溶解を行った。分析を、CellQuestソフトウエア（Becton Dickinson社）を備えたFACSCaliburフローサイトメーターで行った。
【００３６】
４）結果
ＣＤ１４陽性単球についてのフローサイトメトリーの結果を図１−１に示した。左側にアイソタイプコントロールのピークを認め、右側にＣＸ３ＣＲ１のピークを認めた。慢性ＧＶＨＤの症状のないレシピエントのＣＤ１４陽性単球に比べ、慢性ＧＶＨＤの症状が強いレシピエントではＣＤ１４陽性単球におけるＣＸ３ＣＲ１の発現強度が弱かった。
慢性ＧＶＨＤスコアと、ＣＤ１４陽性単球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度を数値化（geometric mean）してコントロールの値を差し引いた値との相関を図１−２に示した。スピアマン順位相関係数を用いて、相関を求めた。P<0.05を統計学的有意とした。その結果、統計学的有意差をもって、慢性ＧＶＨＤの症状が強いレシピエントほど、末梢血ＣＤ１４陽性単球上のＣＸ３ＣＲ１発現強度は低かった。
リンパ球についてのフローサイトメトリーの結果を図２−１に示した。また、慢性ＧＶＨＤスコアと、リンパ球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度を数値化してコントロールの値を差し引いた値との相関を図２−２に示した。その結果、慢性ＧＶＨＤの症状の程度と、リンパ球におけるＣＸ３ＣＲ１の発現量との間に相関関係は認められなかった。
【００３７】
（実施例２）組織の免疫分析
１）組織試料
同種造血幹細胞移植後のレシピエントのうち、慢性ＧＶＨＤによる皮膚発疹を発症した４名から皮膚生検検体を採取した。また、上記４名とは異なるレシピエントで、同種造血幹細胞移植後の閉塞性細気管支炎（ＢＯ）による重症の呼吸不全のため、肺の移植を受けていた４名の摘出肺より肺組織を採取した。正常な皮膚と肺組織はBiochain Institiuteから購入した。
プロトコールは、岡山大学のInternal Review Boardにより認可されており、患者からインフォームドコンセントを得ている。
これらの組織上に発現したフラクラルカインおよびＣＤ１４陽性細胞について調べた。
【００３８】
２）組織免疫分析
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した各検体を、５μｍの厚さにスライスし、脱パラフィンをして、クエン酸緩衝液中でマイクロウェーブにより抗原回復を行った。
試料を３％ H2O2に浸して内因性のペルオキシダーゼを消去し、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ）＋５％ウマ血清でブロックし、ポリクローナルヤギ抗ヒトフラクタルカイン抗体（R&D systems社）または対照ヤギＩｇＧ（Sigma社）でインキュベートし、続いてビオチン化したウマ抗ヤギＩｇＧ(Vector Laboratories)でインキュベートした。アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）キット(Vector Laboratories)を使用して、染色シグナルを増強させた。抗原を、ＶＩＰ (Vector Laboratories)で可視化した。ＣＤ１４染色については、試料をＰＢＳ＋５％ヒツジ血清でブロックし、ビオチン化ヒツジ抗ヒトＣＤ１４抗体(R&D systems社)またはビオチン化対照ヒツジＩｇＧ（Sigma社）でインキュベートした。ＡＢＣキット（Vector Laboratories）とＶＩＰ（Vector Laboratories）を用いて、染色を可視化した。メチルグリーン（Vector Laboratories）を対比染色のために用いた。非特異的抗体での対照染色を、全ての染色実験で行ったが、重大な非特異的な染色は見られなかった。
【００３９】
３）結果
正常および慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの肺組織を図３−１，２に示した。その結果、フラクタルカインについては正常および慢性ＧＶＨＤの肺組織では細気管支上皮に染色が認められ、いずれの組織においても強く発現していることが観察された（図３−１、Ａ，Ｂ）。一方、ＣＤ１４抗原については、正常肺組織では殆ど染色されず、ＣＤ１４抗原は散在性であることが観察されたのに対し（図３−２、Ｃ）、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの肺組織では広い範囲に強く染色され、ＣＤ１４抗原が観察された（図３−２、Ｄ）。このことから、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントでは可溶性フラクタルカインが肺組織の細気管支上皮細胞から放出され、ＣＤ１４陽性単球が肺組織付近に呼び込まれたものと考えられる。
【００４０】
正常および慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚組織を図４−１，２に示した。その結果、フラクタルカインは、正常皮膚では薄く染色され、弱い発現しか観察されなかったのに対し（図４−１、Ｅ）、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントでは、広範な部分で染色を認め、上皮の肥厚とともに強く発現していることが観察された（図４−１、Ｆ）。慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントではケラチノサイトの増殖も観察された。ＣＤ１４抗原については、正常皮膚では殆ど染色されず、殆ど観察されなかったのに対し（図４−２、Ｇ）、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚では真皮で強い染色が認められ、また一部では表皮でもＣＤ１４抗原が観察された（図４−２、Ｈ）。このことから、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの表皮から供給されるフラクタルカインにより、ＣＸ３ＣＲ１を高発現した単球が循環して真皮まで引き寄せられたものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
以上説明したように、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することにより、ＧＶＨＤの検査方法を提供することができる。さらに、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とするＧＶＨＤに対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。
これにより、移植レシピエントがＧＶＨＤを発症しているか、または将来的に発症しうるかについて診断することができる。従来の生検による診断法に比べ、患者への負担は軽減化され、効果的に診断することができ、効果的な治療計画を早期に立てることができる。
また、本発明のスクリーニング方法により選定された薬剤により、ＧＶＨＤに対し、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤に比べ、副作用が少なく、効果的な予防薬および／または治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】ＣＤ１４陽性単球におけるＣＸ３ＣＲ１発現量をフローサイトメトリーにより調べた結果を示す図である。（実施例１）
【図１−２】慢性ＧＶＨＤスコアと、ＣＤ１４陽性単球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度の相関関係の結果を示す図である。（実施例１）
【図２−１】リンパ球におけるＣＸ３ＣＲ１発現量をフローサイトメトリーにより調べた結果を示す図である。（実施例１）
【図２−２】慢性ＧＶＨＤスコアと、リンパ球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度の相関関係の結果を示す図である。（実施例１）
【図３−１】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの肺組織におけるフラクタルカインの発現を染色により調べた図である。（実施例２）
【図３−２】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの肺組織におけるＣＤ１４抗原を染色により調べた図である。（実施例２）
【図４−１】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの皮膚組織におけるフラクタルカインの発現を染色により調べた図である。（実施例２）
【図４−２】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの皮膚組織におけるＣＤ１４抗原を染色により調べた図である。（実施例２）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植後の移植片対宿主病（graft versus host disease：以下「ＧＶＨＤ」という。）の検査方法、検査用試薬ならびに予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
同種造血幹細胞移植は、悪性造血器腫瘍やその他の難治性血液疾患、また一部の非血液難治性疾患に対して治癒を望める治療法であり、現在世界中で広く行われている。同種移植に伴う重篤な合併症にはさまざまなものがあるが、その中で特に、慢性ＧＶＨＤはコントロールが難しく、病変が多臓器に及び、移植後のquality of life（ＱＯＬ）を著しく悪化させる主因である。移植後１００日前後以降に発症し、自己免疫疾患に類似した病態を示し、また感染症の合併などによる死亡も多い。軽度のものを含めると、報告によって４０〜８０％の同種移植レシピエントに発症するといわれている。免疫抑制剤の投与で病勢のコントロールを試みるものの、効果が低いことが少なくない。近年では、肺の慢性ＧＶＨＤにて呼吸不全に陥り、肺移植術が施される例も散見される。
【０００３】
造血器移植は、ヒトの主要組織適合抗原であるＨＬＡの一致した同胞がドナーとして通常選定されるが、移植造血細胞中にＴリンパ球やその前駆細胞が含まれているため、ＨＬＡ以外のいわゆるｎｏｎ ＨＬＡ抗原を標的としてリンパ球が認識すると、種々の移植免疫反応が生じる場合がある。これによって惹起される特異な症候が臨床的にＧＶＨＤと呼ばれる。
【０００４】
同種造血幹細胞移植におけるＧＶＨＤの予防薬または治療薬として、ステロイド剤、サイクロスポリン（ＣｓＡ）、タクロリムス（ＦＫ５０６）などの免疫抑制剤が長期投与される。同種造血幹細胞移植においては、生着までに好中球減少状態だけでなく、ＧＶＨＤに対する強力な免疫抑制療法が細胞性免疫能の回復を遅延させ、日和見感染などの問題が生じている。近年では、強い免疫抑制状態に置かれる症例が増えているため、従来の抗真菌剤の予防的投与下で発熱などの症状が改善せず、新たな抗真菌剤の導入が望まれる例が報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
ＧＶＨＤの予防または治療のために、免疫抑制剤ではなく、他の薬剤を使用することができれば感染などの副作用が軽減され、新たな治療効果が期待できるが、慢性ＧＶＨＤについては、すぐれたマウスモデルが存在せず、その発症メカニズムは殆ど不明であるため、新たな薬剤については殆ど開発されていないのが現状である。
【０００６】
また、ＧＶＨＤの診断は、皮膚生検、肝生検、口唇生検など、各組織において病理学的に行われる。各病変組織における初期の炎症性変化としては、上皮組織や外分泌、内分泌腺へのリンパ球浸潤が主体であるが、進行すると繊維化や狭窄化、閉塞、萎縮が認められる。しかし、生検によらないＧＶＨＤの診断方法については、殆ど報告されていない。生検によらず、症状が進行する前にＧＶＨＤの診断ができれば患者の負担は軽減され、治療計画もたてやすい。
【０００７】
ケモカインの一種であるフラクタルカイン（Fractalkine/ＣＸ３ＣＬ１）の受容体であるＣＸ３ＣＲ１は、リンパ球や単球全般に発現している。フラクタルカインまたはフラクタルカイン受容体であるＣＸ３ＣＲ１のノックアウトマウスにて、単球の局所浸潤がその主な病因と考えられている動脈の粥状硬化症が起こりにくいことが示され、単球の関与する病態においてフラクタルカインが、単球を局所に呼び寄せる重要な因子であることが報告されている（非特許文献２〜４）。しかしながら、フラクタルカインと移植後ＧＶＨＤの関係については、報告されていない。
【０００８】
【非特許文献１】Jpn. J. Med. Mycol. 2003; 44: 187-191
【非特許文献２】J. Exp Med. 2003; 197: 1701-1707
【非特許文献３】Mol. Cell Biol. 2001; 21: 3159-3165
【非特許文献４】J. Clin. Invest. 2003; 111: 333-340
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、組織生検によらず効果的なＧＶＨＤの診断方法を提供することを課題とする。さらには、ＧＶＨＤに関し、副作用が軽減化された効果的な予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、細胞障害性免疫細胞のうち、特にＣＤ１４陽性単球・マクロファージと、それらを特に効果的に局所に呼び寄せるケモカインに注目し、鋭意研究を重ねた結果、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの末梢血単球（ＣＤ１４陽性単球）においてフラクタルカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ１）の発現率が低下していること、また、組織中にフラクタルカインの強発現とＣＤ１４陽性細胞の高度な浸潤を明らかにし、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することを特徴とする、移植片対宿主病の検査方法。
２．移植レシピエントの組織上のフラクタルカインの発現強度を検出することを特徴とする前項１に記載の移植片対宿主病の検査方法。
３．移植レシピエントの末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度を検出することを特徴とする前項１または２に記載の移植片対宿主病の検査方法。
４．前項１〜３のいずれか１に記載の移植片対宿主病の検査方法に使用する検査用試薬。
５．フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする移植片対宿主病に対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法。
６．フラクタルカインの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする前項５に記載のスクリーニング方法。
７．末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動を指標とすることを特徴とする前項５または６に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、移植レシピエントについて、患者組織に大きな侵襲なく採取可能な病変、例えば皮膚においてフラクタルカインの発現、または末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上において、フラクタルカインのレセプターであるＣＸ３ＣＲ１の発現の低下を検出することで、移植レシピエントがＧＶＨＤを発症しているか、または将来的に発症しうるかについて診断することができる。
さらに、ＧＶＨＤに対し、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤に比べ、副作用が少なく、効果的な予防薬および／または治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明が適用される移植は、特に限定されず、あらゆる移植が考えられる。具体的には組織（皮膚、角膜および骨などの組織）または臓器（肝臓、心臓、腎臓、肺、膵臓など）や、血液関係（造血幹細胞、リンパ球輸中）の移植などが挙げられ、特にＧＶＨＤの発症が問題となりうる移植に適用され、より好適には血液関係の移植において適用される。
【００１４】
本発明の検査方法、検査試薬、本発明のスクリーニング方法により得られる予防および／または治療用薬剤は急性ＧＶＨＤまたは慢性ＧＶＨＤのいずれにも適用され得るが、より好適には慢性ＧＶＨＤの場合が好ましい。
【００１５】
例えば、フラクタルカインは正常肺組織では強く発現しているが、正常皮膚では、弱く発現しているのみである。慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの肺組織でのフラクタルカインの発現量は正常肺組織に比べて殆ど変わらないものの、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚では強く発現することが観察された（図３−１、図４−１参照）。急性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚にもフラクタルカインの発現を認めたが、急性ＧＶＨＤの特徴を示す部位の一部で認めたのみである。これに比べて慢性ＧＶＨＤの場合には、より広範囲でフラクタルカインの発現を認めた。
【００１６】
また、健常人の場合はフラクタルカインの受容体であるＣＸ３ＣＲ１の発現は、末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上に認められるが、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントのＣＸ３ＣＲ１は、かなり低い発現量であった。一方、移植レシピエントのうち、慢性ＧＶＨＤでない者のＣＸ３ＣＲ１の発現量は、健常人のそれとほぼ同等である（図１参照）。一方、リンパ球では、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントと健常人もしくは慢性ＧＶＨＤを発症していないレシピエントとの間でＣＸ３ＣＲ１の発現に関し、相関関係は認められていない（図２参照）。このことから、末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動が、慢性ＧＶＨＤの発症のマーカーとなりうる。
【００１７】
上記により、本発明はより好適には慢性ＧＶＨＤの場合に適用される。ここで、慢性ＧＶＨＤの重症度の目安となるスコアリングシステムを次に示す。
【００１８】
慢性移植片対宿主病（重症度分類）
（一般全身状態）
０：症状なし(ECOGによる分類では０。ECOG:Eeastern Cooperative Oncology group)
１：症状あり(ECOGによる分類では１)
２：症状あり(ECOGによる分類では２)
３：症状あり(ECOGによる分類では３)
【００１９】
（皮膚）
０：慢性移植片対宿主病による皮膚症状なし。
１：体表面積の１８％未満の皮疹または皮膚硬化。
２：体表面積の１８〜５０％の皮疹または皮膚硬化。
３：体表面積の５０％を越える皮疹または皮膚硬化。
【００２０】
（口）
０：症状、理学所見なし。
１：口腔の症状（乾燥、味覚異常、口腔内の痛み）または所見（発赤、過角化、苔癬化または潰瘍形成）。
２：経口摂取を部分的に妨げる口腔の症状または所見。
３：経口摂取を大部分妨げる口腔の症状または所見。
【００２１】
（眼）
０：症状、角膜炎なし
１：症状のない角膜炎、または軽度の乾燥症状（保湿のための点眼の使用は１日３回まで）。
２：角結膜炎による症状はあるが視覚障害はない、または保湿のため１日に４回以上の点眼が必要である。
３：偽膜形成を伴う角膜潰瘍による視力障害、または鼻涙管の結紮を行っても痛みや不快感の軽減のための特殊な眼鏡を必要とする、または眼の症状のみが原因で就労不能である。
【００２２】
（消化器）
０：消化器症状なし
１：消化器症状はあるが、経静脈的な補液、栄養を必要としない。
２：消化器症状があり、部分的に経静脈的な補液、栄養による補助を必要とする。
３：消化器症状があり、経静脈栄養に全面的に依存している、または１５％を超える体重減少、または食道の拡張を認める。
【００２３】
（肝）
０：総ビリルビンとアルカリフォスファターゼ ≦１×基準値。
１：総ビリルビンもしくはアルカリフォスファターゼ ＞１×基準値かつ≦２×基準値
２：総ビリルビンもしくはアルカリフォスファターゼ ＞２×基準値かつ≦４×基準値
３：総ビリルビンもしくはアルカリフォスファターゼ ＞４×基準値、ＡＳＴ、ＡＬＴ ＞３×基準値
【００２４】
（肺）
０：症状なし
１：ＦＥＶ１．０が正常の５１〜５７％、ＦＥＶ１．０／ＦＶＣが正常の＜６５％、または１年間に１２％以上のＤＬＣＯの低下、または中等度運動時の呼吸困難。
２：ＦＥＶ１．０が正常の２５〜５０％、または軽度運動時の呼吸困難、または運動時の酸素飽和度の低下。
３：ＦＥＶ１．０が正常の＜２５％、または安静時呼吸困難、または運動時や安静時に酸素吸入を必要とする。
【００２５】
（関節と筋膜）
０：可動域制限なし
１：腕もしくは足に限局する運動制限。
２：ＡＤＬ（日常生活における活動性）に影響しない拘縮、または上下肢の両方に及ぶ運動制限。
３：ＡＤＬ（日常生活における活動性）を低下させる拘縮。
【００２６】
（生殖器）
０：症状なし
１：ＡＤＬ（日常生活における活動性）もしくは性交に影響を及ぼさない症候（萎縮、発赤、苔癬化、浮腫）
２：ＡＤＬ（日常生活における活動性）には影響しないが、性交困難の原因となる症候。
３：ＡＤＬ（日常生活における活動性）には影響する症候。
【００２７】
本発明は、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することによる、ＧＶＨＤの検査方法を提供する。
例えば、本発明における移植後の患者組織、特に好ましくは皮膚組織のフラクタルカインの発現量を調べることにより、ＧＶＨＤの発症を検査することができる。フラクタルカインの発現量は、自体公知の方法によることができ、組織細胞を取得したものを染色などにより検出することができる。その他、今後開発されるフラクタルカインの発現量を調べるあらゆる手段を採用することができる。例えば、フラクタルカイン特異的な遺伝子の発現を調べることにより検査することも可能である。
【００２８】
他の検査方法として、移植レシピエントから末梢血を採取し、末梢血中のＣＤ１４陽性単球に発現するＣＸ３ＣＲ１を検出することで、ＧＶＨＤを検査することができる。末梢血中のＣＤ１４陽性単球を定期的に採取し、ＣＸ３ＣＲ１の変動を観察することで、生検によらずともＧＶＨＤの発症を予測することができ、早期に治療計画をたてることも可能である。ＣＸ３ＣＲ１の変動の観察は、自体公知の方法によることができ、例えばフローサイトメトリーによる手法、あるいは今後開発されるあらゆる手法を採用することができる。例えば、ＣＸ３ＣＲ１特異的な遺伝子の発現を調べることにより検査することも可能である。
【００２９】
本発明は、上記検査方法に使用しうる試薬にもおよぶ。例えば、フラクタルカインおよび／またはＣＸ３ＣＲ１の抗原、抗体あるいはこれらのタンパク質に関連する遺伝子を検出しうるプローブ、プライマーなどを試薬として提供することができる。
【００３０】
本発明は、またフラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とするＧＶＨＤに対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法にもおよぶ。本発明において、初めて移植後ＧＶＨＤと、フラクタルカイン、その受容体ＣＸ３ＣＲ１との関係が見出された。これにより、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１の発現強度に変動を及ぼすメカニズムが、移植後ＧＶＨＤの発症に関係していることが示唆される。そこで、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を起こしうる物質を、候補化合物、候補物質から選定することで、移植後ＧＶＨＤの発症を予防または治療しうる物質の選定を行うことができる。
【００３１】
従来は、移植後ＧＶＨＤ、特に慢性ＧＶＨＤに対しては、効果的な治療方法はなく、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤投与を行うことが主流であった。しかし、本発明において、リンパ球上のＣＸ３ＣＲ１発現量と慢性ＧＶＨＤとの相関関係が認められなかったことから、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤の投与では慢性ＧＶＨＤの予防および／または治療について十分に効果を発揮し得ないことが示唆された。移植後ＧＶＨＤ、特に慢性ＧＶＨＤに特異的な発症メカニズムに応じた薬剤を用いることにより、副作用が軽減され、効果的な予防、治療効果を得ることができる。
【実施例】
【００３２】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは明らかである。
【００３３】
（実施例１）フローサイトメトリーによる分析
１）血液試料
同種造血幹細胞移植後のレシピエント１７名から末梢血を採取し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ１４陽性単球表面およびリンパ球に発現しているＣＸ３ＣＲ１（フラクタルカイン受容体）の発現強度を調べた。
各レシピエントは、男性が８名、女性が９名、年齢は２０〜６４歳、中央値は４５歳、移植後の日数は、９７〜２７８６日、中央値は６８１日であった。
【００３４】
２）臨床評価
慢性ＧＶＨＤの臨床症状（重症度）の評価は、"GVHD Morbidity Assessment"を変更して行った。各レシピエントの症状は、上述のスコアリングシステムに従って評価し、各スコアの合計を慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）スコアとして使用した。
【００３５】
３）フローサイトメトリー
血液試料を、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１４抗体（CALTAG社）で、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＸ３ＣＲ１抗体（MBL社）またはＦＩＴＣ結合のアイソタイプの一致した対照（MBL社）とともに染色し、続いて、溶解溶液（BD Pharmingen社）で赤血球の溶解を行った。分析を、CellQuestソフトウエア（Becton Dickinson社）を備えたFACSCaliburフローサイトメーターで行った。
【００３６】
４）結果
ＣＤ１４陽性単球についてのフローサイトメトリーの結果を図１−１に示した。左側にアイソタイプコントロールのピークを認め、右側にＣＸ３ＣＲ１のピークを認めた。慢性ＧＶＨＤの症状のないレシピエントのＣＤ１４陽性単球に比べ、慢性ＧＶＨＤの症状が強いレシピエントではＣＤ１４陽性単球におけるＣＸ３ＣＲ１の発現強度が弱かった。
慢性ＧＶＨＤスコアと、ＣＤ１４陽性単球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度を数値化（geometric mean）してコントロールの値を差し引いた値との相関を図１−２に示した。スピアマン順位相関係数を用いて、相関を求めた。P<0.05を統計学的有意とした。その結果、統計学的有意差をもって、慢性ＧＶＨＤの症状が強いレシピエントほど、末梢血ＣＤ１４陽性単球上のＣＸ３ＣＲ１発現強度は低かった。
リンパ球についてのフローサイトメトリーの結果を図２−１に示した。また、慢性ＧＶＨＤスコアと、リンパ球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度を数値化してコントロールの値を差し引いた値との相関を図２−２に示した。その結果、慢性ＧＶＨＤの症状の程度と、リンパ球におけるＣＸ３ＣＲ１の発現量との間に相関関係は認められなかった。
【００３７】
（実施例２）組織の免疫分析
１）組織試料
同種造血幹細胞移植後のレシピエントのうち、慢性ＧＶＨＤによる皮膚発疹を発症した４名から皮膚生検検体を採取した。また、上記４名とは異なるレシピエントで、同種造血幹細胞移植後の閉塞性細気管支炎（ＢＯ）による重症の呼吸不全のため、肺の移植を受けていた４名の摘出肺より肺組織を採取した。正常な皮膚と肺組織はBiochain Institiuteから購入した。
プロトコールは、岡山大学のInternal Review Boardにより認可されており、患者からインフォームドコンセントを得ている。
これらの組織上に発現したフラクラルカインおよびＣＤ１４陽性細胞について調べた。
【００３８】
２）組織免疫分析
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した各検体を、５μｍの厚さにスライスし、脱パラフィンをして、クエン酸緩衝液中でマイクロウェーブにより抗原回復を行った。
試料を３％ H2O2に浸して内因性のペルオキシダーゼを消去し、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ）＋５％ウマ血清でブロックし、ポリクローナルヤギ抗ヒトフラクタルカイン抗体（R&D systems社）または対照ヤギＩｇＧ（Sigma社）でインキュベートし、続いてビオチン化したウマ抗ヤギＩｇＧ(Vector Laboratories)でインキュベートした。アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）キット(Vector Laboratories)を使用して、染色シグナルを増強させた。抗原を、ＶＩＰ (Vector Laboratories)で可視化した。ＣＤ１４染色については、試料をＰＢＳ＋５％ヒツジ血清でブロックし、ビオチン化ヒツジ抗ヒトＣＤ１４抗体(R&D systems社)またはビオチン化対照ヒツジＩｇＧ（Sigma社）でインキュベートした。ＡＢＣキット（Vector Laboratories）とＶＩＰ（Vector Laboratories）を用いて、染色を可視化した。メチルグリーン（Vector Laboratories）を対比染色のために用いた。非特異的抗体での対照染色を、全ての染色実験で行ったが、重大な非特異的な染色は見られなかった。
【００３９】
３）結果
正常および慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの肺組織を図３−１，２に示した。その結果、フラクタルカインについては正常および慢性ＧＶＨＤの肺組織では細気管支上皮に染色が認められ、いずれの組織においても強く発現していることが観察された（図３−１、Ａ，Ｂ）。一方、ＣＤ１４抗原については、正常肺組織では殆ど染色されず、ＣＤ１４抗原は散在性であることが観察されたのに対し（図３−２、Ｃ）、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの肺組織では広い範囲に強く染色され、ＣＤ１４抗原が観察された（図３−２、Ｄ）。このことから、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントでは可溶性フラクタルカインが肺組織の細気管支上皮細胞から放出され、ＣＤ１４陽性単球が肺組織付近に呼び込まれたものと考えられる。
【００４０】
正常および慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚組織を図４−１，２に示した。その結果、フラクタルカインは、正常皮膚では薄く染色され、弱い発現しか観察されなかったのに対し（図４−１、Ｅ）、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントでは、広範な部分で染色を認め、上皮の肥厚とともに強く発現していることが観察された（図４−１、Ｆ）。慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントではケラチノサイトの増殖も観察された。ＣＤ１４抗原については、正常皮膚では殆ど染色されず、殆ど観察されなかったのに対し（図４−２、Ｇ）、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの皮膚では真皮で強い染色が認められ、また一部では表皮でもＣＤ１４抗原が観察された（図４−２、Ｈ）。このことから、慢性ＧＶＨＤ発症レシピエントの表皮から供給されるフラクタルカインにより、ＣＸ３ＣＲ１を高発現した単球が循環して真皮まで引き寄せられたものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
以上説明したように、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することにより、ＧＶＨＤの検査方法を提供することができる。さらに、フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とするＧＶＨＤに対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。
これにより、移植レシピエントがＧＶＨＤを発症しているか、または将来的に発症しうるかについて診断することができる。従来の生検による診断法に比べ、患者への負担は軽減化され、効果的に診断することができ、効果的な治療計画を早期に立てることができる。
また、本発明のスクリーニング方法により選定された薬剤により、ＧＶＨＤに対し、リンパ球の作用抑制目的で使用されている免疫抑制剤に比べ、副作用が少なく、効果的な予防薬および／または治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】ＣＤ１４陽性単球におけるＣＸ３ＣＲ１発現量をフローサイトメトリーにより調べた結果を示す図である。（実施例１）
【図１−２】慢性ＧＶＨＤスコアと、ＣＤ１４陽性単球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度の相関関係の結果を示す図である。（実施例１）
【図２−１】リンパ球におけるＣＸ３ＣＲ１発現量をフローサイトメトリーにより調べた結果を示す図である。（実施例１）
【図２−２】慢性ＧＶＨＤスコアと、リンパ球のＣＸ３ＣＲ１蛍光強度の相関関係の結果を示す図である。（実施例１）
【図３−１】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの肺組織におけるフラクタルカインの発現を染色により調べた図である。（実施例２）
【図３−２】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの肺組織におけるＣＤ１４抗原を染色により調べた図である。（実施例２）
【図４−１】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの皮膚組織におけるフラクタルカインの発現を染色により調べた図である。（実施例２）
【図４−２】正常および慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）発症レシピエントの皮膚組織におけるＣＤ１４抗原を染色により調べた図である。（実施例２）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することを特徴とする、移植片対宿主病の検査方法。
【請求項２】
移植レシピエントの組織上のフラクタルカインの発現強度を検出することを特徴とする請求項１に記載の移植片対宿主病の検査方法。
【請求項３】
移植レシピエントの末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度を検出することを特徴とする請求項１または２に記載の移植片対宿主病の検査方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の移植片対宿主病の検査方法に使用する検査用試薬。
【請求項５】
フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする移植片対宿主病に対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
フラクタルカインの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動を指標とすることを特徴とする請求項５または６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとして検出することを特徴とする、移植片対宿主病の検査方法。
【請求項２】
移植レシピエントの組織上のフラクタルカインの発現強度を検出することを特徴とする請求項１に記載の移植片対宿主病の検査方法。
【請求項３】
移植レシピエントの末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度を検出することを特徴とする請求項１または２に記載の移植片対宿主病の検査方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の移植片対宿主病の検査方法に使用する検査用試薬。
【請求項５】
フラクタルカインおよび／またはその受容体ＣＸ３ＣＲ１をマーカーとし、前記マーカーの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする移植片対宿主病に対する予防および／または治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
フラクタルカインの発現強度の変動を指標とすることを特徴とする請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）上のＣＸ３ＣＲ１の発現強度の変動を指標とすることを特徴とする請求項５または６に記載のスクリーニング方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【公開番号】特開２００７−５１９８０（Ｐ２００７−５１９８０Ａ）
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３８９８７（Ｐ２００５−２３８９８７）
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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