突然変異ペニシリンＧアシラーゼ
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのアミノ酸番号付けにより、アミノ酸位置Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１０９、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、野生型ペニシリンＧアシラーゼ由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼに関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、突然変異ペニシリンアシラーゼと、β−ラクタム核が突然変異ペニシリンアシラーゼの存在下で活性側鎖を介してアシル化されたβ−ラクタム抗生物質を調製するための方法とに関する。
【０００２】
［発明の背景］
抗生物質のβ−ラクタムファミリーは、臨床用途における抗菌化合物の最も重要なクラスである。天然β−ラクタム抗生物質の狭い殺菌スペクトル、その低い酸安定性および耐性問題の増大は、半合成ペニシリン（ＳＳＰ）および半合成セファロスポリン（ＳＳＣ）などの半合成抗生物質（ＳＳＡ）の開発の誘因となっている。一般に、半合成β−ラクタム抗生物質の化学合成は、高い下流処理費用および環境破壊的なプロセスの原因となる、反応中間体および有機溶媒を低温で使用する厳しい条件下で行われる。したがって、半合成β−ラクタム抗生物質のより持続可能な生産を得るため、従来の化学プロセスを酵素的変換によって代替する努力がなされている。
【０００３】
天然β−ラクタムは、典型的には、β−ラクタム核（例えば、６−アミノ−ペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、７−アミノ−デスアセトキシ−セファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）など）と、アミド結合を介して核に結合されるいわゆる側鎖とから構成される。ペニシリンＧアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１１）は、ペニシリンＧ（ＰｅｎＧ）、セファロスポリンＧ（ＣｅｆＧ）および関連抗生物質の側鎖を除去し、対応する脱アシル化核６−ＡＰＡおよび７−ＡＤＣＡを、それぞれ遊離側鎖（ＰｅｎＧおよびＣｅｆＧの場合にはフェニル酢酸（ＰＡＡ））とともに生成するように広く使用される加水分解酵素である。これらの脱アシル化β−ラクタム中間体は、アンピシリン、アモキシシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、セファレキシン、セファドロキシル、セフラジン、セファクロール、セフプロジル、セファトキシムなどのＳＳＡの構成要素である。ＰｅｎＧアシラーゼに関する最近のレビューとしては、Ｒａｊｅｎｄｈｒａｎ Ｊ．およびＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｐ．、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００４年）、９７、１−１３頁、Ａｒｒｏｙｏ Ｍ．ら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３年）６０、５０７−１４頁、Ｓｉｏ Ｃ．Ｆ．およびＱｕａｘ Ｗ．Ｊ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４年）、１５、３４９−５５頁、Ｃｈａｎｄｅｌ Ａ．Ｋ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８年）、４２、１９９−２０７頁を参照のこと。
【０００４】
脱アシル化β−ラクタム化合物以外では、ＰｅｎＧアシラーゼおよびアミノエステルヒドロラーゼも、β−ラクタム抗生物質の合成に使用可能であることが見出されている。このプロセスでは、ＰｅｎＧアシラーゼは、活性側鎖と脱アシル化β−ラクタム中間体（６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ、７−ＡＣＡなど）との縮合を触媒する。β−ラクタム抗生物質の酵素触媒合成は、平衡制御されるかまたは速度論的に制御された変換プロセスにおいて行われうる。平衡制御された変換の条件下で、達成可能な生成物蓄積のレベルは、反応の熱動的平衡によって支配され、それは半合成抗生物質の合成の場合、特に反応が水性媒体中で行われる場合には好ましくない。速度論的に制御された変換では、酵素は、アシル基の、活性側鎖、すなわちアシルドナーからβ−ラクタム核、すなわち求核的アクセプター（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｌｉｃ ａｃｃｅｐｔｏｒ）への転移を触媒する。半合成ペニシリンの調製においては、活性側鎖は、芳香族カルボキシル酸のアミド誘導体またはメチルエステルであってもよい。この場合、生成物蓄積のレベルは、酵素の触媒特性によって支配され、また高い非平衡濃度のアシル転移生成物が、一時的に得られうる。ＳＳＡの合成に使用される側鎖の例として、活性フェニルグリシン、活性ヒドロキシフェニルグリシン、活性ジヒドロ−フェニルグリシンなどが挙げられる。
【０００５】
ＰｅｎＧアシラーゼは、アミドおよびエステルの加水分解を、β−サブユニットのＮ末端セリンがアシル基にエステル化されているアシル酵素中間体を介して触媒する。加水分解の場合、水はアシル酵素を攻撃し、加水分解を完了まで駆動する。添加される外部求核試薬（例えば、６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ）のアミノ基が存在する場合、求核試薬と水の双方は、アシル酵素を攻撃し、望ましいアシル転移生成物（抗生物質）と望ましくない加水分解アシルドナーをそれぞれ生成しうる。
【０００６】
ＰｅｎＧアシラーゼがアシルトランスフェラーゼとして作用する、すなわちＳＳＡを合成する能力は、様々な半合成β−ラクタム抗生物質の酵素生産において既に産業規模で利用されている。しかし、ＳＳＡの生産においては、水による加水分解反応は、活性前駆体の側鎖がないことに起因し、転移反応の効率を低下させる。合成の速度（Ｓ）と加水分解の速度（Ｈ）との比は、ＰｅｎＧアシラーゼの合成性能を評価するための重要なパラメータである。Ｓ／Ｈ比は、酵素アシル化反応の間の規定条件での、加水分解生成物に対する合成生成物（ＳＳＡ）のモル比に等しい。合成生成物は、活性側鎖およびβ−ラクタム核から形成されるβ−ラクタム抗生物質として本明細書で定義される。加水分解生成物は、活性側鎖の対応する酸として本明細書で定義される。経済的に魅力的なプロセスにおいては、Ｓ／Ｈ比が高いと同時に、好ましくは酵素活性も十分に高いことが望ましい。
【０００７】
変換において認められるＳ／Ｈ比は、反応物、反応条件および変換の進行に依存する。Ｙｏｕｓｈｋｏらは、Ｓ／Ｈ比の初期値が酵素の速度論的特性と求核的アクセプター（例えば６−ＡＰＡ）の濃度の双方に依存することを示した（Ｙｏｕｓｈｋｏ Ｍ．Ｉ．およびＳｖｅｄａｓ Ｖ．Ｋ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（２０００年）、６５、１３６７−１３７５頁およびＹｏｕｓｈｋｏ Ｍ．Ｉ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２年）、１５９９、１３４−１４０頁）。一定の条件および求核試薬濃度で、初期Ｓ／Ｈ比は、異なるＰｅｎＧアシラーゼおよび／または異なるＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体の性能を比較するのに使用可能である。さらに、異なるＰｅｎＧアシラーゼの性能は、時間の関数として、変換の間での合成および加水分解を測定することによって比較可能である（それはＳ／Ｈ比の計算を変換の異なるステージで可能にする）。アシル化反応におけるＰｅｎＧアシラーゼの合成活性（＝合成の生成物が形成される速度＝合成の速度＝生成速度）は、規定条件下、単位時間当たりの、アシル化反応において形成されるβ−ラクタム抗生物質の量を示す。好ましくは、初期活性は測定される。初期酵素活性は、アシル化反応を行い、次いで反応時間に対する合成される生成物の量のグラフ、いわゆる進行曲線を作成することによって判定可能である。一般に、変換の開始時、生成物形成の速度は比較的一定であり、活性は、進行曲線の勾配から直接的に導くことが可能である。合成活性が変換の開始時に既に低下し始める場合、初期速度は、進行曲線の外挿およびｔ＝０での勾配の計算によって得られるものとする。異なるＰｅｎＧアシラーゼの活性を比較するため、合成活性は、同量のタンパク質に正規化されるものとする。加水分解の初期速度は、合成の初期速度の場合と同様の方法で、反応時間に対する加水分解される活性側鎖の量のグラフから判定可能である。
【０００８】
ＰｅｎＧアシラーゼは、ＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体を含む、いくつかの試験の対象であった。公表された変異体の詳細なリストが、ＲａｊｅｎｄｈｒａｎおよびＧｕｎａｓｅｋａｒａ（２００４年）（上記参照）において示されている。より最近では、さらなる試験が、Ｇａｂｏｒ Ｅ．Ｍ．およびＪａｎｓｓｅｎ Ｄ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２００４年）、１７、５７１−５７９頁；Ｊａｇｅｒ Ｓ．Ａ．Ｗ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８年）、１３３、１８−２６頁；Ｗａｎｇ Ｊ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７年）、７４、１０２３−１０３０頁によって公表された。
【０００９】
Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓに交付された国際特許出願の国際公開第９６／０５３１８号パンフレットは、ＰｅｎＧアシラーゼの特異性が、１つもしくは複数のアミノ酸位置の基質結合部位を突然変異させることによっていかにして修飾可能であるかについて教示している。ＰｅｎＧアシラーゼのＳ／Ｈ比についてもこの方法で調整可能であることが示された。
【００１０】
さらに、国際特許出願の国際公開第９８／２０１２０号パンフレット（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂに交付）、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレット（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓに交付）および中国特許出願第１０１１７７６８８号明細書（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに交付）は、ＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体を介した、β−ラクタム核および活性側鎖からのβ−ラクタム抗生物質の酵素調製のためのプロセスについて記載している。国際公開第９８／２０１２０号パンフレットは、α−サブユニットにおけるアミノ酸位置１４２および１４６、ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰｅｎＧアシラーゼのβ−サブユニットにおけるアミノ酸位置２４、５６もしくは１７７での突然変異について開示している。特に、位置β２４に突然変異を有するＰｅｎＧアシラーゼ変異体（Ｆβ２４Ａ）（そこではフェニルアラニンがアラニンによって置換されている）は、ペニシリンおよびセファロスポリンの合成において有意により高い収率をもたらすように見られる。しかし、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットにおいては、エステル前駆体ではなく、アミド前駆体が前記突然変異体Ｆβ２４Ａと併用される場合のプロセスにおいて、Ｓ／Ｈ比は依然として高いが、酵素活性が非常に低いことから、この突然変異体の使用が経済的にあまり魅力的でないことが示された。それに対し、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットでは、α−サブユニットにおける位置１４５のアルギニンがロイシン（Ｒα１４５Ｌ）、システイン（Ｒα１４５Ｃ）またはリジン（Ｒα１４５Ｋ）によって置換されているＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体がまた、改善されたＳ／Ｈ比を示すが、それに加え、特にアミド前駆体の場合、より高レベルの合成活性を保持していることが示された。それでもなお、これらすべての突然変異体の合成活性は、野生型ＰｅｎＧアシラーゼの合成活性より低かった。
【００１１】
中国特許出願第１０１１７７６８８号明細書は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＰｅｎＧアシラーゼの突然変異体についても、Ｓ／Ｈ比の改善には合成活性の低下を伴うことを開示した。
【００１２】
ＴＵＨＨ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨに交付された欧州特許第１４１８２３０号明細書は、α−サブユニットの翻訳後成熟が不完全であり、ペニシリンＧおよび６−ニトロ−３−フェニルアセトアミド安息香酸（さらにＮＩＰＡＢとも称される）に対してより高い加水分解活性をもたらす、アルカリゲネス・フェアカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）ＰｅｎＧアシラーゼについて開示している。前記α−サブユニットの不完全なプロセシングは、αおよびβサブユニットの間のいわゆるリンカー領域内のアミノ酸置換によって引き起こされた。かかる突然変異が合成活性も高めうるか否かについては、記載されなかった。
【００１３】
上で考察した先行技術は、ＰｅｎＧアシラーゼの様々な突然変異体のＳ／Ｈ比を増加させることは可能であっても、Ｓ／Ｈ比におけるかかる改善が、野生型ＰｅｎＧアシラーゼに対する合成活性の低下を伴うことを示す。したがって、これらの突然変異体の不利益は、かかる変換において、長い変換時間または非常に高い濃度の突然変異ＰｅｎＧアシラーゼが必要とされる点であり、そのため、かかる突然変異体の産業上の利用が、不可能ではないにしても経済的に魅力のないものとなる。
【００１４】
産業プロセスにとって好適であるように、Ｓ／Ｈ比が増加している一方で、野生型酵素に対して合成活性を維持するかまたはより好ましくは増大させる、突然変異ＰｅｎＧアシラーゼを提供することが本発明の目的である。
【００１５】
［発明の詳細な説明］
第１の態様では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのアミノ酸番号付けにより、アミノ酸位置Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１０９、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、野生型ペニシリンＧアシラーゼ由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを提供し、それは次に示される。
【化１】
【００１６】
遺伝子によってコードされる完全ポリペプチド鎖は、シグナルペプチド（２６個のアミノ酸−一重下線部分）、α−サブユニット（２０９個のアミノ酸）、結合ペプチド（５４個のアミノ酸−二重下線部分）およびβ−サブユニット（５５７個のアミノ酸）から構成される。シグナルペプチドと結合ペプチドの双方は、翻訳後成熟の間に除去され、それにより、α−およびβ−サブユニットで構成される酵素的に活性なペニシリンＧアシラーゼが生成される。α−サブユニットにおけるアミノ酸はＡ１〜Ａ２０９、β−サブユニットにおけるアミノ酸はＢ１〜Ｂ５５７で番号付けられる。
【００１７】
野生型ペニシリンＧアシラーゼは、天然ペニシリンＧアシラーゼとして本明細書で定義される。野生型ペニシリンＧアシラーゼは、任意の好適な野生型ペニシリンＧアシラーゼであってもよく、好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼおよび配列番号１に対して少なくとも３０％相同なペニシリンＧアシラーゼからなる群から選択される。好ましくは、野生型ペニシリンＧアシラーゼは、表１中にまとめられ、かつ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼと３０％以上の相同性を共有する１９種のペニシリンＧアシラーゼからなる群から選択される。
【００１８】
【表１】
【００１９】
配列番号１に対して４０％〜１００％相同なペニシリンＧアシラーゼ（例えば、群Ｉ〜ＩＩＩに属するペニシリンＧアシラーゼ）がより好ましく、配列番号１に対して５０％〜１００％相同なペニシリンＧアシラーゼ（例えば、群Ｉ〜ＩＩに属するペニシリンＧアシラーゼ）がさらにより好ましく、また配列番号１に対して８０％〜１００％相同なペニシリンＧアシラーゼ（例えば、群Ｉに属するペニシリンＧアシラーゼ）がさらにより好ましい。配列番号１のアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の野生型ペニシリンＧアシラーゼが最も好ましい。
【００２０】
好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換と、Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１０９、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される１つもしくは複数の位置にアミノ酸置換を有している。位置Ｂ２４での突然変異は、当該技術分野で既知である。国際公開第９６／０５３１８号パンフレットは、正に帯電したアミノ酸のリジンまたはアルギニンによる、アルカリゲネス・フェアカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）のペニシリンＧアシラーゼにおけるＢ２４での天然Ｐｈｅの置換について開示している。特に、Ｂ：Ｆ２４Ｋ突然変異体は、基質フェニルアセチル−ロイシンを切断し、それによってロイシンを遊離させ、アルカリゲネス・フェアカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）の突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子で形質転換されたロイシン欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の成長を可能にする改善された能力を示した。国際公開第９８／２０１２０号パンフレットは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のペニシリンＧアシラーゼの位置Ｂ２４でのあらゆる考えられる突然変異を示す。特に、ＡｌａによるＢ２４での天然Ｐｈｅの置換により、セファドロキシルの合成の間、Ｓ／Ｈ比における実質的改善が得られた。
【００２１】
今では驚くべきことに、Ｂ２４での突然変異とＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数の突然変異との組み合わせの結果、位置Ｂ２４単独に突然変異を有するペニシリンアシラーゼ突然変異体に対し、様々な半合成セファロスポリンおよび半合成ペニシリンの合成反応の間、増大した合成活性、場合によってさらに改善されたＳ／Ｈ比を有するペニシリンアシラーゼ突然変異体を生成しうることが見出されている。好ましいコンビナント（ｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（コンビナントは、野生型酵素に対し、少なくとも２つの突然変異を含む突然変異酵素として本明細書で定義される）は、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ９０］に突然変異を含む。
【００２２】
別の好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換、また場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を有している。位置Ｂ４６０と少なくとも位置Ｂ２４との好ましいコンビナントが上掲されている。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２］または位置［Ｂ４６０＋Ａ３］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２＋Ａ３］に突然変異を含む。
【００２３】
非常に好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のペニシリンＧアシラーゼである。
【００２４】
別の非常に好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、クルイベロミセス・クリオクレッセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ）由来のペニシリンＧアシラーゼである。
【００２５】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ３は、異なる種類のアミノ酸を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、セリンを有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはトレオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｓ３ＡまたはＡ：Ｓ３Ｌを含む。
【００２６】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ７７は、異なる種類のアミノ酸、例えば正に帯電した残基（Ｒ、Ｋ）および負に帯電した残基（Ｄ、Ｅ）ならびに極性残基（Ｓ、Ｎ、Ｑ）を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、アラニンを有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、トレオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ａ７７Ｔを含む。
【００２７】
【表２】
【００２８】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ９０は、異なる種類のアミノ酸であるが、主として正に帯電したもの（Ｒ、Ｋ）を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、メチオニンを有する。リジンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、リジンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｍ９０Ｋを含む。
【００２９】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ１４４は、主にアスパラギンを示す。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、トレオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。さらに、芳香族アミノ酸のチロシンまたはフェニルアラニンまたはトリプトファンは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおけるＡ１４４に対応する位置での好ましいアミノ酸である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｎ１４４Ｓを含む。
【００３０】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ１９２は、異なる種類のアミノ酸を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、バリンを有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、セリンまたはトレオニンなどのより極性が高いアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンなどのさらに帯電したアミノ酸による天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｖ１９２Ｅを含む。
【００３１】
位置Ｂ２４は、野生型ペニシリンＧアシラーゼの中で高度に保存される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼおよび多数の他の野生型酵素においては、フェニルアラニンが見出される。その他の野生型酵素はまた、疎水性残基（Ｍ、Ｖ）または極性残基（Ｑ）を有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、アラニンまたはロイシンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｆ２４ＡまたはＢ：Ｆ２４Ｌを含む。
【００３２】
位置Ｂ１０９は、主として、正に帯電したアミノ酸のリジンまたはアルギニンを示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、リジンが見出される。リジンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、アルギニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｋ１０９Ｒを含む。
【００３３】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ｂ１４８は、異なる種類であるが、主として小さい疎水性残基（Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ）を有しうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、バリンが見出される。ロイシンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｖ１４８Ｌを含む。
【００３４】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ｂ３１３は、異なる種類であるが、主として極性残基または負に帯電した残基（Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｔ、Ｅ）を有しうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、セリンが見出される。アスパラギンまたはアスパラギン酸を有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、アスパラギンまたはアスパラギン酸による天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｓ３１３Ｎを含む。
【００３５】
位置Ｂ４６０は、２０種の野生型ペニシリンＧアシラーゼの中で保存されることは少ない。大部分の野生型酵素は、疎水性残基（Ｆ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ）を有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、フェニルアラニンが見出される。天然ロイシンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシンによる天然アミノ酸の置換であるか、あるいはトレオニン、バリンまたはイソロイシンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｆ４６０Ｌを含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのＢ：Ｆ４６０に対応する位置にロイシンを有するペニシリンアシラーゼにおいては、ロイシンは、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのＢ：Ｆ２４に対応する位置での突然変異と組み合わされる場合、アラニン、トレオニン、バリンまたはイソロイシンによって置換されうる。
【００３６】
位置Ｂ４８８は、野生型ペニシリンＧアシラーゼの中で高度に保存される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、フェニルアラニンが見出される。ロイシンまたはメチオニンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシンまたはメチオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｆ４８８Ｌを含む。
【００３７】
第２の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様の突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする核酸配列を提供する。
【００３８】
第３の態様においては、本発明は、本発明の第２の態様の核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００３９】
第４の態様においては、本発明は、本発明の第３の態様の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４０】
第５の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様の突然変異ペニシリンＧアシラーゼを生産するための方法を提供する。
【００４１】
第６の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための方法を提供する。好ましい半合成β−ラクタム抗生物質は、半合成ペニシリンおよび半合成セファロスポリンからなる群から選択される。好ましい半合成ペニシリンの例として、アモキシシリンおよびアンピシリンがある。アモキシシリンは、活性ＨＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と６−ＡＰＡとの酵素共役によって生産可能である一方、アンピシリンは、活性ＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と６−ＡＰＡとの酵素共役によって生産可能である。好ましい半合成セファロスポリンの例として、セファドロキシル、セファレキシンおよびセフラジンがある。セファドロキシルは、活性ＨＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と７−ＡＤＣＡとの酵素共役によって生産可能である一方、セファレキシンは、活性ＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と７−ＡＤＣＡとの酵素共役によって生産可能であり、かつ、セフラジンは、活性ＤＨＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と７−ＡＤＣＡとの酵素共役によって生産可能である。
【００４２】
好ましい実施形態では、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための本発明の方法は、Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数の突然変異とともに、アミノ酸位置Ｂ２４での突然変異を含む突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを使用する工程を含む。好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ９０］に突然変異を含む。別の好ましい実施形態では、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための本発明の方法は、アミノ酸位置Ｂ４６０に突然変異、また場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を含む突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを使用する工程を含む。位置Ｂ４６０と少なくとも位置Ｂ２４との好ましいコンビナントは、上掲されている。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２］または位置［Ｂ４６０＋Ａ３］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２＋Ａ３］に突然変異を含む。非常に好ましい実施形態は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ、あるいは、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、クルイベロミセス・クリオクレッセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ）由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを使用する工程を含む。
【００４３】
本発明の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用による本発明の方法の利点は、合成活性の維持またはより好ましくは増大と、野生型酵素に対する突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼのより高いＳ／Ｈ比の結果として、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための生産プロセスが非常に効率的である点である。半合成β−ラクタム抗生物質は、高収率で生産される（例えば［生成物のモル数］／［付加されるβ−ラクタム核のモル数］一方、活性側鎖の加水分解は低い。別の利点は、プロセスが、［活性側鎖］／［β−ラクタム核］比（従来の先行技術において報告されたものより低い）で実施可能である点である。
【００４４】
本発明はまた、ＨＰＧと６−ＡＰＡとの共役を触媒する酵素の存在下での、アモキシシリンの生産のための方法であって、ここで、６−ＡＰＡに対する活性ＨＰＧ、好ましくはメチル−およびエチルエステルからなる群から選択されるエステルのモル比が、３．０以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは２．０以下、より好ましくは１．５以下、より好ましくは１．４以下、より好ましくは１．３以下、より好ましくは１．２以下、より好ましくは１．１以下、より好ましくは１．０９以下、より好ましくは１．０８以下、より好ましくは１．０７以下、より好ましくは１．０６以下、より好ましくは１．０５以下、より好ましくは１．０４以下、より好ましくは１．０３以下、および最も好ましくは１．０２以下であり、かつ、６−ＡＰＡを基準とする、酵素共役反応後に測定されるアモキシシリンの収率（モル／モル）が、９０％以上、好ましくは９１％以上、好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、好ましくは９４％以上、好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％以上、およびより好ましくは９９％以上である、方法を提供する。
【００４５】
好ましくは、アモキシシリンの生産のための方法における酵素は、５００ｍモル／ＬのＨＰＧＭおよび５３０ｍモル／Ｌの６−ＡＰＡからアモキシシリンを生産する（すなわち変換）特性を有し、本明細書中に開示される試験Ａに記載される条件下で行われる変換の最終段階で、５ｍモル／Ｌ未満の６−ＡＰＡを生成する、アシラーゼ、好ましくはペニシリン−Ｇアシラーゼである。表２？中の天然野生型ペニシリンＧアシラーゼの中に、この特性を有するものはない。好適な野生型ペニシリンＧアシラーゼは、スクリーニングによって見出されうるか、またはより好ましくは、１つもしくは複数のアミノ酸の置換によって得られうる。
【００４６】
本発明の方法の好ましい実施形態では、アモキシシリンは、本発明の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって生産してもよい。使用可能な非常に好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のペニシリンＧアシラーゼ、あるいは、位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または［Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０［または［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、クルイベロミセス・クリオクレッセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ）由来のペニシリンＧアシラーゼである。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または［Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有する、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のペニシリンＧアシラーゼが最も好ましい。
【００４７】
［材料および方法］
［アシラーゼ突然変異体の調製］
野生型および突然変異ペニシリンＧアシラーゼの生成、単離および精製は、国際公開第９６／０５３１８号パンフレットおよび国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットに記載のように行ってもよい。あるいは、突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子は、遺伝子合成によって得てもよい。
【００４８】
突然変異ペニシリンＧアシラーゼの生成は、突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子を適切な発現ベクターにクローン化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な宿主を、前記ベクターを用いて形質転換し、形質転換宿主を突然変異ペニシリンＧアシラーゼの生成にとって好適な条件下で培養することによって行ってもよい。突然変異体の回収および精製については、国際公開第９６０５３１８号パンフレットに記載のように行われた。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラムを装備したＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０システムおよびＴＳＫｇｅｌ ３０００ＳＷｘｌカラムを装備したＨＰＬＣシステムを使用し、アシラーゼが精製された。両システムは、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中、１ｍｌ／分の流速で稼動していた。
【００４９】
［アシラーゼ濃度の測定］
アシラーゼ濃度が、Ｓｖｅｄａｓら、１９７７年、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍｙａ［Ｒｕｓｓ．］３、５４６−５５３頁およびＡｌｋｅｍａら、１９９９年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７５、４７−５３頁によって記載されるように、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）を用いて活性部位滴定を行うことによって測定された。活性部位滴定時の初期活性および残留活性が、基質としてＮＩＰＡＢを用いて測定された。次いで、ＮＩＰＡＢの加水分解が、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸の放出による、４０５ｎｍでの吸光度の増大を測定することにより、０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中、３７℃で行われる。あるいは、活性部位滴定後の残留活性は、セファレキシンの合成を用いて測定してもよい（下記参照）。
【００５０】
［アシラーゼの固定化］
国際公開第９７／０４０８６号パンフレットおよび欧州特許第０２２２４６２号明細書において開示される方法に従い、様々なアシラーゼが固定化された。
【００５１】
［セファロスポリンの検出］
Ｆｕｊｉｉ法に従い、セファレキシンおよびセフラジンなどのセファロスポリンの検出が行われた（Ｆｕｊｉｉら、１９７６年、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１−２４頁）。本方法は、高スループットフォーマットスクリーニングに容易に変換可能である。
【００５２】
［セファレキシンの検出］
Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル（ＰＧＭ）および７−ＡＤＣＡからのセファレキシンの形成を測定するための標準アッセイが、次の方法で行われた。すなわち、１０μｌのペニシリンＧアシラーゼ溶液が、５０ｇ／ｌのＰＧＭおよび５０ｇ／ｌの７−ＡＤＣＡからなる１３０μｌの基質混合物に添加された（この溶液の調製については下記参照）。その後、反応画分が密封され、蒸発が阻止された。室温で２時間のインキュベーション時間後、１４０μｌの１Ｍ ＮａＯＨが添加されて反応が停止され、カラム展開が開始された。十分に混合することにより、沈殿が阻止される。密封された画分中、室温で２時間のインキュベーション後、４９０ｎｍでの吸光度が測定された。ブランク実験においては、水が酵素の代わりに添加された。初期代謝回転速度の測定の場合、酵素濃度は最終変換が１〜１０％の間であるように行われた。変換の制御を目的として酵素濃度を変化させるのではなく、その代わり反応時間を調整することで、所望される変換が得られうる。形成されるセファレキシンの絶対量は、（既知の量のセファレキシンを含有する試料の場合に測定された）セファレキシン濃度に対して、４９０ｎｍでＯＤをプロットする場合に得られる較正ラインから判定可能である。
【００５３】
ＰＧＭ／７−ＡＤＣＡ基質混合物を調製するため、５０ｇのＰＧＭ．ＭＳＡ（ＰＧＭ．ＭＳＡはＰＧＭのメタンスルホン酸（ＭＳＡ）塩）および５０ｇの７−ＡＤＣＡが、９００ｍｌの０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝６．９）に添加された。連続攪拌下で、ｐＨを４Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して６．９に再調整する。容量を緩衝液を使用して１リットルに調整し、再びｐＨを調整する。各実験においては、ＰＧＭが水で自発的に分解してから、新しい溶液が作製されるものとする。ＭＯＰＳ緩衝液の調製においては、２０．９ｇのＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｍ−１２５４）を、約９００ｍｌのミリＱ水に溶解する。ｐＨを４Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して６．９に調整し、容量をミリＱ水で１Ｌに調整する。
【００５４】
［セフラジンの検出］
Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステル（ＤＨＰＧＭ）および７−ＡＤＣＡからのセフラジンの形成を測定するための標準アッセイが、セファレキシンについての上記のように、次の方法で行われた。Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステルのメタンスルホン酸塩（ＤＨＰＧＭ．ＭＳＡ）のみが、ＰＧＭ．ＭＳＡの代わりに使用された。
【００５５】
［Ｓ／Ｈ比の測定］
β−ラクタム抗生物質の合成におけるＰｅｎＧアシラーゼのＳ／Ｈ比を測定するため、変換は時間の関数として測定された。試料が異なる時点で採取され、変換混合物の組成が測定された。反応は、ｐＨを２．７に低下させることによって停止された。試料は、形成されるアシル化抗生物質、抗生物質核、加水分解側鎖前駆体および側鎖前駆体の濃度を測定するため、ＵＰＬＣ（超高性能液体クロマトグラフィー）によって分析された。
【００５６】
合成活性は、好ましくは０〜１０％の間の変換で、反応時間に対する生成物の量をプロットすることによって得られる曲線の勾配から判定された（その領域では、反応の生成物の形成は通常、時間に対してほぼ線形である）。合成活性が反応の間に急速に低下する場合、初期速度は、進行曲線の外挿およびｔ＝０での勾配の計算によって得られうる。
【００５７】
加水分解活性は、好ましくは０〜１０％の間の加水分解で、反応時間に対する加水分解側鎖前駆体の量をプロットすることによって得られる曲線の勾配から判定された（その領域では、加水分解側鎖前駆体の形成は通常、時間に対してほぼ線形である）。Ｓ／Ｈ比は、合成活性の勾配を加水分解活性の勾配で除することによって計算された。
【００５８】
Ｓ／Ｈ比の測定は、セファレキシンについては１０ｇ／ｌのＰＧＭ．ＭＳＡおよび１０ｇ／ｌの７−ＡＤＣＡを含有する反応混合物中で、またセフラジンについては１０ｇ／ｌのＤＨＰＧＭ．ＭＳＡおよび１０ｇ／ｌの７−ＡＤＣＡを含有する反応混合物中で行われた。ペニシリンＧアシラーゼは、４時間後、７０〜９０％の変換が得られるように添加された。２０μｌの試料が、様々な時点で採取され、直ちに８００μｌの５０ｍＭリン酸（ｐＨ＝２．７）で希釈され、反応が停止された。
【００５９】
次のプロトコルに従って実施されたＵＰＬＣクロマトグラフィーの間、ＤＨＰＧＭ、ＤＨＰＧ、ＰＭＳＦ、ＰＧＭおよびＰＧの量は２１０ｎｍで、また７−ＡＤＣＡ、セファレキシンおよびセフラジンの量は２６０ｎｍで検出された。
ＡＣＱＵＩＴＹ−Ｐｕｍｐ ：バイナリ溶媒マネージャー
ＡＣＱＵＩＴＹ−Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ：試料マネージャーおよび試料オルガナイザー
ＡＣＱＵＩＴＹ−ＵＶ検出器 ：ＰＤＡ検出器（８０ヘルツ）
ＵＰＬＣ ＢＥＨフェニル、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ（カタログ番号１８６００２８８４）
流量 ：０．９ｍｌ／分
注入容量 ：２μｌ（部分ループ）
移動相Ａ ：５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）
移動相Ｂ ：１００％アセトニトリル
カラム温度 ：６０℃
トレー温度 ：１０℃
波長 ：２１０および２６０ｎｍ
稼動時間 ：１分
【００６０】
【表３】
【００６１】
［試験Ａ−６−ＡＰＡおよびＨＰＧメチルエステルからのアモキシシリンの生産］
１４０μｍの孔を有する篩底（ｓｉｅｖｅ ｂｏｔｔｏｍ）および撹拌装置を装備した２Ｌのステンレス鋼製反応器は、ＨＰＧＭと６−ＡＰＡとの共役を触媒するのに使用される固定化酸素で満たされた。容量は、水の添加により、１０００ｍｌに調節された。内容物は１０℃に冷却され、反応器内容物は、蠕動ポンプにより、篩底上で循環された。
【００６２】
１６２．２ｇの６−アミノペニシラン酸が添加された後、１４４ｇのＨＰＧＭが添加された。容量は、水の添加により、１５００ｍｌに調節された。混合物は、篩上で撹拌され、循環された。温度は１０℃に維持された。ｐＨは監視された。ｐＨは、最初は約６．３であり、しばらく経過後、約７に増加し、その後減少した。ｐＨが６．３未満の時点で、反応はほぼ完了する。その時点で（ＨＰＧＭの添加から約２時間後）、試料は、再循環ラインから採取され、濾過され、残留６−ＡＰＡの含量についてＨＰＬＣによって分析された。
【００６３】
［略号のリスト］
６−ＡＰＡ ：６−アミノペニシラン酸
７−ＡＤＣＡ ：７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸
ＡＭＰＩ ：アンピシリン
ＣＥＸ ：セファレキシン
ＤＨＰＧ ：Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシン
ＤＨＰＧＭ．ＭＳＡ ：Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステルメタンスルホン酸塩
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＨＰＧＭ ：Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル
ＰＧ ：Ｄ−フェニルグリシン
ＰＧＡ ：Ｄ−フェニルグリシンアミド
ＰＧＭ ：Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル
ＰＧＭ．ＨＣＬ ：Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルＨＣＩ塩
ＰＧＭ．ＭＳＡ ：Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルメタンスルホン酸塩
【００６４】
【表４】
【００６５】
［相同性および同一性］
用語「相同性」または「パーセント同一性」は、本明細書中で交換可能に使用される。本発明の目的として、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント相同性を判定するため、配列が最適な比較目的で整列されることが本明細書で規定される。２つの配列の間のアラインメントを最適化するため、比較される２つの配列のいずれかに、ギャップを導入してもよい。かかるアラインメントは、比較される配列の完全長にわたって行ってもよい。あるいは、アラインメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００もしくはそれ以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって行ってもよい。同一性は、報告される整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチ（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈ）の百分率である。
【００６６】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の判定は、数学的アルゴリズムを用いて行ってもよい。当業者は、２つの配列を整列し、２つの配列間の相同性を判定するのに、数種の異なるコンピュータプログラムが利用可能であることを理解するであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ Ｊ．Ｂ．（１９８３年） 「Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ（編）、「Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、１−４４頁、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの配列のアラインメントを目的としたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて判定してもよい（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ Ｃ．Ｄ．（１９７０年） Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３頁）。同アルゴリズムは、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の双方を整列することが可能である。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥ中に実装されている。本発明の目的のため、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００年） Ｒｉｃｅ Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ Ｊ．およびＢｌｅａｓｂｙ Ａ． 「Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」 １６、（６）、２７６−２７７頁、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックス用に使用される。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。その他について、規定することは可能である。使用されるオプションパラメータは、１０のギャップオープンペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、すべてのこれら異なるパラメータがやや異なる結果をもたらすが、２つの配列の全パーセント同一性が、異なるアルゴリズムを使用する場合での変化が有意でないことを理解するであろう。
【００６７】
［グローバルな相同性の定義］
相同性または同一性は、任意のギャップを含む全整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチの百分率である。２つの整列配列間の相同性または同一性は、次のように計算される。すなわち、アラインメントにおける対応位置の数は、両配列内の同一のアミノ酸を、ギャップを含むアラインメントの全長によって除したものを示す。本明細書で定義される同一性は、ＮＥＥＤＬＥから得てもよく、プログラムの出力において「ＩＤＥＮＴＩＴＹ」と称される。
【００６８】
［最長の同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の定義］
２つの整列配列間の相同性または同一性は、次のように計算される。すなわち、アラインメントにおける対応位置の数は、両配列における同一のアミノ酸を、アラインメントにおけるギャップの全数を差し引いた後、アラインメントの全長によって除したものを示す。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションの使用によってＮＥＥＤＬＥから得てもよく、プログラムの出力において「最長の同一性」と称される。
【００６９】
［実施例］
［実施例１］
［改善されたセファレキシン合成活性を有するペニシリンＧアシラーゼ突然変異体の選択］
ＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体の活性を改善されたＳ／Ｈ比によって改善する、アミノ酸の位置および突然変異を見出すため、既に次の２つの突然変異体、すなわちＢ：Ｆ２４ＡおよびＢ：Ｖ１４８Ｌ（以降、対照と称される）をタンパク質レベルで有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子の変異性突然変異誘発により、突然変異体ライブラリーを生成した。このようにして得られた突然変異体ライブラリーに対して、対照に対して改善されたセファレキシンの生産性を示す突然変異体についての高スループットスクリーニングを実施した。ｆｕｊｉｉ法によって形成されるセファレキシンの検出のアッセイおよび方法については、材料および方法の項において記載されている。高スループットにおいては、生産性という用語は、特定の期間内に一定量の無細胞抽出物（ＣＶＥ）によって合成されるセファレキシンの量を示す。全部で約７０００のクローンを試験した。
【００７０】
次いで、目的の突然変異体および対照のペニシリンアシラーゼを発現する組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、上記のように成長させた。同様のＯＤ６００ｎｍ値を有する振とうフラスコを取り、培養物を遠心分離し、−２０℃に凍結させた。無細胞抽出物を調製するため、ペレットを、０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅおよび２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する抽出緩衝液０．０５Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝６．９）に再懸濁し、インキュベートした。３０分後、抽出物を遠心分離し、アシラーゼ活性を有する上清を、セファレキシン合成試験に使用した。２時間後、変換を停止させ、形成されたセファレキシンの量を、材料および方法に記載のように測定し、４９０ｎｍでのＯＤとして表した。
【００７１】
対照に対して改善されたセファレキシンの生成についてのスクリーニングによって変異体ライブラリーから選択した突然変異体を、表３：Ｓ／Ｈにまとめる。突然変異体１〜４は、より高い活性を有する。
【００７２】
【表５】
【００７３】
［実施例２］
［アンピシリンの合成において改善されたアンピシリン／６−ＡＰＡを有するペニシリンＧアシラーゼ突然変異体の選択］
上記の突然変異体ライブラリーからの約６０００のクローンを、アンピシリンの合成について試験した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）クローンを成長させた後、無細胞抽出物を上記のように調製した。次いで、２０μＬの無細胞抽出物を、１２ｍＭ ＰＧＭ、４ｍＭ ６−ＡＰＡおよび１０ｍＭアンピシリンを含有する８０μＬの０．０５Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝６．９）に移す。ＰＧＭを、遊離塩基として調製する。すべての溶液を、毎日新しく調製する。反応は、室温で行い、ＰＭＳＦで停止させる。次いで、試料をＵＰＬＣクロマトグラフィーによって分析する。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨフェニル、５０×２．１ｍｍ、粒子サイズ１．７μｍ
溶媒Ａ：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．８
溶媒Ｂ：６０％アセトニトリル＋４０％ミリＱ水
弱洗浄（Ｗｅａｋ ｗａｓｈ）：５％アセトニトリル＋９５％ミリＱ水
強洗浄（Ｓｔｒｏｎｇ ｗａｓｈ）：９５％アセトニトリル＋５％ミリＱ水
【００７４】
【表６】
【００７５】
溶出化合物の同定および定量を、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ ２０００ＬＣ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用する質量分析およびＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）検出器を使用する１９０〜４００ｎｍの範囲内でのＵＶ測定によって行った。適切な標準を用いて較正を行った。
【００７６】
クローンを、アンピシリン／６ＡＰＡ比によってランク付けした。対照より高い比を示すクローンを、数回再試験した。最終的に、アンピシリン／６−ＡＰＡ比において、対照に対して一貫した改善を示す２つのクローンを配列決定した。２つの突然変異体における典型的結果を表４に示す。クローンの配列を表３に示す。
【００７７】
【表７】
【００７８】
突然変異体５〜６および８〜１２を、突然変異を組み合わせることによって得て、変異性ライブラリーのスクリーニングにおいて同定した。これらの突然変異体を試験した結果については、以下の実施例において記述されることになる。
【００７９】
［実施例３］
［改善されたセファレキシンの生産性について選択されるペニシリンＧアシラーゼ突然変異体のセファレキシン・エン・セフラジンの合成活性］
実施例１の選択された突然変異体である突然変異体１〜突然変異体４の活性（表３）は、同様の生成宿主の成長時に、ほぼ同様のペニシリンＧアシラーゼの発現が得られる（同様のＯＤ４９０ｎｍ〜細胞密度）という仮説に基づく。突然変異体の発現レベルにおける任意の差異について訂正するため、無細胞抽出物中のペニシリンアシラーゼの濃度を、材料および方法において記載されるＰＭＳＦ滴定を用いて測定した。ＰＭＳＦ滴定に基づき、活性ペニシリンＧアシラーゼ含量はさらに精製することなく測定可能であることから、（単位／ｍｇのアシラーゼでの）比活性は、より正確に測定できる。セファレキシンおよびセフラジンの合成における初期合成活性を測定するため、変換後、材料および方法に記載のようにＵＰＬＣを行った。結果を表５に示す。
【００８０】
【表８】
【００８１】
［実施例４］
［改善されたセファレキシンの生産性について選択されるペニシリンＧアシラーゼ突然変異体のＳ／Ｈ比］
選択される突然変異体１〜４のＳ／Ｈ比は、材料および方法に記載のように測定した。セファレキシンの合成の間、進行曲線を記録した。セファレキシンの合成およびＰＧＭの加水分解におけるＳ／Ｈ比を、これらの進行曲線から判定した。同じ突然変異体について、セフラジンの合成の間、進行曲線を記録した。セフラジンの合成およびジヒドロフェニルグリシンメチルエステルの加水分解におけるＳ／Ｈ比を判定した。結果を表６に示す。
【００８２】
【表９】
【００８３】
［実施例５］
［位置Ｂ４６０の修飾はペニシリンＧアシラーゼの合成の生産性を高めるのに重要である］
突然変異体５および１２は、突然変異体１に基づいて設計した。突然変異体５は、位置Ｂ４６０でのフェニルアラニンがロイシンによってさらに置換された対照である。突然変異体５と同様、突然変異体１２では、位置Ｂ４６０でのフェニルアラニンがロイシンによってさらに置換されているが、ここでは位置Ｂ２４でのアラニンが、多数の野生型ペニシリンＧアシラーゼにおけるこの位置で認められるように、フェニルアラニンにさらに置換された。上記のように、突然変異体５および１２をコードする遺伝子を、遺伝子合成によって得て、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に形質転換し、またそこで発現させた。発酵後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、細胞からペニシリン−Ｇアシラーゼを放出するため、超音波処理によって処理した。遠心分離によって細胞残渣を除去後、上清中の活性タンパク質の濃度を、ＰＭＳＦ滴定によって測定した。
【００８４】
突然変異体５および１２をセファレキシンの合成に適用する一方、野生型アシラーゼ（配列番号１）、対照アシラーゼおよび突然変異体１を対照として含めた。結果を下記に示す。
【００８５】
【表１０】
【００８６】
突然変異体１、５および１２は、位置Ｂ４６０のフェニルアラニンがロイシンによって置換されているという共通点を有する。全部で３つの突然変異体においては、この修飾は、Ｓ／Ｈ比の大幅な低下を伴うことなく、合成活性を増大させる。ほとんどの場合、Ｓ／Ｈ比はさらに改善される。
【００８７】
［実施例６］
［セファレキシンおよびセフラジンの合成における様々なコンビナントの性能］
突然変異体１および７は、突然変異アシラーゼをＰＧＭ、６−ＡＰＡおよびアンピシリンの混合物に暴露する場合での、改善されたアンピシリン／６−ＡＰＡ比についてのスクリーニングから選択した。突然変異体１はまた、セファレキシンの合成における改善された生産性についてのスクリーニングから選択した。突然変異体１および突然変異体７において認められる突然変異は、異なる方法で組み合わせてもよい。突然変異体６および８〜１１は、かかる組み合わせの例である。上記のように、突然変異体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における遺伝子合成、形質転換および発現によって得てもよい。これらの突然変異体の一部の試験結果を表８に示す。
【００８８】
【表１１】
【００８９】
突然変異体１および突然変異体７の突然変異の組み合わせから得られるコンビナントは、特定の態様では、かかるハイブリッドがそれらの親の性能を超えうることを示す。
【００９０】
［実施例７］
［６−ＡＰＡおよびＨＰＧメチルエステルからのアモキシシリンの生成］
１４０μｍの孔を有する篩底および撹拌装置を装備した２Ｌのステンレス鋼製反応器を、表中に示される固定化酸素で満たした。容量を、水の添加により、１０００ｍｌに調節した。内容物を１０℃に冷却し、反応器内容物を、蠕動ポンプにより、篩底上で循環させた。
【００９１】
１６２．２ｇの６−アミノペニシラン酸を添加後、ＨＰＧＭを添加した（表を参照）。容量を、水の添加により、１５００ｍｌに調節した。混合物を、篩底上で撹拌し、循環させた。温度を１０℃に維持した。ｐＨを監視した。ｐＨは、最初は約６．３であり、しばらく経過後、約７に増加させ、その後減少させた。ｐＨが６．３未満の時点で、反応はほぼ完了する。その時点で（ＨＰＧＭの添加から約２時間後）、試料を、再循環ラインから採取し、濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。様々な実験の結果を表９に示す。
【００９２】
突然変異体１およびＨＰＧＭの１．０６等価物（表中の変換１０）との反応混合物に、さらなるプロセシングを施す。反応混合物を、固定化（ｉｍｍｏｂ）酵素が篩をほぼ遮断する時まで、篩の下部から採取する。次いで、水をステンレス鋼製反応器内の混合物に添加すると同時に、混合物を、回収される全懸濁液が３０００ｍｌの容量を有する時まで、篩の下部から採取する。
【００９３】
変換１０を、反応器内の既存の同じ酵素を使用しながら、同量の６−ＡＰＡおよびＨＰＧＭを添加することにより、さらに３回繰り返した。これら４つの連続的変換１０の懸濁液を、結合させ、再結晶化を施す。懸濁液を２５℃に加熱し、混合物を一連の５つの撹拌容器（各々３０ｍｌ）に導入する。混合物を、重力排出（ｇｒａｖｉｔｙ ｏｖｅｒｆｌｏｗ）により、１つの撹拌容器から次の容器に移す。懸濁液の流量は、３０００ｍｌ／ｈである。同時に、３５％ＨＣｌを、第１の容器に、懸濁液中の沈殿物が一連の５つの撹拌容器内で十分に溶解する程度の速度で添加する。酸性溶液を、ラインで１０μｍのフィルタ上に濾過し、晶析装置に導入する。この晶析装置では、ｐＨは２５％ＮａＯＨの添加によってｐＨ＝３．７に維持し、温度は２０℃に維持する。容量は、第２の晶析装置への重力排出により、２２５０ｍｌに維持する。この晶析装置では、ｐＨは、２０℃で２５％ＮａＯＨの添加によってｐＨ＝５．０に維持する。第２の晶析装置内の容量は、撹拌容器への重力排出により、７５０ｍｌに維持する。この容器の内容物を３℃に冷却する。この容器内の滞留時間は、４時間である。結晶懸濁液を、濾過し、水（１．５ｌ／ｋｇ生成物）で洗浄し、一定重量になるまで、３５℃、換気式ストーブ（ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｓｔｏｖｅ）で乾燥させる。アモキシシリン三水和物の収率（添加される６−ＡＰＡに対して計算）は、９１％（モル／モル）であった。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
［実施例８］
［Ｄ−フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液の合成］
Ｄ−フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液の合成を、本質的に国際公開第２００８／１１０５２７号パンフレット中に記載のように行った。
【００９６】
９０ｇのＰＧを１７０ｍｌのメタノール中に懸濁し、７３．２ｇの濃硫酸を添加した。混合物を、約７３℃、還流下で２時間保持し、減圧下で濃縮した（ｐ＝２０ｍｍＨｇ、Ｔ＝７５〜８０℃）。１７０ｍｌのメタノールを添加し、混合物を、再び還流下で２時間保持し、減圧下で濃縮した。再び、１７０ｍｌのメタノールを添加し、混合物を、還流下で２時間保持し、減圧下で濃縮した。最後に、１２５ｍｌのメタノールを添加した。溶液を、２０ｍｌのメタノールで予備帯電した第２の反応器に、２０℃で１時間以内に投入した。ｐＨを、アンモニアで３．５に保持した。固体が形成され、それを濾過によって除去した。得られた母液を、２５ｍｌの水で希釈し、減圧下で濃縮した（ｐ＝２０ｍｍＨｇ、Ｔ＝４０〜４５℃）。最後に、２０７．５ｇのＰＧＭ溶液を得た。
【００９７】
［実施例９］
［セファレキシンの酵素合成］
１７５μｍの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たし、それにより、固定化（ｉｍｍｏｂ）粒子のタンパク質負荷は、試験したすべてのアシラーゼと同様であった。次いで、２１．４ｇの７−ＡＤＣＡおよび９５ｇの水を２５℃で添加し、ｐＨを２５％アンモニアで７．０に調整した。実施例８において得られた３８ｇのＰＧＭ溶液を、反応器に、１２０分以内に一定速度で投入した。ｐＨをアンモニアで７．０に維持した。温度を２５℃に保持した。３０分後、０．２５ｇの固体セファレキシン（シード）を添加した。セファレキシンの結晶化が、４５分後に開始された。１２０〜１５０分の間に、ｐＨを２５％硫酸で７．０に保持した。次いで、ｐＨを２５％硫酸で５．７に低下させた。
【００９８】
反応器から、上方攪拌により、底部篩を通して放出させた。得られたセファレキシン懸濁液を、ガラスフィルターを通して濾過した。得られた母液を、再び反応器に移した。この順序での工程を５回繰り返した。次いで、酵素を１０ｍｌの水で２回洗浄した。このようにして、セファレキシンの９８％以上を固体生体触媒から分離した。
【００９９】
セファレキシンの湿潤ケーキ（ｗｅｔ ｃａｋｅ）、母液および洗浄水を結合させ、温度を２℃に維持した。結合された湿潤ケーキおよび母液のｐＨを濃硫酸で１．５に低下させ、得られた溶液を０．４５μｍのフィルタを通して濾過した。
【０１００】
結晶化反応器を、２０ｇの水および１．０ｇのセファレキシン（シード）で満たした。上記の酸性セファレキシン溶液を、結晶化反応器に、３０℃で８０分以内に投入した。ｐＨをアンモニアで５．０に保持した。次いで、懸濁液を、２０℃でさらに３０分間撹拌した。懸濁液を、ガラスフィルターを通して濾過し、湿潤ケーキを、１５ｍｌの水で２回および１５ｍｌのアセトンで２回洗浄した。
【０１０１】
【表１３】
【０１０２】
［実施例１０］
［７−ＡＤＣＡおよびＨＰＧメチルエステルからのセファドロキシルの生産］
１７５μｍの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たした。次いで、１７．７ｇの７−ＡＤＣＡ、１５．６ｇのＨＰＧＭ、０．０２ｇのＥＤＴＡおよび１２３ｇの水を１０℃で添加し、ｐＨを２５％アンモニアで７．２に調整した。酵素反応を１０℃で行い、ｐＨをギ酸で７．２に保持した。
【０１０３】
【表１４】
【０１０４】
［実施例１１］
［セフラジンの酵素合成］
１７５μｍの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たした。次いで、１４．８２ｇの７−ＡＤＣＡおよび５０ｇの水を２０℃で添加し、ｐＨを２５％アンモニアで６．９に調整した。
【０１０５】
１８．５ｇのＤＨＰＧＭ．ＭＳＡを２０ｍｌの水に溶解し、溶液を反応器に１５０分以内に一定速度で投入した。ｐＨをアンモニアで７．０に維持した。温度を２０℃に保持した。３０分後、０．２５ｇの固体セフラジン（シード）を添加した。４６０分後、ｐＨを２５％硫酸で５．７に低下させた。ＤＨＰＧの測定の不正確さが原因で、Ｓ／Ｈを十分な精度で測定することができなかった。
【０１０６】
【表１５】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、突然変異ペニシリンアシラーゼと、β−ラクタム核が突然変異ペニシリンアシラーゼの存在下で活性側鎖を介してアシル化されたβ−ラクタム抗生物質を調製するための方法とに関する。
【０００２】
［発明の背景］
抗生物質のβ−ラクタムファミリーは、臨床用途における抗菌化合物の最も重要なクラスである。天然β−ラクタム抗生物質の狭い殺菌スペクトル、その低い酸安定性および耐性問題の増大は、半合成ペニシリン（ＳＳＰ）および半合成セファロスポリン（ＳＳＣ）などの半合成抗生物質（ＳＳＡ）の開発の誘因となっている。一般に、半合成β−ラクタム抗生物質の化学合成は、高い下流処理費用および環境破壊的なプロセスの原因となる、反応中間体および有機溶媒を低温で使用する厳しい条件下で行われる。したがって、半合成β−ラクタム抗生物質のより持続可能な生産を得るため、従来の化学プロセスを酵素的変換によって代替する努力がなされている。
【０００３】
天然β−ラクタムは、典型的には、β−ラクタム核（例えば、６−アミノ−ペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、７−アミノ−デスアセトキシ−セファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）など）と、アミド結合を介して核に結合されるいわゆる側鎖とから構成される。ペニシリンＧアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１１）は、ペニシリンＧ（ＰｅｎＧ）、セファロスポリンＧ（ＣｅｆＧ）および関連抗生物質の側鎖を除去し、対応する脱アシル化核６−ＡＰＡおよび７−ＡＤＣＡを、それぞれ遊離側鎖（ＰｅｎＧおよびＣｅｆＧの場合にはフェニル酢酸（ＰＡＡ））とともに生成するように広く使用される加水分解酵素である。これらの脱アシル化β−ラクタム中間体は、アンピシリン、アモキシシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、セファレキシン、セファドロキシル、セフラジン、セファクロール、セフプロジル、セファトキシムなどのＳＳＡの構成要素である。ＰｅｎＧアシラーゼに関する最近のレビューとしては、Ｒａｊｅｎｄｈｒａｎ Ｊ．およびＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｐ．、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００４年）、９７、１−１３頁、Ａｒｒｏｙｏ Ｍ．ら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３年）６０、５０７−１４頁、Ｓｉｏ Ｃ．Ｆ．およびＱｕａｘ Ｗ．Ｊ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４年）、１５、３４９−５５頁、Ｃｈａｎｄｅｌ Ａ．Ｋ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８年）、４２、１９９−２０７頁を参照のこと。
【０００４】
脱アシル化β−ラクタム化合物以外では、ＰｅｎＧアシラーゼおよびアミノエステルヒドロラーゼも、β−ラクタム抗生物質の合成に使用可能であることが見出されている。このプロセスでは、ＰｅｎＧアシラーゼは、活性側鎖と脱アシル化β−ラクタム中間体（６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ、７−ＡＣＡなど）との縮合を触媒する。β−ラクタム抗生物質の酵素触媒合成は、平衡制御されるかまたは速度論的に制御された変換プロセスにおいて行われうる。平衡制御された変換の条件下で、達成可能な生成物蓄積のレベルは、反応の熱動的平衡によって支配され、それは半合成抗生物質の合成の場合、特に反応が水性媒体中で行われる場合には好ましくない。速度論的に制御された変換では、酵素は、アシル基の、活性側鎖、すなわちアシルドナーからβ−ラクタム核、すなわち求核的アクセプター（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｌｉｃ ａｃｃｅｐｔｏｒ）への転移を触媒する。半合成ペニシリンの調製においては、活性側鎖は、芳香族カルボキシル酸のアミド誘導体またはメチルエステルであってもよい。この場合、生成物蓄積のレベルは、酵素の触媒特性によって支配され、また高い非平衡濃度のアシル転移生成物が、一時的に得られうる。ＳＳＡの合成に使用される側鎖の例として、活性フェニルグリシン、活性ヒドロキシフェニルグリシン、活性ジヒドロ−フェニルグリシンなどが挙げられる。
【０００５】
ＰｅｎＧアシラーゼは、アミドおよびエステルの加水分解を、β−サブユニットのＮ末端セリンがアシル基にエステル化されているアシル酵素中間体を介して触媒する。加水分解の場合、水はアシル酵素を攻撃し、加水分解を完了まで駆動する。添加される外部求核試薬（例えば、６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ）のアミノ基が存在する場合、求核試薬と水の双方は、アシル酵素を攻撃し、望ましいアシル転移生成物（抗生物質）と望ましくない加水分解アシルドナーをそれぞれ生成しうる。
【０００６】
ＰｅｎＧアシラーゼがアシルトランスフェラーゼとして作用する、すなわちＳＳＡを合成する能力は、様々な半合成β−ラクタム抗生物質の酵素生産において既に産業規模で利用されている。しかし、ＳＳＡの生産においては、水による加水分解反応は、活性前駆体の側鎖がないことに起因し、転移反応の効率を低下させる。合成の速度（Ｓ）と加水分解の速度（Ｈ）との比は、ＰｅｎＧアシラーゼの合成性能を評価するための重要なパラメータである。Ｓ／Ｈ比は、酵素アシル化反応の間の規定条件での、加水分解生成物に対する合成生成物（ＳＳＡ）のモル比に等しい。合成生成物は、活性側鎖およびβ−ラクタム核から形成されるβ−ラクタム抗生物質として本明細書で定義される。加水分解生成物は、活性側鎖の対応する酸として本明細書で定義される。経済的に魅力的なプロセスにおいては、Ｓ／Ｈ比が高いと同時に、好ましくは酵素活性も十分に高いことが望ましい。
【０００７】
変換において認められるＳ／Ｈ比は、反応物、反応条件および変換の進行に依存する。Ｙｏｕｓｈｋｏらは、Ｓ／Ｈ比の初期値が酵素の速度論的特性と求核的アクセプター（例えば６−ＡＰＡ）の濃度の双方に依存することを示した（Ｙｏｕｓｈｋｏ Ｍ．Ｉ．およびＳｖｅｄａｓ Ｖ．Ｋ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（２０００年）、６５、１３６７−１３７５頁およびＹｏｕｓｈｋｏ Ｍ．Ｉ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２年）、１５９９、１３４−１４０頁）。一定の条件および求核試薬濃度で、初期Ｓ／Ｈ比は、異なるＰｅｎＧアシラーゼおよび／または異なるＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体の性能を比較するのに使用可能である。さらに、異なるＰｅｎＧアシラーゼの性能は、時間の関数として、変換の間での合成および加水分解を測定することによって比較可能である（それはＳ／Ｈ比の計算を変換の異なるステージで可能にする）。アシル化反応におけるＰｅｎＧアシラーゼの合成活性（＝合成の生成物が形成される速度＝合成の速度＝生成速度）は、規定条件下、単位時間当たりの、アシル化反応において形成されるβ−ラクタム抗生物質の量を示す。好ましくは、初期活性は測定される。初期酵素活性は、アシル化反応を行い、次いで反応時間に対する合成される生成物の量のグラフ、いわゆる進行曲線を作成することによって判定可能である。一般に、変換の開始時、生成物形成の速度は比較的一定であり、活性は、進行曲線の勾配から直接的に導くことが可能である。合成活性が変換の開始時に既に低下し始める場合、初期速度は、進行曲線の外挿およびｔ＝０での勾配の計算によって得られるものとする。異なるＰｅｎＧアシラーゼの活性を比較するため、合成活性は、同量のタンパク質に正規化されるものとする。加水分解の初期速度は、合成の初期速度の場合と同様の方法で、反応時間に対する加水分解される活性側鎖の量のグラフから判定可能である。
【０００８】
ＰｅｎＧアシラーゼは、ＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体を含む、いくつかの試験の対象であった。公表された変異体の詳細なリストが、ＲａｊｅｎｄｈｒａｎおよびＧｕｎａｓｅｋａｒａ（２００４年）（上記参照）において示されている。より最近では、さらなる試験が、Ｇａｂｏｒ Ｅ．Ｍ．およびＪａｎｓｓｅｎ Ｄ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２００４年）、１７、５７１−５７９頁；Ｊａｇｅｒ Ｓ．Ａ．Ｗ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８年）、１３３、１８−２６頁；Ｗａｎｇ Ｊ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７年）、７４、１０２３−１０３０頁によって公表された。
【０００９】
Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓに交付された国際特許出願の国際公開第９６／０５３１８号パンフレットは、ＰｅｎＧアシラーゼの特異性が、１つもしくは複数のアミノ酸位置の基質結合部位を突然変異させることによっていかにして修飾可能であるかについて教示している。ＰｅｎＧアシラーゼのＳ／Ｈ比についてもこの方法で調整可能であることが示された。
【００１０】
さらに、国際特許出願の国際公開第９８／２０１２０号パンフレット（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂに交付）、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレット（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓに交付）および中国特許出願第１０１１７７６８８号明細書（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに交付）は、ＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体を介した、β−ラクタム核および活性側鎖からのβ−ラクタム抗生物質の酵素調製のためのプロセスについて記載している。国際公開第９８／２０１２０号パンフレットは、α−サブユニットにおけるアミノ酸位置１４２および１４６、ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＰｅｎＧアシラーゼのβ−サブユニットにおけるアミノ酸位置２４、５６もしくは１７７での突然変異について開示している。特に、位置β２４に突然変異を有するＰｅｎＧアシラーゼ変異体（Ｆβ２４Ａ）（そこではフェニルアラニンがアラニンによって置換されている）は、ペニシリンおよびセファロスポリンの合成において有意により高い収率をもたらすように見られる。しかし、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットにおいては、エステル前駆体ではなく、アミド前駆体が前記突然変異体Ｆβ２４Ａと併用される場合のプロセスにおいて、Ｓ／Ｈ比は依然として高いが、酵素活性が非常に低いことから、この突然変異体の使用が経済的にあまり魅力的でないことが示された。それに対し、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットでは、α−サブユニットにおける位置１４５のアルギニンがロイシン（Ｒα１４５Ｌ）、システイン（Ｒα１４５Ｃ）またはリジン（Ｒα１４５Ｋ）によって置換されているＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体がまた、改善されたＳ／Ｈ比を示すが、それに加え、特にアミド前駆体の場合、より高レベルの合成活性を保持していることが示された。それでもなお、これらすべての突然変異体の合成活性は、野生型ＰｅｎＧアシラーゼの合成活性より低かった。
【００１１】
中国特許出願第１０１１７７６８８号明細書は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＰｅｎＧアシラーゼの突然変異体についても、Ｓ／Ｈ比の改善には合成活性の低下を伴うことを開示した。
【００１２】
ＴＵＨＨ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨに交付された欧州特許第１４１８２３０号明細書は、α−サブユニットの翻訳後成熟が不完全であり、ペニシリンＧおよび６−ニトロ−３−フェニルアセトアミド安息香酸（さらにＮＩＰＡＢとも称される）に対してより高い加水分解活性をもたらす、アルカリゲネス・フェアカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）ＰｅｎＧアシラーゼについて開示している。前記α−サブユニットの不完全なプロセシングは、αおよびβサブユニットの間のいわゆるリンカー領域内のアミノ酸置換によって引き起こされた。かかる突然変異が合成活性も高めうるか否かについては、記載されなかった。
【００１３】
上で考察した先行技術は、ＰｅｎＧアシラーゼの様々な突然変異体のＳ／Ｈ比を増加させることは可能であっても、Ｓ／Ｈ比におけるかかる改善が、野生型ＰｅｎＧアシラーゼに対する合成活性の低下を伴うことを示す。したがって、これらの突然変異体の不利益は、かかる変換において、長い変換時間または非常に高い濃度の突然変異ＰｅｎＧアシラーゼが必要とされる点であり、そのため、かかる突然変異体の産業上の利用が、不可能ではないにしても経済的に魅力のないものとなる。
【００１４】
産業プロセスにとって好適であるように、Ｓ／Ｈ比が増加している一方で、野生型酵素に対して合成活性を維持するかまたはより好ましくは増大させる、突然変異ＰｅｎＧアシラーゼを提供することが本発明の目的である。
【００１５】
［発明の詳細な説明］
第１の態様では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのアミノ酸番号付けにより、アミノ酸位置Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１０９、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、野生型ペニシリンＧアシラーゼ由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを提供し、それは次に示される。
【化１】
【００１６】
遺伝子によってコードされる完全ポリペプチド鎖は、シグナルペプチド（２６個のアミノ酸−一重下線部分）、α−サブユニット（２０９個のアミノ酸）、結合ペプチド（５４個のアミノ酸−二重下線部分）およびβ−サブユニット（５５７個のアミノ酸）から構成される。シグナルペプチドと結合ペプチドの双方は、翻訳後成熟の間に除去され、それにより、α−およびβ−サブユニットで構成される酵素的に活性なペニシリンＧアシラーゼが生成される。α−サブユニットにおけるアミノ酸はＡ１〜Ａ２０９、β−サブユニットにおけるアミノ酸はＢ１〜Ｂ５５７で番号付けられる。
【００１７】
野生型ペニシリンＧアシラーゼは、天然ペニシリンＧアシラーゼとして本明細書で定義される。野生型ペニシリンＧアシラーゼは、任意の好適な野生型ペニシリンＧアシラーゼであってもよく、好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼおよび配列番号１に対して少なくとも３０％相同なペニシリンＧアシラーゼからなる群から選択される。好ましくは、野生型ペニシリンＧアシラーゼは、表１中にまとめられ、かつ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼと３０％以上の相同性を共有する１９種のペニシリンＧアシラーゼからなる群から選択される。
【００１８】
【表１】
【００１９】
配列番号１に対して４０％〜１００％相同なペニシリンＧアシラーゼ（例えば、群Ｉ〜ＩＩＩに属するペニシリンＧアシラーゼ）がより好ましく、配列番号１に対して５０％〜１００％相同なペニシリンＧアシラーゼ（例えば、群Ｉ〜ＩＩに属するペニシリンＧアシラーゼ）がさらにより好ましく、また配列番号１に対して８０％〜１００％相同なペニシリンＧアシラーゼ（例えば、群Ｉに属するペニシリンＧアシラーゼ）がさらにより好ましい。配列番号１のアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の野生型ペニシリンＧアシラーゼが最も好ましい。
【００２０】
好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換と、Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１０９、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される１つもしくは複数の位置にアミノ酸置換を有している。位置Ｂ２４での突然変異は、当該技術分野で既知である。国際公開第９６／０５３１８号パンフレットは、正に帯電したアミノ酸のリジンまたはアルギニンによる、アルカリゲネス・フェアカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）のペニシリンＧアシラーゼにおけるＢ２４での天然Ｐｈｅの置換について開示している。特に、Ｂ：Ｆ２４Ｋ突然変異体は、基質フェニルアセチル−ロイシンを切断し、それによってロイシンを遊離させ、アルカリゲネス・フェアカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆｅａｃａｌｉｓ）の突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子で形質転換されたロイシン欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の成長を可能にする改善された能力を示した。国際公開第９８／２０１２０号パンフレットは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のペニシリンＧアシラーゼの位置Ｂ２４でのあらゆる考えられる突然変異を示す。特に、ＡｌａによるＢ２４での天然Ｐｈｅの置換により、セファドロキシルの合成の間、Ｓ／Ｈ比における実質的改善が得られた。
【００２１】
今では驚くべきことに、Ｂ２４での突然変異とＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数の突然変異との組み合わせの結果、位置Ｂ２４単独に突然変異を有するペニシリンアシラーゼ突然変異体に対し、様々な半合成セファロスポリンおよび半合成ペニシリンの合成反応の間、増大した合成活性、場合によってさらに改善されたＳ／Ｈ比を有するペニシリンアシラーゼ突然変異体を生成しうることが見出されている。好ましいコンビナント（ｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（コンビナントは、野生型酵素に対し、少なくとも２つの突然変異を含む突然変異酵素として本明細書で定義される）は、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ９０］に突然変異を含む。
【００２２】
別の好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換、また場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を有している。位置Ｂ４６０と少なくとも位置Ｂ２４との好ましいコンビナントが上掲されている。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２］または位置［Ｂ４６０＋Ａ３］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２＋Ａ３］に突然変異を含む。
【００２３】
非常に好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のペニシリンＧアシラーゼである。
【００２４】
別の非常に好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、クルイベロミセス・クリオクレッセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ）由来のペニシリンＧアシラーゼである。
【００２５】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ３は、異なる種類のアミノ酸を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、セリンを有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはトレオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｓ３ＡまたはＡ：Ｓ３Ｌを含む。
【００２６】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ７７は、異なる種類のアミノ酸、例えば正に帯電した残基（Ｒ、Ｋ）および負に帯電した残基（Ｄ、Ｅ）ならびに極性残基（Ｓ、Ｎ、Ｑ）を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、アラニンを有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、トレオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ａ７７Ｔを含む。
【００２７】
【表２】
【００２８】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ９０は、異なる種類のアミノ酸であるが、主として正に帯電したもの（Ｒ、Ｋ）を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、メチオニンを有する。リジンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、リジンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｍ９０Ｋを含む。
【００２９】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ１４４は、主にアスパラギンを示す。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、トレオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。さらに、芳香族アミノ酸のチロシンまたはフェニルアラニンまたはトリプトファンは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおけるＡ１４４に対応する位置での好ましいアミノ酸である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｎ１４４Ｓを含む。
【００３０】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ａ１９２は、異なる種類のアミノ酸を有しうる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）野生型酵素は、バリンを有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、セリンまたはトレオニンなどのより極性が高いアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンなどのさらに帯電したアミノ酸による天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ａ：Ｖ１９２Ｅを含む。
【００３１】
位置Ｂ２４は、野生型ペニシリンＧアシラーゼの中で高度に保存される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼおよび多数の他の野生型酵素においては、フェニルアラニンが見出される。その他の野生型酵素はまた、疎水性残基（Ｍ、Ｖ）または極性残基（Ｑ）を有する。野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、アラニンまたはロイシンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｆ２４ＡまたはＢ：Ｆ２４Ｌを含む。
【００３２】
位置Ｂ１０９は、主として、正に帯電したアミノ酸のリジンまたはアルギニンを示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、リジンが見出される。リジンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、アルギニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｋ１０９Ｒを含む。
【００３３】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ｂ１４８は、異なる種類であるが、主として小さい疎水性残基（Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ）を有しうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、バリンが見出される。ロイシンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｖ１４８Ｌを含む。
【００３４】
野生型ペニシリンアシラーゼにおける位置Ｂ３１３は、異なる種類であるが、主として極性残基または負に帯電した残基（Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｔ、Ｅ）を有しうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、セリンが見出される。アスパラギンまたはアスパラギン酸を有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、アスパラギンまたはアスパラギン酸による天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｓ３１３Ｎを含む。
【００３５】
位置Ｂ４６０は、２０種の野生型ペニシリンＧアシラーゼの中で保存されることは少ない。大部分の野生型酵素は、疎水性残基（Ｆ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ）を有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、フェニルアラニンが見出される。天然ロイシンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシンによる天然アミノ酸の置換であるか、あるいはトレオニン、バリンまたはイソロイシンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｆ４６０Ｌを含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのＢ：Ｆ４６０に対応する位置にロイシンを有するペニシリンアシラーゼにおいては、ロイシンは、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのＢ：Ｆ２４に対応する位置での突然変異と組み合わされる場合、アラニン、トレオニン、バリンまたはイソロイシンによって置換されうる。
【００３６】
位置Ｂ４８８は、野生型ペニシリンＧアシラーゼの中で高度に保存される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおいては、フェニルアラニンが見出される。ロイシンまたはメチオニンを有しない野生型ペニシリンアシラーゼにおける好ましい突然変異は、ロイシンまたはメチオニンによる天然アミノ酸の置換を含む。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼにおける非常に好ましい突然変異は、Ｂ：Ｆ４８８Ｌを含む。
【００３７】
第２の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様の突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする核酸配列を提供する。
【００３８】
第３の態様においては、本発明は、本発明の第２の態様の核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００３９】
第４の態様においては、本発明は、本発明の第３の態様の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４０】
第５の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様の突然変異ペニシリンＧアシラーゼを生産するための方法を提供する。
【００４１】
第６の態様においては、本発明は、本発明の第１の態様の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための方法を提供する。好ましい半合成β−ラクタム抗生物質は、半合成ペニシリンおよび半合成セファロスポリンからなる群から選択される。好ましい半合成ペニシリンの例として、アモキシシリンおよびアンピシリンがある。アモキシシリンは、活性ＨＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と６−ＡＰＡとの酵素共役によって生産可能である一方、アンピシリンは、活性ＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と６−ＡＰＡとの酵素共役によって生産可能である。好ましい半合成セファロスポリンの例として、セファドロキシル、セファレキシンおよびセフラジンがある。セファドロキシルは、活性ＨＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と７−ＡＤＣＡとの酵素共役によって生産可能である一方、セファレキシンは、活性ＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と７−ＡＤＣＡとの酵素共役によって生産可能であり、かつ、セフラジンは、活性ＤＨＰＧ（例えば、アミドまたはエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルとしての）と７−ＡＤＣＡとの酵素共役によって生産可能である。
【００４２】
好ましい実施形態では、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための本発明の方法は、Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数の突然変異とともに、アミノ酸位置Ｂ２４での突然変異を含む突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを使用する工程を含む。好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ３＋Ａ１９２］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０＋Ａ９０］に突然変異を含む。別の好ましい実施形態では、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための本発明の方法は、アミノ酸位置Ｂ４６０に突然変異、また場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１４８、Ｂ１０９、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を含む突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを使用する工程を含む。位置Ｂ４６０と少なくとも位置Ｂ２４との好ましいコンビナントは、上掲されている。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ９０］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］または位置［Ｂ４６０＋Ａ９０＋Ｂ１０９＋Ａ１４４］に突然変異を含む。他の好ましいコンビナントは、位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２］または位置［Ｂ４６０＋Ａ３］または位置［Ｂ４６０＋Ａ１９２＋Ａ３］に突然変異を含む。非常に好ましい実施形態は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ、あるいは、位置［Ｂ２４＋Ａ１４４］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ａ１４４＋Ｂ１０９］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］または位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ１４４＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、クルイベロミセス・クリオクレッセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ）由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼを使用する工程を含む。
【００４３】
本発明の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用による本発明の方法の利点は、合成活性の維持またはより好ましくは増大と、野生型酵素に対する突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼのより高いＳ／Ｈ比の結果として、半合成β−ラクタム抗生物質の生産のための生産プロセスが非常に効率的である点である。半合成β−ラクタム抗生物質は、高収率で生産される（例えば［生成物のモル数］／［付加されるβ−ラクタム核のモル数］一方、活性側鎖の加水分解は低い。別の利点は、プロセスが、［活性側鎖］／［β−ラクタム核］比（従来の先行技術において報告されたものより低い）で実施可能である点である。
【００４４】
本発明はまた、ＨＰＧと６−ＡＰＡとの共役を触媒する酵素の存在下での、アモキシシリンの生産のための方法であって、ここで、６−ＡＰＡに対する活性ＨＰＧ、好ましくはメチル−およびエチルエステルからなる群から選択されるエステルのモル比が、３．０以下、より好ましくは２．５以下、より好ましくは２．０以下、より好ましくは１．５以下、より好ましくは１．４以下、より好ましくは１．３以下、より好ましくは１．２以下、より好ましくは１．１以下、より好ましくは１．０９以下、より好ましくは１．０８以下、より好ましくは１．０７以下、より好ましくは１．０６以下、より好ましくは１．０５以下、より好ましくは１．０４以下、より好ましくは１．０３以下、および最も好ましくは１．０２以下であり、かつ、６−ＡＰＡを基準とする、酵素共役反応後に測定されるアモキシシリンの収率（モル／モル）が、９０％以上、好ましくは９１％以上、好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、好ましくは９４％以上、好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％以上、およびより好ましくは９９％以上である、方法を提供する。
【００４５】
好ましくは、アモキシシリンの生産のための方法における酵素は、５００ｍモル／ＬのＨＰＧＭおよび５３０ｍモル／Ｌの６−ＡＰＡからアモキシシリンを生産する（すなわち変換）特性を有し、本明細書中に開示される試験Ａに記載される条件下で行われる変換の最終段階で、５ｍモル／Ｌ未満の６−ＡＰＡを生成する、アシラーゼ、好ましくはペニシリン−Ｇアシラーゼである。表２？中の天然野生型ペニシリンＧアシラーゼの中に、この特性を有するものはない。好適な野生型ペニシリンＧアシラーゼは、スクリーニングによって見出されうるか、またはより好ましくは、１つもしくは複数のアミノ酸の置換によって得られうる。
【００４６】
本発明の方法の好ましい実施形態では、アモキシシリンは、本発明の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって生産してもよい。使用可能な非常に好ましい突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のペニシリンＧアシラーゼ、あるいは、位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または［Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０［または［Ｂ２４＋Ｂ１４８＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有し、それは場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸置換と組み合わされる、クルイベロミセス・クリオクレッセンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ）由来のペニシリンＧアシラーゼである。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ位置［Ｂ２４＋Ｂ１０９］または［Ｂ２４＋Ｂ４６０］または［Ｂ１０９＋Ｂ４６０］または［Ｂ２４＋Ｂ１０９＋Ｂ４６０］にアミノ酸置換を有する、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のペニシリンＧアシラーゼが最も好ましい。
【００４７】
［材料および方法］
［アシラーゼ突然変異体の調製］
野生型および突然変異ペニシリンＧアシラーゼの生成、単離および精製は、国際公開第９６／０５３１８号パンフレットおよび国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットに記載のように行ってもよい。あるいは、突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子は、遺伝子合成によって得てもよい。
【００４８】
突然変異ペニシリンＧアシラーゼの生成は、突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子を適切な発現ベクターにクローン化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な宿主を、前記ベクターを用いて形質転換し、形質転換宿主を突然変異ペニシリンＧアシラーゼの生成にとって好適な条件下で培養することによって行ってもよい。突然変異体の回収および精製については、国際公開第９６０５３１８号パンフレットに記載のように行われた。さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラムを装備したＡｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０システムおよびＴＳＫｇｅｌ ３０００ＳＷｘｌカラムを装備したＨＰＬＣシステムを使用し、アシラーゼが精製された。両システムは、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中、１ｍｌ／分の流速で稼動していた。
【００４９】
［アシラーゼ濃度の測定］
アシラーゼ濃度が、Ｓｖｅｄａｓら、１９７７年、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍｙａ［Ｒｕｓｓ．］３、５４６−５５３頁およびＡｌｋｅｍａら、１９９９年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７５、４７−５３頁によって記載されるように、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）を用いて活性部位滴定を行うことによって測定された。活性部位滴定時の初期活性および残留活性が、基質としてＮＩＰＡＢを用いて測定された。次いで、ＮＩＰＡＢの加水分解が、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸の放出による、４０５ｎｍでの吸光度の増大を測定することにより、０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中、３７℃で行われる。あるいは、活性部位滴定後の残留活性は、セファレキシンの合成を用いて測定してもよい（下記参照）。
【００５０】
［アシラーゼの固定化］
国際公開第９７／０４０８６号パンフレットおよび欧州特許第０２２２４６２号明細書において開示される方法に従い、様々なアシラーゼが固定化された。
【００５１】
［セファロスポリンの検出］
Ｆｕｊｉｉ法に従い、セファレキシンおよびセフラジンなどのセファロスポリンの検出が行われた（Ｆｕｊｉｉら、１９７６年、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１−２４頁）。本方法は、高スループットフォーマットスクリーニングに容易に変換可能である。
【００５２】
［セファレキシンの検出］
Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル（ＰＧＭ）および７−ＡＤＣＡからのセファレキシンの形成を測定するための標準アッセイが、次の方法で行われた。すなわち、１０μｌのペニシリンＧアシラーゼ溶液が、５０ｇ／ｌのＰＧＭおよび５０ｇ／ｌの７−ＡＤＣＡからなる１３０μｌの基質混合物に添加された（この溶液の調製については下記参照）。その後、反応画分が密封され、蒸発が阻止された。室温で２時間のインキュベーション時間後、１４０μｌの１Ｍ ＮａＯＨが添加されて反応が停止され、カラム展開が開始された。十分に混合することにより、沈殿が阻止される。密封された画分中、室温で２時間のインキュベーション後、４９０ｎｍでの吸光度が測定された。ブランク実験においては、水が酵素の代わりに添加された。初期代謝回転速度の測定の場合、酵素濃度は最終変換が１〜１０％の間であるように行われた。変換の制御を目的として酵素濃度を変化させるのではなく、その代わり反応時間を調整することで、所望される変換が得られうる。形成されるセファレキシンの絶対量は、（既知の量のセファレキシンを含有する試料の場合に測定された）セファレキシン濃度に対して、４９０ｎｍでＯＤをプロットする場合に得られる較正ラインから判定可能である。
【００５３】
ＰＧＭ／７−ＡＤＣＡ基質混合物を調製するため、５０ｇのＰＧＭ．ＭＳＡ（ＰＧＭ．ＭＳＡはＰＧＭのメタンスルホン酸（ＭＳＡ）塩）および５０ｇの７−ＡＤＣＡが、９００ｍｌの０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝６．９）に添加された。連続攪拌下で、ｐＨを４Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して６．９に再調整する。容量を緩衝液を使用して１リットルに調整し、再びｐＨを調整する。各実験においては、ＰＧＭが水で自発的に分解してから、新しい溶液が作製されるものとする。ＭＯＰＳ緩衝液の調製においては、２０．９ｇのＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｍ−１２５４）を、約９００ｍｌのミリＱ水に溶解する。ｐＨを４Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して６．９に調整し、容量をミリＱ水で１Ｌに調整する。
【００５４】
［セフラジンの検出］
Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステル（ＤＨＰＧＭ）および７−ＡＤＣＡからのセフラジンの形成を測定するための標準アッセイが、セファレキシンについての上記のように、次の方法で行われた。Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステルのメタンスルホン酸塩（ＤＨＰＧＭ．ＭＳＡ）のみが、ＰＧＭ．ＭＳＡの代わりに使用された。
【００５５】
［Ｓ／Ｈ比の測定］
β−ラクタム抗生物質の合成におけるＰｅｎＧアシラーゼのＳ／Ｈ比を測定するため、変換は時間の関数として測定された。試料が異なる時点で採取され、変換混合物の組成が測定された。反応は、ｐＨを２．７に低下させることによって停止された。試料は、形成されるアシル化抗生物質、抗生物質核、加水分解側鎖前駆体および側鎖前駆体の濃度を測定するため、ＵＰＬＣ（超高性能液体クロマトグラフィー）によって分析された。
【００５６】
合成活性は、好ましくは０〜１０％の間の変換で、反応時間に対する生成物の量をプロットすることによって得られる曲線の勾配から判定された（その領域では、反応の生成物の形成は通常、時間に対してほぼ線形である）。合成活性が反応の間に急速に低下する場合、初期速度は、進行曲線の外挿およびｔ＝０での勾配の計算によって得られうる。
【００５７】
加水分解活性は、好ましくは０〜１０％の間の加水分解で、反応時間に対する加水分解側鎖前駆体の量をプロットすることによって得られる曲線の勾配から判定された（その領域では、加水分解側鎖前駆体の形成は通常、時間に対してほぼ線形である）。Ｓ／Ｈ比は、合成活性の勾配を加水分解活性の勾配で除することによって計算された。
【００５８】
Ｓ／Ｈ比の測定は、セファレキシンについては１０ｇ／ｌのＰＧＭ．ＭＳＡおよび１０ｇ／ｌの７−ＡＤＣＡを含有する反応混合物中で、またセフラジンについては１０ｇ／ｌのＤＨＰＧＭ．ＭＳＡおよび１０ｇ／ｌの７−ＡＤＣＡを含有する反応混合物中で行われた。ペニシリンＧアシラーゼは、４時間後、７０〜９０％の変換が得られるように添加された。２０μｌの試料が、様々な時点で採取され、直ちに８００μｌの５０ｍＭリン酸（ｐＨ＝２．７）で希釈され、反応が停止された。
【００５９】
次のプロトコルに従って実施されたＵＰＬＣクロマトグラフィーの間、ＤＨＰＧＭ、ＤＨＰＧ、ＰＭＳＦ、ＰＧＭおよびＰＧの量は２１０ｎｍで、また７−ＡＤＣＡ、セファレキシンおよびセフラジンの量は２６０ｎｍで検出された。
ＡＣＱＵＩＴＹ−Ｐｕｍｐ ：バイナリ溶媒マネージャー
ＡＣＱＵＩＴＹ−Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ：試料マネージャーおよび試料オルガナイザー
ＡＣＱＵＩＴＹ−ＵＶ検出器 ：ＰＤＡ検出器（８０ヘルツ）
ＵＰＬＣ ＢＥＨフェニル、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ（カタログ番号１８６００２８８４）
流量 ：０．９ｍｌ／分
注入容量 ：２μｌ（部分ループ）
移動相Ａ ：５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）
移動相Ｂ ：１００％アセトニトリル
カラム温度 ：６０℃
トレー温度 ：１０℃
波長 ：２１０および２６０ｎｍ
稼動時間 ：１分
【００６０】
【表３】
【００６１】
［試験Ａ−６−ＡＰＡおよびＨＰＧメチルエステルからのアモキシシリンの生産］
１４０μｍの孔を有する篩底（ｓｉｅｖｅ ｂｏｔｔｏｍ）および撹拌装置を装備した２Ｌのステンレス鋼製反応器は、ＨＰＧＭと６−ＡＰＡとの共役を触媒するのに使用される固定化酸素で満たされた。容量は、水の添加により、１０００ｍｌに調節された。内容物は１０℃に冷却され、反応器内容物は、蠕動ポンプにより、篩底上で循環された。
【００６２】
１６２．２ｇの６−アミノペニシラン酸が添加された後、１４４ｇのＨＰＧＭが添加された。容量は、水の添加により、１５００ｍｌに調節された。混合物は、篩上で撹拌され、循環された。温度は１０℃に維持された。ｐＨは監視された。ｐＨは、最初は約６．３であり、しばらく経過後、約７に増加し、その後減少した。ｐＨが６．３未満の時点で、反応はほぼ完了する。その時点で（ＨＰＧＭの添加から約２時間後）、試料は、再循環ラインから採取され、濾過され、残留６−ＡＰＡの含量についてＨＰＬＣによって分析された。
【００６３】
［略号のリスト］
６−ＡＰＡ ：６−アミノペニシラン酸
７−ＡＤＣＡ ：７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸
ＡＭＰＩ ：アンピシリン
ＣＥＸ ：セファレキシン
ＤＨＰＧ ：Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシン
ＤＨＰＧＭ．ＭＳＡ ：Ｄ−２，５−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステルメタンスルホン酸塩
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＨＰＧＭ ：Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル
ＰＧ ：Ｄ−フェニルグリシン
ＰＧＡ ：Ｄ−フェニルグリシンアミド
ＰＧＭ ：Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル
ＰＧＭ．ＨＣＬ ：Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルＨＣＩ塩
ＰＧＭ．ＭＳＡ ：Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルメタンスルホン酸塩
【００６４】
【表４】
【００６５】
［相同性および同一性］
用語「相同性」または「パーセント同一性」は、本明細書中で交換可能に使用される。本発明の目的として、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント相同性を判定するため、配列が最適な比較目的で整列されることが本明細書で規定される。２つの配列の間のアラインメントを最適化するため、比較される２つの配列のいずれかに、ギャップを導入してもよい。かかるアラインメントは、比較される配列の完全長にわたって行ってもよい。あるいは、アラインメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００もしくはそれ以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって行ってもよい。同一性は、報告される整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチ（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈ）の百分率である。
【００６６】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の判定は、数学的アルゴリズムを用いて行ってもよい。当業者は、２つの配列を整列し、２つの配列間の相同性を判定するのに、数種の異なるコンピュータプログラムが利用可能であることを理解するであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ Ｊ．Ｂ．（１９８３年） 「Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ（編）、「Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」、１−４４頁、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの配列のアラインメントを目的としたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて判定してもよい（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ Ｃ．Ｄ．（１９７０年） Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３頁）。同アルゴリズムは、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の双方を整列することが可能である。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥ中に実装されている。本発明の目的のため、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００年） Ｒｉｃｅ Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ Ｊ．およびＢｌｅａｓｂｙ Ａ． 「Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」 １６、（６）、２７６−２７７頁、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックス用に使用される。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。その他について、規定することは可能である。使用されるオプションパラメータは、１０のギャップオープンペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、すべてのこれら異なるパラメータがやや異なる結果をもたらすが、２つの配列の全パーセント同一性が、異なるアルゴリズムを使用する場合での変化が有意でないことを理解するであろう。
【００６７】
［グローバルな相同性の定義］
相同性または同一性は、任意のギャップを含む全整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチの百分率である。２つの整列配列間の相同性または同一性は、次のように計算される。すなわち、アラインメントにおける対応位置の数は、両配列内の同一のアミノ酸を、ギャップを含むアラインメントの全長によって除したものを示す。本明細書で定義される同一性は、ＮＥＥＤＬＥから得てもよく、プログラムの出力において「ＩＤＥＮＴＩＴＹ」と称される。
【００６８】
［最長の同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の定義］
２つの整列配列間の相同性または同一性は、次のように計算される。すなわち、アラインメントにおける対応位置の数は、両配列における同一のアミノ酸を、アラインメントにおけるギャップの全数を差し引いた後、アラインメントの全長によって除したものを示す。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションの使用によってＮＥＥＤＬＥから得てもよく、プログラムの出力において「最長の同一性」と称される。
【００６９】
［実施例］
［実施例１］
［改善されたセファレキシン合成活性を有するペニシリンＧアシラーゼ突然変異体の選択］
ＰｅｎＧアシラーゼ突然変異体の活性を改善されたＳ／Ｈ比によって改善する、アミノ酸の位置および突然変異を見出すため、既に次の２つの突然変異体、すなわちＢ：Ｆ２４ＡおよびＢ：Ｖ１４８Ｌ（以降、対照と称される）をタンパク質レベルで有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のペニシリンＧアシラーゼをコードする遺伝子の変異性突然変異誘発により、突然変異体ライブラリーを生成した。このようにして得られた突然変異体ライブラリーに対して、対照に対して改善されたセファレキシンの生産性を示す突然変異体についての高スループットスクリーニングを実施した。ｆｕｊｉｉ法によって形成されるセファレキシンの検出のアッセイおよび方法については、材料および方法の項において記載されている。高スループットにおいては、生産性という用語は、特定の期間内に一定量の無細胞抽出物（ＣＶＥ）によって合成されるセファレキシンの量を示す。全部で約７０００のクローンを試験した。
【００７０】
次いで、目的の突然変異体および対照のペニシリンアシラーゼを発現する組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、上記のように成長させた。同様のＯＤ６００ｎｍ値を有する振とうフラスコを取り、培養物を遠心分離し、−２０℃に凍結させた。無細胞抽出物を調製するため、ペレットを、０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅおよび２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する抽出緩衝液０．０５Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ＝６．９）に再懸濁し、インキュベートした。３０分後、抽出物を遠心分離し、アシラーゼ活性を有する上清を、セファレキシン合成試験に使用した。２時間後、変換を停止させ、形成されたセファレキシンの量を、材料および方法に記載のように測定し、４９０ｎｍでのＯＤとして表した。
【００７１】
対照に対して改善されたセファレキシンの生成についてのスクリーニングによって変異体ライブラリーから選択した突然変異体を、表３：Ｓ／Ｈにまとめる。突然変異体１〜４は、より高い活性を有する。
【００７２】
【表５】
【００７３】
［実施例２］
［アンピシリンの合成において改善されたアンピシリン／６−ＡＰＡを有するペニシリンＧアシラーゼ突然変異体の選択］
上記の突然変異体ライブラリーからの約６０００のクローンを、アンピシリンの合成について試験した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）クローンを成長させた後、無細胞抽出物を上記のように調製した。次いで、２０μＬの無細胞抽出物を、１２ｍＭ ＰＧＭ、４ｍＭ ６−ＡＰＡおよび１０ｍＭアンピシリンを含有する８０μＬの０．０５Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝６．９）に移す。ＰＧＭを、遊離塩基として調製する。すべての溶液を、毎日新しく調製する。反応は、室温で行い、ＰＭＳＦで停止させる。次いで、試料をＵＰＬＣクロマトグラフィーによって分析する。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨフェニル、５０×２．１ｍｍ、粒子サイズ１．７μｍ
溶媒Ａ：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．８
溶媒Ｂ：６０％アセトニトリル＋４０％ミリＱ水
弱洗浄（Ｗｅａｋ ｗａｓｈ）：５％アセトニトリル＋９５％ミリＱ水
強洗浄（Ｓｔｒｏｎｇ ｗａｓｈ）：９５％アセトニトリル＋５％ミリＱ水
【００７４】
【表６】
【００７５】
溶出化合物の同定および定量を、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ ２０００ＬＣ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用する質量分析およびＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）検出器を使用する１９０〜４００ｎｍの範囲内でのＵＶ測定によって行った。適切な標準を用いて較正を行った。
【００７６】
クローンを、アンピシリン／６ＡＰＡ比によってランク付けした。対照より高い比を示すクローンを、数回再試験した。最終的に、アンピシリン／６−ＡＰＡ比において、対照に対して一貫した改善を示す２つのクローンを配列決定した。２つの突然変異体における典型的結果を表４に示す。クローンの配列を表３に示す。
【００７７】
【表７】
【００７８】
突然変異体５〜６および８〜１２を、突然変異を組み合わせることによって得て、変異性ライブラリーのスクリーニングにおいて同定した。これらの突然変異体を試験した結果については、以下の実施例において記述されることになる。
【００７９】
［実施例３］
［改善されたセファレキシンの生産性について選択されるペニシリンＧアシラーゼ突然変異体のセファレキシン・エン・セフラジンの合成活性］
実施例１の選択された突然変異体である突然変異体１〜突然変異体４の活性（表３）は、同様の生成宿主の成長時に、ほぼ同様のペニシリンＧアシラーゼの発現が得られる（同様のＯＤ４９０ｎｍ〜細胞密度）という仮説に基づく。突然変異体の発現レベルにおける任意の差異について訂正するため、無細胞抽出物中のペニシリンアシラーゼの濃度を、材料および方法において記載されるＰＭＳＦ滴定を用いて測定した。ＰＭＳＦ滴定に基づき、活性ペニシリンＧアシラーゼ含量はさらに精製することなく測定可能であることから、（単位／ｍｇのアシラーゼでの）比活性は、より正確に測定できる。セファレキシンおよびセフラジンの合成における初期合成活性を測定するため、変換後、材料および方法に記載のようにＵＰＬＣを行った。結果を表５に示す。
【００８０】
【表８】
【００８１】
［実施例４］
［改善されたセファレキシンの生産性について選択されるペニシリンＧアシラーゼ突然変異体のＳ／Ｈ比］
選択される突然変異体１〜４のＳ／Ｈ比は、材料および方法に記載のように測定した。セファレキシンの合成の間、進行曲線を記録した。セファレキシンの合成およびＰＧＭの加水分解におけるＳ／Ｈ比を、これらの進行曲線から判定した。同じ突然変異体について、セフラジンの合成の間、進行曲線を記録した。セフラジンの合成およびジヒドロフェニルグリシンメチルエステルの加水分解におけるＳ／Ｈ比を判定した。結果を表６に示す。
【００８２】
【表９】
【００８３】
［実施例５］
［位置Ｂ４６０の修飾はペニシリンＧアシラーゼの合成の生産性を高めるのに重要である］
突然変異体５および１２は、突然変異体１に基づいて設計した。突然変異体５は、位置Ｂ４６０でのフェニルアラニンがロイシンによってさらに置換された対照である。突然変異体５と同様、突然変異体１２では、位置Ｂ４６０でのフェニルアラニンがロイシンによってさらに置換されているが、ここでは位置Ｂ２４でのアラニンが、多数の野生型ペニシリンＧアシラーゼにおけるこの位置で認められるように、フェニルアラニンにさらに置換された。上記のように、突然変異体５および１２をコードする遺伝子を、遺伝子合成によって得て、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に形質転換し、またそこで発現させた。発酵後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を、細胞からペニシリン−Ｇアシラーゼを放出するため、超音波処理によって処理した。遠心分離によって細胞残渣を除去後、上清中の活性タンパク質の濃度を、ＰＭＳＦ滴定によって測定した。
【００８４】
突然変異体５および１２をセファレキシンの合成に適用する一方、野生型アシラーゼ（配列番号１）、対照アシラーゼおよび突然変異体１を対照として含めた。結果を下記に示す。
【００８５】
【表１０】
【００８６】
突然変異体１、５および１２は、位置Ｂ４６０のフェニルアラニンがロイシンによって置換されているという共通点を有する。全部で３つの突然変異体においては、この修飾は、Ｓ／Ｈ比の大幅な低下を伴うことなく、合成活性を増大させる。ほとんどの場合、Ｓ／Ｈ比はさらに改善される。
【００８７】
［実施例６］
［セファレキシンおよびセフラジンの合成における様々なコンビナントの性能］
突然変異体１および７は、突然変異アシラーゼをＰＧＭ、６−ＡＰＡおよびアンピシリンの混合物に暴露する場合での、改善されたアンピシリン／６−ＡＰＡ比についてのスクリーニングから選択した。突然変異体１はまた、セファレキシンの合成における改善された生産性についてのスクリーニングから選択した。突然変異体１および突然変異体７において認められる突然変異は、異なる方法で組み合わせてもよい。突然変異体６および８〜１１は、かかる組み合わせの例である。上記のように、突然変異体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における遺伝子合成、形質転換および発現によって得てもよい。これらの突然変異体の一部の試験結果を表８に示す。
【００８８】
【表１１】
【００８９】
突然変異体１および突然変異体７の突然変異の組み合わせから得られるコンビナントは、特定の態様では、かかるハイブリッドがそれらの親の性能を超えうることを示す。
【００９０】
［実施例７］
［６−ＡＰＡおよびＨＰＧメチルエステルからのアモキシシリンの生成］
１４０μｍの孔を有する篩底および撹拌装置を装備した２Ｌのステンレス鋼製反応器を、表中に示される固定化酸素で満たした。容量を、水の添加により、１０００ｍｌに調節した。内容物を１０℃に冷却し、反応器内容物を、蠕動ポンプにより、篩底上で循環させた。
【００９１】
１６２．２ｇの６−アミノペニシラン酸を添加後、ＨＰＧＭを添加した（表を参照）。容量を、水の添加により、１５００ｍｌに調節した。混合物を、篩底上で撹拌し、循環させた。温度を１０℃に維持した。ｐＨを監視した。ｐＨは、最初は約６．３であり、しばらく経過後、約７に増加させ、その後減少させた。ｐＨが６．３未満の時点で、反応はほぼ完了する。その時点で（ＨＰＧＭの添加から約２時間後）、試料を、再循環ラインから採取し、濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。様々な実験の結果を表９に示す。
【００９２】
突然変異体１およびＨＰＧＭの１．０６等価物（表中の変換１０）との反応混合物に、さらなるプロセシングを施す。反応混合物を、固定化（ｉｍｍｏｂ）酵素が篩をほぼ遮断する時まで、篩の下部から採取する。次いで、水をステンレス鋼製反応器内の混合物に添加すると同時に、混合物を、回収される全懸濁液が３０００ｍｌの容量を有する時まで、篩の下部から採取する。
【００９３】
変換１０を、反応器内の既存の同じ酵素を使用しながら、同量の６−ＡＰＡおよびＨＰＧＭを添加することにより、さらに３回繰り返した。これら４つの連続的変換１０の懸濁液を、結合させ、再結晶化を施す。懸濁液を２５℃に加熱し、混合物を一連の５つの撹拌容器（各々３０ｍｌ）に導入する。混合物を、重力排出（ｇｒａｖｉｔｙ ｏｖｅｒｆｌｏｗ）により、１つの撹拌容器から次の容器に移す。懸濁液の流量は、３０００ｍｌ／ｈである。同時に、３５％ＨＣｌを、第１の容器に、懸濁液中の沈殿物が一連の５つの撹拌容器内で十分に溶解する程度の速度で添加する。酸性溶液を、ラインで１０μｍのフィルタ上に濾過し、晶析装置に導入する。この晶析装置では、ｐＨは２５％ＮａＯＨの添加によってｐＨ＝３．７に維持し、温度は２０℃に維持する。容量は、第２の晶析装置への重力排出により、２２５０ｍｌに維持する。この晶析装置では、ｐＨは、２０℃で２５％ＮａＯＨの添加によってｐＨ＝５．０に維持する。第２の晶析装置内の容量は、撹拌容器への重力排出により、７５０ｍｌに維持する。この容器の内容物を３℃に冷却する。この容器内の滞留時間は、４時間である。結晶懸濁液を、濾過し、水（１．５ｌ／ｋｇ生成物）で洗浄し、一定重量になるまで、３５℃、換気式ストーブ（ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｓｔｏｖｅ）で乾燥させる。アモキシシリン三水和物の収率（添加される６−ＡＰＡに対して計算）は、９１％（モル／モル）であった。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
［実施例８］
［Ｄ−フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液の合成］
Ｄ−フェニルグリシン−メチルエステル（ＰＧＭ）溶液の合成を、本質的に国際公開第２００８／１１０５２７号パンフレット中に記載のように行った。
【００９６】
９０ｇのＰＧを１７０ｍｌのメタノール中に懸濁し、７３．２ｇの濃硫酸を添加した。混合物を、約７３℃、還流下で２時間保持し、減圧下で濃縮した（ｐ＝２０ｍｍＨｇ、Ｔ＝７５〜８０℃）。１７０ｍｌのメタノールを添加し、混合物を、再び還流下で２時間保持し、減圧下で濃縮した。再び、１７０ｍｌのメタノールを添加し、混合物を、還流下で２時間保持し、減圧下で濃縮した。最後に、１２５ｍｌのメタノールを添加した。溶液を、２０ｍｌのメタノールで予備帯電した第２の反応器に、２０℃で１時間以内に投入した。ｐＨを、アンモニアで３．５に保持した。固体が形成され、それを濾過によって除去した。得られた母液を、２５ｍｌの水で希釈し、減圧下で濃縮した（ｐ＝２０ｍｍＨｇ、Ｔ＝４０〜４５℃）。最後に、２０７．５ｇのＰＧＭ溶液を得た。
【００９７】
［実施例９］
［セファレキシンの酵素合成］
１７５μｍの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たし、それにより、固定化（ｉｍｍｏｂ）粒子のタンパク質負荷は、試験したすべてのアシラーゼと同様であった。次いで、２１．４ｇの７−ＡＤＣＡおよび９５ｇの水を２５℃で添加し、ｐＨを２５％アンモニアで７．０に調整した。実施例８において得られた３８ｇのＰＧＭ溶液を、反応器に、１２０分以内に一定速度で投入した。ｐＨをアンモニアで７．０に維持した。温度を２５℃に保持した。３０分後、０．２５ｇの固体セファレキシン（シード）を添加した。セファレキシンの結晶化が、４５分後に開始された。１２０〜１５０分の間に、ｐＨを２５％硫酸で７．０に保持した。次いで、ｐＨを２５％硫酸で５．７に低下させた。
【００９８】
反応器から、上方攪拌により、底部篩を通して放出させた。得られたセファレキシン懸濁液を、ガラスフィルターを通して濾過した。得られた母液を、再び反応器に移した。この順序での工程を５回繰り返した。次いで、酵素を１０ｍｌの水で２回洗浄した。このようにして、セファレキシンの９８％以上を固体生体触媒から分離した。
【００９９】
セファレキシンの湿潤ケーキ（ｗｅｔ ｃａｋｅ）、母液および洗浄水を結合させ、温度を２℃に維持した。結合された湿潤ケーキおよび母液のｐＨを濃硫酸で１．５に低下させ、得られた溶液を０．４５μｍのフィルタを通して濾過した。
【０１００】
結晶化反応器を、２０ｇの水および１．０ｇのセファレキシン（シード）で満たした。上記の酸性セファレキシン溶液を、結晶化反応器に、３０℃で８０分以内に投入した。ｐＨをアンモニアで５．０に保持した。次いで、懸濁液を、２０℃でさらに３０分間撹拌した。懸濁液を、ガラスフィルターを通して濾過し、湿潤ケーキを、１５ｍｌの水で２回および１５ｍｌのアセトンで２回洗浄した。
【０１０１】
【表１３】
【０１０２】
［実施例１０］
［７−ＡＤＣＡおよびＨＰＧメチルエステルからのセファドロキシルの生産］
１７５μｍの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たした。次いで、１７．７ｇの７−ＡＤＣＡ、１５．６ｇのＨＰＧＭ、０．０２ｇのＥＤＴＡおよび１２３ｇの水を１０℃で添加し、ｐＨを２５％アンモニアで７．２に調整した。酵素反応を１０℃で行い、ｐＨをギ酸で７．２に保持した。
【０１０３】
【表１４】
【０１０４】
［実施例１１］
［セフラジンの酵素合成］
１７５μｍの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たした。次いで、１４．８２ｇの７−ＡＤＣＡおよび５０ｇの水を２０℃で添加し、ｐＨを２５％アンモニアで６．９に調整した。
【０１０５】
１８．５ｇのＤＨＰＧＭ．ＭＳＡを２０ｍｌの水に溶解し、溶液を反応器に１５０分以内に一定速度で投入した。ｐＨをアンモニアで７．０に維持した。温度を２０℃に保持した。３０分後、０．２５ｇの固体セフラジン（シード）を添加した。４６０分後、ｐＨを２５％硫酸で５．７に低下させた。ＤＨＰＧの測定の不正確さが原因で、Ｓ／Ｈを十分な精度で測定することができなかった。
【０１０６】
【表１５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのアミノ酸番号付けにより、アミノ酸位置Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１０９、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、野生型ペニシリンＧアシラーゼ由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項２】
前記突然変異体が、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項１に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項３】
前記突然変異体が、位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項１に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項４】
前記突然変異体が、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換、位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項２および３に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項５】
前記突然変異体が、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ、位置Ｂ１４８に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項４に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項６】
前記野生型ペニシリンＧアシラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼおよび配列番号１に対して少なくとも３０％相同なペニシリンＧアシラーゼからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、突然変異ペニシリンＧアシラーゼを生成するための方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質を生成するための方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質を生成するための方法。
【請求項１３】
前記半合成β−ラクタム抗生物質は、半合成ペニシリンおよび半合成セファロスポリンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記半合成ペニシリンは、アモキシシリンまたはアンピシリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記半合成セファロスポリンは、セファレキシン、セファドロキシルまたはセフラジンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
活性型のＨＰＧと６−ＡＰＡとの共役を触媒する酵素の存在下でアモキシシリンを生成するための方法であって、６−ＡＰＡに対する、前記活性ＨＰＧ、好ましくはメチル−およびエチルエステルからなる群から選択されるエステルのモル比が、３．０以下、好ましくは２．５以下、より好ましくは２．０以下、およびより好ましくは１．５以下であり、かつ、前記酵素共役反応後に測定される、６−ＡＰＡを基準とするアモキシシリンの収率（モル／モル）が、９０％以上、好ましくは９１％以上、好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、好ましくは９４％以上、およびより好ましくは９５以上である、方法。
【請求項１７】
前記酵素は、５００ｍモル／ＬのＨＰＧＭおよび５３０ｍモル／Ｌの６−ＡＰＡからアモキシシリンを生成する（すなわち、変換）特性を有し、かつ、試験Ａに記載の条件下で行われる前記変換の終了時、５ｍモル／Ｌ未満の６−ＡＰＡを生成する、アシラーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
前記アシラーゼは、請求項１〜６のいずれか一項において規定されたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼのアミノ酸番号付けにより、アミノ酸位置Ａ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１４４、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１０９、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、野生型ペニシリンＧアシラーゼ由来の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項２】
前記突然変異体が、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３、Ｂ４６０およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項１に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項３】
前記突然変異体が、位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ２４、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置に１つもしくは複数のアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項１に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項４】
前記突然変異体が、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換、位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ１４８、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項２および３に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項５】
前記突然変異体が、位置Ｂ２４に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに位置Ｂ４６０に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ、位置Ｂ１４８に少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびに場合によってＡ３、Ａ７７、Ａ９０、Ａ１９２、Ｂ３１３およびＢ４８８からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項４に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項６】
前記野生型ペニシリンＧアシラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼおよび配列番号１に対して少なくとも３０％相同なペニシリンＧアシラーゼからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、突然変異ペニシリンＧアシラーゼをコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、突然変異ペニシリンＧアシラーゼを生成するための方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質を生成するための方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンＧアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質を生成するための方法。
【請求項１３】
前記半合成β−ラクタム抗生物質は、半合成ペニシリンおよび半合成セファロスポリンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記半合成ペニシリンは、アモキシシリンまたはアンピシリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記半合成セファロスポリンは、セファレキシン、セファドロキシルまたはセフラジンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
活性型のＨＰＧと６−ＡＰＡとの共役を触媒する酵素の存在下でアモキシシリンを生成するための方法であって、６−ＡＰＡに対する、前記活性ＨＰＧ、好ましくはメチル−およびエチルエステルからなる群から選択されるエステルのモル比が、３．０以下、好ましくは２．５以下、より好ましくは２．０以下、およびより好ましくは１．５以下であり、かつ、前記酵素共役反応後に測定される、６−ＡＰＡを基準とするアモキシシリンの収率（モル／モル）が、９０％以上、好ましくは９１％以上、好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、好ましくは９４％以上、およびより好ましくは９５以上である、方法。
【請求項１７】
前記酵素は、５００ｍモル／ＬのＨＰＧＭおよび５３０ｍモル／Ｌの６−ＡＰＡからアモキシシリンを生成する（すなわち、変換）特性を有し、かつ、試験Ａに記載の条件下で行われる前記変換の終了時、５ｍモル／Ｌ未満の６−ＡＰＡを生成する、アシラーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１８】
前記アシラーゼは、請求項１〜６のいずれか一項において規定されたものである、請求項１８に記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５１３１９６（Ｐ２０１２−５１３１９６Ａ）
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４１５１１（Ｐ２０１１−５４１５１１）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７７５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７２７６５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７７５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７２７６５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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