第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法
【課題】タンパク質の特定の位置に化合物を修飾する方法を提供すること。
【解決手段】本発明の第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法は、ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該調製したタンパク質とを反応させる工程を含む。好ましくは、ソルターゼは、スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡまたはラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼであり、そしてＬＰＸＴＧ配列、ＬＰＱＴＳ配列またはＬＰＱＴＡＥＱ配列を認識する。
【解決手段】本発明の第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法は、ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該調製したタンパク質とを反応させる工程を含む。好ましくは、ソルターゼは、スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡまたはラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼであり、そしてＬＰＸＴＧ配列、ＬＰＱＴＳ配列またはＬＰＱＴＡＥＱ配列を認識する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法、言い換えれば、第１級アミンを有する化合物でタンパク質を配列特異的に修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を化合物で修飾して高機能化する技術が、種々検討されている。これらの技術は、遺伝子工学による技術、有機化学反応をベースにした化学修飾技術、および酵素反応を用いた部位特異的修飾技術に大別される。
【０００３】
遺伝子工学による修飾では、遺伝子にコードされたとおりの配列を有する融合タンパク質を調製できるが、アミノ酸以外の化合物を導入したタンパク質を得ることができない。また、有機化学反応をベースにした化学修飾技術では、リジンやシステインなどの反応性の高いアミノ酸の側鎖と特異的に反応する試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド）を用いてそのアミノ酸を特異的に修飾できる。しかし、目的のタンパク質中にリジンなどのアミノ酸が複数個存在する場合、修飾されるアミノ酸の位置の制御ができず、複数のアミノ酸のうちで修飾されるアミノ酸の数の制御や確認も非常に難しい。そのため、生成物が混合物になるという問題点がある。
【０００４】
酵素の基質特異性を利用して、特定の配列に特異的に目的物質を修飾することができる。そのような酵素として、トランスグルタミナーゼが知られている。この酵素は、タンパク質のグルタミン残基とリジン残基の側鎖とを、あるいはグルタミン残基の側鎖と第１級アミンとを特異的にペプチド結合する酵素である。この酵素を用いて、タンパク質にアミンを有する化合物を修飾した例がある（非特許文献１〜３）。しかし、このトランスグルタミナーゼが認識するアミノ酸配列は未解明のままであるため、部位特異的にタンパク質を修飾できるとはいえない。
【０００５】
トランスグルタミナーゼのように特定のアミノ酸残基に対して結合を形成する能力を有する酵素として、ソルターゼがある。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡは非常によく研究されている。この酵素は、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）を認識してトレオニン残基とグリシン残基との間を切断し、そこへＮ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ配列を有する別のタンパク質（あるいはペプチド）をペプチド結合で結合させる反応を触媒する（非特許文献４および５）。しかし、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列を有するタンパク質以外との結合については、知られていない。
【非特許文献１】Fontana, A.ら，Adv. Drug Deliv. Rev.，2008年，60巻，1号，13-28頁
【非特許文献２】Sato H.，Adv. Drug Deliv. Rev.，2002年，54巻，4号，487-504頁，Review
【非特許文献３】Sato H.ら，Bioconjug. Chem.，2000年，11巻，4号，502-509頁
【非特許文献４】Mao H.ら，J. Am. Chem. Soc.，2004年，126巻，9号，2670-2671頁
【非特許文献５】Kruqer R.G.ら，Biochemistry，2004年，43巻，6号，1541-1551頁
【非特許文献６】Bentley M.L.ら，J. Biol. Chem.，2007年，282巻，9号，6571-6581頁
【非特許文献７】Maresso A.W.ら，J. Bacteriol.，2006年，188巻，23号，8145-8152頁
【非特許文献８】Marraffini L.A.およびSchneewind O.，J. Bacteriol.，2007年，189巻，17号，6425-6436頁
【非特許文献９】Barnett T.G.ら，J. Bacteriol.，2004年，186巻，17号，5865-5875頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質の特定の部位に化合物を結合させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法を提供し、該方法は、
ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および
該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該調製したタンパク質とを反応させる工程を含む。
【０００８】
１つの実施態様では、上記ソルターゼは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）である。
【０００９】
１つの実施態様では、上記ソルターゼは、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）、配列表の配列番号２の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）または配列表の配列番号３の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、第１級アミンを有する化合物をタンパク質に配列特異的に結合させることができる。すなわち、目的タンパク質に遺伝子工学的に特定の配列を付加して得られる組換えタンパク質を発現させて精製し、その組換えタンパク質に対して第１級アミンを有する化合物およびソルターゼを加えて反応させることにより、目的のタンパク質に部位特異的に種々の化合物を修飾できる。したがって、タンパク質に対してＤＮＡやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの機能分子を修飾した薬剤の調製技術として応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字または１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、ＡｌａまたはＡ；アルギニンは、ＡｒｇまたはＲ；アスパラギンは、ＡｓｎまたはＮ；アスパラギン酸は、ＡｓｐまたはＤ；システインは、ＣｙｓまたはＣ；グルタミン酸は、ＧｌｕまたはＥ；グルタミンは、ＧｌｎまたはＱ；グリシンは、ＧｌｙまたはＧ；ヒスチジンは、ＨｉｓまたはＨ；イソロイシンは、ＩｌｅまたはＩ；ロイシンは、ＬｅｕまたはＬ；リジンは、ＬｙｓまたはＫ；メチオニンは、ＭｅｔまたはＭ；フェニルアラニンは、ＰｈｅまたはＦ；プロリンは、ＰｒｏまたはＰ；セリンは、ＳｅｒまたはＳ；トレオニンは、ＴｈｒまたはＴ；トリプトファンは、ＴｒｐまたはＷ；チロシンは、ＴｙｒまたはＹ；そしてバリンは、ＶａｌまたはＶを示す。また、任意のアミノ酸は、ＸａａまたはＸと表記する場合がある。
【００１２】
本発明の方法は、第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法であって、
ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および
該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該タンパク質とを反応させる工程を含む。
【００１３】
ソルターゼは、グラム陽性菌の細胞壁結合タンパク質の表層提示に必要な酵素として知られている。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡは、細胞壁結合タンパク質がこの菌体の表層に提示される過程で、ＬＰＸＴＧ配列（配列表の配列番号１）を特異的に切断し、生じたポリペプチド末端が細胞壁のペプチドグリカンにペプチド結合されることにより、細胞壁結合タンパク質を細胞壁に配置固定させる。
【００１４】
ソルターゼは、その由来する微生物および種類によって認識する配列や切断部位が異なる。ソルターゼＡは、一般的に、ＬＰＸＴＧ配列（配列表の配列番号１）を認識し、ＴＧ間を切断する。スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＢは、ＮＰＱＴＮを認識し、ＴＮ間を切断する（非特許文献６）。バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来のソルターゼＢは、ＮＰＫＴＧを認識し、ＴＧ間を切断し（非特許文献７）、そしてバシラス・アントラシス由来のソルターゼＣは、ＬＰＮＴＡを認識し、ＴＡ間を切断する（非特許文献８）。また、ストレプトコッカス・パイロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＣは、ＱＶＰＴＧＶを認識する（非特許文献９）。
【００１５】
本発明の方法において用いられるソルターゼは、タンパク質中の特定の配列を認識して、その配列中の特定のアミノ酸残基間を切断し、その切断部位に別のタンパク質（またはペプチド）をペプチド結合で結合させる反応を触媒すれば、その由来や種類は特定されない。例えば、上記のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡ、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼなどが用いられる。このようなソルターゼは、遺伝子配列が公知であれば、その配列を取得して、当業者が通常用いる手段によって、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual，第２版，Sambrook, J.ら編，1989年に記載の操作に従って得られ得る。例えば、この遺伝子配列を含む適切なベクターを調製し、このベクターで適切な細胞（例えば、大腸菌）を形質転換して、得られた形質転換体を適切な培地中で培養することにより、組換えタンパク質として発現させることによって得ることができる。ソルターゼは、粗精製酵素または精製酵素であってもよい。あるいは、分泌発現させた場合は、培養上清を酵素として用いてもよい。
【００１６】
本発明で用いられ得るスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡは、ＬＰＸＴＧ配列（配列表の配列番号１）を認識し、この配列のＴＧ間を切断し、次いでＮ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ配列を有する別のタンパク質（あるいはペプチド）を基質とし、生じたポリペプチド末端にペプチド結合で結合させる。本発明は、この酵素が、細胞壁のペプチドグリカンやＮ末端ＧＧ配列を有するタンパク質以外に、第１級アミンを有する化合物も基質とし得ることを新たに見出したことに基づく。
【００１７】
本発明で用いられ得るラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼは、遺伝子配列（配列表の配列番号４）が公知であったが、発現させたタンパク質（配列表の配列番号５）がソルターゼとして機能することが、本発明により初めて明らかにされた酵素である。この酵素は、ＬＰＸＴＧ（配列表の配列番号１）、ＬＰＱＴＳ（配列表の配列番号２）またはＬＰＱＴＡＥＱ（配列表の配列番号３）を認識し、この配列のＴＧ間、ＴＳ間またはＴＡ間を切断し、そして生じたポリペプチド末端に第１級アミンを有する化合物を結合させ得る。
【００１８】
本発明の方法では、まず、ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する。この工程において、ソルターゼにより特異的に認識される配列は、ソルターゼに応じて異なる。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡを用いる場合は、ＬＰＸＴＧ（配列表の配列番号１）であり、ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用いる場合は、ＬＰＸＴＧ（配列表の配列番号１）、ＬＰＱＴＳ（配列表の配列番号２）またはＬＰＱＴＡＥＱ（配列表の配列番号３）である。
【００１９】
第１級アミンを有する化合物を結合させることを意図する目的のタンパク質は、特に限定されず、例えば、酵素などの任意のタンパク質であり得る。また、タンパク質中の特定の部位も、特に限定されず、目的に応じてＮ末端やＣ末端またはタンパク質配列内部の任意の部位が選択される。特定の部位は、必要に応じて複数であってもよい。上記のような特異的に認識される配列は、タンパク質の特定の部位に遺伝子工学的に付加され得、目的のタンパク質の組換えタンパク質として調製され得る。このような組換えタンパク質の調製は、当業者が通常用いる手段によって、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual，第２版，Sambrook, J.ら編，1989年に記載の操作に従って行われ得る。例えば、目的のタンパク質をコードする遺伝子配列を取得し、この遺伝子配列に任意の位置に特異的に認識される配列をコードするＤＮＡ配列を挿入した遺伝子配列を含む適切なベクターを調製し、次いでこのベクターで適切な細胞を形質転換して、得られた形質転換体を適切な培地中で培養することにより、組換えタンパク質として発現させて精製する。
【００２０】
次いで、ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と上記のように調製したタンパク質とを反応させる。
【００２１】
第１級アミンを有する化合物は、特に限定されない。例えば、薬物、試薬、ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、アミノ酸などが挙げられる。
【００２２】
ソルターゼの存在下での反応の条件は、用いられるソルターゼに応じて、ソルターゼの活性が十分に発揮され得るように適切に設定される。代表的には、反応液中には、特異的に認識される配列を有するタンパク質に対して、１〜１００倍量の第１級アミンを有する化合物が含まれる。反応液のｐＨは、約６〜８、好ましくは約７であり、反応温度は通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。反応時間は、通常１〜７２時間、好ましくは６〜３６時間である。反応は、好ましくは振とうしながら行われる。
【００２３】
反応により得られた修飾されたタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの当該技術分野で通常用いられるタンパク質精製法により、精製することができる。
【実施例】
【００２４】
（実施例１：ソルターゼにより認識される配列を有する緑色蛍光タンパク質の調製−１）
モデルタンパク質として、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を選択した。まず、T. Tanakaら，FEBS Lett.，2005年，579巻，10号，2092-2096頁に記載の方法により、pBAD-DHFRベクターを調製した。具体的には、大腸菌XL1-Blue（Stratagene）を鋳型とし、配列番号６および７のプライマーを用いて、ＰＣＲ酵素pyrobest DNAポリメラーゼ（TAKARA社）を用いてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を増幅した。得られた断片をpBAD/thio-TOPOベクター（Invitrogen社製）にライゲーションし、pBAD-DHFRを得た。
【００２５】
次に、プラスミドｐＥＧＦＰ（クロンテック社）を鋳型として、配列番号８および９のプライマーを用い、ＰＣＲ酵素pyrobest DNAポリメラーゼ（TAKARA社）を用いてＥＧＦＰを増幅した。この断片をＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断し、同様に切断した上記pBAD-DHFRにライゲーションし、pBAD-EGFPを得た。
【００２６】
次いで、pBAD-EGFPをテンプレートとし、配列番号１０および１１のプライマーを用い、QuikChange Site-directed mutagenesisキット（Stratagene社）を用いて、ＥＧＦＰのＣ末端にＬＰＫＴＧＤＤ配列（配列番号１２）を有するベクター調製した。このベクターを大腸菌ＴＯＰ１０（Invitrogen社）に形質転換し、ＬＢ培地中で３７℃にて、ＯＤ６００＝０．８になるまで培養した。その後、最終濃度０．１％(w/v)となるようにＬ−アラビノースを加えて２７℃にて一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON Metal Affinity resin（クロンテック社）にマニュアルに従ってタンパク質を調製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して透析して、Ｃ末端にＬＰＫＴＧＤＤ配列（配列番号１２）を付加した組換えＥＧＦＰ（Ｉ）を得た。
【００２７】
また、配列番号１０および１１のプライマーの代わりに、配列番号１３および１４のプライマーを用いて、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰのＣ末端にＬＰＱＴＳＥＱ配列（配列番号１５）を付加した組換えＥＧＦＰ（ＩＩ）を調製した。
【００２８】
（参考例１：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの調製）
スタフィロコッカス・アウレウスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：１０８３２Ｄ）を鋳型にし、配列番号１６および１７のプライマーを用いて、ソルターゼＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（非特許文献４参照）を増幅した。得られた断片を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断し、pET-30b(+)（Novagen社）にライゲーションして、pET30b-SrtAを得た。このベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Novagen社）に形質転換し、ＬＢ培地中で３７℃にてＯＤ６００＝０．８になるまで培養した。さらにＩＰＴＧを０．３ｍＭとなるように加えて、２７℃にて一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON Metal Affinity resin（クロンテック社）にマニュアルに従ってタンパク質を調製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８に対して透析して、ソルターゼＡを得た。なお、ソルターゼＡの濃度については、BCA protein assayキット（PIERCE社製）を用い、そのマニュアルに従って決定した。
【００２９】
（実施例２：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによるＥＧＦＰの修飾−１）
第１級アミンを有する化合物として、以下の構造を有するビオチン−ＰＥＯ２−アミン（PIERCE社製）を用いた。
【００３０】
【化１】
【００３１】
緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７）中に、上記参考例１で調製したソルターゼＡが５μＭ、上記実施例１で調製した組換えＥＧＦＰ（Ｉ）または（ＩＩ）が５μＭ、およびビオチン−ＰＥＯ２−アミンが５０μＭの最終濃度となるように加えた。この反応液を、３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション終了後、上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを行い、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Promega社製）を用いてタンパク質が修飾されたかどうかを確認した。なお、対照として、ソルターゼＡを含まずに、組換えＥＧＦＰとビオチン−アミンとを反応させた系を設けた。結果を図１に示す。
【００３２】
図１の左に示すように、ソルターゼＡで処理した場合、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）を有するＥＧＦＰ（Ｉ）にのみバンドが確認された。一方、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）を有さないＥＧＦＰ（ＩＩ）では、ソルターゼＡを用いてもバンドを確認できなかった（図１右）。このことから、ソルターゼＡは、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）のみを認識してビオチンを修飾することができるが、ＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）を認識できないことがわかった。
【００３３】
（実施例３：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによるＥＧＦＰの修飾−２）
第１級アミンを有する化合物として、以下の構造を有する５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（PIERCE社製）を用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。
【００３４】
【化２】
【００３５】
実施例２の場合と同様に、ソルターゼＡでの処理により、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）を有するＥＧＦＰ（Ｉ）にのみバンドが確認され、ＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）を有するＥＧＦＰ（ＩＩ）では、バンドを確認できなかった。
【００３６】
（実施例４：ソルターゼにより認識される配列を有するＺＺドメインの調製）
モデルタンパク質として、スタフィロコッカス・アウレウス由来のプロテインＡのＺＺドメインを選択した。まず、スタフィロコッカス・アウレウス由来のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：１０８３２Ｄ）を鋳型にし、配列番号１９および２０のプライマーを用いて、プロテインＡのＺＺドメインのＯＲＦを増幅した。得られた断片を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断してpBAD-EGFPにライゲーションし、Ｃ末端にＬＰＥＴＧＧ配列（配列番号２１）を付加した組換えＺＺドメインを有するベクターを得た。このベクターを大腸菌ＴＯＰ１０（Invitrogen社）に形質転換し、ＬＢ培地中で３７℃にて、ＯＤ６００＝０．８になるまで培養した。その後、最終濃度０．１％(w/v)となるようにＬ−アラビノースを加えて２７℃にて一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON Metal Affinity resin（クロンテック社）にマニュアルに従ってタンパク質を調製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８に対して透析して、Ｃ末端にＬＰＥＴＧＧ配列（配列番号２１）を付加した組換えＺＺドメインを精製した。
【００３７】
（実施例５：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによるＺＺドメインの修飾）
組換えＥＧＦＰの代わりに、上記実施例４で調製した組換えＺＺドメインを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。実施例２の場合と同様に、ソルターゼＡでの処理により、ＬＰＥＴＧ配列（配列番号２２）を有するＺＺドメインにおいてバンドを確認することができた。
【００３８】
（参考例２：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼの調製）
新規酵素として乳酸菌ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株（ＷＣＦＳ１とも呼ばれる）由来のソルターゼをクローニングし、大腸菌で発現させて精製した。
【００３９】
まず、現段階でラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株について、ソルターゼと予測される遺伝子配列を、http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Sortase/から、genome：Lactobacillus plantarum WCFS1を選択し、Sortases/Substrates?で検索実行することにより、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=28376974&from=460295&to=460999&view=gbwithpartsから得た（配列番号４）。この配列をもとに、プライマー（配列番号２３および２４）を設計し、ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株（ＮＣＩＭＢより購入）を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、および７２℃（１分）を３０サイクル繰り返した。得られた断片を増幅後、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断して上記のpBAD-EGFPにライゲーションした。このベクターで大腸菌ＴＯＰ１０（Invitrogen社）を形質転換し、３００ｍＬのＬＢ培地中で３７℃にてＯＤ＝０．８になるまで培養した。次いで、最終濃度０．１％(w/v)になるようにＬ−アラビノースを加えて２６℃で一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON metal affinity resin（クロンテック社）のマニュアルに従ってタンパク質を調製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８の緩衝液に対して透析し、目的のソルターゼを得た。このソルターゼは、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する新規な酵素である。
【００４０】
（実施例６：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＥＧＦＰの修飾−１）
スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの代わりに、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。結果を図２に示す。
【００４１】
図２から明らかなように、この新規な酵素を用いたところ、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）およびＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）のいずれの配列を有するＥＧＦＰにも、ビオチンを付加することができた。したがって、この新規な酵素は、上記のスタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡでは認識できないＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）も認識して、第１級アミンを有する化合物を該配列を有するタンパク質に結合できることがわかった。
【００４２】
（実施例７：ソルターゼにより認識される配列を有する緑色蛍光タンパク質の調製−２）
上記実施例１に記載の手順に従って、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰのＣ末端にＬＰＱＴＡＥＱ（配列番号３）、ＬＰＱＴＴＥＱ（配列番号２５）、ＬＰＱＴＶＥＱ（配列番号２６）、ＬＰＱＴＥＱ（配列番号２７）、ＬＰＱＥＱ（配列番号２８）、ＬＷＡＴＧＥＱ（配列番号２９）、およびＬＷＡＴＳＥＱ（配列番号３０）をそれぞれ付加するように設計されたプライマーを用いて、これらの配列がそれぞれ付加された組換えＥＧＦＰを調製した。
【００４３】
（実施例８：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＥＧＦＰの修飾−２）
スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの代わりに、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用い、第１級アミンを有する化合物として上記実施例３で用いた５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンを用い、そして組換えＥＧＦＰとして上記実施例７で調製した種々の組換えＥＧＦＰを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。
【００４４】
ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼは配列ＬＰＱＴＡＥＱ（配列番号３）を認識できることがわかった（図３）。一方、ＬＰＱＴＴＥＱ（配列番号２５）、ＬＰＱＴＶＥＱ（配列番号２６）、ＬＰＱＴＥＱ（配列番号２７）、ＬＰＱＥＱ（配列番号２８）、ＬＷＡＴＧＥＱ（配列番号２９）、およびＬＷＡＴＳＥＱ（配列番号３０）は認識されないこともわかった。なお、これらの配列はいずれも、スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡでは認識できない配列であることも確認した。
【００４５】
（実施例９：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＺＺドメインの修飾）
スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの代わりに、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用い、第１級アミンを有する化合物として上記実施例３で用いた５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンを用い、そして組換えＥＧＦＰの代わりに上記実施例４で調製した組換えＺＺドメインを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。実施例２の場合と同様に、ソルターゼでの処理により、ＬＰＥＴＧ配列（配列番号２２）を有するＺＺドメインにおいてバンドを確認できた（図４）。
【００４６】
（実施例１０：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＥＧＦＰ修飾−３）
緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７）中に、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼが５μＭ、上記実施例１で調製したＣ末端にＬＰＱＴＳＥＱ（配列番号１５）を有する組換えＥＧＦＰが１μＭ、およびＮＨ２−ＤＮＡ−ビオチン（Invitrogen社）が１００μＭの最終濃度となるように加えた。なお、ＮＨ２−ＤＮＡ−ビオチンのＤＮＡ部分は、配列番号３１に記載の塩基配列を有する。この反応液を、３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション終了後、上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを行い、抗ＥＧＦＰ抗体（MBL社製）を用いてタンパク質が修飾されたかどうかを確認した。結果を図５に示す。
【００４７】
図５から明らかなように、ソルターゼでの処理により、ＬＰＱＴＳＥＱ（配列番号１５）を有する組換えＥＧＦＰにＮＨ２−ＤＮＡ−ビオチンが結合したバンドを確認できた（レーン４）。また、抗ＥＧＦＰ抗体（MBL社製）の代わりに、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Invitrogen社製）（図６：レーン４）またはストレプトアビジン−ＡＰ（Promega社製）を用いて検出できることも確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、第１級アミンを有する化合物をタンパク質に配列特異的に結合させることができる。すなわち、目的タンパク質に遺伝子工学的に特定の配列を付加して得られる組換えタンパク質を発現させて精製し、その組換えタンパク質に対して第１級アミンを有する化合物およびソルターゼを加えて反応させることにより、目的のタンパク質に部位特異的に種々の化合物を修飾できる。したがって、タンパク質に対してＤＮＡやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの機能分子を修飾した薬剤の調製技術として応用できる。また、第１級アミンを有する基板上にタンパク質を部位特異的に固定化したプロテインチップまたはアレイの調製技術としても応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによる組換えＥＧＦＰ（Ｉ）および（ＩＩ）のビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図２】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＥＧＦＰ（Ｉ）および（ＩＩ）のビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図３】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる、Ｃ末端にＬＰＱＴＡＥＱ（配列番号３）を有する組換えＥＧＦＰのビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図４】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＺＺドメインのビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図５】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＥＧＦＰのＤＮＡ−ビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である（抗ＥＧＦＰ抗体による検出）。
【図６】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＥＧＦＰのＤＮＡ−ビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である（ストレプトアビジン−ＨＲＰによる検出）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法、言い換えれば、第１級アミンを有する化合物でタンパク質を配列特異的に修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を化合物で修飾して高機能化する技術が、種々検討されている。これらの技術は、遺伝子工学による技術、有機化学反応をベースにした化学修飾技術、および酵素反応を用いた部位特異的修飾技術に大別される。
【０００３】
遺伝子工学による修飾では、遺伝子にコードされたとおりの配列を有する融合タンパク質を調製できるが、アミノ酸以外の化合物を導入したタンパク質を得ることができない。また、有機化学反応をベースにした化学修飾技術では、リジンやシステインなどの反応性の高いアミノ酸の側鎖と特異的に反応する試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド）を用いてそのアミノ酸を特異的に修飾できる。しかし、目的のタンパク質中にリジンなどのアミノ酸が複数個存在する場合、修飾されるアミノ酸の位置の制御ができず、複数のアミノ酸のうちで修飾されるアミノ酸の数の制御や確認も非常に難しい。そのため、生成物が混合物になるという問題点がある。
【０００４】
酵素の基質特異性を利用して、特定の配列に特異的に目的物質を修飾することができる。そのような酵素として、トランスグルタミナーゼが知られている。この酵素は、タンパク質のグルタミン残基とリジン残基の側鎖とを、あるいはグルタミン残基の側鎖と第１級アミンとを特異的にペプチド結合する酵素である。この酵素を用いて、タンパク質にアミンを有する化合物を修飾した例がある（非特許文献１〜３）。しかし、このトランスグルタミナーゼが認識するアミノ酸配列は未解明のままであるため、部位特異的にタンパク質を修飾できるとはいえない。
【０００５】
トランスグルタミナーゼのように特定のアミノ酸残基に対して結合を形成する能力を有する酵素として、ソルターゼがある。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡは非常によく研究されている。この酵素は、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）を認識してトレオニン残基とグリシン残基との間を切断し、そこへＮ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ配列を有する別のタンパク質（あるいはペプチド）をペプチド結合で結合させる反応を触媒する（非特許文献４および５）。しかし、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列を有するタンパク質以外との結合については、知られていない。
【非特許文献１】Fontana, A.ら，Adv. Drug Deliv. Rev.，2008年，60巻，1号，13-28頁
【非特許文献２】Sato H.，Adv. Drug Deliv. Rev.，2002年，54巻，4号，487-504頁，Review
【非特許文献３】Sato H.ら，Bioconjug. Chem.，2000年，11巻，4号，502-509頁
【非特許文献４】Mao H.ら，J. Am. Chem. Soc.，2004年，126巻，9号，2670-2671頁
【非特許文献５】Kruqer R.G.ら，Biochemistry，2004年，43巻，6号，1541-1551頁
【非特許文献６】Bentley M.L.ら，J. Biol. Chem.，2007年，282巻，9号，6571-6581頁
【非特許文献７】Maresso A.W.ら，J. Bacteriol.，2006年，188巻，23号，8145-8152頁
【非特許文献８】Marraffini L.A.およびSchneewind O.，J. Bacteriol.，2007年，189巻，17号，6425-6436頁
【非特許文献９】Barnett T.G.ら，J. Bacteriol.，2004年，186巻，17号，5865-5875頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質の特定の部位に化合物を結合させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法を提供し、該方法は、
ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および
該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該調製したタンパク質とを反応させる工程を含む。
【０００８】
１つの実施態様では、上記ソルターゼは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）である。
【０００９】
１つの実施態様では、上記ソルターゼは、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）、配列表の配列番号２の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）または配列表の配列番号３の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、第１級アミンを有する化合物をタンパク質に配列特異的に結合させることができる。すなわち、目的タンパク質に遺伝子工学的に特定の配列を付加して得られる組換えタンパク質を発現させて精製し、その組換えタンパク質に対して第１級アミンを有する化合物およびソルターゼを加えて反応させることにより、目的のタンパク質に部位特異的に種々の化合物を修飾できる。したがって、タンパク質に対してＤＮＡやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの機能分子を修飾した薬剤の調製技術として応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字または１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、ＡｌａまたはＡ；アルギニンは、ＡｒｇまたはＲ；アスパラギンは、ＡｓｎまたはＮ；アスパラギン酸は、ＡｓｐまたはＤ；システインは、ＣｙｓまたはＣ；グルタミン酸は、ＧｌｕまたはＥ；グルタミンは、ＧｌｎまたはＱ；グリシンは、ＧｌｙまたはＧ；ヒスチジンは、ＨｉｓまたはＨ；イソロイシンは、ＩｌｅまたはＩ；ロイシンは、ＬｅｕまたはＬ；リジンは、ＬｙｓまたはＫ；メチオニンは、ＭｅｔまたはＭ；フェニルアラニンは、ＰｈｅまたはＦ；プロリンは、ＰｒｏまたはＰ；セリンは、ＳｅｒまたはＳ；トレオニンは、ＴｈｒまたはＴ；トリプトファンは、ＴｒｐまたはＷ；チロシンは、ＴｙｒまたはＹ；そしてバリンは、ＶａｌまたはＶを示す。また、任意のアミノ酸は、ＸａａまたはＸと表記する場合がある。
【００１２】
本発明の方法は、第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法であって、
ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および
該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該タンパク質とを反応させる工程を含む。
【００１３】
ソルターゼは、グラム陽性菌の細胞壁結合タンパク質の表層提示に必要な酵素として知られている。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡは、細胞壁結合タンパク質がこの菌体の表層に提示される過程で、ＬＰＸＴＧ配列（配列表の配列番号１）を特異的に切断し、生じたポリペプチド末端が細胞壁のペプチドグリカンにペプチド結合されることにより、細胞壁結合タンパク質を細胞壁に配置固定させる。
【００１４】
ソルターゼは、その由来する微生物および種類によって認識する配列や切断部位が異なる。ソルターゼＡは、一般的に、ＬＰＸＴＧ配列（配列表の配列番号１）を認識し、ＴＧ間を切断する。スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＢは、ＮＰＱＴＮを認識し、ＴＮ間を切断する（非特許文献６）。バシラス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来のソルターゼＢは、ＮＰＫＴＧを認識し、ＴＧ間を切断し（非特許文献７）、そしてバシラス・アントラシス由来のソルターゼＣは、ＬＰＮＴＡを認識し、ＴＡ間を切断する（非特許文献８）。また、ストレプトコッカス・パイロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＣは、ＱＶＰＴＧＶを認識する（非特許文献９）。
【００１５】
本発明の方法において用いられるソルターゼは、タンパク質中の特定の配列を認識して、その配列中の特定のアミノ酸残基間を切断し、その切断部位に別のタンパク質（またはペプチド）をペプチド結合で結合させる反応を触媒すれば、その由来や種類は特定されない。例えば、上記のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡ、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼなどが用いられる。このようなソルターゼは、遺伝子配列が公知であれば、その配列を取得して、当業者が通常用いる手段によって、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual，第２版，Sambrook, J.ら編，1989年に記載の操作に従って得られ得る。例えば、この遺伝子配列を含む適切なベクターを調製し、このベクターで適切な細胞（例えば、大腸菌）を形質転換して、得られた形質転換体を適切な培地中で培養することにより、組換えタンパク質として発現させることによって得ることができる。ソルターゼは、粗精製酵素または精製酵素であってもよい。あるいは、分泌発現させた場合は、培養上清を酵素として用いてもよい。
【００１６】
本発明で用いられ得るスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡは、ＬＰＸＴＧ配列（配列表の配列番号１）を認識し、この配列のＴＧ間を切断し、次いでＮ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ配列を有する別のタンパク質（あるいはペプチド）を基質とし、生じたポリペプチド末端にペプチド結合で結合させる。本発明は、この酵素が、細胞壁のペプチドグリカンやＮ末端ＧＧ配列を有するタンパク質以外に、第１級アミンを有する化合物も基質とし得ることを新たに見出したことに基づく。
【００１７】
本発明で用いられ得るラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼは、遺伝子配列（配列表の配列番号４）が公知であったが、発現させたタンパク質（配列表の配列番号５）がソルターゼとして機能することが、本発明により初めて明らかにされた酵素である。この酵素は、ＬＰＸＴＧ（配列表の配列番号１）、ＬＰＱＴＳ（配列表の配列番号２）またはＬＰＱＴＡＥＱ（配列表の配列番号３）を認識し、この配列のＴＧ間、ＴＳ間またはＴＡ間を切断し、そして生じたポリペプチド末端に第１級アミンを有する化合物を結合させ得る。
【００１８】
本発明の方法では、まず、ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する。この工程において、ソルターゼにより特異的に認識される配列は、ソルターゼに応じて異なる。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡを用いる場合は、ＬＰＸＴＧ（配列表の配列番号１）であり、ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用いる場合は、ＬＰＸＴＧ（配列表の配列番号１）、ＬＰＱＴＳ（配列表の配列番号２）またはＬＰＱＴＡＥＱ（配列表の配列番号３）である。
【００１９】
第１級アミンを有する化合物を結合させることを意図する目的のタンパク質は、特に限定されず、例えば、酵素などの任意のタンパク質であり得る。また、タンパク質中の特定の部位も、特に限定されず、目的に応じてＮ末端やＣ末端またはタンパク質配列内部の任意の部位が選択される。特定の部位は、必要に応じて複数であってもよい。上記のような特異的に認識される配列は、タンパク質の特定の部位に遺伝子工学的に付加され得、目的のタンパク質の組換えタンパク質として調製され得る。このような組換えタンパク質の調製は、当業者が通常用いる手段によって、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual，第２版，Sambrook, J.ら編，1989年に記載の操作に従って行われ得る。例えば、目的のタンパク質をコードする遺伝子配列を取得し、この遺伝子配列に任意の位置に特異的に認識される配列をコードするＤＮＡ配列を挿入した遺伝子配列を含む適切なベクターを調製し、次いでこのベクターで適切な細胞を形質転換して、得られた形質転換体を適切な培地中で培養することにより、組換えタンパク質として発現させて精製する。
【００２０】
次いで、ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と上記のように調製したタンパク質とを反応させる。
【００２１】
第１級アミンを有する化合物は、特に限定されない。例えば、薬物、試薬、ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、アミノ酸などが挙げられる。
【００２２】
ソルターゼの存在下での反応の条件は、用いられるソルターゼに応じて、ソルターゼの活性が十分に発揮され得るように適切に設定される。代表的には、反応液中には、特異的に認識される配列を有するタンパク質に対して、１〜１００倍量の第１級アミンを有する化合物が含まれる。反応液のｐＨは、約６〜８、好ましくは約７であり、反応温度は通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。反応時間は、通常１〜７２時間、好ましくは６〜３６時間である。反応は、好ましくは振とうしながら行われる。
【００２３】
反応により得られた修飾されたタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの当該技術分野で通常用いられるタンパク質精製法により、精製することができる。
【実施例】
【００２４】
（実施例１：ソルターゼにより認識される配列を有する緑色蛍光タンパク質の調製−１）
モデルタンパク質として、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を選択した。まず、T. Tanakaら，FEBS Lett.，2005年，579巻，10号，2092-2096頁に記載の方法により、pBAD-DHFRベクターを調製した。具体的には、大腸菌XL1-Blue（Stratagene）を鋳型とし、配列番号６および７のプライマーを用いて、ＰＣＲ酵素pyrobest DNAポリメラーゼ（TAKARA社）を用いてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を増幅した。得られた断片をpBAD/thio-TOPOベクター（Invitrogen社製）にライゲーションし、pBAD-DHFRを得た。
【００２５】
次に、プラスミドｐＥＧＦＰ（クロンテック社）を鋳型として、配列番号８および９のプライマーを用い、ＰＣＲ酵素pyrobest DNAポリメラーゼ（TAKARA社）を用いてＥＧＦＰを増幅した。この断片をＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断し、同様に切断した上記pBAD-DHFRにライゲーションし、pBAD-EGFPを得た。
【００２６】
次いで、pBAD-EGFPをテンプレートとし、配列番号１０および１１のプライマーを用い、QuikChange Site-directed mutagenesisキット（Stratagene社）を用いて、ＥＧＦＰのＣ末端にＬＰＫＴＧＤＤ配列（配列番号１２）を有するベクター調製した。このベクターを大腸菌ＴＯＰ１０（Invitrogen社）に形質転換し、ＬＢ培地中で３７℃にて、ＯＤ６００＝０．８になるまで培養した。その後、最終濃度０．１％(w/v)となるようにＬ−アラビノースを加えて２７℃にて一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON Metal Affinity resin（クロンテック社）にマニュアルに従ってタンパク質を調製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して透析して、Ｃ末端にＬＰＫＴＧＤＤ配列（配列番号１２）を付加した組換えＥＧＦＰ（Ｉ）を得た。
【００２７】
また、配列番号１０および１１のプライマーの代わりに、配列番号１３および１４のプライマーを用いて、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰのＣ末端にＬＰＱＴＳＥＱ配列（配列番号１５）を付加した組換えＥＧＦＰ（ＩＩ）を調製した。
【００２８】
（参考例１：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの調製）
スタフィロコッカス・アウレウスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：１０８３２Ｄ）を鋳型にし、配列番号１６および１７のプライマーを用いて、ソルターゼＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（非特許文献４参照）を増幅した。得られた断片を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断し、pET-30b(+)（Novagen社）にライゲーションして、pET30b-SrtAを得た。このベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Novagen社）に形質転換し、ＬＢ培地中で３７℃にてＯＤ６００＝０．８になるまで培養した。さらにＩＰＴＧを０．３ｍＭとなるように加えて、２７℃にて一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON Metal Affinity resin（クロンテック社）にマニュアルに従ってタンパク質を調製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８に対して透析して、ソルターゼＡを得た。なお、ソルターゼＡの濃度については、BCA protein assayキット（PIERCE社製）を用い、そのマニュアルに従って決定した。
【００２９】
（実施例２：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによるＥＧＦＰの修飾−１）
第１級アミンを有する化合物として、以下の構造を有するビオチン−ＰＥＯ２−アミン（PIERCE社製）を用いた。
【００３０】
【化１】
【００３１】
緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７）中に、上記参考例１で調製したソルターゼＡが５μＭ、上記実施例１で調製した組換えＥＧＦＰ（Ｉ）または（ＩＩ）が５μＭ、およびビオチン−ＰＥＯ２−アミンが５０μＭの最終濃度となるように加えた。この反応液を、３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション終了後、上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを行い、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Promega社製）を用いてタンパク質が修飾されたかどうかを確認した。なお、対照として、ソルターゼＡを含まずに、組換えＥＧＦＰとビオチン−アミンとを反応させた系を設けた。結果を図１に示す。
【００３２】
図１の左に示すように、ソルターゼＡで処理した場合、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）を有するＥＧＦＰ（Ｉ）にのみバンドが確認された。一方、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）を有さないＥＧＦＰ（ＩＩ）では、ソルターゼＡを用いてもバンドを確認できなかった（図１右）。このことから、ソルターゼＡは、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）のみを認識してビオチンを修飾することができるが、ＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）を認識できないことがわかった。
【００３３】
（実施例３：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによるＥＧＦＰの修飾−２）
第１級アミンを有する化合物として、以下の構造を有する５−（ビオチンアミド）ペンチルアミン（PIERCE社製）を用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。
【００３４】
【化２】
【００３５】
実施例２の場合と同様に、ソルターゼＡでの処理により、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）を有するＥＧＦＰ（Ｉ）にのみバンドが確認され、ＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）を有するＥＧＦＰ（ＩＩ）では、バンドを確認できなかった。
【００３６】
（実施例４：ソルターゼにより認識される配列を有するＺＺドメインの調製）
モデルタンパク質として、スタフィロコッカス・アウレウス由来のプロテインＡのＺＺドメインを選択した。まず、スタフィロコッカス・アウレウス由来のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号：１０８３２Ｄ）を鋳型にし、配列番号１９および２０のプライマーを用いて、プロテインＡのＺＺドメインのＯＲＦを増幅した。得られた断片を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断してpBAD-EGFPにライゲーションし、Ｃ末端にＬＰＥＴＧＧ配列（配列番号２１）を付加した組換えＺＺドメインを有するベクターを得た。このベクターを大腸菌ＴＯＰ１０（Invitrogen社）に形質転換し、ＬＢ培地中で３７℃にて、ＯＤ６００＝０．８になるまで培養した。その後、最終濃度０．１％(w/v)となるようにＬ−アラビノースを加えて２７℃にて一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON Metal Affinity resin（クロンテック社）にマニュアルに従ってタンパク質を調製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８に対して透析して、Ｃ末端にＬＰＥＴＧＧ配列（配列番号２１）を付加した組換えＺＺドメインを精製した。
【００３７】
（実施例５：スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによるＺＺドメインの修飾）
組換えＥＧＦＰの代わりに、上記実施例４で調製した組換えＺＺドメインを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。実施例２の場合と同様に、ソルターゼＡでの処理により、ＬＰＥＴＧ配列（配列番号２２）を有するＺＺドメインにおいてバンドを確認することができた。
【００３８】
（参考例２：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼの調製）
新規酵素として乳酸菌ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株（ＷＣＦＳ１とも呼ばれる）由来のソルターゼをクローニングし、大腸菌で発現させて精製した。
【００３９】
まず、現段階でラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株について、ソルターゼと予測される遺伝子配列を、http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Sortase/から、genome：Lactobacillus plantarum WCFS1を選択し、Sortases/Substrates?で検索実行することにより、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=28376974&from=460295&to=460999&view=gbwithpartsから得た（配列番号４）。この配列をもとに、プライマー（配列番号２３および２４）を設計し、ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株（ＮＣＩＭＢより購入）を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、および７２℃（１分）を３０サイクル繰り返した。得られた断片を増幅後、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩで切断して上記のpBAD-EGFPにライゲーションした。このベクターで大腸菌ＴＯＰ１０（Invitrogen社）を形質転換し、３００ｍＬのＬＢ培地中で３７℃にてＯＤ＝０．８になるまで培養した。次いで、最終濃度０．１％(w/v)になるようにＬ−アラビノースを加えて２６℃で一晩培養してタンパク質を発現させた。得られた大腸菌からTALON metal affinity resin（クロンテック社）のマニュアルに従ってタンパク質を調製し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８の緩衝液に対して透析し、目的のソルターゼを得た。このソルターゼは、配列番号５に示すアミノ酸配列を有する新規な酵素である。
【００４０】
（実施例６：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＥＧＦＰの修飾−１）
スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの代わりに、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。結果を図２に示す。
【００４１】
図２から明らかなように、この新規な酵素を用いたところ、ＬＰＫＴＧ配列（配列番号１８）およびＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）のいずれの配列を有するＥＧＦＰにも、ビオチンを付加することができた。したがって、この新規な酵素は、上記のスタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡでは認識できないＬＰＱＴＳ配列（配列番号２）も認識して、第１級アミンを有する化合物を該配列を有するタンパク質に結合できることがわかった。
【００４２】
（実施例７：ソルターゼにより認識される配列を有する緑色蛍光タンパク質の調製−２）
上記実施例１に記載の手順に従って、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰのＣ末端にＬＰＱＴＡＥＱ（配列番号３）、ＬＰＱＴＴＥＱ（配列番号２５）、ＬＰＱＴＶＥＱ（配列番号２６）、ＬＰＱＴＥＱ（配列番号２７）、ＬＰＱＥＱ（配列番号２８）、ＬＷＡＴＧＥＱ（配列番号２９）、およびＬＷＡＴＳＥＱ（配列番号３０）をそれぞれ付加するように設計されたプライマーを用いて、これらの配列がそれぞれ付加された組換えＥＧＦＰを調製した。
【００４３】
（実施例８：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＥＧＦＰの修飾−２）
スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの代わりに、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用い、第１級アミンを有する化合物として上記実施例３で用いた５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンを用い、そして組換えＥＧＦＰとして上記実施例７で調製した種々の組換えＥＧＦＰを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。
【００４４】
ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼは配列ＬＰＱＴＡＥＱ（配列番号３）を認識できることがわかった（図３）。一方、ＬＰＱＴＴＥＱ（配列番号２５）、ＬＰＱＴＶＥＱ（配列番号２６）、ＬＰＱＴＥＱ（配列番号２７）、ＬＰＱＥＱ（配列番号２８）、ＬＷＡＴＧＥＱ（配列番号２９）、およびＬＷＡＴＳＥＱ（配列番号３０）は認識されないこともわかった。なお、これらの配列はいずれも、スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡでは認識できない配列であることも確認した。
【００４５】
（実施例９：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＺＺドメインの修飾）
スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡの代わりに、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼを用い、第１級アミンを有する化合物として上記実施例３で用いた５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンを用い、そして組換えＥＧＦＰの代わりに上記実施例４で調製した組換えＺＺドメインを用いたこと以外は、上記実施例２と同様に操作した。実施例２の場合と同様に、ソルターゼでの処理により、ＬＰＥＴＧ配列（配列番号２２）を有するＺＺドメインにおいてバンドを確認できた（図４）。
【００４６】
（実施例１０：ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによるＥＧＦＰ修飾−３）
緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７）中に、上記参考例２で調製したラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼが５μＭ、上記実施例１で調製したＣ末端にＬＰＱＴＳＥＱ（配列番号１５）を有する組換えＥＧＦＰが１μＭ、およびＮＨ２−ＤＮＡ−ビオチン（Invitrogen社）が１００μＭの最終濃度となるように加えた。なお、ＮＨ２−ＤＮＡ−ビオチンのＤＮＡ部分は、配列番号３１に記載の塩基配列を有する。この反応液を、３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベーション終了後、上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを行い、抗ＥＧＦＰ抗体（MBL社製）を用いてタンパク質が修飾されたかどうかを確認した。結果を図５に示す。
【００４７】
図５から明らかなように、ソルターゼでの処理により、ＬＰＱＴＳＥＱ（配列番号１５）を有する組換えＥＧＦＰにＮＨ２−ＤＮＡ−ビオチンが結合したバンドを確認できた（レーン４）。また、抗ＥＧＦＰ抗体（MBL社製）の代わりに、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Invitrogen社製）（図６：レーン４）またはストレプトアビジン−ＡＰ（Promega社製）を用いて検出できることも確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、第１級アミンを有する化合物をタンパク質に配列特異的に結合させることができる。すなわち、目的タンパク質に遺伝子工学的に特定の配列を付加して得られる組換えタンパク質を発現させて精製し、その組換えタンパク質に対して第１級アミンを有する化合物およびソルターゼを加えて反応させることにより、目的のタンパク質に部位特異的に種々の化合物を修飾できる。したがって、タンパク質に対してＤＮＡやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの機能分子を修飾した薬剤の調製技術として応用できる。また、第１級アミンを有する基板上にタンパク質を部位特異的に固定化したプロテインチップまたはアレイの調製技術としても応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】スタフィロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡによる組換えＥＧＦＰ（Ｉ）および（ＩＩ）のビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図２】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＥＧＦＰ（Ｉ）および（ＩＩ）のビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図３】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる、Ｃ末端にＬＰＱＴＡＥＱ（配列番号３）を有する組換えＥＧＦＰのビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図４】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＺＺドメインのビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。
【図５】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＥＧＦＰのＤＮＡ−ビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である（抗ＥＧＦＰ抗体による検出）。
【図６】ラクトバシラス・プランタラムＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼによる組換えＥＧＦＰのＤＮＡ−ビオチン修飾の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である（ストレプトアビジン−ＨＲＰによる検出）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法であって、
ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および
該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該調製したタンパク質とを反応させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ソルターゼが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ソルターゼが、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）、配列表の配列番号２の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）または配列表の配列番号３の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
第１級アミンを有する化合物をタンパク質の特定の部位に結合させる方法であって、
ソルターゼにより特異的に認識される配列を有するタンパク質を調製する工程；および
該ソルターゼの存在下で、第１級アミンを有する化合物と該調製したタンパク質とを反応させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ソルターゼが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ソルターゼが、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＮＣＩＭＢ８８２６株由来のソルターゼであり、そして前記特異的に認識される配列が、配列表の配列番号１の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）、配列表の配列番号２の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）または配列表の配列番号３の配列（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）である、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１８９３２５（Ｐ２００９−１８９３２５Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３５１５０（Ｐ２００８−３５１５０）
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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