第８因子阻害抗体と反応する細胞障害性抗体
【課題】ヒト第８因子阻害抗体を標的とする抗イディオタイプ抗体の提供。
【解決手段】ヒト第８因子のＣ２領域を標的とする前記阻害抗体であって、その各々の軽鎖可変領域が、配列番号１のマウスの核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、その各々の重鎖可変領域が、配列番号２のマウスの核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、その軽鎖定常領域及び重鎖定常領域が、非マウス種由来の定常領域である前記阻害抗体。本発明はまた、細胞障害性免疫細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体を活性化させ、並びに特に血友病Ａの治療用薬剤を製造するための、前記抗体の使用にも関する。
【解決手段】ヒト第８因子のＣ２領域を標的とする前記阻害抗体であって、その各々の軽鎖可変領域が、配列番号１のマウスの核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、その各々の重鎖可変領域が、配列番号２のマウスの核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、その軽鎖定常領域及び重鎖定常領域が、非マウス種由来の定常領域である前記阻害抗体。本発明はまた、細胞障害性免疫細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体を活性化させ、並びに特に血友病Ａの治療用薬剤を製造するための、前記抗体の使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト第８因子阻害抗体と反応する抗イディオタイプ抗体に関する。前記阻害抗体はヒト第８因子のＣ２領域を認識し、当該抗体の各軽鎖可変領域が、配列番号１のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その各重鎖可変領域が、配列番号２のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、更に軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域である。並びに本発明は、細胞障害性免疫細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体の活性化のための、及び薬剤（特に血友病Ａの治療用の薬剤）の調製のための、当該抗体の使用の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病ＡはＸ染色体の異常を原因とする遺伝性疾患であり、その患者においては、血液凝固が行われない。血友病Ａは血液凝固に悪影響を与える不全症の中で最も一般的なものであり、フランスでは５０００の１人の男性が罹患し、血友病患者の８０％を占める。この疾患は、凝固に関係するタンパク質、第８因子（ＦＶＩＩＩ）の遺伝子上の突然変異の結果であり、それにより血液中のＦＶＩＩＩの全体の欠損又は一部の欠損がもたらされる。
【０００３】
他のタイプの血友病（血友病Ｂ）は血友病患者の２０％を占め、それは他の凝固因子（第ＩＸ因子）の不足によって生じる。
【０００４】
現在の血友病（タイプＡ又はＢ）の治療方法は、静脈ルートによる不完全若しくは失活した凝固因子を投与することを含んでなる。フランスにおいては、タイプＡ血友病患者の治療を目的とするＦＶＩＩＩは、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＬＦＢ）、又は国際的な製薬研究所から供給される血液製剤の形で、あるいは遺伝子工学的に調製した組換え製剤の形で入手できる。事実、哺乳類細胞由来のＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡが単離され、発現され、更にそのアミノ酸配列がｃＤＮＡから予想されている（非特許文献１）。
【０００５】
分泌されたＦＶＩＩＩは、生体内の凝固経路の活性化において鍵となる役割を演じる３００のＫｄａの分子量（２３３２アミノ酸）を有する糖タンパク質である。不活性なＦＶＩＩＩは、６つの領域から構成される：（Ｎ末端からＣ末端に向けて）Ａ１（残基１−３７２）、Ａ２（残基３７３−７４０）、Ｂ（残基７４１−１６４８）、Ａ３（残基１６９０−２０１９）、Ｃ１（残基２０２０−２１７２）及びＣ２（残基２１７３−２３３２）。分泌の後、ＦＶＩＩＩはフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）と相互作用することにより、血漿中のプロテアーゼによる攻撃を回避する。ＦＶＩＩＩはトロンビンによる裂開の後、ｖＷＦから分離される。この裂開によりＢ領域が除去され、更にヘテロ二量体の形成がなされる。ＦＶＩＩＩはこの形態で血漿中を循環する。このヘテロ二量体は、重鎖（Ａ１、Ａ２）及び軽鎖（Ａ３、Ｃ１、Ｃ２）により構成される。
【０００６】
ＦＶＩＩＩは、血友病患者に注射された後、患者の血液中を循環するｖＷＦと結合する。活性化するＦＶＩＩＩは活性化第ＩＸ因子の補因子として機能し、活性化因子Ｘへの因子Ｘの変換を促進する。活性化因子Ｘは、プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは更にフィブリノゲンをフィブリンに変換し、凝血塊が形成される。
【０００７】
ＦＶＩＩＩの投与において生じる大きな課題は、患者体内における、ＦＶＩＩＩを認識する「阻害抗体」と呼ばれる抗体の出現である。これらの抗体はＦＶＩＩＩによる血液凝固活性を中和し、注射後直ちに不活性となる。すなわち、投与された凝固因子は、止血を行う前に破壊されてしまい、それは血友病の重い合併症を構成し、治療効果が損なわれる。更に、ある特定の非遺伝的血友病患者は、内因性ＦＶＩＩＩに対する阻害物質を生じさせる、いわゆる後天性血友病の患者である。
【０００８】
抗ＦＶＩＩＩ免疫反応がポリクローン性であり、主にＡ２及びＣ２領域に対する反応であるという研究結果が報告されている（非特許文献２）。ＦＶＩＩＩ阻害物質の形成を研究する目的でモデル動物を作製し、当該ラットを組換えヒトＦＶＩＩＩで免疫した結果、ポリクローン性の急激な免疫反応が観察された（非特許文献３）。
【０００９】
抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体がＦＶＩＩＩの機能を阻害する機構多く存在し、ＦＶＩＩＩのタンパク質分解への干渉、並びに異なるパートナー（例えばｖＷＦ、リン脂質（ＰＬ）、第ＩＸ因子、活性化因子Ｘ（ＦＸａ）又はＡＰＣ（活性化プロテインＣ））とＦＶＩＩＩとの相互作用への干渉が挙げられる。
【００１０】
この免疫反応の低減化を可能にするための幾つかの処理方法が存在する。例えば、ＦＶＩＩＩの産生を刺激する合成ホルモンであるデスモプレッシン（プロトロンビン複合体レベルの上昇、活性化プロトロンビン複合体レベルの上昇などにより凝固を促進する）又は組換え因子ＶＩＩａを投与することや、顕著量若しくは適当量のＦＶＩＩＩを血奨交換及び潅流により供給することが挙げられる。しかしながら、これらの方法は非常に高価であり、また未だ低効率に留まっている。
【００１１】
別のストラテジーとして、抗イディオタイプ抗体を投与してこれらの阻害抗体を中和するという新規な方法が提案されている（非特許文献４）。また特許文献１では、マウスの抗イディオタイプモノクローナル抗体（１４Ｃ１２）を用いて、ヒトＦＶＩＩＩの阻害抗体による阻害特性を、投与量依存的に中和する技術が開示されている。しかしながら、これらの抗体は抗体の中和機能のみを有するに留まっている。すなわちそれらは阻害抗体の分泌の上流側に対する効力を有しない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０１４９５５号
【非特許文献１】Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３３０−３３７
【非特許文献２】Ｇｉｌｌｅｓ ＪＧら、（１９９３）Ｂｌｏｏｄ、８２：２４５２−２４６１
【非特許文献３】Ｊａｒｖｉｓら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９６ Ｆｅｂ、７５（２）：３１８−２５
【非特許文献４】Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ ＪＭら、（１９９９）Ｖｏｘ Ｂｌｏｏｄ、７７（ｓｕｐｐｌ１）：２１−２４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上より、循環する阻害抗体を中和し、阻害抗体の分泌の上流側に作用し、分泌を減少させることを可能にする、新規な治療ツールに対するニーズが存在する。
【００１３】
以上より発明者らは、分泌された阻害抗体対する作用、及び、ＦＶＩＩＩの阻害抗体を分泌するプラズマ細胞の前駆体（特に記憶Ｂ細胞）の上流側に対する作用の両方を有する、血友病Ａの治療に有用が新規ツールの開発を行った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、ＦＶＩＩＩ阻害と反応する新規な細胞障害性抗イディオタイプ抗体を開発した。かかる抗体は、これらの循環する阻害抗体と結合することにより中和活性を発揮し、かつ記憶Ｂ細胞と相互作用できる。記憶Ｂ細胞はプラズマ細胞の起源であり、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）機構によって溶解することにより、これらの阻害抗体が産生される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
抗イディオタイプ抗体とは、他の抗体の可変領域と相互作用する能力を有する抗体のことを意味する。
【００１６】
本発明に係る抗イディオタイプ細胞障害性抗体は、Ａ１領域、Ａ２領域、Ｂ領域、Ａ３領域又はＣ１領域などの、ヒトＦＶＩＩＩにおけるいずれかの領域と結合する阻害抗体と反応する。本発明による好ましい抗イディオタイプ抗体は、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と結合するヒト由来の阻害抗体と反応する抗体である。
【００１７】
ＦＶＩＩＩのＣ２領域は、リン脂質（ＰＬ）結合部位、及びフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）との主要な結合部位を有する。ＰＬｓの結合はＦＶＩＩＩの生理的活性にとり重要であり、特に第ＩＸ因子（ＦＩＸ）と因子Ｘ（ＦＸ）を伴うテナーゼ複合体形成にとり重要である。ｖＷＦはシャペロンタンパク質として作用し、ＦＶＩＩＩを初期の分解及びクリアランスからの保護に関与する。ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応するＦＶＩＩＩ−阻害抗体は、阻害抗体を生合成する患者において最も頻繁に見られる阻害物質である。すなわち、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害抗体を標的とする、本発明に係る好ましい抗イディオタイプ抗体は、それらが阻害抗体を生じさせる大多数の血友病Ａ患者において有効に機能するという点で、特に有用である。
【００１８】
すなわち本発明は、ヒトＦＶＩＩＩ阻害抗体と反応する抗イディオタイプモノクローナル抗体の提供に関する。この阻害抗体はヒトＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応し、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体では、各軽鎖可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その各重鎖可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その軽鎖定常領域及びその重鎖定常領域が非マウスの種由来である。
【００１９】
好適には、配列の同一性は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の同一性である。同一性のパーセンテージは２つの配列のアラインメントを比較し、同一のヌクレオチドを有する部分の数を、この配列中のヌクレオチド総数で除算することにより算出する。同じアミノ酸がいくつかの異なる３ヌクレオチドによってコードされうるという事実により、当該遺伝暗号は縮重していてもよい。いずれにせよ、配列中のこれらの相違は、モノクローナル抗体のその標的への結合特異性に影響を及ぼさず、標的とする阻害抗体と結合することにより阻害活性を中和するその能力にも影響を及ぼさない。好適には、本発明に係る抗体の、その標的分子との親和性は、同一若しくはほぼ同一のレベルが維持される。
【００２０】
本発明では、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」などの表現は、同一及びユニークな特性を有する抗体分子の調製物のことを指す。
【００２１】
軽鎖及び重鎖の可変領域の由来が、軽鎖及び重鎖の定常領域のそれと異なる種由来である、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、「キメラ」抗体とも言える。
【００２２】
本発明に係る抗イディオタイプキメラ抗体は、標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製することもでき、かかる技術は当業者に周知であり、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，：６８５１−５５（１９８４）に記載のキメラ抗体作製技術を使用してもよい。当該技術では、組み換えＤＮＡ技術を用い、ヒト以外の哺乳類由来の抗体の重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を、ヒト免疫グロブリンの対応する領域で置換している。かかる抗体及びそれらの調製方法はまた、例えば欧州特許出願公開第１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２（５９９５）：６０４−８（１９８５）、並びに欧州特許出願公開第１２５０２３号にも記載されている。
【００２３】
マウス由来の配列番号１、配列番号２の核酸配列はそれぞれ、マウスハイブリドーマ１４Ｃ１２が産生する抗体の、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードする。それらは２００２年６月３０日以降、Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）から入手でき、登録番号ＬＭＢＰ ５８７８ＣＢとして、ＬＭＢＰ（プラスミドコレクション、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ、Ｋ．Ｌ． Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ ３５、９０００ Ｇｅｎｔ、ベルギー）に寄託されている。クローン１４Ｃ１２は、国際公開第２００４／０１４９５５号に記載されている。マウス抗体１４Ｃ１２の配列は、本発明に係る抗体の可変領域と同一の配列、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、又更に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列をコードするために選択された。すなわちマウス抗体１４Ｃ１２の可変領域の使用は、国際公開第２００４／０１４９５５号に記載されているように、多くの利点を有する。マウス抗体１４Ｃ１２の第１の有利な側面としては、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害抗体（抗体ＢＯ２Ｃ１１）と結合する能力が挙げられる。抗体ＢＯ２Ｃ１１は、阻害物質を産生する患者において、ＦＶＩＩＩと特異的に結合し、投与量依存的に、この循環する阻害抗体（ＦＶＩＩＩ）とその標的（Ｃ２領域）との結合を阻害する、天然のレパートリに由来するヒトモノクローナル抗体のことを指す（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎら、（１９９８），Ｂｌｏｏｄ ９２：４９６−５０６）。抗体ＢＯ２Ｃ１１の軽鎖及び重鎖の可変領域のヌクレオチド及びペプチド配列は、国際公開第０１／０４２６９号に記載されている。更に、マウス抗体１４Ｃ１２は、抗体ＢＯ２Ｃ１１の阻害特性を、投与量依存的に中和する能力を有する。更にマウス抗体１４Ｃ１２は、ポリクローン性のＦＶＩＩＩｓを阻害する抗体の存在により観察されるＦＶＩＩＩの活性阻害が、インヴィトロで６０％中和させることが明らかとなっている。マウス抗体１４Ｃ１２はまた、クローンＢＯ２Ｃ１１の起源の患者とは異なる患者に由来するポリクローナル抗体により観察される、ＦＶＩＩＩ阻害活性をインヴィトロで顕著に中和することが明らかとなっている。それらの結果は、マウス抗体１４Ｃ１２が、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応するヒト抗体に共通に存在するエピトープを認識することを示すものである。マウス抗体１４Ｃ１２のインビボ特性に関しては、組換えヒトＦＶＩＩＩ及び阻害抗体ＢＯ２Ｃ１１を注射したＦＶＩＩＩ−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウスでは、マウス抗体１４Ｃ１２が投与量依存的に抗体ＢＯ２Ｃ１１の阻害特性を中和することが示されている。すなわち、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害物質が産生される血友病Ａに罹患する患者の治療における、マウス抗体１４Ｃ１２の有用性を物語るものである。更にマウス抗体１４Ｃ１２は、それぞれ１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ値、及び１０−５ｓ−１のｋｏｆｆ値で、抗体ＢＯ２Ｃ１１との高い結合親和性を有する。更に、マウス抗体１４Ｃ１２の重鎖可変部には、１３アミノ酸によるＣ２領域と同一若しくは相同な内部領域、及びＢＯ２Ｃ１１の可変部との接触に供される幾つかの残基の両方が含まれることが明らかとなっている。最後に、マウス抗体１４Ｃ１２は、ｖＷＦ又はＰＬとＦＶＩＩＩとの結合を阻害しないことが証明されている。すなわち、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害抗体が産生されることを特徴とする血友病Ａに罹患する患者へのマウス抗体１４Ｃ１２の投与によって、ＦＶＩＩＩの機能に対する望ましくない阻害効果が生じない。好適には、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、抗体１４Ｃ１２の可変領域に関連する全ての有利な特性を有する。
【００２４】
本発明に係る抗体はまた、非マウスの種に属する軽鎖及び重鎖定常領域を有する。すなわち、マウスでない全ての哺乳類のファミリー及びの種のそれらを使用でき、特にヒト、サル、げっ歯類（マウスを除く）、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ並びにトリなど（これらに限定されない）が挙げられる
【００２５】
好ましくは、本発明の抗イディオタイプ抗体の各軽鎖可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列によってコードされ、その各重鎖可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列によってコードされ、その軽鎖及び重鎖定常領域は非マウス種由来の定常領域である。
【００２６】
好適には、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、抗体組成物の形で細胞において産生され、当該抗体中のＦｃ領域のグリコシル化部位に存在する、そのグリカン構造中のフコース濃度／ガラクトース濃度の比率は０．６以下であることを特徴とする。「Ｆｃ領域のグリコシル化部位」とは、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７、Ｋａｂａｔ付番号）を意味し、Ｎ−グリコシル化部位として機能する。実際、抗体のＦｃ定常領域はＣＨ２及びＣＨ３と称される２つの球状領域により構成されている。２つの重鎖はＣＨ３領域のレベルで密接に相互作用するが、ＣＨ２のレベルでは、各々２つの鎖上の領域における、Ａｓｎ２９７と結合する二アンテナ−タイプのＮ−グリカンの存在により、２つの領域に分離される。すなわち、本発明の実施態様では、抗体組成物に存在するグリコシル化部位の全てに存在するグリカン構造は、０．６以下のフコース濃度／ガラクトース濃度比率を示す。このことは、抗体が強力なＡＤＣＣ活性（「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」）における最適な条件であり、仏国特許出願第０３１２２２９号において開示されている。ゆえに本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、それらのＦｃ領域によって、細胞障害性エフェクター細胞のＦｃ受容体、及び特にＦｃγＲＩＩＩＡ受容体（ＣＤ１６とも呼ばれ、細胞障害性エフェクター細胞を活性化する受容体）、を活性化する能力が強化されている。本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体によって活性化されうるエフェクター細胞としては、例えばＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球又はマスト細胞が挙げられる。好ましくは、本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、ＮＫ細胞の補充を可能にする。すなわち本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は細胞障害性であることを特徴とし、そのＦｃ領域を介して、エフェクター細胞の補充を可能にし、本発明に係る抗イディオタイプ抗体の標的を細胞表面に有する細胞を破壊する。
【００２７】
本発明に係る抗体は、特に記憶Ｂ細胞などの、細胞表面に前記ＦＶＩＩＩ阻害抗体を発現する細胞、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を分泌するプラズマ細胞前駆体を破壊する能力を有する。
【００２８】
好ましくは、標的細胞は記憶Ｂ細胞である。
【００２９】
すなわち本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、一方では阻害抗体のイディオトープとの結合によってＦＶＩＩＩ阻害抗体の結合を阻害し、もう一方では、細胞表面に標的となる阻害抗体を発現する記憶Ｂ細胞、及び阻害抗体を分泌するプラズマ細胞の前駆体の溶解を生じさせる。これらの２つの効果により、血友病患者において産生されるＦＶＩＩＩ阻害抗体による阻害活性の低減化が可能となる。
【００３０】
好ましくは、本発明の抗イディオタイプ抗体が標的とする抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体は抗体ＢＯ２Ｃ１１である。この抗体は、阻害物質が産生される血友病Ａに罹患する患者の天然のレパートリに由来する、ＦＶＩＩＩに特異的なヒトＩｇＧ４κモノクローナル抗体である（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２：４９６−５０６）。抗体ＢＯ２Ｃ１１はＣ２領域を認識し、ＦＶＩＩＩのｖＷＦ及びリン脂質（ＰＬ）との結合を阻害する。この活性メカニズムは、ＦＶＩＩＩのＣ２領域に特異的な阻害抗体を保持する患者において最も頻繁に見られる。更に、Ｃ２領域に対する抗体ＢＯ２Ｃ１１の正確な結合部位が、Ｆａｂフラグメント及びＣ２領域のＸ線結晶構造解析により確認されている（Ｓｐｉｅｇｅｌ ＰＣら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：１３−１９）。抗体ＢＯ２Ｃ１１の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第０１／０４２６９号（２０００）に記載されている。
【００３１】
すなわち、本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、記憶Ｂ細胞ＢＯ２Ｃ１１のクローンの表面に存在する膜抗体ＢＯ２Ｃ１１（ＢＣＲ）のみならず、循環する抗体ＢＯ２Ｃ１１をも認識する。ゆえに本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、一方では循環抗体との結合によって、もう一方では膜免疫グロブリンとの結合によって中和活性を発揮し、それは更に、これらの細胞障害性細胞のＦｃ受容体を介した、本発明抗体のＦｃ領域と細胞障害性細胞との間の結合へと至る。本発明に係る抗体は、従って、それらの表面で免疫グロブリンＢＯ２Ｃ１１を発現している記憶Ｂ細胞の溶解に参加する。
【００３２】
好ましくは、本発明に係る抗イディオタイプ抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域はヒト定常領域である。この本発明の好ましい実施態様により、ヒトの抗体の免疫原性が減少し、その結果、ヒトへのその治療的投与の間におけるその治療効果が向上する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る抗体の各軽鎖の定常領域は、κ（カッパ）タイプである。いかなるアロタイプも本発明の実施にとり好適であり、例えばＫｍ（１）、Ｋｍ（１、２）、Ｋｍ（１、２、３）又はＫｍ（３）が挙げられるが、好ましくはアロタイプＫｍ（３）である。
【００３４】
他の補完的な実施形態では、本発明に係る抗体の各軽鎖定常領域は、λ（ラムダ）タイプである。
【００３５】
特定の本発明の態様では、特に本発明に係る抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域がヒト領域である場合、抗体の各重鎖定常領域はγ型である。この異型の場合、抗体の各重鎖定常領域は、タイプγ１、γ２又はγ３（これらの３つのタイプの定常領域はヒト補体と結合する特徴を有する）であるか、あるいはタイプγ４であってもよい。タイプγの各重鎖定常領域を有する抗体は、ＩｇＧクラスに属する。タイプＧ免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、２つの重鎖及び２つの軽鎖により構成され、ジスルフィド架橋によって各々結合したヘテロ二量体である。各鎖はＮ末端において、当該抗体が反応する抗原に特異的な可変領域又はドメイン（軽鎖の場合はＶ−Ｊ再構成遺伝子、及び重鎖の場合はＶ−Ｄ−Ｊ再構成遺伝子でコードされる）によって構成されており、またＣ末端において、定常領域（軽鎖の場合は単一のＣＬ領域、又は重鎖の場合は３度メイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３））によって構成されている。重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及びＣＨ１及びＣＬ領域の組合せによりＦａｂ領域が形成され、それは非常にフレキシブルなヒンジ部位を介してＦｃ領域と結合し、それにより各Ｆａｂのその標的抗原との結合が可能となり、一方Ｆｃ領域（抗体のエフェクター特性を媒介する）は、エフェクター分子（例えば受容体ＦｃγＲ及びＣ１ｑ）とのアクセスが可能な状態に維持される。Ｆｃ領域（２つの球状領域、ＣＨ２及びＣＨ３により構成される）は、２つの各鎖上で、Ａｓｎ２９７と結合する二アンテナ−タイプのＮ−グリカンの存在により、ＣＨ２ドメインのレベルでグリコシル化される。
【００３６】
好ましくは、抗体の各重鎖定常領域はタイプγ１であり、それにより、かかる抗体による、大多数の個人（ヒト）におけるＡＤＣＣ活性の発揮が可能となる。この点で、いかなるアロタイプ（例えばＧ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１、２、１７）、Ｇ１ｍ（１、１７）又はＧ１ｍ（１、３））も本発明の実施にとり好適である。好ましくは、アロタイプはＧ１ｍ（１、１７）である。
【００３７】
本発明の特定の態様では、抗体の各重鎖定常領域はγ１タイプであり、配列番号３のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その各軽鎖定常領域は、配列番号４のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる。
【００３８】
好適には、前述の配列同一性は、少なくとも８０％、特に好適には少なくとも９０％若しくは９９％であるが、ただし当該変異は本発明に係る抗体の機能特性を変化させるような変異であってはならない。
【００３９】
好ましくは、本発明に係る抗体の各重鎖定常領域はγ１タイプであって、配列番号３のヒト核酸配列によってコードされ、その各軽鎖定常領域は配列番号４のヒト核酸配列によってコードされる。
【００４０】
すなわち、かかる抗体は、γ１タイプの重鎖と共に、マウスの可変領域及びヒトの定常領域を有する。ゆえにこの抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスに属する。この抗体は、２つの軽鎖を有し、その可変ドメインは配列番号１のマウス核酸配列によってコードされ、その定常領域は配列番号４のヒト核酸配列によってコードされる。またその抗体は、２つの重鎖を有し、その可変ドメインは配列番号２のマウス核酸配列によってコードされ、その定常領域は配列番号３のヒト核酸配列によってコードされる。
【００４１】
本発明の他の態様では、本発明に係る抗体の軽鎖の各々は、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされ、重鎖の各々は、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる。特定の有利な態様では、配列同一性は少なくとも８０％、より好適には少なくとも９０％、更に好適には少なくとも９９％であるが、ただし当該変異は本発明に係る抗体の機能特性を変化させるような変異であってはならない。
【００４２】
好ましくは、本発明に係る抗体の軽鎖の各々は配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、重鎖の各々は配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる。抗体の各軽鎖をコードする配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各軽鎖可変ドメインをコードする配列番号１のマウス核酸配列と、抗体の各軽鎖定常領域をコードする配列番号４のヒト核酸配列とを融合させることにより得られる。
【００４３】
抗体の各重鎖をコードする配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各重鎖可変ドメインをコードする配列番号２のマウス核酸配列と、抗体の各重鎖定常領域をコードする配列番号３のヒト核酸配列とを融合させることにより得られる。好適には、本発明に係る抗体の軽鎖の各々は、配列番号７のペプチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有し、本発明に係る抗体の重鎖の各々は、配列番号８のペプチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有する。特定の有利な態様では、配列同一性は少なくとも８０％、より好適には少なくとも９０％、更に好適には少なくとも９９％であるが、ただし当該変異は本発明に係る抗体の機能特性を変化させるような変異であってはならない。
【００４４】
好ましくは、本発明に係る抗体の軽鎖の各々のペプチド配列は配列番号７のペプチド配列であり、本発明に係る抗体の重鎖の各々のペプチド配列は配列番号８のペプチド配列である。
【００４５】
すなわち、抗体の軽鎖の各々が配列番号５のっ歯類−ヒトキメラ核酸配列によってコードされるときに、重鎖の各々は配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、配列番号５の核酸配列から推論される軽鎖の各々のペプチド配列は配列番号７の配列であり、配列番号６の核酸配列から推論される重鎖の各々のペプチド配列は配列番号８の配列である。
【００４６】
本発明に係る抗体は、いかなる細胞系によっても産生させることができ、特にＣＤ１６との高い親和性を有する抗体を産生する細胞系が好ましい。
【００４７】
特に好適な態様では、本発明の抗体はラット骨髄腫細胞系において産生させる。本発明に係る抗体を生産している細胞系は、抗体の具体的な特性を左右しうるため、重要な要素である。事実、抗体発現のための手段は、特にグリコシル化修飾などの、翻訳後修飾の元となり、それは細胞系ごとにそれぞれ異なり、同一の一次構造を有するにも関わらず、抗体の機能特性が異なる結果となりうる。
【００４８】
好ましい実施形態では、抗体は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０、細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１６６２としてＡＴＣＣに寄託されている）において産生される。この細胞株の選択は、例えばＣＨＯを用いて調製した同じ一次構造の抗体と比較し、改良されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を生産する能力、並びに内因性免疫グロブリン産生の欠如が理由である。すなわち、細胞系ＹＢ２／０において産生される本発明に係る抗体は、それらのＦｃ領域によって、他の細胞系において産生された同じ一次構造の抗体と比較して、細胞障害性細胞のＦｃ受容体を活性化する能力が増加している。更に、この細胞系の使用により、抗体組成物の形で抗体を産生し、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位に存在するグリカン構造のフコース濃度／ガラクトース濃度の比率が０．６以下であるという特徴及び効果が得られる。
【００４９】
好適には、本発明に係る抗体は、２００５年１０月２５日に寄託されたクローンＲ５６５（寄託番号Ｉ−３５１０、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅｓ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）から調製することができる
【００５０】
好適には、本発明に係る抗体は抗体ＥＭＡＢ５６５であり、クローンＲ５６５によって産生される。抗体ＥＭＡＢ５６５の軽鎖の各々は配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、その重鎖の各々は配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる。このキメラ抗体はＦＶＩＩＩとの結合においてマウス抗体１４Ｃ１２と競合し、強力な細胞毒性活性（マウス１４Ｃ１２のそれより非常に強力である）を示すが、それはこれらの抗体の重鎖のＮ−グリカンの特有のグリコシル化に一部に起因すると考えられる。事実、クローンＲ５６５は０．６未満のフコース濃度／ガラクトース濃度比率を有する抗体ＥＭＡＢ５６５の組成物を産生することを特徴とし、そのため、強力なＡＤＣＣ活性を有する抗体の産生にとり最適であることが、仏国特許出願第０３１２２２９号に記載されている。ゆえにこの抗体は、標特に的細胞がＦＶＩＩＩ阻害抗体を発現する場合における病理の治療のための治ツールとして有用である。
【００５１】
本発明にはまた、実質的に抗体ＥＭＡＢ５６５と同じ特徴を有するいかなるモノクローナル抗体も包含される。
【００５２】
本発明の他の態様は、本発明に係る抗体の軽鎖を発現するベクターの提供に関する。このベクターは、本発明の抗体を発現させるベクターであり、その抗体の軽鎖は配列番号５の核酸配列によってコードされ、それから推論されるペプチド配列は配列番号７の配列である。このベクターは、抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードする配列番号１のマウス核酸配列と、抗体の各軽鎖定常領域をコードする配列番号４の核酸配列が挿入された核酸分子であり、それらを宿主細胞に導入することにより、それらが細胞内で維持される。選択及び発現のために不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を存在させることにより、宿主細胞におけるこれらの外来の核酸断片の発現が可能となる。かかるベクターは当業者にとって周知で、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、プラスミド又はバクテリオファージが挙げられるが、これらに限定されない。更に、いかなる哺乳類細胞も、本発明に係る抗体を発現させる細胞宿主細胞として使用できる（例えばＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＣＨＯ Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳなどが挙げられる）。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明に係る抗体の重鎖を発現するベクターの提供に関する。このベクターは、本発明の抗体を発現させるベクターであり、その抗体の重鎖は配列番号６の核酸配列によってコードされ、それから推論されるペプチド配列は配列番号８の配列である。このベクターは、抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードする配列番号２のマウス核酸配列と、抗体の各重鎖定常領域をコードする配列番号３の核酸配列が挿入された核酸分子であり、それらを宿主細胞に導入することにより、それらが細胞内で維持される。発現に不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を存在させることにより、宿主細胞におけるこれらの外来の核酸断片の発現が可能となる。上記のように、かかるベクターとしては例えばアデノウイルス、レトロウイルス、プラスミド又はバクテリオファージが挙げられ、例えばＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＣＨＯ Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳなどのいかなる哺乳動物細胞が使用できる。
【００５４】
細胞ＹＢ２／０における重鎖及び軽鎖の発現ベクターの共発現によって得られる抗体としては例えば抗体ＥＭＡＢ５６５が挙げられ、それはクローンＲ５６５（ＣＮＣＭ登録番号：Ｉ−３５１０として寄託）により調製される。この抗体は、ヒトＮＫ細胞の存在下で、マウス抗体１４Ｃ１２により誘導される細胞毒性と比較し、非常に強力な細胞毒性を誘発する。更に、抗体ＥＭＡＢ５６５は、マウス抗体１４Ｃ１２による誘導よりも強力に、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６細胞からのＩＬ−２（インターロイキン２）の分泌を誘発する。ゆえに、培地中における、上記のベクターの発現を可能にする条件下でのクローンＲ５６５の培養組織によって産生される抗体ＥＭＡＢ５６５は、ＢＯ２Ｃ１１が関与する病理（特に血友病Ａ）の治療及び診断の効率化、並びにこの分野における研究の効率化を可能にする最も有用なツールの１つといえる。
【００５５】
本発明の他の具体的態様は、本発明に係る抗体を発現する安定細胞株の提供に関する。
【００５６】
好適には、本発明に係る抗体を発現する安定細胞株は、以下からなる群から選択される：ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト骨髄腫（例えばＮａｍａｌｗａ）又はＰＥＲ．Ｃ６などのヒト由来の他のいかなる細胞、ＣＨＯ株（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯプロ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４））、又はＷｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択される他の細胞株。好ましくは、使用する細胞株はラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞である。この細胞株の選択は、例えばＣＨＯを用いて調製した同じ一次構造の抗体と比較し、改良されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を生産する能力が理由である。
【００５７】
本発明の特定の態様では、本発明に係る抗体を発現している安定な細胞系（より詳しくは前記した群から選択される細胞系）には、前記した重鎖及び軽鎖に係る２つの発現ベクターが組み込まれる。
【００５８】
本発明の具体的態様は、クローンＲ５６５（寄託番号Ｉ−３５１０、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅｓ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に関する。
【００５９】
本発明はまた、上記の通りに細胞株Ｒ５６５によって産生される抗体ＥＭＡＢ５６５と実質的に同等の反応性を有するモノクローナル抗体を産生するあらゆる細胞に関する。
【００６０】
本発明の他の具体的態様は、ヒトＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応し、クローンＲ５６５により産生される抗体と結合する、抗イディオタイプモノクローナル抗体の提供に関する。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、本発明に係る抗体の重鎖をコードする配列番号６の配列のＤＮＡ断片に関する。配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各重鎖をコードする。それは抗体の各重鎖可変領域をコードする配列番号２のマウスの核酸配列と抗体の各重鎖定常領域をコードする配列番号３のヒトの核酸配列とを融合させることによって得られる。
【００６２】
本発明の他の具体的態様は、本発明に係る抗体の軽鎖をコードする配列番号５の配列のＤＮＡ断片に関する。配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各軽鎖をコードする。それは抗体の各軽鎖可変領域をコードする配列番号１のマウスの核酸配列と抗体の各軽鎖定常領域をコードする配列番号４のヒトの核酸配列とを融合させることによって得られる。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、好適には単クローン性の抗イディオタイプ抗体の使用に関する。当該抗体はヒトＦＶＩＩＩの阻害抗体と反応し、前記抗イディオタイプ抗体のＦｃ領域の存在により、インビボ又はインヴィトロで、細胞障害性免疫細胞の補充がなされる。かかる使用は、ＦＶＩＩＩのいずれかのドメインと反応するいかなる細胞障害性の抗イディオタイプ抗体によっても実施できる。これらの細胞障害性抗イディオタイプ抗体は、細胞障害性免疫細胞におけるＦｃγＲＩＩＩ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を活性化させる。好適には、使用する抗体は上記の本発明に係る抗体であり、特に好適な態様では抗体ＥＭＡＢ５６５である。
【００６４】
本発明の抗体は、それらのＦｃ領域を介して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を活性化させる能力を有する。この受容体は「エフェクター細胞」と呼ばれる細胞の表面で発現されるため、非常に好都合である。すなわち、エフェクター細胞に発現されるその受容体への、当該抗体のＦｃ領域の結合によって、エフェクター細胞のＦｃγＲＩＩＩＡ及び標的細胞の破壊が活性化される。エフェクター細胞としては、例えばＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球又はマスト細胞が挙げられる。
【００６５】
好適には、かかる使用により、インビボ又はインヴィトロにおいて、ＦＶＩＩＩの阻害抗体を分泌し、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を細胞表面に発現するプラズマ細胞前駆体細胞の破壊が可能となる。これらの細胞は好ましくはＢ細胞であり、特に好ましくは記憶Ｂ細胞である。好適には、この阻害抗体はＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する。
【００６６】
Ｂリンパ球は、他のタンパク質と結合する膜免疫グロブリンにより構成される、抗原受容体（「Ｂ細胞受容体」（ＢＣＲ））を細胞表面に発現する。各Ｂリンパ球は、一種類の膜免疫グロブリンのみを合成し、その可変領域は、分泌されたその抗体のそれと同一である。Ｂリンパ球はそれらのＢＣＲを介して直接抗原を認識する。ＢＣＲによる抗原の結合は、他の基本的シグナルを伴う場合、前記Ｂリンパ球の増殖を誘発し、それによりこのリンパ球の増殖によるクローン形成がなされる。有糸分裂に由来するＢリンパ球の幾つかは、循環する抗体を分泌するプラズマ細胞に分化し、その他は、記憶Ｂリンパ球（この最初の反応の終わりにおいては不活性）を形成する。
【００６７】
血友病Ａ（特に重度の血友病Ａ）に罹患する患者では、内因性のＦＶＩＩＩの産生は極わずか若しくは全く起こらず、すなわちこのタンパク質はそれらの生物体にとっては外来物質となり、投与されたＦＶＩＩＩはその最初の投与又は次の投与において、免疫反応を誘発する。投与されたＦＶＩＩＩとＢリンパ球に発現されたＢＣＲが充分な親和性を有する場合には、それらの結合によりＢリンパ球が活性化され、プラズマ細胞による可溶性の抗ＦＶＩＩＩ抗体の分泌、及びＦＶＩＩＩ特異的なＢＣＲを細胞表面に発現する記憶Ｂリンパ球の形成がなされる。これらの記憶Ｂリンパ球は、ＦＶＩＩＩと新規に接触した場合、同じ特性を有する記憶Ｂリンパ球が増殖して数を増加させ、高い親和性を有する抗ＦＶＩＩＩ抗体を分泌するプラズマ細胞に分化する。
【００６８】
単純なＢリンパ球により生じる反応より、記憶Ｂリンパ球により生じる反応は強力であり、またこれらの記憶細胞の数は、それらが由来するリンパ球よりはるかに多く、また高い親和性をもつＢＣＲを有する。更に、プラズマ細胞への分化は、同じ特性を有する初期細胞からの場合よりも、記憶細胞からの場合の方が急速である。
【００６９】
膜免疫グロブリンは、特定の抗原に対する特異性を有するため、Ｂリンパ球を特徴付けるものである。抗ＦＶＩＩＩ ＢＣＲを有し、プラズマ細胞を分泌するＦＶＩＩＩ阻害抗体を生じさせるＢリンパ球は更に、抗ＦＶＩＩＩ抗体を特徴づける免疫グロブリン部分への抗体結合により、標的とされうる。すなわち本発明に係る抗体は、膜免疫グロブリンを認識し、そのＦｃ領域を介して細胞障害性免疫細胞を補充させ、細胞表面でＢＣＲを発現する細胞を溶解させる。
【００７０】
より詳細には、かかる使用により、インビボ又はインヴィトロで、抗体ＢＯ２Ｃ１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有するＢＣＲを細胞表面に発現する記憶Ｂ細胞の破壊が可能となる。この破壊は、抗体依存性の細胞除去メカニズム（特にＡＤＣＣ）を介して生じる。
【００７１】
本発明の他の具体的態様は、薬剤としての本発明に係る抗体の使用である。好適には、かかる薬剤はＦＶＩＩＩ阻害抗体が生じる疾患の治療を目的とする。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、薬剤を製造するための本発明に係る抗体の使用である。
【００７３】
より詳細には、本発明の別の実施形態は、血友病Ａの治療用薬剤の製造への、本発明に係る抗体の使用である。本発明では、「血友病Ａの治療に使用される」という用語は、「血友病Ａの治療を目的とする」という用語と同義に解釈すべきである。
【００７４】
好適には、治療される血友病Ａは、阻害物質を伴う血友病Ａである。
【００７５】
本発明に係る抗イディオタイプ抗体はＦＶＩＩＩと同時に患者に投与され、それらは同じ薬剤中に含有させて投与してもよく、又は付随する形で２つを別個に投与してもよい。
【００７６】
最後に、最後の本発明の目的は、本発明に係る抗体と、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤及び／又は担体とを含有する医薬品組成物の提供に関する。上記賦形剤は、食塩水、生理食塩水、等張液、緩衝溶液などの溶液、あらゆる懸濁液、ゲル、粉末などの、製薬への使用に適合する、当業者に当業者に公知のいかなるものであってもよい。本発明に係る組成物は更に、分散剤、可溶化剤、安定化剤、界面活性剤、防腐剤などから選択される１つ以上の物質又は担体を含有してもよい。一方では、本発明に係る組成物は、他の薬品又は有効成分を含有してもよい。
【００７７】
更に、当該組成物は別の方法で、別の形態で投与されてもよい。当該投与はかかる治療的法において標準的ないかなる経路で行ってもよく、特に全身投与経路（例えば静脈内、皮内、腫瘍内、皮下、腹膜内、筋肉内、動脈内注射など）が好適である。例えば、腫瘍付近又は腫瘍内部への注入や、腫瘍の潅注などが挙げられる。
【００７８】
投与量は、投与回数、他の有効成分との組合せ、病理学的な進行段階に基づき適宜変化させてもよい。
【実施例】
【００７９】
＜実施例１：キメラ抗体 抗Ｉｄ−ＦＶＩＩＩ ＥＭＡＢ５６５の発現ベクター構築＞
Ａ．マウス抗体１４Ｃ１２の可変領域のリーダー配列の決定
タイプＩｇＧ２ａ κの免疫グロブリンを産生するマウスハイブリドーマ１４Ｃ１２から、全ＲＮＡを単離した。逆転写の後、抗体１４Ｃ１２の軽鎖（Ｖκ）及び重鎖（ＶＨ）可変ドメインを、５’ＲＡＣＥ技術（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）により増幅した（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｆ．Ｌ１５００−０１）。
【００８０】
簡潔には、最初にマウス定常領域Ｃκ又はＧ１の５’領域に配置されるプライマーを使用して、逆転写を実施した。次に、ポリｄＣ配列を、合成されたｃＤＮＡｓの３’末端に付加し、その後、逆転写プライマーの５’末端で、マウス定常領域Ｃκ又はＧ１に配置される、ポリｄＣ配列及び３’プライマーを認識する５’プライマーを使用してＶκ及びＶＨ領域の増幅を実施した。これらの２段階操作に使用するプライマーを以下に示す：
【００８１】
１．逆転写プライマー
ａ．マウスκ特異的アンチセンスプライマー（配列番号１９）：５’−ＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣ−３’、
ｂ．マウスＧ２ａ特異的アンチセンスプライマー（配列番号２０）：５’−ＣＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＣＴＧ−３’。
【００８２】
２．５’ＲＡＣＥ ＰＣＲプライマー
ａ．マウスκ特異的アンチセンスプライマー（配列番号２１）：５’−ＴＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣ−３’、
ｂ．マウスＧ２ａ特異的アンチセンスプライマー（配列番号２２）：５’−ＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’。
【００８３】
このように得られたＰＣＲ生成物ＶＨ及びＶκを、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（ゼロブラントＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ｒｅｆ．Ｋ２８７５−２０）にクローニングし、更に塩基配列決定した。
【００８４】
マウス抗体１４Ｃ１２のＶκ領域のヌクレオチド配列を配列番号１の配列で示し、推定されるペプチド配列を配列番号９の配列として示す。Ｖκ遺伝子は、サブグループＶκ２３ ［Ａｌｍａｇｒｏ ＪＣら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８），４７：３５５−３６３］に属した。マウス抗体１４Ｃ１２のＶκ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を、Ｋａｂａｔ付番に従い、それぞれ以下の配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５として示す（Ｋａｂａｔら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２（１９９１））。マウス抗体１４Ｃ１２のＶκ領域のＣＤＲ１−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ配列を、ＩＭＧＴ（国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース）分析（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３））に従って定義し、それぞれ以下の配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９として示す。この定義（単に配列可変性の分析のみに基づき、カバットのそれと異なる）は、超可変ループ［Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７（１９８７）］の特徴描写及び抗体の結晶構造解析を考慮し、組み合わせることにより行った。
【００８５】
１４Ｃ１２のＶＨ領域のヌクレオチド配列は配列番号２の配列であり、推定されるペプチド配列は配列番号１０の配列である。ＶＨ遺伝子は、ＶＨ１サブグループ［Ｈｏｎｊｏ Ｔ．ａｎｄ Ｍａｔｓｕｄａ Ｆ．ｉｎ “Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ”．Ｈｏｎｊｏ Ｔ．ａｎｄ Ａｌｔ Ｆ．Ｗ．ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９６），ｐｐ１４５−１７１］に属していた。マウス抗体１４Ｃ１２のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を、Ｋａｂａｔ付番に従い、それぞれ以下の配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８として示す（Ｋａｂａｔら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２（１９９１））。マウス抗体１４Ｃ１２のＶＨ領域のＣＤＲ１−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ配列を、ＩＭＧＴ（国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース）分析（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３））に従って定義し、それぞれ以下の配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２として示す。この定義（単に配列可変性の分析のみに基づき、カバットのそれと異なる）は、超可変ループ［Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７（１９８７）］の特徴描写及び抗体の結晶構造解析を考慮し、組み合わせることにより行った。
【００８６】
Ｂ．キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の重鎖及び軽鎖発現ベクターの構築
１．κ軽鎖ベクター
シークエンス用ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングしたＶκ配列を、以下のクローニングプライマーを使用して増幅した：
【００８７】
ａ）Ｖκセンスプライマー（配列番号２３）：
【数１】
下線を有する配列は制限部位ＳｐｅＩに対応し、太字の配列はコザック共通配列に対応し、ＡＴＧイニシエータをイタリックで示す。
【００８８】
ｂ）Ｖκアンチセンスプライマー（配列番号２４）
【数２】
【００８９】
このプライマーにより、マウスＶκ配列（イタリック）及びヒト定常領域（Ｃκ）（太字）の連結がなされる。下線を引かれた配列はＤｒａＩＩＩ制限部位に対応する。
【００９０】
このように得たＶκＰＣＲ生成物は、マウス抗体１４Ｃ１２の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含む。このＶκＰＣＲ生成物を、ヒトＣκ定常領域の５’末端の、軽鎖キメラベクターのＳｐｅ Ｉ及びＤｒａＩＩＩ部位との間にクローニングした。その核酸配列を配列番号４の配列として示し、その推定されるペプチド配列を配列番号１２の配列として示す。このキメラベクターのヒトＣκ配列は事前に部位特異的突然変異導入により修飾し、マウスＶκ配列をクローニングするためのＤｒａＩＩＩ制限部位を導入した。このキメラベクターは、当業者に公知の、例えばＣＭＶ又はＲＳＶなどのプロモーター、並びにＨＧＨ（Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）ポリアデニル化配列、並びにｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）選抜遺伝子を含む。
【００９１】
抗体ＥＭＡＢ５６５の発現用に、キメラベクターのプロモータを更にヒトＥＦ−１αプロモータで置換した。
【００９２】
このベクターによってコードされるキメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の軽鎖配列を配列番号５のヌクレオチド配列として示し、推定されるペプチド配列を配列番号７として示す。
【００９３】
２．重鎖ベクター
同様の方法を用い、抗体ＥＭＡＢ５６５の重鎖をキメラ化した。シークエンス用ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングしたＶＨ配列を、以下のクローニングプライマーを使用して増幅した：
【００９４】
ａ）ＶＨセンスプライマー（配列番号２５）
【数３】
下線を有する配列は制限部位ＳｐｅＩに対応し、太字の配列はコザック共通配列に対応し、ＡＴＧイニシエータをイタリックで示す。
【００９５】
ｂ）ＶＨアンチセンスプライマー（配列番号２６）
【数４】
このプライマーにより、マウスＶＨ配列（イタリック）及びヒトＧ１定常領域（太字）の連結がなされる。
【００９６】
下線を有する配列はＡｐａＩ制限部位に対応する。
【００９７】
増幅されたＶＨ断片は、マウス抗体１４Ｃ１２の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含む。このＶＨ ＰＣＲ生成物を、ヒトγ１定常領域の５’末端で、重鎖キメラベクターのＳｐｅＩ部位とＡｐａＩ部位との間にクローニングし、その核酸配列を配列番号３の配列として示し、推定されるペプチド配列を配列番号１１の配列として示す。このキメラベクターは、当業者に公知のＣＭＶ又はＲＳＶなどのプロモータ、並びにｂＧＨ（ウシＧｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）ポリアデニル化配列、並びにｎｅｏ選抜遺伝子を含む。
【００９８】
抗体ＥＭＡＢ５６５の発現用に、キメラベクターのプロモータを更にヒトＥＦ−１αプロモータで置換した。
【００９９】
このベクターによってコードされるキメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の重鎖配列を配列番号６のヌクレオチド配列として示し、推定されるペプチド配列を配列番号８として示す。
【０１００】
＜実施例２：ＦＶＩＩＩ抗阻害キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５を産生する、ＹＢ２／０に由来する細胞系の構築＞
ラット細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６６２）を、５％の牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．１２１０７）を含有するＥＭＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．０４１−９５１８１Ｍ）で培養した。５００万の細胞を、２５μｇのＡａｔＩＩで線形化した軽鎖ベクター、２７μｇのＳｃａ−Ｉで線形化した重鎖ベクターを、Ｏｐｔｉｍｉｘ培地（Ｅｑｕｉｂｉｏ，ｒｅｆ．ＥＫＩＴＥ １）中に懸濁し、エレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ， ｍｏｄｅｌ １６５２０７７）によりトランスフェクションした。エレクトロポレーション条件を、０．５ｍｌのキュベットあたり２３０Ｖ及び９６０μＦとした。各エレクトロポレーションキュベットを更に、５０００細胞／ウェルの密度で５枚の９６穴プレートに播いた。
【０１０１】
トランスフェクションの３日後に、５％の透析済血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０６０３−０１７）、ジネティシンＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０１３１−０２７）及び２５ｎＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．Ｍ８４０７）５００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ選択培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ２１８７５−０３４）へ添加した。
【０１０２】
トランスフェクション耐性細胞を含むウェルの上澄を用い、ヒトＩｇ配列に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを行い、キメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在をスクリーニングした。
【０１０３】
最も多くの抗体を生産している１０の形質転換株に関して、２４−ウェルプレートで増殖させ、それらの上澄を用いて再度ＥＬＩＳＡアッセイして抗体の産生性を推定し、最良の３ウェルを選抜し、限界希釈法（４０細胞／プレート）によりクローニングした。
【０１０４】
クローニング終了後、クローンＲ５６５（以下「Ｒ５６５」）を、キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の産生に関して選抜し、徐々にＣＤハイブリドーマ作製用培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１１２７９−０２３）に順応させた。
【０１０５】
キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の産生はＣＤハイブリドーマ作製用培地へ培養細胞を分散させることにより行った。詳細には、ローラータイプフラスコ中に４．５×ｌ０５細胞／ｍｌに希釈し、更に７５ｃｍ２及び１７５ｃｍ２フラスコ中に３×ｌ０５細胞／ｍｌに希釈することにより、抗体を得た。最大容量（１ｌ）に達した後、細胞生存度が２０％に達するまで培養を継続した。抗体産生の後、キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィ（＜９５％、ＨＰＬＣ推定純度）で精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。
【０１０６】
得られる抗体組成物（ＥＭＡＢ５６５）のグリカン分析をＨＰＣＥ−ＬＩＦによって実施した。その結果、約７％のフコース含有、約５２％のガラクトース含有、及び０．１３３のｆｕｃ／Ｇａｌ比率を示した。
【０１０７】
＜実施例３：ヒトＮＫ細胞の存在下、抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢ０２Ｃ１１の溶解＞
ＡＤＣＣ法
ＮＫ細胞は、Ｍｙｌｔｅｎｙｉの磁気活性化細胞分離法（ＭＡＣＳ）を使用して、ＰＢＭＣｓ（末梢血液単核細胞）から単離した。ＮＫ細胞を洗浄し、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地）＋５％ ＦＣＳ（４５×ｌ０５細胞／ｍｌ）中に再懸濁した。エフェクター細胞及び標的細胞を、１５／１の比率で用いた。ＢＯ２Ｃ１１標的細胞を、ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ中で、３×ｌ０５細胞／ｍｌの濃度に調製した。抗体を、ＩＭＤＭ＋０．５％ ＦＣＳ中で、最終濃度５００、５０、５、０．５、０．００５及び０．００５ｎｇ／ｍｌとなるように希釈した。
【０１０８】
９６穴マイクロタイタープレート中に、抗体５０μｌ、エフェクター細胞５０μｌ、標的細胞５０μｌ、ＩＭＤＭ培地５０μｌを含む反応混合液を調製した。以下の２つの陰性コントロールを準備した：
−ＮＫ不含有溶解液：ＮＫエフェクター細胞を、ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳで置換。
−抗体ｌＡｃ不含有溶解液：抗体を、ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳで置換。
【０１０９】
５％のＣＯ２を含む空気下、３７℃で１６時間インキュベートした後、プレートを遠心分離し、上澄みにリリースされる細胞内ＬＤＨ濃度をプローブとし、特異的試薬（細胞毒性検出キット１６４４７９３）でアッセイした。
【０１１０】
トリトンＸ１００（２％）を用いて、異なる希釈率の標的細胞をそれぞれ１００、５０、２５及び０％で溶解させ、それらの溶解度に対応する較正曲線上の範囲を用いて、溶解％を算出した。
【０１１１】
以下の式に従い、結果を算出した：
溶解％＝（抗体及びＮＫを有する溶解％）−（抗体のない溶解％）−（ＮＫのない溶解％）。
【０１１２】
マウス１４Ｃ１２の抗イディオタイプ抗体、及びキメラのＥＭＡＢｌｉｎｇ １４Ｃ１２ ＦＶＩＩＩ阻害物質に関して、ＮＫ細胞の存在下、ＢＯ２Ｃ１１細胞の溶解能を解析した。
【０１１３】
図１は、マウス抗体１４Ｃ１２がＢＯ２Ｃ１１細胞の溶解を誘発しない一方で、キメラ抗体（ＥＭＡＢｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が投与量依存的に溶解を誘発することを示す。
【０１１４】
＜実施例４：ＢＯ２Ｃ１１及び抗体ＥＭＡＢ５６５の存在下における、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６からのＩＬ−２分泌＞
この試験は、当該抗体の、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞に発現されるＣＤ１６受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）との結合能、及びＩＬ２の分泌誘発能を解析するものである。
【０１１５】
９６穴プレート中に、以下の物質を添加して混合した：
５０μｌの抗体溶液（最終濃度２５、２．５、０．２５、０．０２５、０．０１２μｇ／ｍｌ／ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ）、
５０μｌのＰＭＡ（５％のＦＣＳを有するＩＭＤＭの４０ｎｇ／ｍｌに対する希釈）、
５０μｌのＢＯ２Ｃ１１細胞（６×１０５／ｍｌ）（ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ）、
及び５０μｌのＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞（２０×１０６／ｍｌ）（ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ）。
【０１１６】
３７℃で一晩インキュベーションの後、プレートを遠心分離し、上澄みに含まれるＩＬ２を、市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）でアッセイした。ＯＤを４５０ｎｍで測定した。
【０１１７】
ＩＬ−２濃度の測定結果を、抗体濃度の関数として表した。
【０１１８】
ＦＶＩＩＩ阻害物質ＥＭＡＢ５６５の抗イディオタイプ抗体を用い、ＢＯ２Ｃ１１細胞の存在下で、ＣＤ１６でトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞からのＩＬ２の分泌誘発能を解析した。
【０１１９】
図２は、抗体ＥＭＡＢ５６５がＩＬ−２の分泌を誘発することを示す。
【０１２０】
＜実施例５：抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢＯ２Ｃ１１のＢＣＲｓのキャッピング＞
ＢＯ２Ｃ１１細胞（１．２×１０６細胞／ｍｌ）を、５％のＦＣＳ（ｐＨ７．４）を含有するＩＭＤＭで洗浄し、保存した。細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度で事前に標識した抗体ＥＭＡＢ５６５（ＡＬＥＸＡ）で、４℃及び３７℃で１時間、４時間及び１６時間インキュベートした。抗体による受容体のキャッピングを、ＬＥＩＣＡ蛍光顕微鏡（×６３オイル浸漬レンズ）で観察した。
【０１２１】
インキュベーション時間を変化させた試験した結果、キャッピングが早期（３０分後）に行われ、時間経過とともに強まることが示された。例えば、図４では、１６時間、ＢＯ２Ｃ１１と結合する抗体が極部に塊を形成し、膜の表面に均一に分布しないことが示された。これは、ＢＯ２Ｃ１１に対する抗体１４Ｃ１２ ＣＨの結合が、膜受容体の再編成及び潜在的な形質導入シグナルを誘導することを示す。
【０１２２】
＜実施例６：抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢＯ２Ｃ１１アポトーシス＞
ＢＯ２Ｃ１１細胞（２．５×１０５）を、３７℃で２４時間、２４−ウェルプレート中で、１ｍｌのＲＭＰＩ培地（＋１０％ ＦＣＳ）中で、クロスリンカー（１０μｇ／ｍｌのヤギＦ（ａｂ２）’抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ）の有無において、抗体ＥＭＡＢ５６５（１μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。細胞を更に遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、キットに含まれるバッファ中に再懸濁し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の説明に従い、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とインキュベートした。フローサイトメトリを用い、アポトーシス細胞の％を、全細胞に対するアネキシンＶ（アネキシンＶ及びアネキシンＶ＋ＰＩ）標識付き細胞に関して解析した。
【０１２３】
図４は、抗体ＥＭＡＢ５６５（ＥＭＡＢｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下において、アポトーシス誘導が、クロスリンカー非存在下では３％未満、クロスリンカー存在下ではわずか６．５％であることを示す（図４）。
【０１２４】
＜実施例７：補体の存在下、抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢ０２Ｃ１１の溶解＞
ＢＯ２Ｃ１１細胞を洗浄し、ＩＭＤＭ培地＋５％ＦＣＳで１：１０に希釈した補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ製、若いウサギの補体）の存在下で、抗体ＥＭＡＢ５６５（０〜２．５μｇ／ｍｌの最終濃度）の濃度範囲で、３７℃で１時間インキュベートした。更に細胞を２回遠心分離（１分間、１２００回転／分（２７０ｇ））し、上澄を除去した。細胞溶解に対応する、上澄中に放出された細胞内ＬＤＨの量を、特異的な試薬（細胞毒性検出キット１６４４７９３）で測定した。
【０１２５】
トリトンＸ１００（２％）を用いて、異なる希釈率の標的細胞をそれぞれ１００、５０、２５及び０％で溶解させ、それらの溶解度に対応する較正曲線上の範囲を用いて、溶解％を算出した。コントロールは自然発生的な放出（標的細胞だけ）を含む。
【０１２６】
以下の式に従って結果を算出した：
溶解％＝（抗体及び補体を有する溶解％）−（補体のない溶解％）。
【０１２７】
図５は、抗体ＥＭＡＢ５６５（ＥＭＡＢｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により誘導されるＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）活性は、最も高い抗体濃度を使用した場合の５％が最大であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ヒトＮＫ細胞の存在下で、抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１の溶解。
【図２】ＢＯ２Ｃ１１及び抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６によるＩＬ２の分泌。
【図３】抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１のＢＣＲｓのキャッピング。
【図４】抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１のアポトーシス。
【図５】補体の存在下で、抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１の溶解。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト第８因子阻害抗体と反応する抗イディオタイプ抗体に関する。前記阻害抗体はヒト第８因子のＣ２領域を認識し、当該抗体の各軽鎖可変領域が、配列番号１のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その各重鎖可変領域が、配列番号２のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、更に軽鎖及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域である。並びに本発明は、細胞障害性免疫細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体の活性化のための、及び薬剤（特に血友病Ａの治療用の薬剤）の調製のための、当該抗体の使用の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病ＡはＸ染色体の異常を原因とする遺伝性疾患であり、その患者においては、血液凝固が行われない。血友病Ａは血液凝固に悪影響を与える不全症の中で最も一般的なものであり、フランスでは５０００の１人の男性が罹患し、血友病患者の８０％を占める。この疾患は、凝固に関係するタンパク質、第８因子（ＦＶＩＩＩ）の遺伝子上の突然変異の結果であり、それにより血液中のＦＶＩＩＩの全体の欠損又は一部の欠損がもたらされる。
【０００３】
他のタイプの血友病（血友病Ｂ）は血友病患者の２０％を占め、それは他の凝固因子（第ＩＸ因子）の不足によって生じる。
【０００４】
現在の血友病（タイプＡ又はＢ）の治療方法は、静脈ルートによる不完全若しくは失活した凝固因子を投与することを含んでなる。フランスにおいては、タイプＡ血友病患者の治療を目的とするＦＶＩＩＩは、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＬＦＢ）、又は国際的な製薬研究所から供給される血液製剤の形で、あるいは遺伝子工学的に調製した組換え製剤の形で入手できる。事実、哺乳類細胞由来のＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡが単離され、発現され、更にそのアミノ酸配列がｃＤＮＡから予想されている（非特許文献１）。
【０００５】
分泌されたＦＶＩＩＩは、生体内の凝固経路の活性化において鍵となる役割を演じる３００のＫｄａの分子量（２３３２アミノ酸）を有する糖タンパク質である。不活性なＦＶＩＩＩは、６つの領域から構成される：（Ｎ末端からＣ末端に向けて）Ａ１（残基１−３７２）、Ａ２（残基３７３−７４０）、Ｂ（残基７４１−１６４８）、Ａ３（残基１６９０−２０１９）、Ｃ１（残基２０２０−２１７２）及びＣ２（残基２１７３−２３３２）。分泌の後、ＦＶＩＩＩはフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）と相互作用することにより、血漿中のプロテアーゼによる攻撃を回避する。ＦＶＩＩＩはトロンビンによる裂開の後、ｖＷＦから分離される。この裂開によりＢ領域が除去され、更にヘテロ二量体の形成がなされる。ＦＶＩＩＩはこの形態で血漿中を循環する。このヘテロ二量体は、重鎖（Ａ１、Ａ２）及び軽鎖（Ａ３、Ｃ１、Ｃ２）により構成される。
【０００６】
ＦＶＩＩＩは、血友病患者に注射された後、患者の血液中を循環するｖＷＦと結合する。活性化するＦＶＩＩＩは活性化第ＩＸ因子の補因子として機能し、活性化因子Ｘへの因子Ｘの変換を促進する。活性化因子Ｘは、プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは更にフィブリノゲンをフィブリンに変換し、凝血塊が形成される。
【０００７】
ＦＶＩＩＩの投与において生じる大きな課題は、患者体内における、ＦＶＩＩＩを認識する「阻害抗体」と呼ばれる抗体の出現である。これらの抗体はＦＶＩＩＩによる血液凝固活性を中和し、注射後直ちに不活性となる。すなわち、投与された凝固因子は、止血を行う前に破壊されてしまい、それは血友病の重い合併症を構成し、治療効果が損なわれる。更に、ある特定の非遺伝的血友病患者は、内因性ＦＶＩＩＩに対する阻害物質を生じさせる、いわゆる後天性血友病の患者である。
【０００８】
抗ＦＶＩＩＩ免疫反応がポリクローン性であり、主にＡ２及びＣ２領域に対する反応であるという研究結果が報告されている（非特許文献２）。ＦＶＩＩＩ阻害物質の形成を研究する目的でモデル動物を作製し、当該ラットを組換えヒトＦＶＩＩＩで免疫した結果、ポリクローン性の急激な免疫反応が観察された（非特許文献３）。
【０００９】
抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体がＦＶＩＩＩの機能を阻害する機構多く存在し、ＦＶＩＩＩのタンパク質分解への干渉、並びに異なるパートナー（例えばｖＷＦ、リン脂質（ＰＬ）、第ＩＸ因子、活性化因子Ｘ（ＦＸａ）又はＡＰＣ（活性化プロテインＣ））とＦＶＩＩＩとの相互作用への干渉が挙げられる。
【００１０】
この免疫反応の低減化を可能にするための幾つかの処理方法が存在する。例えば、ＦＶＩＩＩの産生を刺激する合成ホルモンであるデスモプレッシン（プロトロンビン複合体レベルの上昇、活性化プロトロンビン複合体レベルの上昇などにより凝固を促進する）又は組換え因子ＶＩＩａを投与することや、顕著量若しくは適当量のＦＶＩＩＩを血奨交換及び潅流により供給することが挙げられる。しかしながら、これらの方法は非常に高価であり、また未だ低効率に留まっている。
【００１１】
別のストラテジーとして、抗イディオタイプ抗体を投与してこれらの阻害抗体を中和するという新規な方法が提案されている（非特許文献４）。また特許文献１では、マウスの抗イディオタイプモノクローナル抗体（１４Ｃ１２）を用いて、ヒトＦＶＩＩＩの阻害抗体による阻害特性を、投与量依存的に中和する技術が開示されている。しかしながら、これらの抗体は抗体の中和機能のみを有するに留まっている。すなわちそれらは阻害抗体の分泌の上流側に対する効力を有しない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０１４９５５号
【非特許文献１】Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３３０−３３７
【非特許文献２】Ｇｉｌｌｅｓ ＪＧら、（１９９３）Ｂｌｏｏｄ、８２：２４５２−２４６１
【非特許文献３】Ｊａｒｖｉｓら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９６ Ｆｅｂ、７５（２）：３１８−２５
【非特許文献４】Ｓａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ ＪＭら、（１９９９）Ｖｏｘ Ｂｌｏｏｄ、７７（ｓｕｐｐｌ１）：２１−２４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上より、循環する阻害抗体を中和し、阻害抗体の分泌の上流側に作用し、分泌を減少させることを可能にする、新規な治療ツールに対するニーズが存在する。
【００１３】
以上より発明者らは、分泌された阻害抗体対する作用、及び、ＦＶＩＩＩの阻害抗体を分泌するプラズマ細胞の前駆体（特に記憶Ｂ細胞）の上流側に対する作用の両方を有する、血友病Ａの治療に有用が新規ツールの開発を行った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、ＦＶＩＩＩ阻害と反応する新規な細胞障害性抗イディオタイプ抗体を開発した。かかる抗体は、これらの循環する阻害抗体と結合することにより中和活性を発揮し、かつ記憶Ｂ細胞と相互作用できる。記憶Ｂ細胞はプラズマ細胞の起源であり、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）機構によって溶解することにより、これらの阻害抗体が産生される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
抗イディオタイプ抗体とは、他の抗体の可変領域と相互作用する能力を有する抗体のことを意味する。
【００１６】
本発明に係る抗イディオタイプ細胞障害性抗体は、Ａ１領域、Ａ２領域、Ｂ領域、Ａ３領域又はＣ１領域などの、ヒトＦＶＩＩＩにおけるいずれかの領域と結合する阻害抗体と反応する。本発明による好ましい抗イディオタイプ抗体は、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と結合するヒト由来の阻害抗体と反応する抗体である。
【００１７】
ＦＶＩＩＩのＣ２領域は、リン脂質（ＰＬ）結合部位、及びフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）との主要な結合部位を有する。ＰＬｓの結合はＦＶＩＩＩの生理的活性にとり重要であり、特に第ＩＸ因子（ＦＩＸ）と因子Ｘ（ＦＸ）を伴うテナーゼ複合体形成にとり重要である。ｖＷＦはシャペロンタンパク質として作用し、ＦＶＩＩＩを初期の分解及びクリアランスからの保護に関与する。ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応するＦＶＩＩＩ−阻害抗体は、阻害抗体を生合成する患者において最も頻繁に見られる阻害物質である。すなわち、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害抗体を標的とする、本発明に係る好ましい抗イディオタイプ抗体は、それらが阻害抗体を生じさせる大多数の血友病Ａ患者において有効に機能するという点で、特に有用である。
【００１８】
すなわち本発明は、ヒトＦＶＩＩＩ阻害抗体と反応する抗イディオタイプモノクローナル抗体の提供に関する。この阻害抗体はヒトＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応し、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体では、各軽鎖可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その各重鎖可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その軽鎖定常領域及びその重鎖定常領域が非マウスの種由来である。
【００１９】
好適には、配列の同一性は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の同一性である。同一性のパーセンテージは２つの配列のアラインメントを比較し、同一のヌクレオチドを有する部分の数を、この配列中のヌクレオチド総数で除算することにより算出する。同じアミノ酸がいくつかの異なる３ヌクレオチドによってコードされうるという事実により、当該遺伝暗号は縮重していてもよい。いずれにせよ、配列中のこれらの相違は、モノクローナル抗体のその標的への結合特異性に影響を及ぼさず、標的とする阻害抗体と結合することにより阻害活性を中和するその能力にも影響を及ぼさない。好適には、本発明に係る抗体の、その標的分子との親和性は、同一若しくはほぼ同一のレベルが維持される。
【００２０】
本発明では、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」などの表現は、同一及びユニークな特性を有する抗体分子の調製物のことを指す。
【００２１】
軽鎖及び重鎖の可変領域の由来が、軽鎖及び重鎖の定常領域のそれと異なる種由来である、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、「キメラ」抗体とも言える。
【００２２】
本発明に係る抗イディオタイプキメラ抗体は、標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製することもでき、かかる技術は当業者に周知であり、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，：６８５１−５５（１９８４）に記載のキメラ抗体作製技術を使用してもよい。当該技術では、組み換えＤＮＡ技術を用い、ヒト以外の哺乳類由来の抗体の重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を、ヒト免疫グロブリンの対応する領域で置換している。かかる抗体及びそれらの調製方法はまた、例えば欧州特許出願公開第１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２（５９９５）：６０４−８（１９８５）、並びに欧州特許出願公開第１２５０２３号にも記載されている。
【００２３】
マウス由来の配列番号１、配列番号２の核酸配列はそれぞれ、マウスハイブリドーマ１４Ｃ１２が産生する抗体の、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードする。それらは２００２年６月３０日以降、Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）から入手でき、登録番号ＬＭＢＰ ５８７８ＣＢとして、ＬＭＢＰ（プラスミドコレクション、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ、Ｋ．Ｌ． Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ ３５、９０００ Ｇｅｎｔ、ベルギー）に寄託されている。クローン１４Ｃ１２は、国際公開第２００４／０１４９５５号に記載されている。マウス抗体１４Ｃ１２の配列は、本発明に係る抗体の可変領域と同一の配列、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、又更に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列をコードするために選択された。すなわちマウス抗体１４Ｃ１２の可変領域の使用は、国際公開第２００４／０１４９５５号に記載されているように、多くの利点を有する。マウス抗体１４Ｃ１２の第１の有利な側面としては、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害抗体（抗体ＢＯ２Ｃ１１）と結合する能力が挙げられる。抗体ＢＯ２Ｃ１１は、阻害物質を産生する患者において、ＦＶＩＩＩと特異的に結合し、投与量依存的に、この循環する阻害抗体（ＦＶＩＩＩ）とその標的（Ｃ２領域）との結合を阻害する、天然のレパートリに由来するヒトモノクローナル抗体のことを指す（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎら、（１９９８），Ｂｌｏｏｄ ９２：４９６−５０６）。抗体ＢＯ２Ｃ１１の軽鎖及び重鎖の可変領域のヌクレオチド及びペプチド配列は、国際公開第０１／０４２６９号に記載されている。更に、マウス抗体１４Ｃ１２は、抗体ＢＯ２Ｃ１１の阻害特性を、投与量依存的に中和する能力を有する。更にマウス抗体１４Ｃ１２は、ポリクローン性のＦＶＩＩＩｓを阻害する抗体の存在により観察されるＦＶＩＩＩの活性阻害が、インヴィトロで６０％中和させることが明らかとなっている。マウス抗体１４Ｃ１２はまた、クローンＢＯ２Ｃ１１の起源の患者とは異なる患者に由来するポリクローナル抗体により観察される、ＦＶＩＩＩ阻害活性をインヴィトロで顕著に中和することが明らかとなっている。それらの結果は、マウス抗体１４Ｃ１２が、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応するヒト抗体に共通に存在するエピトープを認識することを示すものである。マウス抗体１４Ｃ１２のインビボ特性に関しては、組換えヒトＦＶＩＩＩ及び阻害抗体ＢＯ２Ｃ１１を注射したＦＶＩＩＩ−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウスでは、マウス抗体１４Ｃ１２が投与量依存的に抗体ＢＯ２Ｃ１１の阻害特性を中和することが示されている。すなわち、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害物質が産生される血友病Ａに罹患する患者の治療における、マウス抗体１４Ｃ１２の有用性を物語るものである。更にマウス抗体１４Ｃ１２は、それぞれ１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ値、及び１０−５ｓ−１のｋｏｆｆ値で、抗体ＢＯ２Ｃ１１との高い結合親和性を有する。更に、マウス抗体１４Ｃ１２の重鎖可変部には、１３アミノ酸によるＣ２領域と同一若しくは相同な内部領域、及びＢＯ２Ｃ１１の可変部との接触に供される幾つかの残基の両方が含まれることが明らかとなっている。最後に、マウス抗体１４Ｃ１２は、ｖＷＦ又はＰＬとＦＶＩＩＩとの結合を阻害しないことが証明されている。すなわち、ＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する阻害抗体が産生されることを特徴とする血友病Ａに罹患する患者へのマウス抗体１４Ｃ１２の投与によって、ＦＶＩＩＩの機能に対する望ましくない阻害効果が生じない。好適には、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、抗体１４Ｃ１２の可変領域に関連する全ての有利な特性を有する。
【００２４】
本発明に係る抗体はまた、非マウスの種に属する軽鎖及び重鎖定常領域を有する。すなわち、マウスでない全ての哺乳類のファミリー及びの種のそれらを使用でき、特にヒト、サル、げっ歯類（マウスを除く）、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ並びにトリなど（これらに限定されない）が挙げられる
【００２５】
好ましくは、本発明の抗イディオタイプ抗体の各軽鎖可変領域は、配列番号１のマウス核酸配列によってコードされ、その各重鎖可変領域は、配列番号２のマウス核酸配列によってコードされ、その軽鎖及び重鎖定常領域は非マウス種由来の定常領域である。
【００２６】
好適には、本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、抗体組成物の形で細胞において産生され、当該抗体中のＦｃ領域のグリコシル化部位に存在する、そのグリカン構造中のフコース濃度／ガラクトース濃度の比率は０．６以下であることを特徴とする。「Ｆｃ領域のグリコシル化部位」とは、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７、Ｋａｂａｔ付番号）を意味し、Ｎ−グリコシル化部位として機能する。実際、抗体のＦｃ定常領域はＣＨ２及びＣＨ３と称される２つの球状領域により構成されている。２つの重鎖はＣＨ３領域のレベルで密接に相互作用するが、ＣＨ２のレベルでは、各々２つの鎖上の領域における、Ａｓｎ２９７と結合する二アンテナ−タイプのＮ−グリカンの存在により、２つの領域に分離される。すなわち、本発明の実施態様では、抗体組成物に存在するグリコシル化部位の全てに存在するグリカン構造は、０．６以下のフコース濃度／ガラクトース濃度比率を示す。このことは、抗体が強力なＡＤＣＣ活性（「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」）における最適な条件であり、仏国特許出願第０３１２２２９号において開示されている。ゆえに本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、それらのＦｃ領域によって、細胞障害性エフェクター細胞のＦｃ受容体、及び特にＦｃγＲＩＩＩＡ受容体（ＣＤ１６とも呼ばれ、細胞障害性エフェクター細胞を活性化する受容体）、を活性化する能力が強化されている。本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体によって活性化されうるエフェクター細胞としては、例えばＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球又はマスト細胞が挙げられる。好ましくは、本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、ＮＫ細胞の補充を可能にする。すなわち本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は細胞障害性であることを特徴とし、そのＦｃ領域を介して、エフェクター細胞の補充を可能にし、本発明に係る抗イディオタイプ抗体の標的を細胞表面に有する細胞を破壊する。
【００２７】
本発明に係る抗体は、特に記憶Ｂ細胞などの、細胞表面に前記ＦＶＩＩＩ阻害抗体を発現する細胞、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を分泌するプラズマ細胞前駆体を破壊する能力を有する。
【００２８】
好ましくは、標的細胞は記憶Ｂ細胞である。
【００２９】
すなわち本発明に係る抗イディオタイプモノクローナル抗体は、一方では阻害抗体のイディオトープとの結合によってＦＶＩＩＩ阻害抗体の結合を阻害し、もう一方では、細胞表面に標的となる阻害抗体を発現する記憶Ｂ細胞、及び阻害抗体を分泌するプラズマ細胞の前駆体の溶解を生じさせる。これらの２つの効果により、血友病患者において産生されるＦＶＩＩＩ阻害抗体による阻害活性の低減化が可能となる。
【００３０】
好ましくは、本発明の抗イディオタイプ抗体が標的とする抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体は抗体ＢＯ２Ｃ１１である。この抗体は、阻害物質が産生される血友病Ａに罹患する患者の天然のレパートリに由来する、ＦＶＩＩＩに特異的なヒトＩｇＧ４κモノクローナル抗体である（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２：４９６−５０６）。抗体ＢＯ２Ｃ１１はＣ２領域を認識し、ＦＶＩＩＩのｖＷＦ及びリン脂質（ＰＬ）との結合を阻害する。この活性メカニズムは、ＦＶＩＩＩのＣ２領域に特異的な阻害抗体を保持する患者において最も頻繁に見られる。更に、Ｃ２領域に対する抗体ＢＯ２Ｃ１１の正確な結合部位が、Ｆａｂフラグメント及びＣ２領域のＸ線結晶構造解析により確認されている（Ｓｐｉｅｇｅｌ ＰＣら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：１３−１９）。抗体ＢＯ２Ｃ１１の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第０１／０４２６９号（２０００）に記載されている。
【００３１】
すなわち、本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、記憶Ｂ細胞ＢＯ２Ｃ１１のクローンの表面に存在する膜抗体ＢＯ２Ｃ１１（ＢＣＲ）のみならず、循環する抗体ＢＯ２Ｃ１１をも認識する。ゆえに本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、一方では循環抗体との結合によって、もう一方では膜免疫グロブリンとの結合によって中和活性を発揮し、それは更に、これらの細胞障害性細胞のＦｃ受容体を介した、本発明抗体のＦｃ領域と細胞障害性細胞との間の結合へと至る。本発明に係る抗体は、従って、それらの表面で免疫グロブリンＢＯ２Ｃ１１を発現している記憶Ｂ細胞の溶解に参加する。
【００３２】
好ましくは、本発明に係る抗イディオタイプ抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域はヒト定常領域である。この本発明の好ましい実施態様により、ヒトの抗体の免疫原性が減少し、その結果、ヒトへのその治療的投与の間におけるその治療効果が向上する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る抗体の各軽鎖の定常領域は、κ（カッパ）タイプである。いかなるアロタイプも本発明の実施にとり好適であり、例えばＫｍ（１）、Ｋｍ（１、２）、Ｋｍ（１、２、３）又はＫｍ（３）が挙げられるが、好ましくはアロタイプＫｍ（３）である。
【００３４】
他の補完的な実施形態では、本発明に係る抗体の各軽鎖定常領域は、λ（ラムダ）タイプである。
【００３５】
特定の本発明の態様では、特に本発明に係る抗体の各軽鎖及び各重鎖の定常領域がヒト領域である場合、抗体の各重鎖定常領域はγ型である。この異型の場合、抗体の各重鎖定常領域は、タイプγ１、γ２又はγ３（これらの３つのタイプの定常領域はヒト補体と結合する特徴を有する）であるか、あるいはタイプγ４であってもよい。タイプγの各重鎖定常領域を有する抗体は、ＩｇＧクラスに属する。タイプＧ免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、２つの重鎖及び２つの軽鎖により構成され、ジスルフィド架橋によって各々結合したヘテロ二量体である。各鎖はＮ末端において、当該抗体が反応する抗原に特異的な可変領域又はドメイン（軽鎖の場合はＶ−Ｊ再構成遺伝子、及び重鎖の場合はＶ−Ｄ−Ｊ再構成遺伝子でコードされる）によって構成されており、またＣ末端において、定常領域（軽鎖の場合は単一のＣＬ領域、又は重鎖の場合は３度メイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３））によって構成されている。重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及びＣＨ１及びＣＬ領域の組合せによりＦａｂ領域が形成され、それは非常にフレキシブルなヒンジ部位を介してＦｃ領域と結合し、それにより各Ｆａｂのその標的抗原との結合が可能となり、一方Ｆｃ領域（抗体のエフェクター特性を媒介する）は、エフェクター分子（例えば受容体ＦｃγＲ及びＣ１ｑ）とのアクセスが可能な状態に維持される。Ｆｃ領域（２つの球状領域、ＣＨ２及びＣＨ３により構成される）は、２つの各鎖上で、Ａｓｎ２９７と結合する二アンテナ−タイプのＮ−グリカンの存在により、ＣＨ２ドメインのレベルでグリコシル化される。
【００３６】
好ましくは、抗体の各重鎖定常領域はタイプγ１であり、それにより、かかる抗体による、大多数の個人（ヒト）におけるＡＤＣＣ活性の発揮が可能となる。この点で、いかなるアロタイプ（例えばＧ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１、２、１７）、Ｇ１ｍ（１、１７）又はＧ１ｍ（１、３））も本発明の実施にとり好適である。好ましくは、アロタイプはＧ１ｍ（１、１７）である。
【００３７】
本発明の特定の態様では、抗体の各重鎖定常領域はγ１タイプであり、配列番号３のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、その各軽鎖定常領域は、配列番号４のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる。
【００３８】
好適には、前述の配列同一性は、少なくとも８０％、特に好適には少なくとも９０％若しくは９９％であるが、ただし当該変異は本発明に係る抗体の機能特性を変化させるような変異であってはならない。
【００３９】
好ましくは、本発明に係る抗体の各重鎖定常領域はγ１タイプであって、配列番号３のヒト核酸配列によってコードされ、その各軽鎖定常領域は配列番号４のヒト核酸配列によってコードされる。
【００４０】
すなわち、かかる抗体は、γ１タイプの重鎖と共に、マウスの可変領域及びヒトの定常領域を有する。ゆえにこの抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスに属する。この抗体は、２つの軽鎖を有し、その可変ドメインは配列番号１のマウス核酸配列によってコードされ、その定常領域は配列番号４のヒト核酸配列によってコードされる。またその抗体は、２つの重鎖を有し、その可変ドメインは配列番号２のマウス核酸配列によってコードされ、その定常領域は配列番号３のヒト核酸配列によってコードされる。
【００４１】
本発明の他の態様では、本発明に係る抗体の軽鎖の各々は、配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされ、重鎖の各々は、配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる。特定の有利な態様では、配列同一性は少なくとも８０％、より好適には少なくとも９０％、更に好適には少なくとも９９％であるが、ただし当該変異は本発明に係る抗体の機能特性を変化させるような変異であってはならない。
【００４２】
好ましくは、本発明に係る抗体の軽鎖の各々は配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、重鎖の各々は配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる。抗体の各軽鎖をコードする配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各軽鎖可変ドメインをコードする配列番号１のマウス核酸配列と、抗体の各軽鎖定常領域をコードする配列番号４のヒト核酸配列とを融合させることにより得られる。
【００４３】
抗体の各重鎖をコードする配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各重鎖可変ドメインをコードする配列番号２のマウス核酸配列と、抗体の各重鎖定常領域をコードする配列番号３のヒト核酸配列とを融合させることにより得られる。好適には、本発明に係る抗体の軽鎖の各々は、配列番号７のペプチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有し、本発明に係る抗体の重鎖の各々は、配列番号８のペプチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有する。特定の有利な態様では、配列同一性は少なくとも８０％、より好適には少なくとも９０％、更に好適には少なくとも９９％であるが、ただし当該変異は本発明に係る抗体の機能特性を変化させるような変異であってはならない。
【００４４】
好ましくは、本発明に係る抗体の軽鎖の各々のペプチド配列は配列番号７のペプチド配列であり、本発明に係る抗体の重鎖の各々のペプチド配列は配列番号８のペプチド配列である。
【００４５】
すなわち、抗体の軽鎖の各々が配列番号５のっ歯類−ヒトキメラ核酸配列によってコードされるときに、重鎖の各々は配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、配列番号５の核酸配列から推論される軽鎖の各々のペプチド配列は配列番号７の配列であり、配列番号６の核酸配列から推論される重鎖の各々のペプチド配列は配列番号８の配列である。
【００４６】
本発明に係る抗体は、いかなる細胞系によっても産生させることができ、特にＣＤ１６との高い親和性を有する抗体を産生する細胞系が好ましい。
【００４７】
特に好適な態様では、本発明の抗体はラット骨髄腫細胞系において産生させる。本発明に係る抗体を生産している細胞系は、抗体の具体的な特性を左右しうるため、重要な要素である。事実、抗体発現のための手段は、特にグリコシル化修飾などの、翻訳後修飾の元となり、それは細胞系ごとにそれぞれ異なり、同一の一次構造を有するにも関わらず、抗体の機能特性が異なる結果となりうる。
【００４８】
好ましい実施形態では、抗体は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０、細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１６６２としてＡＴＣＣに寄託されている）において産生される。この細胞株の選択は、例えばＣＨＯを用いて調製した同じ一次構造の抗体と比較し、改良されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を生産する能力、並びに内因性免疫グロブリン産生の欠如が理由である。すなわち、細胞系ＹＢ２／０において産生される本発明に係る抗体は、それらのＦｃ領域によって、他の細胞系において産生された同じ一次構造の抗体と比較して、細胞障害性細胞のＦｃ受容体を活性化する能力が増加している。更に、この細胞系の使用により、抗体組成物の形で抗体を産生し、抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位に存在するグリカン構造のフコース濃度／ガラクトース濃度の比率が０．６以下であるという特徴及び効果が得られる。
【００４９】
好適には、本発明に係る抗体は、２００５年１０月２５日に寄託されたクローンＲ５６５（寄託番号Ｉ−３５１０、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅｓ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ，２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５）から調製することができる
【００５０】
好適には、本発明に係る抗体は抗体ＥＭＡＢ５６５であり、クローンＲ５６５によって産生される。抗体ＥＭＡＢ５６５の軽鎖の各々は配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、その重鎖の各々は配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる。このキメラ抗体はＦＶＩＩＩとの結合においてマウス抗体１４Ｃ１２と競合し、強力な細胞毒性活性（マウス１４Ｃ１２のそれより非常に強力である）を示すが、それはこれらの抗体の重鎖のＮ−グリカンの特有のグリコシル化に一部に起因すると考えられる。事実、クローンＲ５６５は０．６未満のフコース濃度／ガラクトース濃度比率を有する抗体ＥＭＡＢ５６５の組成物を産生することを特徴とし、そのため、強力なＡＤＣＣ活性を有する抗体の産生にとり最適であることが、仏国特許出願第０３１２２２９号に記載されている。ゆえにこの抗体は、標特に的細胞がＦＶＩＩＩ阻害抗体を発現する場合における病理の治療のための治ツールとして有用である。
【００５１】
本発明にはまた、実質的に抗体ＥＭＡＢ５６５と同じ特徴を有するいかなるモノクローナル抗体も包含される。
【００５２】
本発明の他の態様は、本発明に係る抗体の軽鎖を発現するベクターの提供に関する。このベクターは、本発明の抗体を発現させるベクターであり、その抗体の軽鎖は配列番号５の核酸配列によってコードされ、それから推論されるペプチド配列は配列番号７の配列である。このベクターは、抗体の軽鎖の各々の可変ドメインをコードする配列番号１のマウス核酸配列と、抗体の各軽鎖定常領域をコードする配列番号４の核酸配列が挿入された核酸分子であり、それらを宿主細胞に導入することにより、それらが細胞内で維持される。選択及び発現のために不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を存在させることにより、宿主細胞におけるこれらの外来の核酸断片の発現が可能となる。かかるベクターは当業者にとって周知で、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、プラスミド又はバクテリオファージが挙げられるが、これらに限定されない。更に、いかなる哺乳類細胞も、本発明に係る抗体を発現させる細胞宿主細胞として使用できる（例えばＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＣＨＯ Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳなどが挙げられる）。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明に係る抗体の重鎖を発現するベクターの提供に関する。このベクターは、本発明の抗体を発現させるベクターであり、その抗体の重鎖は配列番号６の核酸配列によってコードされ、それから推論されるペプチド配列は配列番号８の配列である。このベクターは、抗体の重鎖の各々の可変ドメインをコードする配列番号２のマウス核酸配列と、抗体の各重鎖定常領域をコードする配列番号３の核酸配列が挿入された核酸分子であり、それらを宿主細胞に導入することにより、それらが細胞内で維持される。発現に不可欠な配列（プロモータ、ポリアデニル化配列、選択遺伝子）を存在させることにより、宿主細胞におけるこれらの外来の核酸断片の発現が可能となる。上記のように、かかるベクターとしては例えばアデノウイルス、レトロウイルス、プラスミド又はバクテリオファージが挙げられ、例えばＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（例えばＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＣＨＯ Ｌｅｃ１３、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、２９３、ＢＨＫ又はＣＯＳなどのいかなる哺乳動物細胞が使用できる。
【００５４】
細胞ＹＢ２／０における重鎖及び軽鎖の発現ベクターの共発現によって得られる抗体としては例えば抗体ＥＭＡＢ５６５が挙げられ、それはクローンＲ５６５（ＣＮＣＭ登録番号：Ｉ−３５１０として寄託）により調製される。この抗体は、ヒトＮＫ細胞の存在下で、マウス抗体１４Ｃ１２により誘導される細胞毒性と比較し、非常に強力な細胞毒性を誘発する。更に、抗体ＥＭＡＢ５６５は、マウス抗体１４Ｃ１２による誘導よりも強力に、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＤ１６細胞からのＩＬ−２（インターロイキン２）の分泌を誘発する。ゆえに、培地中における、上記のベクターの発現を可能にする条件下でのクローンＲ５６５の培養組織によって産生される抗体ＥＭＡＢ５６５は、ＢＯ２Ｃ１１が関与する病理（特に血友病Ａ）の治療及び診断の効率化、並びにこの分野における研究の効率化を可能にする最も有用なツールの１つといえる。
【００５５】
本発明の他の具体的態様は、本発明に係る抗体を発現する安定細胞株の提供に関する。
【００５６】
好適には、本発明に係る抗体を発現する安定細胞株は、以下からなる群から選択される：ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト骨髄腫（例えばＮａｍａｌｗａ）又はＰＥＲ．Ｃ６などのヒト由来の他のいかなる細胞、ＣＨＯ株（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯプロ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ ＤＸ Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４））、又はＷｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択される他の細胞株。好ましくは、使用する細胞株はラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞である。この細胞株の選択は、例えばＣＨＯを用いて調製した同じ一次構造の抗体と比較し、改良されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を生産する能力が理由である。
【００５７】
本発明の特定の態様では、本発明に係る抗体を発現している安定な細胞系（より詳しくは前記した群から選択される細胞系）には、前記した重鎖及び軽鎖に係る２つの発現ベクターが組み込まれる。
【００５８】
本発明の具体的態様は、クローンＲ５６５（寄託番号Ｉ−３５１０、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅｓ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に関する。
【００５９】
本発明はまた、上記の通りに細胞株Ｒ５６５によって産生される抗体ＥＭＡＢ５６５と実質的に同等の反応性を有するモノクローナル抗体を産生するあらゆる細胞に関する。
【００６０】
本発明の他の具体的態様は、ヒトＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応し、クローンＲ５６５により産生される抗体と結合する、抗イディオタイプモノクローナル抗体の提供に関する。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、本発明に係る抗体の重鎖をコードする配列番号６の配列のＤＮＡ断片に関する。配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各重鎖をコードする。それは抗体の各重鎖可変領域をコードする配列番号２のマウスの核酸配列と抗体の各重鎖定常領域をコードする配列番号３のヒトの核酸配列とを融合させることによって得られる。
【００６２】
本発明の他の具体的態様は、本発明に係る抗体の軽鎖をコードする配列番号５の配列のＤＮＡ断片に関する。配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列は、抗体の各軽鎖をコードする。それは抗体の各軽鎖可変領域をコードする配列番号１のマウスの核酸配列と抗体の各軽鎖定常領域をコードする配列番号４のヒトの核酸配列とを融合させることによって得られる。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、好適には単クローン性の抗イディオタイプ抗体の使用に関する。当該抗体はヒトＦＶＩＩＩの阻害抗体と反応し、前記抗イディオタイプ抗体のＦｃ領域の存在により、インビボ又はインヴィトロで、細胞障害性免疫細胞の補充がなされる。かかる使用は、ＦＶＩＩＩのいずれかのドメインと反応するいかなる細胞障害性の抗イディオタイプ抗体によっても実施できる。これらの細胞障害性抗イディオタイプ抗体は、細胞障害性免疫細胞におけるＦｃγＲＩＩＩ受容体、特にＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を活性化させる。好適には、使用する抗体は上記の本発明に係る抗体であり、特に好適な態様では抗体ＥＭＡＢ５６５である。
【００６４】
本発明の抗体は、それらのＦｃ領域を介して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体を活性化させる能力を有する。この受容体は「エフェクター細胞」と呼ばれる細胞の表面で発現されるため、非常に好都合である。すなわち、エフェクター細胞に発現されるその受容体への、当該抗体のＦｃ領域の結合によって、エフェクター細胞のＦｃγＲＩＩＩＡ及び標的細胞の破壊が活性化される。エフェクター細胞としては、例えばＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球又はマスト細胞が挙げられる。
【００６５】
好適には、かかる使用により、インビボ又はインヴィトロにおいて、ＦＶＩＩＩの阻害抗体を分泌し、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を細胞表面に発現するプラズマ細胞前駆体細胞の破壊が可能となる。これらの細胞は好ましくはＢ細胞であり、特に好ましくは記憶Ｂ細胞である。好適には、この阻害抗体はＦＶＩＩＩのＣ２領域と反応する。
【００６６】
Ｂリンパ球は、他のタンパク質と結合する膜免疫グロブリンにより構成される、抗原受容体（「Ｂ細胞受容体」（ＢＣＲ））を細胞表面に発現する。各Ｂリンパ球は、一種類の膜免疫グロブリンのみを合成し、その可変領域は、分泌されたその抗体のそれと同一である。Ｂリンパ球はそれらのＢＣＲを介して直接抗原を認識する。ＢＣＲによる抗原の結合は、他の基本的シグナルを伴う場合、前記Ｂリンパ球の増殖を誘発し、それによりこのリンパ球の増殖によるクローン形成がなされる。有糸分裂に由来するＢリンパ球の幾つかは、循環する抗体を分泌するプラズマ細胞に分化し、その他は、記憶Ｂリンパ球（この最初の反応の終わりにおいては不活性）を形成する。
【００６７】
血友病Ａ（特に重度の血友病Ａ）に罹患する患者では、内因性のＦＶＩＩＩの産生は極わずか若しくは全く起こらず、すなわちこのタンパク質はそれらの生物体にとっては外来物質となり、投与されたＦＶＩＩＩはその最初の投与又は次の投与において、免疫反応を誘発する。投与されたＦＶＩＩＩとＢリンパ球に発現されたＢＣＲが充分な親和性を有する場合には、それらの結合によりＢリンパ球が活性化され、プラズマ細胞による可溶性の抗ＦＶＩＩＩ抗体の分泌、及びＦＶＩＩＩ特異的なＢＣＲを細胞表面に発現する記憶Ｂリンパ球の形成がなされる。これらの記憶Ｂリンパ球は、ＦＶＩＩＩと新規に接触した場合、同じ特性を有する記憶Ｂリンパ球が増殖して数を増加させ、高い親和性を有する抗ＦＶＩＩＩ抗体を分泌するプラズマ細胞に分化する。
【００６８】
単純なＢリンパ球により生じる反応より、記憶Ｂリンパ球により生じる反応は強力であり、またこれらの記憶細胞の数は、それらが由来するリンパ球よりはるかに多く、また高い親和性をもつＢＣＲを有する。更に、プラズマ細胞への分化は、同じ特性を有する初期細胞からの場合よりも、記憶細胞からの場合の方が急速である。
【００６９】
膜免疫グロブリンは、特定の抗原に対する特異性を有するため、Ｂリンパ球を特徴付けるものである。抗ＦＶＩＩＩ ＢＣＲを有し、プラズマ細胞を分泌するＦＶＩＩＩ阻害抗体を生じさせるＢリンパ球は更に、抗ＦＶＩＩＩ抗体を特徴づける免疫グロブリン部分への抗体結合により、標的とされうる。すなわち本発明に係る抗体は、膜免疫グロブリンを認識し、そのＦｃ領域を介して細胞障害性免疫細胞を補充させ、細胞表面でＢＣＲを発現する細胞を溶解させる。
【００７０】
より詳細には、かかる使用により、インビボ又はインヴィトロで、抗体ＢＯ２Ｃ１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有するＢＣＲを細胞表面に発現する記憶Ｂ細胞の破壊が可能となる。この破壊は、抗体依存性の細胞除去メカニズム（特にＡＤＣＣ）を介して生じる。
【００７１】
本発明の他の具体的態様は、薬剤としての本発明に係る抗体の使用である。好適には、かかる薬剤はＦＶＩＩＩ阻害抗体が生じる疾患の治療を目的とする。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、薬剤を製造するための本発明に係る抗体の使用である。
【００７３】
より詳細には、本発明の別の実施形態は、血友病Ａの治療用薬剤の製造への、本発明に係る抗体の使用である。本発明では、「血友病Ａの治療に使用される」という用語は、「血友病Ａの治療を目的とする」という用語と同義に解釈すべきである。
【００７４】
好適には、治療される血友病Ａは、阻害物質を伴う血友病Ａである。
【００７５】
本発明に係る抗イディオタイプ抗体はＦＶＩＩＩと同時に患者に投与され、それらは同じ薬剤中に含有させて投与してもよく、又は付随する形で２つを別個に投与してもよい。
【００７６】
最後に、最後の本発明の目的は、本発明に係る抗体と、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤及び／又は担体とを含有する医薬品組成物の提供に関する。上記賦形剤は、食塩水、生理食塩水、等張液、緩衝溶液などの溶液、あらゆる懸濁液、ゲル、粉末などの、製薬への使用に適合する、当業者に当業者に公知のいかなるものであってもよい。本発明に係る組成物は更に、分散剤、可溶化剤、安定化剤、界面活性剤、防腐剤などから選択される１つ以上の物質又は担体を含有してもよい。一方では、本発明に係る組成物は、他の薬品又は有効成分を含有してもよい。
【００７７】
更に、当該組成物は別の方法で、別の形態で投与されてもよい。当該投与はかかる治療的法において標準的ないかなる経路で行ってもよく、特に全身投与経路（例えば静脈内、皮内、腫瘍内、皮下、腹膜内、筋肉内、動脈内注射など）が好適である。例えば、腫瘍付近又は腫瘍内部への注入や、腫瘍の潅注などが挙げられる。
【００７８】
投与量は、投与回数、他の有効成分との組合せ、病理学的な進行段階に基づき適宜変化させてもよい。
【実施例】
【００７９】
＜実施例１：キメラ抗体 抗Ｉｄ−ＦＶＩＩＩ ＥＭＡＢ５６５の発現ベクター構築＞
Ａ．マウス抗体１４Ｃ１２の可変領域のリーダー配列の決定
タイプＩｇＧ２ａ κの免疫グロブリンを産生するマウスハイブリドーマ１４Ｃ１２から、全ＲＮＡを単離した。逆転写の後、抗体１４Ｃ１２の軽鎖（Ｖκ）及び重鎖（ＶＨ）可変ドメインを、５’ＲＡＣＥ技術（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）により増幅した（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｆ．Ｌ１５００−０１）。
【００８０】
簡潔には、最初にマウス定常領域Ｃκ又はＧ１の５’領域に配置されるプライマーを使用して、逆転写を実施した。次に、ポリｄＣ配列を、合成されたｃＤＮＡｓの３’末端に付加し、その後、逆転写プライマーの５’末端で、マウス定常領域Ｃκ又はＧ１に配置される、ポリｄＣ配列及び３’プライマーを認識する５’プライマーを使用してＶκ及びＶＨ領域の増幅を実施した。これらの２段階操作に使用するプライマーを以下に示す：
【００８１】
１．逆転写プライマー
ａ．マウスκ特異的アンチセンスプライマー（配列番号１９）：５’−ＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣ−３’、
ｂ．マウスＧ２ａ特異的アンチセンスプライマー（配列番号２０）：５’−ＣＴＧＡＧＧＧＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＣＴＧ−３’。
【００８２】
２．５’ＲＡＣＥ ＰＣＲプライマー
ａ．マウスκ特異的アンチセンスプライマー（配列番号２１）：５’−ＴＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＧＧＣＡＣ−３’、
ｂ．マウスＧ２ａ特異的アンチセンスプライマー（配列番号２２）：５’−ＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’。
【００８３】
このように得られたＰＣＲ生成物ＶＨ及びＶκを、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（ゼロブラントＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ｒｅｆ．Ｋ２８７５−２０）にクローニングし、更に塩基配列決定した。
【００８４】
マウス抗体１４Ｃ１２のＶκ領域のヌクレオチド配列を配列番号１の配列で示し、推定されるペプチド配列を配列番号９の配列として示す。Ｖκ遺伝子は、サブグループＶκ２３ ［Ａｌｍａｇｒｏ ＪＣら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８），４７：３５５−３６３］に属した。マウス抗体１４Ｃ１２のＶκ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を、Ｋａｂａｔ付番に従い、それぞれ以下の配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５として示す（Ｋａｂａｔら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２（１９９１））。マウス抗体１４Ｃ１２のＶκ領域のＣＤＲ１−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ配列を、ＩＭＧＴ（国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース）分析（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３））に従って定義し、それぞれ以下の配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９として示す。この定義（単に配列可変性の分析のみに基づき、カバットのそれと異なる）は、超可変ループ［Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７（１９８７）］の特徴描写及び抗体の結晶構造解析を考慮し、組み合わせることにより行った。
【００８５】
１４Ｃ１２のＶＨ領域のヌクレオチド配列は配列番号２の配列であり、推定されるペプチド配列は配列番号１０の配列である。ＶＨ遺伝子は、ＶＨ１サブグループ［Ｈｏｎｊｏ Ｔ．ａｎｄ Ｍａｔｓｕｄａ Ｆ．ｉｎ “Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ”．Ｈｏｎｊｏ Ｔ．ａｎｄ Ａｌｔ Ｆ．Ｗ．ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９６），ｐｐ１４５−１７１］に属していた。マウス抗体１４Ｃ１２のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を、Ｋａｂａｔ付番に従い、それぞれ以下の配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８として示す（Ｋａｂａｔら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２（１９９１））。マウス抗体１４Ｃ１２のＶＨ領域のＣＤＲ１−ＩＭＧＴ、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ配列を、ＩＭＧＴ（国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース）分析（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３））に従って定義し、それぞれ以下の配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２として示す。この定義（単に配列可変性の分析のみに基づき、カバットのそれと異なる）は、超可変ループ［Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７（１９８７）］の特徴描写及び抗体の結晶構造解析を考慮し、組み合わせることにより行った。
【００８６】
Ｂ．キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の重鎖及び軽鎖発現ベクターの構築
１．κ軽鎖ベクター
シークエンス用ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングしたＶκ配列を、以下のクローニングプライマーを使用して増幅した：
【００８７】
ａ）Ｖκセンスプライマー（配列番号２３）：
【数１】
下線を有する配列は制限部位ＳｐｅＩに対応し、太字の配列はコザック共通配列に対応し、ＡＴＧイニシエータをイタリックで示す。
【００８８】
ｂ）Ｖκアンチセンスプライマー（配列番号２４）
【数２】
【００８９】
このプライマーにより、マウスＶκ配列（イタリック）及びヒト定常領域（Ｃκ）（太字）の連結がなされる。下線を引かれた配列はＤｒａＩＩＩ制限部位に対応する。
【００９０】
このように得たＶκＰＣＲ生成物は、マウス抗体１４Ｃ１２の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含む。このＶκＰＣＲ生成物を、ヒトＣκ定常領域の５’末端の、軽鎖キメラベクターのＳｐｅ Ｉ及びＤｒａＩＩＩ部位との間にクローニングした。その核酸配列を配列番号４の配列として示し、その推定されるペプチド配列を配列番号１２の配列として示す。このキメラベクターのヒトＣκ配列は事前に部位特異的突然変異導入により修飾し、マウスＶκ配列をクローニングするためのＤｒａＩＩＩ制限部位を導入した。このキメラベクターは、当業者に公知の、例えばＣＭＶ又はＲＳＶなどのプロモーター、並びにＨＧＨ（Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）ポリアデニル化配列、並びにｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）選抜遺伝子を含む。
【００９１】
抗体ＥＭＡＢ５６５の発現用に、キメラベクターのプロモータを更にヒトＥＦ−１αプロモータで置換した。
【００９２】
このベクターによってコードされるキメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の軽鎖配列を配列番号５のヌクレオチド配列として示し、推定されるペプチド配列を配列番号７として示す。
【００９３】
２．重鎖ベクター
同様の方法を用い、抗体ＥＭＡＢ５６５の重鎖をキメラ化した。シークエンス用ベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにクローニングしたＶＨ配列を、以下のクローニングプライマーを使用して増幅した：
【００９４】
ａ）ＶＨセンスプライマー（配列番号２５）
【数３】
下線を有する配列は制限部位ＳｐｅＩに対応し、太字の配列はコザック共通配列に対応し、ＡＴＧイニシエータをイタリックで示す。
【００９５】
ｂ）ＶＨアンチセンスプライマー（配列番号２６）
【数４】
このプライマーにより、マウスＶＨ配列（イタリック）及びヒトＧ１定常領域（太字）の連結がなされる。
【００９６】
下線を有する配列はＡｐａＩ制限部位に対応する。
【００９７】
増幅されたＶＨ断片は、マウス抗体１４Ｃ１２の天然のシグナルペプチドをコードする配列を含む。このＶＨ ＰＣＲ生成物を、ヒトγ１定常領域の５’末端で、重鎖キメラベクターのＳｐｅＩ部位とＡｐａＩ部位との間にクローニングし、その核酸配列を配列番号３の配列として示し、推定されるペプチド配列を配列番号１１の配列として示す。このキメラベクターは、当業者に公知のＣＭＶ又はＲＳＶなどのプロモータ、並びにｂＧＨ（ウシＧｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）ポリアデニル化配列、並びにｎｅｏ選抜遺伝子を含む。
【００９８】
抗体ＥＭＡＢ５６５の発現用に、キメラベクターのプロモータを更にヒトＥＦ−１αプロモータで置換した。
【００９９】
このベクターによってコードされるキメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の重鎖配列を配列番号６のヌクレオチド配列として示し、推定されるペプチド配列を配列番号８として示す。
【０１００】
＜実施例２：ＦＶＩＩＩ抗阻害キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５を産生する、ＹＢ２／０に由来する細胞系の構築＞
ラット細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６６２）を、５％の牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．１２１０７）を含有するＥＭＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．０４１−９５１８１Ｍ）で培養した。５００万の細胞を、２５μｇのＡａｔＩＩで線形化した軽鎖ベクター、２７μｇのＳｃａ−Ｉで線形化した重鎖ベクターを、Ｏｐｔｉｍｉｘ培地（Ｅｑｕｉｂｉｏ，ｒｅｆ．ＥＫＩＴＥ １）中に懸濁し、エレクトロポレーション（Ｂｉｏｒａｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ， ｍｏｄｅｌ １６５２０７７）によりトランスフェクションした。エレクトロポレーション条件を、０．５ｍｌのキュベットあたり２３０Ｖ及び９６０μＦとした。各エレクトロポレーションキュベットを更に、５０００細胞／ウェルの密度で５枚の９６穴プレートに播いた。
【０１０１】
トランスフェクションの３日後に、５％の透析済血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０６０３−０１７）、ジネティシンＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１０１３１−０２７）及び２５ｎＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．Ｍ８４０７）５００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ選択培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ２１８７５−０３４）へ添加した。
【０１０２】
トランスフェクション耐性細胞を含むウェルの上澄を用い、ヒトＩｇ配列に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを行い、キメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）の存在をスクリーニングした。
【０１０３】
最も多くの抗体を生産している１０の形質転換株に関して、２４−ウェルプレートで増殖させ、それらの上澄を用いて再度ＥＬＩＳＡアッセイして抗体の産生性を推定し、最良の３ウェルを選抜し、限界希釈法（４０細胞／プレート）によりクローニングした。
【０１０４】
クローニング終了後、クローンＲ５６５（以下「Ｒ５６５」）を、キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の産生に関して選抜し、徐々にＣＤハイブリドーマ作製用培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｒｅｆ．１１２７９−０２３）に順応させた。
【０１０５】
キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５の産生はＣＤハイブリドーマ作製用培地へ培養細胞を分散させることにより行った。詳細には、ローラータイプフラスコ中に４．５×ｌ０５細胞／ｍｌに希釈し、更に７５ｃｍ２及び１７５ｃｍ２フラスコ中に３×ｌ０５細胞／ｍｌに希釈することにより、抗体を得た。最大容量（１ｌ）に達した後、細胞生存度が２０％に達するまで培養を継続した。抗体産生の後、キメラ抗体ＥＭＡＢ５６５を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィ（＜９５％、ＨＰＬＣ推定純度）で精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。
【０１０６】
得られる抗体組成物（ＥＭＡＢ５６５）のグリカン分析をＨＰＣＥ−ＬＩＦによって実施した。その結果、約７％のフコース含有、約５２％のガラクトース含有、及び０．１３３のｆｕｃ／Ｇａｌ比率を示した。
【０１０７】
＜実施例３：ヒトＮＫ細胞の存在下、抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢ０２Ｃ１１の溶解＞
ＡＤＣＣ法
ＮＫ細胞は、Ｍｙｌｔｅｎｙｉの磁気活性化細胞分離法（ＭＡＣＳ）を使用して、ＰＢＭＣｓ（末梢血液単核細胞）から単離した。ＮＫ細胞を洗浄し、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地）＋５％ ＦＣＳ（４５×ｌ０５細胞／ｍｌ）中に再懸濁した。エフェクター細胞及び標的細胞を、１５／１の比率で用いた。ＢＯ２Ｃ１１標的細胞を、ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ中で、３×ｌ０５細胞／ｍｌの濃度に調製した。抗体を、ＩＭＤＭ＋０．５％ ＦＣＳ中で、最終濃度５００、５０、５、０．５、０．００５及び０．００５ｎｇ／ｍｌとなるように希釈した。
【０１０８】
９６穴マイクロタイタープレート中に、抗体５０μｌ、エフェクター細胞５０μｌ、標的細胞５０μｌ、ＩＭＤＭ培地５０μｌを含む反応混合液を調製した。以下の２つの陰性コントロールを準備した：
−ＮＫ不含有溶解液：ＮＫエフェクター細胞を、ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳで置換。
−抗体ｌＡｃ不含有溶解液：抗体を、ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳで置換。
【０１０９】
５％のＣＯ２を含む空気下、３７℃で１６時間インキュベートした後、プレートを遠心分離し、上澄みにリリースされる細胞内ＬＤＨ濃度をプローブとし、特異的試薬（細胞毒性検出キット１６４４７９３）でアッセイした。
【０１１０】
トリトンＸ１００（２％）を用いて、異なる希釈率の標的細胞をそれぞれ１００、５０、２５及び０％で溶解させ、それらの溶解度に対応する較正曲線上の範囲を用いて、溶解％を算出した。
【０１１１】
以下の式に従い、結果を算出した：
溶解％＝（抗体及びＮＫを有する溶解％）−（抗体のない溶解％）−（ＮＫのない溶解％）。
【０１１２】
マウス１４Ｃ１２の抗イディオタイプ抗体、及びキメラのＥＭＡＢｌｉｎｇ １４Ｃ１２ ＦＶＩＩＩ阻害物質に関して、ＮＫ細胞の存在下、ＢＯ２Ｃ１１細胞の溶解能を解析した。
【０１１３】
図１は、マウス抗体１４Ｃ１２がＢＯ２Ｃ１１細胞の溶解を誘発しない一方で、キメラ抗体（ＥＭＡＢｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が投与量依存的に溶解を誘発することを示す。
【０１１４】
＜実施例４：ＢＯ２Ｃ１１及び抗体ＥＭＡＢ５６５の存在下における、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６からのＩＬ−２分泌＞
この試験は、当該抗体の、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞に発現されるＣＤ１６受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）との結合能、及びＩＬ２の分泌誘発能を解析するものである。
【０１１５】
９６穴プレート中に、以下の物質を添加して混合した：
５０μｌの抗体溶液（最終濃度２５、２．５、０．２５、０．０２５、０．０１２μｇ／ｍｌ／ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ）、
５０μｌのＰＭＡ（５％のＦＣＳを有するＩＭＤＭの４０ｎｇ／ｍｌに対する希釈）、
５０μｌのＢＯ２Ｃ１１細胞（６×１０５／ｍｌ）（ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ）、
及び５０μｌのＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞（２０×１０６／ｍｌ）（ＩＭＤＭ＋５％ ＦＣＳ）。
【０１１６】
３７℃で一晩インキュベーションの後、プレートを遠心分離し、上澄みに含まれるＩＬ２を、市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）でアッセイした。ＯＤを４５０ｎｍで測定した。
【０１１７】
ＩＬ−２濃度の測定結果を、抗体濃度の関数として表した。
【０１１８】
ＦＶＩＩＩ阻害物質ＥＭＡＢ５６５の抗イディオタイプ抗体を用い、ＢＯ２Ｃ１１細胞の存在下で、ＣＤ１６でトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞からのＩＬ２の分泌誘発能を解析した。
【０１１９】
図２は、抗体ＥＭＡＢ５６５がＩＬ−２の分泌を誘発することを示す。
【０１２０】
＜実施例５：抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢＯ２Ｃ１１のＢＣＲｓのキャッピング＞
ＢＯ２Ｃ１１細胞（１．２×１０６細胞／ｍｌ）を、５％のＦＣＳ（ｐＨ７．４）を含有するＩＭＤＭで洗浄し、保存した。細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度で事前に標識した抗体ＥＭＡＢ５６５（ＡＬＥＸＡ）で、４℃及び３７℃で１時間、４時間及び１６時間インキュベートした。抗体による受容体のキャッピングを、ＬＥＩＣＡ蛍光顕微鏡（×６３オイル浸漬レンズ）で観察した。
【０１２１】
インキュベーション時間を変化させた試験した結果、キャッピングが早期（３０分後）に行われ、時間経過とともに強まることが示された。例えば、図４では、１６時間、ＢＯ２Ｃ１１と結合する抗体が極部に塊を形成し、膜の表面に均一に分布しないことが示された。これは、ＢＯ２Ｃ１１に対する抗体１４Ｃ１２ ＣＨの結合が、膜受容体の再編成及び潜在的な形質導入シグナルを誘導することを示す。
【０１２２】
＜実施例６：抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢＯ２Ｃ１１アポトーシス＞
ＢＯ２Ｃ１１細胞（２．５×１０５）を、３７℃で２４時間、２４−ウェルプレート中で、１ｍｌのＲＭＰＩ培地（＋１０％ ＦＣＳ）中で、クロスリンカー（１０μｇ／ｍｌのヤギＦ（ａｂ２）’抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ）の有無において、抗体ＥＭＡＢ５６５（１μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。細胞を更に遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、キットに含まれるバッファ中に再懸濁し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の説明に従い、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とインキュベートした。フローサイトメトリを用い、アポトーシス細胞の％を、全細胞に対するアネキシンＶ（アネキシンＶ及びアネキシンＶ＋ＰＩ）標識付き細胞に関して解析した。
【０１２３】
図４は、抗体ＥＭＡＢ５６５（ＥＭＡＢｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下において、アポトーシス誘導が、クロスリンカー非存在下では３％未満、クロスリンカー存在下ではわずか６．５％であることを示す（図４）。
【０１２４】
＜実施例７：補体の存在下、抗体ＥＭＡＢ５６５により誘発されるＢ０２Ｃ１１の溶解＞
ＢＯ２Ｃ１１細胞を洗浄し、ＩＭＤＭ培地＋５％ＦＣＳで１：１０に希釈した補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ製、若いウサギの補体）の存在下で、抗体ＥＭＡＢ５６５（０〜２．５μｇ／ｍｌの最終濃度）の濃度範囲で、３７℃で１時間インキュベートした。更に細胞を２回遠心分離（１分間、１２００回転／分（２７０ｇ））し、上澄を除去した。細胞溶解に対応する、上澄中に放出された細胞内ＬＤＨの量を、特異的な試薬（細胞毒性検出キット１６４４７９３）で測定した。
【０１２５】
トリトンＸ１００（２％）を用いて、異なる希釈率の標的細胞をそれぞれ１００、５０、２５及び０％で溶解させ、それらの溶解度に対応する較正曲線上の範囲を用いて、溶解％を算出した。コントロールは自然発生的な放出（標的細胞だけ）を含む。
【０１２６】
以下の式に従って結果を算出した：
溶解％＝（抗体及び補体を有する溶解％）−（補体のない溶解％）。
【０１２７】
図５は、抗体ＥＭＡＢ５６５（ＥＭＡＢｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により誘導されるＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）活性は、最も高い抗体濃度を使用した場合の５％が最大であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ヒトＮＫ細胞の存在下で、抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１の溶解。
【図２】ＢＯ２Ｃ１１及び抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６によるＩＬ２の分泌。
【図３】抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１のＢＣＲｓのキャッピング。
【図４】抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１のアポトーシス。
【図５】補体の存在下で、抗体ＥＭＡＢ５６５（図中１４Ｃ１２ ＣＨと示す）により誘発されるＢＯ２Ｃ１１の溶解。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第８因子（ＦＶＩＩＩ）の阻害抗体と反応する抗イディオタイプモノクローナル抗体であって、前記阻害抗体はＦＶＩＩＩのＣ２領域を認識し、当該抗体の各軽鎖可変領域が配列番号１のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、当該抗体の各重鎖可変領域が配列番号２のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、当該抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域である、抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記各軽鎖可変領域が配列番号１のマウス核酸配列によってコードされ、前記各重鎖可変領域が配列番号２のマウス核酸配列によってコードされ、前記軽鎖定常領域及び前記重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域である、請求項１記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項３】
抗体組成物の形で細胞において産生され、Ｆｃ領域のグリコシル化部位に存在するグリカン構造中のフコース濃度／ガラクトース濃度の比率が０．６以下である、請求項１又は２のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記ＦＶＩＩＩ阻害抗体が抗体ＢＯ２Ｃ１１である、請求項１から３のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記各軽鎖定常領域及び前記各重鎖定常領域がヒト定常領域である、請求項１から４のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記各軽鎖定常領域がタイプκである、請求項１から５のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記各重鎖定常領域がタイプγである、請求項１から６のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記各重鎖定常領域がタイプγ１である、請求項７記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記各重鎖定常領域がタイプγ１であって、配列番号３のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされ、前記各軽鎖定常領域が、配列番号４のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる、請求項１から８のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記各重鎖定常領域がタイプγ１であって、配列番号３のヒト核酸配列によってコードされ、前記各軽鎖定常領域が配列番号４のヒト核酸配列によってコードされる、請求項１から９のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１１】
各軽鎖が配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、各重鎖が配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる、請求項１から１０のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１２】
各軽鎖が配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、各重鎖が配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる、請求項１から１１のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１３】
各軽鎖が配列番号７の配列を有する少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有し、各重鎖が配列番号８の配列を有する少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有する、請求項１から１２のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１４】
各軽鎖のペプチド配列が配列番号７のペプチド配列であり、各重鎖のペプチド配列が配列番号８のペプチド配列である、請求項１から１３のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ラットハイブリドーマ細胞系によって産生される、請求項１から１４のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ラットハイブリドーマＹＢ２／０（細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ＡＴＣＣ寄託番号：ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２）によって産生される、請求項１５記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１７】
クローンＲ５６５（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓの寄託番号Ｉ−３５１０）によって産生される、請求項１から１６のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１８】
クローンＲ５６５（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓの寄託番号Ｉ−３５１０）によって産生される抗体ＥＭＡＢ５６５である、請求項１から１７のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか１項記載の抗体を発現する安定細胞株。
【請求項２０】
ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト骨髄腫Ｎａｍａｌｗａ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ株（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、ＭｏＩｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３からなる群から選択される、請求項１９記載の安定な細胞株。
【請求項２１】
クローンＲ５６５（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓの寄託番号Ｉ−３５１０）。
【請求項２２】
請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体重鎖をコードする、配列番号６の配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２３】
請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体重鎖をコードする、配列番号５の配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２４】
前記抗イディオタイプ抗体のＦｃ領域を介する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、細胞障害性免疫細胞の補充のための、ヒトＦＶＩＩＩの阻害抗体と反応する抗イディオタイプモノクローナル抗体の使用。
【請求項２５】
前記抗体が請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
ＦＶＩＩＩ阻害抗体を細胞表面に発現するＢ細胞（特に記憶Ｂ細胞）のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける破壊のための、請求項２４又は２５記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体の使用。
【請求項２７】
抗体ＢＯ２Ｃ１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有するＢＣＲを細胞表面で発現する記憶Ｂ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける破壊のための、請求項２４から２６のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項２８】
前記破壊のメカニズムが抗体依存性の細胞溶解メカニズム（ＡＤＣＣ）である、請求項２４から２７のいずれか１項記載の使用。
【請求項２９】
薬剤を製造するための、請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項３０】
血友病Ａの治療用薬剤の製造への、請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項３１】
前記血友病Ａが、阻害物質の存在を伴う血友病Ａである、請求項３０記載の抗体の使用。
【請求項３２】
請求項１から１８のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体、及び１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤及び／又は担体を含有する医薬品組成物。
【請求項１】
ヒト第８因子（ＦＶＩＩＩ）の阻害抗体と反応する抗イディオタイプモノクローナル抗体であって、前記阻害抗体はＦＶＩＩＩのＣ２領域を認識し、当該抗体の各軽鎖可変領域が配列番号１のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、当該抗体の各重鎖可変領域が配列番号２のマウスの核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、当該抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域である、抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記各軽鎖可変領域が配列番号１のマウス核酸配列によってコードされ、前記各重鎖可変領域が配列番号２のマウス核酸配列によってコードされ、前記軽鎖定常領域及び前記重鎖定常領域が非マウス種由来の定常領域である、請求項１記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項３】
抗体組成物の形で細胞において産生され、Ｆｃ領域のグリコシル化部位に存在するグリカン構造中のフコース濃度／ガラクトース濃度の比率が０．６以下である、請求項１又は２のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記ＦＶＩＩＩ阻害抗体が抗体ＢＯ２Ｃ１１である、請求項１から３のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記各軽鎖定常領域及び前記各重鎖定常領域がヒト定常領域である、請求項１から４のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記各軽鎖定常領域がタイプκである、請求項１から５のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記各重鎖定常領域がタイプγである、請求項１から６のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記各重鎖定常領域がタイプγ１である、請求項７記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記各重鎖定常領域がタイプγ１であって、配列番号３のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされ、前記各軽鎖定常領域が、配列番号４のヒト核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる、請求項１から８のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記各重鎖定常領域がタイプγ１であって、配列番号３のヒト核酸配列によってコードされ、前記各軽鎖定常領域が配列番号４のヒト核酸配列によってコードされる、請求項１から９のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１１】
各軽鎖が配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列によってコードされ、各重鎖が配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列によってコードされる、請求項１から１０のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１２】
各軽鎖が配列番号５のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされ、各重鎖が配列番号６のマウス−ヒトキメラ核酸配列によってコードされる、請求項１から１１のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１３】
各軽鎖が配列番号７の配列を有する少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有し、各重鎖が配列番号８の配列を有する少なくとも７０％の同一性を有するペプチド配列を有する、請求項１から１２のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１４】
各軽鎖のペプチド配列が配列番号７のペプチド配列であり、各重鎖のペプチド配列が配列番号８のペプチド配列である、請求項１から１３のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ラットハイブリドーマ細胞系によって産生される、請求項１から１４のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ラットハイブリドーマＹＢ２／０（細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０、ＡＴＣＣ寄託番号：ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２）によって産生される、請求項１５記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１７】
クローンＲ５６５（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓの寄託番号Ｉ−３５１０）によって産生される、請求項１から１６のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１８】
クローンＲ５６５（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓの寄託番号Ｉ−３５１０）によって産生される抗体ＥＭＡＢ５６５である、請求項１から１７のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項１から１４のいずれか１項記載の抗体を発現する安定細胞株。
【請求項２０】
ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ、ヒト骨髄腫Ｎａｍａｌｗａ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ株（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、ＭｏＩｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３からなる群から選択される、請求項１９記載の安定な細胞株。
【請求項２１】
クローンＲ５６５（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓの寄託番号Ｉ−３５１０）。
【請求項２２】
請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体重鎖をコードする、配列番号６の配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２３】
請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体重鎖をコードする、配列番号５の配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２４】
前記抗イディオタイプ抗体のＦｃ領域を介する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、細胞障害性免疫細胞の補充のための、ヒトＦＶＩＩＩの阻害抗体と反応する抗イディオタイプモノクローナル抗体の使用。
【請求項２５】
前記抗体が請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体である、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
ＦＶＩＩＩ阻害抗体を細胞表面に発現するＢ細胞（特に記憶Ｂ細胞）のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける破壊のための、請求項２４又は２５記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体の使用。
【請求項２７】
抗体ＢＯ２Ｃ１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）を有するＢＣＲを細胞表面で発現する記憶Ｂ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける破壊のための、請求項２４から２６のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項２８】
前記破壊のメカニズムが抗体依存性の細胞溶解メカニズム（ＡＤＣＣ）である、請求項２４から２７のいずれか１項記載の使用。
【請求項２９】
薬剤を製造するための、請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項３０】
血友病Ａの治療用薬剤の製造への、請求項１から１８のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項３１】
前記血友病Ａが、阻害物質の存在を伴う血友病Ａである、請求項３０記載の抗体の使用。
【請求項３２】
請求項１から１８のいずれか１項記載の抗イディオタイプモノクローナル抗体、及び１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤及び／又は担体を含有する医薬品組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５１４５１６（Ｐ２００９−５１４５１６Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８３８２（Ｐ２００８−５３８３８２）
【出願日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５１９２６
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０８１７７４６０）エルエフビー バイオテクノロジーズ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２４５２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５１９２６
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０８１７７４６０）エルエフビー バイオテクノロジーズ (3)
【Ｆターム（参考）】
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