筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤
【課題】 スーパーオキシドジスムターゼを含有する筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤を提供する。
【解決手段】 本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）複合体を有効成分として含有することを特徴とし、経口投与で有効であることから長期投与に適している。
【解決手段】 本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）複合体を有効成分として含有することを特徴とし、経口投与で有効であることから長期投与に適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ複合体を含有する筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤に関し、特に、酸化ストレスによる筋肉組織の分解を抑制し、廃用性筋萎縮等の筋萎縮障害を阻止し得る経口用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉は自発的な運動のみならず、消化管の運動、呼吸又は心臓の拍動などの生命維持活動にも深く関与しており、筋萎縮による機能障害は重篤な症状を引き起こすことが知られている。筋萎縮とは筋の容積が減少することをいい、骨格筋の萎縮は筋繊維の萎縮や筋繊維数の減少によりもたらされる。筋萎縮の原因には、細胞内での活性酸素の増加が関与していると言われている。
生体の抗酸化能力以上に活性酸素が増加している状態を酸化ストレス状態と言う。生体内では、生理活動から派生して、或いは、体内に侵入した毒物又は免疫学的異物を分解するなどの様々な目的のために活性酸素（スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、窒素酸化物など）が生成し、生理機能の維持に役立っている。正常な状態では、体内の余分な活性酸素は抗酸化酵素を含む制御系により除去され、過剰になることはない。しかしながら、筋萎縮では、このような酸化ストレス状態が引き起こされる。
【０００３】
筋萎縮のなかでも、廃用性筋萎縮（disuse muscle atrophy）は、寝たきり等の安静状態、或いは、疾病による長期臥床やギプス固定などの活動制限により引き起こされ、日常散見される現象である。筋萎縮に伴う筋力低下は日常生活での身体活動を制限し、Quality of life（ＱＯＬ）を低下させる。
従来、廃用性筋萎縮を防止又は改善するためには、健常時に適度な運動などの予防を実践すること、或いは、術後早期より十分なリハビリテーションを施行することなどが行われているが、これら以外に有効な解決方法は無かった。そのため、寝たきり状態や手術後の長期臥床によって廃用性筋萎縮が生じると、身体の回復がさらに困難になるという問題がある。
特に、加齢に伴い筋タンパク合成能は低下するため、老齢期では退縮からの筋機能の回復は遷延すると考えられる。そのため、高齢化社会を迎えた現在において、高齢期における廃用性筋萎縮の予防は、健康的な日常生活の活動を確保するうえで重要な課題の一つである。
【０００４】
Kondoらは（非特許文献１）、下肢をギプス拘束することによりヒラメ筋のtiobarbituric acid reactive substance（ＴＢＡＲＳ）が増加することを報告している。また、Lawlerらも（非特許文献２）、尾部懸垂によりヒラメ筋で過酸化脂質とdichlorohydro-fluorescein diacetate（ＤＣＦＨ−ＤＡ）の酸化が増加することを報告している。
活性酸素の増加（酸化ストレス状態）による筋萎縮亢進の作用機序については不明な点が多いが、その一つに細胞内のカルシウムイオンの増加が考えられている（非特許文献３）。細胞膜が脂質過酸化反応により障害され、細胞質のカルシウム濃度が上昇することにより（非特許文献４）、カルシウム依存性のプロテアーゼが活性化され、タンパク分解が亢進する。その結果、筋肉組織の分解を引き起こし、筋萎縮を生じさせると考えられる。
さらに、フリーラジカルにより酸化されたタンパク質は生体内で分解されやすくなり（非特許文献５）、このことが筋肉組織の分解及び筋萎縮を更に進行させると考えられる。
【０００５】
このような廃用性筋萎縮を抑制する手段として、抗酸化物質の投与が検討され、抗酸化ビタミンであるビタミンＥの投与が廃用性筋萎縮の程度を減少させることが報告されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
従来知られているビタミンＥ、ビタミンＣ、β−カロチン等の抗酸化物質は、他の栄養分と同様に摂取後数時間で体内に吸収され、速やかに効果を発揮し、活性酸素を消去する。しかし、これらは活性酸素と反応することにより自らは酸化されしまうため、化学量論的に消費され、効果の持続性がないため、頻繁に摂取し続ける必要がある。
【０００６】
スーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide Dismutase, 以下「ＳＯＤ」と略記する場合がある）は様々な生物の組織に存在する抗酸化酵素であり、銅、亜鉛、マンガン等を含むタンパク質からなり、特に肝臓、副腎、腎臓などに多く含まれており、細胞質内に局在するＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ、ミトコンドリア内に局在するＭｎ−ＳＯＤ、体液中に局在するＥＣ−ＳＯＤの３種類が知られている。
ＳＯＤは、生体内で発生した反応性の強い活性酸素であるスーパーオキシドアニオンラジカル（以下「Ｏ２−」と略記する場合がある）を分解する。生体内の活性酸素制御系においては、Ｏ２−が発生するとＳＯＤの作用により不均化されて過酸化水素が生じ、過剰の過酸化水素はカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ等の過酸化水素の除去に関連した酵素により分解される。この一連のスキームを以下に示す。
【０００７】
ＳＯＤの作用： ２Ｏ２−＋２Ｈ＋ → Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
カタラーゼの作用： ２Ｈ２Ｏ２ → Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ
グルタチオンペルオキシダーゼの作用： ＲＯＯＨ＋２ＧＳＨ → ＲＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ＧＳＳＧ
なお、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼの存在量が不十分の場合には、そして特に細胞病変に起因して鉄の存在量が非常に少ない場合には、過酸化水素は以下のスキームによって、毒性がより強いヒドロキシラジカルに転化される（フェントン反応）。
フェントン反応：
Ｏ２−＋Ｆｅ３＋ → Ｆｅ２＋＋Ｏ２
Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２ → Ｆｅ３＋＋ＯＨ−＋ＯＨ０
Ｏ２−＋Ｈ２Ｏ２ → Ｏ２＋ＯＨ−＋ＯＨ０
【０００８】
特許文献１には、スパーオキシドジスムターゼを含有する経口投与用の医薬品組成物が記載されており、その用途は異なる炎症性作用（特にリューマチや繊維症）、ウィルス性作用（特にＨＩＶ感染）、及び多量の酸素の存在と関連している毒性症状（中枢神経系、虚血、非血管性胃腸障害、眼性障害又は抗癌治療の望ましくない効果抑制）等の緩和に役立つとされている。しかしながら、ＳＯＤが筋萎縮に有効に作用することは全く記載されていない。
また、特許文献２には、神経変性疾患、肝硬変、レンチウィルス感染、寄生虫感染及び医原性疾患（薬物中毒）からなる群から選択される変性疾患の治療のためにＳＯＤを使用することが記載されている。しかしながら、この文献には、細胞を用いた実験結果しか記載されておらず、ＳＯＤが筋萎縮に有効であることも、経口投与が可能であることも記載されていない。
【０００９】
【特許文献１】特表平１０−５１１９４４号公報
【特許文献２】特表２００２−５００２３６号公報
【非特許文献１】Kondo et al., Acta Physiosol Scand 142, p527-528 (1991)
【非特許文献２】Lawler et al., Free Radic Biol Med 35, 9-16 (2003)
【非特許文献３】井上正康, 「廃用性筋萎縮における酸化的ストレス．活性酸素と運動−しなやかな健康と長寿を求めて−」共立出版（東京）, p115-119 (1999)
【非特許文献４】Mourelle et al., J. Appl Toxicol 10, p23-27 (1990)
【非特許文献５】Davies et al., J. Biol Chem 262, p8220-8226 (1987)
【非特許文献６】Appell et al., Int J. Sports Med 18, p157-160 (1997)
【非特許文献７】Kondo et al., Am J. Physiol 262, E583-590 (1992)
【非特許文献８】Kondo et al., FEBS Lett 326, p189-919 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、筋肉の酸化ストレスが筋肉組織の分解及び筋萎縮の一因であると考え、その阻止のために有用な経口用剤を開発すべく鋭意研究を進めた。
本発明の目的は、経口摂取によって生体内のＳＯＤ活性を誘導し得る、筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤、特に、筋肉の酸化ストレスが一因と考えられる筋肉組織の分解及び筋萎縮を阻止し得る経口用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明により提供される筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、スーパーオキシドジスムターゼ複合体を有効成分として含有し、経口摂取用に処方された筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤である。
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口摂取により筋肉の酸化ストレス状態を軽減し、筋肉の酸化ストレス状態に起因する生体の様々な疾患、機能障害又はそれらの発症前段階を阻止すると考えられる。
特に、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、臨床上頻繁に遭遇する廃用性筋萎縮をはじめとして、筋肉組織の分解又は筋萎縮に対し広く予防的及び治療的効果を発揮する。
【００１２】
有効成分であるＳＯＤ複合体は、消化抵抗性を持っているため、分解されずに腸管から吸収されると同時に、生体に対する異物として認識され、免疫系を刺激する。そのためＳＯＤ複合体は、生体の防御反応の一環として内因性ＳＯＤ及びその他の抗酸化酵素活性、例えばカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等を誘導し、活性酸素抑制系に対して全体的に改善効果を与えると考えられる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口摂取により筋肉の酸化ストレス状態に対して優れた軽減効果が認められるため、投与経路が簡便である。
特に、廃用性筋萎縮を薬物療法により予防、改善、治療するためには、萎縮の原因となる長期間の活動制限状態及びその後の回復期間にわたり薬物投与を続ける必要がある。本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口投与により優れた筋萎縮阻止の効果が認められるため長期投与に適しており、廃用性筋萎縮阻止剤として非常に利用価値が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、消化管内で消化抵抗性を有するＳＯＤ複合体を有効成分として含有し、経口摂取により生体内のＳＯＤ活性を誘導する。
複合体を形成するＳＯＤとしては、ヒト由来ＳＯＤでなければ、いかなる起源の異種ＳＯＤを用いても良いが、ＳＯＤ含量の高いメロン果実から抽出されるＳＯＤを用いることが好ましい。
ＳＯＤはそのまま用いても良いし、薬学上許容される塩を用いても良い。また本発明においては、天然ＳＯＤに部位特異的変異法等の方法を行って配列中のアミノ酸の一部を他のアミノ酸に変換したものや、一部のアミノ酸を化学的に修飾したものであっても、ＳＯＤ活性を失っていないものである限り、ＳＯＤとして用いることができる。
【００１５】
ＳＯＤに付加して複合体を形成する物質としては、経口摂取時に消化酵素に抵抗性を持ち、かつ、生体内において異物として認識されやすいものを選択すべきであり、例えば、種々の脂質や蛋白質を用いることができる。
具体的に好ましい複合体としては、ＳＯＤと少なくともプロラミンを含む１種または２種以上の付加物質との複合体が挙げられる。プロラミンは、植物起源、特に種々の穀類（小麦、ライ麦、大麦、エンバク、米、キビ及びトウモロコシ等）から誘導される天然（すなわち、非変性）の不溶性蛋白であり、特に小麦から得られるプロラミン（グリアジン）が好ましい。
ＳＯＤ複合体は、特表平10-511944に記載の方法により製造することが可能であるほか、市販品のメロンＳＯＤ−グリアジン複合体（商品名「オキシカイン（登録商標）」、製造会社ISOCELL S.A.）を用いることができる。
【００１６】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口摂取により筋肉の酸化ストレス状態を軽減し、筋肉の酸化ストレス状態に起因する生体の様々な疾患、機能障害又はそれらの発症前段階を阻止すると考えられる。
すなわち、有効成分であるＳＯＤ複合体は、経口摂取される際に消化抵抗性を持っているため、分解されずに腸管から吸収されると同時に、生体に対する異物として認識され、免疫系を刺激する。異物として認識されたＳＯＤ複合体は、マクロファージ等が産生する活性酸素等により分解を受けるが、ＳＯＤ複合体自体が活性酸素を分解してしまうため、ＳＯＤ複合体は本質的に分解されにくい。そのためＳＯＤ複合体は、生体内において手強い異物として認識され、生体の防御反応の一環として内因性ＳＯＤ及びその他の抗酸化酵素活性、例えばカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等を誘導し、活性酸素抑制系に対して全体的に改善効果を与えると考えられる。
【００１７】
ＳＯＤ誘導体を注射により直接体内に投与する場合には、それ自身の酵素作用によって活性酸素を消去するだけであるが、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、ＳＯＤ複合体が免疫系を刺激することにより活性酸素抑制系全体を改善する点で、効果発現のメカニズムが異なっている。
また、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤の効果は免疫系を刺激によるものであるから、一旦発現すると持続性がある。しかも、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は経口摂取するものであるから、投与時の生体に与える侵襲が注射剤と比べて少ない。
【００１８】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、臨床上頻繁に遭遇する廃用性筋萎縮をはじめとして、筋肉組織の分解又は筋萎縮の予防、改善、治療を目的として、医薬品又は健康食品として用いることができる。
実際の投与に際し、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、筋肉組織の分解又は筋萎縮の進行度に合わせて、その投与量、投与スケジュール等の条件を適宜決定される。
特に、廃用性筋萎縮を薬物療法により予防、改善、治療するためには、萎縮の原因となる長期間の活動制限状態及びその後の回復期間にわたり薬物投与を続ける必要があるが、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は経口投与で有効であり、且つ、効果に持続性があるため長期投与に適しており、非常に利用価値が高い。
【００１９】
経口投与する場合の投与量は、予防的又は保健的に用いるのか、治療的に用いるのかでも異なるが、通常は成人１人１日当り、ＳＯＤ量として１ｍｇ〜２５ｍｇ又は１００〜２，５００単位を１〜４回程度に分けて投与すればよい。
なお、本発明においてＳＯＤの１単位とは、McCordとFridovichの方法に従い、キサンチン／キサンチンオキシダーゼにより発生させたＯ２−により発色する系の５５０ｎｍの吸光度が直線的に増加する濃度域において、１分間の吸光度変化0.025を、Ｏ２−を消去することにより50％に阻害するときに試験系（３．０ｍｌ）中に含まれるＳＯＤ量である（McCord, J.M. & Fridovich, I. : J. Biol. Chem., 244, 6049-6055 (1969)）。
【００２０】
経口投与剤の剤型や処方等の製剤化も、投与経路及び投与条件を考慮して適宜設計される。経口投与の剤型としては、錠剤、ハード又はソフトカプセル、顆粒又は細粒のような粒剤、散剤等の公知のものを選択できる。経口投与の処方としては、ＳＯＤ複合体を有効成分とし、上記剤型に合わせて、公知の賦型剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、及びその他の成分を適宜配合すればよい。
【実施例】
【００２１】
（１）実験方法
（ａ）実験動物の群分け及び飼育条件
５週齢のWister系ラットを無作為に、（ａ）水投与群（以下「Ｗ群」と略す）、（ｂ）複合ＳＯＤであるオキシカイン（商品名）の投与群（以下「Ｏ群」と略す）、（ｃ）ビタミンＥ投与群（以下「Ｅ群」と略す）、（ｄ）対照群（以下「Ｃ群」と略す）の４群に分け、１群につき８〜１０匹の動物を割り当た。
各群のラットを、実験動物用固形飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業）と水を自由摂取させて５週間飼育し、この飼育期間中、以下の投与を行った。
【００２２】
Ｏ群には、水に溶解したオキシカインを小動物用ゾンデを用いて週６回の頻度で経口投与したが、体重の変化を考慮して投与量を調整した結果、その投与量は１日１回、１ｋｇ当たり５〜６．２５ｍｇであった。
Ｅ群には、大豆油に溶解したα−トコフェロール酢酸塩（和光純薬）を小動物用ゾンデを用いて週６回の頻度で経口投与したが、体重の変化を考慮して投与量を調整した結果、その投与量は１日１回、体重１ｋｇ当たり３０〜３５ｍｇであった。
Ｗ群には水を小動物用ゾンデにて、１日１回、体重１ｋｇ当たり０．２ｍｌを週６日の頻度で経口投与した。Ｃ群は飼料と水の自由摂取だけで飼育した。
【００２３】
（ｂ）骨格筋萎縮の方法
飼育開始から５週間目に入った日（飼育開始から２９日目）から、下肢の筋を萎縮させるために、Ｗ群、Ｏ群、Ｅ群のラットの両下肢を、いわゆる「ふくらはぎ」側の筋であるヒラメ筋（soleus）、足底筋（plantaris）、腓腹筋（gastrocnemius）が緩み、いわゆる「すね」側の筋である長指伸筋（extensor digitorum longus）が引っ張られる状態に進展し、石膏ギプスにより固定した。一方、Ｃ群はギプス拘束しなかった。なお、拘束期間中も、上記の投与スケジュールを続行した。
【００２４】
（ｃ）骨格筋の採取
飼育開始から５週間経過後（飼育開始から３５日目）、ネンブタール麻酔下のラットから骨格筋を採取した。採取した骨格筋はギプス拘束により緩ませた部分、すなわちヒラメ筋、足底筋及び、腓腹筋である。
採取した骨格筋は、筋湿重量を測定した後、直ちに液体窒素で凍結し、分析に供するまでは−８０℃で凍結保存した。
【００２５】
（２）測定方法
（ａ）ＳＯＤ活性値の測定
ＳＯＤ測定キット（SOD Assay Kit-WST；Dojindo Molecular Technology社）を用いて測定した。約２０ｍｇの骨格筋サンプルに、キットに付属の希釈用バッファを１０倍量で添加し、ハンドホモジナイザーにてホモジナイズした。その後、遠心分離（6,500 rpm×10 min）して上清を回収し、これを希釈用バッファで１０倍に希釈したものを測定に用いた。反応は、９６wellプレートを用いて行い、測定手順はキットのプロトコールに順じ、プレートリーダー（Multistan；Labsystems社）で４５０ｎｍでの吸光度の変化を測定し、サンプル添加による吸光度上昇の阻害率を求めた。
【００２６】
同時に、既知濃度のＳＯＤをサンプルと同様の手順で測定し、この時の阻害率を基に検量線を作成し、サンプルの阻害率をこの検量線に代入して、サンプルのＳＯＤ活性値を求めた。また、Coomassie Plus Protein Assay Reagent Kit (Pierce社)を用いてＳＯＤ測定に用いた希釈サンプルのタンパク質濃度を測定した。最終的にサンプルのＳＯＤ値は、筋のタンパク１ｍｇ当たりのＳＯＤ活性値（U/mg protein）として表した。
【００２７】
（ｂ）α−トコフェロールの測定
組織サンプル中のα−トコフェロール量は、Uedaらの方法（五十嵐、島崎共著、生物化学実験法34, 過酸化脂質・フリーラジカル実験法, p65-69, 学会出版センター, 東京（1995））に従い、高速クロマトグラフィーを用いて以下の手順で測定した。
約２０ｍｇの組織サンプルをハサミで１ｍｍ角以下の大きさに細切りし、チューブに入れて重量を測定した後、０．０２ｍｌの１％ＮａＣｌ溶液を加えて細切り試料を分散させ、その後、０．２ｍｌの６％ピロガロール／エタノール溶液と、０．２ｍｌのＰＭＣ（2,2,5,7,8−pentamethyl−6−hydroxychroman）内部標準液（１μｇ／ｍｌ）を加えて混和した。さらに、０．０４ｍｌの６０％ＫＯＨ溶液を加え、キャップをして混和した後、７０℃の水浴中で時々振り混ぜながら約３０分間けん化した。チューブを氷水中で冷却した後に、０．９ｍｌの１％ＮａＣｌ溶液と、０．６ｍｌの１０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン溶液を加え、１分間激しく混和してα−トコフェロールを抽出した。再びチューブを氷水中で約５分間冷却した後、遠心分離（3,000 rpm×5 min）し、０．４ｍｌの上層（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン層）を別のチューブに分取した。
【００２８】
その後、０．２ｍｌの５％ｎ−デカン溶液を加え、ヒートブロックで加温（４０℃以下）しながらＮ２を通気して少量のｎ−デカンを残して溶液を留去し、残ったｎ−デカンに０．０４ｍｌのｎ−ヘキサンを加えて溶解した。この溶液０．０５ｍｌを高速液体クロマトグラフィーに注入して、α−トコフェロールを検出した。この時の高速液体クロマトグラフィーの測定条件は、カラムがInertosil-5NH2(径4.6mm×長さ250mm)、カラム温度は３０℃、移動相はｎ−ヘキサン／イソプロパノール（体積比９８：２）、流速は１．５ｍｌ／分、検出器は蛍光検出器（励起波長297nm、蛍光波長327nm）で行った。
【００２９】
（ｃ）酸化タンパク質（Carbonyl protein）濃度の測定
Levinらの方法（Levin RL et al., "Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins", Methods Enzymol 233, p346-357, 1994）に従い、以下の手順で測定した。
１５〜２０ｍｇの各筋組織サンプルをできるだけ細かく刻み、０．３ｍｌのホモジナイズ用バッファ（50mM phosphate buffer, pH 7.4, 0.1% digitonin, 40 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 μg/ml leupeptin, 7 μg/ml pepstatin, 5 μg/ml aprotonin, 1 mM EDTA）の入った１．５ｍｌサンプルチューブに入れ、室温で１５分間インキュベートした後、遠心分離（6,000 rpm×10 min）して不溶物を取り除いた。
【００３０】
核酸の有無を調べるために、上清の吸光比（280nm/260nm）を測定し、この吸光比が１．０以下の場合は核酸除去のために、０．０３ｍｌの１０％ストレプトマイシンを添加して室温で１５分間インキュベートした後に、遠心分離（6,000 rpm×10 min）した。この吸光比が１．０以上の場合は上記の操作を省略した。遠心分離の上清を０．１ｍｌずつ２個の１．５ｍｌサンプルチューブに分取し、そのうちの一本には０．４ｍｌの１０ｍＭ ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH, in 2.5M HCl）を添加し、もう一本には同量の２．５Ｍ ＨＣｌを添加した。チューブを遮光して室温で１時間インキュベートした。この間１５分毎にチューブを振とうした。０．５ｍｌの２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を両チューブに添加し、１０分間氷中で冷却し、遠心分離（1,000 rpm×5 min）して上清を除去した。
【００３１】
新たに０．４ｍｌの１０％ＴＣＡを両チューブに添加し、ガラス棒でタンパク質の沈殿を砕き、遠心分離（1,000 rpm×5 min）して上清を除去した。遊離ＤＮＰＨと脂質の混入を除去するために、沈殿に０．４ｍｌのエタノール／酢酸エチル溶液（体積比１：１）を添加し、遠心分離（1,000 rpm×5 min）して上清を除去し、この洗浄操作を３回繰り返した。２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ２．３）に溶解した６Ｍ 塩酸グアニジンを０．２ｍｌ添加して３７℃で１０分間インキュベートした後に、遠心分離（12,000 rpm×5 min）して不溶物を除去した。ＤＮＰＨ添加反応液と２．５Ｍ ＨＣｌ添加反応液ともに吸光度（370nm）を測定した。酸化タンパク質濃度は、以下の式により計算した。
＜計算式＞
Ｃ（DNPH/ml）＝Absorption(Abs)／ε＝Ａｂｓ（370nm）／２．２×１０４／１０６＝Ａｂｓ（370nm）×４５．４５ ｎｍｏｌ／ｍｌ〔ε＝22,000/M＝22,000/106 nmol/ml〕
【００３２】
最終的に回収されたタンパク質量を測定するために、２．５Ｍ ＨＣｌ添加後の吸光度（280nm）を測定した。同時にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を６Ｍ 塩酸グアニジン溶液に溶解させた各種濃度のＢＳＡ標準液（0.25-2.0 mg/ml）を調製し、これらの吸光度を測定して検量線を作成し、サンプルのタンパク質濃度を計算した。組織サンプルの酸化タンパク質量は、沈殿として回収されたタンパク質当たりの酸化タンパク質量（ＤＮＰＨ濃度）として計算した（表示単位はnmol/mg protein）。
【００３３】
（ｄ）過酸化脂質の測定
過酸化脂質測定キット（BIOXYTECH LPO-586；OXIS International社）を用いて測定を行った。各筋を、リン酸バッファ生理食塩水（ＰＢＳ）でホモジナイズした後に遠心分離（6,500 rpm×10 min）して上清を回収し、これをサンプルとして用いた。測定は、キットに添付されたマニュアルに従って行い、Ultrospec Plus（Pharmacia International社）で５８６ｎｍの吸光度を測定した。
【００３４】
（ｅ）統計処理
得られたデータは、平均±標準誤差で表した。各測定項目の比較にはtwo-way ANOVAを用い、Fisher's PLSD post hoc testにより統計処理を行い、危険率が５％未満の場合を有意差ありとした。
【００３５】
（３）実験結果
表１に、各群ごとに被験ラットの解剖時体重、筋湿重量、ＳＯＤ活性、α−トコフェロール量、酸化タンパク質量、過酸化脂質量それぞれの平均値±標準誤差を示す。また、これらの測定値をグラフ化して図に示した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（ａ）解剖時体重
図１は、解剖時のラット体重を示すグラフである。体重は、一週間のギプス拘束により各群とも有意な減少を示した。ギプス拘束によるストレスが、体重減少の原因と考えられる。
【００３８】
（ｂ）筋湿重量
図２は、ヒラメ筋の筋湿重量を示すグラフである。Ｏ群のヒラメ筋湿重量は、非拘束であるＣ群の筋湿重量に最も近く、拘束による筋萎縮の影響が最も軽かった。また、Ｏ群のヒラメ筋湿重量は、他の拘束群であるＥ群及びＷ群との対比において、有意差（Ｐ＜０．０５）をもって筋萎縮の阻止に効果があるという結果が得られた。
図３は、非拘束であるＣ群と対比したＷ群の筋萎縮変化量を基準（抑制率０％）とした時の、Ｏ群とＥ群の筋萎縮抑制率を示すグラフである。すなわち、筋萎縮抑制率は次式により計算される。
＜計算式＞
筋萎縮抑制率（％）＝１００−筋萎縮変化率（％）
ここで、
筋萎縮変化率（％）＝（Ｃ群の筋湿重量−Ｏ群又はＥ群の筋湿重量）÷（Ｃ群の筋湿重量−Ｗ群の筋湿重量）×１００
Ｏ群及びＥ群は、ネガティブコントロールであるＷ群での筋萎縮と比べて筋萎縮の阻止が認められ、特にＯ群は、Ｅ群と比べて阻止効果が大きいことが認められた。
【００３９】
（ｃ）ＳＯＤ活性値
図４ａ及び４ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋のＳＯＤ活性値である。ヒラメ筋、足底筋ともに、Ｏ群は他の３群に対して有意な高値を示した。一方、Ｃ群、Ｅ群、Ｗ群の３群間には有意な差は見られなかった。
【００４０】
（ｄ）α−トコフェロール量
図５ａ及び５ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋のα−トコフェロール量である。ヒラメ筋、足底筋ともに、Ｅ群は他の３群に対して有意な高値を示した。一方、Ｃ群、Ｏ群、Ｗ群の３群間には有意な差は見られなかった。
【００４１】
（ｅ）酸化タンパク質量
図６ａ及び６ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋の酸化タンパク質量である。図６ａに示すヒラメ筋では、Ｃ群に対してＥ群とＷ群は有意な高値を示した。しかし、Ｃ群とＯ群の間には有意な差は見られなかった。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群がＷ群とＥ群に対して有意な低値を示した。
一方、図６ｂに示す足底筋では、ギプス拘束した３群（Ｏ群、Ｅ群、Ｗ群）は、Ｃ群に対して有意な高値を示した。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群はＥ群とＷ群に対して有意な低値を示した。
【００４２】
（ｆ）過酸化脂質量
図７ａ及び７ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋の過酸化脂質量である。図７ａに示すヒラメ筋では、ギプス拘束した３群（Ｏ群、Ｅ群、Ｗ群）は、Ｃ群に対して有意な高値を示した。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群がＷ群に対して有意な低値を示した。
一方、図７ｂに示す足底筋でも、ヒラメ筋と同様に、ギプス拘束した３群（Ｏ群、Ｅ群、Ｗ群）は、Ｃ群に対して有意な高値を示した。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群がＥ群に対して有意な低値を示した。
【００４３】
（ｇ）結果のまとめ
筋湿重量の測定結果から、ギプス拘束しないコントロールであるＣ群と比べ、ギプス拘束し水を経口投与したネガティブコントロールであるＷ群は、廃用性筋萎縮が現れた。ギプス拘束しオキシカイン（ＳＯＤ複合体）を経口投与した実施例であるＯ群と、ギプス拘束しビタミンＥを経口投与した比較例であるＥ群は、Ｗ群と比べて筋湿重量の減少が抑制され、萎縮阻止の効果が認められた。
Ｏ群は、Ｅ群との比較でも筋萎縮抑制率が大きく、より大きな萎縮阻止の効果が認められた。この傾向は、ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋いずれの比較においても認められたが、特にヒラメ筋の比較（図２及び図３を参照）においては有意差（Ｐ＜０．０５）をもって効果の差が認められた。
【００４４】
酸化タンパク質量及び過酸化脂質量の測定結果から、筋萎縮阻止の効果が高いＯ群において、酸化ストレスの状態がより軽減されていることが認められた。すなわち、オキシカイン（ＳＯＤ複合体）を経口投与した実施例であるＯ群における酸化タンパク質量は、比較例であるＥ群及びネガティブコントロールであるＷ群のそれと比べて有意に低い値であった（図６ａ及び図６ｂを参照）。特に、ヒラメ筋の比較（図６ａを参照）においては、Ｏ群の酸化タンパク質量は、ギプス拘束しないコントロールであるＣ群との有意差が認められなかった。また、Ｏ群の過酸化脂質量は、ヒラメ筋の比較（図７ａを参照）においてはネガティブコントロールであるＷ群と比べて有意に低い値であり、足底筋の比較（図７ｂを参照）においては比較例であるＥ群と比べて有意に低い値であった。
【００４５】
ＳＯＤ活性値及びα−トコフェロール量の結果（図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ）から、実施例であるＯ群は、ＳＯＤ複合体の経口投与によりＳＯＤ活性値を有意に高くする効果が認められた。一方、比較例であるＥ群では、ビタミンＥの経口投与によりα−トコフェロール量が有意に大きくなったが、ＳＯＤ活性値がそれほど高くならなかった。
また、今回の実験に用いたＯ群とＥ群の投与量は、Ｏ群でのＳＯＤ換算した投与量が１日１回、体重１ｋｇ当たり５ｍｇ〜６．２５ｍｇであったのに対して、Ｅ群でのビタミンＥ投与量が１日１回、体重１ｋｇ当たり３０ｍｇ〜３５ｍｇであり、ＳＯＤはビタミンＥよりも少ない量で優れた筋萎縮阻止の効果が認められた。
これらの結果から、実施例であるＯ群ではＳＯＤ複合体の経口投与により体内のＳＯＤ活性を直接高め、酸化ストレス及び廃用性筋萎縮に対して優れた阻止効果を発揮することが認められた。その阻止効果は、比較例であるＥ群（ＳＯＤ様作用物質であるビタミンＥの経口投与）と比べて有意に優れていた。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】被験ラットの解剖時体重を示すグラフである。
【図２】被験ラットのヒラメ筋湿重量を示すグラフである。
【図３】被験ラットのヒラメ筋湿重量について、Ｗ群の萎縮に対する筋萎縮抑制率を示すグラフである。
【図４】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋のＳＯＤ活性値を示すグラフである。
【図５】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋のα−トコフェロール量を示すグラフである。
【図６】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋の酸化タンパク質量を示すグラフである。
【図７】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋の過酸化脂質量を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ複合体を含有する筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤に関し、特に、酸化ストレスによる筋肉組織の分解を抑制し、廃用性筋萎縮等の筋萎縮障害を阻止し得る経口用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉は自発的な運動のみならず、消化管の運動、呼吸又は心臓の拍動などの生命維持活動にも深く関与しており、筋萎縮による機能障害は重篤な症状を引き起こすことが知られている。筋萎縮とは筋の容積が減少することをいい、骨格筋の萎縮は筋繊維の萎縮や筋繊維数の減少によりもたらされる。筋萎縮の原因には、細胞内での活性酸素の増加が関与していると言われている。
生体の抗酸化能力以上に活性酸素が増加している状態を酸化ストレス状態と言う。生体内では、生理活動から派生して、或いは、体内に侵入した毒物又は免疫学的異物を分解するなどの様々な目的のために活性酸素（スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、窒素酸化物など）が生成し、生理機能の維持に役立っている。正常な状態では、体内の余分な活性酸素は抗酸化酵素を含む制御系により除去され、過剰になることはない。しかしながら、筋萎縮では、このような酸化ストレス状態が引き起こされる。
【０００３】
筋萎縮のなかでも、廃用性筋萎縮（disuse muscle atrophy）は、寝たきり等の安静状態、或いは、疾病による長期臥床やギプス固定などの活動制限により引き起こされ、日常散見される現象である。筋萎縮に伴う筋力低下は日常生活での身体活動を制限し、Quality of life（ＱＯＬ）を低下させる。
従来、廃用性筋萎縮を防止又は改善するためには、健常時に適度な運動などの予防を実践すること、或いは、術後早期より十分なリハビリテーションを施行することなどが行われているが、これら以外に有効な解決方法は無かった。そのため、寝たきり状態や手術後の長期臥床によって廃用性筋萎縮が生じると、身体の回復がさらに困難になるという問題がある。
特に、加齢に伴い筋タンパク合成能は低下するため、老齢期では退縮からの筋機能の回復は遷延すると考えられる。そのため、高齢化社会を迎えた現在において、高齢期における廃用性筋萎縮の予防は、健康的な日常生活の活動を確保するうえで重要な課題の一つである。
【０００４】
Kondoらは（非特許文献１）、下肢をギプス拘束することによりヒラメ筋のtiobarbituric acid reactive substance（ＴＢＡＲＳ）が増加することを報告している。また、Lawlerらも（非特許文献２）、尾部懸垂によりヒラメ筋で過酸化脂質とdichlorohydro-fluorescein diacetate（ＤＣＦＨ−ＤＡ）の酸化が増加することを報告している。
活性酸素の増加（酸化ストレス状態）による筋萎縮亢進の作用機序については不明な点が多いが、その一つに細胞内のカルシウムイオンの増加が考えられている（非特許文献３）。細胞膜が脂質過酸化反応により障害され、細胞質のカルシウム濃度が上昇することにより（非特許文献４）、カルシウム依存性のプロテアーゼが活性化され、タンパク分解が亢進する。その結果、筋肉組織の分解を引き起こし、筋萎縮を生じさせると考えられる。
さらに、フリーラジカルにより酸化されたタンパク質は生体内で分解されやすくなり（非特許文献５）、このことが筋肉組織の分解及び筋萎縮を更に進行させると考えられる。
【０００５】
このような廃用性筋萎縮を抑制する手段として、抗酸化物質の投与が検討され、抗酸化ビタミンであるビタミンＥの投与が廃用性筋萎縮の程度を減少させることが報告されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
従来知られているビタミンＥ、ビタミンＣ、β−カロチン等の抗酸化物質は、他の栄養分と同様に摂取後数時間で体内に吸収され、速やかに効果を発揮し、活性酸素を消去する。しかし、これらは活性酸素と反応することにより自らは酸化されしまうため、化学量論的に消費され、効果の持続性がないため、頻繁に摂取し続ける必要がある。
【０００６】
スーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide Dismutase, 以下「ＳＯＤ」と略記する場合がある）は様々な生物の組織に存在する抗酸化酵素であり、銅、亜鉛、マンガン等を含むタンパク質からなり、特に肝臓、副腎、腎臓などに多く含まれており、細胞質内に局在するＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ、ミトコンドリア内に局在するＭｎ−ＳＯＤ、体液中に局在するＥＣ−ＳＯＤの３種類が知られている。
ＳＯＤは、生体内で発生した反応性の強い活性酸素であるスーパーオキシドアニオンラジカル（以下「Ｏ２−」と略記する場合がある）を分解する。生体内の活性酸素制御系においては、Ｏ２−が発生するとＳＯＤの作用により不均化されて過酸化水素が生じ、過剰の過酸化水素はカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ等の過酸化水素の除去に関連した酵素により分解される。この一連のスキームを以下に示す。
【０００７】
ＳＯＤの作用： ２Ｏ２−＋２Ｈ＋ → Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
カタラーゼの作用： ２Ｈ２Ｏ２ → Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ
グルタチオンペルオキシダーゼの作用： ＲＯＯＨ＋２ＧＳＨ → ＲＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ＧＳＳＧ
なお、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼの存在量が不十分の場合には、そして特に細胞病変に起因して鉄の存在量が非常に少ない場合には、過酸化水素は以下のスキームによって、毒性がより強いヒドロキシラジカルに転化される（フェントン反応）。
フェントン反応：
Ｏ２−＋Ｆｅ３＋ → Ｆｅ２＋＋Ｏ２
Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２ → Ｆｅ３＋＋ＯＨ−＋ＯＨ０
Ｏ２−＋Ｈ２Ｏ２ → Ｏ２＋ＯＨ−＋ＯＨ０
【０００８】
特許文献１には、スパーオキシドジスムターゼを含有する経口投与用の医薬品組成物が記載されており、その用途は異なる炎症性作用（特にリューマチや繊維症）、ウィルス性作用（特にＨＩＶ感染）、及び多量の酸素の存在と関連している毒性症状（中枢神経系、虚血、非血管性胃腸障害、眼性障害又は抗癌治療の望ましくない効果抑制）等の緩和に役立つとされている。しかしながら、ＳＯＤが筋萎縮に有効に作用することは全く記載されていない。
また、特許文献２には、神経変性疾患、肝硬変、レンチウィルス感染、寄生虫感染及び医原性疾患（薬物中毒）からなる群から選択される変性疾患の治療のためにＳＯＤを使用することが記載されている。しかしながら、この文献には、細胞を用いた実験結果しか記載されておらず、ＳＯＤが筋萎縮に有効であることも、経口投与が可能であることも記載されていない。
【０００９】
【特許文献１】特表平１０−５１１９４４号公報
【特許文献２】特表２００２−５００２３６号公報
【非特許文献１】Kondo et al., Acta Physiosol Scand 142, p527-528 (1991)
【非特許文献２】Lawler et al., Free Radic Biol Med 35, 9-16 (2003)
【非特許文献３】井上正康, 「廃用性筋萎縮における酸化的ストレス．活性酸素と運動−しなやかな健康と長寿を求めて−」共立出版（東京）, p115-119 (1999)
【非特許文献４】Mourelle et al., J. Appl Toxicol 10, p23-27 (1990)
【非特許文献５】Davies et al., J. Biol Chem 262, p8220-8226 (1987)
【非特許文献６】Appell et al., Int J. Sports Med 18, p157-160 (1997)
【非特許文献７】Kondo et al., Am J. Physiol 262, E583-590 (1992)
【非特許文献８】Kondo et al., FEBS Lett 326, p189-919 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、筋肉の酸化ストレスが筋肉組織の分解及び筋萎縮の一因であると考え、その阻止のために有用な経口用剤を開発すべく鋭意研究を進めた。
本発明の目的は、経口摂取によって生体内のＳＯＤ活性を誘導し得る、筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤、特に、筋肉の酸化ストレスが一因と考えられる筋肉組織の分解及び筋萎縮を阻止し得る経口用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明により提供される筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、スーパーオキシドジスムターゼ複合体を有効成分として含有し、経口摂取用に処方された筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤である。
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口摂取により筋肉の酸化ストレス状態を軽減し、筋肉の酸化ストレス状態に起因する生体の様々な疾患、機能障害又はそれらの発症前段階を阻止すると考えられる。
特に、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、臨床上頻繁に遭遇する廃用性筋萎縮をはじめとして、筋肉組織の分解又は筋萎縮に対し広く予防的及び治療的効果を発揮する。
【００１２】
有効成分であるＳＯＤ複合体は、消化抵抗性を持っているため、分解されずに腸管から吸収されると同時に、生体に対する異物として認識され、免疫系を刺激する。そのためＳＯＤ複合体は、生体の防御反応の一環として内因性ＳＯＤ及びその他の抗酸化酵素活性、例えばカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等を誘導し、活性酸素抑制系に対して全体的に改善効果を与えると考えられる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口摂取により筋肉の酸化ストレス状態に対して優れた軽減効果が認められるため、投与経路が簡便である。
特に、廃用性筋萎縮を薬物療法により予防、改善、治療するためには、萎縮の原因となる長期間の活動制限状態及びその後の回復期間にわたり薬物投与を続ける必要がある。本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口投与により優れた筋萎縮阻止の効果が認められるため長期投与に適しており、廃用性筋萎縮阻止剤として非常に利用価値が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、消化管内で消化抵抗性を有するＳＯＤ複合体を有効成分として含有し、経口摂取により生体内のＳＯＤ活性を誘導する。
複合体を形成するＳＯＤとしては、ヒト由来ＳＯＤでなければ、いかなる起源の異種ＳＯＤを用いても良いが、ＳＯＤ含量の高いメロン果実から抽出されるＳＯＤを用いることが好ましい。
ＳＯＤはそのまま用いても良いし、薬学上許容される塩を用いても良い。また本発明においては、天然ＳＯＤに部位特異的変異法等の方法を行って配列中のアミノ酸の一部を他のアミノ酸に変換したものや、一部のアミノ酸を化学的に修飾したものであっても、ＳＯＤ活性を失っていないものである限り、ＳＯＤとして用いることができる。
【００１５】
ＳＯＤに付加して複合体を形成する物質としては、経口摂取時に消化酵素に抵抗性を持ち、かつ、生体内において異物として認識されやすいものを選択すべきであり、例えば、種々の脂質や蛋白質を用いることができる。
具体的に好ましい複合体としては、ＳＯＤと少なくともプロラミンを含む１種または２種以上の付加物質との複合体が挙げられる。プロラミンは、植物起源、特に種々の穀類（小麦、ライ麦、大麦、エンバク、米、キビ及びトウモロコシ等）から誘導される天然（すなわち、非変性）の不溶性蛋白であり、特に小麦から得られるプロラミン（グリアジン）が好ましい。
ＳＯＤ複合体は、特表平10-511944に記載の方法により製造することが可能であるほか、市販品のメロンＳＯＤ−グリアジン複合体（商品名「オキシカイン（登録商標）」、製造会社ISOCELL S.A.）を用いることができる。
【００１６】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、経口摂取により筋肉の酸化ストレス状態を軽減し、筋肉の酸化ストレス状態に起因する生体の様々な疾患、機能障害又はそれらの発症前段階を阻止すると考えられる。
すなわち、有効成分であるＳＯＤ複合体は、経口摂取される際に消化抵抗性を持っているため、分解されずに腸管から吸収されると同時に、生体に対する異物として認識され、免疫系を刺激する。異物として認識されたＳＯＤ複合体は、マクロファージ等が産生する活性酸素等により分解を受けるが、ＳＯＤ複合体自体が活性酸素を分解してしまうため、ＳＯＤ複合体は本質的に分解されにくい。そのためＳＯＤ複合体は、生体内において手強い異物として認識され、生体の防御反応の一環として内因性ＳＯＤ及びその他の抗酸化酵素活性、例えばカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等を誘導し、活性酸素抑制系に対して全体的に改善効果を与えると考えられる。
【００１７】
ＳＯＤ誘導体を注射により直接体内に投与する場合には、それ自身の酵素作用によって活性酸素を消去するだけであるが、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、ＳＯＤ複合体が免疫系を刺激することにより活性酸素抑制系全体を改善する点で、効果発現のメカニズムが異なっている。
また、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤の効果は免疫系を刺激によるものであるから、一旦発現すると持続性がある。しかも、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は経口摂取するものであるから、投与時の生体に与える侵襲が注射剤と比べて少ない。
【００１８】
本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、臨床上頻繁に遭遇する廃用性筋萎縮をはじめとして、筋肉組織の分解又は筋萎縮の予防、改善、治療を目的として、医薬品又は健康食品として用いることができる。
実際の投与に際し、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は、筋肉組織の分解又は筋萎縮の進行度に合わせて、その投与量、投与スケジュール等の条件を適宜決定される。
特に、廃用性筋萎縮を薬物療法により予防、改善、治療するためには、萎縮の原因となる長期間の活動制限状態及びその後の回復期間にわたり薬物投与を続ける必要があるが、本発明に係る筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤は経口投与で有効であり、且つ、効果に持続性があるため長期投与に適しており、非常に利用価値が高い。
【００１９】
経口投与する場合の投与量は、予防的又は保健的に用いるのか、治療的に用いるのかでも異なるが、通常は成人１人１日当り、ＳＯＤ量として１ｍｇ〜２５ｍｇ又は１００〜２，５００単位を１〜４回程度に分けて投与すればよい。
なお、本発明においてＳＯＤの１単位とは、McCordとFridovichの方法に従い、キサンチン／キサンチンオキシダーゼにより発生させたＯ２−により発色する系の５５０ｎｍの吸光度が直線的に増加する濃度域において、１分間の吸光度変化0.025を、Ｏ２−を消去することにより50％に阻害するときに試験系（３．０ｍｌ）中に含まれるＳＯＤ量である（McCord, J.M. & Fridovich, I. : J. Biol. Chem., 244, 6049-6055 (1969)）。
【００２０】
経口投与剤の剤型や処方等の製剤化も、投与経路及び投与条件を考慮して適宜設計される。経口投与の剤型としては、錠剤、ハード又はソフトカプセル、顆粒又は細粒のような粒剤、散剤等の公知のものを選択できる。経口投与の処方としては、ＳＯＤ複合体を有効成分とし、上記剤型に合わせて、公知の賦型剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、及びその他の成分を適宜配合すればよい。
【実施例】
【００２１】
（１）実験方法
（ａ）実験動物の群分け及び飼育条件
５週齢のWister系ラットを無作為に、（ａ）水投与群（以下「Ｗ群」と略す）、（ｂ）複合ＳＯＤであるオキシカイン（商品名）の投与群（以下「Ｏ群」と略す）、（ｃ）ビタミンＥ投与群（以下「Ｅ群」と略す）、（ｄ）対照群（以下「Ｃ群」と略す）の４群に分け、１群につき８〜１０匹の動物を割り当た。
各群のラットを、実験動物用固形飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業）と水を自由摂取させて５週間飼育し、この飼育期間中、以下の投与を行った。
【００２２】
Ｏ群には、水に溶解したオキシカインを小動物用ゾンデを用いて週６回の頻度で経口投与したが、体重の変化を考慮して投与量を調整した結果、その投与量は１日１回、１ｋｇ当たり５〜６．２５ｍｇであった。
Ｅ群には、大豆油に溶解したα−トコフェロール酢酸塩（和光純薬）を小動物用ゾンデを用いて週６回の頻度で経口投与したが、体重の変化を考慮して投与量を調整した結果、その投与量は１日１回、体重１ｋｇ当たり３０〜３５ｍｇであった。
Ｗ群には水を小動物用ゾンデにて、１日１回、体重１ｋｇ当たり０．２ｍｌを週６日の頻度で経口投与した。Ｃ群は飼料と水の自由摂取だけで飼育した。
【００２３】
（ｂ）骨格筋萎縮の方法
飼育開始から５週間目に入った日（飼育開始から２９日目）から、下肢の筋を萎縮させるために、Ｗ群、Ｏ群、Ｅ群のラットの両下肢を、いわゆる「ふくらはぎ」側の筋であるヒラメ筋（soleus）、足底筋（plantaris）、腓腹筋（gastrocnemius）が緩み、いわゆる「すね」側の筋である長指伸筋（extensor digitorum longus）が引っ張られる状態に進展し、石膏ギプスにより固定した。一方、Ｃ群はギプス拘束しなかった。なお、拘束期間中も、上記の投与スケジュールを続行した。
【００２４】
（ｃ）骨格筋の採取
飼育開始から５週間経過後（飼育開始から３５日目）、ネンブタール麻酔下のラットから骨格筋を採取した。採取した骨格筋はギプス拘束により緩ませた部分、すなわちヒラメ筋、足底筋及び、腓腹筋である。
採取した骨格筋は、筋湿重量を測定した後、直ちに液体窒素で凍結し、分析に供するまでは−８０℃で凍結保存した。
【００２５】
（２）測定方法
（ａ）ＳＯＤ活性値の測定
ＳＯＤ測定キット（SOD Assay Kit-WST；Dojindo Molecular Technology社）を用いて測定した。約２０ｍｇの骨格筋サンプルに、キットに付属の希釈用バッファを１０倍量で添加し、ハンドホモジナイザーにてホモジナイズした。その後、遠心分離（6,500 rpm×10 min）して上清を回収し、これを希釈用バッファで１０倍に希釈したものを測定に用いた。反応は、９６wellプレートを用いて行い、測定手順はキットのプロトコールに順じ、プレートリーダー（Multistan；Labsystems社）で４５０ｎｍでの吸光度の変化を測定し、サンプル添加による吸光度上昇の阻害率を求めた。
【００２６】
同時に、既知濃度のＳＯＤをサンプルと同様の手順で測定し、この時の阻害率を基に検量線を作成し、サンプルの阻害率をこの検量線に代入して、サンプルのＳＯＤ活性値を求めた。また、Coomassie Plus Protein Assay Reagent Kit (Pierce社)を用いてＳＯＤ測定に用いた希釈サンプルのタンパク質濃度を測定した。最終的にサンプルのＳＯＤ値は、筋のタンパク１ｍｇ当たりのＳＯＤ活性値（U/mg protein）として表した。
【００２７】
（ｂ）α−トコフェロールの測定
組織サンプル中のα−トコフェロール量は、Uedaらの方法（五十嵐、島崎共著、生物化学実験法34, 過酸化脂質・フリーラジカル実験法, p65-69, 学会出版センター, 東京（1995））に従い、高速クロマトグラフィーを用いて以下の手順で測定した。
約２０ｍｇの組織サンプルをハサミで１ｍｍ角以下の大きさに細切りし、チューブに入れて重量を測定した後、０．０２ｍｌの１％ＮａＣｌ溶液を加えて細切り試料を分散させ、その後、０．２ｍｌの６％ピロガロール／エタノール溶液と、０．２ｍｌのＰＭＣ（2,2,5,7,8−pentamethyl−6−hydroxychroman）内部標準液（１μｇ／ｍｌ）を加えて混和した。さらに、０．０４ｍｌの６０％ＫＯＨ溶液を加え、キャップをして混和した後、７０℃の水浴中で時々振り混ぜながら約３０分間けん化した。チューブを氷水中で冷却した後に、０．９ｍｌの１％ＮａＣｌ溶液と、０．６ｍｌの１０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン溶液を加え、１分間激しく混和してα−トコフェロールを抽出した。再びチューブを氷水中で約５分間冷却した後、遠心分離（3,000 rpm×5 min）し、０．４ｍｌの上層（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン層）を別のチューブに分取した。
【００２８】
その後、０．２ｍｌの５％ｎ−デカン溶液を加え、ヒートブロックで加温（４０℃以下）しながらＮ２を通気して少量のｎ−デカンを残して溶液を留去し、残ったｎ−デカンに０．０４ｍｌのｎ−ヘキサンを加えて溶解した。この溶液０．０５ｍｌを高速液体クロマトグラフィーに注入して、α−トコフェロールを検出した。この時の高速液体クロマトグラフィーの測定条件は、カラムがInertosil-5NH2(径4.6mm×長さ250mm)、カラム温度は３０℃、移動相はｎ−ヘキサン／イソプロパノール（体積比９８：２）、流速は１．５ｍｌ／分、検出器は蛍光検出器（励起波長297nm、蛍光波長327nm）で行った。
【００２９】
（ｃ）酸化タンパク質（Carbonyl protein）濃度の測定
Levinらの方法（Levin RL et al., "Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins", Methods Enzymol 233, p346-357, 1994）に従い、以下の手順で測定した。
１５〜２０ｍｇの各筋組織サンプルをできるだけ細かく刻み、０．３ｍｌのホモジナイズ用バッファ（50mM phosphate buffer, pH 7.4, 0.1% digitonin, 40 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 μg/ml leupeptin, 7 μg/ml pepstatin, 5 μg/ml aprotonin, 1 mM EDTA）の入った１．５ｍｌサンプルチューブに入れ、室温で１５分間インキュベートした後、遠心分離（6,000 rpm×10 min）して不溶物を取り除いた。
【００３０】
核酸の有無を調べるために、上清の吸光比（280nm/260nm）を測定し、この吸光比が１．０以下の場合は核酸除去のために、０．０３ｍｌの１０％ストレプトマイシンを添加して室温で１５分間インキュベートした後に、遠心分離（6,000 rpm×10 min）した。この吸光比が１．０以上の場合は上記の操作を省略した。遠心分離の上清を０．１ｍｌずつ２個の１．５ｍｌサンプルチューブに分取し、そのうちの一本には０．４ｍｌの１０ｍＭ ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH, in 2.5M HCl）を添加し、もう一本には同量の２．５Ｍ ＨＣｌを添加した。チューブを遮光して室温で１時間インキュベートした。この間１５分毎にチューブを振とうした。０．５ｍｌの２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を両チューブに添加し、１０分間氷中で冷却し、遠心分離（1,000 rpm×5 min）して上清を除去した。
【００３１】
新たに０．４ｍｌの１０％ＴＣＡを両チューブに添加し、ガラス棒でタンパク質の沈殿を砕き、遠心分離（1,000 rpm×5 min）して上清を除去した。遊離ＤＮＰＨと脂質の混入を除去するために、沈殿に０．４ｍｌのエタノール／酢酸エチル溶液（体積比１：１）を添加し、遠心分離（1,000 rpm×5 min）して上清を除去し、この洗浄操作を３回繰り返した。２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ２．３）に溶解した６Ｍ 塩酸グアニジンを０．２ｍｌ添加して３７℃で１０分間インキュベートした後に、遠心分離（12,000 rpm×5 min）して不溶物を除去した。ＤＮＰＨ添加反応液と２．５Ｍ ＨＣｌ添加反応液ともに吸光度（370nm）を測定した。酸化タンパク質濃度は、以下の式により計算した。
＜計算式＞
Ｃ（DNPH/ml）＝Absorption(Abs)／ε＝Ａｂｓ（370nm）／２．２×１０４／１０６＝Ａｂｓ（370nm）×４５．４５ ｎｍｏｌ／ｍｌ〔ε＝22,000/M＝22,000/106 nmol/ml〕
【００３２】
最終的に回収されたタンパク質量を測定するために、２．５Ｍ ＨＣｌ添加後の吸光度（280nm）を測定した。同時にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を６Ｍ 塩酸グアニジン溶液に溶解させた各種濃度のＢＳＡ標準液（0.25-2.0 mg/ml）を調製し、これらの吸光度を測定して検量線を作成し、サンプルのタンパク質濃度を計算した。組織サンプルの酸化タンパク質量は、沈殿として回収されたタンパク質当たりの酸化タンパク質量（ＤＮＰＨ濃度）として計算した（表示単位はnmol/mg protein）。
【００３３】
（ｄ）過酸化脂質の測定
過酸化脂質測定キット（BIOXYTECH LPO-586；OXIS International社）を用いて測定を行った。各筋を、リン酸バッファ生理食塩水（ＰＢＳ）でホモジナイズした後に遠心分離（6,500 rpm×10 min）して上清を回収し、これをサンプルとして用いた。測定は、キットに添付されたマニュアルに従って行い、Ultrospec Plus（Pharmacia International社）で５８６ｎｍの吸光度を測定した。
【００３４】
（ｅ）統計処理
得られたデータは、平均±標準誤差で表した。各測定項目の比較にはtwo-way ANOVAを用い、Fisher's PLSD post hoc testにより統計処理を行い、危険率が５％未満の場合を有意差ありとした。
【００３５】
（３）実験結果
表１に、各群ごとに被験ラットの解剖時体重、筋湿重量、ＳＯＤ活性、α−トコフェロール量、酸化タンパク質量、過酸化脂質量それぞれの平均値±標準誤差を示す。また、これらの測定値をグラフ化して図に示した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（ａ）解剖時体重
図１は、解剖時のラット体重を示すグラフである。体重は、一週間のギプス拘束により各群とも有意な減少を示した。ギプス拘束によるストレスが、体重減少の原因と考えられる。
【００３８】
（ｂ）筋湿重量
図２は、ヒラメ筋の筋湿重量を示すグラフである。Ｏ群のヒラメ筋湿重量は、非拘束であるＣ群の筋湿重量に最も近く、拘束による筋萎縮の影響が最も軽かった。また、Ｏ群のヒラメ筋湿重量は、他の拘束群であるＥ群及びＷ群との対比において、有意差（Ｐ＜０．０５）をもって筋萎縮の阻止に効果があるという結果が得られた。
図３は、非拘束であるＣ群と対比したＷ群の筋萎縮変化量を基準（抑制率０％）とした時の、Ｏ群とＥ群の筋萎縮抑制率を示すグラフである。すなわち、筋萎縮抑制率は次式により計算される。
＜計算式＞
筋萎縮抑制率（％）＝１００−筋萎縮変化率（％）
ここで、
筋萎縮変化率（％）＝（Ｃ群の筋湿重量−Ｏ群又はＥ群の筋湿重量）÷（Ｃ群の筋湿重量−Ｗ群の筋湿重量）×１００
Ｏ群及びＥ群は、ネガティブコントロールであるＷ群での筋萎縮と比べて筋萎縮の阻止が認められ、特にＯ群は、Ｅ群と比べて阻止効果が大きいことが認められた。
【００３９】
（ｃ）ＳＯＤ活性値
図４ａ及び４ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋のＳＯＤ活性値である。ヒラメ筋、足底筋ともに、Ｏ群は他の３群に対して有意な高値を示した。一方、Ｃ群、Ｅ群、Ｗ群の３群間には有意な差は見られなかった。
【００４０】
（ｄ）α−トコフェロール量
図５ａ及び５ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋のα−トコフェロール量である。ヒラメ筋、足底筋ともに、Ｅ群は他の３群に対して有意な高値を示した。一方、Ｃ群、Ｏ群、Ｗ群の３群間には有意な差は見られなかった。
【００４１】
（ｅ）酸化タンパク質量
図６ａ及び６ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋の酸化タンパク質量である。図６ａに示すヒラメ筋では、Ｃ群に対してＥ群とＷ群は有意な高値を示した。しかし、Ｃ群とＯ群の間には有意な差は見られなかった。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群がＷ群とＥ群に対して有意な低値を示した。
一方、図６ｂに示す足底筋では、ギプス拘束した３群（Ｏ群、Ｅ群、Ｗ群）は、Ｃ群に対して有意な高値を示した。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群はＥ群とＷ群に対して有意な低値を示した。
【００４２】
（ｆ）過酸化脂質量
図７ａ及び７ｂは、それぞれヒラメ筋及び足底筋の過酸化脂質量である。図７ａに示すヒラメ筋では、ギプス拘束した３群（Ｏ群、Ｅ群、Ｗ群）は、Ｃ群に対して有意な高値を示した。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群がＷ群に対して有意な低値を示した。
一方、図７ｂに示す足底筋でも、ヒラメ筋と同様に、ギプス拘束した３群（Ｏ群、Ｅ群、Ｗ群）は、Ｃ群に対して有意な高値を示した。また、ギプス拘束した３群間の比較では、Ｏ群がＥ群に対して有意な低値を示した。
【００４３】
（ｇ）結果のまとめ
筋湿重量の測定結果から、ギプス拘束しないコントロールであるＣ群と比べ、ギプス拘束し水を経口投与したネガティブコントロールであるＷ群は、廃用性筋萎縮が現れた。ギプス拘束しオキシカイン（ＳＯＤ複合体）を経口投与した実施例であるＯ群と、ギプス拘束しビタミンＥを経口投与した比較例であるＥ群は、Ｗ群と比べて筋湿重量の減少が抑制され、萎縮阻止の効果が認められた。
Ｏ群は、Ｅ群との比較でも筋萎縮抑制率が大きく、より大きな萎縮阻止の効果が認められた。この傾向は、ヒラメ筋、足底筋、腓腹筋いずれの比較においても認められたが、特にヒラメ筋の比較（図２及び図３を参照）においては有意差（Ｐ＜０．０５）をもって効果の差が認められた。
【００４４】
酸化タンパク質量及び過酸化脂質量の測定結果から、筋萎縮阻止の効果が高いＯ群において、酸化ストレスの状態がより軽減されていることが認められた。すなわち、オキシカイン（ＳＯＤ複合体）を経口投与した実施例であるＯ群における酸化タンパク質量は、比較例であるＥ群及びネガティブコントロールであるＷ群のそれと比べて有意に低い値であった（図６ａ及び図６ｂを参照）。特に、ヒラメ筋の比較（図６ａを参照）においては、Ｏ群の酸化タンパク質量は、ギプス拘束しないコントロールであるＣ群との有意差が認められなかった。また、Ｏ群の過酸化脂質量は、ヒラメ筋の比較（図７ａを参照）においてはネガティブコントロールであるＷ群と比べて有意に低い値であり、足底筋の比較（図７ｂを参照）においては比較例であるＥ群と比べて有意に低い値であった。
【００４５】
ＳＯＤ活性値及びα−トコフェロール量の結果（図４ａ、図４ｂ、図５ａ、図５ｂ）から、実施例であるＯ群は、ＳＯＤ複合体の経口投与によりＳＯＤ活性値を有意に高くする効果が認められた。一方、比較例であるＥ群では、ビタミンＥの経口投与によりα−トコフェロール量が有意に大きくなったが、ＳＯＤ活性値がそれほど高くならなかった。
また、今回の実験に用いたＯ群とＥ群の投与量は、Ｏ群でのＳＯＤ換算した投与量が１日１回、体重１ｋｇ当たり５ｍｇ〜６．２５ｍｇであったのに対して、Ｅ群でのビタミンＥ投与量が１日１回、体重１ｋｇ当たり３０ｍｇ〜３５ｍｇであり、ＳＯＤはビタミンＥよりも少ない量で優れた筋萎縮阻止の効果が認められた。
これらの結果から、実施例であるＯ群ではＳＯＤ複合体の経口投与により体内のＳＯＤ活性を直接高め、酸化ストレス及び廃用性筋萎縮に対して優れた阻止効果を発揮することが認められた。その阻止効果は、比較例であるＥ群（ＳＯＤ様作用物質であるビタミンＥの経口投与）と比べて有意に優れていた。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】被験ラットの解剖時体重を示すグラフである。
【図２】被験ラットのヒラメ筋湿重量を示すグラフである。
【図３】被験ラットのヒラメ筋湿重量について、Ｗ群の萎縮に対する筋萎縮抑制率を示すグラフである。
【図４】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋のＳＯＤ活性値を示すグラフである。
【図５】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋のα−トコフェロール量を示すグラフである。
【図６】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋の酸化タンパク質量を示すグラフである。
【図７】被験ラットのヒラメ筋及び足底筋の過酸化脂質量を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパーオキシドジスムターゼ複合体を有効成分として含有し、経口摂取用に処方された筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項２】
筋肉分解抑制剤である請求項１に記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項３】
経口用筋萎縮阻止剤である請求項１又は２に記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項４】
経口用廃用性筋萎縮阻止剤である請求項１乃至３のいずれかに記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項５】
前記スーパーオキシドジスムターゼ複合体は、スーパーオキシドジスムターゼと少なくともプロラミンとの複合体である、請求項１乃至４のいずれかに記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項１】
スーパーオキシドジスムターゼ複合体を有効成分として含有し、経口摂取用に処方された筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項２】
筋肉分解抑制剤である請求項１に記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項３】
経口用筋萎縮阻止剤である請求項１又は２に記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項４】
経口用廃用性筋萎縮阻止剤である請求項１乃至３のいずれかに記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【請求項５】
前記スーパーオキシドジスムターゼ複合体は、スーパーオキシドジスムターゼと少なくともプロラミンとの複合体である、請求項１乃至４のいずれかに記載の筋肉の酸化ストレス軽減用経口剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−６２９７６（Ｐ２００６−６２９７６Ａ）
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２４４１４５（Ｐ２００４−２４４１４５）
【出願日】平成１６年８月２４日（２００４．８．２４）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【出願人】（３９１００３９１２）コンビ株式会社 (165)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２４日（２００４．８．２４）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【出願人】（３９１００３９１２）コンビ株式会社 (165)
【Ｆターム（参考）】
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