筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法
【課題】 本発明は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ２）の治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【解決手段】 細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法、及び細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【解決手段】 細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法、及び細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）は、大脳皮質から脊髄に至る上位運動ニューロン及び脊髄から筋に至る下位運動ニューロンが選択的に障害される進行性神経変性疾患であり、神経疾患の中で最も過酷な疾患であるとされているが、その根本的な治療法は未だにない。
【０００３】
ＡＬＳはその遺伝性の有無に基づいて、孤発性ＡＬＳ（ｓｐｏｒａｄｉｃ ＡＬＳ：ＳＡＬＳ）と家族性ＡＬＳ（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＬＳ：ＦＡＬＳ）に分類され、ＦＡＬＳは全体の約５〜１０％を占める。ＦＡＬＳはもとより、ＡＬＳの大部分を占めるＳＡＬＳの発症素因を解明するためには、全てのＡＬＳに共通する運動ニューロン障害・変性の物質的背景が明らかなＦＡＬＳの原因遺伝子の研究は、重要なアプローチの一つであると考えられる。
【０００４】
これまで、ＦＡＬＳには優性遺伝性ＡＬＳ及び劣性遺伝性ＡＬＳが知られている。優性遺伝性ＡＬＳの一つであるＡＬＳ１型の原因遺伝子として、銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（Ｃｕ／Ｚｎ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ １；ＳＯＤ１）を発現するＳＯＤ１遺伝子が同定された（非特許文献１）。しかし、ＡＬＳ１が全ＡＬＳに占める割合は２％以下であり、また大部分のＳＡＬＳにはＳＯＤ１遺伝子変異が認められないことから、ＳＯＤ１遺伝子以外のＡＬＳ原因遺伝子の発見が期待されていた。
【０００５】
その後、劣性遺伝性ＡＬＳの一つである若年性劣性遺伝性ＡＬＳ（ＡＬＳ２）患者から単離されたＡＬＳ２ＣＲ６（その後、ＡＬＳ２と命名された）遺伝子に、欠失変異が認められることが報告された（非特許文献２及び３）。ＡＬＳ２遺伝子の産生タンパクはａｌｓｉｎと命名されている。ａｌｓｉｎは、シグナル伝達関連酵素であるＧＴＰａｓｅの活性化因子ＧＥＦ（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ）と機能構造的によく似たアミノ酸配列を含むことから、新規のＧＴＰａｓｅ調節因子であると考えられるが、そのタンパク質機能は未だに解明されていない。
【０００６】
これまで報告された９種類のＡＬＳ２遺伝子変異は全て欠失変異である（非特許文献２〜４）。例えば、チュニジア型には第３エクソンにおける１塩基欠失の変異（Ｔｕｎｉｓｉａｎ；１３８ｄｅｌＡ）、クエート型には第５エクソンにおける２塩基欠失の変異（Ｋｕｗａｉｔｉ；１４２５−１４２６ｄｅｌＡＧ）が認められている。これらの欠失変異遺伝子によって、ａｌｓｉｎのＣ末端の一部が切断された不完全タンパク断片が翻訳され、それによってａｌｓｉｎの本来の機能が損なわれことがＡＬＳ２の発症の主な原因であると考えられている（非特許文献２）。
【０００７】
一方、Ｔｏｌｌｉｐ（Ｔｏｌｌ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｅｒ）のアダプタータンパク質とされている。また、ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルにおいて強制発現させたＴｏｌｌｉｐはＬＰＳによって誘導されたＮＦκＢ活性を抑制する報告もあった（非特許文献５）。Ｔｏｌｌｉｐはａｌｓｉｎと結合する報告はなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎ Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：５９−６２、１９９３
【非特許文献２】Ｙａｎｇ Ｙ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２９：１０３−１０４、２００１
【非特許文献３】Ｈａｄａｎｏ Ｓ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２９：１６６−１７３、２００１
【非特許文献４】Ｋａｎｅｋｕｒａ Ｋ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７９： １９２４７−１９２５６、２００４
【非特許文献５】Ａｒｎａｕｄ Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６：７３５−７４２、２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、これまでＡＬＳの発症原因を解明するための有力な原因遺伝子であるＡＬＳ２遺伝子が同定されたものの、その産生タンパクであるａｌｓｉｎの機能は未だに判っておらず、ＡＬＳの発症機序の解明や治療方法の開発までに至らなかった。
【００１０】
そこで、本発明は、ａｌｓｉｎの細胞内機能及びそのシグナル伝達の分子メカニズムを解明することを目的の一つとし、その分子メカニズムに基づく家族性若年性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ２）の治療剤のスクリーニング方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＬＳ２遺伝子の産生タンパクであるワイルドタイプのａｌｓｉｎの結合タンパク質はＴｏｌｌｉｐであること、及びａｌｓｉｎとＴｏｌｌｉｐとの結合にはａｌｓｉｎのＭＯＲＮモチーフドメインが必要であることを見出し、ＭＯＲＮモチーフが欠失した変異ａｌｓｉｎはＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制されなくなることが、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症原因の一つであると見出した。本発明者は、また、ａｌｓｉｎが細胞質にのみ存在すること、Ｔｏｌｌｉｐが細胞質及び細胞核の両方に存在すること、並びにＴＮＦ−αによってＴｏｌｌｉｐが細胞質から細胞核へと移行することを見出し、さらに、ＴｏｌｌｉｐはＴＮＦシグナルにおいてＩＲＡＫ−１と結合し細胞死を誘導することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１２】
即ち、本発明は、まず、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症の分子メカニズム、即ち、欠失変異ａｌｓｉｎがＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制できないとの分子メカニズムに基づいたものである。かかる分子メカニズムは、本発明者が新たに見出したものであるため、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１３】
本発明は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を測定する測定工程と、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量よりも少ない場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程とを備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。本スクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１４】
本発明は、また、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症の分子メカニズム、即ち、欠失変異ａｌｓｉｎがＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制できないとの分子メカニズム、並びに、ａｌｓｉｎが細胞質にのみ存在し、Ｔｏｌｌｉｐは細胞質及び細胞核の両方に存在するとの知見に基づくものである。かかる分子メカニズム及び上記知見は、本発明者が新たに見出したものであるため、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１５】
本発明は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、被検物質の存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比が、被検物質の非存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比よりも高い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１６】
本発明は、さらに、細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症の分子メカニズム、即ち、欠失変異ａｌｓｉｎがＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制できないとの分子メカニズム、並びに、ＴＮＦシグナルにおいてＴｏｌｌｉｐはＩＲＡＫ−１と結合し細胞死を誘導するとの知見に基づくものである。かかる分子メカニズム及び上記知見は、本発明者が新たに見出したものであるため、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１７】
本発明は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を測定する測定工程と、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１８】
また、本発明の家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法において、上記家族性若年性筋萎縮性側索硬化症がＡＬＳ２遺伝子を原因遺伝子とすることが好ましい。本発明者の新たな知見から、Ｔｏｌｌｉｐに誘導される細胞死が家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症原因の一つであると考えられるため、原因遺伝子の究明は必ずしも必要ではないが、原因遺伝子がＡＬＳ２遺伝子である場合、本スクリーニング方法によれば家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤をより確実に選択することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法より選択することができる。本発明のスクリーニング方法によって選択された治療剤は、新たな家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療薬として有望であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
＜遺伝子及びタンパク質＞
まず、本発明のスクリーニング方法に関連するＡＬＳ２、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１の各遺伝子並びにこれらの産生タンパク質について説明する。なお、本明細書において、遺伝子とその産生タンパク質とが同一の名称となる場合があるが、遺伝子又はタンパク質と明記しなくても、当業者にとってどちらを指しているかは明らかである。また、疾患名とその原因遺伝子名とが同一の場合も同様である。
【００２２】
（ＡＬＳ２遺伝子及びａｌｓｉｎ）
ＡＬＳ２遺伝子は、ＡＬＳ２ＣＲ６とも呼ばれ、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子とされている。ヒトＡＬＳ２遺伝子は、元々ヒト染色体２ｑ３３に存在し、３４のエクソンを有する、全長約８０．３ｂｐの遺伝子である。ＡＬＳ２のイントロンを除いた部分の塩基配列が同定され（全長６４７０ｋｂ）、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）にＮＭ＿０２０９１９として登録されている。ＡＬＳ２のアミノ酸翻訳部分（ＣＤＳ）は４９７４ｂｐである（２００〜５１７３）。
【００２３】
ヒトＡＬＳ２の産生タンパク質はａｌｓｉｎと命名され、１６５７アミノ酸を有し、Ｎ−末端から順に４つのドメイン、ＲＬＤ、ＤＨ−ＰＨ、ＭＯＲＮ ｍｏｔｉｆｓ、及びＶＰＳ９が存在する（図１）。
【００２４】
（Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子及びその産生タンパク質）
ヒトＴｏｌｌｉｐ遺伝子は、全長が３６１５ｂｐであり、Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）にＮＭ＿０１９００９として登録されている。ＴｏｌｌｉｐのＣＤＳは８２５ｂｐ（１１２〜９３６）である。Ｔｏｌｌｉｐは２７４アミノ酸残基を有するタンパク質であり、Ｎ−末端から順に２つのドメイン、Ｃ２及びＣＵＥが存在する（図１）。
【００２５】
（ＩＲＡＫ−１遺伝子及びその産生タンパク質）
ヒトＩＲＡＫ−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １）遺伝子は、全長３５６９ｂｐであり、Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）にＮＭ＿００１５６９として登録されている。ＩＲＡＫ−１のＣＤＳは、２１３９ｂｐ（８０〜２２１８）である。ＩＲＡＫ−１は７１２アミノ酸残基を有するタンパク質である。
【００２６】
＜スクリーニング方法＞
次に、本実施形態における家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法について説明する。本発明のスクリーニング方法には、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現の抑制を指標とする第一のスクリーニング方法、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行の促進を指標とする第二のスクリーニング方法、及び細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用の阻害を指標とする第三のスクリーニング方法を含む。
【００２７】
（第一のスクリーニング方法）
まず、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現の抑制を指標とする第一のスクリーニング方法について説明する。第一のスクリーニング方法は、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える。ここで、Ｔｏｌｌｉｐの発現の抑制とは、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量（以下、第一のスクリーニング方法において、Ｔｏｌｌｉｐの発現量という）を低下させることをいう。
【００２８】
第一のスクリーニング方法において、ある被検物質が、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量を低下できるのであれば、該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤であると判定する。Ｔｏｌｌｉｐの発現量の測定方法として、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定できる、当業者にとって公知の測定系を用いることができる。具体的には、ｍＲＮＡの発現量の測定方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。また、タンパク質の発現量の測定方法として、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。この際、コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨや、β−アクチンなどのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を用い、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を標準化してもよい。Ｔｏｌｌｉｐは哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
【００２９】
第一のスクリーニング方法は、好ましく、まず、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程を行う。ここで、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞とは、発現可能なＴｏｌｌｉｐ遺伝子又はそのｃＤＮＡを含有し、かつＴｏｌｌｉｐ遺伝子の転写及び翻訳を可能とする細胞をいう。特に、ＴｏｌｌｉｐのｃＤＮＡが発現可能に挿入された発現プラスミドによりトランスフェクトされた細胞が、好ましく用いられる。Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子は既知の遺伝子であるため、当業者にとって公知の実験系、例えばＲＴ−ＰＣＲやＰＣＲなどを用いて、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子又はそのｃＤＮＡは選択的に増幅することによって得られる。また、トランスフェクト及び細胞培養は、当業者にとって公知技術である。細胞の培養時間は、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写及び発現に十分な時間があればよく、用いる細胞の種類及びプラスミドのプロモータなどによって異なるが、例えば１２〜４８時間である。
【００３０】
次に、培養したそれぞれの細胞における、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を測定する測定工程を行う。Ｔｏｌｌｉｐの発現量の測定方法として、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定できる、当業者にとって公知の測定系を用いることができる。具体的には、上述した方法がある。
【００３１】
最後に、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量よりも少ない場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程を行う。この判定工程によって最終的に細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現抑制作用のある物質を選択することができ、このような作用を有する物質は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の症状、特に運動ニューロンの障害や変性に起因する運動障害などの症状を緩和し、又はこれらの症状の進行を遅らせる若しくは阻止する可能性がある。
【００３２】
（第二のスクリーニング方法）
次に、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行の促進を指標とする第二のスクリーニング方法について説明する。第二のスクリーニング方法は、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える。
【００３３】
ここで、Ｔｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行とは、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の細胞質における存在量が減少し、細胞核における存在量が増加することをいう。また、Ｔｏｌｌｉｐの存在量とは、Ｔｏｌｌｉｐの局所のおける発現量、即ち、局所におけるＴｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量（以下、第二のスクリーニング方法において、Ｔｏｌｌｉｐの存在量）をいう。Ｔｏｌｌｉｐの存在量の測定方法は、第一のスクリーニング方法におけるＴｏｌｌｉｐの発現量の測定方法を用いることができるため、ここでの説明は省略する。Ｔｏｌｌｉｐは哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
【００３４】
第二のスクリーニング方法は、好ましく、まず、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程を含む。この培養工程は、第一のスクリーニング方法における培養工程と同様であるため、ここでの説明を省略する。
【００３５】
次に、培養したそれぞれの細胞の細胞質及び細胞核におけるＴｏｌｌｉｐの存在量を測定する測定工程を行う。このために、まず細胞を分画する必要がある。細胞分画の方法としては、細胞質画分と細胞核画分とを分けることができる、当業者にとって公知の実験系を用いることができる。例えば、市販されている様々な細胞分画キットを用いることができる。
【００３６】
最後に、被検物質の存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比が、被検物質の非存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比よりも高い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程を行う。この判定工程によって最終的に細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行促進作用のある物質を選択することができ、このような作用を有する物質は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の症状、特に運動ニューロンの障害や変性に起因する運動障害などの症状を緩和し、又はこれらの症状の進行を遅らせる若しくは阻止する可能性がある。
【００３７】
（第三のスクリーニング方法）
最後に、細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用の阻害を指標とする第三のスクリーニング方法について説明する。第三のスクリーニング方法は、細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える。ここで、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用とは、主にＴｏｌｌｉｐタンパク質とＩＲＡＫ−１タンパク質との結合をいう。相互作用の阻害とは、その作用機構を問わず、Ｔｏｌｌｉｐタンパク質とＩＲＡＫ−１タンパク質との結合量又は結合強度を低減することをいう。
【００３８】
第三のスクリーニング方法において、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系、例えば免疫沈降を利用することが可能である。具体的には、まず、培養した細胞を粉砕して細胞可溶化物を調製する。調製した細胞可溶化物にＴｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１のいずれか一方の分子に対する抗体を加えて免疫沈降を行う。そして、得られた沈殿物（Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１の複合体が含まれている）を他方の分子に対する抗体を用いた免疫学的手法（イムノブロット等）により、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１の複合体を検出、定量することにより、両者の相互作用を測定できる。Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１は哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
【００３９】
第三のスクリーニング方法は、好ましくは、まず、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞を培養する培養工程を行う。Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞としては、両者を発現している細胞、どちらか一方を発現している細胞に他方をトランスフェクションさせて両者を発現させた細胞、又は、いずれも発現していない細胞に両者をコトランスフェクションさせた細胞のいずれを用いてもよい。そして、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。培養時間は、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１とが相互作用する時間であればよく、用いる細胞の種類によって異なるが、例えば、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１をコトランスフェクトした場合、１２〜４８時間程度である。
【００４０】
次に、培養したそれぞれの細胞における、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を測定する測定工程を行う。具体的な測定方法は、上述した通りであるため、ここでの説明を省略する。
【００４１】
最後に、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程を行う。この判定工程によって最終的に細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する作用のある物質を選択することができ、このような作用を有する物質は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の症状、特に運動ニューロンの障害や変性に起因する運動障害などの症状を緩和し、又はこれらの症状の進行を遅らせる若しくは阻止する可能性がある。
【００４２】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
（ＡＬＳ２ｃＤＮＡの作製）
ＡＬＳ２遺伝子の一部を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ＫＩＡＡ１５６３（ＦＨ２０４６０）ベクターは、かずさＤＮＡ研究所より分譲された。残りの５’部分はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により合成した。ＰＣＲ反応は、Ｐａｔｅｌ Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ２０５：１５７−１６１、１９９７に記載の方法に従って行われた。テンプレートとしては、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、オリゴヌクレオチドプライマーとしては、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｔｇｔｃａｇｔｔ−３’（配列番号１）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｇａａｇｃｃｔａｇｇｃａｇａａｃａｔｃ−３’（配列番号２）を使用した。
【００４４】
次に、合成された５’部分を制限酵素ＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩによって処理した後、同様に処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ＫＩＡＡ１５６３のＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩサイトの間に挿入した。その後、ベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩによって処理し、ＡＬＳ２の全長ｃＤＮＡを得た。このＡＬＳ２全長をｐＢＳ２ベクター（ＴＯＹＯＢＯ）に組み込んだ。
【００４５】
得られたＡＬＳ２／ｐＢＳ２をテンプレートに、ａｌｓｉｎのＲＬＤ（２００〜２２１５）、ＤＨ／ＰＨ（２２０７〜３２７４）、ＭＯＲＮ（３２６９〜３９９７）及びＶＰＳ９（４４６６〜５１７０）の各ドメインに相当するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、それぞれｐＢＳ２ベクターに組み込んだ。
【００４６】
ＡＬＳ２全長及び各ドメインのｃＤＮＡの塩基配列を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、製造業者のプロトコールに従って確認した。その結果、得られたＡＬＳ２全長のｃＤＮＡが４９７４ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）ＮＭ＿０２０９１９遺伝子の塩基配列の２００〜５１７３番目と一致し、得られた各ドメインのｃＤＮＡも各ドメインの塩基配列と一致した。
【００４７】
（実施例１ ａｌｓｉｎと相互作用するタンパク質のスクリーニング）
酵母ツーハイブリッドシステム（Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）によって、ａｌｓｉｎと相互作用するタンパク質のスクリーニングを行った。ツーハイブリッド法は、Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７９：１１３２７〜１１３３５、２００４に記載の方法に従って行われた。
【００４８】
Ｂａｉｔベクターとしては、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＤＢＤ）にＡＬＳ２全長及びそれぞれのＡＬＳ２ドメインのｃＤＮＡを挿入したｐＡＳ２−１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、Ｐｒｅｙベクターとしては、酵母転写活性化ドメイン（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＡＤ）に様々な種類のｃＤＮＡライブラリーを挿入したｐＡＣＴ−２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【００４９】
ｐＡＳ２−１はＴＲＰ１遺伝子を有するため、トリプトファンフリー培地（Ｔｒｐ（−））でも生育できる。一方、ｐＡＣＴ−２はＬＥＵ２遺伝子を有するため、ロイシンフリー培地（Ｌｅｕ（−））でも生育できる。また、発現した２種類の融合タンパク質（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）が相互作用することによって複合体が形成された場合、酵母細胞リポータ遺伝子Ｈｉｓ３／ＬａｃＺが発現され、ヒスチジンフリー培地（Ｈｉｓ（−））でも生育できるようになり、また、β−ガラクトシダーゼも活性化される（図２Ｃ）。
【００５０】
Ｂａｉベクター及びＰｒｅｙベクターをともに酵母細胞ＣＧ−１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に酢酸リチウム法によって形質導入し、Ｔｒｐ（−）／Ｌｅｕ（−）／Ｈｉｓ（−）プレートに撒いて、Ｈｉｓ耐性の酵母を得た。３０℃、７日間培養した後、得られたコロニーを新たなＴｒｐ（−）／Ｌｅｕ（−）／Ｈｉｓ（−）プレートに拾い移し、さらにニトロセルロース膜に転写した。複合体が形成された場合のみ生じるβ−ガラクトシダーゼの活性化を検出するため、膜上のコロニーをＸ−ｇａｌと反応させ、β−ガラクトシダーゼの活性化により青色に変色したコロニーを陽性コロニーとした。そして、陽性コロニーのＰｒｅｙベクターに挿入された遺伝子の塩基配列をシークエンスによって特定し、さらにデータベースと照合した結果、ａｌｓｉｎの結合タンパク質として、Ｔｏｌｌｉｐを同定した。
【００５１】
（実施例２ ａｌｓｉｎにおけるＴｏｌｌｉｐとの結合ドメインの特定）
ａｌｓｉｎにおけるＴｏｌｌｉｐとの結合ドメインを特定するために、免疫沈降を行った。免疫沈降法は、Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７９：１１３２７〜１１３３５、２００４に記載の方法に従って行われた。
【００５２】
まず、図３に示すように、ＦＬＡＧタグ（５’−ｇａｃｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇ−３’；配列番号３）の下流にＡＬＳ２全長及び各ドメインのｃＤＮＡを融合タンパクが形成できるように挿入したｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を作製し、また、Ｍｙｃタグ（５’−ｇａａｃａａａａａｃｔｃａｔｃｔｃａｇａａｇａｇｇａｔｃｔｇ−３’；配列番号４）の下流にＴｏｌｌｉｐのｃＤＮＡを融合タンパクが形成できるように挿入したｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターを作製した。
【００５３】
得られた両プラスミドを共にＣＯＳ−７細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を用いて共トランスフェクトした。細胞をさらに４８時間培養した後、溶解した。細胞溶解液をまず、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、抗ＦＬＡＧ Ｍ５抗体によって免疫沈降（ＩＰ）を行った。次に、抗Ｍｙｃ抗体によって免疫染色（ＩＢ）を行った。また、抗Ｍｙｃ抗体によって免疫沈降した後、抗ＦＬＡＧ Ｍ５抗体によって免疫染色する確認も行った。その結果を図４に示した。
【００５４】
図４ＡはＡＬＳ２全長とＴｏｌｌｉｐとの相互作用を確認した結果であり、ＡＬＳ２全長とＴｏｌｌｉｐとは複合体を形成することが確認された。図４Ｂは、ＡＬＳ２の各ドメインとＴｏｌｌｉｐとの相互作用を確認した結果であり、４つのドメインのうち、ＭＯＲＮのみがＴｏｌｌｉｐと複合体形成できることが確認された。図４Ｃは、ＭＯＲＮドメインとＴｏｌｌｉｐとの相互作用を確認した結果であり、ＭＯＲＮドメインとＴｏｌｌｉｐとは複合体を形成することが確認された。以上により、ＡＬＳ２のＭＯＲＮドメインがＴｏｌｌｉｐに特異的に結合することが確認された。
【００５５】
（実施例３ ＡＬＳ２全長によるＴｏｌｌｉｐ誘導細胞死への抑制）
ＡＬＳ２全長及びＴｏｌｌｉｐを発現するベクターを、それぞれ又は共にＮＳＣ３４細胞にトランスフェクトし、７２時間後、細胞死を確認するためトリパンブルー染色を行った。ＮＳＣ３４細胞はＮｅｉｌ Ｃａｓｈｍａｎ’ｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）より分譲された。トリパンブルー染色の結果は図５に示した。
【００５６】
図５から、ＡＬＳ２全長のみトランスフェクトされたＮＳＣ３４細胞においては細胞死を殆ど起こさないが、ＴｏｌｌｉｐのみトランスフェクトされたＮＳＣ３４細胞においては約４割の細胞が細胞死を起こしたことが確認された。一方、ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐを共発現させた細胞では、Ｔｏｌｌｉｐの細胞死誘導作用が抑制されたことも確認された。コントロールは空ベクターであった。
【００５７】
ＮＳＣ３４細胞の代わりにＨＥＫ２９３細胞についても実験した。ＡＬＳ２全長のみ、Ｔｏｌｌｉｐのみ、ＡＬＳ２全長＋Ｔｏｌｌｉｐ、及びコントロールとしての空ベクターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞について、蛍光色素（ＰＩ）１００μｇ／ｍＬで染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）を用いてフローサイトメトリーを行い、細胞死を確認した。その結果を図６Ａ及び図７に示した。
【００５８】
また、ＡＬＳ２全長のみ、Ｔｏｌｌｉｐのみ、ＡＬＳ２全長＋Ｔｏｌｌｉｐ、及びコントロールとしての空ベクターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの発現量をウエスタンブロッティング（ＷＢ）によって測定した。ＷＢでは、一次抗体としてマウス抗ＦＬＡＧ ＩｇＧ抗体、又はマウス抗Ｍｙｃ ＩｇＧ抗体、コントロールとして、ラビット抗アクチンＩｇＧ抗体、また、二次抗体としては、ヤギ抗マウスＳＣ−２００５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又はヤギ抗ラビットＳＣ−２００４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用した。その結果は図６Ｂに示した。
【００５９】
図６及び図７から、ＨＥＫ２９３細胞においてもＮＳＣ３４細胞と同様な結果、すなわち、ａｌｓｉｎはＴｏｌｌｉｐの誘導した細胞死を抑制したことが確認された。
【００６０】
（実施例４ ＡＬＳ２のＭＯＲＮドメインによるＴｏｌｌｉｐ誘導細胞死への抑制）
ＡＬＳ２の各ドメインについても、ＮＳＣ３４細胞におけるＴｏｌｌｉｐの誘導した細胞死への抑制作用があるか否かについてトリパンブルー染色によって確認した。実験方法は実施例３と同じである。結果は図８に示した。図８から、４つのドメインのうち、ＭＯＲＮのみが、Ｔｏｌｌｉｐの誘導した細胞死への抑制作用があることが確認された。
【００６１】
（実施例５ ＡＬＳ２によるＴｏｌｌｉｐのＮＦκＢ抑制作用への影響）
ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルにおいて、ＴｏｌｌｉｐはＬＰＳによって誘導されたＮＦκＢ活性を抑制する報告があった。そこで、本発明者らはＡＬＳ２がＴｏｌｌｉｐによるＮＦκＢ抑制作用を影響するかどうかを調べることとした。しかし、ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルは複雑であるため、本発明者らはＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導系を用いて、ＡＬＳ２によるＴｏｌｌｉｐのＮＦκＢ抑制作用への影響を調べた。
【００６２】
まず、実験系を確立するために、ＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導の最適条件を、様々なＴＮＦ−αの処理時間及び用量を用いてスクリーニングした。スクリーニングはルシフェラーゼアッセイによって行われた。具体的には、まず、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）リポータベクターであるｐＥＬＡＭ１−Ｌｕｃに、ＮＦκＢ遺伝子をＬＵＣの上流に位置するよう導入し、ＮＦκＢ／ＬＵＣ融合タンパク質を発現するベクターを作製した。次に、この発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト２４時間後、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αによって１、２、４、８及び２４時間処理した。その後、常法によってルシフェラーゼアッセイを行い、目的遺伝子であるＮＦκＢの転写レベルを調べた。その結果を図９Ａに示した。図９Ａから、ＴＮＦ−αによる処理１時間後は、ＮＦκＢの活性が最も誘導されたことが確認された。
【００６３】
また、処理時間を１時間として、ＴＮＦ−αの濃度が１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬであるそれぞれの場合のＮＦκＢの転写レベルを調べた。その結果を図９Ｂに示した。図９Ｂから、１００ｎｇ／ｍＬの濃度ではＮＦκＢの活性が最も誘導されたことが確認された。
【００６４】
さらに、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを用いて、ＨＥＫ２９３細胞を１、２、４、８及び２４時間処理した場合の、細胞核及び細胞質におけるＮＦκＢのタンパク質発現レベルをウエスタンブロッティング（ＷＢ）法によって調べた。ＷＢにおいて、一次抗体としてラビット抗ＮＦκＢｐ６５（Ｃ−２０）ＳＣ−３７２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用い、二次抗体として、ヤギ抗ラビットＳＣ−２００４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。その結果、処理１時間後に細胞核内で発現されたＮＦκＢのタンパク質が最も多かった。
【００６５】
以上によって、ＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導の最適条件が１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αによって１時間処理することと決まった。
【００６６】
次に、ＴＮＦ−αシグナルにおいて、ＡＬＳ２及びＴｏｌｌｉｐのＮＦκＢ活性への影響を、ルシフェラーゼアッセイによって調べた。ＨＥＫ２９３細胞に、上記のＮＦκＢ／ＬＵＣ融合タンパク質を発現するｐＥＬＡＭ１−Ｌｕｃベクターと、ＡＬＳ２ＣＲ６−ＦＬＡＧ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２又は／及びＴｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３とを共トランスフェクトし、２４時間後に、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを用いて１時間処理した。その後、常法によってルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６７】
予備実験では、Ｔｏｌｌｉｐのトランスフェクト２４又は４８時間後には、ＴＮＦ−αによって処理された細胞では、ＴｏｌｌｉｐによるＮＦκＢ活性に対する影響が確認された。本実験では、トランスフェクト２４時間後の時点でＴＮＦ−α処理を行われ、様々なＡＬＳ２及びＴｏｌｌｉｐのトランスフェクト量（ベクターの用量）について調べた。その結果は、図１０Ａ及び図１０Ｂに示した。図１０Ａ及び図１０Ｂからは、ＡＬＳは用量依存的にＮＦκＢ活性を誘導しており、Ｔｏｌｌｉｐは用量依存的にＮＦκＢの活性を抑制していたことが確認された。
【００６８】
さらに、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合、ＡＬＳ２（１８７．５ｎｇ）のみ、Ｔｏｌｌｉｐ（１８７．５ｎｇ）のみ、又はＡＬＳ２（１８７．５ｎｇ）及びＴｏｌｌｉｐ（１８７．５ｎｇ）の両方によってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦκＢ活性をルシフェラーゼアッセイによって確認した。結果は図１０Ｃに示した。図１０Ｃから、ＡＬＳ２はＴｏｌｌｉｐによって抑制されたＮＦκＢ活性を部分的に回復したことも確認された。
【００６９】
以上により、ＴｏｌｌｉｐはＴＮＦ−αシグナルにおいてもＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルと同様に、ＮＦκＢの活性を抑制し、この抑制作用はＡＬＳ２によって抑制されることが確認された。
【００７０】
（実施例６ ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用）
ＴｏｌｌｉｐはＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルにおいてＩＲＡＫ−１と結合するとの報告があったが、ＴＮＦ−αシグナルにおいてはどうか調べた。実験はタンパク質同士の結合を確認できる免疫沈降法によって行われた。
【００７１】
Ｔｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、２４時間後、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを用いて１時間処理し又は処理せず、その後細胞を溶解し、免疫沈降（ＩＢ）を行った。免疫沈降において、コントロールとしてはＣｈｒｏｍ ＰｕｍＰｕｒｅ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、一次抗体としてはマウス抗ＩＲＡＫ−１（Ｆ−４）ＳＣ−５２８８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ）又はマウス抗Ｍｙｃ（９Ｂ１１）＃２２７６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ）を用い、二次抗体としてはヤギ抗マウスＳＣ−２００５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。
結果は図１１に示した。
【００７２】
図１１からは、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１とは結合し複合体を形成したこと（図１１Ａ第５レーン及び図１１Ｂ第４レーン）、及びこの結合はＴＮＦ−α処理によって抑制されたこと（図１１Ａ第８レーン及び図１１Ｂ第７レーン）が確認された。これによって、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１とはＴＮＦ−αシグナルにおいても結合すると結論付けられる。また、このことから、ＴｏｌｌｉｐはＩＲＡＫ−１を介して、ＮＦκＢの活性を抑制しているではないかと考えられる。
【００７３】
（実施例７ ＴＮＦ−αによるＴｏｌｌｉｐの細胞核への移行）
まず、細胞分画／ウエスタンブロッティングによって、ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在を調べた。具体的には、ＡＬＳ２ＣＲ６−ＦＬＡＧ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２及びＴｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３をそれぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、２４時間後、細胞を溶解し、さらに常法によって細胞分画した。その後、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）をした。ＷＢにおいて、コントロールとしては細胞核にのみ局在するＬａｍｉｎ及び細胞質にのみ局在するチューブリンを用い、一次抗体としてはマウス抗ＬａｍｉｎＢ（１０１−Ｂ７）ＮＡ１２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）又はマウス抗Ｔｕｂｌｉｎ（Ａｂ−２）（ｃｌｏｎｅ ＤＭ１Ａ）（ＬＡＢＶＩＳＩＯＮ／ＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ）を用い、二次抗体としてはヤギ抗マウスＳＣ−２００５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。結果は図１２に示した。
【００７４】
図１２からは、ａｌｓｉｎは殆ど細胞質に局在しており、一方、Ｔｏｌｌｉｐは細胞質と細胞核との両方に局在していることが確認された。
【００７５】
次に、Ｔｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についてＴＮＦ−α処理にてＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在が変化するかどうかを調べた。ＴＮＦ−α処理は１００ｎｇ／ｍＬにて４８時間までＴｏｌｌｉｐの局在の変化を経時的に確認した。結果は図１３に示した。図１３からは、ＴＮＦ−α処理により、Ｔｏｌｌｉｐの発現が減少し、そして、細胞核（Ｎ）へと移行したことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの各ドメインのイメージ図である。
【図２】Ａは酵母ツーハイブリッドシステムに使用されるＢａｉｔベクターであるＡＬＳ２ＣＲ６−ｐＡＳ２−１ベクターのイメージ図であり、Ｂは酵母ツーハイブリッドシステムに使用されるＰｒｅｙベクターであるｃＤＮＡライブラリー−ｐＡＣＴ−２ベクターのイメージ図であり、Ｃは酵母ツーハイブリッドシステムにおけるａｌｓｉｎとＴｏｌｌｉｐとが相互作用するイメージ図である。
【図３】免疫沈降に使用される各種タグ付き発現ベクターのイメージ図である。
【図４】実施例２の免疫沈降の結果を示す図である。Ａは、ＡＬＳ２全長とＴｏｌｌｉｐとの複合体の形成の有無を確認したウエスタンブロッティングの結果であり、Ｂは、ＡＬＳ２の各ドメインとＴｏｌｌｉｐとの複合体の形成の有無を確認したウエスタンブロッティングの結果であり、Ｃは、ＡＬＳ２のＭＯＲＮドメインとＴｏｌｌｉｐとの複合体の形成の有無を確認したウエスタンブロッティングの結果である。
【図５】ＮＳＣ３４細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をトリパンブルー染色によって確認した結果を示す図である。
【図６】ＡはＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をＦＡＣＳｃａｎによって確認した結果を示す図である。ＢはＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの発現量をウエスタンブロッティングによって確認した結果である。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をフローサイトメトリーによって確認した結果を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ、空ベクター、ＡＳＬ２全長発現ベクター、Ｔｏｌｌｉｐ発現ベクター、及びＡＳＬ２全長発現ベクター＋Ｔｏｌｌｉｐ発現ベクターによってトランスフェクトした細胞の結果である。
【図８】ＮＳＣ３４細胞におけるａｌｓｉｎ、その各ドメイン、及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をトリパンブルー染色によって確認した結果を示す図である。
【図９】Ａは様々な処理時間における１０ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導をルシフェラーゼアッセイによって確認した結果を示す図であり、Ｂは処理時間を１時間とした場合、様々な濃度のＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導をルシフェラーゼアッセイによって確認した結果を示す図であり、Ｃは細胞質（Ｃ）及び細胞核（Ｎ）におけるＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導レベルを確認した結果を示す図である。
【図１０】Ａは様々なＡＬＳ２のトランスフェクト量における、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合のＮＦκＢの活性誘導レベルを確認した結果を示す図であり、Ｂは様々なＴｏｌｌｉｐのトランスフェクト量における、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合のＮＦκＢの活性誘導レベルを確認した結果を示す図であり、Ｃは１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合、ＡＬＳ２のみ、Ｔｏｌｌｉｐのみ、又はＡＬＳ２及びＴｏｌｌｉｐの両方によってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦκＢ活性をルシフェラーゼアッセイによって確認した結果を示す図である。
【図１１】ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を免疫沈降によって確認した結果を示す図である。Ａ及びＢはそれぞれ、抗ＩＲＡＫ−１抗体及び抗Ｍｙｃ抗体によって免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った結果である。
【図１２】Ａ及びＢはそれぞれ、ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在をウエスタンブロッティングによって確認した結果を示す図である。細胞核はＮ、細胞質はＣで示す。
【図１３】ＴＮＦ−α処理によってＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在の変化を経時的にウエスタンブロッティングによって確認した結果を示す図である。細胞核はＮ、細胞質はＣで示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）は、大脳皮質から脊髄に至る上位運動ニューロン及び脊髄から筋に至る下位運動ニューロンが選択的に障害される進行性神経変性疾患であり、神経疾患の中で最も過酷な疾患であるとされているが、その根本的な治療法は未だにない。
【０００３】
ＡＬＳはその遺伝性の有無に基づいて、孤発性ＡＬＳ（ｓｐｏｒａｄｉｃ ＡＬＳ：ＳＡＬＳ）と家族性ＡＬＳ（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＬＳ：ＦＡＬＳ）に分類され、ＦＡＬＳは全体の約５〜１０％を占める。ＦＡＬＳはもとより、ＡＬＳの大部分を占めるＳＡＬＳの発症素因を解明するためには、全てのＡＬＳに共通する運動ニューロン障害・変性の物質的背景が明らかなＦＡＬＳの原因遺伝子の研究は、重要なアプローチの一つであると考えられる。
【０００４】
これまで、ＦＡＬＳには優性遺伝性ＡＬＳ及び劣性遺伝性ＡＬＳが知られている。優性遺伝性ＡＬＳの一つであるＡＬＳ１型の原因遺伝子として、銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ１（Ｃｕ／Ｚｎ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ １；ＳＯＤ１）を発現するＳＯＤ１遺伝子が同定された（非特許文献１）。しかし、ＡＬＳ１が全ＡＬＳに占める割合は２％以下であり、また大部分のＳＡＬＳにはＳＯＤ１遺伝子変異が認められないことから、ＳＯＤ１遺伝子以外のＡＬＳ原因遺伝子の発見が期待されていた。
【０００５】
その後、劣性遺伝性ＡＬＳの一つである若年性劣性遺伝性ＡＬＳ（ＡＬＳ２）患者から単離されたＡＬＳ２ＣＲ６（その後、ＡＬＳ２と命名された）遺伝子に、欠失変異が認められることが報告された（非特許文献２及び３）。ＡＬＳ２遺伝子の産生タンパクはａｌｓｉｎと命名されている。ａｌｓｉｎは、シグナル伝達関連酵素であるＧＴＰａｓｅの活性化因子ＧＥＦ（ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ）と機能構造的によく似たアミノ酸配列を含むことから、新規のＧＴＰａｓｅ調節因子であると考えられるが、そのタンパク質機能は未だに解明されていない。
【０００６】
これまで報告された９種類のＡＬＳ２遺伝子変異は全て欠失変異である（非特許文献２〜４）。例えば、チュニジア型には第３エクソンにおける１塩基欠失の変異（Ｔｕｎｉｓｉａｎ；１３８ｄｅｌＡ）、クエート型には第５エクソンにおける２塩基欠失の変異（Ｋｕｗａｉｔｉ；１４２５−１４２６ｄｅｌＡＧ）が認められている。これらの欠失変異遺伝子によって、ａｌｓｉｎのＣ末端の一部が切断された不完全タンパク断片が翻訳され、それによってａｌｓｉｎの本来の機能が損なわれことがＡＬＳ２の発症の主な原因であると考えられている（非特許文献２）。
【０００７】
一方、Ｔｏｌｌｉｐ（Ｔｏｌｌ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｅｒ）のアダプタータンパク質とされている。また、ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルにおいて強制発現させたＴｏｌｌｉｐはＬＰＳによって誘導されたＮＦκＢ活性を抑制する報告もあった（非特許文献５）。Ｔｏｌｌｉｐはａｌｓｉｎと結合する報告はなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎ Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：５９−６２、１９９３
【非特許文献２】Ｙａｎｇ Ｙ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２９：１０３−１０４、２００１
【非特許文献３】Ｈａｄａｎｏ Ｓ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２９：１６６−１７３、２００１
【非特許文献４】Ｋａｎｅｋｕｒａ Ｋ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７９： １９２４７−１９２５６、２００４
【非特許文献５】Ａｒｎａｕｄ Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６：７３５−７４２、２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、これまでＡＬＳの発症原因を解明するための有力な原因遺伝子であるＡＬＳ２遺伝子が同定されたものの、その産生タンパクであるａｌｓｉｎの機能は未だに判っておらず、ＡＬＳの発症機序の解明や治療方法の開発までに至らなかった。
【００１０】
そこで、本発明は、ａｌｓｉｎの細胞内機能及びそのシグナル伝達の分子メカニズムを解明することを目的の一つとし、その分子メカニズムに基づく家族性若年性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ２）の治療剤のスクリーニング方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＬＳ２遺伝子の産生タンパクであるワイルドタイプのａｌｓｉｎの結合タンパク質はＴｏｌｌｉｐであること、及びａｌｓｉｎとＴｏｌｌｉｐとの結合にはａｌｓｉｎのＭＯＲＮモチーフドメインが必要であることを見出し、ＭＯＲＮモチーフが欠失した変異ａｌｓｉｎはＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制されなくなることが、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症原因の一つであると見出した。本発明者は、また、ａｌｓｉｎが細胞質にのみ存在すること、Ｔｏｌｌｉｐが細胞質及び細胞核の両方に存在すること、並びにＴＮＦ−αによってＴｏｌｌｉｐが細胞質から細胞核へと移行することを見出し、さらに、ＴｏｌｌｉｐはＴＮＦシグナルにおいてＩＲＡＫ−１と結合し細胞死を誘導することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１２】
即ち、本発明は、まず、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症の分子メカニズム、即ち、欠失変異ａｌｓｉｎがＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制できないとの分子メカニズムに基づいたものである。かかる分子メカニズムは、本発明者が新たに見出したものであるため、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１３】
本発明は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を測定する測定工程と、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量よりも少ない場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程とを備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。本スクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１４】
本発明は、また、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症の分子メカニズム、即ち、欠失変異ａｌｓｉｎがＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制できないとの分子メカニズム、並びに、ａｌｓｉｎが細胞質にのみ存在し、Ｔｏｌｌｉｐは細胞質及び細胞核の両方に存在するとの知見に基づくものである。かかる分子メカニズム及び上記知見は、本発明者が新たに見出したものであるため、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１５】
本発明は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、被検物質の存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比が、被検物質の非存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比よりも高い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１６】
本発明は、さらに、細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症の分子メカニズム、即ち、欠失変異ａｌｓｉｎがＴｏｌｌｉｐと結合できなくなることによってＴｏｌｌｉｐが誘導した細胞死が抑制できないとの分子メカニズム、並びに、ＴＮＦシグナルにおいてＴｏｌｌｉｐはＩＲＡＫ−１と結合し細胞死を誘導するとの知見に基づくものである。かかる分子メカニズム及び上記知見は、本発明者が新たに見出したものであるため、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１７】
本発明は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を測定する測定工程と、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法により選択することができる。
【００１８】
また、本発明の家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法において、上記家族性若年性筋萎縮性側索硬化症がＡＬＳ２遺伝子を原因遺伝子とすることが好ましい。本発明者の新たな知見から、Ｔｏｌｌｉｐに誘導される細胞死が家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の発症原因の一つであると考えられるため、原因遺伝子の究明は必ずしも必要ではないが、原因遺伝子がＡＬＳ２遺伝子である場合、本スクリーニング方法によれば家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤をより確実に選択することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が全く異なる家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤を本スクリーニング方法より選択することができる。本発明のスクリーニング方法によって選択された治療剤は、新たな家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療薬として有望であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
＜遺伝子及びタンパク質＞
まず、本発明のスクリーニング方法に関連するＡＬＳ２、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１の各遺伝子並びにこれらの産生タンパク質について説明する。なお、本明細書において、遺伝子とその産生タンパク質とが同一の名称となる場合があるが、遺伝子又はタンパク質と明記しなくても、当業者にとってどちらを指しているかは明らかである。また、疾患名とその原因遺伝子名とが同一の場合も同様である。
【００２２】
（ＡＬＳ２遺伝子及びａｌｓｉｎ）
ＡＬＳ２遺伝子は、ＡＬＳ２ＣＲ６とも呼ばれ、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の原因遺伝子とされている。ヒトＡＬＳ２遺伝子は、元々ヒト染色体２ｑ３３に存在し、３４のエクソンを有する、全長約８０．３ｂｐの遺伝子である。ＡＬＳ２のイントロンを除いた部分の塩基配列が同定され（全長６４７０ｋｂ）、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）にＮＭ＿０２０９１９として登録されている。ＡＬＳ２のアミノ酸翻訳部分（ＣＤＳ）は４９７４ｂｐである（２００〜５１７３）。
【００２３】
ヒトＡＬＳ２の産生タンパク質はａｌｓｉｎと命名され、１６５７アミノ酸を有し、Ｎ−末端から順に４つのドメイン、ＲＬＤ、ＤＨ−ＰＨ、ＭＯＲＮ ｍｏｔｉｆｓ、及びＶＰＳ９が存在する（図１）。
【００２４】
（Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子及びその産生タンパク質）
ヒトＴｏｌｌｉｐ遺伝子は、全長が３６１５ｂｐであり、Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）にＮＭ＿０１９００９として登録されている。ＴｏｌｌｉｐのＣＤＳは８２５ｂｐ（１１２〜９３６）である。Ｔｏｌｌｉｐは２７４アミノ酸残基を有するタンパク質であり、Ｎ−末端から順に２つのドメイン、Ｃ２及びＣＵＥが存在する（図１）。
【００２５】
（ＩＲＡＫ−１遺伝子及びその産生タンパク質）
ヒトＩＲＡＫ−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １）遺伝子は、全長３５６９ｂｐであり、Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）にＮＭ＿００１５６９として登録されている。ＩＲＡＫ−１のＣＤＳは、２１３９ｂｐ（８０〜２２１８）である。ＩＲＡＫ−１は７１２アミノ酸残基を有するタンパク質である。
【００２６】
＜スクリーニング方法＞
次に、本実施形態における家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法について説明する。本発明のスクリーニング方法には、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現の抑制を指標とする第一のスクリーニング方法、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行の促進を指標とする第二のスクリーニング方法、及び細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用の阻害を指標とする第三のスクリーニング方法を含む。
【００２７】
（第一のスクリーニング方法）
まず、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現の抑制を指標とする第一のスクリーニング方法について説明する。第一のスクリーニング方法は、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える。ここで、Ｔｏｌｌｉｐの発現の抑制とは、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量（以下、第一のスクリーニング方法において、Ｔｏｌｌｉｐの発現量という）を低下させることをいう。
【００２８】
第一のスクリーニング方法において、ある被検物質が、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量を低下できるのであれば、該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤であると判定する。Ｔｏｌｌｉｐの発現量の測定方法として、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定できる、当業者にとって公知の測定系を用いることができる。具体的には、ｍＲＮＡの発現量の測定方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。また、タンパク質の発現量の測定方法として、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。この際、コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨや、β−アクチンなどのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を用い、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を標準化してもよい。Ｔｏｌｌｉｐは哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
【００２９】
第一のスクリーニング方法は、好ましく、まず、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程を行う。ここで、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞とは、発現可能なＴｏｌｌｉｐ遺伝子又はそのｃＤＮＡを含有し、かつＴｏｌｌｉｐ遺伝子の転写及び翻訳を可能とする細胞をいう。特に、ＴｏｌｌｉｐのｃＤＮＡが発現可能に挿入された発現プラスミドによりトランスフェクトされた細胞が、好ましく用いられる。Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子は既知の遺伝子であるため、当業者にとって公知の実験系、例えばＲＴ−ＰＣＲやＰＣＲなどを用いて、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子又はそのｃＤＮＡは選択的に増幅することによって得られる。また、トランスフェクト及び細胞培養は、当業者にとって公知技術である。細胞の培養時間は、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写及び発現に十分な時間があればよく、用いる細胞の種類及びプラスミドのプロモータなどによって異なるが、例えば１２〜４８時間である。
【００３０】
次に、培養したそれぞれの細胞における、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を測定する測定工程を行う。Ｔｏｌｌｉｐの発現量の測定方法として、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定できる、当業者にとって公知の測定系を用いることができる。具体的には、上述した方法がある。
【００３１】
最後に、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量よりも少ない場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程を行う。この判定工程によって最終的に細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現抑制作用のある物質を選択することができ、このような作用を有する物質は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の症状、特に運動ニューロンの障害や変性に起因する運動障害などの症状を緩和し、又はこれらの症状の進行を遅らせる若しくは阻止する可能性がある。
【００３２】
（第二のスクリーニング方法）
次に、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行の促進を指標とする第二のスクリーニング方法について説明する。第二のスクリーニング方法は、細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える。
【００３３】
ここで、Ｔｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行とは、Ｔｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の細胞質における存在量が減少し、細胞核における存在量が増加することをいう。また、Ｔｏｌｌｉｐの存在量とは、Ｔｏｌｌｉｐの局所のおける発現量、即ち、局所におけるＴｏｌｌｉｐ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量（以下、第二のスクリーニング方法において、Ｔｏｌｌｉｐの存在量）をいう。Ｔｏｌｌｉｐの存在量の測定方法は、第一のスクリーニング方法におけるＴｏｌｌｉｐの発現量の測定方法を用いることができるため、ここでの説明は省略する。Ｔｏｌｌｉｐは哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
【００３４】
第二のスクリーニング方法は、好ましく、まず、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程を含む。この培養工程は、第一のスクリーニング方法における培養工程と同様であるため、ここでの説明を省略する。
【００３５】
次に、培養したそれぞれの細胞の細胞質及び細胞核におけるＴｏｌｌｉｐの存在量を測定する測定工程を行う。このために、まず細胞を分画する必要がある。細胞分画の方法としては、細胞質画分と細胞核画分とを分けることができる、当業者にとって公知の実験系を用いることができる。例えば、市販されている様々な細胞分画キットを用いることができる。
【００３６】
最後に、被検物質の存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比が、被検物質の非存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比よりも高い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程を行う。この判定工程によって最終的に細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行促進作用のある物質を選択することができ、このような作用を有する物質は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の症状、特に運動ニューロンの障害や変性に起因する運動障害などの症状を緩和し、又はこれらの症状の進行を遅らせる若しくは阻止する可能性がある。
【００３７】
（第三のスクリーニング方法）
最後に、細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用の阻害を指標とする第三のスクリーニング方法について説明する。第三のスクリーニング方法は、細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える。ここで、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用とは、主にＴｏｌｌｉｐタンパク質とＩＲＡＫ−１タンパク質との結合をいう。相互作用の阻害とは、その作用機構を問わず、Ｔｏｌｌｉｐタンパク質とＩＲＡＫ−１タンパク質との結合量又は結合強度を低減することをいう。
【００３８】
第三のスクリーニング方法において、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系、例えば免疫沈降を利用することが可能である。具体的には、まず、培養した細胞を粉砕して細胞可溶化物を調製する。調製した細胞可溶化物にＴｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１のいずれか一方の分子に対する抗体を加えて免疫沈降を行う。そして、得られた沈殿物（Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１の複合体が含まれている）を他方の分子に対する抗体を用いた免疫学的手法（イムノブロット等）により、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１の複合体を検出、定量することにより、両者の相互作用を測定できる。Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１は哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
【００３９】
第三のスクリーニング方法は、好ましくは、まず、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞を培養する培養工程を行う。Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞としては、両者を発現している細胞、どちらか一方を発現している細胞に他方をトランスフェクションさせて両者を発現させた細胞、又は、いずれも発現していない細胞に両者をコトランスフェクションさせた細胞のいずれを用いてもよい。そして、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。培養時間は、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１とが相互作用する時間であればよく、用いる細胞の種類によって異なるが、例えば、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１をコトランスフェクトした場合、１２〜４８時間程度である。
【００４０】
次に、培養したそれぞれの細胞における、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を測定する測定工程を行う。具体的な測定方法は、上述した通りであるため、ここでの説明を省略する。
【００４１】
最後に、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程を行う。この判定工程によって最終的に細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する作用のある物質を選択することができ、このような作用を有する物質は、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の症状、特に運動ニューロンの障害や変性に起因する運動障害などの症状を緩和し、又はこれらの症状の進行を遅らせる若しくは阻止する可能性がある。
【００４２】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
（ＡＬＳ２ｃＤＮＡの作製）
ＡＬＳ２遺伝子の一部を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ＫＩＡＡ１５６３（ＦＨ２０４６０）ベクターは、かずさＤＮＡ研究所より分譲された。残りの５’部分はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により合成した。ＰＣＲ反応は、Ｐａｔｅｌ Ｓ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄ ２０５：１５７−１６１、１９９７に記載の方法に従って行われた。テンプレートとしては、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ ｌｉｂｒａｒｙ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、オリゴヌクレオチドプライマーとしては、Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｇｇｇｔａｃｃｇｇｔｔｇｔｃａｇｔｔ−３’（配列番号１）、及びＲｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｇａａｇｃｃｔａｇｇｃａｇａａｃａｔｃ−３’（配列番号２）を使用した。
【００４４】
次に、合成された５’部分を制限酵素ＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩによって処理した後、同様に処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ＫＩＡＡ１５６３のＫｐｎＩ及びＡｖｒＩＩサイトの間に挿入した。その後、ベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩによって処理し、ＡＬＳ２の全長ｃＤＮＡを得た。このＡＬＳ２全長をｐＢＳ２ベクター（ＴＯＹＯＢＯ）に組み込んだ。
【００４５】
得られたＡＬＳ２／ｐＢＳ２をテンプレートに、ａｌｓｉｎのＲＬＤ（２００〜２２１５）、ＤＨ／ＰＨ（２２０７〜３２７４）、ＭＯＲＮ（３２６９〜３９９７）及びＶＰＳ９（４４６６〜５１７０）の各ドメインに相当するｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、それぞれｐＢＳ２ベクターに組み込んだ。
【００４６】
ＡＬＳ２全長及び各ドメインのｃＤＮＡの塩基配列を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、製造業者のプロトコールに従って確認した。その結果、得られたＡＬＳ２全長のｃＤＮＡが４９７４ｂｐであり、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）ＮＭ＿０２０９１９遺伝子の塩基配列の２００〜５１７３番目と一致し、得られた各ドメインのｃＤＮＡも各ドメインの塩基配列と一致した。
【００４７】
（実施例１ ａｌｓｉｎと相互作用するタンパク質のスクリーニング）
酵母ツーハイブリッドシステム（Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）によって、ａｌｓｉｎと相互作用するタンパク質のスクリーニングを行った。ツーハイブリッド法は、Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７９：１１３２７〜１１３３５、２００４に記載の方法に従って行われた。
【００４８】
Ｂａｉｔベクターとしては、酵母転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＤＢＤ）にＡＬＳ２全長及びそれぞれのＡＬＳ２ドメインのｃＤＮＡを挿入したｐＡＳ２−１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、Ｐｒｅｙベクターとしては、酵母転写活性化ドメイン（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＡＤ）に様々な種類のｃＤＮＡライブラリーを挿入したｐＡＣＴ−２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【００４９】
ｐＡＳ２−１はＴＲＰ１遺伝子を有するため、トリプトファンフリー培地（Ｔｒｐ（−））でも生育できる。一方、ｐＡＣＴ−２はＬＥＵ２遺伝子を有するため、ロイシンフリー培地（Ｌｅｕ（−））でも生育できる。また、発現した２種類の融合タンパク質（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）が相互作用することによって複合体が形成された場合、酵母細胞リポータ遺伝子Ｈｉｓ３／ＬａｃＺが発現され、ヒスチジンフリー培地（Ｈｉｓ（−））でも生育できるようになり、また、β−ガラクトシダーゼも活性化される（図２Ｃ）。
【００５０】
Ｂａｉベクター及びＰｒｅｙベクターをともに酵母細胞ＣＧ−１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に酢酸リチウム法によって形質導入し、Ｔｒｐ（−）／Ｌｅｕ（−）／Ｈｉｓ（−）プレートに撒いて、Ｈｉｓ耐性の酵母を得た。３０℃、７日間培養した後、得られたコロニーを新たなＴｒｐ（−）／Ｌｅｕ（−）／Ｈｉｓ（−）プレートに拾い移し、さらにニトロセルロース膜に転写した。複合体が形成された場合のみ生じるβ−ガラクトシダーゼの活性化を検出するため、膜上のコロニーをＸ−ｇａｌと反応させ、β−ガラクトシダーゼの活性化により青色に変色したコロニーを陽性コロニーとした。そして、陽性コロニーのＰｒｅｙベクターに挿入された遺伝子の塩基配列をシークエンスによって特定し、さらにデータベースと照合した結果、ａｌｓｉｎの結合タンパク質として、Ｔｏｌｌｉｐを同定した。
【００５１】
（実施例２ ａｌｓｉｎにおけるＴｏｌｌｉｐとの結合ドメインの特定）
ａｌｓｉｎにおけるＴｏｌｌｉｐとの結合ドメインを特定するために、免疫沈降を行った。免疫沈降法は、Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７９：１１３２７〜１１３３５、２００４に記載の方法に従って行われた。
【００５２】
まず、図３に示すように、ＦＬＡＧタグ（５’−ｇａｃｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇ−３’；配列番号３）の下流にＡＬＳ２全長及び各ドメインのｃＤＮＡを融合タンパクが形成できるように挿入したｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を作製し、また、Ｍｙｃタグ（５’−ｇａａｃａａａａａｃｔｃａｔｃｔｃａｇａａｇａｇｇａｔｃｔｇ−３’；配列番号４）の下流にＴｏｌｌｉｐのｃＤＮＡを融合タンパクが形成できるように挿入したｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターを作製した。
【００５３】
得られた両プラスミドを共にＣＯＳ−７細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００を用いて共トランスフェクトした。細胞をさらに４８時間培養した後、溶解した。細胞溶解液をまず、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、抗ＦＬＡＧ Ｍ５抗体によって免疫沈降（ＩＰ）を行った。次に、抗Ｍｙｃ抗体によって免疫染色（ＩＢ）を行った。また、抗Ｍｙｃ抗体によって免疫沈降した後、抗ＦＬＡＧ Ｍ５抗体によって免疫染色する確認も行った。その結果を図４に示した。
【００５４】
図４ＡはＡＬＳ２全長とＴｏｌｌｉｐとの相互作用を確認した結果であり、ＡＬＳ２全長とＴｏｌｌｉｐとは複合体を形成することが確認された。図４Ｂは、ＡＬＳ２の各ドメインとＴｏｌｌｉｐとの相互作用を確認した結果であり、４つのドメインのうち、ＭＯＲＮのみがＴｏｌｌｉｐと複合体形成できることが確認された。図４Ｃは、ＭＯＲＮドメインとＴｏｌｌｉｐとの相互作用を確認した結果であり、ＭＯＲＮドメインとＴｏｌｌｉｐとは複合体を形成することが確認された。以上により、ＡＬＳ２のＭＯＲＮドメインがＴｏｌｌｉｐに特異的に結合することが確認された。
【００５５】
（実施例３ ＡＬＳ２全長によるＴｏｌｌｉｐ誘導細胞死への抑制）
ＡＬＳ２全長及びＴｏｌｌｉｐを発現するベクターを、それぞれ又は共にＮＳＣ３４細胞にトランスフェクトし、７２時間後、細胞死を確認するためトリパンブルー染色を行った。ＮＳＣ３４細胞はＮｅｉｌ Ｃａｓｈｍａｎ’ｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）より分譲された。トリパンブルー染色の結果は図５に示した。
【００５６】
図５から、ＡＬＳ２全長のみトランスフェクトされたＮＳＣ３４細胞においては細胞死を殆ど起こさないが、ＴｏｌｌｉｐのみトランスフェクトされたＮＳＣ３４細胞においては約４割の細胞が細胞死を起こしたことが確認された。一方、ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐを共発現させた細胞では、Ｔｏｌｌｉｐの細胞死誘導作用が抑制されたことも確認された。コントロールは空ベクターであった。
【００５７】
ＮＳＣ３４細胞の代わりにＨＥＫ２９３細胞についても実験した。ＡＬＳ２全長のみ、Ｔｏｌｌｉｐのみ、ＡＬＳ２全長＋Ｔｏｌｌｉｐ、及びコントロールとしての空ベクターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞について、蛍光色素（ＰＩ）１００μｇ／ｍＬで染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）を用いてフローサイトメトリーを行い、細胞死を確認した。その結果を図６Ａ及び図７に示した。
【００５８】
また、ＡＬＳ２全長のみ、Ｔｏｌｌｉｐのみ、ＡＬＳ２全長＋Ｔｏｌｌｉｐ、及びコントロールとしての空ベクターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの発現量をウエスタンブロッティング（ＷＢ）によって測定した。ＷＢでは、一次抗体としてマウス抗ＦＬＡＧ ＩｇＧ抗体、又はマウス抗Ｍｙｃ ＩｇＧ抗体、コントロールとして、ラビット抗アクチンＩｇＧ抗体、また、二次抗体としては、ヤギ抗マウスＳＣ−２００５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又はヤギ抗ラビットＳＣ−２００４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用した。その結果は図６Ｂに示した。
【００５９】
図６及び図７から、ＨＥＫ２９３細胞においてもＮＳＣ３４細胞と同様な結果、すなわち、ａｌｓｉｎはＴｏｌｌｉｐの誘導した細胞死を抑制したことが確認された。
【００６０】
（実施例４ ＡＬＳ２のＭＯＲＮドメインによるＴｏｌｌｉｐ誘導細胞死への抑制）
ＡＬＳ２の各ドメインについても、ＮＳＣ３４細胞におけるＴｏｌｌｉｐの誘導した細胞死への抑制作用があるか否かについてトリパンブルー染色によって確認した。実験方法は実施例３と同じである。結果は図８に示した。図８から、４つのドメインのうち、ＭＯＲＮのみが、Ｔｏｌｌｉｐの誘導した細胞死への抑制作用があることが確認された。
【００６１】
（実施例５ ＡＬＳ２によるＴｏｌｌｉｐのＮＦκＢ抑制作用への影響）
ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルにおいて、ＴｏｌｌｉｐはＬＰＳによって誘導されたＮＦκＢ活性を抑制する報告があった。そこで、本発明者らはＡＬＳ２がＴｏｌｌｉｐによるＮＦκＢ抑制作用を影響するかどうかを調べることとした。しかし、ＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルは複雑であるため、本発明者らはＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導系を用いて、ＡＬＳ２によるＴｏｌｌｉｐのＮＦκＢ抑制作用への影響を調べた。
【００６２】
まず、実験系を確立するために、ＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導の最適条件を、様々なＴＮＦ−αの処理時間及び用量を用いてスクリーニングした。スクリーニングはルシフェラーゼアッセイによって行われた。具体的には、まず、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）リポータベクターであるｐＥＬＡＭ１−Ｌｕｃに、ＮＦκＢ遺伝子をＬＵＣの上流に位置するよう導入し、ＮＦκＢ／ＬＵＣ融合タンパク質を発現するベクターを作製した。次に、この発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト２４時間後、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αによって１、２、４、８及び２４時間処理した。その後、常法によってルシフェラーゼアッセイを行い、目的遺伝子であるＮＦκＢの転写レベルを調べた。その結果を図９Ａに示した。図９Ａから、ＴＮＦ−αによる処理１時間後は、ＮＦκＢの活性が最も誘導されたことが確認された。
【００６３】
また、処理時間を１時間として、ＴＮＦ−αの濃度が１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬであるそれぞれの場合のＮＦκＢの転写レベルを調べた。その結果を図９Ｂに示した。図９Ｂから、１００ｎｇ／ｍＬの濃度ではＮＦκＢの活性が最も誘導されたことが確認された。
【００６４】
さらに、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを用いて、ＨＥＫ２９３細胞を１、２、４、８及び２４時間処理した場合の、細胞核及び細胞質におけるＮＦκＢのタンパク質発現レベルをウエスタンブロッティング（ＷＢ）法によって調べた。ＷＢにおいて、一次抗体としてラビット抗ＮＦκＢｐ６５（Ｃ−２０）ＳＣ−３７２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用い、二次抗体として、ヤギ抗ラビットＳＣ−２００４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。その結果、処理１時間後に細胞核内で発現されたＮＦκＢのタンパク質が最も多かった。
【００６５】
以上によって、ＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導の最適条件が１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αによって１時間処理することと決まった。
【００６６】
次に、ＴＮＦ−αシグナルにおいて、ＡＬＳ２及びＴｏｌｌｉｐのＮＦκＢ活性への影響を、ルシフェラーゼアッセイによって調べた。ＨＥＫ２９３細胞に、上記のＮＦκＢ／ＬＵＣ融合タンパク質を発現するｐＥＬＡＭ１−Ｌｕｃベクターと、ＡＬＳ２ＣＲ６−ＦＬＡＧ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２又は／及びＴｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３とを共トランスフェクトし、２４時間後に、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを用いて１時間処理した。その後、常法によってルシフェラーゼアッセイを行った。
【００６７】
予備実験では、Ｔｏｌｌｉｐのトランスフェクト２４又は４８時間後には、ＴＮＦ−αによって処理された細胞では、ＴｏｌｌｉｐによるＮＦκＢ活性に対する影響が確認された。本実験では、トランスフェクト２４時間後の時点でＴＮＦ−α処理を行われ、様々なＡＬＳ２及びＴｏｌｌｉｐのトランスフェクト量（ベクターの用量）について調べた。その結果は、図１０Ａ及び図１０Ｂに示した。図１０Ａ及び図１０Ｂからは、ＡＬＳは用量依存的にＮＦκＢ活性を誘導しており、Ｔｏｌｌｉｐは用量依存的にＮＦκＢの活性を抑制していたことが確認された。
【００６８】
さらに、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合、ＡＬＳ２（１８７．５ｎｇ）のみ、Ｔｏｌｌｉｐ（１８７．５ｎｇ）のみ、又はＡＬＳ２（１８７．５ｎｇ）及びＴｏｌｌｉｐ（１８７．５ｎｇ）の両方によってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦκＢ活性をルシフェラーゼアッセイによって確認した。結果は図１０Ｃに示した。図１０Ｃから、ＡＬＳ２はＴｏｌｌｉｐによって抑制されたＮＦκＢ活性を部分的に回復したことも確認された。
【００６９】
以上により、ＴｏｌｌｉｐはＴＮＦ−αシグナルにおいてもＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルと同様に、ＮＦκＢの活性を抑制し、この抑制作用はＡＬＳ２によって抑制されることが確認された。
【００７０】
（実施例６ ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用）
ＴｏｌｌｉｐはＩＬ−１Ｒ／ＴＬＲシグナルにおいてＩＲＡＫ−１と結合するとの報告があったが、ＴＮＦ−αシグナルにおいてはどうか調べた。実験はタンパク質同士の結合を確認できる免疫沈降法によって行われた。
【００７１】
Ｔｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、２４時間後、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを用いて１時間処理し又は処理せず、その後細胞を溶解し、免疫沈降（ＩＢ）を行った。免疫沈降において、コントロールとしてはＣｈｒｏｍ ＰｕｍＰｕｒｅ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、一次抗体としてはマウス抗ＩＲＡＫ−１（Ｆ−４）ＳＣ−５２８８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ）又はマウス抗Ｍｙｃ（９Ｂ１１）＃２２７６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｓ）を用い、二次抗体としてはヤギ抗マウスＳＣ−２００５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。
結果は図１１に示した。
【００７２】
図１１からは、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１とは結合し複合体を形成したこと（図１１Ａ第５レーン及び図１１Ｂ第４レーン）、及びこの結合はＴＮＦ−α処理によって抑制されたこと（図１１Ａ第８レーン及び図１１Ｂ第７レーン）が確認された。これによって、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１とはＴＮＦ−αシグナルにおいても結合すると結論付けられる。また、このことから、ＴｏｌｌｉｐはＩＲＡＫ−１を介して、ＮＦκＢの活性を抑制しているではないかと考えられる。
【００７３】
（実施例７ ＴＮＦ−αによるＴｏｌｌｉｐの細胞核への移行）
まず、細胞分画／ウエスタンブロッティングによって、ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在を調べた。具体的には、ＡＬＳ２ＣＲ６−ＦＬＡＧ−ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２及びＴｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３をそれぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、２４時間後、細胞を溶解し、さらに常法によって細胞分画した。その後、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）をした。ＷＢにおいて、コントロールとしては細胞核にのみ局在するＬａｍｉｎ及び細胞質にのみ局在するチューブリンを用い、一次抗体としてはマウス抗ＬａｍｉｎＢ（１０１−Ｂ７）ＮＡ１２（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）又はマウス抗Ｔｕｂｌｉｎ（Ａｂ−２）（ｃｌｏｎｅ ＤＭ１Ａ）（ＬＡＢＶＩＳＩＯＮ／ＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ）を用い、二次抗体としてはヤギ抗マウスＳＣ−２００５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いた。結果は図１２に示した。
【００７４】
図１２からは、ａｌｓｉｎは殆ど細胞質に局在しており、一方、Ｔｏｌｌｉｐは細胞質と細胞核との両方に局在していることが確認された。
【００７５】
次に、Ｔｏｌｌｉｐ−Ｍｙｃ−ｐｃＤＮＡ３によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞についてＴＮＦ−α処理にてＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在が変化するかどうかを調べた。ＴＮＦ−α処理は１００ｎｇ／ｍＬにて４８時間までＴｏｌｌｉｐの局在の変化を経時的に確認した。結果は図１３に示した。図１３からは、ＴＮＦ−α処理により、Ｔｏｌｌｉｐの発現が減少し、そして、細胞核（Ｎ）へと移行したことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの各ドメインのイメージ図である。
【図２】Ａは酵母ツーハイブリッドシステムに使用されるＢａｉｔベクターであるＡＬＳ２ＣＲ６−ｐＡＳ２−１ベクターのイメージ図であり、Ｂは酵母ツーハイブリッドシステムに使用されるＰｒｅｙベクターであるｃＤＮＡライブラリー−ｐＡＣＴ−２ベクターのイメージ図であり、Ｃは酵母ツーハイブリッドシステムにおけるａｌｓｉｎとＴｏｌｌｉｐとが相互作用するイメージ図である。
【図３】免疫沈降に使用される各種タグ付き発現ベクターのイメージ図である。
【図４】実施例２の免疫沈降の結果を示す図である。Ａは、ＡＬＳ２全長とＴｏｌｌｉｐとの複合体の形成の有無を確認したウエスタンブロッティングの結果であり、Ｂは、ＡＬＳ２の各ドメインとＴｏｌｌｉｐとの複合体の形成の有無を確認したウエスタンブロッティングの結果であり、Ｃは、ＡＬＳ２のＭＯＲＮドメインとＴｏｌｌｉｐとの複合体の形成の有無を確認したウエスタンブロッティングの結果である。
【図５】ＮＳＣ３４細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をトリパンブルー染色によって確認した結果を示す図である。
【図６】ＡはＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をＦＡＣＳｃａｎによって確認した結果を示す図である。ＢはＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの発現量をウエスタンブロッティングによって確認した結果である。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞におけるａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をフローサイトメトリーによって確認した結果を示す図である。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ、空ベクター、ＡＳＬ２全長発現ベクター、Ｔｏｌｌｉｐ発現ベクター、及びＡＳＬ２全長発現ベクター＋Ｔｏｌｌｉｐ発現ベクターによってトランスフェクトした細胞の結果である。
【図８】ＮＳＣ３４細胞におけるａｌｓｉｎ、その各ドメイン、及びＴｏｌｌｉｐによる細胞死への影響をトリパンブルー染色によって確認した結果を示す図である。
【図９】Ａは様々な処理時間における１０ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導をルシフェラーゼアッセイによって確認した結果を示す図であり、Ｂは処理時間を１時間とした場合、様々な濃度のＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導をルシフェラーゼアッセイによって確認した結果を示す図であり、Ｃは細胞質（Ｃ）及び細胞核（Ｎ）におけるＴＮＦ−αによるＮＦκＢの活性誘導レベルを確認した結果を示す図である。
【図１０】Ａは様々なＡＬＳ２のトランスフェクト量における、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合のＮＦκＢの活性誘導レベルを確認した結果を示す図であり、Ｂは様々なＴｏｌｌｉｐのトランスフェクト量における、１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合のＮＦκＢの活性誘導レベルを確認した結果を示す図であり、Ｃは１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αによって１時間処理した又は処理しない場合、ＡＬＳ２のみ、Ｔｏｌｌｉｐのみ、又はＡＬＳ２及びＴｏｌｌｉｐの両方によってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦκＢ活性をルシフェラーゼアッセイによって確認した結果を示す図である。
【図１１】ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を免疫沈降によって確認した結果を示す図である。Ａ及びＢはそれぞれ、抗ＩＲＡＫ−１抗体及び抗Ｍｙｃ抗体によって免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った結果である。
【図１２】Ａ及びＢはそれぞれ、ａｌｓｉｎ及びＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在をウエスタンブロッティングによって確認した結果を示す図である。細胞核はＮ、細胞質はＣで示す。
【図１３】ＴＮＦ−α処理によってＴｏｌｌｉｐの細胞内の局在の変化を経時的にウエスタンブロッティングによって確認した結果を示す図である。細胞核はＮ、細胞質はＣで示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞における、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を測定する測定工程と、
被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量よりも少ない場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、
を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞の細胞質及び細胞核におけるＴｏｌｌｉｐの存在量を測定する測定工程と、
被検物質の存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比が、被検物質の非存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比よりも高い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、
を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞における、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を測定する測定工程と、
被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、
を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記家族性若年性筋萎縮性側索硬化症が、ＡＬＳ２遺伝子を原因遺伝子とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現を抑制する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞における、Ｔｏｌｌｉｐの発現量を測定する測定工程と、
被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐの発現量よりも少ない場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、
を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
細胞におけるＴｏｌｌｉｐの細胞質から細胞核への移行を促進する物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐを発現する細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞の細胞質及び細胞核におけるＴｏｌｌｉｐの存在量を測定する測定工程と、
被検物質の存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比が、被検物質の非存在下において培養した細胞における細胞質のＴｏｌｌｉｐの存在量と細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量との合計に対する細胞核のＴｏｌｌｉｐの存在量の比よりも高い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、
を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を阻害する物質を、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する工程を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、Ｔｏｌｌｉｐ及びＩＲＡＫ−１を発現する細胞を培養する培養工程と、
培養したそれぞれの細胞における、ＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用を測定する測定工程と、
被検物質の存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＴｏｌｌｉｐとＩＲＡＫ−１との相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤と判定する判定工程と、
を備える、家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記家族性若年性筋萎縮性側索硬化症が、ＡＬＳ２遺伝子を原因遺伝子とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の家族性若年性筋萎縮性側索硬化症の治療剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−６１５０５（Ｐ２００８−６１５０５Ａ）
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３９４２２（Ｐ２００６−２３９４２２）
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【Ｆターム（参考）】
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