筋萎縮性側索硬化症の治療
【課題】運動ニューロン疾患の治療法、より具体的には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療法の提供。
【解決手段】前臨床ＡＬＳ動物モデルへの少量の血管内皮増殖因子の脳室内送達による、該動物の有意な運動性能及び生存時間の延長を誘導する方法。血管内皮増殖因子の投与はくも膜下腔内、あるいは脳室内に行われる。さらに該因子の連続的な投与は埋め込まれた浸透圧ミニポンプを介して行われる。該因子は０．０５〜１μg/kg/日の範囲内の用量で投与される。
【解決手段】前臨床ＡＬＳ動物モデルへの少量の血管内皮増殖因子の脳室内送達による、該動物の有意な運動性能及び生存時間の延長を誘導する方法。血管内皮増殖因子の投与はくも膜下腔内、あるいは脳室内に行われる。さらに該因子の連続的な投与は埋め込まれた浸透圧ミニポンプを介して行われる。該因子は０．０５〜１μg/kg/日の範囲内の用量で投与される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、運動ニューロン疾患の処置に関する。より具体的には、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置に関する。前臨床ＡＬＳ動物モデルへの少量の血管内皮増殖因子の脳室内送達が、該動物の有意な運動性能及び生存時間の延長を誘導することが見出される。
【０００２】
発明の序論
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、発症後３〜５年以内に患者を死亡させる、壊滅的な麻痺障害である1-4。臨床症状は、主に、脊髄及び脳幹における運動ニューロンの進行性の変性に起因し、認知機能は概して残される。その疾患は、家族歴のない症例の＞９０％において散発的に中年期の健康な個体に影響を与える。６０歳未満では女性より男性の方が多く影響を受けるが、それより高い年齢では男女とも同様に影響を受ける5。３番目に多い神経変性性障害であるＡＬＳに罹患する個体は、集団が加齢するほど、多くなる6。多くのＡＬＳ患者が、四肢における筋力低下を最初に認める（「四肢発症型」ＡＬＳ）。ＡＬＳ患者のおよそ２５％においては、最初に脳幹の運動核において運動ニューロンが変性し（「球発症型」ＡＬＳ）、構語障害、嚥下困難、及び呼吸器障害を引き起こす。球発症型ＡＬＳ患者は、一般に、四肢発症型患者より速くかつ攻撃的な疾患進行を示すが、後者も最終的には球症状を発症する。ほとんどの場合、運動ニューロン変性の正確な原因は、概して謎のままである2,4,7。ＳＯＤ−１突然変異は、ヒトにおいて、そして過剰発現させた場合にはトランスジェニックマウスにおいても、運動ニューロン変性を引き起こす。実際、ＳＯＤ−１G93Aマウスは、新規薬物候補の治療可能性を査定するための最も標準的な動物モデルとなっている8。ＳＯＤ−１G93Aラットは、攻撃的な型のＡＬＳを発症するが、新規治療の評価には未だ使用されていない9,10。ＡＬＳのための認可された有効な治療法は、未だ利用可能となっていない。リルゾール（Riluzole）は、全てではないがいくつかの国において認可されている唯一の薬物であるが、生存率に対してわずかな効果しか示さず、高価であり、副作用がないわけではなく、そして重要なこととして、球症状に対しては効果がない16。ＡＬＳは運動ニューロンの変性に起因するため、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン（cardiotrophin）（ＣＴ）−１、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような神経栄養性の増殖因子が、長い間、ＡＬＳのための治療候補と見なされてきた。逆行性に軸索輸送されたウイルスベクターを使用したＧＤＮＦ、特にＩＧＦ−１の遺伝子導入は、ＳＯＤ−１G93Aマウスの生存を延長することが示された17,18。臨床試験が進行中であるがｃ、ＡＬＳのための遺伝子治療の臨床的な適用可能性は未だ確立されておらず、不可逆性に関する問題、有害な染色体効果のリスク、トランスジーン発現の不十分な調節、及び大量生産の必要が、未だ克服されていない。従って、その代わりに、組換え神経栄養性増殖因子を送達することは、投与されるタンパク質の用量及び投与期間の柔軟な調節を可能とするため、魅力的な治療戦略である。しかしながら、ある研究において、ＩＧＦ−１送達後に疾患進行が２６％遅れ、もう一つの研究においてはそうでなかったことを除いて21,22、ＢＤＮＦのくも膜下腔内注入19、ＧＤＮＦの脳室内送達ａ、又はＢＤＮＦbもしくはＣＮＴＦ20の全身投与は、現在のところ、ＡＬＳ患者における実質的な臨床的改善をもたらしていない。失敗の少なくとも一部は、これらのタンパク質の全身送達後の短い半減期、免疫原性、ニューロンの生存対アポトーシスに対する用量依存的な二重の効果、望まれない毒性、及び血液脳関門通過能の限界によるかもしれない23-25。もう一つの可能性のある理由は、これらの因子のいくつかは、外因的に供給された場合、急性の損傷を受けた運動ニューロンの生存は促進しても、ＡＬＳのような慢性疾患における成人運動ニューロン生存の内因性の調節においてはそのような重要な役割を果たし得ないという事実に関係しているかもしれない。本発明者らは、低いＶＥＧＦレベルが、運動ニューロンの発達にとっては不必要であるが、遺伝学的に修飾されたマウスにおいて成人発症型ＡＬＳ様運動ニューロン変性を引き起こし（ＷＯ０１７６６２０）、ヒトにおける散発性及び家族性のＡＬＳのリスクも増加させることを最近発見した13-15。ＶＥＧＦは、健康及び疾患における血管増殖に関与しているプロトタイプの血管形成因子である11,12。免疫の問題及び全身性副作用を回避し、ＶＥＧＦの血液脳関門を通過する能力の限界を克服し、脊髄実質における最大のＶＥＧＦタンパク質レベルを達成するため、本発明者らは、ＡＬＳのトランスジェニックＳＯＤ−１G93Aラットモデルを使用して、前臨床ＡＬＳ研究において組換えタンパク質の治療可能性を調査するため、即ち、長期にわたり組換えＶＥＧＦを脳室内送達するため、以前には使用されたことがない戦略を開発した。驚くべきことに、本発明者らは、極めて低レベルのＶＥＧＦが、運動性能を有意に改善するのみならず、予想外の長い時間、ラット前臨床ＡＬＳモデルにおける生存時間を延長することを見出した。結果は、低レベルのＶＥＧＦが脳室内投与された場合、ＡＬＳに罹患した患者の疾患進行を遅延させ得ることを示している。
【０００３】
発明の詳細な説明
本発明は、少量のＶＥＧＦの脳室内（ＩＣＶ）送達が、攻撃的な型のＡＬＳに罹患したラット系統の発症を遅らせ、運動性能を改善し、生存を延長することを示す。これは、前臨床ＡＬＳモデルにおける疾患特徴に対する組換え増殖因子の有意な治療効果を示す最初の研究である。ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、及びＧＤＮＦを含む、既知の神経栄養活性を有するいくつかの組換え増殖因子が、ＡＬＳ患者又はＳＯＤ１G93Aマウスにおいて評価されているが、実質的な利益を一貫して提供した組換え増殖因子は一つもなく19-22,35、従って、以前の臨床試験の失敗以来19-22、組換え増殖因子の投与は大きく魅力を失っていた。本発明者らがここで示すように、ＶＥＧＦは、ｉｎ ｖｉｖｏの運動ニューロンに対する直接的な効果を有している。ＶＥＧＦがｉｎ ｖｉｖｏの様々なニューロン過程に影響を与えることは既知であるが15、ＶＥＧＦが、ニューロンに対して直接的に効果を発揮するのか、又は他の細胞型を通して、もしくは他の分子的中間体を介して間接的に効果を発揮するのかは確立されていなかった。このように、ＶＥＧＦは、多面的な活性スペクトルを有しており、それが、本発明における注目すべき治療的利益に寄与したのかもしれない。本発明は、ＶＥＧＦが、運動ニューロン障害の処置、より具体的には筋萎縮性側索硬化症及び筋萎縮性側索硬化症様疾患の処置のための医薬品を製造するために使用され得ることを示す。特定の実施態様において、ＶＥＧＦ165−アイソフォームが、運動ニューロン障害の処置、より具体的には筋萎縮性側索硬化症及び筋萎縮性側索硬化症様疾患の処置のための医薬品の製造のために使用され、ここで、該ＶＥＧＦは発症の場所の近くに連続的に投与される。ＶＥＧＦ165は、典型的にはヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）と呼ばれる１６５アミノ酸タンパク質である。ＶＥＧＦは、オルタナティブＲＮＡスプライシングに起因する複数のホモダイマー型（１モノマー当たり１２１、１４５、１６５、１８９、及び２０６アミノ酸）として多様な組織において発現される。ＶＥＧＦ121は、ヘパリンに結合しない可溶性の有系分裂促進物質であり；ＶＥＧＦの型が長くなるほど、次第に高い親和性でヘパリンに結合するようになる。ヘパリン結合型ＶＥＧＦは、プラスミンによりカルボキシ末端で切断され、（一つ又は複数の）拡散型のＶＥＧＦを放出し得る。さらに、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅを含む、ＶＥＧＦと構造的に関係のあるいくつかの分子も、最近同定されている。Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocr. Rev., Ogawa et al.(1998) J.Biological Chem.273: 31273-31281; Meyer et al.(1999) EMBO J.,18: 363-374。「医薬組成物」又は「医薬品」又は「を処置するための医薬品の製造のための使用」という用語は、上に示されたような運動ニューロン疾患を処置するための、上記のようなＶＥＧＦ及び医薬的に許容される担体又は賦形剤（両方の用語は、交換可能に使用され得る）を含む組成物に関する。当業者に既知の適当な担体又は賦形剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、不揮発性油、オレイン酸エチル、５％デキストロースを含む生理食塩水、等張性及び化学的安定性を増強する物質、緩衝液、並びに保存剤である。その他の適当な担体には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体型アミノ酸、及びアミノ酸共重合体のような組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生を、それ自体、誘導しない担体が含まれる。特定の実施態様において、「医薬品」は、発症の場所の近くに、ある方法により投与され得る。実際、ＶＥＧＦレベル及び治療的利益の空間的な勾配は、有意なＣＳＦ代謝回転にも関わらず、ＶＥＧＦが注射部位の近傍に沈着することを示している。これは、ＶＥＧＦ療法を患者の必要に適合させる新規の機会を提示し得る。実際、球発症型のＡＬＳに罹患した個体は、頸髄レベルにおけるＶＥＧＦのＩＣＶ又はくも膜下腔内送達から、より多くの利益を得ることができ、腰髄発症型のＡＬＳ患者は、腰髄レベルにおけるＶＥＧＦのくも膜下腔内注入から、より多くの利益を得ることができる。一般に、医薬品は、ＶＥＧＦ、より具体的にはＶＥＧＦ165が、０．０１〜１．５μg/kg/日、より好ましくは０．０５〜１μg/kg/日、最も好ましくは０．２〜０．８μg/kg/日の用量で与えられるよう、投与される。好ましくは、連続的な注入が使用され、浸透圧ミニポンプを介した連続的な皮下送達を含む。もう一つの実施態様において、ＶＥＧＦ165は、ＶＥＧＦ165が０．０５〜１μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与される、運動ニューロン疾患を処置するための医薬品の製造のために使用される。もう一つの実施態様において、ＶＥＧＦ165は、ＶＥＧＦが０．２〜０．８μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与される、運動ニューロン疾患を処置するための医薬品の製造のために使用される。もう一つの実施態様において、該発症に近い投与は、くも膜下腔内投与である。もう一つの実施態様において、該発症に近い投与は、脳室内投与である。ＶＥＧＦ165の投与が、０．０１〜１．４μg/kg/日又は０．０１〜１．３μg/kg/日又は０．０１〜１．２μg/kg/日又は０．０１〜１．１μg/kg/日又は０．０１〜１μg/kg/日又は０．０１〜０．９μg/kg/日又は０．０１〜０．８μg/kg/日又は０．０１〜０．７μg/kg/日又は０．０１〜０．６μg/kg/日又は０．０１〜０．５μg/kg/日又は０．０１〜０．４μg/kg/日又は０．０１〜０．３μg/kg/日又は０．０１〜０．２μg/kg/日又は０．０１〜０．１μg/kg/日又は０．０１〜０．０９μg/kg/日又は０．０１〜０．０８μg/kg/日又は０．０１〜０．０７μg/kg/日又は０．０１〜０．０６μg/kg/日又は０．０１〜０．０５μg/kg/日又は０．０１〜０．０４μg/kg/日又は０．０１〜０．０３μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与されることも明らかであるべきである。ＶＥＧＦ165の投与が、０．０２〜１．５μg/kg/日又は０．０３〜１．５μg/kg/日又は０．０４〜１．５μg/kg/日又は０．０５〜１．５μg/kg/日又は０．０６〜１．５μg/kg/日又は０．０７〜１．５μg/kg/日又は０．０８〜１．５μg/kg/日又は０．０９〜１．５μg/kg/日又は０．１〜１．５μg/kg/日又は０．２〜１．５μg/kg/日又は０．３〜１．５μg/kg/日又は０．４〜１．５μg/kg/日又は０．５〜１．５μg/kg/日又は０．６〜１．５μg/kg/日又は０．７〜１．５μg/kg/日又は０．８〜１．５μg/kg/日又は０．９〜１．５μg/kg/日又は１〜１．５μg/kg/日又は１．１〜１．５μg/kg/日又は１．２〜１．５μg/kg/日又は１．３〜１．５μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与されることも明らかであるべきである。従って、特定の実施態様において、ＶＥＧＦを含む組成物の注入は、くも膜下腔内である。くも膜下腔内投与は、例えば、外科的にポンプを埋め込み、脊椎へとカテーテルを送ることによって実施され得る。本発明を明確にするため、「運動ニューロン疾患」という用語を、以下に説明する。運動ニューロン疾患とは、筋肉活動を調節する中枢神経系の神経である前角細胞の変性を含む疾患の群である。これは、筋系を徐々に衰弱させ、最終的には消耗（委縮）をもたらす。運動ニューロンの疾患は、上位運動ニューロン（ＵＭＮ）及び／又は下位運動ニューロン（ＬＭＮ）の関与によって分類される。上位運動ニューロンは、脳、特に運動皮質から発生し、下位運動ニューロンと直接的又は間接的にシナプス接合する。上位運動ニューロンは、より正確には、プレモトニューロン（pre-motoneurons）と呼ばれ、運動のための下行性の命令の伝達を担っている。下位運動ニューロンは、内臓運動ニューロン及び体性運動ニューロンという２つのカテゴリーへと工夫できる。内臓運動ニューロンとは、腺、血管、及び平滑筋を神経支配する節ニューロンの活動を制御する自律神経節前ニューロンである。体性運動ニューロンは、骨格筋を神経支配し、第１に、その名称が暗示するように脊髄の前角に位置する前角細胞を含み、第２に、脳神経核に位置する下位運動ニューロンを含む。筋萎縮性側索硬化症又はＡＬＳは、運動ニューロン障害の最も高頻度の型である（全症例のおよそ８０％を占める）。ＡＬＳは、有名なヤンキース（Yankee）の野球選手にちなんで命名されたルーゲーリッグ（Lou Gehrig's）病として既知である。ＡＬＳの初期症状は、手及び脚の衰弱であり、影響を受けた筋肉の繊維束形成である場合も多い。いずれの肢が最初に影響を受けたとしても、最終的には四肢全てが影響を受ける。上位運動ニューロンへの傷害は、筋力低下、痙縮、及び機能亢進性の深部腱反射を生ずる。下位運動ニューロン傷害は、委縮、繊維束形成、無気力、及び減少した深部腱反射を伴う筋力低下を生ずる。ＡＬＳは、脳神経の上位及び下位両方の運動ニューロンの特色を有し、従って、症状は頭部及び頸部に隔離されている。脳神経のＵＭＮ関与を示す患者もおり、これが唯一の徴候である場合、それは仮性球麻痺と呼ばれる。脊髄筋萎縮症又は進行性筋萎縮症は、脳神経を含まない、下位運動ニューロン変性による運動ニューロン疾患である。シャイドレーガー（Shy-Drager）症候群は、体位性低血圧、失禁、発汗、筋硬直、及び振戦を特徴とし、交感神経繊維が発生する脊髄内の胸髄核からのニューロンの欠損を特徴とする。脊髄の破壊的な病変は、前角細胞の欠損をもたらす。これは、大きな液体が充填された嚢胞が頚部脊髄の中心に形成される脊髄髄膜瘤及び脊髄空洞症において見られる。
【０００４】
ＶＥＧＦによる有益な効果は、本発明において、この組換え増殖因子が、脳脊髄液（ＣＳＦ）へと連続的かつ直接的に送達されたという事実と関係しており−従って、ＡＬＳのより大きなＳＯＤ１G93Aラットモデルの利用可能性が役に立った。体内分布データは、ＶＥＧＦが、ＩＣＶ送達後、ＣＳＦから脊髄実質へと迅速に拡散し、従って、下位脊髄運動ニューロンに達し得ることを示しているが、利益のうちのいくらかは、上位運動ニューロンに対する効果から得られた可能性を排除することはできない。（腰部脊髄より脳幹の方が高い）ＶＥＧＦの体内分布と、その治療効果との間の密接な相関は、ＶＥＧＦが、そのレベルが最も高い部位で最も大きな効果を誘導したことを示している。ＶＥＧＦは（その他のニューロトロフィンと同様に38）３時間を過ぎると中枢神経系から除去されるため、ＶＥＧＦの連続的な送達が有益な効果に寄与した可能性が高い。その他の理由は、ＩＣＶ投与されたＶＥＧＦの一般安全性プロファイル（毒性しきい値より１０倍低い治療用量を使用した場合、顕著な有害効果は観察され得なかった）及び（その他の方法では中和抗体を誘導するかもしれない）免疫応答の欠如に関係しているかもしれない。ＶＥＧＦを全身送達した場合には免疫反応が起こったが、ＶＥＧＦの無視し得る程度の血液脳関門通過は、大量の（毒性である可能性が高い）ＶＥＧＦの全身投与によってのみ克服されるであろう。
【０００５】
ＩＣＶ送達は、一見、面倒に思われるかもしれないが、技術的に実行可能であり、他の慢性神経学的適応症のため既に適用されている43。ポンプを位置決めするための単一の外科的介入の不便は、実際、この投与経路の利益（全身性副作用及び免疫応答の欠如；調節可能な投与）より大きくまさっているかもしれない。本発明者らの以前の遺伝学的データは、ＶＥＧＦが散発性ＡＬＳにも家族性ＡＬＳにも影響を与えることを示している14。本発明者らは、本発明において、家族性ＡＬＳの動物モデルのみを使用することができたが、ＶＥＧＦがＡＬＳの散発例においても有効である見込みは十分にある。結局、ＶＥＧＦは、ストレス（低酸素、興奮毒性、血清欠乏、突然変異体ＳＯＤ１関連毒性等）の種類に関わらず、様々な型のニューロンのための生存効果を有しており、従って、魅力的な候補である15。ＶＥＧＦ療法は、安全であり、血管側を引き起こすことなく長期にわたりよく容認されるようである。本発明者らの所見は、ＶＥＧＦが異なる濃度で定性的に異なる生物学的活性（血管浸透性、血管形成）を有することが既知であるという以前の観察を拡張する57。さらに、低いＶＥＧＦレベルは、脳実質へ直接的に送達された場合には、虚血／損傷脳における血管形成のみを刺激するが、ＣＳＦに送達された場合にはそうではない48,58。
【０００６】
実施例
１．組換えＶＥＧＦの全身送達対脳室内送達
本発明者らは、まず、いずれの経路（即ち、全身又は脳室内）を介して、ＶＥＧＦが最もよく投与されるであろうかを評価した。ＡＬＳの安全かつ有効な増殖因子療法は、タンパク質の投与が、免疫応答を開始させずに又は全身的な有害効果を誘導せずに、脊髄実質における十分に高い、即ち治療的なレベルをもたらすことを必要とする。初期の研究は、全ての商業的に入手可能な組換えのヒト、ラット、又はマウスのＶＥＧＦ調製物が、２日毎に１μg（血管形成を刺激するための治療的用量37）でマウスに腹腔内投与された場合、２週間以内に強い免疫応答を引き起こすことを示した。我々の大腸菌により産生されたマウスＶＥＧＦを使用した場合、最適な結果が得られたが、この調製物ですら、４週間以内に免疫応答を引き起こし、従って、ＶＥＧＦの慢性全身送達は妨げられた。さらに、ＶＥＧＦは親水性であり、４４kDaという分子量を有し、従って、注射された用量の１％超の効率で血液脳関門又は血液脳脊髄液（ＣＳＦ）関門を通過する可能性は低い38。従って、脊髄実質における十分なＶＥＧＦレベルを入手するためには、毒性の全身性副作用を誘導する可能性が高い過剰量のＶＥＧＦが投与されなければならないであろう。さらに、ＶＥＧＦは、ヘパラン硫酸リッチな細胞外マトリックスによって組織内に捕獲されるのみならず、可溶性Ｆｌｔ１（ｓＦｌｔ１）、即ち、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ１とも呼ばれる）の細胞外リガンド結合ドメインによって血漿中にも捕獲される39,40。しかしながら、本発明者らは、マウスにおいて脳脊髄液より５倍高い血清中の可溶性Ｆｌｔ１レベルを検出した（３，８００±５９４pg/ml対８１０±６６pg/ml；Ｎ＝３；Ｐ＜０．０５）。従って、全身投与された場合には、脳室内投与された場合より大きなＶＥＧＦの画分が、ｓＦｌｔ１及びヘパラン硫酸リッチなマトリックスにより捕獲されるであろう。最後に、ＶＥＧＦレベルはＣＳＦ中に検出不可能であるが41、脈絡叢は、ＶＥＧＦが成人において恒常的に発現し続けている体内の少数の部位のうちの一つである42。これらの全ての理由のため、本発明者らは、ＶＥＧＦの脳室内（ＩＣＶ）送達が代替的なアプローチを提示するであろうか否かを評価し、増殖因子の長期ＩＣＶ送達のために必要な技術を最適化した。本発明者らは、ＶＥＧＦ164アイソフォーム（ヒト等価物はＶＥＧＦ165である）が、運動ニューロン生存を刺激するための最適の生物学的特性を示すことを以前に決定したため13（ＷＯ０１７６６２０）、残りの研究においては、このアイソフォームを使用した。全ての送達実験にラットが使用されたため（下記参照）、本発明者らは、＞９９％純粋であり内毒素を含まないラットＶＥＧＦ164タンパク質調製物をクローニングし発現させた。
【０００７】
２．脳室内送達後のＶＥＧＦの体内分布
ＩＣＶ送達後の中枢神経系におけるＶＥＧＦの薬物動態に関しては何も知られていない38。ＣＳＦへ投与されたＶＥＧＦが、上衣関門を越えて脊髄実質へ拡散し得るか否かすら未知である。従って、本発明者らは、まず、健康なラットにおいてＩＣＶ送達後の125Ｉ−ＶＥＧＦの分布パターンを決定した。ＩＣＶのボーラス注射の１時間後、まだＣＳＦ中に存在していた125Ｉ−ＶＥＧＦは、注射された量の１２％のみであり、７０％及び１２％がそれぞれ脳及び脊髄の実質において回収されたが、このことは、125Ｉ−ＶＥＧＦがＣＳＦから実質へと容易に拡散したことを示している。従って、ＮＧＦの場合と同様だが、ＢＤＮＦとは異なって、上衣層は、ＶＥＧＦにとっては実質へと拡散するための関門とならない38。組織１グラム当たりの125Ｉ−ＶＥＧＦレベルを示すと、125Ｉ−ＶＥＧＦレベルは、注射部位の近傍において最も高く、脊髄に沿った吻側尾側勾配で次第に低下し：延髄／頸髄、胸髄、及び腰髄における125Ｉ−ＶＥＧＦレベルは、それぞれ脳内レベルの８０％、５０％、及び１６％であった。注射の３時間後には、注射された125Ｉ−ＶＥＧＦの３０％しか脳及び脊髄に存在せず、２４時間後には無視し得る程度の量が検出可能となり、125Ｉ−ＶＥＧＦは排泄物中に回収されたが、このことは、その他の増殖因子について立証されているように38、ＶＥＧＦが静脈系及びリンパ系へと除去されたことを示唆している。これらの実験から、２つの結論が引き出され得る。第一に、ＩＣＶ送達されたＶＥＧＦは、ＣＳＦから実質内のニューロンへと迅速に拡散するが、次いで、ＣＳＦから２４時間以内に除去される。ＡＬＳにおける運動ニューロンは慢性的に生存シグナルを必要としているため、ＶＥＧＦは連続的に送達されるべきである。第２に、ＩＣＶ送達後、ＶＥＧＦは吻側尾側勾配で分布する−これは、類似した空間的パターンで運動ニューロン生存に影響を与えるという結果を有し得る。
【０００８】
３．組換えＶＥＧＦの長期脳室内送達
最長８ヶ月間のＧＤＮＦの長期ＩＣＶ送達は、他の神経変性性障害のためヒトにおいて達成されているが43、この経路は、前臨床ＡＬＳモデルにおいて組換え増殖因子の治療可能性を評価するためには使用されていない。組換えＶＥＧＦの長期の連続的な一定の送達を達成するため、本発明者らは、動物の背部の皮下に浸透圧ミニポンプを埋め込み、脳の側脳室において定位的に位置決めされたカテーテルにそれらを接続した。マウスにおいて側脳室にカテーテルを挿入することは技術的には実行可能であるが、マウスが頭部を引っ掻くことによりそれらを取り除こうとするため、カテーテルは脳内に固定され続けず、数週間後に取り外されることになった。さらに、身体サイズに比べて比較的大きいポンプのサイズ（身体サイズのほぼ３０％）は、信頼性のある運動性能測定を妨げた。従って、本発明者らは、組換えＶＥＧＦタンパク質のＩＣＶ送達の治療可能性を査定するため、ＳＯＤ１G93AラットＡＬＳモデルにおいて、ポンプを埋め込み、最長４週間、化合物を送達することに決定した。４週間毎にポンプを交換することにより、本発明者らは、有害効果なしに１００日超にわたり再現性よくＶＥＧＦタンパク質を送達することに成功した（下記参照）。カテーテルの正確な位置及び開存性は、解剖の時点で各ラットにおいてチェックされた。重要なこととして、ＶＥＧＦは、数週間、動物体内の浸透圧ミニポンプへ取り込まれた後であっても、その受容体、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ１とも呼ばれる）及びＶＥＧＦ受容体−２（Ｆｌｋ１）と結合する生物学的活性を依然として有していた。実際、３週間後にポンプから回収されたとき、ポンプ内に残存していたＶＥＧＦの８９％及び６８％が、それぞれ、Ｆｌｔ１及びＦｌｋ１に結合したが、このことは、ポンプ内に保管されていたｒＶＥＧＦ164の大部分が依然として活性であったことを示している。ＶＥＧＦが中枢神経系に慢性的に投与されたことはなく（最長期間は１週間であった）、ＶＥＧＦの急性投与と長期投与とでは効果が異なるかもしれないため、本発明者らはＶＥＧＦの特定の用量が、数ヶ月間の長期送達の後ですら、過度の血管増殖又は漏出を引き起こすことなく、運動ニューロン生存を刺激するであろうか否かを慎重に査定した。初期の実験は、高用量のＶＥＧＦ（例えば、２０μg/kg/日）を脳室内に受容したラットが全て数日後に死亡することを明らかにした。２μg/kg/日では、ラットの６６％が３〜４週間後に発病した。それらは、麻痺してはいなかった（動物は、押されると、まだ普通に歩行することができた）が、一般に感情鈍麻であった。脳及び脊髄の巨視的検査及び組織学的分析は、付加的な血管増殖、心室膨張、並びに脳及び脊髄の発赤及び浮腫を明らかにした。０．２〜０．６μg/kg/日の用量範囲は、１００日超にわたり慢性的に投与された場合ですら、浮腫、漏出、又は過剰の血管増殖を誘導することなく、ラットによってよく容認された。この用量において、ＣＳＦ中のＶＥＧＦレベルは検出不可能なままであった。ＳＯＤ１G93A／LSdラット（スプラーグドーリー（Sprague-Dawley）背景で少量のＳＯＤ１G93A発現を有するＳＯＤ１G93Aラット；実施例４参照）を、０．６μg ＶＥＧＦ/kg/日により処理した。この用量において、ＣＳＦ中のＶＥＧＦレベルは検出不可能なままであったが、それは、おそらく、注入されたＶＥＧＦが脊髄実質へと迅速に拡散したためであった。検出可能なＶＥＧＦレベルのみが病理に関連しているため41、これは重要である。従って、本発明者らは、ＳＯＤ１G93Aラットを処理するために０．６μg ＶＥＧＦ/kg/日という用量を使用した。この用量は、全身対脳／脊髄の相対分布容積の補正の後ですら、治療的血管形成に使用される用量より５倍低い37。コントロールとして注入された人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）も、長期にわたりよく容認され、このことは、その外科的手技が安全であったことを示している。この低いＶＥＧＦ用量のもう一つの利点は、免疫応答を誘導しないということであった。実際、０．２〜０．６μg/kg/日の用量範囲のＶＥＧＦの１００日間の送達の後ですら、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラットの末梢血又はＣＳＦの中に検出可能でなかった。
【０００９】
４．ＡＬＳのラットモデルにおけるＶＥＧＦの効果
ＳＯＤ１G93Aラットは、新規のＡＬＳ治療パラダイムを評価するために以前に使用されたことはない。本発明者らは、スプラーグドーリーを背景（Ｓｄ）としてナガイ（Ｎａｇａｉ）ら10により作出されたＳＯＤ１G93A／LSdラットを使用した（「Ｌ」は、このモデルにおける、低い、例えば２倍増加したＳＯＤ１G93Aレベルを示す）。このモデルにおける疾患進行は極めて攻撃的であり、疾患発症後１０日以内に動物を死亡させる10。ＳＯＤ１G93A／LSdラットは、９５〜１４５日という範囲の、疾患発症の大きな同腹仔間可変性を示した。この可変性を減少させるため、本発明者らはＳＯＤ１G93A／Lsd同腹仔を使用し、対で結果を分析した（Ｎ＝１７ラットを６同腹仔対で分析した；詳細に関しては、方法を参照のこと）。６０日齢における０．６μg ＶＥＧＦ/kg/日によるＳＯＤ１G93A／Lsdラットの処理は、コントロール人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）と比較して、疾患発症を有意に遅らせ、判定方法に関わらず、運動性能及び全体的な臨床結果を改善した。例えば、ａＣＳＦ−動物が既に麻痺のサインを示し、次第に不動になり悪液質になりつつあった時点で、ＶＥＧＦにより処理されたＳＯＤ１G93A／LSdラットは、一般に、活動的で、可動性で、注意力を有しており、毛づくろいを示した。コントロール動物は、ＶＥＧＦにより処理されたラットより重度の筋萎縮を有していた。ＶＥＧＦのＩＣＶ送達は、後肢の引きずり、又は歩行もしくは立ち直りの際の前肢の不使用として判定された四肢麻痺の発症を１０日間遅らせた（Ｐ＜０．０５）。レーザービーム検出系10を使用して、本発明者らは、ラットが「アクティビティケージ」において等間隔に配置されたレーザービームを１時間当たり少なくとも１，０００回通過することができなくなる齢（自発的歩行行動の尺度）を同定した。ＶＥＧＦ送達後、ラットは、より高い齢において自発的に活動的なままであった（ａＣＳＦの１３５±５日に対し１４６±８日、ＶＥＧＦ；Ｐ＜０．０５）。また、本発明者らは、自発的活動の付加的な尺度として、ラットをビデオテープに録画し、ラットがケージ内を探索するのに費やした時間を決定し、ラットが後肢で立ち上がる頻度を計数した。疾患発症前、即ち１１０日齢においては、両方の群が同等に活動的にケージ内を探索し、同等の頻度で立ち上がりを示した（Ｐ＝ＮＳ）。ａＣＳＦ−ラットが四肢麻痺の最初のサインを示してから４日後、ＶＥＧＦにより処理されたラットは、ａＣＳＦにより処理された動物より長時間ケージ内を探索し、より高頻度に立ち上がりを示した（Ｐ＜０．０５）。最後に、ＶＥＧＦは、これらのＡＬＳラットの生存を１０日間延長した（Ｐ＜０．０１）。従って、このモデルにおける極めて急速な疾患進行及び疾患発症の大きな同腹仔間可変性にも関わらず、ＶＥＧＦ処理は、有害効果を引き起こすことなく、ＳＯＤ１G93A／LSdラットの発症を遅らせ、運動性能を改善し、生存を延長した。
【００１０】
５．ＶＥＧＦの神経保護効果の分子的メカニズム
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦが運動ニューロン生存を延長したメカニズムをさらに調査した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究は、ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ受容体−２（Ｆｌｋ１とも呼ばれる）と結合することにより、ストレスによって誘導される細胞死から運動ニューロンを保護することを示したが13、ｉｎ ｖｉｖｏのＶＥＧＦの直接的な神経栄養活性は証明されていない。後者の問題に取り組むため、本発明者らは、出生後のニューロンにおいてマウスＦｌｋ１の発現を駆動するためＴｈｙ１．２発現カセットを使用してトランスジェニックマウスを作出した45。Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１マウスは、非トランスジェニック同腹仔と比較して、より多くのＦｌｋ１ ｍＲＮＡ転写物（ＨＰＲＴ１０3コピー当たりのＦｌｋ１コピー数：４７０±４５対５０±５；Ｎ＝３；Ｐ＜０．０５）及びタンパク質を発現した。非トランスジェニック同腹仔におけるＦｌｋ１発現は、血管において検出可能であり、より低いレベルで大きな運動ニューロンにおいても検出可能であった。対照的に、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１マウスにおいては、内皮細胞における基線発現に加え、高いＦｌｋ１レベルが前角の大きな運動ニューロンに存在した。Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１マウスは、健康で、繁殖能を有しているようであり、ＳＯＤ１G93Aマウスと交配された。注目すべきことに、ＳＯＤ１G93AマウスにおけるＦｌｋ１のニューロン過剰発現は、運動障害の発症を２３日遅らせ（Ｎ＝８；Ｐ＜０．００１）、Ｔｈｙ１−Ｆｌｋ１：ＳＯＤ１G93Aマウスは、２６日間、ＳＯＤ１G93Aマウスより高い性能を有していた（Ｎ＝８；Ｐ＜０．０１）。さらに、Ｔｈｙ１−Ｆｌｋ１：ＳＯＤ１G93Aマウスは、ＳＯＤ１G93A同腹仔より１０日間長く生存した（Ｎ＝８、Ｐ＜０．０５）。従って、これらの遺伝学的所見は、運動ニューロン上のＦｌｋ１が、内因性ＶＥＧＦの重要な生存シグナルを伝達し、それにより、ＡＬＳにおける早熟の運動ニューロン変性を遅らせることを示している。Ｆｌｋ１の神経保護効果についてのさらなる証拠は、ＶＥＧＦシグナル伝達を損なうドミナントネガティブＦｌｋ１のニューロン発現を駆動するために同Ｔｈｙ１．２発現カセットを使用してトランスジェニックマウスを作出することにより提供された（Ｆｌｋ１DN）。Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスは、運動ニューロンにおいて高レベルのＦｌｋ１DNトランスジーンも発現した。３ヶ月齢において、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスは、健康で、繁殖能を有し、正常な筋力、運動性能、及び運動ニューロン数（ＳＭＩ３２＋運動ニューロン／前角：野生型マウス３１±４．４に対しＴｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウス２９±１．２；Ｎ＝４；Ｐ＝ＮＳ）を有していた。運動ニューロンにストレスを与えるため、マウスを、３０日間１日おきに、１０％Ｏ2を有するチャンバーに収容した。慢性の断続的な低酸素は、脊髄におけるＶＥＧＦレベルをアップレギュレートした（pg ＶＥＧＦ／μgタンパク質：正常酸素１２±０．５に対し低酸素２２±１．４；Ｎ＝５；Ｐ＜０．０５）。野生型マウスは、問題なく低酸素症に耐え、それらの握力はわずかに増加すらした。対照的に、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスは、低酸素曝露後１週間以内に握力を２５％失い、実験の残りの間、より弱いままであった。組織学的分析は、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスの灰白質における著しいグリオーシスを示したが、野生型マウスにおいては示さなかった（前角におけるＧＦＡＰ＋面積／灰白質面積：野生型０．１３±０．４５％に対しＴｈｙ−Ｆｌｋ１DN ２．７±０．４５％；Ｎ＝３〜５；Ｐ＜０．０５）。さらに、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスにおける運動ニューロンは、リン酸化された神経フィラメントを蓄積したが、野生型マウスにおいては蓄積しなかった（ＳＭＩ３１＋ニューロン／１０前角切片：野生型ゼロに対しＴｈｙ−Ｆｌｋ１DN １５．３±７．２；Ｎ＝３〜５；Ｐ＜０．０５）。従って、これらの所見は、Ｆｌｋ１が、低酸素ストレス条件における成人運動ニューロン維持において重要な防御的役割を有していることを例示している。
【００１１】
材料及び方法
１．組換えラットＶＥＧＦ164（ＶＥＧＦ164）の作製
ラットｃＤＮＡライブラリーから増幅されたＶＥＧＦ164 ｃＤＮＡを、製造業者（Invitrogen,Carlsbad,CA）の指示に従って、ｐＰＩＣＺαＡ分泌ベクターへとクローニングし、ピキアパストリス（Pichia pastoris）酵母発現系を使用して発現させた。酵母条件培地を１０mM 酢酸（ｐＨ５．５）に対して一夜透析した後、フェニルセファロース（phenyl Sepharose）６ファーストフロー（Phast flow）カラム及びヘパリン−アガロースカラム（いずれもAmersham Pharmacia Biotech製）における逐次クロマトグラフィによりＶＥＧＦを精製した。ＶＥＧＦ濃度を、ラットデュオセット（Duoset）ＥＬＩＳＡ（R&D Systems,Abingdon,UK）を使用して決定した。次いで、精製されたＶＥＧＦ164を電気泳動にかけ、非還元条件下及び還元条件下でそれぞれ４５kDa又は２２kDaに染色された単一のバンドを、ゲルのクーマシーブルー染色及び銀染色により可視化した。バンドは、ｒＶＥＧＦ164に特異的なモノクローナル抗体（R&D Systems）によるイムノブロッティング及びエドマン（Edman）の分解プロトコル後のＮ末端配列決定により、組換えラットＶＥＧＦ164であることが確認された。顕著な４５kDaのバンドをトリプシンで消化し、続いて、切断されたペプチドをｄＨＰＬＣで分離した後、３つの内部ペプチドを選択し、エドマンの分解プロトコルに従ってＮ末端配列決定した。３つのペプチドは、全て、発表されているＶＥＧＦ１６４アミノ酸配列と完全に一致した。
【００１２】
２．ＶＥＧＦ164の機能的特徴決定
固定化されたｒｈＦｃ−ＦＬＴ１受容体及びｒｈＦｃ−ＦＬＫ１受容体（R&D Systems）との我々のＶＥＧＦ164調製物の結合を、商業的に入手可能なラットＶＥＧＦ164のものと比較した。結合したＶＥＧＦ164を、ビオチン化抗ラットＶＥＧＦ抗体（R&D Systems；２００ng/ml）、ＡＢＣベクター染色キット、及び分光測定的読み出しを使用して検出した。我々が作成したＶＥＧＦ164は、ｒｈＦｃ−ＦＬＫ１に対するより高い親和性及びｒｈＦｃ−ＦＬＴ１に対する類似した結合親和性を示した。内毒素レベルを、リムルスアメボサイトライセート（Limulus Amebocyte Lysate）（ＬＡＬ）キット（Bio-Whittaker, Waikersville, USA）を使用することにより決定したところ、ＶＥＧＦ164 ３５０μg当たり１内毒素単位（又はＶＥＧＦ164 １μg当たり３Ｅ１０−３内毒素単位）の存在が明らかとなった。
【００１３】
３．放射標識実験
２５μCi/μg ＶＥＧＦ165の比放射能を有する放射標識されたヒト125Ｉ−ＶＥＧＦを、アマシャムファルマシア（Amersham Pharmacia）から購入した。この調製物１００ngを、１０μLに溶解させ、３３ゲージハミルトン針を使用することにより、健康な雌ウィスター（Wistar）ラットの左側脳室へと定位的に注射した−定位座標は、浸透圧ポンプの埋め込みの場合と同一であった（下記参照）。ＩＣＶ注射に続いて、１、３、及び２４時間後にラットを解剖し、脳、脊髄（頸髄、胸髄、及び腰髄へと分割された）、血液、並びにその他の器官（肝臓、腸、心臓等）を計量し、全カウント毎分（cpm）をガンマ−カウンターを使用して測定した。脳の実質における125Ｉ−ｈＶＥＧＦ165の分布を、ミクロオートラジオグラフィーにより評価した。まず、125Ｉ標識ＶＥＧＦ165を含有している脳及び脊髄の凍結切片を、写真乳剤（Kodak,Cedex,France）に浸漬した。２日間の曝露の後、乳化された切片を現像し、光学顕微鏡検により検出されるような銀粒子の位置を使用して、125Ｉ標識ＶＥＧＦ165の組織分布を決定した。
【００１４】
４．トランスジェニックマウスの作出及び特徴決定
以前に記載されたようにして59、成人ニューロンにおいて特異的にＦｌｋ−１を発現するトランスジェニックマウスを、マウスＴｈｙ１．２発現カセットを使用して作出した。マウスＦｌｋ−１ ｃＤＮＡをＴｈｙ−１．２発現カセットへとクローニングし、標準的な微量注入技術を使用して、直鎖化された構築物をＦｖＢマウス胚へと微量注入した。以前に記載されたようにして13,37、ファウンダーをＰＣＲを使用して同定し、トランスジーンの発現をＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、及び免疫染色により決定した。
【００１５】
５．動物
ヒトＳＯＤ１G93Aトランスジーンを発現するスプラーグドーリーラット（ＳＯＤ１G93A−Ｌ）は、Dr.Itoyama10より寄贈され、ヒトＳＯＤ１G93Aトランスジーンを発現するマウスは、ＦｖＢ背景において１０世代を超えて戻し交配され、Dr.C.Kunst60より寄贈された。全ての動物実験が、地域の動物倫理委員会により承認された。
【００１６】
６．外科的手技
組換えラットＶＥＧＦ164をラットの脳室へと注入するため、脳注入カニューレとカテーテルで接続されたアルゼット（Alzet）浸透圧ポンプ（モデル２００４）を使用した。脳注入アセンブリに、５μg/ml組換えラットＶＥＧＦ164溶液２００μl又は人工ＣＳＦを充填し、生理食塩水で４８時間プライミングした。人工ＣＳＦの組成は、１５０mM Ｎａ＋、３mM Ｋ＋、１．４mM Ｃａ2＋、０．８mM Ｍｇ2＋、１mM ＰＯ43-、１５５mM Ｃｌ-であった。ポンプの埋め込みのため、ラットにハロセンで麻酔をかけ、目の後から出発して正中矢状切開を行い、頭蓋を露出させた。ラットの背部の肩甲中央（midscapular）領域に皮下ポケットを調製し、浸透圧ポンプをポケットへと挿入した。頭蓋に穴を空け、以下の定位座標を使用してカニューレを設置した：前頂部より０．８mm後側、頭蓋表面から１．６mm外側かつ４．５mm腹側。埋め込み手技が完了した時、皮膚切開部を縫合し、ラットを回復させた。２８日後、空になった浸透圧ポンプを、新鮮な、完全に負荷されプライミングされた浸透圧ポンプと交換した。そのためには、ラットに再び麻酔をかけ、背部の肩甲中央部に小さな皮膚切開部を作成した。消費されたポンプの５mm前方でカテーテルを切断し、新鮮なポンプをカテーテル管材料に取り付けた。この手技は、０．２５μl/h（１．２５ng ＶＥＧＦ／時に相当）の速度でのＶＥＧＦ164のＣＳＦへの連続的な注入をもたらす。予防試験においては、６０日齢でポンプを埋め込み、後退試験においては、８０日（疾患発症齢）でポンプを埋め込んだ。マウスを、３０日間１日おきに、１２％酸素を含有している酸素チャンバーに移すことにより、慢性の断続的な低酸素に曝した。
【００１７】
７．行動分析
週に３回、ラットの運動性能を、ロータロッド、筋力計、及び自発的活動尺度を使用してテストした。一定の回転スピード（毎分１５回転）を有するラット用ロータロッド（Ugo Basile, Comerio VA, Italy）を使用した。最大１８０秒の試験５回の平均を、所定の日に決定した。ラットがロータロッド上に留まることができた平均時間が１２０秒未満であった場合、これを失敗と見なした。筋力計テストに関しては、各ラットについて試験５回の平均を得、ラットが平均８００mgを引っ張ることができなかった場合、これを失敗と見なした。自発的活動を定量化するためには、ラットを３時間アクティビティケージ（Ugo Basile）に置き、１時間当たりの平均活動、即ち、ラットがケージ床より１０cm上に位置付けられた赤外線ビームを通過する回数を計算した。ラットの疾患発症齢を判定する基準としては、歩行中の肢の引きずりを使用した。以前の研究においては、動物が最大３０秒間片側に回された後に立ち直ることができない場合を、「臨床死」として判定した9。しかしながら、初期の実験は、立ち直りができないＳＯＤ１G93Aラットであっても、数日間生存し得ることを明らかにした−これは、前肢疾患を有するラットの場合、特に当てはまった。従って、本発明者らは、最終症状前（presymptomatic）齢における最初の体重の４０％をラットが失った日として、死亡時点を判定した（実験は、その後２４〜３６時間以内に動物を示したため）。記載された臨床テストにより作出されたデータ、及び生存データを、カプランマイヤー（Kaplan Meyer）の統計分析を使用して、又はＡＮＯＶＡ反復測定（ロータロッド、筋力計、及び活動）を使用することにより分析した。
【００１８】
８．組織学、免疫組織化学、及びＥＬＩＳＡ
動物を、深いネンブタール麻酔下で、経心的に、０．９％ＮａＣｌ溶液で灌流し、続いて１％リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで灌流した。脊髄及び脳を解剖し、同固定液で一夜後固定し、脱水し、パラフィンで包埋した。連続切片を、脳については２０μm、脊髄については７μmの厚さで切断した。免疫組織化学には、以下のような一次抗体を使用した：マウス抗ＳＭＩ−３２及びマウス抗ＳＭＩ−３１（いずれも１：５００、Sternberger Monoclonals）；マウス抗ＧＦＡＰ（１：４００、Sigma）；ヤギ抗Ｇｌｕｔ−１（１：２０、Santa Cruz Biotechnology）；ウサギ抗ユビキチン（１／１００、Dako）、及びウサギ抗アルブミン（１：２５０、ＩＣＮ／Cappel）。脊髄の運動ニューロン計数に関しては、前角のＳＭＩ−３２陽性ニューロンを、３５０μmの距離の等間隔の５つの切片において両側的に計数した。顔面神経核の運動ニューロンの数を決定するためには、１０番目毎の脳幹切片を染色し、顔面神経核部の全ＳＭＩ−３２陽性ニューロンを計数した。顔面神経核の運動ニューロンの総数を推定するため、この数に１０を掛けた。
【００１９】
９．免疫応答
脊髄及び血漿におけるＶＥＧＦ164のレベルは、ａＣＳＦで処理されたマウスにおいてもＶＥＧＦで処理されたマウスにおいても、ＥＬＩＳＡ検出限界（３２．５pg/mL；R&D Systems）未満であった（各群ｎ＝７）。ＶＥＧＦで処理されたラットにおいて、循環血中抗ＶＥＧＦ抗体が存在するか否かを検出するため、９６穴マイクロタイタープレートを、１μg/ml ＶＥＧＦ164タンパク質溶液１００μlにより一夜コーティングした。ａＣＳＦで処理されたラット及びＶＥＧＦで処理されたラットからの血漿又はＣＳＦと共にインキュベートした後、結合した抗ＶＥＧＦ164抗体を、ＨＲＰ標識抗ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ；２００ng/ml）、ＡＢＣベクター染色キット、及び分光測定的読み出しを使用することにより検出した。
【００２０】
１０．統計
本発明者らはＳＰＳＳバージョン１０を全ての統計計算に使用した。累積生存率統計は、カプランマイヤー統計を使用することにより計算した。自発的活動、ロータロッド、及び体重減少のデータは、反復測定ＡＮＯＶＡを使用して分析した。組織学的研究のための有意差を計算するためには、スチューデントｔ検定を使用した。
【００２１】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、運動ニューロン疾患の処置に関する。より具体的には、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置に関する。前臨床ＡＬＳ動物モデルへの少量の血管内皮増殖因子の脳室内送達が、該動物の有意な運動性能及び生存時間の延長を誘導することが見出される。
【０００２】
発明の序論
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、発症後３〜５年以内に患者を死亡させる、壊滅的な麻痺障害である1-4。臨床症状は、主に、脊髄及び脳幹における運動ニューロンの進行性の変性に起因し、認知機能は概して残される。その疾患は、家族歴のない症例の＞９０％において散発的に中年期の健康な個体に影響を与える。６０歳未満では女性より男性の方が多く影響を受けるが、それより高い年齢では男女とも同様に影響を受ける5。３番目に多い神経変性性障害であるＡＬＳに罹患する個体は、集団が加齢するほど、多くなる6。多くのＡＬＳ患者が、四肢における筋力低下を最初に認める（「四肢発症型」ＡＬＳ）。ＡＬＳ患者のおよそ２５％においては、最初に脳幹の運動核において運動ニューロンが変性し（「球発症型」ＡＬＳ）、構語障害、嚥下困難、及び呼吸器障害を引き起こす。球発症型ＡＬＳ患者は、一般に、四肢発症型患者より速くかつ攻撃的な疾患進行を示すが、後者も最終的には球症状を発症する。ほとんどの場合、運動ニューロン変性の正確な原因は、概して謎のままである2,4,7。ＳＯＤ−１突然変異は、ヒトにおいて、そして過剰発現させた場合にはトランスジェニックマウスにおいても、運動ニューロン変性を引き起こす。実際、ＳＯＤ−１G93Aマウスは、新規薬物候補の治療可能性を査定するための最も標準的な動物モデルとなっている8。ＳＯＤ−１G93Aラットは、攻撃的な型のＡＬＳを発症するが、新規治療の評価には未だ使用されていない9,10。ＡＬＳのための認可された有効な治療法は、未だ利用可能となっていない。リルゾール（Riluzole）は、全てではないがいくつかの国において認可されている唯一の薬物であるが、生存率に対してわずかな効果しか示さず、高価であり、副作用がないわけではなく、そして重要なこととして、球症状に対しては効果がない16。ＡＬＳは運動ニューロンの変性に起因するため、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン（cardiotrophin）（ＣＴ）−１、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような神経栄養性の増殖因子が、長い間、ＡＬＳのための治療候補と見なされてきた。逆行性に軸索輸送されたウイルスベクターを使用したＧＤＮＦ、特にＩＧＦ−１の遺伝子導入は、ＳＯＤ−１G93Aマウスの生存を延長することが示された17,18。臨床試験が進行中であるがｃ、ＡＬＳのための遺伝子治療の臨床的な適用可能性は未だ確立されておらず、不可逆性に関する問題、有害な染色体効果のリスク、トランスジーン発現の不十分な調節、及び大量生産の必要が、未だ克服されていない。従って、その代わりに、組換え神経栄養性増殖因子を送達することは、投与されるタンパク質の用量及び投与期間の柔軟な調節を可能とするため、魅力的な治療戦略である。しかしながら、ある研究において、ＩＧＦ−１送達後に疾患進行が２６％遅れ、もう一つの研究においてはそうでなかったことを除いて21,22、ＢＤＮＦのくも膜下腔内注入19、ＧＤＮＦの脳室内送達ａ、又はＢＤＮＦbもしくはＣＮＴＦ20の全身投与は、現在のところ、ＡＬＳ患者における実質的な臨床的改善をもたらしていない。失敗の少なくとも一部は、これらのタンパク質の全身送達後の短い半減期、免疫原性、ニューロンの生存対アポトーシスに対する用量依存的な二重の効果、望まれない毒性、及び血液脳関門通過能の限界によるかもしれない23-25。もう一つの可能性のある理由は、これらの因子のいくつかは、外因的に供給された場合、急性の損傷を受けた運動ニューロンの生存は促進しても、ＡＬＳのような慢性疾患における成人運動ニューロン生存の内因性の調節においてはそのような重要な役割を果たし得ないという事実に関係しているかもしれない。本発明者らは、低いＶＥＧＦレベルが、運動ニューロンの発達にとっては不必要であるが、遺伝学的に修飾されたマウスにおいて成人発症型ＡＬＳ様運動ニューロン変性を引き起こし（ＷＯ０１７６６２０）、ヒトにおける散発性及び家族性のＡＬＳのリスクも増加させることを最近発見した13-15。ＶＥＧＦは、健康及び疾患における血管増殖に関与しているプロトタイプの血管形成因子である11,12。免疫の問題及び全身性副作用を回避し、ＶＥＧＦの血液脳関門を通過する能力の限界を克服し、脊髄実質における最大のＶＥＧＦタンパク質レベルを達成するため、本発明者らは、ＡＬＳのトランスジェニックＳＯＤ−１G93Aラットモデルを使用して、前臨床ＡＬＳ研究において組換えタンパク質の治療可能性を調査するため、即ち、長期にわたり組換えＶＥＧＦを脳室内送達するため、以前には使用されたことがない戦略を開発した。驚くべきことに、本発明者らは、極めて低レベルのＶＥＧＦが、運動性能を有意に改善するのみならず、予想外の長い時間、ラット前臨床ＡＬＳモデルにおける生存時間を延長することを見出した。結果は、低レベルのＶＥＧＦが脳室内投与された場合、ＡＬＳに罹患した患者の疾患進行を遅延させ得ることを示している。
【０００３】
発明の詳細な説明
本発明は、少量のＶＥＧＦの脳室内（ＩＣＶ）送達が、攻撃的な型のＡＬＳに罹患したラット系統の発症を遅らせ、運動性能を改善し、生存を延長することを示す。これは、前臨床ＡＬＳモデルにおける疾患特徴に対する組換え増殖因子の有意な治療効果を示す最初の研究である。ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、及びＧＤＮＦを含む、既知の神経栄養活性を有するいくつかの組換え増殖因子が、ＡＬＳ患者又はＳＯＤ１G93Aマウスにおいて評価されているが、実質的な利益を一貫して提供した組換え増殖因子は一つもなく19-22,35、従って、以前の臨床試験の失敗以来19-22、組換え増殖因子の投与は大きく魅力を失っていた。本発明者らがここで示すように、ＶＥＧＦは、ｉｎ ｖｉｖｏの運動ニューロンに対する直接的な効果を有している。ＶＥＧＦがｉｎ ｖｉｖｏの様々なニューロン過程に影響を与えることは既知であるが15、ＶＥＧＦが、ニューロンに対して直接的に効果を発揮するのか、又は他の細胞型を通して、もしくは他の分子的中間体を介して間接的に効果を発揮するのかは確立されていなかった。このように、ＶＥＧＦは、多面的な活性スペクトルを有しており、それが、本発明における注目すべき治療的利益に寄与したのかもしれない。本発明は、ＶＥＧＦが、運動ニューロン障害の処置、より具体的には筋萎縮性側索硬化症及び筋萎縮性側索硬化症様疾患の処置のための医薬品を製造するために使用され得ることを示す。特定の実施態様において、ＶＥＧＦ165−アイソフォームが、運動ニューロン障害の処置、より具体的には筋萎縮性側索硬化症及び筋萎縮性側索硬化症様疾患の処置のための医薬品の製造のために使用され、ここで、該ＶＥＧＦは発症の場所の近くに連続的に投与される。ＶＥＧＦ165は、典型的にはヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）と呼ばれる１６５アミノ酸タンパク質である。ＶＥＧＦは、オルタナティブＲＮＡスプライシングに起因する複数のホモダイマー型（１モノマー当たり１２１、１４５、１６５、１８９、及び２０６アミノ酸）として多様な組織において発現される。ＶＥＧＦ121は、ヘパリンに結合しない可溶性の有系分裂促進物質であり；ＶＥＧＦの型が長くなるほど、次第に高い親和性でヘパリンに結合するようになる。ヘパリン結合型ＶＥＧＦは、プラスミンによりカルボキシ末端で切断され、（一つ又は複数の）拡散型のＶＥＧＦを放出し得る。さらに、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、及びＶＥＧＦ−Ｅを含む、ＶＥＧＦと構造的に関係のあるいくつかの分子も、最近同定されている。Ferrara and Davis-Smyth(1997)Endocr. Rev., Ogawa et al.(1998) J.Biological Chem.273: 31273-31281; Meyer et al.(1999) EMBO J.,18: 363-374。「医薬組成物」又は「医薬品」又は「を処置するための医薬品の製造のための使用」という用語は、上に示されたような運動ニューロン疾患を処置するための、上記のようなＶＥＧＦ及び医薬的に許容される担体又は賦形剤（両方の用語は、交換可能に使用され得る）を含む組成物に関する。当業者に既知の適当な担体又は賦形剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、不揮発性油、オレイン酸エチル、５％デキストロースを含む生理食塩水、等張性及び化学的安定性を増強する物質、緩衝液、並びに保存剤である。その他の適当な担体には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体型アミノ酸、及びアミノ酸共重合体のような組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生を、それ自体、誘導しない担体が含まれる。特定の実施態様において、「医薬品」は、発症の場所の近くに、ある方法により投与され得る。実際、ＶＥＧＦレベル及び治療的利益の空間的な勾配は、有意なＣＳＦ代謝回転にも関わらず、ＶＥＧＦが注射部位の近傍に沈着することを示している。これは、ＶＥＧＦ療法を患者の必要に適合させる新規の機会を提示し得る。実際、球発症型のＡＬＳに罹患した個体は、頸髄レベルにおけるＶＥＧＦのＩＣＶ又はくも膜下腔内送達から、より多くの利益を得ることができ、腰髄発症型のＡＬＳ患者は、腰髄レベルにおけるＶＥＧＦのくも膜下腔内注入から、より多くの利益を得ることができる。一般に、医薬品は、ＶＥＧＦ、より具体的にはＶＥＧＦ165が、０．０１〜１．５μg/kg/日、より好ましくは０．０５〜１μg/kg/日、最も好ましくは０．２〜０．８μg/kg/日の用量で与えられるよう、投与される。好ましくは、連続的な注入が使用され、浸透圧ミニポンプを介した連続的な皮下送達を含む。もう一つの実施態様において、ＶＥＧＦ165は、ＶＥＧＦ165が０．０５〜１μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与される、運動ニューロン疾患を処置するための医薬品の製造のために使用される。もう一つの実施態様において、ＶＥＧＦ165は、ＶＥＧＦが０．２〜０．８μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与される、運動ニューロン疾患を処置するための医薬品の製造のために使用される。もう一つの実施態様において、該発症に近い投与は、くも膜下腔内投与である。もう一つの実施態様において、該発症に近い投与は、脳室内投与である。ＶＥＧＦ165の投与が、０．０１〜１．４μg/kg/日又は０．０１〜１．３μg/kg/日又は０．０１〜１．２μg/kg/日又は０．０１〜１．１μg/kg/日又は０．０１〜１μg/kg/日又は０．０１〜０．９μg/kg/日又は０．０１〜０．８μg/kg/日又は０．０１〜０．７μg/kg/日又は０．０１〜０．６μg/kg/日又は０．０１〜０．５μg/kg/日又は０．０１〜０．４μg/kg/日又は０．０１〜０．３μg/kg/日又は０．０１〜０．２μg/kg/日又は０．０１〜０．１μg/kg/日又は０．０１〜０．０９μg/kg/日又は０．０１〜０．０８μg/kg/日又は０．０１〜０．０７μg/kg/日又は０．０１〜０．０６μg/kg/日又は０．０１〜０．０５μg/kg/日又は０．０１〜０．０４μg/kg/日又は０．０１〜０．０３μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与されることも明らかであるべきである。ＶＥＧＦ165の投与が、０．０２〜１．５μg/kg/日又は０．０３〜１．５μg/kg/日又は０．０４〜１．５μg/kg/日又は０．０５〜１．５μg/kg/日又は０．０６〜１．５μg/kg/日又は０．０７〜１．５μg/kg/日又は０．０８〜１．５μg/kg/日又は０．０９〜１．５μg/kg/日又は０．１〜１．５μg/kg/日又は０．２〜１．５μg/kg/日又は０．３〜１．５μg/kg/日又は０．４〜１．５μg/kg/日又は０．５〜１．５μg/kg/日又は０．６〜１．５μg/kg/日又は０．７〜１．５μg/kg/日又は０．８〜１．５μg/kg/日又は０．９〜１．５μg/kg/日又は１〜１．５μg/kg/日又は１．１〜１．５μg/kg/日又は１．２〜１．５μg/kg/日又は１．３〜１．５μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与されることも明らかであるべきである。従って、特定の実施態様において、ＶＥＧＦを含む組成物の注入は、くも膜下腔内である。くも膜下腔内投与は、例えば、外科的にポンプを埋め込み、脊椎へとカテーテルを送ることによって実施され得る。本発明を明確にするため、「運動ニューロン疾患」という用語を、以下に説明する。運動ニューロン疾患とは、筋肉活動を調節する中枢神経系の神経である前角細胞の変性を含む疾患の群である。これは、筋系を徐々に衰弱させ、最終的には消耗（委縮）をもたらす。運動ニューロンの疾患は、上位運動ニューロン（ＵＭＮ）及び／又は下位運動ニューロン（ＬＭＮ）の関与によって分類される。上位運動ニューロンは、脳、特に運動皮質から発生し、下位運動ニューロンと直接的又は間接的にシナプス接合する。上位運動ニューロンは、より正確には、プレモトニューロン（pre-motoneurons）と呼ばれ、運動のための下行性の命令の伝達を担っている。下位運動ニューロンは、内臓運動ニューロン及び体性運動ニューロンという２つのカテゴリーへと工夫できる。内臓運動ニューロンとは、腺、血管、及び平滑筋を神経支配する節ニューロンの活動を制御する自律神経節前ニューロンである。体性運動ニューロンは、骨格筋を神経支配し、第１に、その名称が暗示するように脊髄の前角に位置する前角細胞を含み、第２に、脳神経核に位置する下位運動ニューロンを含む。筋萎縮性側索硬化症又はＡＬＳは、運動ニューロン障害の最も高頻度の型である（全症例のおよそ８０％を占める）。ＡＬＳは、有名なヤンキース（Yankee）の野球選手にちなんで命名されたルーゲーリッグ（Lou Gehrig's）病として既知である。ＡＬＳの初期症状は、手及び脚の衰弱であり、影響を受けた筋肉の繊維束形成である場合も多い。いずれの肢が最初に影響を受けたとしても、最終的には四肢全てが影響を受ける。上位運動ニューロンへの傷害は、筋力低下、痙縮、及び機能亢進性の深部腱反射を生ずる。下位運動ニューロン傷害は、委縮、繊維束形成、無気力、及び減少した深部腱反射を伴う筋力低下を生ずる。ＡＬＳは、脳神経の上位及び下位両方の運動ニューロンの特色を有し、従って、症状は頭部及び頸部に隔離されている。脳神経のＵＭＮ関与を示す患者もおり、これが唯一の徴候である場合、それは仮性球麻痺と呼ばれる。脊髄筋萎縮症又は進行性筋萎縮症は、脳神経を含まない、下位運動ニューロン変性による運動ニューロン疾患である。シャイドレーガー（Shy-Drager）症候群は、体位性低血圧、失禁、発汗、筋硬直、及び振戦を特徴とし、交感神経繊維が発生する脊髄内の胸髄核からのニューロンの欠損を特徴とする。脊髄の破壊的な病変は、前角細胞の欠損をもたらす。これは、大きな液体が充填された嚢胞が頚部脊髄の中心に形成される脊髄髄膜瘤及び脊髄空洞症において見られる。
【０００４】
ＶＥＧＦによる有益な効果は、本発明において、この組換え増殖因子が、脳脊髄液（ＣＳＦ）へと連続的かつ直接的に送達されたという事実と関係しており−従って、ＡＬＳのより大きなＳＯＤ１G93Aラットモデルの利用可能性が役に立った。体内分布データは、ＶＥＧＦが、ＩＣＶ送達後、ＣＳＦから脊髄実質へと迅速に拡散し、従って、下位脊髄運動ニューロンに達し得ることを示しているが、利益のうちのいくらかは、上位運動ニューロンに対する効果から得られた可能性を排除することはできない。（腰部脊髄より脳幹の方が高い）ＶＥＧＦの体内分布と、その治療効果との間の密接な相関は、ＶＥＧＦが、そのレベルが最も高い部位で最も大きな効果を誘導したことを示している。ＶＥＧＦは（その他のニューロトロフィンと同様に38）３時間を過ぎると中枢神経系から除去されるため、ＶＥＧＦの連続的な送達が有益な効果に寄与した可能性が高い。その他の理由は、ＩＣＶ投与されたＶＥＧＦの一般安全性プロファイル（毒性しきい値より１０倍低い治療用量を使用した場合、顕著な有害効果は観察され得なかった）及び（その他の方法では中和抗体を誘導するかもしれない）免疫応答の欠如に関係しているかもしれない。ＶＥＧＦを全身送達した場合には免疫反応が起こったが、ＶＥＧＦの無視し得る程度の血液脳関門通過は、大量の（毒性である可能性が高い）ＶＥＧＦの全身投与によってのみ克服されるであろう。
【０００５】
ＩＣＶ送達は、一見、面倒に思われるかもしれないが、技術的に実行可能であり、他の慢性神経学的適応症のため既に適用されている43。ポンプを位置決めするための単一の外科的介入の不便は、実際、この投与経路の利益（全身性副作用及び免疫応答の欠如；調節可能な投与）より大きくまさっているかもしれない。本発明者らの以前の遺伝学的データは、ＶＥＧＦが散発性ＡＬＳにも家族性ＡＬＳにも影響を与えることを示している14。本発明者らは、本発明において、家族性ＡＬＳの動物モデルのみを使用することができたが、ＶＥＧＦがＡＬＳの散発例においても有効である見込みは十分にある。結局、ＶＥＧＦは、ストレス（低酸素、興奮毒性、血清欠乏、突然変異体ＳＯＤ１関連毒性等）の種類に関わらず、様々な型のニューロンのための生存効果を有しており、従って、魅力的な候補である15。ＶＥＧＦ療法は、安全であり、血管側を引き起こすことなく長期にわたりよく容認されるようである。本発明者らの所見は、ＶＥＧＦが異なる濃度で定性的に異なる生物学的活性（血管浸透性、血管形成）を有することが既知であるという以前の観察を拡張する57。さらに、低いＶＥＧＦレベルは、脳実質へ直接的に送達された場合には、虚血／損傷脳における血管形成のみを刺激するが、ＣＳＦに送達された場合にはそうではない48,58。
【０００６】
実施例
１．組換えＶＥＧＦの全身送達対脳室内送達
本発明者らは、まず、いずれの経路（即ち、全身又は脳室内）を介して、ＶＥＧＦが最もよく投与されるであろうかを評価した。ＡＬＳの安全かつ有効な増殖因子療法は、タンパク質の投与が、免疫応答を開始させずに又は全身的な有害効果を誘導せずに、脊髄実質における十分に高い、即ち治療的なレベルをもたらすことを必要とする。初期の研究は、全ての商業的に入手可能な組換えのヒト、ラット、又はマウスのＶＥＧＦ調製物が、２日毎に１μg（血管形成を刺激するための治療的用量37）でマウスに腹腔内投与された場合、２週間以内に強い免疫応答を引き起こすことを示した。我々の大腸菌により産生されたマウスＶＥＧＦを使用した場合、最適な結果が得られたが、この調製物ですら、４週間以内に免疫応答を引き起こし、従って、ＶＥＧＦの慢性全身送達は妨げられた。さらに、ＶＥＧＦは親水性であり、４４kDaという分子量を有し、従って、注射された用量の１％超の効率で血液脳関門又は血液脳脊髄液（ＣＳＦ）関門を通過する可能性は低い38。従って、脊髄実質における十分なＶＥＧＦレベルを入手するためには、毒性の全身性副作用を誘導する可能性が高い過剰量のＶＥＧＦが投与されなければならないであろう。さらに、ＶＥＧＦは、ヘパラン硫酸リッチな細胞外マトリックスによって組織内に捕獲されるのみならず、可溶性Ｆｌｔ１（ｓＦｌｔ１）、即ち、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ１とも呼ばれる）の細胞外リガンド結合ドメインによって血漿中にも捕獲される39,40。しかしながら、本発明者らは、マウスにおいて脳脊髄液より５倍高い血清中の可溶性Ｆｌｔ１レベルを検出した（３，８００±５９４pg/ml対８１０±６６pg/ml；Ｎ＝３；Ｐ＜０．０５）。従って、全身投与された場合には、脳室内投与された場合より大きなＶＥＧＦの画分が、ｓＦｌｔ１及びヘパラン硫酸リッチなマトリックスにより捕獲されるであろう。最後に、ＶＥＧＦレベルはＣＳＦ中に検出不可能であるが41、脈絡叢は、ＶＥＧＦが成人において恒常的に発現し続けている体内の少数の部位のうちの一つである42。これらの全ての理由のため、本発明者らは、ＶＥＧＦの脳室内（ＩＣＶ）送達が代替的なアプローチを提示するであろうか否かを評価し、増殖因子の長期ＩＣＶ送達のために必要な技術を最適化した。本発明者らは、ＶＥＧＦ164アイソフォーム（ヒト等価物はＶＥＧＦ165である）が、運動ニューロン生存を刺激するための最適の生物学的特性を示すことを以前に決定したため13（ＷＯ０１７６６２０）、残りの研究においては、このアイソフォームを使用した。全ての送達実験にラットが使用されたため（下記参照）、本発明者らは、＞９９％純粋であり内毒素を含まないラットＶＥＧＦ164タンパク質調製物をクローニングし発現させた。
【０００７】
２．脳室内送達後のＶＥＧＦの体内分布
ＩＣＶ送達後の中枢神経系におけるＶＥＧＦの薬物動態に関しては何も知られていない38。ＣＳＦへ投与されたＶＥＧＦが、上衣関門を越えて脊髄実質へ拡散し得るか否かすら未知である。従って、本発明者らは、まず、健康なラットにおいてＩＣＶ送達後の125Ｉ−ＶＥＧＦの分布パターンを決定した。ＩＣＶのボーラス注射の１時間後、まだＣＳＦ中に存在していた125Ｉ−ＶＥＧＦは、注射された量の１２％のみであり、７０％及び１２％がそれぞれ脳及び脊髄の実質において回収されたが、このことは、125Ｉ−ＶＥＧＦがＣＳＦから実質へと容易に拡散したことを示している。従って、ＮＧＦの場合と同様だが、ＢＤＮＦとは異なって、上衣層は、ＶＥＧＦにとっては実質へと拡散するための関門とならない38。組織１グラム当たりの125Ｉ−ＶＥＧＦレベルを示すと、125Ｉ−ＶＥＧＦレベルは、注射部位の近傍において最も高く、脊髄に沿った吻側尾側勾配で次第に低下し：延髄／頸髄、胸髄、及び腰髄における125Ｉ−ＶＥＧＦレベルは、それぞれ脳内レベルの８０％、５０％、及び１６％であった。注射の３時間後には、注射された125Ｉ−ＶＥＧＦの３０％しか脳及び脊髄に存在せず、２４時間後には無視し得る程度の量が検出可能となり、125Ｉ−ＶＥＧＦは排泄物中に回収されたが、このことは、その他の増殖因子について立証されているように38、ＶＥＧＦが静脈系及びリンパ系へと除去されたことを示唆している。これらの実験から、２つの結論が引き出され得る。第一に、ＩＣＶ送達されたＶＥＧＦは、ＣＳＦから実質内のニューロンへと迅速に拡散するが、次いで、ＣＳＦから２４時間以内に除去される。ＡＬＳにおける運動ニューロンは慢性的に生存シグナルを必要としているため、ＶＥＧＦは連続的に送達されるべきである。第２に、ＩＣＶ送達後、ＶＥＧＦは吻側尾側勾配で分布する−これは、類似した空間的パターンで運動ニューロン生存に影響を与えるという結果を有し得る。
【０００８】
３．組換えＶＥＧＦの長期脳室内送達
最長８ヶ月間のＧＤＮＦの長期ＩＣＶ送達は、他の神経変性性障害のためヒトにおいて達成されているが43、この経路は、前臨床ＡＬＳモデルにおいて組換え増殖因子の治療可能性を評価するためには使用されていない。組換えＶＥＧＦの長期の連続的な一定の送達を達成するため、本発明者らは、動物の背部の皮下に浸透圧ミニポンプを埋め込み、脳の側脳室において定位的に位置決めされたカテーテルにそれらを接続した。マウスにおいて側脳室にカテーテルを挿入することは技術的には実行可能であるが、マウスが頭部を引っ掻くことによりそれらを取り除こうとするため、カテーテルは脳内に固定され続けず、数週間後に取り外されることになった。さらに、身体サイズに比べて比較的大きいポンプのサイズ（身体サイズのほぼ３０％）は、信頼性のある運動性能測定を妨げた。従って、本発明者らは、組換えＶＥＧＦタンパク質のＩＣＶ送達の治療可能性を査定するため、ＳＯＤ１G93AラットＡＬＳモデルにおいて、ポンプを埋め込み、最長４週間、化合物を送達することに決定した。４週間毎にポンプを交換することにより、本発明者らは、有害効果なしに１００日超にわたり再現性よくＶＥＧＦタンパク質を送達することに成功した（下記参照）。カテーテルの正確な位置及び開存性は、解剖の時点で各ラットにおいてチェックされた。重要なこととして、ＶＥＧＦは、数週間、動物体内の浸透圧ミニポンプへ取り込まれた後であっても、その受容体、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ１とも呼ばれる）及びＶＥＧＦ受容体−２（Ｆｌｋ１）と結合する生物学的活性を依然として有していた。実際、３週間後にポンプから回収されたとき、ポンプ内に残存していたＶＥＧＦの８９％及び６８％が、それぞれ、Ｆｌｔ１及びＦｌｋ１に結合したが、このことは、ポンプ内に保管されていたｒＶＥＧＦ164の大部分が依然として活性であったことを示している。ＶＥＧＦが中枢神経系に慢性的に投与されたことはなく（最長期間は１週間であった）、ＶＥＧＦの急性投与と長期投与とでは効果が異なるかもしれないため、本発明者らはＶＥＧＦの特定の用量が、数ヶ月間の長期送達の後ですら、過度の血管増殖又は漏出を引き起こすことなく、運動ニューロン生存を刺激するであろうか否かを慎重に査定した。初期の実験は、高用量のＶＥＧＦ（例えば、２０μg/kg/日）を脳室内に受容したラットが全て数日後に死亡することを明らかにした。２μg/kg/日では、ラットの６６％が３〜４週間後に発病した。それらは、麻痺してはいなかった（動物は、押されると、まだ普通に歩行することができた）が、一般に感情鈍麻であった。脳及び脊髄の巨視的検査及び組織学的分析は、付加的な血管増殖、心室膨張、並びに脳及び脊髄の発赤及び浮腫を明らかにした。０．２〜０．６μg/kg/日の用量範囲は、１００日超にわたり慢性的に投与された場合ですら、浮腫、漏出、又は過剰の血管増殖を誘導することなく、ラットによってよく容認された。この用量において、ＣＳＦ中のＶＥＧＦレベルは検出不可能なままであった。ＳＯＤ１G93A／LSdラット（スプラーグドーリー（Sprague-Dawley）背景で少量のＳＯＤ１G93A発現を有するＳＯＤ１G93Aラット；実施例４参照）を、０．６μg ＶＥＧＦ/kg/日により処理した。この用量において、ＣＳＦ中のＶＥＧＦレベルは検出不可能なままであったが、それは、おそらく、注入されたＶＥＧＦが脊髄実質へと迅速に拡散したためであった。検出可能なＶＥＧＦレベルのみが病理に関連しているため41、これは重要である。従って、本発明者らは、ＳＯＤ１G93Aラットを処理するために０．６μg ＶＥＧＦ/kg/日という用量を使用した。この用量は、全身対脳／脊髄の相対分布容積の補正の後ですら、治療的血管形成に使用される用量より５倍低い37。コントロールとして注入された人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）も、長期にわたりよく容認され、このことは、その外科的手技が安全であったことを示している。この低いＶＥＧＦ用量のもう一つの利点は、免疫応答を誘導しないということであった。実際、０．２〜０．６μg/kg/日の用量範囲のＶＥＧＦの１００日間の送達の後ですら、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラットの末梢血又はＣＳＦの中に検出可能でなかった。
【０００９】
４．ＡＬＳのラットモデルにおけるＶＥＧＦの効果
ＳＯＤ１G93Aラットは、新規のＡＬＳ治療パラダイムを評価するために以前に使用されたことはない。本発明者らは、スプラーグドーリーを背景（Ｓｄ）としてナガイ（Ｎａｇａｉ）ら10により作出されたＳＯＤ１G93A／LSdラットを使用した（「Ｌ」は、このモデルにおける、低い、例えば２倍増加したＳＯＤ１G93Aレベルを示す）。このモデルにおける疾患進行は極めて攻撃的であり、疾患発症後１０日以内に動物を死亡させる10。ＳＯＤ１G93A／LSdラットは、９５〜１４５日という範囲の、疾患発症の大きな同腹仔間可変性を示した。この可変性を減少させるため、本発明者らはＳＯＤ１G93A／Lsd同腹仔を使用し、対で結果を分析した（Ｎ＝１７ラットを６同腹仔対で分析した；詳細に関しては、方法を参照のこと）。６０日齢における０．６μg ＶＥＧＦ/kg/日によるＳＯＤ１G93A／Lsdラットの処理は、コントロール人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）と比較して、疾患発症を有意に遅らせ、判定方法に関わらず、運動性能及び全体的な臨床結果を改善した。例えば、ａＣＳＦ−動物が既に麻痺のサインを示し、次第に不動になり悪液質になりつつあった時点で、ＶＥＧＦにより処理されたＳＯＤ１G93A／LSdラットは、一般に、活動的で、可動性で、注意力を有しており、毛づくろいを示した。コントロール動物は、ＶＥＧＦにより処理されたラットより重度の筋萎縮を有していた。ＶＥＧＦのＩＣＶ送達は、後肢の引きずり、又は歩行もしくは立ち直りの際の前肢の不使用として判定された四肢麻痺の発症を１０日間遅らせた（Ｐ＜０．０５）。レーザービーム検出系10を使用して、本発明者らは、ラットが「アクティビティケージ」において等間隔に配置されたレーザービームを１時間当たり少なくとも１，０００回通過することができなくなる齢（自発的歩行行動の尺度）を同定した。ＶＥＧＦ送達後、ラットは、より高い齢において自発的に活動的なままであった（ａＣＳＦの１３５±５日に対し１４６±８日、ＶＥＧＦ；Ｐ＜０．０５）。また、本発明者らは、自発的活動の付加的な尺度として、ラットをビデオテープに録画し、ラットがケージ内を探索するのに費やした時間を決定し、ラットが後肢で立ち上がる頻度を計数した。疾患発症前、即ち１１０日齢においては、両方の群が同等に活動的にケージ内を探索し、同等の頻度で立ち上がりを示した（Ｐ＝ＮＳ）。ａＣＳＦ−ラットが四肢麻痺の最初のサインを示してから４日後、ＶＥＧＦにより処理されたラットは、ａＣＳＦにより処理された動物より長時間ケージ内を探索し、より高頻度に立ち上がりを示した（Ｐ＜０．０５）。最後に、ＶＥＧＦは、これらのＡＬＳラットの生存を１０日間延長した（Ｐ＜０．０１）。従って、このモデルにおける極めて急速な疾患進行及び疾患発症の大きな同腹仔間可変性にも関わらず、ＶＥＧＦ処理は、有害効果を引き起こすことなく、ＳＯＤ１G93A／LSdラットの発症を遅らせ、運動性能を改善し、生存を延長した。
【００１０】
５．ＶＥＧＦの神経保護効果の分子的メカニズム
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦが運動ニューロン生存を延長したメカニズムをさらに調査した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究は、ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ受容体−２（Ｆｌｋ１とも呼ばれる）と結合することにより、ストレスによって誘導される細胞死から運動ニューロンを保護することを示したが13、ｉｎ ｖｉｖｏのＶＥＧＦの直接的な神経栄養活性は証明されていない。後者の問題に取り組むため、本発明者らは、出生後のニューロンにおいてマウスＦｌｋ１の発現を駆動するためＴｈｙ１．２発現カセットを使用してトランスジェニックマウスを作出した45。Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１マウスは、非トランスジェニック同腹仔と比較して、より多くのＦｌｋ１ ｍＲＮＡ転写物（ＨＰＲＴ１０3コピー当たりのＦｌｋ１コピー数：４７０±４５対５０±５；Ｎ＝３；Ｐ＜０．０５）及びタンパク質を発現した。非トランスジェニック同腹仔におけるＦｌｋ１発現は、血管において検出可能であり、より低いレベルで大きな運動ニューロンにおいても検出可能であった。対照的に、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１マウスにおいては、内皮細胞における基線発現に加え、高いＦｌｋ１レベルが前角の大きな運動ニューロンに存在した。Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１マウスは、健康で、繁殖能を有しているようであり、ＳＯＤ１G93Aマウスと交配された。注目すべきことに、ＳＯＤ１G93AマウスにおけるＦｌｋ１のニューロン過剰発現は、運動障害の発症を２３日遅らせ（Ｎ＝８；Ｐ＜０．００１）、Ｔｈｙ１−Ｆｌｋ１：ＳＯＤ１G93Aマウスは、２６日間、ＳＯＤ１G93Aマウスより高い性能を有していた（Ｎ＝８；Ｐ＜０．０１）。さらに、Ｔｈｙ１−Ｆｌｋ１：ＳＯＤ１G93Aマウスは、ＳＯＤ１G93A同腹仔より１０日間長く生存した（Ｎ＝８、Ｐ＜０．０５）。従って、これらの遺伝学的所見は、運動ニューロン上のＦｌｋ１が、内因性ＶＥＧＦの重要な生存シグナルを伝達し、それにより、ＡＬＳにおける早熟の運動ニューロン変性を遅らせることを示している。Ｆｌｋ１の神経保護効果についてのさらなる証拠は、ＶＥＧＦシグナル伝達を損なうドミナントネガティブＦｌｋ１のニューロン発現を駆動するために同Ｔｈｙ１．２発現カセットを使用してトランスジェニックマウスを作出することにより提供された（Ｆｌｋ１DN）。Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスは、運動ニューロンにおいて高レベルのＦｌｋ１DNトランスジーンも発現した。３ヶ月齢において、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスは、健康で、繁殖能を有し、正常な筋力、運動性能、及び運動ニューロン数（ＳＭＩ３２＋運動ニューロン／前角：野生型マウス３１±４．４に対しＴｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウス２９±１．２；Ｎ＝４；Ｐ＝ＮＳ）を有していた。運動ニューロンにストレスを与えるため、マウスを、３０日間１日おきに、１０％Ｏ2を有するチャンバーに収容した。慢性の断続的な低酸素は、脊髄におけるＶＥＧＦレベルをアップレギュレートした（pg ＶＥＧＦ／μgタンパク質：正常酸素１２±０．５に対し低酸素２２±１．４；Ｎ＝５；Ｐ＜０．０５）。野生型マウスは、問題なく低酸素症に耐え、それらの握力はわずかに増加すらした。対照的に、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスは、低酸素曝露後１週間以内に握力を２５％失い、実験の残りの間、より弱いままであった。組織学的分析は、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスの灰白質における著しいグリオーシスを示したが、野生型マウスにおいては示さなかった（前角におけるＧＦＡＰ＋面積／灰白質面積：野生型０．１３±０．４５％に対しＴｈｙ−Ｆｌｋ１DN ２．７±０．４５％；Ｎ＝３〜５；Ｐ＜０．０５）。さらに、Ｔｈｙ−Ｆｌｋ１DNマウスにおける運動ニューロンは、リン酸化された神経フィラメントを蓄積したが、野生型マウスにおいては蓄積しなかった（ＳＭＩ３１＋ニューロン／１０前角切片：野生型ゼロに対しＴｈｙ−Ｆｌｋ１DN １５．３±７．２；Ｎ＝３〜５；Ｐ＜０．０５）。従って、これらの所見は、Ｆｌｋ１が、低酸素ストレス条件における成人運動ニューロン維持において重要な防御的役割を有していることを例示している。
【００１１】
材料及び方法
１．組換えラットＶＥＧＦ164（ＶＥＧＦ164）の作製
ラットｃＤＮＡライブラリーから増幅されたＶＥＧＦ164 ｃＤＮＡを、製造業者（Invitrogen,Carlsbad,CA）の指示に従って、ｐＰＩＣＺαＡ分泌ベクターへとクローニングし、ピキアパストリス（Pichia pastoris）酵母発現系を使用して発現させた。酵母条件培地を１０mM 酢酸（ｐＨ５．５）に対して一夜透析した後、フェニルセファロース（phenyl Sepharose）６ファーストフロー（Phast flow）カラム及びヘパリン−アガロースカラム（いずれもAmersham Pharmacia Biotech製）における逐次クロマトグラフィによりＶＥＧＦを精製した。ＶＥＧＦ濃度を、ラットデュオセット（Duoset）ＥＬＩＳＡ（R&D Systems,Abingdon,UK）を使用して決定した。次いで、精製されたＶＥＧＦ164を電気泳動にかけ、非還元条件下及び還元条件下でそれぞれ４５kDa又は２２kDaに染色された単一のバンドを、ゲルのクーマシーブルー染色及び銀染色により可視化した。バンドは、ｒＶＥＧＦ164に特異的なモノクローナル抗体（R&D Systems）によるイムノブロッティング及びエドマン（Edman）の分解プロトコル後のＮ末端配列決定により、組換えラットＶＥＧＦ164であることが確認された。顕著な４５kDaのバンドをトリプシンで消化し、続いて、切断されたペプチドをｄＨＰＬＣで分離した後、３つの内部ペプチドを選択し、エドマンの分解プロトコルに従ってＮ末端配列決定した。３つのペプチドは、全て、発表されているＶＥＧＦ１６４アミノ酸配列と完全に一致した。
【００１２】
２．ＶＥＧＦ164の機能的特徴決定
固定化されたｒｈＦｃ−ＦＬＴ１受容体及びｒｈＦｃ−ＦＬＫ１受容体（R&D Systems）との我々のＶＥＧＦ164調製物の結合を、商業的に入手可能なラットＶＥＧＦ164のものと比較した。結合したＶＥＧＦ164を、ビオチン化抗ラットＶＥＧＦ抗体（R&D Systems；２００ng/ml）、ＡＢＣベクター染色キット、及び分光測定的読み出しを使用して検出した。我々が作成したＶＥＧＦ164は、ｒｈＦｃ−ＦＬＫ１に対するより高い親和性及びｒｈＦｃ−ＦＬＴ１に対する類似した結合親和性を示した。内毒素レベルを、リムルスアメボサイトライセート（Limulus Amebocyte Lysate）（ＬＡＬ）キット（Bio-Whittaker, Waikersville, USA）を使用することにより決定したところ、ＶＥＧＦ164 ３５０μg当たり１内毒素単位（又はＶＥＧＦ164 １μg当たり３Ｅ１０−３内毒素単位）の存在が明らかとなった。
【００１３】
３．放射標識実験
２５μCi/μg ＶＥＧＦ165の比放射能を有する放射標識されたヒト125Ｉ−ＶＥＧＦを、アマシャムファルマシア（Amersham Pharmacia）から購入した。この調製物１００ngを、１０μLに溶解させ、３３ゲージハミルトン針を使用することにより、健康な雌ウィスター（Wistar）ラットの左側脳室へと定位的に注射した−定位座標は、浸透圧ポンプの埋め込みの場合と同一であった（下記参照）。ＩＣＶ注射に続いて、１、３、及び２４時間後にラットを解剖し、脳、脊髄（頸髄、胸髄、及び腰髄へと分割された）、血液、並びにその他の器官（肝臓、腸、心臓等）を計量し、全カウント毎分（cpm）をガンマ−カウンターを使用して測定した。脳の実質における125Ｉ−ｈＶＥＧＦ165の分布を、ミクロオートラジオグラフィーにより評価した。まず、125Ｉ標識ＶＥＧＦ165を含有している脳及び脊髄の凍結切片を、写真乳剤（Kodak,Cedex,France）に浸漬した。２日間の曝露の後、乳化された切片を現像し、光学顕微鏡検により検出されるような銀粒子の位置を使用して、125Ｉ標識ＶＥＧＦ165の組織分布を決定した。
【００１４】
４．トランスジェニックマウスの作出及び特徴決定
以前に記載されたようにして59、成人ニューロンにおいて特異的にＦｌｋ−１を発現するトランスジェニックマウスを、マウスＴｈｙ１．２発現カセットを使用して作出した。マウスＦｌｋ−１ ｃＤＮＡをＴｈｙ−１．２発現カセットへとクローニングし、標準的な微量注入技術を使用して、直鎖化された構築物をＦｖＢマウス胚へと微量注入した。以前に記載されたようにして13,37、ファウンダーをＰＣＲを使用して同定し、トランスジーンの発現をＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、及び免疫染色により決定した。
【００１５】
５．動物
ヒトＳＯＤ１G93Aトランスジーンを発現するスプラーグドーリーラット（ＳＯＤ１G93A−Ｌ）は、Dr.Itoyama10より寄贈され、ヒトＳＯＤ１G93Aトランスジーンを発現するマウスは、ＦｖＢ背景において１０世代を超えて戻し交配され、Dr.C.Kunst60より寄贈された。全ての動物実験が、地域の動物倫理委員会により承認された。
【００１６】
６．外科的手技
組換えラットＶＥＧＦ164をラットの脳室へと注入するため、脳注入カニューレとカテーテルで接続されたアルゼット（Alzet）浸透圧ポンプ（モデル２００４）を使用した。脳注入アセンブリに、５μg/ml組換えラットＶＥＧＦ164溶液２００μl又は人工ＣＳＦを充填し、生理食塩水で４８時間プライミングした。人工ＣＳＦの組成は、１５０mM Ｎａ＋、３mM Ｋ＋、１．４mM Ｃａ2＋、０．８mM Ｍｇ2＋、１mM ＰＯ43-、１５５mM Ｃｌ-であった。ポンプの埋め込みのため、ラットにハロセンで麻酔をかけ、目の後から出発して正中矢状切開を行い、頭蓋を露出させた。ラットの背部の肩甲中央（midscapular）領域に皮下ポケットを調製し、浸透圧ポンプをポケットへと挿入した。頭蓋に穴を空け、以下の定位座標を使用してカニューレを設置した：前頂部より０．８mm後側、頭蓋表面から１．６mm外側かつ４．５mm腹側。埋め込み手技が完了した時、皮膚切開部を縫合し、ラットを回復させた。２８日後、空になった浸透圧ポンプを、新鮮な、完全に負荷されプライミングされた浸透圧ポンプと交換した。そのためには、ラットに再び麻酔をかけ、背部の肩甲中央部に小さな皮膚切開部を作成した。消費されたポンプの５mm前方でカテーテルを切断し、新鮮なポンプをカテーテル管材料に取り付けた。この手技は、０．２５μl/h（１．２５ng ＶＥＧＦ／時に相当）の速度でのＶＥＧＦ164のＣＳＦへの連続的な注入をもたらす。予防試験においては、６０日齢でポンプを埋め込み、後退試験においては、８０日（疾患発症齢）でポンプを埋め込んだ。マウスを、３０日間１日おきに、１２％酸素を含有している酸素チャンバーに移すことにより、慢性の断続的な低酸素に曝した。
【００１７】
７．行動分析
週に３回、ラットの運動性能を、ロータロッド、筋力計、及び自発的活動尺度を使用してテストした。一定の回転スピード（毎分１５回転）を有するラット用ロータロッド（Ugo Basile, Comerio VA, Italy）を使用した。最大１８０秒の試験５回の平均を、所定の日に決定した。ラットがロータロッド上に留まることができた平均時間が１２０秒未満であった場合、これを失敗と見なした。筋力計テストに関しては、各ラットについて試験５回の平均を得、ラットが平均８００mgを引っ張ることができなかった場合、これを失敗と見なした。自発的活動を定量化するためには、ラットを３時間アクティビティケージ（Ugo Basile）に置き、１時間当たりの平均活動、即ち、ラットがケージ床より１０cm上に位置付けられた赤外線ビームを通過する回数を計算した。ラットの疾患発症齢を判定する基準としては、歩行中の肢の引きずりを使用した。以前の研究においては、動物が最大３０秒間片側に回された後に立ち直ることができない場合を、「臨床死」として判定した9。しかしながら、初期の実験は、立ち直りができないＳＯＤ１G93Aラットであっても、数日間生存し得ることを明らかにした−これは、前肢疾患を有するラットの場合、特に当てはまった。従って、本発明者らは、最終症状前（presymptomatic）齢における最初の体重の４０％をラットが失った日として、死亡時点を判定した（実験は、その後２４〜３６時間以内に動物を示したため）。記載された臨床テストにより作出されたデータ、及び生存データを、カプランマイヤー（Kaplan Meyer）の統計分析を使用して、又はＡＮＯＶＡ反復測定（ロータロッド、筋力計、及び活動）を使用することにより分析した。
【００１８】
８．組織学、免疫組織化学、及びＥＬＩＳＡ
動物を、深いネンブタール麻酔下で、経心的に、０．９％ＮａＣｌ溶液で灌流し、続いて１％リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで灌流した。脊髄及び脳を解剖し、同固定液で一夜後固定し、脱水し、パラフィンで包埋した。連続切片を、脳については２０μm、脊髄については７μmの厚さで切断した。免疫組織化学には、以下のような一次抗体を使用した：マウス抗ＳＭＩ−３２及びマウス抗ＳＭＩ−３１（いずれも１：５００、Sternberger Monoclonals）；マウス抗ＧＦＡＰ（１：４００、Sigma）；ヤギ抗Ｇｌｕｔ−１（１：２０、Santa Cruz Biotechnology）；ウサギ抗ユビキチン（１／１００、Dako）、及びウサギ抗アルブミン（１：２５０、ＩＣＮ／Cappel）。脊髄の運動ニューロン計数に関しては、前角のＳＭＩ−３２陽性ニューロンを、３５０μmの距離の等間隔の５つの切片において両側的に計数した。顔面神経核の運動ニューロンの数を決定するためには、１０番目毎の脳幹切片を染色し、顔面神経核部の全ＳＭＩ−３２陽性ニューロンを計数した。顔面神経核の運動ニューロンの総数を推定するため、この数に１０を掛けた。
【００１９】
９．免疫応答
脊髄及び血漿におけるＶＥＧＦ164のレベルは、ａＣＳＦで処理されたマウスにおいてもＶＥＧＦで処理されたマウスにおいても、ＥＬＩＳＡ検出限界（３２．５pg/mL；R&D Systems）未満であった（各群ｎ＝７）。ＶＥＧＦで処理されたラットにおいて、循環血中抗ＶＥＧＦ抗体が存在するか否かを検出するため、９６穴マイクロタイタープレートを、１μg/ml ＶＥＧＦ164タンパク質溶液１００μlにより一夜コーティングした。ａＣＳＦで処理されたラット及びＶＥＧＦで処理されたラットからの血漿又はＣＳＦと共にインキュベートした後、結合した抗ＶＥＧＦ164抗体を、ＨＲＰ標識抗ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ；２００ng/ml）、ＡＢＣベクター染色キット、及び分光測定的読み出しを使用することにより検出した。
【００２０】
１０．統計
本発明者らはＳＰＳＳバージョン１０を全ての統計計算に使用した。累積生存率統計は、カプランマイヤー統計を使用することにより計算した。自発的活動、ロータロッド、及び体重減少のデータは、反復測定ＡＮＯＶＡを使用して分析した。組織学的研究のための有意差を計算するためには、スチューデントｔ検定を使用した。
【００２１】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
運動ニューロン疾患を処置するための医薬品の製造のためのＶＥＧＦの使用であって、該ＶＥＧＦが０．０５〜１μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与される、使用。
【請求項２】
用量が０．２〜０．８μg/kg/日の範囲内である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
投与がくも膜下腔内である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
投与が脳室内である、請求項１記載の使用。
【請求項５】
ＶＥＧＦの連続的な投与が、埋め込まれた浸透圧ミニポンプを介して行われる、請求項１記載の使用。
【請求項６】
運動ニューロン疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項１記載の使用。
【請求項１】
運動ニューロン疾患を処置するための医薬品の製造のためのＶＥＧＦの使用であって、該ＶＥＧＦが０．０５〜１μg/kg/日の範囲内の用量で発症の場所の近くに連続的に投与される、使用。
【請求項２】
用量が０．２〜０．８μg/kg/日の範囲内である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
投与がくも膜下腔内である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
投与が脳室内である、請求項１記載の使用。
【請求項５】
ＶＥＧＦの連続的な投与が、埋め込まれた浸透圧ミニポンプを介して行われる、請求項１記載の使用。
【請求項６】
運動ニューロン疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項１記載の使用。
【公開番号】特開２０１２−１１１７７４（Ｐ２０１２−１１１７７４Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２０８１６（Ｐ２０１２−２０８１６）
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【分割の表示】特願２００７−５１３９４５（Ｐ２００７−５１３９４５）の分割
【原出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（３０１０３４２６７）フラームス・インテルウニフェルシタイル・インステイチュート・フォール・ビオテヒノロヒー・ヴェーゼットウェー（ヴェーイーベー・ヴェーゼットウェー） (10)
【氏名又は名称原語表記】ＶＬＡＡＭＳ ＩＮＴＥＲＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲ ＩＮＳＴＩＴＵＵＴ ＶＯＯＲ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥ ＶＺＷ（ＶＩＢ ＶＺＷ）
【出願人】（５０２０１４３６３）ライフ・サイエンシーズ・リサーチ・パートナーズ・フェレニゲング・ゾンデル・ウィンストーメルク (12)
【氏名又は名称原語表記】ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＡＲＴＮＥＲＳ ＶＺＷ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２０８１６（Ｐ２０１２−２０８１６）
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【分割の表示】特願２００７−５１３９４５（Ｐ２００７−５１３９４５）の分割
【原出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（３０１０３４２６７）フラームス・インテルウニフェルシタイル・インステイチュート・フォール・ビオテヒノロヒー・ヴェーゼットウェー（ヴェーイーベー・ヴェーゼットウェー） (10)
【氏名又は名称原語表記】ＶＬＡＡＭＳ ＩＮＴＥＲＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲ ＩＮＳＴＩＴＵＵＴ ＶＯＯＲ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥ ＶＺＷ（ＶＩＢ ＶＺＷ）
【出願人】（５０２０１４３６３）ライフ・サイエンシーズ・リサーチ・パートナーズ・フェレニゲング・ゾンデル・ウィンストーメルク (12)
【氏名又は名称原語表記】ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＡＲＴＮＥＲＳ ＶＺＷ
【Ｆターム（参考）】
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