簡便かつ迅速な核酸抽出方法
【課題】核酸含有溶液、特に生物試料中に含まれる核酸を標的として、従来よりも簡便、迅速に核酸を抽出する方法を提供する。
【解決手段】核酸回収容器の核酸吸着担体として通液孔、直径、厚さを限定したモノリス構造体を用いることで核酸含有溶液を大気圧以下で吸引・吐出可能な液通りと核酸回収効率とを両立できる。
【解決手段】核酸回収容器の核酸吸着担体として通液孔、直径、厚さを限定したモノリス構造体を用いることで核酸含有溶液を大気圧以下で吸引・吐出可能な液通りと核酸回収効率とを両立できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は不純物の混じったサンプル中から核酸を簡便、迅速に抽出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査分野では病原細菌遺伝子や薬物代謝に関与する遺伝子をターゲットとした遺伝子検査が広まってきている。遺伝子検査は核酸を短時間で指数関数的に増幅させるため、他の臨床検査に比べて感度、迅速性に優れる検査である。核酸増幅技術はこれまで様々な技術が開発されてきている。例えば、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮなどが挙げられる。これらの技術は、検体中に含まれる核酸を鋳型にして増幅されること、増幅を行う前の検体の状態によって阻害を受けやすいことから、検体からの核酸の抽出、不純物の除去など、検体の前処理方法が特に重要であることが知られている。
【０００３】
現在主に用いられている核酸抽出法の基礎となっている技術は、特許文献１に示されているカオトロピック剤およびシリカを用いた方法で、ヒトの血清や尿などから核酸を精製することができる。具体的にはシリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニジンチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に吸着（結合）した複合体を遠心分離により沈降させた後、上清を廃棄し、残った複合体に洗浄液を加えて洗浄し、再沈殿させた複合体をエタノール水溶液で洗浄した後アセトンで洗浄し、アセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する方法が記載されている。
【０００４】
上記方法をさらに発展させた様々な方法が開示されている。特許文献２には磁性粒子を利用して核酸を簡便に抽出する方法が記載されている。核酸と特異的に吸着しない磁性粒子を、核酸を含む溶液に懸濁し、塩とアルコールを加えて核酸を不溶化させ、冷却することで磁性粒子の周りに核酸を凝集させる。磁界を与え、磁性粒子と核酸の複合体を凝集させ、上清を除去し、溶出液を加えて核酸を再溶解させ、磁界を与えて磁性粒子を沈殿させて、核酸が溶解した上清を得る。
【０００５】
特許文献３にはシリカ担体を保持したカラムを利用して核酸を効率よく抽出する方法が示されている。孔径が＜５μｍのシリカゲル、ガラスまたは石英の繊維でできた網状の薄膜を中空体中に保持された５０〜２００μｍの孔径のポリエチレンフリットの間に挿入したものをカラムとしている。該カラムを用いて、核酸を含む溶液を高イオン強度の緩衝液と混合し、混合液を吸引もしくは遠心分離により薄膜を通過させて吸着させている。さらにアルコールを含む洗浄液で洗浄し、低イオン強度の緩衝液で溶出している。シリカ粒子を核酸吸着担体に用いる「バッチ式」の方法に比べて液が一方向に流れるため核酸の吸着効率は高くなる。
【０００６】
特許文献４ではカラム中の核酸吸着担体に一体型モノリス構造体を利用した核酸精製方法が開示されている。モノリス構造体を用いることにより、液残りが少なく、遠心力が従来のカラムを利用した核酸精製方法よりも少なくてすむという利点があった。
【０００７】
特許文献５にはより簡便に核酸を抽出する方法が示されている。シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続し、固相への核酸の吸着を促進する物質と核酸含有試料との混合液を所定容器から液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸引し、核酸を固相に吸着した後、核酸捕捉用チップ内の液体を排除し、次いで洗浄液を吸引、排出することにより核酸捕捉チップ内を洗浄し、洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、固相から溶離された核酸を含む溶離液を精製品容器に吐出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第２６８０４６２号
【特許文献２】特許第２７０３１１４号
【特許文献３】特許公表平８−５０１３２１号
【特許文献４】特開２００５−２２４１６７号
【特許文献５】特開平１１−２６６８６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述の磁性粒子を用いた核酸抽出方法では、自動化が容易に行える利点がある一方で凝集粒子に付着した残存アルコールや核酸溶解上清中に懸濁された細かい磁性粒子によって核酸増幅が阻害される問題があった。
【００１０】
また、シリカ担体を保持したカラムを用いる核酸抽出方法では、溶液をカラム通過させる時に吸引装置や遠心分離機などの特別な装置が必要であるため、簡便な方法ではなかった。
【００１１】
シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いる方法では、遠心分離機などの特別な装置を必要としないが、簡便さを追求した半面、核酸回収効率の低下および不純物を多く含むサンプルでは担体が詰まり液の吸引ができないという問題点があった。
【００１２】
本発明の目的は、核酸含有溶液、特に生物試料中に含まれる核酸を標的として、従来よりも簡便、迅速に核酸を抽出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、核酸回収容器の核酸吸着担体として通液孔、直径、厚さを限定したモノリス構造体を用いることで核酸含有溶液を大気圧以下で吸引・吐出可能な液通りと核酸回収効率とを両立できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１４】
［項１］
核酸を含む溶液から核酸を抽出する方法であって、
空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置を使用して、核酸の固相担体への特異的な吸着・洗浄および溶出により核酸を抽出する方法において、
次の（１）〜（６）の工程を含む核酸抽出方法。
（１）以下の（ａ）（ｂ）の特徴を有する容器を準備する工程。
（ａ）核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ。
（ｂ）固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている。
（２）該容器の通気部側を吸引吐出機構に接続する工程。
（３）核酸を含む溶液と吸着液を混合する工程。
（４）核酸を含む溶液と混合した吸着液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させて核酸をモノリス構造体に吸着した後、容器内の液体を吐出する工程。
（５）洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出する工程。
（６）溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出する工程。
［項２］
モノリス構造体の通液方向に対して垂直方向の切断面積が０．１平方ｍｍ以上１００平方ｍｍ以下である項1に記載の核酸抽出方法。
［項３］
モノリス構造体の通液方向の厚さが０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下である項1または２に記載の核酸抽出方法。
［項４］
溶液の吸引速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である項１から３のいずれかに記載の核酸抽出方法。
［項５］
溶液の吐出速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である項１から４のいずれかに記載の核酸抽出方法。
［項６］
吸着液がカオトロピック塩を含む項１に記載の核酸抽出方法。
［項７］
吸着液がカオトロピック塩を含み、かつ酢酸塩を含む項６に記載の核酸抽出方法。
［項８］
カオトロピック塩が、グアニジン塩、ヨウ化物塩および尿素からなる群より選ばれるいずれか１つ以上である項６または７のいずれかに記載の核酸抽出方法。
［項９］
洗浄液がアルコール類を含む項１に記載の核酸抽出方法。
［項１０］
洗浄液がアルコール類を含み、かつ酢酸塩を含む項９に記載の核酸抽出方法。
［項１１］
アルコール類が、エタノール、イソプロパノールおよび１−プロパノールからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である項９または１０に記載の核酸抽出方法。
［項１２］
酢酸塩が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸リチウムからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である項７または１０に記載の核酸抽出方法。
［項１３］
溶出液がｐＨ７以上の溶液であることを特徴とする項１に記載の核酸抽出方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、以上のように核酸回収効率が良く、迅速かつ簡便な操作で核酸を抽出することが可能となる。具体的には、複雑な操作を行っていた核酸抽出がより安価で簡便な操作で実現可能である。また、自動化についても容易に達成でき、より小型で安価な装置への適用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】モノリス構造体を固定したチップの一例
【図２】モノリスチップによる核酸の添加回収方法の概略図。
【図３】モノリスチップによる吸引方法
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一つの実施形態は、核酸を含む溶液から核酸を抽出する方法であって、空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置を使用して、核酸の固相担体への特異的な結合・洗浄および溶出により核酸を抽出する方法において、
次の（１）〜（６）の工程を含む核酸抽出方法である。
（１）以下の（ａ）（ｂ）の特徴を有する容器を準備する工程。
（ａ）核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ。
（ｂ）固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている。
（２）該容器の通気部側を吸引吐出機構に接続する工程。
（３）核酸を含む溶液と吸着液を混合する工程。
（４）核酸を含む溶液と混合した吸着液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させて核酸をモノリス構造体に吸着した後、容器内の液体を吐出する工程。
（５）洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出する工程。
（６）溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出する工程。
【００１８】
本発明の実施形態における特徴の一つは、通液部側および通気部側の二方向に開放面をもち、かつ、固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている容器を使用することである。
【００１９】
モノリス構造体の作製方法
本発明で用いるモノリス構造体は、一体成型された多孔質体を意味し、以下に例示する方法で作製することができるが、特に限定されるものではない。
【００２０】
モノリス構造体は、主に、ゾル−ゲル法で作成することができる。即ち、金属アルコキシドを部分的に加水分解して反応性モノマーを作り、このモノマーを重縮合してコロイド状オリゴマーを作り（ゾルの生成）、更に加水分解して重合と架橋を促進させ、三次元構造を作る（ゲルの生成）ことで合成される。
この反応時に種々の有機モノマーを添加すると、有機・無機ハイブリッドモノリスも簡単に作成できる。従って、添加する有機モノマーの種類によって、化学的特性を加えることも可能となる。
例えば、親水基を持つ有機モノマーを添加することによって、水系試料成分の吸水性を向上することができる。又、有機・無機を混在させることによって、モノリス構造体の化学的安定を上げることも可能となる。ゾル−ゲル法にて作成される有機・無機ハイブリッドモノリス構造体は、添加有機モノマーの種類で目的に応じた化学表面を構成したり、化学的安定性を向上したりといった性質を付加できる。核酸抽出において有効なモノリス特性を目的に応じて自由に改善できることを示している。
【００２１】
更に、ゾル−ゲル方法から作成したモノリス構造体は金属の含有が少ないという点で適している。一般的なシリカゲルなどは、ケイ酸ナトリウムなどから作成され、多量の金属が残る。確かに、一部では精製したケイ酸ナトリウムからの作成やゾル−ゲル法からの高純度のシリカゲルもあるが、それらは高価であり、使い捨てで使用する核酸回収容器としては適さない。又、安価に出来たとしても、粒子作成時点ではバッチ式合成であり、合成雰囲気から金属濃縮が生じる可能性が大きい。ゾル−ゲル法におけるモノリス構造体の合成においては、連続行程により作成され、金属のコンタミネーションは全くない。従来、シリカゲルでは、塩酸や硝酸等で洗浄するなどの工夫や、金属影響を減らすようなＥＤＴＡなどの添加があったが、本発明のモノリス構造体では全く必要ない。
【００２２】
もう一法として、ガラス分相によってもモノリス構造体を作成できる。
基本的には、ゾルーゲル法からのモノリス構造体の合成と同様の有効性があるが、ゾルーゲルモノリスよりもマクロ細孔を大きく作る事ができるので、２次ミクロ細孔を内部表面に作る場合に有効である。更に、ガラス分相は、その組成より耐アルカリ性が高く、アルカリ洗浄による再生が出来ると言うメリットがある。
【００２３】
前述のようなゾル−ゲル法で作成したモノリス構造体は、例えばＨＰＬＣ用カラムで使用されていることが、一般的に知られている。
【００２４】
上述の方法によりシリカ表面にシラノール基が付与される。
核酸抽出に用いるモノリス構造体は、ブーム法として広く知られているシリカを用いた核酸抽出方法と同様の原理で核酸を吸脱着させるため、表面にシラノール基を持つことが好ましい。
【００２５】
モノリス構造体の特性
本発明の実施形態における特徴の一つは、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体を用いることである。
【００２６】
モノリス構造体の利点は、液の通過する細孔径を制御して生成できる点にある。本発明では溶液の吸引・吐出により溶液の通過を行うため、従来遠心によって溶液を通過させていたモノリス構造体の細孔径では液詰まりを起こす。吸引・吐出に適したモノリス構造体の細孔径は、吸引・吐出により溶液の液詰まりが起こらず、かつ核酸が回収できればよい。
【００２７】
圧力変化によって溶液を吸引・吐出する時に、溶液の粘性や純度が液詰まりに関係する。特に生体試料の場合、タンパク質などの不純物が多く含まれるため液詰まりを起こす可能性が高くなる。このような生体試料からの核酸抽出に適したモノリス構造体の細孔径は２０μｍ以上が好ましい。さらに通液性を考えると粘性の高い溶液を使用する場合、３０μｍ以上がより好ましい。２０μｍ未満になると大気圧下の吸引・吐出操作では使用溶液中に不純物が含まれるとモノリス構造体の通液が難しくなる。
【００２８】
また、モノリス構造体への核酸の吸着には溶液中の核酸とモノリス構造体の接触が必要となる。核酸がモノリス構造体表面へ効率よく接触するには溶液の通過する細孔径が小さいほうが良く、特に限定はされないが、１００μｍ以下が好ましく、６０μｍ以下がより好ましく、５０μｍ以下がさらに好ましく、４０μｍ以下がさらに好ましい。
【００２９】
通液性と核酸吸着効率を両立させるモノリス構造体の細孔径の下限は、好ましくは２０μｍ以上であり、さらに好ましくは３０μｍである。上限は、好ましくは６０μｍ以下であり、さらに好ましくは４０μｍ以下である。このようなモノリス構造体の細孔径は電子顕微鏡映像から通液孔の平均径によって求められる。さらに正確に測定する場合は、水銀圧入法を用いて測定することもできる。
【００３０】
モノリス構造体の体積も通液性及び核酸吸着効率に影響する。
吸着液や洗浄液の吸引および吐出時にはモノリス構造体の体積よりも溶液の体積のほうが極めて大きいため溶液の通過に影響は与えない。しかし、溶出液の場合は核酸の濃縮のためできるだけ少量を用いることが好ましく、少量の場合はモノリス構造体を通過する時の溶液通過速度の制御が難しくなる。溶出液の体積がモノリス構造体の体積と同じ場合は、吸引および吐出する時に気体を含む可能性が高く、溶出液の制御が極めて難しい。例えば、使用する溶出液とモノリス構造体の体積の比が２以上であることが好ましい。より好ましくは４以上である。さらに好ましくは５以上である。特に限定はされないが、モノリス構造体の形状は、円柱形、直方体、円錐形、円錐形を切断した形、球などが考えられる。形状は容器の形状や大きさによって選択される。
【００３１】
本発明において、モノリス構造体の切断面積は０．１平方ｍｍ以上１００平方ｍｍ以下であることが好ましく、１平方ｍｍ以上３０平方ｍｍ以下がより好ましい。さらに好ましくは１平方ｍｍ以上５０平方ｍｍ以下であり、３平方ｍｍ以上２０平方ｍｍ以下である。
【００３２】
モノリス構造体の通液方向に対して垂直方向の切断面積とは、容器中にモノリス構造体を固定した時の開放面に対して平行に切断したモノリス構造体の面の面積を示す。切断位置はモノリス構造体の中間で切断した面の面積を切断面積とする。切断面の形は円形や四角形が主に挙げられるが、この限りではない。
【００３３】
モノリス構造体と固定する容器との溶着を隙間なく行うために、切断面は円形であることが好ましく、切断面積は半径、半径、３．１４の積で算出できる。
【００３４】
モノリス構造体の通液性及び核酸吸着効率は同じ体積でも形状によって異なる。一例を挙げると、円柱形のモノリス構造体を用いた場合モノリス構造体の製造または強度確保の点から直径０．２ｍｍ以上、通液方向の厚さ０．２ｍｍ以上が好ましい。厚さは０．２ｍｍ以上５ｍｍ未満が好ましく、０．４ｍｍ以上４ｍｍ未満がより好ましい。さらに好ましくは０．８ｍｍ以上２ｍｍ未満である。厚さが厚くなればモノリス構造体で生じる抵抗が大きくなり、通液が困難になる。直径は０．２ｍｍ以上１０ｍｍ未満が好ましく、０．５ｍｍ以上８ｍｍ未満がより好ましい。さらに好ましくは１ｍｍ以上５ｍｍ未満である。厚さが１０ｍｍを超える場合は、モノリス構造体による溶液抵抗が増加するため、溶液の吸引および吐出が困難となる。吸引および吐出を行うために、吸引および吐出力を強くすると気泡の発生により核酸の回収効率が低下してしまう。直径または厚さが０．２ｍｍ未満の場合、モノリス構造体の強度が足りずもろく壊れやすくなるため、本発明のモノリス構造体の形状には適さない。
【００３５】
容器
本発明では、上記のようなモノリス構造体を、核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ容器に固定する。該容器において、モノリス構造体は、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定される。
モノリス構造体が容器に固定される位置は、特に限定されないが、容器の中心部より通液側にあることが好ましい。モノリス構造体から通液部側の開放面までの距離が２０ｍｍ以内であることがより好ましい。モノリス構造体から通液部側の開放面までの距離は溶液を吐出した後の残存溶液の増加を引き起こす。この理由によりモノリス構造体から通液部側の開放面までの距離は、溶液を吸引吐出する容器の構造上可能な限り、短いことが好ましい。
【００３６】
モノリス構造体を固定する容器は、ピペットチップが適している。チップ形状は特に限定されないが、一般的に利用されている円錐形で先が切断されており筒上のチップが好ましい。例えばレイニン社製の１０μＬから５０００μＬまでのチップや、エッペンドルフ社製の同じく１０μＬから５０００μＬまでのチップなどが利用できる。ピペットチップにモノリス構造体を固定した例を図１に示す。また、ピペットチップに限らず、圧力変化を起こす装置とのかん合部に密着できる形状であれば良く、所望の形状が選択できる。
チップへのモノリス構造体の固定はチップとモノリス構造体が強固に固定されるのであれば良く、例えば超音波による溶着法で固定できる。
【００３７】
核酸を含む溶液
核酸を含む溶液としては、特に限定されるものではないが、血液、血清、血球、喀痰、尿、胃液、スワブなどの生体試料が挙げられる。各生体試料に適した前処理方法を施したサンプルも含まれる。また培養した組織、細胞、細菌、ウイルスなども挙げられる。さらには別に最適な方法で核酸を抽出した溶液や精製後の核酸についても該当する。
【００３８】
吸引吐出を行うための装置
空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置、すなわち、モノリス構造体を固定した容器に圧力変化を加える装置（「吸引吐出装置」とも表現する。）としては溶液の吸引および吐出ができれば特に限定されないが、圧力変化を制御できる装置が好ましい。例えば、手動で操作が行えるピペットやシリンジなどが挙げられる。また自動装置であれば自動分注機のようにピペットチップをかん合し、吸引および吐出時の液量と速度が正確に制御できるものも適している。例えば、ニチリョー製のＭｕｌｔｉ−ＣＨＯＴ（商標登録）の１０００μＬディスポーザブルチップヘッドを利用して、モノリス構造体を固定した容器を勘合させ、通常のピペットチップのように吸引・吐出を行うことができる。
【００３９】
モノリス構造体が固定された容器と、溶液の吸引および吐出の圧力変化を生み出す装置とのかん合部は、空気が漏れないことが望ましい。容器と装置のかん合部で空気漏れが起こると吸引および吐出力の著しい低下が起こり、モノリス構造体での溶液の通過が制御できなくなる。
【００４０】
容器における通液部は溶液と接触する部分を示し、吸引する時に最初に溶液が通過する部分である。通液部は溶液を吸引しやすい形状がよく、ピペットチップの先端のような形状が好ましい。また、通気部は圧力変化を生み出す装置を接続できる開放面を示し、吸引する時に最初に気体が通過する部分である。通気部は吸着液または洗浄液の量によっては吸引および吐出時に溶液が通過することもある。
【００４１】
溶液の吸引速度
高い核酸回収率を得るには、溶液中の核酸とモノリス構造体表面との接触時間を長くする必要がある。接触時間を長くするためには、溶液の吸引および吐出速度は極力遅いほうが好ましい。しかしながら、簡便、迅速な核酸抽出方法が望まれており、短時間かつ高回収率達成可能な吸引および吐出速度が好ましい。
吸引および吐出速度は一定量の溶液を吸引するのに要した時間（秒）あるいは一定量の溶液を吐出するのに要した時間（秒）で定義される。例えば、５００μＬの溶液を吸引する場合、モノリス構造体を固定した容器の先端に溶液を吸引した時点からモノリス構造体を固定した容器に５００μＬの溶液が全て吸引された時点の時間を計測し、５秒かかった時は１００μＬ／秒とする。また、吐出も同様にモノリス構造体を固定した容器の内部に保持した５００μＬの溶液を、モノリス構造体を固定した容器外へ溶液を押し出した時点の時間を計測して算出できる。
【００４２】
溶液を急激に吸引させると核酸を含む溶液中に気泡が発生する。気泡の発生により核酸のモノリス構造体への吸着作用が弱まるとともに接触時間が短くなることで核酸の吸着効率は低下する。５００μＬ／秒を超える吸引速度はモノリス構造体の抵抗があるため達成が困難である。溶液の粘性によっても吸引速度の上限は異なるため限定はされないが、一般的なピペット操作で吸引し得る溶液であれば、吸引速度は、例えば５００μＬ／秒以下が好ましく、３００μＬ／秒以下がより好ましく、２００μＬ／秒以下がさらに好ましい。
【００４３】
溶液を急激に吐出させるとモノリス構造体に吸着している核酸を物理的に脱離させる可能性がある。吐出時の核酸の脱離は再度モノリス構造体への吸着が必要となり、結果吸着効率のロスとなり得る。５００μＬ／秒を超える吐出速度はモノリス構造体の抵抗があるため達成が困難である。吸引速度と同じく溶液の粘性によって吐出速度の上限は異なるため限定はされないが、一般的なピペット操作で吐出し得る溶液であれば、例えば５００μＬ／秒以下が好ましく、３００μＬ／秒以下がより好ましく、２００μＬ／秒以下がさらに好ましい。
吸引吐出速度の下限については、全体の処理時間を考慮して、迅速性が損なわれない程度に適宜設定すればよく、特に限定されない。
【００４４】
核酸抽出方法
本発明の核酸抽出方法では、上記のモノリス構造体を固定した容器の通気部側を、吸引吐出装置に接続し、ブーム法として広く知られているシリカを用いた核酸抽出方法と同様の原理で、核酸の固相担体への特異的な結合・洗浄および溶出により核酸を抽出する。
【００４５】
核酸のモノリス構造体への結合
核酸の固相担体への特異的な結合は、核酸を含む溶液を吸着液と混合し、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させることにより行われる。
吸着液は、核酸を効率よくモノリス構造体表面へ吸着させることができる組成であることが好ましい。
さらには、粘性が低く泡立ちの少ない溶液が適している。特に限定はされないが、シリカ担体に核酸を吸着させる時に用いるカオトロピック塩を用いることができる。例えば、グアニジウム塩、ヨウ化物塩が挙げられる。特にグアニジウム塩は濃度１Ｍから８Ｍの範囲で使用することが好ましい。さらに詳細にはグアニジウム塩としてグアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン硫酸塩などが使用できる。また、ヨウ化物塩として、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが使用できる。その他にも、チオシアン酸ナトリウム、尿素などが使用できるがこの限りではない。
吸着液のｐＨは２〜７であることが好ましい。ｐＨ３〜６であることがさらに好ましい。吸着液のｐＨを安定化させるため、緩衝液を用いることができる。また、酢酸塩などの塩を加えることができる。酢酸塩は一価の陰イオンとの塩が好ましく、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸リチウムを用いることができる。
【００４６】
洗浄
核酸をモノリス構造体に特異的に結合させたのち、容器内の液体は吐出され、次にモノリス構造体および容器内の洗浄を行う。
洗浄は、洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出することにより行われる。
洗浄液には、モノリス構造体に吸着している核酸を脱離させない溶液が好ましい。さらには、粘性が低く泡立ちの少ない溶液が適している。核酸を溶解しない溶液、例えば３０％以上の濃度のアルコール類が挙げられる。アルコール類はエタノール、イソプロパノール、１−プロパノールが好ましい。また、アルコール類とカオトロピック塩との組み合わせも洗浄液の試薬組成として適している。カオトロピック塩は吸着液のカオトロピック塩濃度よりも低い濃度であれば良く、３Ｍ以下が好ましく、２Ｍ以下がより好ましく、１Ｍ以下がさらに好ましい。アルコール類はカオトロピック塩と混合して用いる場合、１０％以上の濃度が好ましく、３０％以上の濃度がさらに好ましい。
【００４７】
溶出
洗浄後、モノリス構造体からの核酸の溶出を行う。
溶出は、溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出することにより行われる。
溶出液については、核酸を溶解し、モノリス構造体から脱離できる溶液が好ましい。さらには、核酸抽出後の反応、例えばＰＣＲに代表される核酸増幅反応を阻害しない溶液組成が好ましい。例えば、トリス緩衝液などの低濃度緩衝液、水酸化ナトリウム溶液や水酸化カリウム溶液などのｐＨ７以上の溶液、好ましくはアルカリ性溶液が挙げられる。また、溶出液の温度を上げることによってモノリス構造体に吸着した核酸を溶出することもできる。この場合は特にアルカリ性溶液を用いなくとも効率よく吸着した核酸を溶出することが可能である。
【００４８】
吸引および吐出回数
上記の結合、洗浄、溶出の各工程においては、吸引および吐出を複数回行っても良い。
結合（吸着）工程においては、核酸を含む溶液の吸引および吐出回数を増加させることにより、核酸とモノリス構造体との接触時間を延ばすことができ、それが、吸引・吐出速度と並んで核酸の吸着効率に影響を与えている。接触機会を増やす点では回数は多いほうが好ましいが、速度同様迅速な核酸抽出を達成するためにはより少ない回数で高い吸着効率を得られることが望ましい。
【００４９】
吸着液は、１００％近い状態で核酸をモノリス構造体に吸着させるために、回数はより重要で少なくとも２回以上が好ましく、３回以上が好ましい。さらに５回以上が好ましく、より好ましくは１０回以上である。吸引・吐出速度とも関係し、例えば１００μＬ／秒の速度で吸引・吐出を行った場合、吸着液を１０回吸引・吐出すれば核酸の吸着はほぼ１００％となる。
【００５０】
洗浄工程においては、洗浄液は、核酸を脱離させず吸着液の除去・希釈が目的であるため吸引・吐出回数は限定されない。むしろ回数ではなく、洗浄に用いていない新しい洗浄液を少なくとも２回以上用いることが好ましい。より好ましくは洗浄工程を３回以上繰り返す。
【００５１】
溶出工程においては、溶出液の吸引吐出回数は、モノリス構造体に吸着している核酸を１００％近く溶解できる回数が好ましい。洗浄液の残存により核酸の溶出液への溶解が妨げられるため、少なくとも２回以上の吸引・吐出回数が好ましい。少なくとも３回以上がより好ましく、少なくとも５回以上がさらに好ましい。５回以上の吸引・吐出を繰り返せば、溶出液中へ残存していた洗浄液が溶け込み、モノリス構造体に吸着している核酸と溶出液が接触するため、核酸がモノリス構造体へ残存することなく溶出される。
【実施例１】
【００５２】
〔細孔径の異なるモノリス構造体を用いた細菌ゲノムの添加回収〕
（１）試料の調製
細菌ゲノムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ株のゲノムを使用した。３％小川培地（日水製薬製）にて培養後、フェノール・クロロホルム法にてゲノムＤＮＡを抽出して添加回収用試料とした。
【００５３】
（２）材料の準備
細孔径が１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍと異なるモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに超音波により溶着する方法で固定したもの（以下モノリスチップと略す）を作成した。その他モノリス構造体の性状は全て切断面積３．１４平方ｍｍ、厚さ１ｍｍとした。圧力変化を起こす装置として、テルモ製１ｍＬシリンジを利用した。吸着液は５Ｍグアニジンチオシアン酸、０．８Ｍ酢酸カリウム溶液、洗浄液は０．８Ｍ酢酸カリウム溶液、７０％エタノール、溶出液には１０ｍＭ水酸化カリウム溶液を使用した。サンプルには抽出した添加回収用試料を１０ｍＭトリス緩衝液で１μＬ中に約１０００コピー含むように希釈して用いた。
【００５４】
（３）モノリスチップによる細菌ゲノムの添加回収
モノリス構造体の細孔径が異なる５種類のモノリスチップを利用して、それぞれ図２の簡略図に示されるような操作を実施した。
以下に詳細に記載する。１．５ｍＬのチューブに吸着液５００μＬを分注し、サンプル１００μＬを加えてピペッティングにて５回混合した。シリンジに装着した各モノリスチップを用いて吸着液・サンプル混合液を１００μＬ／秒の速度で１０回吸引および吐出した。混合液を完全に出し切った後に、洗浄液５００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、洗浄液を１００μＬ／秒の速度で３回吸引および吐出して洗浄した。洗浄工程をもう一度繰り返した。最後に溶出液１００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、溶出液を１００μＬ／秒の速度で５回吸引および吐出してモノリスチップ内に吸着したゲノムＤＮＡを溶出した。溶出効率の低下を抑えるため、吸引および吐出の間はモノリス構造体に空気が接触しないように注意した。
【００５５】
（４）リアルタイムＰＣＲ検出
モノリス構造体の細孔径が異なるモノリスチップを利用して添加回収した５種類のゲノムＤＮＡ溶液、モノリスチップによる添加回収を実施していないサンプル（標準物質）および陰性コントロールをそれぞれ（５）に示す試薬に添加して、（６）に示す条件によりリアルタイムＰＣＲ検出を行った。オリゴ１およびオリゴ２をプライマーとして使用し、かつオリゴ３をプローブとして使用した試薬はＢＣＧ株を特異的に検出できるプライマー及びプローブの組み合わせである。増幅産物とプローブがハイブリダイゼーションすることでプローブに標識された蛍光色素の蛍光が消光することを検出原理としている。核酸増幅および検出にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、得られたリアルタイム検出データを利用して、アニーリング時のＱＰｒｏｂｅ消光率を算出した。さらに消光率２％に達したサイクル数を求めて、従来のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたリアルタイム定量ＰＣＲ法同様に解析を行った。添加回収効率は標準物質の検出を１００％として、それぞれのサンプルについて算出した。
【００５６】
（５）試薬組成
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（配列番号１） ２５０ｎＭ、
オリゴ２（配列番号２） １５００ｎＭ、
オリゴ３（配列番号３）（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
溶出液 １μＬ
【００５７】
（６）核酸増幅および検出条件
９４℃２分
９８℃０秒、６０℃５秒（蛍光検出）、５０サイクル
９４℃６０秒、４０℃６０秒、４０℃から７５℃へ０．５℃／秒の温度上昇
【００５８】
（７）結果
表１は、モノリス構造体の細孔径が異なる５種類のモノリスチップを利用して添加回収したゲノムＤＮＡ溶液を用いて検出・解析した添加回収率を示している。表１より明らかなようにモノリス構造体の細孔径が２０μｍから５０μｍで回収が可能であった。２０μｍから４０μｍで回収率が５０％以上となり良好な結果を示した。
１０μｍの細孔径を持つモノリス構造体を用いて回収を行った場合、吸着液の吸引・吐出が液詰まりにより困難となり、添加回収操作を途中で断念した。
【００５９】
【表１】
【実施例２】
【００６０】
〔直径の異なるモノリスチップを用いた細菌ゲノムの添加回収〕
（１）使用した材料、操作方法、測定方法、解析方法
直径が０．４ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍと異なるモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに固定したもの（以下モノリスチップと略す）を作成した。また直径が４ｍｍ、１０ｍｍのものについてはそれぞれ内径４ｍｍ、１０ｍｍで１ｍＬのシリンジにかん合できる容器に固定した。その他モノリス構造体の性状は全て平均細孔径３０μｍ、厚さ１ｍｍとした。それぞれの切断面積は、０．１２６平方ｍｍ、１．７６７平方ｍｍ、３．１４平方ｍｍ、７８．５平方ｍｍとなる。その他の材料、操作方法、測定方法、解析方法は実施例１に従って実施した。
【００６１】
（２）結果
表２は、モノリス構造体の切断面積が異なる５種類のモノリスチップを利用して添加回収したゲノムＤＮＡ溶液を用いて検出および解析した添加回収率を示している。表２より明らかなようにモノリス構造体の直径が０．４ｍｍから１０ｍｍで核酸の回収が可能であった。直径が１０ｍｍの場合は、モノリス構造体への残液量が増えて溶出後の溶液量が少なくなった。また吸引および吐出速度を２００μＬ／秒以上にすると溶出工程中に空気が入りやすいため、注意する必要がある。
【００６２】
【表２】
【実施例３】
【００６３】
〔厚さの異なるモノリスチップを用いた細菌ゲノムの添加回収〕
（１）使用した材料、操作方法、測定方法、解析方法
厚さが１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍと異なるモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに固定したもの（以下モノリスチップと略す）を作成した。その他モノリス構造体の性状は全て平均細孔径３０μｍ、切断面３．１４平方ｍｍとした。その他の材料、操作方法、測定方法、解析方法は実施例１に従って実施した。
【００６４】
（２）結果
表３は、モノリス構造体の厚さが異なる４種類のモノリスチップを利用して添加回収したゲノムＤＮＡ溶液を用いて検出および解析した添加回収率を示している。表３より明らかなようにモノリス構造体の厚さが１ｍｍから５ｍｍで核酸の回収が可能であった。厚さが１０ｍｍの場合は、モノリス構造体の通液抵抗が増加しており、操作に１０分以上を要したため、迅速な核酸抽出には適さなかった。
【００６５】
【表３】
【実施例４】
【００６６】
〔モノリスチップの通液性テスト〕
（１）材料の準備
モノリス構造体は円柱状で平均細孔径３０μｍ、直径２ｍｍ、厚さ１ｍｍを基本構造とした。平均細孔径を１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍに変更したもの、直径を０．４ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍに変更したもの、厚さを１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍに変更したもの、合計１４種類を使用した。それぞれを適した容器に固定したものをモノリスチップとした。テストに用いる粘性溶液には０．１％ムチン溶液（シグマ社製）となるように含有した実施例１の吸着液を使用した。圧力変化を起こす器具は実施例１同様に１ｍＬのシリンジを利用した。
【００６７】
（２）通液性テストの方法
１．５ｍLチューブに分注した吸着液５００μＬに粘性溶液１００μＬを混合し、ピペッティングにより混合十分に混合した。テストするモノリスチップを用いて、混合液６００μＬを全量吸引（チューブ内に粘性溶液がない状態で、かつ液下面がモノリス構造体の下にある状態、図３に例示した）後、全量吐出（モノリスチップ内の溶液を出し切った状態）までの時間を計測した。
【００６８】
（３）通液性テストの判断基準
粘性溶液を用いて吸引および吐出した時にかかる時間が６０秒以内である時を通液性良好とした。６０秒を超える時は通液性不良とした。
【００６９】
（４）結果
表４から表６に示されるように、平均細孔径１０μｍ、２０μｍ、直径０．４ｍｍ、厚さ５ｍｍ、１０ｍｍにそれぞれ変更したモノリス構造体を用いた場合にモノリス構造体中での抵抗が強く、通液性が不良であった。平均細孔径２０μｍ、直径０．４ｍｍ、厚さ５ｍｍに変更したモノリス構造体の場合、ゲノム溶液程度なら問題はないが、臨床検体など不純物が含まれ、粘性のある溶液を使用した場合に液詰まりの可能性がある。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
【表６】
【実施例５】
【００７３】
〔細菌ゲノムの添加回収時間の比較〕
（１）使用した材料、操作方法、測定方法、解析方法
平均細孔径３０μｍ、切断面３．１４平方ｍｍ、厚さ１ｍｍのモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに固定したモノリスチップを作成した。その他の材料、操作方法、測定方法、解析方法は実施例１に従って実施した。３回実施して、それぞれの時間を計測した。
【００７４】
（２）結果
細菌ゲノム溶液の混合から溶出完了までの時間は、４分００秒、３分４７秒、３分５３秒であった。吸引吐出を用いた核酸精製方法として開示されている特開２００７−３０６９６７では吸引吐出による核酸の精製は、全血サンプルの混合から溶出完了までの時間が比較例では１６分、加圧と減圧を同時に行う方法で８分であり、本発明による方法は極めて迅速な核酸精製方法であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、臨床診断上重要な生体試料から迅速、かつ簡便に核酸を抽出または精製することが可能となる。具体的には、診察によって得られた遺伝子増幅法の阻害物質を含む生体試料から１０分以内に核酸を抽出および精製できる。また、溶液の吸引および吐出のみの操作であるため、遠心操作が不要で機器への適用が容易に達成される。よって臨床現場での需要も高く、産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は不純物の混じったサンプル中から核酸を簡便、迅速に抽出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査分野では病原細菌遺伝子や薬物代謝に関与する遺伝子をターゲットとした遺伝子検査が広まってきている。遺伝子検査は核酸を短時間で指数関数的に増幅させるため、他の臨床検査に比べて感度、迅速性に優れる検査である。核酸増幅技術はこれまで様々な技術が開発されてきている。例えば、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮなどが挙げられる。これらの技術は、検体中に含まれる核酸を鋳型にして増幅されること、増幅を行う前の検体の状態によって阻害を受けやすいことから、検体からの核酸の抽出、不純物の除去など、検体の前処理方法が特に重要であることが知られている。
【０００３】
現在主に用いられている核酸抽出法の基礎となっている技術は、特許文献１に示されているカオトロピック剤およびシリカを用いた方法で、ヒトの血清や尿などから核酸を精製することができる。具体的にはシリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニジンチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に吸着（結合）した複合体を遠心分離により沈降させた後、上清を廃棄し、残った複合体に洗浄液を加えて洗浄し、再沈殿させた複合体をエタノール水溶液で洗浄した後アセトンで洗浄し、アセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する方法が記載されている。
【０００４】
上記方法をさらに発展させた様々な方法が開示されている。特許文献２には磁性粒子を利用して核酸を簡便に抽出する方法が記載されている。核酸と特異的に吸着しない磁性粒子を、核酸を含む溶液に懸濁し、塩とアルコールを加えて核酸を不溶化させ、冷却することで磁性粒子の周りに核酸を凝集させる。磁界を与え、磁性粒子と核酸の複合体を凝集させ、上清を除去し、溶出液を加えて核酸を再溶解させ、磁界を与えて磁性粒子を沈殿させて、核酸が溶解した上清を得る。
【０００５】
特許文献３にはシリカ担体を保持したカラムを利用して核酸を効率よく抽出する方法が示されている。孔径が＜５μｍのシリカゲル、ガラスまたは石英の繊維でできた網状の薄膜を中空体中に保持された５０〜２００μｍの孔径のポリエチレンフリットの間に挿入したものをカラムとしている。該カラムを用いて、核酸を含む溶液を高イオン強度の緩衝液と混合し、混合液を吸引もしくは遠心分離により薄膜を通過させて吸着させている。さらにアルコールを含む洗浄液で洗浄し、低イオン強度の緩衝液で溶出している。シリカ粒子を核酸吸着担体に用いる「バッチ式」の方法に比べて液が一方向に流れるため核酸の吸着効率は高くなる。
【０００６】
特許文献４ではカラム中の核酸吸着担体に一体型モノリス構造体を利用した核酸精製方法が開示されている。モノリス構造体を用いることにより、液残りが少なく、遠心力が従来のカラムを利用した核酸精製方法よりも少なくてすむという利点があった。
【０００７】
特許文献５にはより簡便に核酸を抽出する方法が示されている。シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続し、固相への核酸の吸着を促進する物質と核酸含有試料との混合液を所定容器から液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸引し、核酸を固相に吸着した後、核酸捕捉用チップ内の液体を排除し、次いで洗浄液を吸引、排出することにより核酸捕捉チップ内を洗浄し、洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、固相から溶離された核酸を含む溶離液を精製品容器に吐出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第２６８０４６２号
【特許文献２】特許第２７０３１１４号
【特許文献３】特許公表平８−５０１３２１号
【特許文献４】特開２００５−２２４１６７号
【特許文献５】特開平１１−２６６８６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述の磁性粒子を用いた核酸抽出方法では、自動化が容易に行える利点がある一方で凝集粒子に付着した残存アルコールや核酸溶解上清中に懸濁された細かい磁性粒子によって核酸増幅が阻害される問題があった。
【００１０】
また、シリカ担体を保持したカラムを用いる核酸抽出方法では、溶液をカラム通過させる時に吸引装置や遠心分離機などの特別な装置が必要であるため、簡便な方法ではなかった。
【００１１】
シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップを用いる方法では、遠心分離機などの特別な装置を必要としないが、簡便さを追求した半面、核酸回収効率の低下および不純物を多く含むサンプルでは担体が詰まり液の吸引ができないという問題点があった。
【００１２】
本発明の目的は、核酸含有溶液、特に生物試料中に含まれる核酸を標的として、従来よりも簡便、迅速に核酸を抽出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、核酸回収容器の核酸吸着担体として通液孔、直径、厚さを限定したモノリス構造体を用いることで核酸含有溶液を大気圧以下で吸引・吐出可能な液通りと核酸回収効率とを両立できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１４】
［項１］
核酸を含む溶液から核酸を抽出する方法であって、
空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置を使用して、核酸の固相担体への特異的な吸着・洗浄および溶出により核酸を抽出する方法において、
次の（１）〜（６）の工程を含む核酸抽出方法。
（１）以下の（ａ）（ｂ）の特徴を有する容器を準備する工程。
（ａ）核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ。
（ｂ）固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている。
（２）該容器の通気部側を吸引吐出機構に接続する工程。
（３）核酸を含む溶液と吸着液を混合する工程。
（４）核酸を含む溶液と混合した吸着液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させて核酸をモノリス構造体に吸着した後、容器内の液体を吐出する工程。
（５）洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出する工程。
（６）溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出する工程。
［項２］
モノリス構造体の通液方向に対して垂直方向の切断面積が０．１平方ｍｍ以上１００平方ｍｍ以下である項1に記載の核酸抽出方法。
［項３］
モノリス構造体の通液方向の厚さが０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下である項1または２に記載の核酸抽出方法。
［項４］
溶液の吸引速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である項１から３のいずれかに記載の核酸抽出方法。
［項５］
溶液の吐出速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である項１から４のいずれかに記載の核酸抽出方法。
［項６］
吸着液がカオトロピック塩を含む項１に記載の核酸抽出方法。
［項７］
吸着液がカオトロピック塩を含み、かつ酢酸塩を含む項６に記載の核酸抽出方法。
［項８］
カオトロピック塩が、グアニジン塩、ヨウ化物塩および尿素からなる群より選ばれるいずれか１つ以上である項６または７のいずれかに記載の核酸抽出方法。
［項９］
洗浄液がアルコール類を含む項１に記載の核酸抽出方法。
［項１０］
洗浄液がアルコール類を含み、かつ酢酸塩を含む項９に記載の核酸抽出方法。
［項１１］
アルコール類が、エタノール、イソプロパノールおよび１−プロパノールからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である項９または１０に記載の核酸抽出方法。
［項１２］
酢酸塩が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸リチウムからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である項７または１０に記載の核酸抽出方法。
［項１３］
溶出液がｐＨ７以上の溶液であることを特徴とする項１に記載の核酸抽出方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、以上のように核酸回収効率が良く、迅速かつ簡便な操作で核酸を抽出することが可能となる。具体的には、複雑な操作を行っていた核酸抽出がより安価で簡便な操作で実現可能である。また、自動化についても容易に達成でき、より小型で安価な装置への適用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】モノリス構造体を固定したチップの一例
【図２】モノリスチップによる核酸の添加回収方法の概略図。
【図３】モノリスチップによる吸引方法
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一つの実施形態は、核酸を含む溶液から核酸を抽出する方法であって、空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置を使用して、核酸の固相担体への特異的な結合・洗浄および溶出により核酸を抽出する方法において、
次の（１）〜（６）の工程を含む核酸抽出方法である。
（１）以下の（ａ）（ｂ）の特徴を有する容器を準備する工程。
（ａ）核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ。
（ｂ）固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている。
（２）該容器の通気部側を吸引吐出機構に接続する工程。
（３）核酸を含む溶液と吸着液を混合する工程。
（４）核酸を含む溶液と混合した吸着液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させて核酸をモノリス構造体に吸着した後、容器内の液体を吐出する工程。
（５）洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出する工程。
（６）溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出する工程。
【００１８】
本発明の実施形態における特徴の一つは、通液部側および通気部側の二方向に開放面をもち、かつ、固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている容器を使用することである。
【００１９】
モノリス構造体の作製方法
本発明で用いるモノリス構造体は、一体成型された多孔質体を意味し、以下に例示する方法で作製することができるが、特に限定されるものではない。
【００２０】
モノリス構造体は、主に、ゾル−ゲル法で作成することができる。即ち、金属アルコキシドを部分的に加水分解して反応性モノマーを作り、このモノマーを重縮合してコロイド状オリゴマーを作り（ゾルの生成）、更に加水分解して重合と架橋を促進させ、三次元構造を作る（ゲルの生成）ことで合成される。
この反応時に種々の有機モノマーを添加すると、有機・無機ハイブリッドモノリスも簡単に作成できる。従って、添加する有機モノマーの種類によって、化学的特性を加えることも可能となる。
例えば、親水基を持つ有機モノマーを添加することによって、水系試料成分の吸水性を向上することができる。又、有機・無機を混在させることによって、モノリス構造体の化学的安定を上げることも可能となる。ゾル−ゲル法にて作成される有機・無機ハイブリッドモノリス構造体は、添加有機モノマーの種類で目的に応じた化学表面を構成したり、化学的安定性を向上したりといった性質を付加できる。核酸抽出において有効なモノリス特性を目的に応じて自由に改善できることを示している。
【００２１】
更に、ゾル−ゲル方法から作成したモノリス構造体は金属の含有が少ないという点で適している。一般的なシリカゲルなどは、ケイ酸ナトリウムなどから作成され、多量の金属が残る。確かに、一部では精製したケイ酸ナトリウムからの作成やゾル−ゲル法からの高純度のシリカゲルもあるが、それらは高価であり、使い捨てで使用する核酸回収容器としては適さない。又、安価に出来たとしても、粒子作成時点ではバッチ式合成であり、合成雰囲気から金属濃縮が生じる可能性が大きい。ゾル−ゲル法におけるモノリス構造体の合成においては、連続行程により作成され、金属のコンタミネーションは全くない。従来、シリカゲルでは、塩酸や硝酸等で洗浄するなどの工夫や、金属影響を減らすようなＥＤＴＡなどの添加があったが、本発明のモノリス構造体では全く必要ない。
【００２２】
もう一法として、ガラス分相によってもモノリス構造体を作成できる。
基本的には、ゾルーゲル法からのモノリス構造体の合成と同様の有効性があるが、ゾルーゲルモノリスよりもマクロ細孔を大きく作る事ができるので、２次ミクロ細孔を内部表面に作る場合に有効である。更に、ガラス分相は、その組成より耐アルカリ性が高く、アルカリ洗浄による再生が出来ると言うメリットがある。
【００２３】
前述のようなゾル−ゲル法で作成したモノリス構造体は、例えばＨＰＬＣ用カラムで使用されていることが、一般的に知られている。
【００２４】
上述の方法によりシリカ表面にシラノール基が付与される。
核酸抽出に用いるモノリス構造体は、ブーム法として広く知られているシリカを用いた核酸抽出方法と同様の原理で核酸を吸脱着させるため、表面にシラノール基を持つことが好ましい。
【００２５】
モノリス構造体の特性
本発明の実施形態における特徴の一つは、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体を用いることである。
【００２６】
モノリス構造体の利点は、液の通過する細孔径を制御して生成できる点にある。本発明では溶液の吸引・吐出により溶液の通過を行うため、従来遠心によって溶液を通過させていたモノリス構造体の細孔径では液詰まりを起こす。吸引・吐出に適したモノリス構造体の細孔径は、吸引・吐出により溶液の液詰まりが起こらず、かつ核酸が回収できればよい。
【００２７】
圧力変化によって溶液を吸引・吐出する時に、溶液の粘性や純度が液詰まりに関係する。特に生体試料の場合、タンパク質などの不純物が多く含まれるため液詰まりを起こす可能性が高くなる。このような生体試料からの核酸抽出に適したモノリス構造体の細孔径は２０μｍ以上が好ましい。さらに通液性を考えると粘性の高い溶液を使用する場合、３０μｍ以上がより好ましい。２０μｍ未満になると大気圧下の吸引・吐出操作では使用溶液中に不純物が含まれるとモノリス構造体の通液が難しくなる。
【００２８】
また、モノリス構造体への核酸の吸着には溶液中の核酸とモノリス構造体の接触が必要となる。核酸がモノリス構造体表面へ効率よく接触するには溶液の通過する細孔径が小さいほうが良く、特に限定はされないが、１００μｍ以下が好ましく、６０μｍ以下がより好ましく、５０μｍ以下がさらに好ましく、４０μｍ以下がさらに好ましい。
【００２９】
通液性と核酸吸着効率を両立させるモノリス構造体の細孔径の下限は、好ましくは２０μｍ以上であり、さらに好ましくは３０μｍである。上限は、好ましくは６０μｍ以下であり、さらに好ましくは４０μｍ以下である。このようなモノリス構造体の細孔径は電子顕微鏡映像から通液孔の平均径によって求められる。さらに正確に測定する場合は、水銀圧入法を用いて測定することもできる。
【００３０】
モノリス構造体の体積も通液性及び核酸吸着効率に影響する。
吸着液や洗浄液の吸引および吐出時にはモノリス構造体の体積よりも溶液の体積のほうが極めて大きいため溶液の通過に影響は与えない。しかし、溶出液の場合は核酸の濃縮のためできるだけ少量を用いることが好ましく、少量の場合はモノリス構造体を通過する時の溶液通過速度の制御が難しくなる。溶出液の体積がモノリス構造体の体積と同じ場合は、吸引および吐出する時に気体を含む可能性が高く、溶出液の制御が極めて難しい。例えば、使用する溶出液とモノリス構造体の体積の比が２以上であることが好ましい。より好ましくは４以上である。さらに好ましくは５以上である。特に限定はされないが、モノリス構造体の形状は、円柱形、直方体、円錐形、円錐形を切断した形、球などが考えられる。形状は容器の形状や大きさによって選択される。
【００３１】
本発明において、モノリス構造体の切断面積は０．１平方ｍｍ以上１００平方ｍｍ以下であることが好ましく、１平方ｍｍ以上３０平方ｍｍ以下がより好ましい。さらに好ましくは１平方ｍｍ以上５０平方ｍｍ以下であり、３平方ｍｍ以上２０平方ｍｍ以下である。
【００３２】
モノリス構造体の通液方向に対して垂直方向の切断面積とは、容器中にモノリス構造体を固定した時の開放面に対して平行に切断したモノリス構造体の面の面積を示す。切断位置はモノリス構造体の中間で切断した面の面積を切断面積とする。切断面の形は円形や四角形が主に挙げられるが、この限りではない。
【００３３】
モノリス構造体と固定する容器との溶着を隙間なく行うために、切断面は円形であることが好ましく、切断面積は半径、半径、３．１４の積で算出できる。
【００３４】
モノリス構造体の通液性及び核酸吸着効率は同じ体積でも形状によって異なる。一例を挙げると、円柱形のモノリス構造体を用いた場合モノリス構造体の製造または強度確保の点から直径０．２ｍｍ以上、通液方向の厚さ０．２ｍｍ以上が好ましい。厚さは０．２ｍｍ以上５ｍｍ未満が好ましく、０．４ｍｍ以上４ｍｍ未満がより好ましい。さらに好ましくは０．８ｍｍ以上２ｍｍ未満である。厚さが厚くなればモノリス構造体で生じる抵抗が大きくなり、通液が困難になる。直径は０．２ｍｍ以上１０ｍｍ未満が好ましく、０．５ｍｍ以上８ｍｍ未満がより好ましい。さらに好ましくは１ｍｍ以上５ｍｍ未満である。厚さが１０ｍｍを超える場合は、モノリス構造体による溶液抵抗が増加するため、溶液の吸引および吐出が困難となる。吸引および吐出を行うために、吸引および吐出力を強くすると気泡の発生により核酸の回収効率が低下してしまう。直径または厚さが０．２ｍｍ未満の場合、モノリス構造体の強度が足りずもろく壊れやすくなるため、本発明のモノリス構造体の形状には適さない。
【００３５】
容器
本発明では、上記のようなモノリス構造体を、核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ容器に固定する。該容器において、モノリス構造体は、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定される。
モノリス構造体が容器に固定される位置は、特に限定されないが、容器の中心部より通液側にあることが好ましい。モノリス構造体から通液部側の開放面までの距離が２０ｍｍ以内であることがより好ましい。モノリス構造体から通液部側の開放面までの距離は溶液を吐出した後の残存溶液の増加を引き起こす。この理由によりモノリス構造体から通液部側の開放面までの距離は、溶液を吸引吐出する容器の構造上可能な限り、短いことが好ましい。
【００３６】
モノリス構造体を固定する容器は、ピペットチップが適している。チップ形状は特に限定されないが、一般的に利用されている円錐形で先が切断されており筒上のチップが好ましい。例えばレイニン社製の１０μＬから５０００μＬまでのチップや、エッペンドルフ社製の同じく１０μＬから５０００μＬまでのチップなどが利用できる。ピペットチップにモノリス構造体を固定した例を図１に示す。また、ピペットチップに限らず、圧力変化を起こす装置とのかん合部に密着できる形状であれば良く、所望の形状が選択できる。
チップへのモノリス構造体の固定はチップとモノリス構造体が強固に固定されるのであれば良く、例えば超音波による溶着法で固定できる。
【００３７】
核酸を含む溶液
核酸を含む溶液としては、特に限定されるものではないが、血液、血清、血球、喀痰、尿、胃液、スワブなどの生体試料が挙げられる。各生体試料に適した前処理方法を施したサンプルも含まれる。また培養した組織、細胞、細菌、ウイルスなども挙げられる。さらには別に最適な方法で核酸を抽出した溶液や精製後の核酸についても該当する。
【００３８】
吸引吐出を行うための装置
空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置、すなわち、モノリス構造体を固定した容器に圧力変化を加える装置（「吸引吐出装置」とも表現する。）としては溶液の吸引および吐出ができれば特に限定されないが、圧力変化を制御できる装置が好ましい。例えば、手動で操作が行えるピペットやシリンジなどが挙げられる。また自動装置であれば自動分注機のようにピペットチップをかん合し、吸引および吐出時の液量と速度が正確に制御できるものも適している。例えば、ニチリョー製のＭｕｌｔｉ−ＣＨＯＴ（商標登録）の１０００μＬディスポーザブルチップヘッドを利用して、モノリス構造体を固定した容器を勘合させ、通常のピペットチップのように吸引・吐出を行うことができる。
【００３９】
モノリス構造体が固定された容器と、溶液の吸引および吐出の圧力変化を生み出す装置とのかん合部は、空気が漏れないことが望ましい。容器と装置のかん合部で空気漏れが起こると吸引および吐出力の著しい低下が起こり、モノリス構造体での溶液の通過が制御できなくなる。
【００４０】
容器における通液部は溶液と接触する部分を示し、吸引する時に最初に溶液が通過する部分である。通液部は溶液を吸引しやすい形状がよく、ピペットチップの先端のような形状が好ましい。また、通気部は圧力変化を生み出す装置を接続できる開放面を示し、吸引する時に最初に気体が通過する部分である。通気部は吸着液または洗浄液の量によっては吸引および吐出時に溶液が通過することもある。
【００４１】
溶液の吸引速度
高い核酸回収率を得るには、溶液中の核酸とモノリス構造体表面との接触時間を長くする必要がある。接触時間を長くするためには、溶液の吸引および吐出速度は極力遅いほうが好ましい。しかしながら、簡便、迅速な核酸抽出方法が望まれており、短時間かつ高回収率達成可能な吸引および吐出速度が好ましい。
吸引および吐出速度は一定量の溶液を吸引するのに要した時間（秒）あるいは一定量の溶液を吐出するのに要した時間（秒）で定義される。例えば、５００μＬの溶液を吸引する場合、モノリス構造体を固定した容器の先端に溶液を吸引した時点からモノリス構造体を固定した容器に５００μＬの溶液が全て吸引された時点の時間を計測し、５秒かかった時は１００μＬ／秒とする。また、吐出も同様にモノリス構造体を固定した容器の内部に保持した５００μＬの溶液を、モノリス構造体を固定した容器外へ溶液を押し出した時点の時間を計測して算出できる。
【００４２】
溶液を急激に吸引させると核酸を含む溶液中に気泡が発生する。気泡の発生により核酸のモノリス構造体への吸着作用が弱まるとともに接触時間が短くなることで核酸の吸着効率は低下する。５００μＬ／秒を超える吸引速度はモノリス構造体の抵抗があるため達成が困難である。溶液の粘性によっても吸引速度の上限は異なるため限定はされないが、一般的なピペット操作で吸引し得る溶液であれば、吸引速度は、例えば５００μＬ／秒以下が好ましく、３００μＬ／秒以下がより好ましく、２００μＬ／秒以下がさらに好ましい。
【００４３】
溶液を急激に吐出させるとモノリス構造体に吸着している核酸を物理的に脱離させる可能性がある。吐出時の核酸の脱離は再度モノリス構造体への吸着が必要となり、結果吸着効率のロスとなり得る。５００μＬ／秒を超える吐出速度はモノリス構造体の抵抗があるため達成が困難である。吸引速度と同じく溶液の粘性によって吐出速度の上限は異なるため限定はされないが、一般的なピペット操作で吐出し得る溶液であれば、例えば５００μＬ／秒以下が好ましく、３００μＬ／秒以下がより好ましく、２００μＬ／秒以下がさらに好ましい。
吸引吐出速度の下限については、全体の処理時間を考慮して、迅速性が損なわれない程度に適宜設定すればよく、特に限定されない。
【００４４】
核酸抽出方法
本発明の核酸抽出方法では、上記のモノリス構造体を固定した容器の通気部側を、吸引吐出装置に接続し、ブーム法として広く知られているシリカを用いた核酸抽出方法と同様の原理で、核酸の固相担体への特異的な結合・洗浄および溶出により核酸を抽出する。
【００４５】
核酸のモノリス構造体への結合
核酸の固相担体への特異的な結合は、核酸を含む溶液を吸着液と混合し、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させることにより行われる。
吸着液は、核酸を効率よくモノリス構造体表面へ吸着させることができる組成であることが好ましい。
さらには、粘性が低く泡立ちの少ない溶液が適している。特に限定はされないが、シリカ担体に核酸を吸着させる時に用いるカオトロピック塩を用いることができる。例えば、グアニジウム塩、ヨウ化物塩が挙げられる。特にグアニジウム塩は濃度１Ｍから８Ｍの範囲で使用することが好ましい。さらに詳細にはグアニジウム塩としてグアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン硫酸塩などが使用できる。また、ヨウ化物塩として、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが使用できる。その他にも、チオシアン酸ナトリウム、尿素などが使用できるがこの限りではない。
吸着液のｐＨは２〜７であることが好ましい。ｐＨ３〜６であることがさらに好ましい。吸着液のｐＨを安定化させるため、緩衝液を用いることができる。また、酢酸塩などの塩を加えることができる。酢酸塩は一価の陰イオンとの塩が好ましく、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸リチウムを用いることができる。
【００４６】
洗浄
核酸をモノリス構造体に特異的に結合させたのち、容器内の液体は吐出され、次にモノリス構造体および容器内の洗浄を行う。
洗浄は、洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出することにより行われる。
洗浄液には、モノリス構造体に吸着している核酸を脱離させない溶液が好ましい。さらには、粘性が低く泡立ちの少ない溶液が適している。核酸を溶解しない溶液、例えば３０％以上の濃度のアルコール類が挙げられる。アルコール類はエタノール、イソプロパノール、１−プロパノールが好ましい。また、アルコール類とカオトロピック塩との組み合わせも洗浄液の試薬組成として適している。カオトロピック塩は吸着液のカオトロピック塩濃度よりも低い濃度であれば良く、３Ｍ以下が好ましく、２Ｍ以下がより好ましく、１Ｍ以下がさらに好ましい。アルコール類はカオトロピック塩と混合して用いる場合、１０％以上の濃度が好ましく、３０％以上の濃度がさらに好ましい。
【００４７】
溶出
洗浄後、モノリス構造体からの核酸の溶出を行う。
溶出は、溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出することにより行われる。
溶出液については、核酸を溶解し、モノリス構造体から脱離できる溶液が好ましい。さらには、核酸抽出後の反応、例えばＰＣＲに代表される核酸増幅反応を阻害しない溶液組成が好ましい。例えば、トリス緩衝液などの低濃度緩衝液、水酸化ナトリウム溶液や水酸化カリウム溶液などのｐＨ７以上の溶液、好ましくはアルカリ性溶液が挙げられる。また、溶出液の温度を上げることによってモノリス構造体に吸着した核酸を溶出することもできる。この場合は特にアルカリ性溶液を用いなくとも効率よく吸着した核酸を溶出することが可能である。
【００４８】
吸引および吐出回数
上記の結合、洗浄、溶出の各工程においては、吸引および吐出を複数回行っても良い。
結合（吸着）工程においては、核酸を含む溶液の吸引および吐出回数を増加させることにより、核酸とモノリス構造体との接触時間を延ばすことができ、それが、吸引・吐出速度と並んで核酸の吸着効率に影響を与えている。接触機会を増やす点では回数は多いほうが好ましいが、速度同様迅速な核酸抽出を達成するためにはより少ない回数で高い吸着効率を得られることが望ましい。
【００４９】
吸着液は、１００％近い状態で核酸をモノリス構造体に吸着させるために、回数はより重要で少なくとも２回以上が好ましく、３回以上が好ましい。さらに５回以上が好ましく、より好ましくは１０回以上である。吸引・吐出速度とも関係し、例えば１００μＬ／秒の速度で吸引・吐出を行った場合、吸着液を１０回吸引・吐出すれば核酸の吸着はほぼ１００％となる。
【００５０】
洗浄工程においては、洗浄液は、核酸を脱離させず吸着液の除去・希釈が目的であるため吸引・吐出回数は限定されない。むしろ回数ではなく、洗浄に用いていない新しい洗浄液を少なくとも２回以上用いることが好ましい。より好ましくは洗浄工程を３回以上繰り返す。
【００５１】
溶出工程においては、溶出液の吸引吐出回数は、モノリス構造体に吸着している核酸を１００％近く溶解できる回数が好ましい。洗浄液の残存により核酸の溶出液への溶解が妨げられるため、少なくとも２回以上の吸引・吐出回数が好ましい。少なくとも３回以上がより好ましく、少なくとも５回以上がさらに好ましい。５回以上の吸引・吐出を繰り返せば、溶出液中へ残存していた洗浄液が溶け込み、モノリス構造体に吸着している核酸と溶出液が接触するため、核酸がモノリス構造体へ残存することなく溶出される。
【実施例１】
【００５２】
〔細孔径の異なるモノリス構造体を用いた細菌ゲノムの添加回収〕
（１）試料の調製
細菌ゲノムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ株のゲノムを使用した。３％小川培地（日水製薬製）にて培養後、フェノール・クロロホルム法にてゲノムＤＮＡを抽出して添加回収用試料とした。
【００５３】
（２）材料の準備
細孔径が１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍと異なるモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに超音波により溶着する方法で固定したもの（以下モノリスチップと略す）を作成した。その他モノリス構造体の性状は全て切断面積３．１４平方ｍｍ、厚さ１ｍｍとした。圧力変化を起こす装置として、テルモ製１ｍＬシリンジを利用した。吸着液は５Ｍグアニジンチオシアン酸、０．８Ｍ酢酸カリウム溶液、洗浄液は０．８Ｍ酢酸カリウム溶液、７０％エタノール、溶出液には１０ｍＭ水酸化カリウム溶液を使用した。サンプルには抽出した添加回収用試料を１０ｍＭトリス緩衝液で１μＬ中に約１０００コピー含むように希釈して用いた。
【００５４】
（３）モノリスチップによる細菌ゲノムの添加回収
モノリス構造体の細孔径が異なる５種類のモノリスチップを利用して、それぞれ図２の簡略図に示されるような操作を実施した。
以下に詳細に記載する。１．５ｍＬのチューブに吸着液５００μＬを分注し、サンプル１００μＬを加えてピペッティングにて５回混合した。シリンジに装着した各モノリスチップを用いて吸着液・サンプル混合液を１００μＬ／秒の速度で１０回吸引および吐出した。混合液を完全に出し切った後に、洗浄液５００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、洗浄液を１００μＬ／秒の速度で３回吸引および吐出して洗浄した。洗浄工程をもう一度繰り返した。最後に溶出液１００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、溶出液を１００μＬ／秒の速度で５回吸引および吐出してモノリスチップ内に吸着したゲノムＤＮＡを溶出した。溶出効率の低下を抑えるため、吸引および吐出の間はモノリス構造体に空気が接触しないように注意した。
【００５５】
（４）リアルタイムＰＣＲ検出
モノリス構造体の細孔径が異なるモノリスチップを利用して添加回収した５種類のゲノムＤＮＡ溶液、モノリスチップによる添加回収を実施していないサンプル（標準物質）および陰性コントロールをそれぞれ（５）に示す試薬に添加して、（６）に示す条件によりリアルタイムＰＣＲ検出を行った。オリゴ１およびオリゴ２をプライマーとして使用し、かつオリゴ３をプローブとして使用した試薬はＢＣＧ株を特異的に検出できるプライマー及びプローブの組み合わせである。増幅産物とプローブがハイブリダイゼーションすることでプローブに標識された蛍光色素の蛍光が消光することを検出原理としている。核酸増幅および検出にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、得られたリアルタイム検出データを利用して、アニーリング時のＱＰｒｏｂｅ消光率を算出した。さらに消光率２％に達したサイクル数を求めて、従来のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたリアルタイム定量ＰＣＲ法同様に解析を行った。添加回収効率は標準物質の検出を１００％として、それぞれのサンプルについて算出した。
【００５６】
（５）試薬組成
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１（配列番号１） ２５０ｎＭ、
オリゴ２（配列番号２） １５００ｎＭ、
オリゴ３（配列番号３）（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
溶出液 １μＬ
【００５７】
（６）核酸増幅および検出条件
９４℃２分
９８℃０秒、６０℃５秒（蛍光検出）、５０サイクル
９４℃６０秒、４０℃６０秒、４０℃から７５℃へ０．５℃／秒の温度上昇
【００５８】
（７）結果
表１は、モノリス構造体の細孔径が異なる５種類のモノリスチップを利用して添加回収したゲノムＤＮＡ溶液を用いて検出・解析した添加回収率を示している。表１より明らかなようにモノリス構造体の細孔径が２０μｍから５０μｍで回収が可能であった。２０μｍから４０μｍで回収率が５０％以上となり良好な結果を示した。
１０μｍの細孔径を持つモノリス構造体を用いて回収を行った場合、吸着液の吸引・吐出が液詰まりにより困難となり、添加回収操作を途中で断念した。
【００５９】
【表１】
【実施例２】
【００６０】
〔直径の異なるモノリスチップを用いた細菌ゲノムの添加回収〕
（１）使用した材料、操作方法、測定方法、解析方法
直径が０．４ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍと異なるモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに固定したもの（以下モノリスチップと略す）を作成した。また直径が４ｍｍ、１０ｍｍのものについてはそれぞれ内径４ｍｍ、１０ｍｍで１ｍＬのシリンジにかん合できる容器に固定した。その他モノリス構造体の性状は全て平均細孔径３０μｍ、厚さ１ｍｍとした。それぞれの切断面積は、０．１２６平方ｍｍ、１．７６７平方ｍｍ、３．１４平方ｍｍ、７８．５平方ｍｍとなる。その他の材料、操作方法、測定方法、解析方法は実施例１に従って実施した。
【００６１】
（２）結果
表２は、モノリス構造体の切断面積が異なる５種類のモノリスチップを利用して添加回収したゲノムＤＮＡ溶液を用いて検出および解析した添加回収率を示している。表２より明らかなようにモノリス構造体の直径が０．４ｍｍから１０ｍｍで核酸の回収が可能であった。直径が１０ｍｍの場合は、モノリス構造体への残液量が増えて溶出後の溶液量が少なくなった。また吸引および吐出速度を２００μＬ／秒以上にすると溶出工程中に空気が入りやすいため、注意する必要がある。
【００６２】
【表２】
【実施例３】
【００６３】
〔厚さの異なるモノリスチップを用いた細菌ゲノムの添加回収〕
（１）使用した材料、操作方法、測定方法、解析方法
厚さが１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍと異なるモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに固定したもの（以下モノリスチップと略す）を作成した。その他モノリス構造体の性状は全て平均細孔径３０μｍ、切断面３．１４平方ｍｍとした。その他の材料、操作方法、測定方法、解析方法は実施例１に従って実施した。
【００６４】
（２）結果
表３は、モノリス構造体の厚さが異なる４種類のモノリスチップを利用して添加回収したゲノムＤＮＡ溶液を用いて検出および解析した添加回収率を示している。表３より明らかなようにモノリス構造体の厚さが１ｍｍから５ｍｍで核酸の回収が可能であった。厚さが１０ｍｍの場合は、モノリス構造体の通液抵抗が増加しており、操作に１０分以上を要したため、迅速な核酸抽出には適さなかった。
【００６５】
【表３】
【実施例４】
【００６６】
〔モノリスチップの通液性テスト〕
（１）材料の準備
モノリス構造体は円柱状で平均細孔径３０μｍ、直径２ｍｍ、厚さ１ｍｍを基本構造とした。平均細孔径を１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍに変更したもの、直径を０．４ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍに変更したもの、厚さを１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍに変更したもの、合計１４種類を使用した。それぞれを適した容器に固定したものをモノリスチップとした。テストに用いる粘性溶液には０．１％ムチン溶液（シグマ社製）となるように含有した実施例１の吸着液を使用した。圧力変化を起こす器具は実施例１同様に１ｍＬのシリンジを利用した。
【００６７】
（２）通液性テストの方法
１．５ｍLチューブに分注した吸着液５００μＬに粘性溶液１００μＬを混合し、ピペッティングにより混合十分に混合した。テストするモノリスチップを用いて、混合液６００μＬを全量吸引（チューブ内に粘性溶液がない状態で、かつ液下面がモノリス構造体の下にある状態、図３に例示した）後、全量吐出（モノリスチップ内の溶液を出し切った状態）までの時間を計測した。
【００６８】
（３）通液性テストの判断基準
粘性溶液を用いて吸引および吐出した時にかかる時間が６０秒以内である時を通液性良好とした。６０秒を超える時は通液性不良とした。
【００６９】
（４）結果
表４から表６に示されるように、平均細孔径１０μｍ、２０μｍ、直径０．４ｍｍ、厚さ５ｍｍ、１０ｍｍにそれぞれ変更したモノリス構造体を用いた場合にモノリス構造体中での抵抗が強く、通液性が不良であった。平均細孔径２０μｍ、直径０．４ｍｍ、厚さ５ｍｍに変更したモノリス構造体の場合、ゲノム溶液程度なら問題はないが、臨床検体など不純物が含まれ、粘性のある溶液を使用した場合に液詰まりの可能性がある。
【００７０】
【表４】
【００７１】
【表５】
【００７２】
【表６】
【実施例５】
【００７３】
〔細菌ゲノムの添加回収時間の比較〕
（１）使用した材料、操作方法、測定方法、解析方法
平均細孔径３０μｍ、切断面３．１４平方ｍｍ、厚さ１ｍｍのモノリス構造体をレイニン製ＬＴＳ１０００μＬピペットチップに固定したモノリスチップを作成した。その他の材料、操作方法、測定方法、解析方法は実施例１に従って実施した。３回実施して、それぞれの時間を計測した。
【００７４】
（２）結果
細菌ゲノム溶液の混合から溶出完了までの時間は、４分００秒、３分４７秒、３分５３秒であった。吸引吐出を用いた核酸精製方法として開示されている特開２００７−３０６９６７では吸引吐出による核酸の精製は、全血サンプルの混合から溶出完了までの時間が比較例では１６分、加圧と減圧を同時に行う方法で８分であり、本発明による方法は極めて迅速な核酸精製方法であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、臨床診断上重要な生体試料から迅速、かつ簡便に核酸を抽出または精製することが可能となる。具体的には、診察によって得られた遺伝子増幅法の阻害物質を含む生体試料から１０分以内に核酸を抽出および精製できる。また、溶液の吸引および吐出のみの操作であるため、遠心操作が不要で機器への適用が容易に達成される。よって臨床現場での需要も高く、産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む溶液から核酸を抽出する方法であって、
空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置を使用して、核酸の固相担体への特異的な吸着・洗浄および溶出により核酸を抽出する方法において、
次の（１）〜（６）の工程を含む核酸抽出方法。
（１）以下の（ａ）（ｂ）の特徴を有する容器を準備する工程。
（ａ）核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ。
（ｂ）固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている。
（２）該容器の通気部側を吸引吐出機構に接続する工程。
（３）核酸を含む溶液と吸着液を混合する工程。
（４）核酸を含む溶液と混合した吸着液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させて核酸をモノリス構造体に吸着した後、容器内の液体を吐出する工程。
（５）洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出する工程。
（６）溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出する工程。
【請求項２】
モノリス構造体の通液方向に対して垂直方向の切断面積が０．１平方ｍｍ以上１００平方ｍｍ以下である請求項1に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
モノリス構造体の通液方向の厚さが０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下である請求項1または２に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
溶液の吸引速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である請求項１から３のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
溶液の吐出速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である請求項１から４のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
吸着液がカオトロピック塩を含む請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
吸着液がカオトロピック塩を含み、かつ酢酸塩を含む請求項６に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
カオトロピック塩が、グアニジン塩、ヨウ化物塩および尿素からなる群より選ばれるいずれか１つ以上である請求項６または７のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
洗浄液がアルコール類を含む請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１０】
洗浄液がアルコール類を含み、かつ酢酸塩を含む請求項９に記載の核酸抽出方法。
【請求項１１】
アルコール類が、エタノール、イソプロパノールおよび１−プロパノールからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である請求項９または１０に記載の核酸抽出方法。
【請求項１２】
酢酸塩が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸リチウムからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である請求項７または１０に記載の核酸抽出方法。
【請求項１３】
溶出液がｐＨ７以上の溶液であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１】
核酸を含む溶液から核酸を抽出する方法であって、
空気を媒体として圧力を利用した吸引吐出ができる機構を有する装置を使用して、核酸の固相担体への特異的な吸着・洗浄および溶出により核酸を抽出する方法において、
次の（１）〜（６）の工程を含む核酸抽出方法。
（１）以下の（ａ）（ｂ）の特徴を有する容器を準備する工程。
（ａ）核酸を含む溶液を吸引吐出する側（通液部側）および空気を媒体として圧力を加減する側（通気部側）の二方向に開放面をもつ。
（ｂ）固相担体として、平均細孔径が２０μｍ以上１００μｍ以下のモノリス構造体が、該容器の空間を完全に二つに分かつように固定されている。
（２）該容器の通気部側を吸引吐出機構に接続する工程。
（３）核酸を含む溶液と吸着液を混合する工程。
（４）核酸を含む溶液と混合した吸着液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させて核酸をモノリス構造体に吸着した後、容器内の液体を吐出する工程。
（５）洗浄液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に接触させてモノリス構造体内部及び容器内を洗浄した後、容器内の液体を吐出する工程。
（６）溶出液を、該容器の通液部側から吸引して、モノリス構造体に吸着した核酸を溶出した後、容器内の液体を吐出する工程。
【請求項２】
モノリス構造体の通液方向に対して垂直方向の切断面積が０．１平方ｍｍ以上１００平方ｍｍ以下である請求項1に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
モノリス構造体の通液方向の厚さが０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下である請求項1または２に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
溶液の吸引速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である請求項１から３のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
溶液の吐出速度が、１０μＬ／秒より速く、５００μL／秒より遅い速度である請求項１から４のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
吸着液がカオトロピック塩を含む請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
吸着液がカオトロピック塩を含み、かつ酢酸塩を含む請求項６に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
カオトロピック塩が、グアニジン塩、ヨウ化物塩および尿素からなる群より選ばれるいずれか１つ以上である請求項６または７のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
洗浄液がアルコール類を含む請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１０】
洗浄液がアルコール類を含み、かつ酢酸塩を含む請求項９に記載の核酸抽出方法。
【請求項１１】
アルコール類が、エタノール、イソプロパノールおよび１−プロパノールからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である請求項９または１０に記載の核酸抽出方法。
【請求項１２】
酢酸塩が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸リチウムからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である請求項７または１０に記載の核酸抽出方法。
【請求項１３】
溶出液がｐＨ７以上の溶液であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２００６６１（Ｐ２０１０−２００６６１Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４８８５９（Ｐ２００９−４８８５９）
【出願日】平成２１年３月３日（２００９．３．３）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３日（２００９．３．３）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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