糖脂質または糖脂質類似化合物の分離または精製方法
【課題】 動物細胞、植物細胞、酵母由来の糖脂質または糖脂質類似化合物を含有する試料から、糖脂質または糖脂質類似化合物を種類別に効率的に分離・精製する方法を提供する。
【解決手段】 液液分配クロマトグラフィを用い、二相溶媒系を特定の溶媒から選択することにより、糖脂質または糖脂質類似化合物を種類別に効率的に分離・精製できる。溶媒は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水または酸性水溶液またはアルカリ性水溶液から選択される。
【解決手段】 液液分配クロマトグラフィを用い、二相溶媒系を特定の溶媒から選択することにより、糖脂質または糖脂質類似化合物を種類別に効率的に分離・精製できる。溶媒は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水または酸性水溶液またはアルカリ性水溶液から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質または糖脂質類似化合物の分離または精製方法に関し、より詳しくは二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィを用いた糖脂質または糖脂質類似化合物の分離または精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
天然型の糖鎖において、シアル酸を含む一群のスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドは、脳内微量ガングリオシドの構造解析や機能などを解明するために、イオン交換クロマトグラフィにより、ウシの脳から分離・精製されている。また、シアル酸のない中性糖鎖であるグロボ系構造についても、機能解明が進められている。糖脂質の精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィやHPLC、HPTLCなどが行われている。（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）
【０００４】
また、糖鎖を合成することも可能である。糖鎖の合成方法としては、化学的に合成する方法、分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法などがあるが、それぞれ、工程が煩雑であったり、収量が低かったり、使用原料が限定されるなどの欠点がある。このような中、最近、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成技術が注目されている。
【０００５】
動物細胞の機能を利用した糖鎖合成では、糖鎖合成経路の前駆体となる「糖鎖プライマー」を培地中に添加することにより細胞内に取り込ませ、糖鎖伸長を受けた生成物が細胞外に分泌されるようにする方法がある。このようにして生成される糖鎖伸長物を分離・精製し、有用な糖鎖のスクリーニング、あるいは産業利用するための研究が進められている。
【０００６】
しかしながら、動物細胞により伸長されて生成される糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、細胞種、「糖鎖プライマー」のオリゴ糖部分の構造により多種多様な糖脂質および／または糖脂質類似化合物が複数種類混在した状態で存在することや、「糖鎖プライマー」が残存することから、単一種類の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を得るためには、これらを分離しなければならない。
【０００７】
これまで動物細胞の機能を利用した糖鎖合成で得られる大量の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離・精製する方法例はなく、主に分析目的としたC18系固相カートリッジでの濃縮や、HPLCまたはHPTLCを用いた分離および／または精製方法が行われていた（例えば特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献４）。また、生体由来の天然型糖鎖化合物、特にガングリオシドの分離・精製は、主に陰イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィで行われていた（非特許文献6）。
【０００８】
また、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成では、糖鎖合成経路の前駆体となる「糖鎖プライマー」を培地中に添加することにより細胞内に取り込ませたのち、糖鎖伸長を受けた生成物が細胞外に分泌されるが、未反応の「糖鎖プライマー」の多くが伸長されないまま、培地中に残るが、この未反応の「糖鎖プライマー」を効率良く回収する方法は未だない。
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２
【非特許文献１】M. C. Z. Kasuyaら、Carbohydrate Research 329 (2000) 755-763
【非特許文献２】Johannes Muthing, Method in Enzymology, Vol312, Part B, 45-64
【非特許文献３】Stephan Ladisch and Ruixiang Li, Method in Enzymology, Vol312, Part B, 135-145
【非特許文献４】Robert K. Yu and Toshio Ariga, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 115-134
【非特許文献５】Y. Hirabayashiら、J. Biol. Chem., 265 (1990), 8144-8151
【非特許文献６】Gerhild Van Echten-Deckert, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 64-79
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離および／または精製するのに用いられているC18系固相抽出カートリッジあるいはHPLCやHPTLCを用いる方法では、カートリッジあるいは装置の価格が高く、大量の試料の処理には適さない。また、イオン交換クロマトグラフィに用いられている樹脂も高価である。このように、大量の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を効率的かつ安価に分離および／または精製する方法は未だなく、このような方法の開発が強く望まれている。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、主に生体由来の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を、細胞、細胞培養物またはその上清などから大量にかつ安価に分離および／または精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、特定の二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィにより、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離および／または精製することで、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
すなわち、本発明は、糖脂質および／または糖脂質類似化合物の分離および／または精製方法であって、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸、酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和した二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィに、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料を供する工程を含む、分離および／または精製方法を提供する。
【００１４】
上記液液分配クロマトグラフィは、遠心液液分配クロマトグラフィまたは高速向流クロマトグラフィであり得る。
【００１５】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が中性である場合には、上記二相溶媒系は、クロロホルム、アルコール類、および水を混和して調製され得る。ここで、アルコール類はメタノールであり得る。さらに、この二相溶媒系は、クロロホルム、メタノール、および水を、５：６：４で混和して調製され得る。
【００１６】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性である場合、上記二相溶媒系は、アルコール類、酸または酸性水溶液、および水を混和して調製され得る。
【００１７】
上記アルコール類はｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液は酢酸であり得る。
【００１８】
上記二相溶媒系は、n−ブタノール、酢酸、水を４：１：５で混和して調製され得る。
【００１９】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性である場合、前記二相溶媒系は、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和して調製され得る。
【００２０】
上記二相溶媒系は、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和して調製され得る。ここで、n−ブタノール、エタノール、１％酢酸水溶液は、４：１：５であり得る。
【００２１】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性である場合、上記二相溶媒系は、アルコール類、エーテル類、アセトニトリルおよび水を混和して調製され得る。
【００２２】
上記二相溶媒系は、n−ブタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、および水を３：１：１：５で混和して調製され得る。
【００２３】
上記分離精製方法では、さらに、合成吸着剤による濃縮および／または精製工程を含み得る。
【００２４】
上記分離精製方法では、さらに、固相抽出カートリッジ、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、およびＧＰＣからなる群より選択されるいずれかひとつ以上の精製工程を含み得る。
【００２５】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、動物細胞、植物細胞、または酵母に、オリゴ糖プライマーを与えて培養することによって得られ得る。
【００２６】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、動物細胞、植物細胞、または酵母由来の、天然型糖脂質であり得る。
【００２７】
本発明においてはまた、上記の分離および／または精製方法を用いて得られる糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む糖鎖材料の製造方法が提供される。
【００２８】
本発明ではさらに、上記の分離および／または精製方法を用いて、培養細胞中にある糖鎖プライマーを回収する方法が提供される。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように、本発明を適用することによって、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料から、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を、工業的に容易に分離および／または精製することができる。よって、特に、有用な動物細胞などの生体由来の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を安価に大量に調製することが可能になり、糖鎖を利用した製品の開発の迅速な実用化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００３１】
糖脂質とは、分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質の総称であり、脂溶性基がセラミド (N-アシルスフィンゴシン) であるスフィンゴ糖脂質、アシル- あるいはアルキルグリセロールであるグリセロ糖脂質、ステロイド (ステリルグリコシド, ステロイド配糖体)、ヒドロキシ脂肪酸(ラムノリピド) などの脂溶性基をもつグリコシドなどが含まれる。通常、糖脂質は天然に存在する構造のものを指す。本発明においては、天然に存在するものと同一の構造のものの他、天然には存在しない構造のもので、動物細胞などに糖鎖プライマーを加えて得ることができ、水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質を、糖脂質と呼ぶこともある。または特に動物細胞などに糖鎖プライマーを加えて得られるこのような物質を糖脂質類似化合物と呼ぶこともある。本明細書においては、このような糖脂質類似化合物を、対応する糖鎖構造を有する糖脂質の名称を冠して表記する。例えば、動物細胞等に糖鎖プライマーを添加して得られた糖鎖伸長生成物が、ガングリオシドＧＭ３と同一の糖鎖構造を有する場合、該生成物をＧＭ３型糖脂質類似化合物と記す。同様に、糖鎖伸長生成物がグロボ系糖脂質Ｇｂ３と同一の糖鎖構造を有する場合、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物のように記す。
【００３２】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、糖鎖の性質により、中性、酸性に分けられる。酸性を示す糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、限定はされないが、ガングリオシドやスルファチドをはじめとするシアル酸残基や硫酸基を有する各種糖脂質および／または糖脂質類似化合物が挙げられる。具体的には、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１α、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ｃ、ＧＭ４、ＳＭ４ｓ、ＳＭ３、ＳＧＰＧ、シアリルパラグロボシド、ＳＳＥＡ−４、ジシアリルＳＳＥＡ−３、ＧＭ１α、ＧＤ１β、ＳＬｅｘ、ＳＬｅｃ、ＳＬａ等の糖脂質およびこれらの糖脂質類似化合物（ＧＭ１型糖脂質類似化合物、ＧＭ２型糖脂質類似化合物、ＧＭ３型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ａ型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＭ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＤ１α型糖脂質類似化合物、ＧＭ３型糖脂質類似化合物、ＧＭ２型糖脂質類似化合物、ＧＭ１型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ａ型糖脂質類似化合物、ＧＴ１ａ型糖脂質類似化合物、ＧＤ３型糖脂質類似化合物、ＧＤ２型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＴ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＱ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＴ３型糖脂質類似化合物、ＧＴ２型糖脂質類似化合物、ＧＴ１ｃ型糖脂質類似化合物、ＧＱ１ｃ型糖脂質類似化合物、ＧＰ１ｃ型糖脂質類似化合物、ＧＭ４型糖脂質類似化合物、ＳＭ４ｓ型糖脂質類似化合物、ＳＭ３型糖脂質類似化合物、ＳＧＰＧ型糖脂質類似化合物、シアリルパラグロボシド型糖脂質類似化合物、ＳＳＥＡ−４型糖脂質類似化合物、ジシアリルＳＳＥＡ−３型糖脂質類似化合物、ＧＭ１α型糖脂質類似化合物、ＧＤ１β型糖脂質類似化合物、ＳＬｅｘ型糖脂質類似化合物、ＳＬｅｃ型糖脂質類似化合物、ＳＬａ型糖脂質類似化合物など）が挙げられる。中性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、中性糖のみから成る糖脂質および／または糖脂質類似化合物類などのことで、限定はされないが、グロボ系列のＧｂ3、Ｇｂ４や、それらの類似化合物であるＧｂ３型糖脂質類似化合物、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物などが含まれる。その他にも、Ｌａｃ-Ｃｅｒ、ｉＧｂ３、ｉＧｂ４、アシアロＧＭ２、アシアロＧＭ１、パラグロボシド、グロボシド、Ｆｏｒｓｓｍａｎ抗原、ＳＳＥＡ−３、Ｌｅｘ、Ｌｅｙ、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｃ、などの糖脂質やこれらの糖脂質類似化合物が含まれる。
【００３３】
液液分配クロマトグラフィは、有機溶媒、各種水溶液、および水などから選択される少なくとも2種以上の溶媒を混和した二相溶媒系の上層または下層の一方を固定相とし、他方を移動相に用いて試料を分離する方法をいう。
【００３４】
遠心液液分配クロマトグラフィ(ＣＰＣ)とは、二相溶媒系の上層または下層の一方の液層を固定相としてドーナツ型のローターと呼ばれる円盤に放射線状に内蔵されたセル内に満たし、分配セルを回転させて下層または上層を移動相として送液して成分分離を行う液液分配クロマトグラフィである。分離後の試料成分をローターから全て回収でき、正溶出／反転溶出の切り替えも容易に行える利点を持つ。例えば、極性の異なる化合物を含む場合、正溶出により溶出されない場合があるが、ＣＰＣでは固定相を回収できるため、試料を全量回収できる。
【００３５】
本発明に用いるＣＰＣ装置は、固定相の保持をおこなう分配セルおよびそのセルを保持するローターを備え、これに送液ポンプおよび検出器を組み合わせた構造を有していれば、特に限定されることなく、どのような装置でも利用可能である。セルサイズ、回転速度層液速度は、装置のそれぞれの処理能力により異なり、特に限定はされない。ＣＰＣ２４０（センシュー科学）を使用する場合、回転速度としては、500rpmから2500rpm程度の範囲で好ましく使用でき、送液速度は１mlから１０ml/min程度が好ましく使用できる。
【００３６】
高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）とは、二相溶媒系の上層または下層の一方の液層を固定相としてコイル状チューブカラム内に遠心力で保持させ、下層または上層の他方の液層を移動相として送液して成分分離を行う液液分配クロマトグラフィである。分離後の試料成分をカラムから全て回収できるほか、順相／逆相、分析／分取の切り替えも容易である。
【００３７】
本発明に用いるＨＳＣＣＣ装置は、固定相の保持をおこなうカラム部分にＪ型コイル惑星状遠心装置を備え、これに送液ポンプおよび検出器を組み合わせた構造を有する。Ｊ型コイル惑星状遠心装置はコイル部分が回転（自転）し、かつコイル部分の保持装置も回転（公転）する原理を有していれば、特に限定されることなく、どのような装置でも利用可能である（例えば、限定はされないが、Ｅａｓｙ-ＰＲＥＰｃｃｃセミ分取モデル）。
【００３８】
カラム部分に巻きつけて流路およびカラムとなるチューブ部には一般にチューブ状に成型できる素材であれば特に問題なく用いることができる。好適な例としては内径０．５〜３ｍｍのテフロン（登録商標）チューブを挙げる事ができる。送液ポンプはロータリー型、ペリスタ型など、一般に液体の送液に用いることのできるものであれば問題なく用いることができる。まずカラム部分に二相溶媒のどちらか一方を送液し、チューブを満たして固定相とする。続いてコイル部分を自転させ、遠心力で固定相を保持させる。この際の回転数は１０〜１０，０００ｒｐｍを用いることができるが、好適な例としては１，０００〜１，５００ｒｐｍとすることが望ましい。糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料を溶媒に溶解させたサンプルをカラム部分に導入し、その後に二相溶媒の固定相に用いなかった他の相を移動相として送液する。移動相の送液速度は特に制限はないが、０．１〜１０ｍｌ／分の間とすることが望ましい。
【００３９】
ＣＰＣ装置またはＨＳＣＣＣ装置のいずれの場合でも、溶出する移動相を適当な分析装置で分析する。この分析装置は、ＵＶ検出器、ＲＩ検出器、ダイオードアレイ検出器、ＩＲ検出器、蛍光検出器、蒸発光散乱検出器などを用いることができる。
【００４０】
本発明の液液分配クロマトグラフィに用いる二相溶媒系は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性水溶液としては、酢酸水溶液が挙げられるが、これに限定されない。
【００４１】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含有する試料から中性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合には、二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなるものであることが好ましい。ここで、アルコール類は、メタノールであることがより好ましい。特に、二相溶媒系が、クロロホルム、メタノール、および水を、５：６：４で混和して調製することが好ましい。この比率において用いられるメタノールは、９５％から１００％、好ましくは、９７％から１００％のものである。
【００４２】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含有する試料から酸性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合、二相溶媒系が、アルコール類、酸、および水を混和して調製されることが好ましい。より好ましくは、アルコール類がｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液が酢酸である。あるいは、二相溶媒系を、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和することで調製することも好ましい。この場合、より好ましくは、二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和して調製されるものである。
【００４３】
より好ましくは、酸性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合は、二相溶媒系は、n−ブタノール、酢酸、水を４：１：５で混和してなる。あるいは、二相溶媒系は、n−ブタノール、エタノール、１％酢酸水溶液を４：１：５で混和してなる。さらに、あるいは、二相溶媒系は、n−ブタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、エタノール、１％酢酸水溶液を３：１：１：５で混和して調製することも可能である。これらの比率において、用いられるアルコール濃度は、９５％以上１００％以下、より好ましくは、９７％以上１００％以下のものである。
【００４４】
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、固相抽出カートリッジ、逆相ＴＬＣ、順相ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析に供することにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。その際に必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により取り除いてから分析を行ってもよい。
【００４５】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料は、限定はされないが、例えば、マウス、ウシ、ヒトなどの哺乳類、その他の動物、あるいは植物の組織または細胞、例えば脳やメラノーマ癌組織等の組織由来であり得る。あるいは、酵母などの微生物を培養して得られる培養細胞由来である。このような組織又は細胞から、天然型糖脂質を含む試料であれば、抽出などの操作によって得ることができる。
【００４６】
抽出は特に限定されないが、細胞や組織を有機溶媒で、例えばクロロホルム-メタノール（２：１）などの溶媒でホモジナイズすることによってなされる。このような抽出物を本発明の方法に供して、糖鎖化合物、主に糖脂質および／または糖脂質類似化合物系の化合物を分離することができる。
【００４７】
細胞培養物は、好ましくは動物細胞を糖脂質および／または糖脂質類似化合物が得られるような条件下にて培養することで得られる。動物細胞は特に限定されず、所望の糖脂質および／または糖脂質類似化合物の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得る。培養は、通常の動物細胞の培養条件に従って行う。
【００４８】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間でＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、糖鎖プライマーを添加した培地に置換してさらに培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００４９】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。限定はされないが、好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｘで表される化合物が挙げられる。ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)n−、−Ｓ−（ＣＨ2)n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)n−から選択される連結基であり、Ｘは、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、ｎは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。従って、糖鎖プライマーも、本明細書では、糖脂質類似化合物ということができる。
【００５０】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。
【００５１】
得られる細胞培養物または細胞培養物から細胞を除いた上清は、糖鎖プライマーから伸長して得られた生成物である糖脂質または糖脂質類似化合物を含有する。この細胞培養物または細胞培養物の上清を本発明の液液分配クロマトグラフィに供する。
【００５２】
本発明では、液液分配クロマトグラフィの前あるいは後に、固体吸着剤を接触させることにより、予め糖脂質または糖脂質類似化合物を含む濃縮液を調製したり、より純粋な糖脂質または糖脂質類似化合物を調製することも可能である。
【００５３】
接触は、例えば、細胞培養物または細胞培養物の上清に直接固体吸着剤を加え、３０分以上の時間で振盪するなどして行う。あるいは、カラムなどに予め固体吸着剤を充填しておき、充填したカラムに細胞培養物または細胞培養物の上清を流すことによって行う。
【００５４】
さらに、接触工程終了後の固体吸着剤に適度な濃度の溶離剤を接触させて、固体吸着剤から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を脱着させるとともに、脱着させた糖脂質および／または糖脂質類似化合物を溶離剤中に溶離させる溶離工程を行い得る。溶離剤は、限定はされないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、およびアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種であり得る。この工程は、糖脂質および／または糖脂質類似化合物と吸着体が疎水性相互作用によって吸着していたものに、有機溶媒などの溶離剤を接触させることで、吸着剤から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を脱着させて、さらにこの糖脂質および／または糖脂質類似化合物を有機溶媒中に溶離させる工程である。
【００５５】
ここで、固体吸着剤は、スチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種であり得る。その他、フェノール系合成吸着体も用いることができる。培養物中または培養上清中の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ２０、ＨＰ２１、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ロームアンドハース社製アンバーライト（登録商標、以下同じ）ＸＡＤ４、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００、Ｂａｙｅｒ社製ＶＰＯＣ１０６２、ＶＰＯＣ１０６４等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等を用いることができる。
【００５６】
中性で糖鎖プライマーの１２‐アジドドデシル‐βラクトシドは、培地上清に同量の酢酸エチルを添加し振盪することにより、酢酸エチル層に抽出できることにより予め除くことも可能である。よって、培地上清を吸着剤に接触させる前に、酢酸エチルによる抽出により中性である糖鎖プライマーである１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを除いておくと、吸着工程及び、溶離工程における負荷を軽減することが可能である。
【００５７】
糖鎖プライマーは、ラクトースやN-アセチルグルコサミンなどをドデシル基と結合することで作成し利用できる。更に、アジド基などの官能基をアグリコン部分に導入しておけば、後の操作でその部分と別の化合物とを共有結合などで結合して固定化することが可能である。
【００５８】
溶出した移動相はそのまま、或いは溶出時間毎に分画して、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析を行うことにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。その際に必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により取り除いてから分析を行うこともできる。
【００５９】
また溶出した移動相をそのまま、或いは溶出時間毎に分画し、必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により除いて、糖脂質および／または糖脂質類似化合物画分として利用することもできる。
【００６０】
本発明においては、上記の方法で得られる組織や細胞からの抽出物、又は細胞による糖鎖プライマー伸長法により得られた試料に含まれる複数種類の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を、液液分配クロマトグラフィを用いて効率的に分離できる。更に、細胞による糖鎖プライマー伸長法により糖鎖合成を行う場合、未反応の「糖鎖プライマー」が培養液中に多量に残るが、このような未反応の「糖鎖プライマー」も、本発明の特定溶媒による液液分配クロマトグラフィで、効率良く回収することも可能であることから、「糖鎖プライマー」を再利用することができるようになる。
【００６１】
このようにして分離、精製された糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、様々な糖鎖材料として、使用することができる。このような材料としては、特に限定はされないが、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を固相に固定化して得られるものが含まれる。糖鎖材料は、ウィルス、バクテリア、および／または毒素の吸着材、毒素の中和剤、生体防御系刺激、抗炎症、抗菌、および／または抗腫瘍転移に有用な薬剤、診断薬、細胞培養基材または特異的細胞分離基材、毒素などの検出基盤に好適に用いられうる。
【００６２】
以下に、本発明の糖脂質および／または糖脂質類似化合物の精製方法および濃縮方法の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００６３】
まず、触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)とアジド基を導入したアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、「糖鎖プライマー」：１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063, Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）
【００６４】
５００ｍＬ容量のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて培養及び、糖鎖伸長反応を行った。バスケットに１０ｇのフィブラセルディスクを保持させた容器に５００ｍｌのＰＢＳを入れ、オートクレーブに滅菌した（１２１℃、２０分）。その後、容器中の液を５００ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地（インビトロジェン社）に置換し、2×１０８ｃｅｌｌｓのベロ細胞を接種し、５０ｒｐｍの回転数で１時間撹拌した。その後、１００ｒｐｍの回転数に上げて、８日間培養を続けた。その間、２〜３日おきに培地を交換した。
【００６５】
その後、１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）と、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ のドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて９６時間培養した。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメントと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し４８時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００６６】
８０枚の１００ｍｍのディッシュに各々、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのベロ細胞を７ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、培養した。培養後、１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメントと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間し、糖鎖伸長反応を行った。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメントと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し９６時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００６７】
上記のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット、及び１００ｍｍのディッシュを用いて培養することによって得られた約３Ｌの培地上清に対し、５０ｇのポリスチレン系の合成吸着剤ＨＰ２０（三菱化学社製）を加え、２時間以上振盪し、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を吸着剤に吸着させた。吸着後、水洗しメタノールで溶出した。更に、得られた溶出液を、減圧下で濃縮、乾燥させた。乾燥物を３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、濃縮液を調製した。
【００６８】
ＣＰＣ（ＣＰＣ２４０、株式会社センシュー科学）により、濃縮物から生成物の分離精製を行った。条件としては、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い、上層を固定相とし、下層を上から下へ通液させる、下降法にて行った。また、ローターの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００６９】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図１に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。フラクションＮｏ．１６から２０にドデシル‐βラクトシド、Ｎｏ．２６から４０にＧｂ３型糖脂質類似化合物が溶出されてきた。この方法では、極性の低い性質を持つ中性糖鎖である、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物、未反応の「糖鎖プライマー」である１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを分離することができた。
【００７０】
溶出されてこない画分については、反転溶出、つまり、固定相を下から上へ通液させることにより、固定相を押し出すことにより、回収した。同様に、溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図２に示す。フラクションＮｏ．６１から６６において、酸性糖脂質および糖脂質類似化合物ＧＭ３型糖脂質、及び培地由来のスポットが検出された。なお、フラクションＮｏ．６８から７２において、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物が溶出した。
【００７１】
上記で得られた、ドデシル‐βラクトシド、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物、ＧＭ３型糖脂質類似化合物、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物を含む画分をそれぞれ集め、減圧下で濃縮した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）にて精製した。得られた糖脂質および／または糖脂質類似化合物および、ドデシル‐βラクトシドを減圧下で乾燥させた。
【００７２】
さらに、ＧＭ３型糖脂質類似化合物を含む画分については、乾燥後、３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解した後、ＣＰＣにより、n−ブタノール／エタノール／１％酢酸水溶液（４：１：５）を二層系の溶媒として用いて、下降法にて分離を行った。ローターの回転速度は１２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００７３】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを２００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図３に示す。フラクションＮｏ．４１から７５にかけて、酸性の糖脂質類似化合物であるＧＭ３型糖脂質類似化合物が検出された。全フラクションを集め、減圧下で乾燥させた。
【００７４】
以上の結果より得られた、糖脂質類似化合物および、ドデシル‐βラクトシドの乾燥重量を測定した結果、ドデシル‐βラクトシドは２１．7ｍｇ、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物は８．３ｍｇ、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物は５．１ｍｇ、ＧＭ３型糖脂質類似化合物は１９．５ｍｇであった。イオントラップ型質量分析装置ＨＣＴｐｌｕｓ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）により、ＭＳｎ解析を行った結果を図４に示す。
【実施例２】
【００７５】
約２０ｇのラット脳組織（Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ、ＲＯＣＫＬＡＮＤ，Ｉｎｃ）を乳鉢ですり潰した後、１００ｍｌのクロロホルム−メタノール（２：１）を加え、５分間超音波処理し、３７度のインキュベータ中で１時間振盪して脂質を抽出した。８，０００ｒｐｍで１０分間遠心してペレットと上清を分離し、ペレットに１００ｍｌのクロロホルム−メタノール−水（１：２：０．８）を加えて、３７℃で１時間振盪し、再抽出した。８，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上清液を合わせ、総脂質抽出液を得た。脂質抽出液全量を減圧下で濃縮乾燥を行い、１２ｍｌのクロロホルム−メタノール（２：１）に溶解した。
【００７６】
実施例１と同様に、ＣＰＣにより、生成物の分離精製を行った。２ｍｌの脂質溶液を注入し、二層系の溶媒として、ｎ−ブタノール／エタノール／１％酢酸（４：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を上から下へ通液させる、下降法にて行った。また、ローターの回転速度は１，２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００７７】
溶出液は２０ｍｌずつ分取し、各フラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図５に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．１１から２６にＧＴ１ｂ、フラクションＮｏ．２０から４３にＧＤ1ａ、フラクションＮｏ．３３から４８にＧＤ1ｂ、Ｎｏ．５８から９２にＧＭ１が溶出されてきた。
【実施例３】
【００７８】
実施例１に示したディッシュによる培養により、ベロ細胞によるドデシル‐βラクトシド（プライマー）からの糖鎖伸長物を調製し、ＨＰ２０を用いて濃縮液を得た。
【００７９】
高速向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）（Ｅａｓｙ−ＰＲＥＰｃｃｃセミ分取モデル、クツワ産業株式会社）により、生成物の分離精製を行った。２ｍｌの濃縮液を注入し、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８０】
溶出液は１０ｍｌずつ３３本分取した後、固定相による押し出しを行い、更に１０ｍｌずつ３０本分取した。得られた６３本のフラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図６に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．３０から３５にプライマーであるドデシル‐βラクトシド、フラクションＮｏ．５１から５５にＧｂ３型糖脂質類似化合物が溶出されてきた。
【実施例４】
【００８１】
実施例２に示した方法と同様に、ラット脳組織より、総脂質抽出液を調製した。
【００８２】
高速向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）により、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。２ｍｌの濃縮液を注入し、二層系の溶媒として、ｎ-ブタノール／エタノール／１％酢酸（４：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は１，０００ｒｐｍ、流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８３】
溶出液は５ｍｌずつ２５本分取した後、固定相による押し出しを行い、更に５ｍｌずつ２５本分取した。得られた５０本のフラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図７に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．２３から３５にかけてガングリオシド（ＧＭ1、ＧＤ1ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ1ｂ）が他の不純物と分離して溶出されてきた。
【実施例５】
【００８４】
実施例２に示した方法と同様に、ラット脳組織より、総脂質抽出液を調製した。
【００８５】
高速向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）により、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。２ｍｌの濃縮液を注入し、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／１％酢酸（５：６：４）を用い、下層を固定相とし、上層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は１．８ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８６】
溶出液は５ｍｌずつ３０本分取した後、固定相による押し出しを行い、更に１０ｍｌずつ２０本分取した。得られた５０本のフラクションを２００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図８に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．４６から４９にかけてガングリオシド（ＧＭ1、ＧＤ1ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ1ｂ）が他の不純物と分離して溶出されてきた。
【実施例６】
【００８７】
実施例２に示した方法と同様に、ラット脳組織より、総脂質抽出液を調製した。更に、その３００μｌの総脂質抽出液からガングリオシドを以下のように調製した。強陰イオン交換カートリッジカラムＩｎｔｅｒＳｅｐ ＳＡＸ（２ｇ）（ＧＬサイエンス）に１００ｍｌのメタノール、１００ｍｌの水、１００ｍｌの０．８Ｍ 酢酸ナトリウム、１００ｍｌの水、１００ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（５：１０：１）を順に通液した後、２０倍（６ｍｌ）のクロロホルム／メタノール／水（５：１０：１）で希釈した３００μｌの総脂質抽出液を通し酸性糖脂質を吸着させた。その後、１００ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（５：１０：１）で洗浄し、１００ｍｌのクロロホルム／メタノール／４Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液（５：１０：１）により溶出し、酸性糖脂質抽出物を得た。この酸性糖脂質抽出物は、減圧下で乾燥させた後、５ｍｌの１−Ｂｕｔａｎｏｌ／ｔ‐ブチルメチルエーテル／アセトニトリル／水（３：１：１：５）に溶解した。
【００８８】
ＣPＣにより、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。５ｍｌの酸性糖脂質抽出物の溶解液を注入し、二層系の溶媒として、１−Ｂｕｔａｎｏｌ／ｔ‐ブチルメチルエーテル／アセトニトリル／水（３：１：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は１２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８９】
溶出液は１０ｍｌずつ５０本分取し、各フラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図９に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．１２から１３にかけてＧＴ1ｂ、Ｎｏ．２４から２５にかけてＧＤ1ａ、Ｎｏ．２５から２６にかけてＧＤ１ｂ、Ｎｏ．２８から３０にかけてＧＭ1が溶出されてきた。
【実施例７】
【００９０】
実施例６に示した方法と同様に、ラット脳組織より、５ｍｌの酸性糖脂質抽出物の溶解液を調製した。
【００９１】
ＨＳＣＣＣにより、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。５ｍｌの酸性糖脂質抽出物の溶解液を注入し、二層系の溶媒として、１−Ｂｕｔａｎｏｌ／ｔ‐ブチルメチルエーテル／アセトニトリル／水（３：１：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は１０００ｒｐｍ、流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００９２】
溶出液は６ｍｌずつ５０本分取し、各フラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図１０に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．３５から３６にかけてＧＴ1ｂ、Ｎｏ．３６から３７にかけてＧＤ1ｂ、Ｎｏ．３６から４０にかけてＧＤ１ａ、Ｎｏ．４６から５０にかけてＧＭ1が溶出されてきた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ベロ細胞によりドデシル‐βラクトシドから生成された糖脂質および／または糖脂質類似化合物をＣＰＣによりクロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図２】ベロ細胞によりドデシル‐βラクトシドから生成された糖脂質類似化合物をＣＰＣによりクロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い反転溶出にて分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図３】ベロ細胞によりドデシル‐βラクトシドから生成された酸性糖脂質類似化合物であるＧＭ３型糖脂質類似化合物をＣＰＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図４】分離したベロ細胞により生成された糖脂質類似化合物のＭＳｎ解析結果である。
【図５】ラット脳組織より天然型のガングリオシドをＣＰＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図６】ベロ細胞により12−アジドドデシル‐βラクトシドから生成された糖脂質類似化合物をＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図７】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図８】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図９】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＣＰＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図１０】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質または糖脂質類似化合物の分離または精製方法に関し、より詳しくは二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィを用いた糖脂質または糖脂質類似化合物の分離または精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるＤＮＡやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
天然型の糖鎖において、シアル酸を含む一群のスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドは、脳内微量ガングリオシドの構造解析や機能などを解明するために、イオン交換クロマトグラフィにより、ウシの脳から分離・精製されている。また、シアル酸のない中性糖鎖であるグロボ系構造についても、機能解明が進められている。糖脂質の精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィやHPLC、HPTLCなどが行われている。（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）
【０００４】
また、糖鎖を合成することも可能である。糖鎖の合成方法としては、化学的に合成する方法、分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法などがあるが、それぞれ、工程が煩雑であったり、収量が低かったり、使用原料が限定されるなどの欠点がある。このような中、最近、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成技術が注目されている。
【０００５】
動物細胞の機能を利用した糖鎖合成では、糖鎖合成経路の前駆体となる「糖鎖プライマー」を培地中に添加することにより細胞内に取り込ませ、糖鎖伸長を受けた生成物が細胞外に分泌されるようにする方法がある。このようにして生成される糖鎖伸長物を分離・精製し、有用な糖鎖のスクリーニング、あるいは産業利用するための研究が進められている。
【０００６】
しかしながら、動物細胞により伸長されて生成される糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、細胞種、「糖鎖プライマー」のオリゴ糖部分の構造により多種多様な糖脂質および／または糖脂質類似化合物が複数種類混在した状態で存在することや、「糖鎖プライマー」が残存することから、単一種類の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を得るためには、これらを分離しなければならない。
【０００７】
これまで動物細胞の機能を利用した糖鎖合成で得られる大量の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離・精製する方法例はなく、主に分析目的としたC18系固相カートリッジでの濃縮や、HPLCまたはHPTLCを用いた分離および／または精製方法が行われていた（例えば特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献４）。また、生体由来の天然型糖鎖化合物、特にガングリオシドの分離・精製は、主に陰イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィで行われていた（非特許文献6）。
【０００８】
また、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成では、糖鎖合成経路の前駆体となる「糖鎖プライマー」を培地中に添加することにより細胞内に取り込ませたのち、糖鎖伸長を受けた生成物が細胞外に分泌されるが、未反応の「糖鎖プライマー」の多くが伸長されないまま、培地中に残るが、この未反応の「糖鎖プライマー」を効率良く回収する方法は未だない。
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２
【非特許文献１】M. C. Z. Kasuyaら、Carbohydrate Research 329 (2000) 755-763
【非特許文献２】Johannes Muthing, Method in Enzymology, Vol312, Part B, 45-64
【非特許文献３】Stephan Ladisch and Ruixiang Li, Method in Enzymology, Vol312, Part B, 135-145
【非特許文献４】Robert K. Yu and Toshio Ariga, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 115-134
【非特許文献５】Y. Hirabayashiら、J. Biol. Chem., 265 (1990), 8144-8151
【非特許文献６】Gerhild Van Echten-Deckert, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 64-79
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離および／または精製するのに用いられているC18系固相抽出カートリッジあるいはHPLCやHPTLCを用いる方法では、カートリッジあるいは装置の価格が高く、大量の試料の処理には適さない。また、イオン交換クロマトグラフィに用いられている樹脂も高価である。このように、大量の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を効率的かつ安価に分離および／または精製する方法は未だなく、このような方法の開発が強く望まれている。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、主に生体由来の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を、細胞、細胞培養物またはその上清などから大量にかつ安価に分離および／または精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、特定の二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィにより、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離および／または精製することで、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
すなわち、本発明は、糖脂質および／または糖脂質類似化合物の分離および／または精製方法であって、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸、酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和した二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィに、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料を供する工程を含む、分離および／または精製方法を提供する。
【００１４】
上記液液分配クロマトグラフィは、遠心液液分配クロマトグラフィまたは高速向流クロマトグラフィであり得る。
【００１５】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が中性である場合には、上記二相溶媒系は、クロロホルム、アルコール類、および水を混和して調製され得る。ここで、アルコール類はメタノールであり得る。さらに、この二相溶媒系は、クロロホルム、メタノール、および水を、５：６：４で混和して調製され得る。
【００１６】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性である場合、上記二相溶媒系は、アルコール類、酸または酸性水溶液、および水を混和して調製され得る。
【００１７】
上記アルコール類はｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液は酢酸であり得る。
【００１８】
上記二相溶媒系は、n−ブタノール、酢酸、水を４：１：５で混和して調製され得る。
【００１９】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性である場合、前記二相溶媒系は、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和して調製され得る。
【００２０】
上記二相溶媒系は、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和して調製され得る。ここで、n−ブタノール、エタノール、１％酢酸水溶液は、４：１：５であり得る。
【００２１】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性である場合、上記二相溶媒系は、アルコール類、エーテル類、アセトニトリルおよび水を混和して調製され得る。
【００２２】
上記二相溶媒系は、n−ブタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、および水を３：１：１：５で混和して調製され得る。
【００２３】
上記分離精製方法では、さらに、合成吸着剤による濃縮および／または精製工程を含み得る。
【００２４】
上記分離精製方法では、さらに、固相抽出カートリッジ、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、およびＧＰＣからなる群より選択されるいずれかひとつ以上の精製工程を含み得る。
【００２５】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、動物細胞、植物細胞、または酵母に、オリゴ糖プライマーを与えて培養することによって得られ得る。
【００２６】
上記糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、動物細胞、植物細胞、または酵母由来の、天然型糖脂質であり得る。
【００２７】
本発明においてはまた、上記の分離および／または精製方法を用いて得られる糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む糖鎖材料の製造方法が提供される。
【００２８】
本発明ではさらに、上記の分離および／または精製方法を用いて、培養細胞中にある糖鎖プライマーを回収する方法が提供される。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように、本発明を適用することによって、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料から、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を、工業的に容易に分離および／または精製することができる。よって、特に、有用な動物細胞などの生体由来の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を安価に大量に調製することが可能になり、糖鎖を利用した製品の開発の迅速な実用化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００３１】
糖脂質とは、分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質の総称であり、脂溶性基がセラミド (N-アシルスフィンゴシン) であるスフィンゴ糖脂質、アシル- あるいはアルキルグリセロールであるグリセロ糖脂質、ステロイド (ステリルグリコシド, ステロイド配糖体)、ヒドロキシ脂肪酸(ラムノリピド) などの脂溶性基をもつグリコシドなどが含まれる。通常、糖脂質は天然に存在する構造のものを指す。本発明においては、天然に存在するものと同一の構造のものの他、天然には存在しない構造のもので、動物細胞などに糖鎖プライマーを加えて得ることができ、水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質を、糖脂質と呼ぶこともある。または特に動物細胞などに糖鎖プライマーを加えて得られるこのような物質を糖脂質類似化合物と呼ぶこともある。本明細書においては、このような糖脂質類似化合物を、対応する糖鎖構造を有する糖脂質の名称を冠して表記する。例えば、動物細胞等に糖鎖プライマーを添加して得られた糖鎖伸長生成物が、ガングリオシドＧＭ３と同一の糖鎖構造を有する場合、該生成物をＧＭ３型糖脂質類似化合物と記す。同様に、糖鎖伸長生成物がグロボ系糖脂質Ｇｂ３と同一の糖鎖構造を有する場合、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物のように記す。
【００３２】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、糖鎖の性質により、中性、酸性に分けられる。酸性を示す糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、限定はされないが、ガングリオシドやスルファチドをはじめとするシアル酸残基や硫酸基を有する各種糖脂質および／または糖脂質類似化合物が挙げられる。具体的には、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１α、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ｃ、ＧＭ４、ＳＭ４ｓ、ＳＭ３、ＳＧＰＧ、シアリルパラグロボシド、ＳＳＥＡ−４、ジシアリルＳＳＥＡ−３、ＧＭ１α、ＧＤ１β、ＳＬｅｘ、ＳＬｅｃ、ＳＬａ等の糖脂質およびこれらの糖脂質類似化合物（ＧＭ１型糖脂質類似化合物、ＧＭ２型糖脂質類似化合物、ＧＭ３型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ａ型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＭ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＤ１α型糖脂質類似化合物、ＧＭ３型糖脂質類似化合物、ＧＭ２型糖脂質類似化合物、ＧＭ１型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ａ型糖脂質類似化合物、ＧＴ１ａ型糖脂質類似化合物、ＧＤ３型糖脂質類似化合物、ＧＤ２型糖脂質類似化合物、ＧＤ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＴ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＱ１ｂ型糖脂質類似化合物、ＧＴ３型糖脂質類似化合物、ＧＴ２型糖脂質類似化合物、ＧＴ１ｃ型糖脂質類似化合物、ＧＱ１ｃ型糖脂質類似化合物、ＧＰ１ｃ型糖脂質類似化合物、ＧＭ４型糖脂質類似化合物、ＳＭ４ｓ型糖脂質類似化合物、ＳＭ３型糖脂質類似化合物、ＳＧＰＧ型糖脂質類似化合物、シアリルパラグロボシド型糖脂質類似化合物、ＳＳＥＡ−４型糖脂質類似化合物、ジシアリルＳＳＥＡ−３型糖脂質類似化合物、ＧＭ１α型糖脂質類似化合物、ＧＤ１β型糖脂質類似化合物、ＳＬｅｘ型糖脂質類似化合物、ＳＬｅｃ型糖脂質類似化合物、ＳＬａ型糖脂質類似化合物など）が挙げられる。中性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、中性糖のみから成る糖脂質および／または糖脂質類似化合物類などのことで、限定はされないが、グロボ系列のＧｂ3、Ｇｂ４や、それらの類似化合物であるＧｂ３型糖脂質類似化合物、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物などが含まれる。その他にも、Ｌａｃ-Ｃｅｒ、ｉＧｂ３、ｉＧｂ４、アシアロＧＭ２、アシアロＧＭ１、パラグロボシド、グロボシド、Ｆｏｒｓｓｍａｎ抗原、ＳＳＥＡ−３、Ｌｅｘ、Ｌｅｙ、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｃ、などの糖脂質やこれらの糖脂質類似化合物が含まれる。
【００３３】
液液分配クロマトグラフィは、有機溶媒、各種水溶液、および水などから選択される少なくとも2種以上の溶媒を混和した二相溶媒系の上層または下層の一方を固定相とし、他方を移動相に用いて試料を分離する方法をいう。
【００３４】
遠心液液分配クロマトグラフィ(ＣＰＣ)とは、二相溶媒系の上層または下層の一方の液層を固定相としてドーナツ型のローターと呼ばれる円盤に放射線状に内蔵されたセル内に満たし、分配セルを回転させて下層または上層を移動相として送液して成分分離を行う液液分配クロマトグラフィである。分離後の試料成分をローターから全て回収でき、正溶出／反転溶出の切り替えも容易に行える利点を持つ。例えば、極性の異なる化合物を含む場合、正溶出により溶出されない場合があるが、ＣＰＣでは固定相を回収できるため、試料を全量回収できる。
【００３５】
本発明に用いるＣＰＣ装置は、固定相の保持をおこなう分配セルおよびそのセルを保持するローターを備え、これに送液ポンプおよび検出器を組み合わせた構造を有していれば、特に限定されることなく、どのような装置でも利用可能である。セルサイズ、回転速度層液速度は、装置のそれぞれの処理能力により異なり、特に限定はされない。ＣＰＣ２４０（センシュー科学）を使用する場合、回転速度としては、500rpmから2500rpm程度の範囲で好ましく使用でき、送液速度は１mlから１０ml/min程度が好ましく使用できる。
【００３６】
高速向流クロマトグラフィ（ＨＳＣＣＣ）とは、二相溶媒系の上層または下層の一方の液層を固定相としてコイル状チューブカラム内に遠心力で保持させ、下層または上層の他方の液層を移動相として送液して成分分離を行う液液分配クロマトグラフィである。分離後の試料成分をカラムから全て回収できるほか、順相／逆相、分析／分取の切り替えも容易である。
【００３７】
本発明に用いるＨＳＣＣＣ装置は、固定相の保持をおこなうカラム部分にＪ型コイル惑星状遠心装置を備え、これに送液ポンプおよび検出器を組み合わせた構造を有する。Ｊ型コイル惑星状遠心装置はコイル部分が回転（自転）し、かつコイル部分の保持装置も回転（公転）する原理を有していれば、特に限定されることなく、どのような装置でも利用可能である（例えば、限定はされないが、Ｅａｓｙ-ＰＲＥＰｃｃｃセミ分取モデル）。
【００３８】
カラム部分に巻きつけて流路およびカラムとなるチューブ部には一般にチューブ状に成型できる素材であれば特に問題なく用いることができる。好適な例としては内径０．５〜３ｍｍのテフロン（登録商標）チューブを挙げる事ができる。送液ポンプはロータリー型、ペリスタ型など、一般に液体の送液に用いることのできるものであれば問題なく用いることができる。まずカラム部分に二相溶媒のどちらか一方を送液し、チューブを満たして固定相とする。続いてコイル部分を自転させ、遠心力で固定相を保持させる。この際の回転数は１０〜１０，０００ｒｐｍを用いることができるが、好適な例としては１，０００〜１，５００ｒｐｍとすることが望ましい。糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料を溶媒に溶解させたサンプルをカラム部分に導入し、その後に二相溶媒の固定相に用いなかった他の相を移動相として送液する。移動相の送液速度は特に制限はないが、０．１〜１０ｍｌ／分の間とすることが望ましい。
【００３９】
ＣＰＣ装置またはＨＳＣＣＣ装置のいずれの場合でも、溶出する移動相を適当な分析装置で分析する。この分析装置は、ＵＶ検出器、ＲＩ検出器、ダイオードアレイ検出器、ＩＲ検出器、蛍光検出器、蒸発光散乱検出器などを用いることができる。
【００４０】
本発明の液液分配クロマトグラフィに用いる二相溶媒系は、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和して調製する。このうち、アルコール類として好ましいのは、メタノール、エタノール、ブタノールであるが、これに限定されない。酸性水溶液としては、酢酸水溶液が挙げられるが、これに限定されない。
【００４１】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含有する試料から中性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合には、二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなるものであることが好ましい。ここで、アルコール類は、メタノールであることがより好ましい。特に、二相溶媒系が、クロロホルム、メタノール、および水を、５：６：４で混和して調製することが好ましい。この比率において用いられるメタノールは、９５％から１００％、好ましくは、９７％から１００％のものである。
【００４２】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含有する試料から酸性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合、二相溶媒系が、アルコール類、酸、および水を混和して調製されることが好ましい。より好ましくは、アルコール類がｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液が酢酸である。あるいは、二相溶媒系を、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和することで調製することも好ましい。この場合、より好ましくは、二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和して調製されるものである。
【００４３】
より好ましくは、酸性の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を分離する場合は、二相溶媒系は、n−ブタノール、酢酸、水を４：１：５で混和してなる。あるいは、二相溶媒系は、n−ブタノール、エタノール、１％酢酸水溶液を４：１：５で混和してなる。さらに、あるいは、二相溶媒系は、n−ブタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、エタノール、１％酢酸水溶液を３：１：１：５で混和して調製することも可能である。これらの比率において、用いられるアルコール濃度は、９５％以上１００％以下、より好ましくは、９７％以上１００％以下のものである。
【００４４】
溶出した移動相はそのままあるいは溶出時間毎に分画し、固相抽出カートリッジ、逆相ＴＬＣ、順相ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析に供することにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。その際に必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により取り除いてから分析を行ってもよい。
【００４５】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料は、限定はされないが、例えば、マウス、ウシ、ヒトなどの哺乳類、その他の動物、あるいは植物の組織または細胞、例えば脳やメラノーマ癌組織等の組織由来であり得る。あるいは、酵母などの微生物を培養して得られる培養細胞由来である。このような組織又は細胞から、天然型糖脂質を含む試料であれば、抽出などの操作によって得ることができる。
【００４６】
抽出は特に限定されないが、細胞や組織を有機溶媒で、例えばクロロホルム-メタノール（２：１）などの溶媒でホモジナイズすることによってなされる。このような抽出物を本発明の方法に供して、糖鎖化合物、主に糖脂質および／または糖脂質類似化合物系の化合物を分離することができる。
【００４７】
細胞培養物は、好ましくは動物細胞を糖脂質および／または糖脂質類似化合物が得られるような条件下にて培養することで得られる。動物細胞は特に限定されず、所望の糖脂質および／または糖脂質類似化合物の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得る。培養は、通常の動物細胞の培養条件に従って行う。
【００４８】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間でＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、糖鎖プライマーを添加した培地に置換してさらに培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００４９】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。限定はされないが、好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｘで表される化合物が挙げられる。ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)n−、−Ｓ−（ＣＨ2)n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)n−から選択される連結基であり、Ｘは、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、ｎは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。従って、糖鎖プライマーも、本明細書では、糖脂質類似化合物ということができる。
【００５０】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。
【００５１】
得られる細胞培養物または細胞培養物から細胞を除いた上清は、糖鎖プライマーから伸長して得られた生成物である糖脂質または糖脂質類似化合物を含有する。この細胞培養物または細胞培養物の上清を本発明の液液分配クロマトグラフィに供する。
【００５２】
本発明では、液液分配クロマトグラフィの前あるいは後に、固体吸着剤を接触させることにより、予め糖脂質または糖脂質類似化合物を含む濃縮液を調製したり、より純粋な糖脂質または糖脂質類似化合物を調製することも可能である。
【００５３】
接触は、例えば、細胞培養物または細胞培養物の上清に直接固体吸着剤を加え、３０分以上の時間で振盪するなどして行う。あるいは、カラムなどに予め固体吸着剤を充填しておき、充填したカラムに細胞培養物または細胞培養物の上清を流すことによって行う。
【００５４】
さらに、接触工程終了後の固体吸着剤に適度な濃度の溶離剤を接触させて、固体吸着剤から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を脱着させるとともに、脱着させた糖脂質および／または糖脂質類似化合物を溶離剤中に溶離させる溶離工程を行い得る。溶離剤は、限定はされないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、およびアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種であり得る。この工程は、糖脂質および／または糖脂質類似化合物と吸着体が疎水性相互作用によって吸着していたものに、有機溶媒などの溶離剤を接触させることで、吸着剤から糖脂質および／または糖脂質類似化合物を脱着させて、さらにこの糖脂質および／または糖脂質類似化合物を有機溶媒中に溶離させる工程である。
【００５５】
ここで、固体吸着剤は、スチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種であり得る。その他、フェノール系合成吸着体も用いることができる。培養物中または培養上清中の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ２０、ＨＰ２１、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ロームアンドハース社製アンバーライト（登録商標、以下同じ）ＸＡＤ４、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００、Ｂａｙｅｒ社製ＶＰＯＣ１０６２、ＶＰＯＣ１０６４等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等を用いることができる。
【００５６】
中性で糖鎖プライマーの１２‐アジドドデシル‐βラクトシドは、培地上清に同量の酢酸エチルを添加し振盪することにより、酢酸エチル層に抽出できることにより予め除くことも可能である。よって、培地上清を吸着剤に接触させる前に、酢酸エチルによる抽出により中性である糖鎖プライマーである１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを除いておくと、吸着工程及び、溶離工程における負荷を軽減することが可能である。
【００５７】
糖鎖プライマーは、ラクトースやN-アセチルグルコサミンなどをドデシル基と結合することで作成し利用できる。更に、アジド基などの官能基をアグリコン部分に導入しておけば、後の操作でその部分と別の化合物とを共有結合などで結合して固定化することが可能である。
【００５８】
溶出した移動相はそのまま、或いは溶出時間毎に分画して、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィ、ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＴＯＦ−ＭＳなどの分析を行うことにより、さらに詳細な分離、分析を行うことができる。その際に必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により取り除いてから分析を行うこともできる。
【００５９】
また溶出した移動相をそのまま、或いは溶出時間毎に分画し、必要があれば移動相を減圧乾固などの方法により除いて、糖脂質および／または糖脂質類似化合物画分として利用することもできる。
【００６０】
本発明においては、上記の方法で得られる組織や細胞からの抽出物、又は細胞による糖鎖プライマー伸長法により得られた試料に含まれる複数種類の糖脂質および／または糖脂質類似化合物を、液液分配クロマトグラフィを用いて効率的に分離できる。更に、細胞による糖鎖プライマー伸長法により糖鎖合成を行う場合、未反応の「糖鎖プライマー」が培養液中に多量に残るが、このような未反応の「糖鎖プライマー」も、本発明の特定溶媒による液液分配クロマトグラフィで、効率良く回収することも可能であることから、「糖鎖プライマー」を再利用することができるようになる。
【００６１】
このようにして分離、精製された糖脂質および／または糖脂質類似化合物は、様々な糖鎖材料として、使用することができる。このような材料としては、特に限定はされないが、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を固相に固定化して得られるものが含まれる。糖鎖材料は、ウィルス、バクテリア、および／または毒素の吸着材、毒素の中和剤、生体防御系刺激、抗炎症、抗菌、および／または抗腫瘍転移に有用な薬剤、診断薬、細胞培養基材または特異的細胞分離基材、毒素などの検出基盤に好適に用いられうる。
【００６２】
以下に、本発明の糖脂質および／または糖脂質類似化合物の精製方法および濃縮方法の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００６３】
まず、触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)とアジド基を導入したアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、「糖鎖プライマー」：１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063, Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）
【００６４】
５００ｍＬ容量のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット（ＮＥＷ ＢＲＵＮＳＷＩＣＫ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて培養及び、糖鎖伸長反応を行った。バスケットに１０ｇのフィブラセルディスクを保持させた容器に５００ｍｌのＰＢＳを入れ、オートクレーブに滅菌した（１２１℃、２０分）。その後、容器中の液を５００ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地（インビトロジェン社）に置換し、2×１０８ｃｅｌｌｓのベロ細胞を接種し、５０ｒｐｍの回転数で１時間撹拌した。その後、１００ｒｐｍの回転数に上げて、８日間培養を続けた。その間、２〜３日おきに培地を交換した。
【００６５】
その後、１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）と、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ のドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて９６時間培養した。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメントと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し４８時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００６６】
８０枚の１００ｍｍのディッシュに各々、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのベロ細胞を７ｍｌの１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したOptiPRO SFM培地に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間、培養した。培養後、１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメントと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベーターの中で３７℃にて４８時間し、糖鎖伸長反応を行った。培養した後、培地全量を回収し、フレッシュな１％ ＩＴＳ−Ｘサプリメントと、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ社製）と、５０ μＭ の１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し９６時間培養することを、更に２回繰り返し行い、約１．５Lの培地上清を得た。
【００６７】
上記のフィブラセルＴＭサポート付スピンナーバスケット、及び１００ｍｍのディッシュを用いて培養することによって得られた約３Ｌの培地上清に対し、５０ｇのポリスチレン系の合成吸着剤ＨＰ２０（三菱化学社製）を加え、２時間以上振盪し、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を吸着剤に吸着させた。吸着後、水洗しメタノールで溶出した。更に、得られた溶出液を、減圧下で濃縮、乾燥させた。乾燥物を３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、濃縮液を調製した。
【００６８】
ＣＰＣ（ＣＰＣ２４０、株式会社センシュー科学）により、濃縮物から生成物の分離精製を行った。条件としては、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い、上層を固定相とし、下層を上から下へ通液させる、下降法にて行った。また、ローターの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００６９】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図１に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。フラクションＮｏ．１６から２０にドデシル‐βラクトシド、Ｎｏ．２６から４０にＧｂ３型糖脂質類似化合物が溶出されてきた。この方法では、極性の低い性質を持つ中性糖鎖である、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物、未反応の「糖鎖プライマー」である１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを分離することができた。
【００７０】
溶出されてこない画分については、反転溶出、つまり、固定相を下から上へ通液させることにより、固定相を押し出すことにより、回収した。同様に、溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図２に示す。フラクションＮｏ．６１から６６において、酸性糖脂質および糖脂質類似化合物ＧＭ３型糖脂質、及び培地由来のスポットが検出された。なお、フラクションＮｏ．６８から７２において、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物が溶出した。
【００７１】
上記で得られた、ドデシル‐βラクトシド、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物、ＧＭ３型糖脂質類似化合物、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物を含む画分をそれぞれ集め、減圧下で濃縮した後、Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）にて精製した。得られた糖脂質および／または糖脂質類似化合物および、ドデシル‐βラクトシドを減圧下で乾燥させた。
【００７２】
さらに、ＧＭ３型糖脂質類似化合物を含む画分については、乾燥後、３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解した後、ＣＰＣにより、n−ブタノール／エタノール／１％酢酸水溶液（４：１：５）を二層系の溶媒として用いて、下降法にて分離を行った。ローターの回転速度は１２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００７３】
溶出液は１０ｍｌずつ分取し、各フラクションを２００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図３に示す。フラクションＮｏ．４１から７５にかけて、酸性の糖脂質類似化合物であるＧＭ３型糖脂質類似化合物が検出された。全フラクションを集め、減圧下で乾燥させた。
【００７４】
以上の結果より得られた、糖脂質類似化合物および、ドデシル‐βラクトシドの乾燥重量を測定した結果、ドデシル‐βラクトシドは２１．7ｍｇ、Ｇｂ３型糖脂質類似化合物は８．３ｍｇ、Ｇｂ４型糖脂質類似化合物は５．１ｍｇ、ＧＭ３型糖脂質類似化合物は１９．５ｍｇであった。イオントラップ型質量分析装置ＨＣＴｐｌｕｓ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ社製）により、ＭＳｎ解析を行った結果を図４に示す。
【実施例２】
【００７５】
約２０ｇのラット脳組織（Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ、ＲＯＣＫＬＡＮＤ，Ｉｎｃ）を乳鉢ですり潰した後、１００ｍｌのクロロホルム−メタノール（２：１）を加え、５分間超音波処理し、３７度のインキュベータ中で１時間振盪して脂質を抽出した。８，０００ｒｐｍで１０分間遠心してペレットと上清を分離し、ペレットに１００ｍｌのクロロホルム−メタノール−水（１：２：０．８）を加えて、３７℃で１時間振盪し、再抽出した。８，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上清液を合わせ、総脂質抽出液を得た。脂質抽出液全量を減圧下で濃縮乾燥を行い、１２ｍｌのクロロホルム−メタノール（２：１）に溶解した。
【００７６】
実施例１と同様に、ＣＰＣにより、生成物の分離精製を行った。２ｍｌの脂質溶液を注入し、二層系の溶媒として、ｎ−ブタノール／エタノール／１％酢酸（４：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を上から下へ通液させる、下降法にて行った。また、ローターの回転速度は１，２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００７７】
溶出液は２０ｍｌずつ分取し、各フラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図５に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．１１から２６にＧＴ１ｂ、フラクションＮｏ．２０から４３にＧＤ1ａ、フラクションＮｏ．３３から４８にＧＤ1ｂ、Ｎｏ．５８から９２にＧＭ１が溶出されてきた。
【実施例３】
【００７８】
実施例１に示したディッシュによる培養により、ベロ細胞によるドデシル‐βラクトシド（プライマー）からの糖鎖伸長物を調製し、ＨＰ２０を用いて濃縮液を得た。
【００７９】
高速向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）（Ｅａｓｙ−ＰＲＥＰｃｃｃセミ分取モデル、クツワ産業株式会社）により、生成物の分離精製を行った。２ｍｌの濃縮液を注入し、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８０】
溶出液は１０ｍｌずつ３３本分取した後、固定相による押し出しを行い、更に１０ｍｌずつ３０本分取した。得られた６３本のフラクションを５００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図６に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．３０から３５にプライマーであるドデシル‐βラクトシド、フラクションＮｏ．５１から５５にＧｂ３型糖脂質類似化合物が溶出されてきた。
【実施例４】
【００８１】
実施例２に示した方法と同様に、ラット脳組織より、総脂質抽出液を調製した。
【００８２】
高速向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）により、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。２ｍｌの濃縮液を注入し、二層系の溶媒として、ｎ-ブタノール／エタノール／１％酢酸（４：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は１，０００ｒｐｍ、流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８３】
溶出液は５ｍｌずつ２５本分取した後、固定相による押し出しを行い、更に５ｍｌずつ２５本分取した。得られた５０本のフラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図７に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．２３から３５にかけてガングリオシド（ＧＭ1、ＧＤ1ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ1ｂ）が他の不純物と分離して溶出されてきた。
【実施例５】
【００８４】
実施例２に示した方法と同様に、ラット脳組織より、総脂質抽出液を調製した。
【００８５】
高速向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）により、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。２ｍｌの濃縮液を注入し、二層系の溶媒として、クロロホルム／メタノール／１％酢酸（５：６：４）を用い、下層を固定相とし、上層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は７００ｒｐｍ、流速は１．８ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８６】
溶出液は５ｍｌずつ３０本分取した後、固定相による押し出しを行い、更に１０ｍｌずつ２０本分取した。得られた５０本のフラクションを２００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図８に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．４６から４９にかけてガングリオシド（ＧＭ1、ＧＤ1ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ1ｂ）が他の不純物と分離して溶出されてきた。
【実施例６】
【００８７】
実施例２に示した方法と同様に、ラット脳組織より、総脂質抽出液を調製した。更に、その３００μｌの総脂質抽出液からガングリオシドを以下のように調製した。強陰イオン交換カートリッジカラムＩｎｔｅｒＳｅｐ ＳＡＸ（２ｇ）（ＧＬサイエンス）に１００ｍｌのメタノール、１００ｍｌの水、１００ｍｌの０．８Ｍ 酢酸ナトリウム、１００ｍｌの水、１００ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（５：１０：１）を順に通液した後、２０倍（６ｍｌ）のクロロホルム／メタノール／水（５：１０：１）で希釈した３００μｌの総脂質抽出液を通し酸性糖脂質を吸着させた。その後、１００ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（５：１０：１）で洗浄し、１００ｍｌのクロロホルム／メタノール／４Ｍ 酢酸アンモニウム水溶液（５：１０：１）により溶出し、酸性糖脂質抽出物を得た。この酸性糖脂質抽出物は、減圧下で乾燥させた後、５ｍｌの１−Ｂｕｔａｎｏｌ／ｔ‐ブチルメチルエーテル／アセトニトリル／水（３：１：１：５）に溶解した。
【００８８】
ＣPＣにより、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。５ｍｌの酸性糖脂質抽出物の溶解液を注入し、二層系の溶媒として、１−Ｂｕｔａｎｏｌ／ｔ‐ブチルメチルエーテル／アセトニトリル／水（３：１：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は１２００ｒｐｍ、流速は４ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００８９】
溶出液は１０ｍｌずつ５０本分取し、各フラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図９に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．１２から１３にかけてＧＴ1ｂ、Ｎｏ．２４から２５にかけてＧＤ1ａ、Ｎｏ．２５から２６にかけてＧＤ１ｂ、Ｎｏ．２８から３０にかけてＧＭ1が溶出されてきた。
【実施例７】
【００９０】
実施例６に示した方法と同様に、ラット脳組織より、５ｍｌの酸性糖脂質抽出物の溶解液を調製した。
【００９１】
ＨＳＣＣＣにより、総脂質抽出液よりガングリオシドの分離精製を行った。５ｍｌの酸性糖脂質抽出物の溶解液を注入し、二層系の溶媒として、１−Ｂｕｔａｎｏｌ／ｔ‐ブチルメチルエーテル／アセトニトリル／水（３：１：１：５）を用い、上層を固定相とし、下層を移動相として用いた。また、カラムの回転速度は１０００ｒｐｍ、流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００９２】
溶出液は６ｍｌずつ５０本分取し、各フラクションを１００μｌずつ減圧下で乾燥し、少量のクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を、図１０に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。Ｎｏ．３５から３６にかけてＧＴ1ｂ、Ｎｏ．３６から３７にかけてＧＤ1ｂ、Ｎｏ．３６から４０にかけてＧＤ１ａ、Ｎｏ．４６から５０にかけてＧＭ1が溶出されてきた。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ベロ細胞によりドデシル‐βラクトシドから生成された糖脂質および／または糖脂質類似化合物をＣＰＣによりクロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図２】ベロ細胞によりドデシル‐βラクトシドから生成された糖脂質類似化合物をＣＰＣによりクロロホルム／メタノール／水（５：６：４）を用い反転溶出にて分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図３】ベロ細胞によりドデシル‐βラクトシドから生成された酸性糖脂質類似化合物であるＧＭ３型糖脂質類似化合物をＣＰＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図４】分離したベロ細胞により生成された糖脂質類似化合物のＭＳｎ解析結果である。
【図５】ラット脳組織より天然型のガングリオシドをＣＰＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図６】ベロ細胞により12−アジドドデシル‐βラクトシドから生成された糖脂質類似化合物をＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図７】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図８】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図９】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＣＰＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図１０】ラット脳組織より抽出した天然型のガングリオシドをＨＳＣＣＣにより分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物の分離および／または精製方法であって、
クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和した二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィに、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料を供する工程を含む、分離および／または精製方法。
【請求項２】
前記液液分配クロマトグラフィが、遠心液液分配クロマトグラフィまたは高速向流クロマトグラフィである請求項1記載の分離および／または精製方法。
【請求項３】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が中性であり、前記二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなる請求項１または2記載の分離および／または精製方法。
【請求項４】
前記アルコール類がメタノールである請求項３記載の分離および／または精製方法。
【請求項５】
前記二相溶媒系が、クロロホルム、メタノール、および水を、５：６：４で混和してなる請求項４記載の分離および／または精製方法。
【請求項６】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性であり、前記二相溶媒系が、アルコール類、酸または酸性水溶液、および水を混和してなる請求項１または2記載の分離および／または精製方法。
【請求項７】
前記アルコール類がｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液が酢酸である請求項６記載の分離および／または精製方法。
【請求項８】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、酢酸、水を４：１：５で混和してなる請求項７記載の分離および／または精製方法。
【請求項９】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性であり、前記二相溶媒系が、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和してなる請求項１または２に記載の分離および／または精製方法。
【請求項１０】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和してなる請求項９記載の分離および／または精製方法。
【請求項１１】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、１％酢酸水溶液を４：１：５で混和してなる請求項１０記載の分離および／または精製方法。
【請求項１２】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性であり、前記二相溶媒系が、アルコール類、エーテル類、アセトニトリルおよび水を混和してなる請求項１または2記載の分離および／または精製方法。
【請求項１３】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、および水を３：１：１：５で混和してなる請求項１２記載の分離および／または精製方法。
【請求項１４】
さらに、合成吸着剤による濃縮および／または精製工程を含む、請求項１から１３までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１５】
さらに、固相抽出カートリッジ、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、およびＧＰＣからなる群より選択されるいずれかひとつ以上の精製工程を含む、請求項１から１４までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１６】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料が、動物細胞、植物細胞、または酵母に、オリゴ糖プライマーを与えて培養することによって得られる請求項１から１５までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１７】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料が、動物細胞、植物細胞、または酵母由来の、天然型糖脂質を含む請求項１から１６までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれかに記載の分離および／または精製方法により糖脂質および／または糖脂質類似化合物を得ることを含む、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む糖鎖材料の製造方法。
【請求項１９】
前記糖脂質類似化合物が、オリゴ糖鎖プライマーである、請求項１から１８までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１】
糖脂質および／または糖脂質類似化合物の分離および／または精製方法であって、
クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトニトリル、アルコール類、エーテル類、水、酸または酸性水溶液、およびアルカリ性水溶液からなる群より選択される少なくとも２種以上を混和した二相溶媒系による液液分配クロマトグラフィに、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料を供する工程を含む、分離および／または精製方法。
【請求項２】
前記液液分配クロマトグラフィが、遠心液液分配クロマトグラフィまたは高速向流クロマトグラフィである請求項1記載の分離および／または精製方法。
【請求項３】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が中性であり、前記二相溶媒系が、クロロホルム、アルコール類、および水を混和してなる請求項１または2記載の分離および／または精製方法。
【請求項４】
前記アルコール類がメタノールである請求項３記載の分離および／または精製方法。
【請求項５】
前記二相溶媒系が、クロロホルム、メタノール、および水を、５：６：４で混和してなる請求項４記載の分離および／または精製方法。
【請求項６】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性であり、前記二相溶媒系が、アルコール類、酸または酸性水溶液、および水を混和してなる請求項１または2記載の分離および／または精製方法。
【請求項７】
前記アルコール類がｎ−ブタノールであり、前記酸または酸性水溶液が酢酸である請求項６記載の分離および／または精製方法。
【請求項８】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、酢酸、水を４：１：５で混和してなる請求項７記載の分離および／または精製方法。
【請求項９】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性であり、前記二相溶媒系が、二種の異なるアルコール類および酸性水溶液を混和してなる請求項１または２に記載の分離および／または精製方法。
【請求項１０】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、および１％酢酸水溶液を混和してなる請求項９記載の分離および／または精製方法。
【請求項１１】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、エタノール、１％酢酸水溶液を４：１：５で混和してなる請求項１０記載の分離および／または精製方法。
【請求項１２】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物が酸性であり、前記二相溶媒系が、アルコール類、エーテル類、アセトニトリルおよび水を混和してなる請求項１または2記載の分離および／または精製方法。
【請求項１３】
前記二相溶媒系が、n−ブタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、および水を３：１：１：５で混和してなる請求項１２記載の分離および／または精製方法。
【請求項１４】
さらに、合成吸着剤による濃縮および／または精製工程を含む、請求項１から１３までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１５】
さらに、固相抽出カートリッジ、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、およびＧＰＣからなる群より選択されるいずれかひとつ以上の精製工程を含む、請求項１から１４までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１６】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料が、動物細胞、植物細胞、または酵母に、オリゴ糖プライマーを与えて培養することによって得られる請求項１から１５までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１７】
前記糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む試料が、動物細胞、植物細胞、または酵母由来の、天然型糖脂質を含む請求項１から１６までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれかに記載の分離および／または精製方法により糖脂質および／または糖脂質類似化合物を得ることを含む、糖脂質および／または糖脂質類似化合物を含む糖鎖材料の製造方法。
【請求項１９】
前記糖脂質類似化合物が、オリゴ糖鎖プライマーである、請求項１から１８までのいずれかに記載の分離および／または精製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−２３９８８（Ｐ２００９−２３９８８Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９２６８（Ｐ２００８−１９２６８）
【出願日】平成２０年１月３０日（２００８．１．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月３０日（２００８．１．３０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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