納豆菌株、納豆及びその製造方法
【課題】既存納豆菌株で十分な発酵が困難な有色素大豆を用いた納豆において、表皮が口に残らず柔らかく仕上がり、十分な旨みを感じ、大豆臭ではなく、良い発酵臭を感じる納豆を作ることの出来る納豆菌株、納豆及びその製造方法を提供する。
【解決手段】バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する新規な微生物変異株であるバチルス・サブチリスＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７８）である納豆菌株、あるいは、当該納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９）の混合割合が質量比で８：２である納豆菌株を用いることにより、柔らかく、十分な旨みと良い発酵臭を感じる納豆を製造することができる方法。
【解決手段】バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する新規な微生物変異株であるバチルス・サブチリスＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７８）である納豆菌株、あるいは、当該納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９）の混合割合が質量比で８：２である納豆菌株を用いることにより、柔らかく、十分な旨みと良い発酵臭を感じる納豆を製造することができる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチラス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌株及びその用途に関する。特に、本明細書において「有色素大豆」と呼称する黒、茶、紅又は緑などの色大豆を用いて、食感が柔らかく、旨みや香りにおいても優れた納豆を製造することの出来る納豆菌株、納豆及びその製造方法に関わるものである。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、日本の伝統的な発酵食品で栄養価が高く食卓でも馴染み深い食品であり、蒸した大豆に納豆菌を植菌して発酵することで製造される。原料となる大豆は、黄色い大豆が一般的で、用いられる納豆菌も大手メーカーが自社開発した物を除くと、全国で大きく３種類しか存在しない。その３種類の中で全国的に利用率が高いのは、有限会社宮城野納豆製造所が販売する宮城野菌である。しかし、原料となる大豆は、黄色以外にも黒、茶、紅などの有色素大豆が存在するが、有色素大豆に対してはこれら３種類のどの納豆菌を用いても、食感が硬く、旨みに乏しく、さらには、発酵が不十分な際に生じる大豆臭さが残るなどの問題点がある。黄大豆においても、原産国、その年の気候及び品種により、皮の硬いものや旨みに欠けるものなど、既存の納豆菌では問題の残るものが存在する。黒大豆納豆を製造する方法として、例えば特許文献１に記載の手法が開示されている。しかし、蒸煮した大豆を冷凍する設備の導入が不可避であり、そのための設備投資費が掛かる他、納豆製造に新たな工程が加わるために手間が増えるといった問題がある。また、皮が硬く食感が悪いといった問題点を解決するために、例えば特許文献２や３には、セルロースやヘミセルロースを分解する能力の高い菌を用いて大豆の表皮成分を部分的に分解する方法が開示されている。しかし、これらの方法のみでは有色素大豆に対しては十分な効果が得られない。有色素大豆を十分に発酵させ、旨みや香りにおいても優れた納豆を製造する為には、従来の納豆菌よりも高いプロテアーゼ活性を有する納豆菌が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２０１４６６号公報
【特許文献２】特開２００９−３９０８０号公報
【特許文献３】特開平９−０９９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
有色素大豆、特に黒大豆は、難分解性の成分を含む表皮が厚いため、従来の納豆菌株では発酵が不十分となり、できあがった納豆は、発酵が十分でないことに起因すると思われる表皮のごぞごぞとした食感が残り硬めに仕上がる。また、旨みに乏しく大豆臭さが残るといった問題点を有している。そこで、表皮が口に残らないように柔らかく仕上がり、十分な旨みを感じ、大豆臭がなく良い発酵臭を感じる納豆を作る技術が求められている。本発明は、従来技術の問題点を解決し、従来の納豆菌株では十分な発酵が困難な有色素大豆に適用可能な新規の納豆菌株を提供するとともに、この新規な納豆菌株を用いて製造した納豆及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明の第１手段は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１株（ＦＥＲＭＰ−２２０７８）であることを特徴とする。
【０００６】
また、第２手段は、黒大豆、茶大豆、紅大豆及び緑大豆からなる群から選択される大豆を原料とする納豆を製造しうることを特徴とする第１手段に記載の納豆菌変異株であることを特徴とする。
【０００７】
また、第３手段は、第１手段に記載の納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９）とを８：２の質量比で混合してなる納豆菌株であることを特徴とする。
【０００８】
また、第４手段は、第１手段又は第２手段に記載の納豆菌変異株あるいは第３手段に記載の混合してなる納豆菌株を用いることを特徴とする納豆の製造方法である。
【０００９】
また、第５手段は、第４手段に記載の製造方法により得られる納豆であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、新規なバチラス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１；ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）が提供される。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は、納豆の製造に用いることができる。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌を、煮豆に植菌して発酵させることにより、納豆を製造することが出来る。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は高いセルラーゼ活性とプロテアーゼ活性の両方を持つ為、セルラーゼにより大豆表皮の分解が進むことで、種子にプロテアーゼがしっかり働くことが出来るという相乗効果により表皮だけでなく種子も柔らかく、さらにたんぱく質分解物であるペプチドやアミノ酸が豊富に産生されることにより旨みの強い納豆を作ることが可能になる。加えて、十分発酵が進むことで、発酵が不十分である場合に感じる大豆臭さも抑えられ、良い発酵臭の納豆製造が可能になる。こうした効果により、納豆製造に多く用いられる表皮が黄色い大豆の納豆製造に使用可能なのはもちろんのこと、従来の納豆菌で十分な発酵が難しかった有色素大豆に対しても表皮が口に残らず柔らかく仕上がり、十分な旨みを感じ、大豆臭ではない良い発酵臭を感じる納豆を製造することが可能になる。さらに、当該納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株とを混合した納豆菌株を用いることで、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌単独の場合よりも糸引きの強い納豆を製造することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】 ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌と宮城野菌のセルラーゼ活性の経時変化を示す。
【図２】 ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌と宮城野菌のプロテアーゼ活性の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の納豆菌変異株（ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）の分離、培養及び用途について詳しく説明する。
【００１３】
本発明の新規な納豆菌であるＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は、次のようにして得たものである。収穫後の稲藁１本を滅菌済みの５０ｍｌ遠心チューブに入れ、そこに滅菌水を注ぎ懸濁した。耐熱性胞子のみを選択的に得るべく、これを９５℃で５分程処理した。この懸濁液１ｍｌをＴＳＢ（トリプティックソイブロス）１０ｍｌに注ぎ、３７℃で一晩振盪培養した後、培養液を１０，０００倍希釈して１００μｌをＴＳＡ（トリプティックソイ寒天培地）平板培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した後、分離した細菌をＴＳＡ平板培地に塗布し、純化する行程を繰り返した。
【００１４】
単離した細菌株全てについて納豆を試作し、菌の被り、豆の硬さ、糸引き、糸の節などの観点から、納豆加工適性を有する細菌株を選抜した。選抜した細菌株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析の他、ＡＦＬＰ等の系統解析試験及びビオチン要求性試験を行い、その結果からバチラス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌であることを確認した。なお、納豆菌と納豆菌以外のバチラス・ズブチルスとの相違は、納豆菌がビオチン要求性を示し、かつ粘質物産出能を有するのに対し、納豆菌以外のバチラス・ズブチルスはこれらの特性を示さないことにある。
【００１５】
次に、これらの細菌株について、変異を誘発する操作を行った。枯草菌をリファンピシン含有培地で培養し、生育が見られた菌株、つまりリファンピシン耐性を獲得した菌株は、ＲＮＡポリメラーゼに変異が入り、幾つかの酵素活性が上昇するという報告がなされている。この手法を枯草菌の一種である納豆菌に応用した。具体的には次の通りである。
【００１６】
グルタミン酸ナトリウム一水和物を６ｇと、サッカロースを１２ｇと、フィトンペプトンを６ｇと、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇと、Ｎａ２ＨＰＯ４を０．６８ｇと、ＮａＣｌを０．２ｇと、ＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏを０．２ｇと、寒天を６ｇとを、逆浸透水４００ｍｌに溶かし（ＧＳＰ培地）、滅菌した後、リファンピシンを２μｇ／ｍｌの割合で添加した培地を調製した。遺伝子解析を行った菌株のうち特に納豆加工適性の高かった１株をＬＢ培地で一晩振盪培養した。培養後、２倍希釈して、調製したリファンピシン入りのＧＳＰ培地に１００μｌ塗布し、３７℃で一晩培養した。納豆の粘りに相当する粘性物質であるγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）生産能がある菌株を分離し、ＬＢ寒天培地で純化を行った。これにより、本発明のバチラス・ズブチルス イバラキ シー ワン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１；ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）を得た。この納豆菌変異株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２２０７８号の受託番号で寄託されたバチラス・ズブチルス イバラキ シー ワン株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１）である。なお、本発明の納豆菌変異株の変異前の親株については、宮城野菌などの市販納豆スターター株が必ず保有しているＩＳ４Ｂｓｕ１及びＩＳ２５６Ｂｓｕ１を保持していないことと、ＡＦＬＰ試験により市販納豆スターター株と異なることを確認した。
【００１７】
本発明のＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌と市販納豆スターター株である宮城野菌についてセルラーゼ及びプロテアーゼ活性測定を実施して比較した。まず、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌及び宮城野菌をＬＢ培地にて３７℃で一晩振盪培養した。１００ｍｌのＬＢ培地を注いだ３００ｍｌのバッフル付フラスコに培養液１ｍｌを注いだ。この培養液を培養中のある一定時間毎に採取し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を取得し、この培養上清を酵素液として活性の測定を行った。
【００１８】
セルラーゼ活性測定法は、次の通りである。基質として１％のＡｚｏ−ＣＭＣ溶液（ＰＨ６）を用いた。反応容器は１．５ｍｌのエッペンチューブを用いた。基質溶液１００μｌに酵素液（培養上清）を１００μｌ添加し、手早く混ぜ、サンプル用チューブを５０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、９９．５％エタノールを１０００μｌ添加し、反応を停止させた。これを１０分間室温放置後、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を取得した。Ａｚｏ−ＣＭＣの分解度合いを５９０ｎｍの吸光度を測定することで実施し、セルラーゼ活性を評価した。なお、基質溶液と酵素液を混合後、直ちにエタノールを添加したものをバックグラウンドとした。
【００１９】
その結果を図１及び表１に示す。表１によると、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は宮城野菌に比べて、酵素活性の立ち上がり、つまり吸光度（５９０ｎｍ）が０．０５を超えてくるのが３時間ほど早いことが確認できた。また、図１によりＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の酵素活性がピークに達しつつある培養９時間前後数時間においてＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の方が最大１５％以上高い数値を示す時間帯が存在することが確認された。このことから、発酵完了までにより多くの表皮成分を分解できるため、皮を柔らかく仕上げることが出来る。また、表皮成分が分解されることで、後述のプロテアーゼなどの酵素も働きやすくなり、発酵の進行も容易になると期待できる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
プロテアーゼ活性測定法は、次の通りである。基質として０．５％％アゾカゼイン（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８））を用いた。反応容器は１．５ｍｌのエッペンチューブを用いた。基質溶液５００μｌに酵素液（培養上清）１００μｌを添加し、手早く混ぜ、サンプル用チューブを３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、１５％ＴＣＡを４００μｌ添加し、反応を停止させた。これを１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清９００μｌを新たなエッペンチューブに分注し、ここに１０Ｍ ＮａＯＨを４５μｌ添加した。アゾカゼインの分解の度合いを４４０ｎｍの吸光度を測定することで実施し、プロテアーゼ活性を評価した。なお、基質溶液と酵素液を混合後、直ちに１５％ＴＣＡを添加したものをバックグラウンドとした。
【００２２】
その結果を図２に示す。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は、プロテアーゼ活性の立ち上がり直後から宮城野菌に比べて、１．５倍以上の数値を示すだけでなく、発酵に重要な発酵開始後１８時間頃までの時間帯において、常に２倍強の活性を示すことが確認された。この結果から、より多くのたんぱく質が分解されることで、豆そのものも柔らかく仕上がると共に、ペプチドやアミノ酸が多く生じてくることでより旨みのある納豆ができる。
【００２３】
本発明の納豆菌（ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）及び市販納豆スターター株である宮城野菌を用い、以下に示すようにして黒大豆納豆を試作した。最初に、黒大豆を３倍量の水（２０℃）に１６時間浸漬した後、よく水を切り、０．１８ＭＰａの条件で３０分間蒸煮した。次に、蒸煮大豆１ｇに対して上記納豆菌の菌数が１０３個となるように納豆菌胞子懸濁液を噴霧し、よく攪拌した。これを、発泡スチロール製の容器に所定量充填し、小孔のあるポリスチレン製フィルムで被覆して蓋をした。次に、３９℃，湿度９０％で１８時間発酵処理を行った後、２０℃，５０％であら熱を取り、５℃で１日以上冷蔵して熟成させ、目的とする納豆を得た。
【００２４】
このようにして得られた納豆について、硬度評価及び官能試験を行った。なお、上記硬度評価及び官能試験は、下記に示す方法により行った。
【００２５】
（１）納豆の硬さの評価試験
納豆の硬さの評価試験は、「納豆試験法」（納豆試験研究会編、光琳社、平成２年３月８日発行）に記載の方法により行った。すなわち、上皿時計秤上に、納豆をのせ、試験用アダプター（縦２ｃｍ横２ｃｍ、厚み２ｍｍで先３ｍｍ付近から細くなり、納豆との接触面は厚みが１ｍｍ）にて大豆の単軸方向に切断し、切断時の重量（ｇ）を切断強度とした。なお、この切断強度試験は、納豆５０粒について行い、その平均値を表２に示した。このことから、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌を用いた方が切断強度が小さく、セルラーゼやプロテアーゼの効果により納豆が柔らかく仕上がったことが確認された。
【００２６】
【表２】
【００２７】
（２）官能試験
年齢・性別も様々な２６名により２種類の納豆について比較評価を実施した。その結果を表３に示す。検査した全ての項目でＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の方が良いという評価が宮城野菌を上回り、本発明のＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌を用いることで、表皮が口に残らず柔らかく仕上がり、十分な旨みを感じ、大豆臭ではなく良い発酵臭を感じる納豆を作ることが可能になった。
【００２８】
【表３】
【実施例１】
【００２９】
ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌およびＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の変異前の親株であるＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９号の受託番号で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されたバチラス・ズブチルス イバラキ ピー ワン株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１；ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１菌）を用い、以下に示すようにして納豆を製造した。すなわち、まず、黄大豆を３倍量の水（２０℃）で１６時間浸漬した後、よく水を切り、０．１８ＭＰａの条件で３０分間蒸煮した。次に、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌８０％に対し、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１菌２０％で混合し、蒸煮大豆１ｇに対して上記納豆菌の菌数が１０３個となるように納豆菌胞子懸濁液を噴霧し、よく攪拌した。これを、発泡スチロール製の容器に所定量充填し、小孔のあるポリスチレン製フィルムで被覆して蓋をした。次に、３９℃、湿度９０％で１０時間発酵処理を行った後、２０℃、５０％であら熱を取り、５℃で１日以上冷蔵して熟成させ目的とする納豆を得た。その結果、通常では１８時間から２０時間程度の発酵を要するが、混合した納豆菌を用いることで通常より短時間での納豆製造が可能であった。また、混合菌はＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌単独よりも糸引きの強い納豆を製造することが出来る。
【受託番号】
【００３０】
ＦＥＲＭ Ｐ ２２０７８
【受託番号】
【００３１】
ＦＥＲＭ Ｐ ２２０７９
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチラス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌株及びその用途に関する。特に、本明細書において「有色素大豆」と呼称する黒、茶、紅又は緑などの色大豆を用いて、食感が柔らかく、旨みや香りにおいても優れた納豆を製造することの出来る納豆菌株、納豆及びその製造方法に関わるものである。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、日本の伝統的な発酵食品で栄養価が高く食卓でも馴染み深い食品であり、蒸した大豆に納豆菌を植菌して発酵することで製造される。原料となる大豆は、黄色い大豆が一般的で、用いられる納豆菌も大手メーカーが自社開発した物を除くと、全国で大きく３種類しか存在しない。その３種類の中で全国的に利用率が高いのは、有限会社宮城野納豆製造所が販売する宮城野菌である。しかし、原料となる大豆は、黄色以外にも黒、茶、紅などの有色素大豆が存在するが、有色素大豆に対してはこれら３種類のどの納豆菌を用いても、食感が硬く、旨みに乏しく、さらには、発酵が不十分な際に生じる大豆臭さが残るなどの問題点がある。黄大豆においても、原産国、その年の気候及び品種により、皮の硬いものや旨みに欠けるものなど、既存の納豆菌では問題の残るものが存在する。黒大豆納豆を製造する方法として、例えば特許文献１に記載の手法が開示されている。しかし、蒸煮した大豆を冷凍する設備の導入が不可避であり、そのための設備投資費が掛かる他、納豆製造に新たな工程が加わるために手間が増えるといった問題がある。また、皮が硬く食感が悪いといった問題点を解決するために、例えば特許文献２や３には、セルロースやヘミセルロースを分解する能力の高い菌を用いて大豆の表皮成分を部分的に分解する方法が開示されている。しかし、これらの方法のみでは有色素大豆に対しては十分な効果が得られない。有色素大豆を十分に発酵させ、旨みや香りにおいても優れた納豆を製造する為には、従来の納豆菌よりも高いプロテアーゼ活性を有する納豆菌が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２０１４６６号公報
【特許文献２】特開２００９−３９０８０号公報
【特許文献３】特開平９−０９９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
有色素大豆、特に黒大豆は、難分解性の成分を含む表皮が厚いため、従来の納豆菌株では発酵が不十分となり、できあがった納豆は、発酵が十分でないことに起因すると思われる表皮のごぞごぞとした食感が残り硬めに仕上がる。また、旨みに乏しく大豆臭さが残るといった問題点を有している。そこで、表皮が口に残らないように柔らかく仕上がり、十分な旨みを感じ、大豆臭がなく良い発酵臭を感じる納豆を作る技術が求められている。本発明は、従来技術の問題点を解決し、従来の納豆菌株では十分な発酵が困難な有色素大豆に適用可能な新規の納豆菌株を提供するとともに、この新規な納豆菌株を用いて製造した納豆及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明の第１手段は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１株（ＦＥＲＭＰ−２２０７８）であることを特徴とする。
【０００６】
また、第２手段は、黒大豆、茶大豆、紅大豆及び緑大豆からなる群から選択される大豆を原料とする納豆を製造しうることを特徴とする第１手段に記載の納豆菌変異株であることを特徴とする。
【０００７】
また、第３手段は、第１手段に記載の納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９）とを８：２の質量比で混合してなる納豆菌株であることを特徴とする。
【０００８】
また、第４手段は、第１手段又は第２手段に記載の納豆菌変異株あるいは第３手段に記載の混合してなる納豆菌株を用いることを特徴とする納豆の製造方法である。
【０００９】
また、第５手段は、第４手段に記載の製造方法により得られる納豆であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、新規なバチラス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１；ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）が提供される。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は、納豆の製造に用いることができる。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌を、煮豆に植菌して発酵させることにより、納豆を製造することが出来る。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は高いセルラーゼ活性とプロテアーゼ活性の両方を持つ為、セルラーゼにより大豆表皮の分解が進むことで、種子にプロテアーゼがしっかり働くことが出来るという相乗効果により表皮だけでなく種子も柔らかく、さらにたんぱく質分解物であるペプチドやアミノ酸が豊富に産生されることにより旨みの強い納豆を作ることが可能になる。加えて、十分発酵が進むことで、発酵が不十分である場合に感じる大豆臭さも抑えられ、良い発酵臭の納豆製造が可能になる。こうした効果により、納豆製造に多く用いられる表皮が黄色い大豆の納豆製造に使用可能なのはもちろんのこと、従来の納豆菌で十分な発酵が難しかった有色素大豆に対しても表皮が口に残らず柔らかく仕上がり、十分な旨みを感じ、大豆臭ではない良い発酵臭を感じる納豆を製造することが可能になる。さらに、当該納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株とを混合した納豆菌株を用いることで、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌単独の場合よりも糸引きの強い納豆を製造することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】 ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌と宮城野菌のセルラーゼ活性の経時変化を示す。
【図２】 ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌と宮城野菌のプロテアーゼ活性の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の納豆菌変異株（ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）の分離、培養及び用途について詳しく説明する。
【００１３】
本発明の新規な納豆菌であるＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は、次のようにして得たものである。収穫後の稲藁１本を滅菌済みの５０ｍｌ遠心チューブに入れ、そこに滅菌水を注ぎ懸濁した。耐熱性胞子のみを選択的に得るべく、これを９５℃で５分程処理した。この懸濁液１ｍｌをＴＳＢ（トリプティックソイブロス）１０ｍｌに注ぎ、３７℃で一晩振盪培養した後、培養液を１０，０００倍希釈して１００μｌをＴＳＡ（トリプティックソイ寒天培地）平板培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した後、分離した細菌をＴＳＡ平板培地に塗布し、純化する行程を繰り返した。
【００１４】
単離した細菌株全てについて納豆を試作し、菌の被り、豆の硬さ、糸引き、糸の節などの観点から、納豆加工適性を有する細菌株を選抜した。選抜した細菌株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析の他、ＡＦＬＰ等の系統解析試験及びビオチン要求性試験を行い、その結果からバチラス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌であることを確認した。なお、納豆菌と納豆菌以外のバチラス・ズブチルスとの相違は、納豆菌がビオチン要求性を示し、かつ粘質物産出能を有するのに対し、納豆菌以外のバチラス・ズブチルスはこれらの特性を示さないことにある。
【００１５】
次に、これらの細菌株について、変異を誘発する操作を行った。枯草菌をリファンピシン含有培地で培養し、生育が見られた菌株、つまりリファンピシン耐性を獲得した菌株は、ＲＮＡポリメラーゼに変異が入り、幾つかの酵素活性が上昇するという報告がなされている。この手法を枯草菌の一種である納豆菌に応用した。具体的には次の通りである。
【００１６】
グルタミン酸ナトリウム一水和物を６ｇと、サッカロースを１２ｇと、フィトンペプトンを６ｇと、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇと、Ｎａ２ＨＰＯ４を０．６８ｇと、ＮａＣｌを０．２ｇと、ＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏを０．２ｇと、寒天を６ｇとを、逆浸透水４００ｍｌに溶かし（ＧＳＰ培地）、滅菌した後、リファンピシンを２μｇ／ｍｌの割合で添加した培地を調製した。遺伝子解析を行った菌株のうち特に納豆加工適性の高かった１株をＬＢ培地で一晩振盪培養した。培養後、２倍希釈して、調製したリファンピシン入りのＧＳＰ培地に１００μｌ塗布し、３７℃で一晩培養した。納豆の粘りに相当する粘性物質であるγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）生産能がある菌株を分離し、ＬＢ寒天培地で純化を行った。これにより、本発明のバチラス・ズブチルス イバラキ シー ワン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１；ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）を得た。この納豆菌変異株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２２０７８号の受託番号で寄託されたバチラス・ズブチルス イバラキ シー ワン株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１）である。なお、本発明の納豆菌変異株の変異前の親株については、宮城野菌などの市販納豆スターター株が必ず保有しているＩＳ４Ｂｓｕ１及びＩＳ２５６Ｂｓｕ１を保持していないことと、ＡＦＬＰ試験により市販納豆スターター株と異なることを確認した。
【００１７】
本発明のＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌と市販納豆スターター株である宮城野菌についてセルラーゼ及びプロテアーゼ活性測定を実施して比較した。まず、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌及び宮城野菌をＬＢ培地にて３７℃で一晩振盪培養した。１００ｍｌのＬＢ培地を注いだ３００ｍｌのバッフル付フラスコに培養液１ｍｌを注いだ。この培養液を培養中のある一定時間毎に採取し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を取得し、この培養上清を酵素液として活性の測定を行った。
【００１８】
セルラーゼ活性測定法は、次の通りである。基質として１％のＡｚｏ−ＣＭＣ溶液（ＰＨ６）を用いた。反応容器は１．５ｍｌのエッペンチューブを用いた。基質溶液１００μｌに酵素液（培養上清）を１００μｌ添加し、手早く混ぜ、サンプル用チューブを５０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、９９．５％エタノールを１０００μｌ添加し、反応を停止させた。これを１０分間室温放置後、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を取得した。Ａｚｏ−ＣＭＣの分解度合いを５９０ｎｍの吸光度を測定することで実施し、セルラーゼ活性を評価した。なお、基質溶液と酵素液を混合後、直ちにエタノールを添加したものをバックグラウンドとした。
【００１９】
その結果を図１及び表１に示す。表１によると、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は宮城野菌に比べて、酵素活性の立ち上がり、つまり吸光度（５９０ｎｍ）が０．０５を超えてくるのが３時間ほど早いことが確認できた。また、図１によりＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の酵素活性がピークに達しつつある培養９時間前後数時間においてＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の方が最大１５％以上高い数値を示す時間帯が存在することが確認された。このことから、発酵完了までにより多くの表皮成分を分解できるため、皮を柔らかく仕上げることが出来る。また、表皮成分が分解されることで、後述のプロテアーゼなどの酵素も働きやすくなり、発酵の進行も容易になると期待できる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
プロテアーゼ活性測定法は、次の通りである。基質として０．５％％アゾカゼイン（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８））を用いた。反応容器は１．５ｍｌのエッペンチューブを用いた。基質溶液５００μｌに酵素液（培養上清）１００μｌを添加し、手早く混ぜ、サンプル用チューブを３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、１５％ＴＣＡを４００μｌ添加し、反応を停止させた。これを１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清９００μｌを新たなエッペンチューブに分注し、ここに１０Ｍ ＮａＯＨを４５μｌ添加した。アゾカゼインの分解の度合いを４４０ｎｍの吸光度を測定することで実施し、プロテアーゼ活性を評価した。なお、基質溶液と酵素液を混合後、直ちに１５％ＴＣＡを添加したものをバックグラウンドとした。
【００２２】
その結果を図２に示す。ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌は、プロテアーゼ活性の立ち上がり直後から宮城野菌に比べて、１．５倍以上の数値を示すだけでなく、発酵に重要な発酵開始後１８時間頃までの時間帯において、常に２倍強の活性を示すことが確認された。この結果から、より多くのたんぱく質が分解されることで、豆そのものも柔らかく仕上がると共に、ペプチドやアミノ酸が多く生じてくることでより旨みのある納豆ができる。
【００２３】
本発明の納豆菌（ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌）及び市販納豆スターター株である宮城野菌を用い、以下に示すようにして黒大豆納豆を試作した。最初に、黒大豆を３倍量の水（２０℃）に１６時間浸漬した後、よく水を切り、０．１８ＭＰａの条件で３０分間蒸煮した。次に、蒸煮大豆１ｇに対して上記納豆菌の菌数が１０３個となるように納豆菌胞子懸濁液を噴霧し、よく攪拌した。これを、発泡スチロール製の容器に所定量充填し、小孔のあるポリスチレン製フィルムで被覆して蓋をした。次に、３９℃，湿度９０％で１８時間発酵処理を行った後、２０℃，５０％であら熱を取り、５℃で１日以上冷蔵して熟成させ、目的とする納豆を得た。
【００２４】
このようにして得られた納豆について、硬度評価及び官能試験を行った。なお、上記硬度評価及び官能試験は、下記に示す方法により行った。
【００２５】
（１）納豆の硬さの評価試験
納豆の硬さの評価試験は、「納豆試験法」（納豆試験研究会編、光琳社、平成２年３月８日発行）に記載の方法により行った。すなわち、上皿時計秤上に、納豆をのせ、試験用アダプター（縦２ｃｍ横２ｃｍ、厚み２ｍｍで先３ｍｍ付近から細くなり、納豆との接触面は厚みが１ｍｍ）にて大豆の単軸方向に切断し、切断時の重量（ｇ）を切断強度とした。なお、この切断強度試験は、納豆５０粒について行い、その平均値を表２に示した。このことから、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌を用いた方が切断強度が小さく、セルラーゼやプロテアーゼの効果により納豆が柔らかく仕上がったことが確認された。
【００２６】
【表２】
【００２７】
（２）官能試験
年齢・性別も様々な２６名により２種類の納豆について比較評価を実施した。その結果を表３に示す。検査した全ての項目でＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の方が良いという評価が宮城野菌を上回り、本発明のＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌を用いることで、表皮が口に残らず柔らかく仕上がり、十分な旨みを感じ、大豆臭ではなく良い発酵臭を感じる納豆を作ることが可能になった。
【００２８】
【表３】
【実施例１】
【００２９】
ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌およびＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌の変異前の親株であるＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９号の受託番号で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されたバチラス・ズブチルス イバラキ ピー ワン株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１；ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１菌）を用い、以下に示すようにして納豆を製造した。すなわち、まず、黄大豆を３倍量の水（２０℃）で１６時間浸漬した後、よく水を切り、０．１８ＭＰａの条件で３０分間蒸煮した。次に、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌８０％に対し、ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１菌２０％で混合し、蒸煮大豆１ｇに対して上記納豆菌の菌数が１０３個となるように納豆菌胞子懸濁液を噴霧し、よく攪拌した。これを、発泡スチロール製の容器に所定量充填し、小孔のあるポリスチレン製フィルムで被覆して蓋をした。次に、３９℃、湿度９０％で１０時間発酵処理を行った後、２０℃、５０％であら熱を取り、５℃で１日以上冷蔵して熟成させ目的とする納豆を得た。その結果、通常では１８時間から２０時間程度の発酵を要するが、混合した納豆菌を用いることで通常より短時間での納豆製造が可能であった。また、混合菌はＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１菌単独よりも糸引きの強い納豆を製造することが出来る。
【受託番号】
【００３０】
ＦＥＲＭ Ｐ ２２０７８
【受託番号】
【００３１】
ＦＥＲＭ Ｐ ２２０７９
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７８）。
【請求項２】
黒大豆、茶大豆、紅大豆及び緑大豆からなる群から選択される大豆を原料とする納豆を製造しうることを特徴とする請求項１に記載の納豆菌変異株。
【請求項３】
請求項１に記載の納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９）とを８：２の質量比で混合してなる納豆菌株。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の納豆菌変異株あるいは請求項３に記載の混合してなる納豆菌株を用いることを特徴とする納豆の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の製造方法により得られる納豆。
【請求項１】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌変異株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｃ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７８）。
【請求項２】
黒大豆、茶大豆、紅大豆及び緑大豆からなる群から選択される大豆を原料とする納豆を製造しうることを特徴とする請求項１に記載の納豆菌変異株。
【請求項３】
請求項１に記載の納豆菌株とバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌株ＩＢＡＲＡＫＩ Ｐ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０７９）とを８：２の質量比で混合してなる納豆菌株。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の納豆菌変異株あるいは請求項３に記載の混合してなる納豆菌株を用いることを特徴とする納豆の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の製造方法により得られる納豆。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−２２３１７３（Ｐ２０１２−２２３１７３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０５６８９（Ｐ２０１１−１０５６８９）
【出願日】平成２３年４月１９日（２０１１．４．１９）
【出願人】（５９１１０６４６２）茨城県 (45)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１９日（２０１１．４．１９）
【出願人】（５９１１０６４６２）茨城県 (45)
【Ｆターム（参考）】
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