細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法
【課題】 マイクロ流路内での細胞カップリングを簡便かつ正確に行うことができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を提供する。
【解決手段】
搬送媒体とともに卵子１３及びドナー細胞１５を搬送する前段流路１２と、前段流路１２に連続する後段流路１６と、後段流路１６に交流電界を生じさせるための電極対１９と、後段流路１６に設けられた誘電体３１、３２の間隙からなり交流電界の作用により生成する電界により卵子１３を捕捉するための捕捉ギャップ３３と、後段流路１６の上流側に接続され搬送媒体の供給により後段流路１６内に二層流を生じさせて卵子１３及びドナー細胞１５を捕捉ギャップ３３に近接して流動させる媒体注入路１８とを設ける。捕捉ギャップ３３の裏面側には、搬送媒体を吸引して卵子１３を捕捉ギャップ３３に捕捉するための吸引路１７を設ける。
【解決手段】
搬送媒体とともに卵子１３及びドナー細胞１５を搬送する前段流路１２と、前段流路１２に連続する後段流路１６と、後段流路１６に交流電界を生じさせるための電極対１９と、後段流路１６に設けられた誘電体３１、３２の間隙からなり交流電界の作用により生成する電界により卵子１３を捕捉するための捕捉ギャップ３３と、後段流路１６の上流側に接続され搬送媒体の供給により後段流路１６内に二層流を生じさせて卵子１３及びドナー細胞１５を捕捉ギャップ３３に近接して流動させる媒体注入路１８とを設ける。捕捉ギャップ３３の裏面側には、搬送媒体を吸引して卵子１３を捕捉ギャップ３３に捕捉するための吸引路１７を設ける。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関し、更に詳細には、クローン胚の作出、細胞融合などに際して、簡便にしかも確実に細胞同士をカップリングさせることができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学の分野を中心に微小流路をガラス基板やプラスチック基板に形成し、その微小閉空間内で化学反応を起こすマイクロ（化学）チップが開発されている。特にＤＮＡのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法の応用として、従来技術と比較し数倍〜十数倍の高速分離検出を可能とした多くの製品開発がされている（例えば、非特許文献１参照。）。現在その応用先は生化学反応を中心とした分野であり、細胞の分離や加工などの操作における細胞単体の個別搬送、個別加工などの技術は確立されていない。
【０００３】
ところで、クローン技術の確立は今後の医療・化学産業を革新的に変化させると期待される技術である。ファンクショナルジェノミクスの分野では、遺伝子の影響を調べるために特定の遺伝子を持ったマウス（ＫＯマウス）を作成し、様々な創薬や治療の研究に使われている。ＫＯマウスの作成方法では、主として、ＥＳ細胞からキメラマウスを作り、その子孫からＫＯマウスを作成する方法が採られているが、安定したクローン技術により、ＥＳ細胞から直接クローン技術でＫＯマウスを作る方法や、体細胞で遺伝子をノックアウトしてクローンマウスを作る方法が有用となってくる。特に、ＥＳ細胞が樹立されていない動物種やマウスの系統では、体細胞からのクローン体の作成は非常に有効である。一方、現状のクローニングにおける核移植作業は、移植工程中に多くの手作業が含まれており（例えば、非特許文献２参照。）、研究の効率化、妥当な評価の障害になっている。例えば、移植後の卵細胞に対し、添加薬品の効果を比較する場合、手作業による卵子の損傷のばらつきが大きいと、薬品の効果を正確に評価することができない。
【０００４】
このように自動化による研究の省力化と実験条件の安定化はファンクショナルジェノミクスの技術発展に必要不可欠であり、また、今後の産業化を考慮する上でも作業の自動化は重要であることに鑑み、種々の検討が行われている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００６−３２５４２９号公報
【非特許文献１】ANDREW J.DEMELLO, “Microfluidics: DNA amplification moves on”, Nature 422, 28-29 (06March 2003); doi:10.1038/422028a.
【非特許文献２】T. WAKAYAMA,A. C. F. PERRY, M. ZUCCOTTI, K. R. JOHNSON, R. YANAGIMACHI, “Full-termdevelopment of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei”,Nature 394, 369-374 (23 July 1998); doi:10.1038/28615.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、マイクロ流路内での細胞カップリングを簡便かつ正確に行うことができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞カップリングモジュールは、マイクロ流路内の搬送媒体中において複数の細胞のカップリングを行う細胞カップリングモジュールであって、前記搬送媒体とともに前記細胞を搬送する前段流路と、該前段流路に連続する後段流路と、該後段流路に交流電界を生じさせるための電極対と、該後段流路に設けられた誘電体の間隙からなり、前記交流電界の作用により生成する電界により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、前記後段流路の上流側に接続され、搬送媒体の注入により前記後段流路内に二層流を生じさせて前記細胞を前記捕捉ギャップに近接して流動させる媒体注入路とを備えたことを特徴とする。
【０００７】
本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、後段流路内の細胞の搬送媒体中に電極対を用いて交流電界を生じさせ、その交流電界中には誘電体の間隙からなる捕捉ギャップが設けられている。捕捉ギャップには電場集中による電場勾配が生じ、その近傍を通過する細胞は、その電場勾配の方向に誘電泳動力を受けて捕捉ギャップに捕捉されることになる。ここで、誘電泳動力は（電場）2の勾配に比例するため、捕捉ギャップからの距離の増大に伴って著しく小さくなる。そのため、後段流路の幅が広く細胞が捕捉ギャップから遠い場所を通過する場合には、十分な大きさの誘電泳動力が細胞に作用せず、細胞を捕捉できない可能性がある。このような場合、捕捉ギャップからの距離に応じて電極対間の印加電圧を高くする必要があるが、強い電場による細胞損傷の虞があり、また、誘電泳動力以外の力又は流れが発生したり、機器の高出力化によるの影響が懸念される。本発明では、この点に鑑み、細胞が捕捉ギャップ近傍を通過するように、前段流路内に二層流を生じさせて細胞を捕捉ギャップに近づけるための媒体注入路が前段流路に接続されている。
【０００８】
更に、本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、捕捉ギャップに細胞が捕捉されると、捕捉ギャップにおける電場分布は変化し、捕捉された細胞の表面を頂点とする電場勾配が新たに生じることとなる。そして、捕捉された細胞の近傍を更に他の細胞が通過すれば、その細胞にも上記新たな電場勾配により誘電泳動力が作用し、先に捕捉されている細胞に付着することとなる。このようにして、細胞のカップリングが成立する。
【０００９】
本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、前記後段流路における前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を吸引して前記細胞を捕捉ギャップに捕捉するための吸引路を更に備えていてもよい。この吸引路を設けたことにより、確実に細胞を捕捉ギャップに捕らえることができる。
【００１０】
ここで、前記後段流路における前記捕捉ギャップは、前記後段流路の流れを妨げないように、前記後段流路の延設方向に平行に開口するように設けられていることが好ましい。
【００１１】
本発明の細胞カップリングモジュールは、前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である場合に好適に使用することができる。
【００１２】
本発明の細胞カップリング装置は、上記の細胞カップリングモジュールと、前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプとを備えたことを特徴とする。
【００１３】
更に、本発明の細胞カップリング装置は、前記吸引路から前記搬送媒体を吸引する吸引ポンプを備えていてもよい。
【００１４】
加えて、前記後段流路における画像を撮像する画像センサと、該画像センサで撮像された画像に基づいて、前記第１の送液ポンプ及び前記第２の送液ポンプによる送液をコントロールするコントローラとを設けてもよく、このコントローラにより、前記吸引ポンプによる搬送媒体の吸引をコントロールしてもよい。
【００１５】
本発明の細胞カップリング方法は、上記の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界により前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、前記電極対による交流電界の発生を止めることにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送することを特徴とする。
【００１６】
また、前記細胞を捕捉するための吸引路を備えた細胞カップリングモジュールの場合には、前記交流電界の作用により生成する電界と、前記媒体注入路からの搬送媒体の送出により生ずる二層流と、前記吸引路からの前記前記搬送媒体の吸引とにより前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、前記電極対による交流電界の発生を止めるとともに、前記吸引路からの前記前記搬送媒体を送出することにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送するように構成することもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を使用すれば、交流電界に置かれた誘電体からなる捕捉ギャップに形成された電界と二層流との作用により、細胞を確実に捕捉ギャップに捕捉することができる。また、捕捉ギャップから搬送媒体を吸引する吸引路を備えた構成では、更に確実に細胞を捕捉ギャップに捕捉することが可能となる。
【００１８】
これにより、細胞を機械的に把持するような機構は不要となる。また、細胞の捕捉により後段流路で搬送媒体の流れが変化しても後段流路は十分な幅を有しているので、捕捉された細胞が搬送媒体の圧力によって離脱することもなく、搬送媒体の流速を細かく制御する必要もない。そのため、マイクロ流路の製造が容易となり、付随する装置も簡略化することができる。
【００１９】
また、細胞のサイズや硬さのばらつきがあっても、種々の細胞を捕捉ギャップに捕捉することが可能となり、細胞の捕捉による搬送媒体の流量の乱れに対しても安定して細胞を保持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本実施形態では、卵子からクローン胚を作出する際の操作を例として説明する。クローン胚の作出に際しては、卵子の透明帯が除去された後、卵子が二分割され、分割されたうちの無核卵子（核の無い方）にドナー細胞がカップリングされる。ここで、本明細書におけるカップリングとは、例えば電気融合において電圧を印加する前において、融合すべき細胞同士を接着した状態にすることを言う。
【００２１】
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。本実施形態の細胞カップリング装置は、マイクロ流路１１を形成したＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）からなる細胞カップリングモジュール１０と、ＺＦＭ（Zimmerman's fusion medium）などの搬送媒体をマイクロ流路１１内に送出する卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３と、マイクロ流路１１から搬送媒体を吸引する吸引ポンプ２５と、卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３の送液量（速度）並びに吸引ポンプ２５の吸引量を制御するコントローラ２４と、マイクロ流路１１の画像を撮像する画像センサ２８と、マイクロ流路１１の画像の監視と装置全体の運転状況を表示及び監視するためのモニタ２６とを備えている。
【００２２】
本実施形態における細胞カップリングモジュール１０の詳細を図２に示す。また、図２におけるＡ部の拡大平面図を図３に示す。図２及び図３に示すように、マイクロ流路１１は、無核卵子１３を搬送媒体とともに搬送する前段流路１２と、前段流路１２に続く幅の広くなった後段流路１６とを有しており、この後段流路１６は、図２に示すように、相対する電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９と、この電極対１９の延長上に設けられたＰＤＭＳとによって形成されている。電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９は、後段流路１６に交流電界を生じさせるために設けられている。また、マイクロ流路１１は、前段流路１２と後段流路１６との接続部分近傍に接続された媒体注入路１８と、卵子にカップリングするためのドナー細胞を搬送媒体とともに搬送するドナー搬送流路１４と、後述する捕捉ギャップ３３に連なる吸引路１７とを有している。本実施形態では、図３に示すように、前段流路１２の幅Ｗ1＝１２０μｍ、媒体注入路１８の幅Ｗ2＝５０μｍ、後段流路１６の幅Ｗ3＝４００μｍ、吸引路１７の幅Ｗ5＝１００μｍである。図２に示すように、前段流路１２、ドナー搬送流路１４及び媒体注入路１８の端部には、搬送媒体の流量を急激な変動を抑制するための緩衝部１２ａ,１４ａ,１８ａがそれぞれ設けられている。また、吸引路１７及び後段流路１６の端部にも、搬送媒体を吸引するための緩衝部１７ａ,１６ａがそれぞれ設けられている。
【００２３】
更に、本実施形態の細胞カップリングモジュールでは、後段流路１６の前段流路１２との接続部側にＰＤＭＳからなる突起部３１と、島状部３２とが設けられており、この突起部３１と島状部３２との間に、卵子等の細胞を捕捉するための捕捉ギャップ３３が形成されている。捕捉ギャップ３３は後段流路１６の延設方向、即ち搬送媒体の流れの方向に沿って開口するように設けられており、捕捉ギャップ３３の裏面側には、前述の吸引路１７が接続されている。
【００２４】
本実施形態では、捕捉ギャップ３３の開口部の幅ｄ＝４０μｍであり、突起部３１の幅Ｄ1＝１００μｍ、長さＬ1＝５００μｍ、島状部３２の長さＬ2＝４００μｍ、幅Ｄ2＝２００μｍである。ここで、捕捉ギャップ３３の開口部の幅ｄは、捕捉すべき卵子１３の直径より小さく、卵子１３の直径の２分の１程度が好ましい。また、後段流路１６の突起部３１及び島状部３２が形成されている部分での流路の幅Ｗ4＝２００μｍである。この幅Ｗ4は、卵子１３の直径の２〜３倍程度が好ましい。更に、本実施形態では、媒体注入路１８の前段流路１２への接続部から捕捉ギャップ３３までの距離Ｌ3＝７００μｍである。この距離Ｌ3は、後述する二層流により卵子１３が捕捉ギャップ３３に最も近接するように決められるが、卵子１３が捕捉ギャップ３３に捕捉されるために十分な距離であればよい。
【００２５】
本実施形態におけるマイクロ流路１１は、以下のようにして作成される。まず、基板上にリソグラフィー用の光硬化剤（レジスト）の塗膜を形成し、次に、フォトマスクを用いてマイクロ流路１１の形状の部分に光照射して硬化させる。更に、未照射の部分を除去することにより、マイクロ流路１１の形状の凸状パターンを基板上に形成する。次に、このパターンを覆って基板上にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を塗布し、これを硬化させた後に基板から取り外することにより、凹状のマイクロ流路１１が形成された細胞カップリングモジュール１０が得られる。このようにして作成したマイクロ流路１１の断面形状はほぼ矩形であり、その深さは、本実施形態では１２０μｍとなっている。
【００２６】
以上の構成を有する装置における細胞カップリング方法について説明する。まず、卵子用送液ポンプ２０及び／又はドナー用送液ポンプ２２と、注入用送液ポンプ２３から搬送媒体を送出し、マイクロ流路１１のすべてを搬送媒体で満たす。
【００２７】
次に、電極１９ａ及び電極１９ｂの間に交流電圧を印加し、後段流路１６内に交流電界を生じさせる。後段流路１６に何も存在しなければ、交流電圧の印加により後段流路１６には一様な交流電界が形成されるが、後段流路１６内には誘電体（ＰＤＭＳ）からなる突起部３１及び島状部３２が形成されているため、突起部３１及び島状部３２の間の捕捉ギャップ３３近傍では電界は一様とはならない。図５は、後段流路１６内における捕捉ギャップ３３近傍に形成される電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、１ＭＨｚ，１Ｖｒｍｓとした。同図に示すように、生成する電界は捕捉ギャップ３３近傍では一様とならず、電場勾配を生じている。このような電場勾配が生じている捕捉ギャップ３３の近傍を卵子１３が通過すると、卵子１３は誘電泳動力により捕捉ギャップ３３に捕捉されることとなる。なお、卵子などの誘電体が電場勾配から何れの方向に誘電泳動力を受けるかは、誘電体の誘電率、交流の周波数などの条件によって決まることが知られている。本実施形態では、卵子１３が捕捉ギャップ３３に引かれるような条件に設定されている。
【００２８】
このような電界が形成された後、マイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて卵子１３が緩衝部１２ａから前段流路１２に導入される。なお、卵子１３及び後述するドナー細胞１５は、接着性を高めるために予めＰＨＡ（Phytohemagglutinin）で処理してある。次に、前段流路１２に卵子用送液ポンプ２０及び／又はドナー用送液ポンプ２２から搬送媒体が送出されるとともに、媒体注入路１８にも搬送媒体が送出される。前段流路１２における搬送媒体の流量は、０．０５〜０．２μｌ／分である。また、媒体注入路１８には、前段流路１２における搬送媒体の２〜３倍の量の搬送媒体が送出される。卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３からの搬送媒体の送出量は、画像センサ２８からの後段流路１６の画像に基づいてコントローラ２４により制御されている。
【００２９】
上述のように、後段流路１６では、前段流路１２からの搬送媒体と、媒体注入路１８からの搬送媒体とが合流することになる。このように２つの流れが合流すると、その合流地点から下流には二層流が形成されることが知られている。即ち、図３の破線３４に示すように、前段流路１２からの搬送媒体の流れは媒体注入路１８が接続されている側とは反対側に押しやられ、前段流路１２からの搬送媒体と媒体注入路１８からの搬送媒体との間に境界面が生じることとなる。この境界面は消滅せずに後段流路１６の下流まで移動し、少なくとも捕捉ギャップ３３の位置まで維持される。その結果、前段流路１２内を搬送媒体とともに搬送されてきた卵子１３は、後段流路１６内で媒体注入路１８からの搬送媒体によって突起部３１及び島状部３２の側に押しやられることとなる。そして、上述のように捕捉ギャップ３３には電場勾配が形成されているため、卵子１３は捕捉ギャップ３３に容易に捕捉されることとなる。また、本実施形態では、捕捉ギャップ３３の裏面側には吸引路１７が形成されているので、この吸引路１７からの搬送媒体の吸引により、卵子１３を捕捉ギャップ３３に更に容易に捕捉することが可能となっている。
【００３０】
次に、ドナー細胞１５がマイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて緩衝部１４ａからドナー搬送流路１４に導入される。ドナー細胞１５も前段流路１２に誘導され、更に後段流路１６に到達する。後段流路１６では、ドナー細胞１５も卵子１３と同様に二層流の影響を受けて、突起部３１及び島状部３２の側に押しやられて下流へと移動する。
【００３１】
後段流路１６には前述と同様に交流電界が生じているが、捕捉ギャップ３３には前述のように既に卵子１３が捕捉されているので、図５とは異なる電界が生じている。図６は捕捉ギャップ３３に卵子１３が捕捉されている場合の電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、前述と同様に１ＭＨｚ，１Ｖｒｍｓである。卵子１３が捕捉されている場合、同図に示すように、捕捉された卵子１３を頂点とする電場勾配が新たに生じていることがわかる。このような電場勾配が生じている卵子１３の近傍をドナー細胞１５が通過すると、図４に示すように、その電場勾配によりドナー細胞１５は卵子１３にカップリングされることとなる。
【００３２】
次に、電極１９ａ及び電極１９ｂへの交流電圧の印加を止め、更に必要に応じて吸引路１７から搬送媒体を送出することにより、カップリングした卵子１３及びドナー細胞１５は捕捉ギャップ３３から離れて後段流路１６を流動して緩衝部１６ａ（図２）で回収されることとなる。
【００３３】
本実施形態の細胞カップリングモジュールを使用すれば、交流電界に置かれた誘電体の間の捕捉ギャップ３３に形成された電界と二層流との作用により、卵子１３を確実に捕捉ギャップ３３に捕捉するとともに、ドナー細胞１５を卵子１３にカップリングさせることができる。また、捕捉ギャップ３３から搬送媒体を吸引する吸引路１７を備えているので、更に確実に卵子１３を捕捉ギャップ３３に捕捉することが可能となる。
【００３４】
また、卵子１３の捕捉により後段流路１６において搬送媒体の流れが変化しても、後段流路１６は十分な幅を有しているので卵子１３が離脱することはなく、搬送媒体の流速を細かく制御する必要もない。
【００３５】
また、卵子１３のサイズや硬さのばらつきがあっても、種々の卵子１３を捕捉ギャップに保持することが可能となり、卵子１３の捕捉による搬送媒体の流量の乱れに対しても安定して卵子１３を保持することができ、ドナー細胞１５の卵子１３への接触も確実に行うことが可能となる。
【００３６】
なお、上記ではドナー搬送流路１４からドナー細胞１５を供給したが、ドナー搬送流路１４を設けることなく、前段流路１２からドナー細胞１５を供給するように構成してもよい。
【００３７】
また、上記で説明した実施形態では、第１の細胞が分割した卵子であり、第２の細胞がドナー細胞である場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、２つの細胞をカップリングする操作について適用することができる。その場合、第１の細胞及び第２の細胞の大きさに応じて、前段流路１２、ドナー搬送流路１４、媒体注入路１８、後段流路１６、捕捉ギャップ３３等の大きさや幅を変更する必要があることは言うまでもない。
【００３８】
更に、本実施形態では、マイクロ流路１１の断面形状が矩形の場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、断面が矩形以外の例えば円形であっても差し支えない。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法は、細胞融合、クローン家畜生産などに有用なので、バイオ産業、畜産業などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る細胞カップリングモジュールの詳細平面図である。
【図３】図２におけるＡ部の拡大平面図である。
【図４】捕捉ギャップに捕捉された卵子にドナー細胞がカップリングされた様子を示す平面図である。
【図５】後段流路内における捕捉ギャップ近傍に形成される電界を解析により求めた平面図である。
【図６】後段流路内に卵子が捕捉されている場合における捕捉ギャップ近傍に形成される電界を解析により求めた平面図である。
【符号の説明】
【００４１】
１０ 細胞カップリングモジュール
１１ マイクロ流路
１２ 前段流路
１２ａ 緩衝部
１３ 卵子
１４ ドナー搬送流路
１４ａ 緩衝部
１５ ドナー細胞
１６ 後段流路
１６ａ 緩衝部
１７ 吸引路
１７ａ 緩衝部
１８ 媒体注入路
１８ａ 緩衝部
１９ 電極対
１９ａ 電極
１９ｂ 電極
２０ 卵子用送液ポンプ
２２ ドナー用送液ポンプ
２３ 注入用送液ポンプ
２４ コントローラ
２５ 吸引ポンプ
２６ モニタ
２８ 画像センサ
３１ 突起部
３２ 島状部
３３ 捕捉ギャップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関し、更に詳細には、クローン胚の作出、細胞融合などに際して、簡便にしかも確実に細胞同士をカップリングさせることができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学の分野を中心に微小流路をガラス基板やプラスチック基板に形成し、その微小閉空間内で化学反応を起こすマイクロ（化学）チップが開発されている。特にＤＮＡのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法の応用として、従来技術と比較し数倍〜十数倍の高速分離検出を可能とした多くの製品開発がされている（例えば、非特許文献１参照。）。現在その応用先は生化学反応を中心とした分野であり、細胞の分離や加工などの操作における細胞単体の個別搬送、個別加工などの技術は確立されていない。
【０００３】
ところで、クローン技術の確立は今後の医療・化学産業を革新的に変化させると期待される技術である。ファンクショナルジェノミクスの分野では、遺伝子の影響を調べるために特定の遺伝子を持ったマウス（ＫＯマウス）を作成し、様々な創薬や治療の研究に使われている。ＫＯマウスの作成方法では、主として、ＥＳ細胞からキメラマウスを作り、その子孫からＫＯマウスを作成する方法が採られているが、安定したクローン技術により、ＥＳ細胞から直接クローン技術でＫＯマウスを作る方法や、体細胞で遺伝子をノックアウトしてクローンマウスを作る方法が有用となってくる。特に、ＥＳ細胞が樹立されていない動物種やマウスの系統では、体細胞からのクローン体の作成は非常に有効である。一方、現状のクローニングにおける核移植作業は、移植工程中に多くの手作業が含まれており（例えば、非特許文献２参照。）、研究の効率化、妥当な評価の障害になっている。例えば、移植後の卵細胞に対し、添加薬品の効果を比較する場合、手作業による卵子の損傷のばらつきが大きいと、薬品の効果を正確に評価することができない。
【０００４】
このように自動化による研究の省力化と実験条件の安定化はファンクショナルジェノミクスの技術発展に必要不可欠であり、また、今後の産業化を考慮する上でも作業の自動化は重要であることに鑑み、種々の検討が行われている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００６−３２５４２９号公報
【非特許文献１】ANDREW J.DEMELLO, “Microfluidics: DNA amplification moves on”, Nature 422, 28-29 (06March 2003); doi:10.1038/422028a.
【非特許文献２】T. WAKAYAMA,A. C. F. PERRY, M. ZUCCOTTI, K. R. JOHNSON, R. YANAGIMACHI, “Full-termdevelopment of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei”,Nature 394, 369-374 (23 July 1998); doi:10.1038/28615.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、マイクロ流路内での細胞カップリングを簡便かつ正確に行うことができる細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞カップリングモジュールは、マイクロ流路内の搬送媒体中において複数の細胞のカップリングを行う細胞カップリングモジュールであって、前記搬送媒体とともに前記細胞を搬送する前段流路と、該前段流路に連続する後段流路と、該後段流路に交流電界を生じさせるための電極対と、該後段流路に設けられた誘電体の間隙からなり、前記交流電界の作用により生成する電界により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、前記後段流路の上流側に接続され、搬送媒体の注入により前記後段流路内に二層流を生じさせて前記細胞を前記捕捉ギャップに近接して流動させる媒体注入路とを備えたことを特徴とする。
【０００７】
本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、後段流路内の細胞の搬送媒体中に電極対を用いて交流電界を生じさせ、その交流電界中には誘電体の間隙からなる捕捉ギャップが設けられている。捕捉ギャップには電場集中による電場勾配が生じ、その近傍を通過する細胞は、その電場勾配の方向に誘電泳動力を受けて捕捉ギャップに捕捉されることになる。ここで、誘電泳動力は（電場）2の勾配に比例するため、捕捉ギャップからの距離の増大に伴って著しく小さくなる。そのため、後段流路の幅が広く細胞が捕捉ギャップから遠い場所を通過する場合には、十分な大きさの誘電泳動力が細胞に作用せず、細胞を捕捉できない可能性がある。このような場合、捕捉ギャップからの距離に応じて電極対間の印加電圧を高くする必要があるが、強い電場による細胞損傷の虞があり、また、誘電泳動力以外の力又は流れが発生したり、機器の高出力化によるの影響が懸念される。本発明では、この点に鑑み、細胞が捕捉ギャップ近傍を通過するように、前段流路内に二層流を生じさせて細胞を捕捉ギャップに近づけるための媒体注入路が前段流路に接続されている。
【０００８】
更に、本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、捕捉ギャップに細胞が捕捉されると、捕捉ギャップにおける電場分布は変化し、捕捉された細胞の表面を頂点とする電場勾配が新たに生じることとなる。そして、捕捉された細胞の近傍を更に他の細胞が通過すれば、その細胞にも上記新たな電場勾配により誘電泳動力が作用し、先に捕捉されている細胞に付着することとなる。このようにして、細胞のカップリングが成立する。
【０００９】
本発明の細胞カップリングモジュールにおいては、前記後段流路における前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を吸引して前記細胞を捕捉ギャップに捕捉するための吸引路を更に備えていてもよい。この吸引路を設けたことにより、確実に細胞を捕捉ギャップに捕らえることができる。
【００１０】
ここで、前記後段流路における前記捕捉ギャップは、前記後段流路の流れを妨げないように、前記後段流路の延設方向に平行に開口するように設けられていることが好ましい。
【００１１】
本発明の細胞カップリングモジュールは、前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である場合に好適に使用することができる。
【００１２】
本発明の細胞カップリング装置は、上記の細胞カップリングモジュールと、前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプとを備えたことを特徴とする。
【００１３】
更に、本発明の細胞カップリング装置は、前記吸引路から前記搬送媒体を吸引する吸引ポンプを備えていてもよい。
【００１４】
加えて、前記後段流路における画像を撮像する画像センサと、該画像センサで撮像された画像に基づいて、前記第１の送液ポンプ及び前記第２の送液ポンプによる送液をコントロールするコントローラとを設けてもよく、このコントローラにより、前記吸引ポンプによる搬送媒体の吸引をコントロールしてもよい。
【００１５】
本発明の細胞カップリング方法は、上記の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界により前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、前記電極対による交流電界の発生を止めることにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送することを特徴とする。
【００１６】
また、前記細胞を捕捉するための吸引路を備えた細胞カップリングモジュールの場合には、前記交流電界の作用により生成する電界と、前記媒体注入路からの搬送媒体の送出により生ずる二層流と、前記吸引路からの前記前記搬送媒体の吸引とにより前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、前記電極対による交流電界の発生を止めるとともに、前記吸引路からの前記前記搬送媒体を送出することにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送するように構成することもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法を使用すれば、交流電界に置かれた誘電体からなる捕捉ギャップに形成された電界と二層流との作用により、細胞を確実に捕捉ギャップに捕捉することができる。また、捕捉ギャップから搬送媒体を吸引する吸引路を備えた構成では、更に確実に細胞を捕捉ギャップに捕捉することが可能となる。
【００１８】
これにより、細胞を機械的に把持するような機構は不要となる。また、細胞の捕捉により後段流路で搬送媒体の流れが変化しても後段流路は十分な幅を有しているので、捕捉された細胞が搬送媒体の圧力によって離脱することもなく、搬送媒体の流速を細かく制御する必要もない。そのため、マイクロ流路の製造が容易となり、付随する装置も簡略化することができる。
【００１９】
また、細胞のサイズや硬さのばらつきがあっても、種々の細胞を捕捉ギャップに捕捉することが可能となり、細胞の捕捉による搬送媒体の流量の乱れに対しても安定して細胞を保持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本実施形態では、卵子からクローン胚を作出する際の操作を例として説明する。クローン胚の作出に際しては、卵子の透明帯が除去された後、卵子が二分割され、分割されたうちの無核卵子（核の無い方）にドナー細胞がカップリングされる。ここで、本明細書におけるカップリングとは、例えば電気融合において電圧を印加する前において、融合すべき細胞同士を接着した状態にすることを言う。
【００２１】
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。本実施形態の細胞カップリング装置は、マイクロ流路１１を形成したＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）からなる細胞カップリングモジュール１０と、ＺＦＭ（Zimmerman's fusion medium）などの搬送媒体をマイクロ流路１１内に送出する卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３と、マイクロ流路１１から搬送媒体を吸引する吸引ポンプ２５と、卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３の送液量（速度）並びに吸引ポンプ２５の吸引量を制御するコントローラ２４と、マイクロ流路１１の画像を撮像する画像センサ２８と、マイクロ流路１１の画像の監視と装置全体の運転状況を表示及び監視するためのモニタ２６とを備えている。
【００２２】
本実施形態における細胞カップリングモジュール１０の詳細を図２に示す。また、図２におけるＡ部の拡大平面図を図３に示す。図２及び図３に示すように、マイクロ流路１１は、無核卵子１３を搬送媒体とともに搬送する前段流路１２と、前段流路１２に続く幅の広くなった後段流路１６とを有しており、この後段流路１６は、図２に示すように、相対する電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９と、この電極対１９の延長上に設けられたＰＤＭＳとによって形成されている。電極１９ａ及び電極１９ｂからなる電極対１９は、後段流路１６に交流電界を生じさせるために設けられている。また、マイクロ流路１１は、前段流路１２と後段流路１６との接続部分近傍に接続された媒体注入路１８と、卵子にカップリングするためのドナー細胞を搬送媒体とともに搬送するドナー搬送流路１４と、後述する捕捉ギャップ３３に連なる吸引路１７とを有している。本実施形態では、図３に示すように、前段流路１２の幅Ｗ1＝１２０μｍ、媒体注入路１８の幅Ｗ2＝５０μｍ、後段流路１６の幅Ｗ3＝４００μｍ、吸引路１７の幅Ｗ5＝１００μｍである。図２に示すように、前段流路１２、ドナー搬送流路１４及び媒体注入路１８の端部には、搬送媒体の流量を急激な変動を抑制するための緩衝部１２ａ,１４ａ,１８ａがそれぞれ設けられている。また、吸引路１７及び後段流路１６の端部にも、搬送媒体を吸引するための緩衝部１７ａ,１６ａがそれぞれ設けられている。
【００２３】
更に、本実施形態の細胞カップリングモジュールでは、後段流路１６の前段流路１２との接続部側にＰＤＭＳからなる突起部３１と、島状部３２とが設けられており、この突起部３１と島状部３２との間に、卵子等の細胞を捕捉するための捕捉ギャップ３３が形成されている。捕捉ギャップ３３は後段流路１６の延設方向、即ち搬送媒体の流れの方向に沿って開口するように設けられており、捕捉ギャップ３３の裏面側には、前述の吸引路１７が接続されている。
【００２４】
本実施形態では、捕捉ギャップ３３の開口部の幅ｄ＝４０μｍであり、突起部３１の幅Ｄ1＝１００μｍ、長さＬ1＝５００μｍ、島状部３２の長さＬ2＝４００μｍ、幅Ｄ2＝２００μｍである。ここで、捕捉ギャップ３３の開口部の幅ｄは、捕捉すべき卵子１３の直径より小さく、卵子１３の直径の２分の１程度が好ましい。また、後段流路１６の突起部３１及び島状部３２が形成されている部分での流路の幅Ｗ4＝２００μｍである。この幅Ｗ4は、卵子１３の直径の２〜３倍程度が好ましい。更に、本実施形態では、媒体注入路１８の前段流路１２への接続部から捕捉ギャップ３３までの距離Ｌ3＝７００μｍである。この距離Ｌ3は、後述する二層流により卵子１３が捕捉ギャップ３３に最も近接するように決められるが、卵子１３が捕捉ギャップ３３に捕捉されるために十分な距離であればよい。
【００２５】
本実施形態におけるマイクロ流路１１は、以下のようにして作成される。まず、基板上にリソグラフィー用の光硬化剤（レジスト）の塗膜を形成し、次に、フォトマスクを用いてマイクロ流路１１の形状の部分に光照射して硬化させる。更に、未照射の部分を除去することにより、マイクロ流路１１の形状の凸状パターンを基板上に形成する。次に、このパターンを覆って基板上にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を塗布し、これを硬化させた後に基板から取り外することにより、凹状のマイクロ流路１１が形成された細胞カップリングモジュール１０が得られる。このようにして作成したマイクロ流路１１の断面形状はほぼ矩形であり、その深さは、本実施形態では１２０μｍとなっている。
【００２６】
以上の構成を有する装置における細胞カップリング方法について説明する。まず、卵子用送液ポンプ２０及び／又はドナー用送液ポンプ２２と、注入用送液ポンプ２３から搬送媒体を送出し、マイクロ流路１１のすべてを搬送媒体で満たす。
【００２７】
次に、電極１９ａ及び電極１９ｂの間に交流電圧を印加し、後段流路１６内に交流電界を生じさせる。後段流路１６に何も存在しなければ、交流電圧の印加により後段流路１６には一様な交流電界が形成されるが、後段流路１６内には誘電体（ＰＤＭＳ）からなる突起部３１及び島状部３２が形成されているため、突起部３１及び島状部３２の間の捕捉ギャップ３３近傍では電界は一様とはならない。図５は、後段流路１６内における捕捉ギャップ３３近傍に形成される電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、１ＭＨｚ，１Ｖｒｍｓとした。同図に示すように、生成する電界は捕捉ギャップ３３近傍では一様とならず、電場勾配を生じている。このような電場勾配が生じている捕捉ギャップ３３の近傍を卵子１３が通過すると、卵子１３は誘電泳動力により捕捉ギャップ３３に捕捉されることとなる。なお、卵子などの誘電体が電場勾配から何れの方向に誘電泳動力を受けるかは、誘電体の誘電率、交流の周波数などの条件によって決まることが知られている。本実施形態では、卵子１３が捕捉ギャップ３３に引かれるような条件に設定されている。
【００２８】
このような電界が形成された後、マイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて卵子１３が緩衝部１２ａから前段流路１２に導入される。なお、卵子１３及び後述するドナー細胞１５は、接着性を高めるために予めＰＨＡ（Phytohemagglutinin）で処理してある。次に、前段流路１２に卵子用送液ポンプ２０及び／又はドナー用送液ポンプ２２から搬送媒体が送出されるとともに、媒体注入路１８にも搬送媒体が送出される。前段流路１２における搬送媒体の流量は、０．０５〜０．２μｌ／分である。また、媒体注入路１８には、前段流路１２における搬送媒体の２〜３倍の量の搬送媒体が送出される。卵子用送液ポンプ２０、ドナー用送液ポンプ２２及び注入用送液ポンプ２３からの搬送媒体の送出量は、画像センサ２８からの後段流路１６の画像に基づいてコントローラ２４により制御されている。
【００２９】
上述のように、後段流路１６では、前段流路１２からの搬送媒体と、媒体注入路１８からの搬送媒体とが合流することになる。このように２つの流れが合流すると、その合流地点から下流には二層流が形成されることが知られている。即ち、図３の破線３４に示すように、前段流路１２からの搬送媒体の流れは媒体注入路１８が接続されている側とは反対側に押しやられ、前段流路１２からの搬送媒体と媒体注入路１８からの搬送媒体との間に境界面が生じることとなる。この境界面は消滅せずに後段流路１６の下流まで移動し、少なくとも捕捉ギャップ３３の位置まで維持される。その結果、前段流路１２内を搬送媒体とともに搬送されてきた卵子１３は、後段流路１６内で媒体注入路１８からの搬送媒体によって突起部３１及び島状部３２の側に押しやられることとなる。そして、上述のように捕捉ギャップ３３には電場勾配が形成されているため、卵子１３は捕捉ギャップ３３に容易に捕捉されることとなる。また、本実施形態では、捕捉ギャップ３３の裏面側には吸引路１７が形成されているので、この吸引路１７からの搬送媒体の吸引により、卵子１３を捕捉ギャップ３３に更に容易に捕捉することが可能となっている。
【００３０】
次に、ドナー細胞１５がマイクロピペット、ガラス毛細管などを用いて緩衝部１４ａからドナー搬送流路１４に導入される。ドナー細胞１５も前段流路１２に誘導され、更に後段流路１６に到達する。後段流路１６では、ドナー細胞１５も卵子１３と同様に二層流の影響を受けて、突起部３１及び島状部３２の側に押しやられて下流へと移動する。
【００３１】
後段流路１６には前述と同様に交流電界が生じているが、捕捉ギャップ３３には前述のように既に卵子１３が捕捉されているので、図５とは異なる電界が生じている。図６は捕捉ギャップ３３に卵子１３が捕捉されている場合の電界を解析により求めたものである。解析の際の交流は、前述と同様に１ＭＨｚ，１Ｖｒｍｓである。卵子１３が捕捉されている場合、同図に示すように、捕捉された卵子１３を頂点とする電場勾配が新たに生じていることがわかる。このような電場勾配が生じている卵子１３の近傍をドナー細胞１５が通過すると、図４に示すように、その電場勾配によりドナー細胞１５は卵子１３にカップリングされることとなる。
【００３２】
次に、電極１９ａ及び電極１９ｂへの交流電圧の印加を止め、更に必要に応じて吸引路１７から搬送媒体を送出することにより、カップリングした卵子１３及びドナー細胞１５は捕捉ギャップ３３から離れて後段流路１６を流動して緩衝部１６ａ（図２）で回収されることとなる。
【００３３】
本実施形態の細胞カップリングモジュールを使用すれば、交流電界に置かれた誘電体の間の捕捉ギャップ３３に形成された電界と二層流との作用により、卵子１３を確実に捕捉ギャップ３３に捕捉するとともに、ドナー細胞１５を卵子１３にカップリングさせることができる。また、捕捉ギャップ３３から搬送媒体を吸引する吸引路１７を備えているので、更に確実に卵子１３を捕捉ギャップ３３に捕捉することが可能となる。
【００３４】
また、卵子１３の捕捉により後段流路１６において搬送媒体の流れが変化しても、後段流路１６は十分な幅を有しているので卵子１３が離脱することはなく、搬送媒体の流速を細かく制御する必要もない。
【００３５】
また、卵子１３のサイズや硬さのばらつきがあっても、種々の卵子１３を捕捉ギャップに保持することが可能となり、卵子１３の捕捉による搬送媒体の流量の乱れに対しても安定して卵子１３を保持することができ、ドナー細胞１５の卵子１３への接触も確実に行うことが可能となる。
【００３６】
なお、上記ではドナー搬送流路１４からドナー細胞１５を供給したが、ドナー搬送流路１４を設けることなく、前段流路１２からドナー細胞１５を供給するように構成してもよい。
【００３７】
また、上記で説明した実施形態では、第１の細胞が分割した卵子であり、第２の細胞がドナー細胞である場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、２つの細胞をカップリングする操作について適用することができる。その場合、第１の細胞及び第２の細胞の大きさに応じて、前段流路１２、ドナー搬送流路１４、媒体注入路１８、後段流路１６、捕捉ギャップ３３等の大きさや幅を変更する必要があることは言うまでもない。
【００３８】
更に、本実施形態では、マイクロ流路１１の断面形状が矩形の場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、断面が矩形以外の例えば円形であっても差し支えない。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の細胞カップリングモジュール、細胞カップリング装置及び細胞カップリング方法は、細胞融合、クローン家畜生産などに有用なので、バイオ産業、畜産業などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る細胞カップリング装置の概略構成図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る細胞カップリングモジュールの詳細平面図である。
【図３】図２におけるＡ部の拡大平面図である。
【図４】捕捉ギャップに捕捉された卵子にドナー細胞がカップリングされた様子を示す平面図である。
【図５】後段流路内における捕捉ギャップ近傍に形成される電界を解析により求めた平面図である。
【図６】後段流路内に卵子が捕捉されている場合における捕捉ギャップ近傍に形成される電界を解析により求めた平面図である。
【符号の説明】
【００４１】
１０ 細胞カップリングモジュール
１１ マイクロ流路
１２ 前段流路
１２ａ 緩衝部
１３ 卵子
１４ ドナー搬送流路
１４ａ 緩衝部
１５ ドナー細胞
１６ 後段流路
１６ａ 緩衝部
１７ 吸引路
１７ａ 緩衝部
１８ 媒体注入路
１８ａ 緩衝部
１９ 電極対
１９ａ 電極
１９ｂ 電極
２０ 卵子用送液ポンプ
２２ ドナー用送液ポンプ
２３ 注入用送液ポンプ
２４ コントローラ
２５ 吸引ポンプ
２６ モニタ
２８ 画像センサ
３１ 突起部
３２ 島状部
３３ 捕捉ギャップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路内の搬送媒体中において複数の細胞のカップリングを行う細胞カップリングモジュールであって、
前記搬送媒体とともに前記細胞を搬送する前段流路と、
該前段流路に連続する後段流路と、
該後段流路に交流電界を生じさせるための電極対と、
該後段流路に設けられた誘電体の間隙からなり、前記交流電界の作用により生成する電界により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、
前記後段流路の上流側に接続され、搬送媒体の注入により前記後段流路内に二層流を生じさせて前記細胞を前記捕捉ギャップに近接して流動させる媒体注入路と
を備えたことを特徴とする細胞カップリングモジュール。
【請求項２】
前記後段流路における前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を吸引して前記細胞を捕捉ギャップに捕捉するための吸引路を更に備えている請求項１記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項３】
前記後段流路における前記捕捉ギャップは、前記後段流路の延設方向に平行に開口するように設けられている請求項１又は２記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項４】
前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である請求項１乃至３の何れかに記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れかに記載の細胞カップリングモジュールと、
前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、
前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。
【請求項６】
請求項２記載の細胞カップリングモジュールと、
前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、
前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプと、
前記吸引路から前記搬送媒体を吸引して細胞を捕捉する吸引ポンプと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。
【請求項７】
請求項１乃至４の何れかに記載の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界により前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、
前記電極対による交流電界の発生を止めることにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送する
ことを特徴とする細胞カップリング方法。
【請求項８】
請求項２記載の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界と前記吸引路からの前記前記搬送媒体の吸引とにより、前記捕捉ギャップ近傍を通過する前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、
前記電極対による交流電界の発生を止めるとともに、前記吸引路からの前記前記搬送媒体を送出することにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送する
ことを特徴とする細胞カップリング方法。
【請求項１】
マイクロ流路内の搬送媒体中において複数の細胞のカップリングを行う細胞カップリングモジュールであって、
前記搬送媒体とともに前記細胞を搬送する前段流路と、
該前段流路に連続する後段流路と、
該後段流路に交流電界を生じさせるための電極対と、
該後段流路に設けられた誘電体の間隙からなり、前記交流電界の作用により生成する電界により前記細胞を捕捉するための捕捉ギャップと、
前記後段流路の上流側に接続され、搬送媒体の注入により前記後段流路内に二層流を生じさせて前記細胞を前記捕捉ギャップに近接して流動させる媒体注入路と
を備えたことを特徴とする細胞カップリングモジュール。
【請求項２】
前記後段流路における前記捕捉ギャップから前記搬送媒体を吸引して前記細胞を捕捉ギャップに捕捉するための吸引路を更に備えている請求項１記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項３】
前記後段流路における前記捕捉ギャップは、前記後段流路の延設方向に平行に開口するように設けられている請求項１又は２記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項４】
前記複数の細胞の一つが卵子であり、前記複数の細胞の他の一つがドナー細胞である請求項１乃至３の何れかに記載の細胞カップリングモジュール。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れかに記載の細胞カップリングモジュールと、
前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、
前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。
【請求項６】
請求項２記載の細胞カップリングモジュールと、
前記前段流路に前記細胞を搬送するための前記搬送媒体を送出する第１の送液ポンプと、
前記媒体注入路に前記搬送媒体を送出して二層流を生じさせる第２の送液ポンプと、
前記吸引路から前記搬送媒体を吸引して細胞を捕捉する吸引ポンプと
を備えたことを特徴とする細胞カップリング装置。
【請求項７】
請求項１乃至４の何れかに記載の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界により前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、
前記電極対による交流電界の発生を止めることにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送する
ことを特徴とする細胞カップリング方法。
【請求項８】
請求項２記載の細胞カップリングモジュールを用いた細胞カップリング方法であって、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第１の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路に二層流を生じさせることにより、前記第１の細胞が前記捕捉ギャップ近傍を通過するようにするとともに、前記捕捉ギャップに生成している電界と前記吸引路からの前記前記搬送媒体の吸引とにより、前記捕捉ギャップ近傍を通過する前記第１の細胞を前記捕捉ギャップに捕捉し、
前記前段流路に前記搬送媒体を送出して前記複数の細胞のうちの第２の細胞を前記後段流路まで搬送するとともに、前記媒体注入路から前記搬送媒体を送出して前記後段流路内に二層流を生じさせることにより、前記第２の細胞が前記第１の細胞の近傍を通過するようにして、前記交流電界の捕捉ギャップを構成する誘電体及び前記第１の細胞への作用により生成する電界により前記第２の細胞を前記第１の細胞にカップリングさせ、
前記電極対による交流電界の発生を止めるとともに、前記吸引路からの前記前記搬送媒体を送出することにより、前記カップリング後の前記第１及び前記第２の細胞を前記捕捉ギャップから離脱させて搬送する
ことを特徴とする細胞カップリング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１３０９４６（Ｐ２０１０−１３０９４６Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０９８０６（Ｐ２００８−３０９８０６）
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（００００００９７４）川崎重工業株式会社 (1,710)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（００００００９７４）川崎重工業株式会社 (1,710)
【Ｆターム（参考）】
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