細胞スフェロイドの回収方法及び細胞スフェロイド
【課題】細胞スフェロイドの回収方法及び細胞スフェロイド
【解決手段】細胞非接着性の表面上にマイクロオーダーの細胞接着性ドメインをパターニングし、このドメイン上で細胞を自発的に凝集させることでサイズの整ったスフェロイドを効率的に形成せしめた後、条件によって形成した細胞スフェロイドを非侵襲的に回収する手段の提供
【解決手段】細胞非接着性の表面上にマイクロオーダーの細胞接着性ドメインをパターニングし、このドメイン上で細胞を自発的に凝集させることでサイズの整ったスフェロイドを効率的に形成せしめた後、条件によって形成した細胞スフェロイドを非侵襲的に回収する手段の提供
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外にて各種実質細胞の機能を長期にわたって維持することが可能な細胞の三次元凝集体であるスフェロイドを簡便に調製させることができ、また調製したスフェロイドにダメージを与えることなく回収する手段を提供するものである。
【技術的な背景】
【０００２】
近年の細胞工学の発展および再生医療への注目と相まって、生体外にて細胞を適切な形で培養し、治療への応用および生体反応のシュミレーターとして使用する試みが現在活発に行われている（非特許文献１参照）。このような目的において、培養される細胞は各種臓器機能の担い手である実質細胞が中心であるが、一般に生体外にて実質細胞の機能を維持した状態で長期の培養を行うことは困難であり、この点を解決するための様々な試みがなされている。
【背景技術】
【０００３】
生体外での培養において実質細胞の培養が困難であることの理由に、実際の生体内において、実質細胞は他の細胞および細胞外マトリックスと高度に組織化された状態で存在し、その機能の維持がなされていることに主な原因がある。そこで、生体外における実質細胞の培養においても、培養ディッシュに各実質細胞に適した細胞外マトリックスタンパクをコーティングしたもので細胞を培養する、また非実質細胞と実質細胞のヘテロ培養を行う、また細胞極性を保った状態で三次元的な培養を行う、等の手法により、実質細胞機能の生体外における長期維持について多角的な検討がなされている。
【０００４】
この中の一例として、多数の細胞の三次元的凝集状態を作って培養を行うスフェロイド培養系は、細胞極性および細胞間相互作用の維持という観点から、生体外における優れた実質細胞培養系として、様々な報告がなされており、膵細胞、骨芽細胞、肝細胞、など多種の細胞に適用された例が存在する（非特許文献２〜４参照）。いずれも単層培養系とは異なった生物学的応答を示し、分化マーカーが高レベルで維持されている例も報告されている。中でも肝細胞のスフェロイド培養は、急性肝炎時における一時補助型人工肝臓へ適用できる可能性、また生体外における薬物代謝シュミレーターに応用できる可能性などがあることから、これまでに数多くの報告例が存在する。
【０００５】
このようにスフェロイド培養は生体外における優れた実質細胞培養系であるが、難点として細胞にダメージを与えずにスフェロイド化させる手法、およびスフェロイド化した細胞を維持する簡便な手法が報告されていないことが挙げられる。スフェロイド形成の手法として、主に（１）物理的な力（培養液の撹拌など）で細胞を強制的に浮遊状態に保ち、細胞同士の接着確率を高める（非特許文献５参照）、もしくは（２）細胞培養容器の表面状態若しくは培養器の形状それ自体を改質することによりスフェロイド化を促進する（非特許文献６〜８参照）という二通りの手法が存在する。また（２）の方法の変法として、温度応答性高分子を修飾した表面上に接着した細胞を温度変化により剥離させ、細胞シートを自発的に凝集させることでスフェロイド化させる手法が存在する（非特許文献９参照）。この二種の方法にはそれぞれ長所と短所が存在し、（１）においては極端に接着依存性の細胞には適用できない、物理的な力が細胞に及ぼすストレスが無視できない、等の点が問題であり、（２）においては大量調製が困難であること、細胞によっては初期接着によって細胞極性を失い脱分化する、接着スフェロイドを正常な状態で回収することが困難、等の点が問題として存在する。また両者共通の欠点として、スフェロイドそれ自体のサイズを規定する機構が存在しないため、スフェロイドサイズがそろわない、またスフェロイド同士の衝突によるスフェロイドの癒合が生じることが挙げられる。
【０００６】
スフェロイドは血管系を持たない細胞凝集体であるため、細胞活動の維持に必須である酸素及び栄養分の供給はスフェロイド表面からの単純拡散の速度に依存する。従ってスフェロイドサイズが増大するに従い中心部への酸素供給レベルは低下し、内部の細胞が壊死することが広く知られている（非特許文献１０参照）。それゆえに、サイズを規定する機構をもたないスフェロイド形成系では、得られたスフェロイドの品質にばらつきが必ず生じ、問題となる。
【０００７】
サイズ規制という点に関しては、細胞接着性Ｕ字底を有する９６穴プレートに細胞数を定めて細胞を播種することによってサイズをコントロールし、かつ簡便にスフェロイドを形成される手法が報告されているが（非特許文献８参照）、スフェロイド形成の培養面積当り効率が極めて低く、人工肝臓や薬物シュミレーターへの応用を考えた際のボトルネックとなる。
【０００８】
本発明者らは細胞非接着性表面上、数十〜数百マイクロのサイズを有する細胞接着性マイクロドメインを有する培養基材を作成し、その基板上に実質細胞を播種することで細胞接着性マイクロドメイン上限定的に、高効率でスフェロイドを形成せしめる技術を確立している（特許文献１、非特許文献１１、１２参照）。
【特許文献１】
【非特許文献１】Ｋｕｎｚ−Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ９（２００４）２７３−２８５
【非特許文献２】Ｈｏｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｓ２５（２００２）７１−７７
【非特許文献３】Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３２２（２００４）６８４−６９２
【非特許文献４】Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６１（１９８９）３８５−３９１
【非特許文献５】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０（１９９６）４０４−４１５
【非特許文献６】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４２（２００３）５７−６６
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（１９９１）３２４
【非特許文献８】Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４７（２００１）１６５−１７１
【非特許文献９】Ｔａｋｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０１（１９９２）４９５
【非特許文献１０】Ｓｕｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．２０（２００４）１２７−１３６
【非特許文献１１】Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４（２００１）１０１−１０４
【非特許文献１２】Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ５（２００４）８５０−８５５
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上に述べたように、現行のスフェロイド培養法にはそれぞれに十分満足された調製法がなく、形成効率、サイズ制御、細胞へのダメージの低減というすべての問題点を克服する手法は存在しない。本発明は細胞非接着性表面上に細胞接着性マイクロドメインを作成することによってサイズのそろったスフェロイドを自発的に形成せしめ、物理的方法によらずにスフェロイドを容易に回収できる方法を見いだした。従って、形成効率、サイズ制御、細胞へのダメージの低減という三つの問題を克服する手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、細胞非接着性表面上に特定の間隔および形状で細胞接着性のマイクロドメインを作成し、各細胞種に適した生化学的条件を与えることにより、スフェロイドのサイズをマイクロドメインのサイズによって厳密に規定した状態で調製できる事を見出した。マイクロドメインのサイズを変更することも容易であることから種々のサイズのスフェロイドを厳密なサイズ規定の元に調製することが可能である。また実質細胞の播種前に予めフィーダー細胞を播種しておくことも可能であり、広範な細胞種にわたって極めて簡便に、高効率的にスフェロイドを形成させることが可能である。また、フィーダー細胞の種類を選択することにより、スフェロイド形成後に培地に含まれる二価イオン濃度依存的に、物理的な力を与えることなくスフェロイドを回収可能であることを見出した。更に、スフェロイド形成後にフィーダー細胞をシート化させることにより、フィーダー細胞とスフェロイドの接着性が変化し、非浸襲的にスフェロイドを回収することが可能であることを見出した。このような手法は本発明者の知る限り、文献未載のものである。この技術はこれまでのスフェロイド培養に存在した数々の問題点を解決する優れた手法であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に伴う細胞スフェロイドの調製および回収は、生体外での機能細胞の長期機能維持、生物機能シュミレーター、生体内環境モデル、生体外での細胞に対する機能付加後の生体内移植への適用等を主たる目的とするものである。
【００１２】
本発明にいう細胞は、接着性細胞であれば種および由来組織に限定されない。また、限定されるものではないが、本発明で扱うことを意図している細胞としては、生体より採取した直後の細胞および癌化した樹立細胞系が挙げられる。
【００１３】
本発明が目的とする細胞は、本発明の目的に沿う限り、いかなる細胞であってもよいが、好ましくは特定の臓器の機能発現および病態に関連する細胞であることができる。限定されるものではないが、目的細胞としては薬物代謝に関連する肝実質細胞、血糖値制御に関連する膵臓β細胞、骨再生に関連する骨芽細胞、軟骨細胞、神経伝達にかかわる神経幹細胞およびがん細胞を挙げることができる。またこれら細胞と相互作用する非実質細胞も用いることができる。
【００１４】
細胞接着性ドメインはスフェロイドを形成せしめるサイズであれば如何なるサイズでも可能であるが、好適には５〜１０００マイクロメートル、さらに好ましくは５０〜５００マイクロメートルが望ましい。
【００１５】
スフェロイド形成を促進させるためのフィーダー細胞として、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、肝臓および軟骨のスフェロイドを形成させる場合のフィーダー細胞としてはＣＯＳ−１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種である。
【００１６】
フィーダー細胞を用いた場合および用いていない場合にかかわらず、スフェロイドを回収するための手段として、培地成分の細胞−基質間接着にかかわる因子を取り除くことが挙げられる。限定されるものではないが、二価イオンのカルシウムおよびマグネシウムを含まない生理条件リン酸緩衝溶液がこの目的に供することが可能である。
【００１７】
フィーダー細胞を用いた場合のスフェロイドを回収するための手段として、フィーダー細胞間の接着を優先させることにより、スフェロイドとの接着を弱め、自発的にスフェロイドを遊離させる手法を用いることができる。その際には、細胞非接着性ドメインに生分解性を持たせ、培養時間の経過とともに細胞非接着性ポリマーが基板表面より脱離することにより可能となる。限定されるものではないが、生分解性を有する細胞非接着性ポリマーとして密度を制御したポリエチレングリコールブラシ表面、特にポリエチレングリコール−ポリラクチドブロック共重合体を用いることが可能である。また、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、ポリアクリルアミドなどの水溶性のポリマー基材を用いることも可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明で得られたスフェロイド調製および回収法は、マイクロメートルオーダーでの高密度培養が可能であるため、基板面積あたりのスフェロイド形成効率を著しく向上させることが可能である。また、高密度スフェロイド培養時においても、細胞への物理的ダメージを与えることなくスフェロイドの癒合を排除することが可能である。また、培地成分の変化により、非侵襲的にスフェロイドを回収することが可能である。また、フィーダー細胞同士の相互作用を促進させることにより、非侵襲的にスフェロイドを回収することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例などについて説明するが、発明を限定するものではない。
【００２０】
実施例１：ポリエチレングリコール−ポリラクチドブロック共重合体から調製したスフェロイド培養基板によるスフェロイドの培養および回収
【００２１】
３−メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン処理によって疎水化したスライドガラス上に、ポリラクチド（分子量３７０００）およびポリエチレングリコール−ポリラクチドブロックコポリマー（分子量６０００／８０００）のトルエン溶液を用いて順次スピンコーティングを行い、細胞非接着性のＰＥＧ化表面を得た。この表面上にプラズマエッチングにより１００μｍの円形細胞接着性ドメインを間隔１００μｍで作成した。この表面上にウシ血管内皮細胞（ＪＣＲＢ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ ｎａｍｅ：ＨＨ）を１０％血清入りダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて播種した。内皮細胞播種の一日後にウィスターラット（オス、４週齢）よりコラゲナーゼ潅流法により採取した肝細胞を播種し、経過を観察した。
【００２２】
プラズマエッチング後の表面を観察したところ、マスクにより規定された良好なマイクロパターンが作成されていることが確認できた（図１ａ）。内皮細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、内皮細胞はマイクロパターン内選択的に接着していることが確認できた（図１ｂ）。肝細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、肝細胞はフィーダー細胞である内皮細胞上選択的に接着していることが確認できた（図１ｃ）。このときの肝細胞は多数の細胞が凝集したスフェロイド形態をとっていることが確認され、その形成効率はほぼ１００％であった。
【００２３】
培養を継続したところ、ポリラクチド鎖の生分解に伴いポリエチレングリコールが基板より脱落していくことにより、内皮細胞は徐々にパターン外へと進展を開始した。（図１ｄ）肝細胞の播種から一週間程度が経過した時点で、内皮細胞は完全な細胞シートを形成し、それに伴い肝細胞スフェロイドが自発的に内皮細胞から脱離することが確認できた（図１ｅ）。
【００２４】
実施例２：細胞非接着性を有する光反応性ポリビニルアルコールによる実施例
【００２５】
アミノプロピルシラン処理したスライドガラス上に、細胞非接着性の感光樹脂（東洋合成工業（株）製：商標「ＡＷＰ」）をスピンコートにより塗布し、ガラスマスクを介したＵＶ露光、そのあとの現像により、基板表面上に細胞接着性のマイクロパターンを作成した。細胞接着性ドメインは１００μｍの円形であり、これを間隔１００μｍで方陣状に配列させたものを調製した。この表面上にウシ血管内皮細胞（ＪＣＲＢ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ ｎａｍｅ：ＨＨ）を１０％血清入りダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて播種した。内皮細胞播種の一日後にウィスターラット（オス、４週齢）よりコラゲナーゼ潅流法により採取した肝細胞を播種し、経過を観察した。
【００２６】
現像後の表面を観察したところ、マスクにより規定された良好なマイクロパターンが作成されていることが確認できた（図２ａ）。内皮細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、内皮細胞はマイクロパターン内選択的に接着していることが確認できた。肝細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、肝細胞はフィーダー細胞である内皮細胞上に多く接着していることが確認できた。このとき、内皮細胞上に接着した肝細胞は、多数の細胞が凝集したスフェロイド形態をとっていることが確認され、その形成効率はほぼ１００％であった。
【００２７】
培養を継続したところ、少なくとも２５日にわたって内皮細胞はパターンを維持しつづけ、また内皮細胞上に接着した肝細胞もスフェロイド形態を維持しつづけていることが確認できた（図２ｂ）。また、培養中任意の時点で二価イオンを含まない生理条件リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−））に培地を交換すると、スフェロイドは自発的に培養基との接着を解消し、浮遊状態にて容易に回収することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図１ａ：プラズマエッチング後のポリエチレングリコール表面の顕微鏡観察結果である。
図１ｂ：パターン化ポリエチレングリコール表面上に内皮細胞を播種してから一日が経過した時点での顕微鏡観察結果である
図１ｃ：パターン化された内皮細胞上にラット肝細胞を播種してから一日が経過した時点での顕微鏡観察結果である
図１ｄ：肝細胞播種から四日が経過した時点での顕微鏡観察結果である。
図１ｅ：肝細胞播種から一週間が経過した時点での顕微鏡観察結果である
図２ａ：光リソグラフィ法により作成した表面の顕微鏡観察結果である。
図２ｂ：光リソグラフィ法により作成した表面上での、肝細胞播種から２５日が経過した時点における位相差顕微鏡観察の結果である。
【図１】
【図２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外にて各種実質細胞の機能を長期にわたって維持することが可能な細胞の三次元凝集体であるスフェロイドを簡便に調製させることができ、また調製したスフェロイドにダメージを与えることなく回収する手段を提供するものである。
【技術的な背景】
【０００２】
近年の細胞工学の発展および再生医療への注目と相まって、生体外にて細胞を適切な形で培養し、治療への応用および生体反応のシュミレーターとして使用する試みが現在活発に行われている（非特許文献１参照）。このような目的において、培養される細胞は各種臓器機能の担い手である実質細胞が中心であるが、一般に生体外にて実質細胞の機能を維持した状態で長期の培養を行うことは困難であり、この点を解決するための様々な試みがなされている。
【背景技術】
【０００３】
生体外での培養において実質細胞の培養が困難であることの理由に、実際の生体内において、実質細胞は他の細胞および細胞外マトリックスと高度に組織化された状態で存在し、その機能の維持がなされていることに主な原因がある。そこで、生体外における実質細胞の培養においても、培養ディッシュに各実質細胞に適した細胞外マトリックスタンパクをコーティングしたもので細胞を培養する、また非実質細胞と実質細胞のヘテロ培養を行う、また細胞極性を保った状態で三次元的な培養を行う、等の手法により、実質細胞機能の生体外における長期維持について多角的な検討がなされている。
【０００４】
この中の一例として、多数の細胞の三次元的凝集状態を作って培養を行うスフェロイド培養系は、細胞極性および細胞間相互作用の維持という観点から、生体外における優れた実質細胞培養系として、様々な報告がなされており、膵細胞、骨芽細胞、肝細胞、など多種の細胞に適用された例が存在する（非特許文献２〜４参照）。いずれも単層培養系とは異なった生物学的応答を示し、分化マーカーが高レベルで維持されている例も報告されている。中でも肝細胞のスフェロイド培養は、急性肝炎時における一時補助型人工肝臓へ適用できる可能性、また生体外における薬物代謝シュミレーターに応用できる可能性などがあることから、これまでに数多くの報告例が存在する。
【０００５】
このようにスフェロイド培養は生体外における優れた実質細胞培養系であるが、難点として細胞にダメージを与えずにスフェロイド化させる手法、およびスフェロイド化した細胞を維持する簡便な手法が報告されていないことが挙げられる。スフェロイド形成の手法として、主に（１）物理的な力（培養液の撹拌など）で細胞を強制的に浮遊状態に保ち、細胞同士の接着確率を高める（非特許文献５参照）、もしくは（２）細胞培養容器の表面状態若しくは培養器の形状それ自体を改質することによりスフェロイド化を促進する（非特許文献６〜８参照）という二通りの手法が存在する。また（２）の方法の変法として、温度応答性高分子を修飾した表面上に接着した細胞を温度変化により剥離させ、細胞シートを自発的に凝集させることでスフェロイド化させる手法が存在する（非特許文献９参照）。この二種の方法にはそれぞれ長所と短所が存在し、（１）においては極端に接着依存性の細胞には適用できない、物理的な力が細胞に及ぼすストレスが無視できない、等の点が問題であり、（２）においては大量調製が困難であること、細胞によっては初期接着によって細胞極性を失い脱分化する、接着スフェロイドを正常な状態で回収することが困難、等の点が問題として存在する。また両者共通の欠点として、スフェロイドそれ自体のサイズを規定する機構が存在しないため、スフェロイドサイズがそろわない、またスフェロイド同士の衝突によるスフェロイドの癒合が生じることが挙げられる。
【０００６】
スフェロイドは血管系を持たない細胞凝集体であるため、細胞活動の維持に必須である酸素及び栄養分の供給はスフェロイド表面からの単純拡散の速度に依存する。従ってスフェロイドサイズが増大するに従い中心部への酸素供給レベルは低下し、内部の細胞が壊死することが広く知られている（非特許文献１０参照）。それゆえに、サイズを規定する機構をもたないスフェロイド形成系では、得られたスフェロイドの品質にばらつきが必ず生じ、問題となる。
【０００７】
サイズ規制という点に関しては、細胞接着性Ｕ字底を有する９６穴プレートに細胞数を定めて細胞を播種することによってサイズをコントロールし、かつ簡便にスフェロイドを形成される手法が報告されているが（非特許文献８参照）、スフェロイド形成の培養面積当り効率が極めて低く、人工肝臓や薬物シュミレーターへの応用を考えた際のボトルネックとなる。
【０００８】
本発明者らは細胞非接着性表面上、数十〜数百マイクロのサイズを有する細胞接着性マイクロドメインを有する培養基材を作成し、その基板上に実質細胞を播種することで細胞接着性マイクロドメイン上限定的に、高効率でスフェロイドを形成せしめる技術を確立している（特許文献１、非特許文献１１、１２参照）。
【特許文献１】
【非特許文献１】Ｋｕｎｚ−Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ９（２００４）２７３−２８５
【非特許文献２】Ｈｏｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｓ２５（２００２）７１−７７
【非特許文献３】Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３２２（２００４）６８４−６９２
【非特許文献４】Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６１（１９８９）３８５−３９１
【非特許文献５】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０（１９９６）４０４−４１５
【非特許文献６】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４２（２００３）５７−６６
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（１９９１）３２４
【非特許文献８】Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４７（２００１）１６５−１７１
【非特許文献９】Ｔａｋｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０１（１９９２）４９５
【非特許文献１０】Ｓｕｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．２０（２００４）１２７−１３６
【非特許文献１１】Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４（２００１）１０１−１０４
【非特許文献１２】Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ５（２００４）８５０−８５５
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上に述べたように、現行のスフェロイド培養法にはそれぞれに十分満足された調製法がなく、形成効率、サイズ制御、細胞へのダメージの低減というすべての問題点を克服する手法は存在しない。本発明は細胞非接着性表面上に細胞接着性マイクロドメインを作成することによってサイズのそろったスフェロイドを自発的に形成せしめ、物理的方法によらずにスフェロイドを容易に回収できる方法を見いだした。従って、形成効率、サイズ制御、細胞へのダメージの低減という三つの問題を克服する手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、細胞非接着性表面上に特定の間隔および形状で細胞接着性のマイクロドメインを作成し、各細胞種に適した生化学的条件を与えることにより、スフェロイドのサイズをマイクロドメインのサイズによって厳密に規定した状態で調製できる事を見出した。マイクロドメインのサイズを変更することも容易であることから種々のサイズのスフェロイドを厳密なサイズ規定の元に調製することが可能である。また実質細胞の播種前に予めフィーダー細胞を播種しておくことも可能であり、広範な細胞種にわたって極めて簡便に、高効率的にスフェロイドを形成させることが可能である。また、フィーダー細胞の種類を選択することにより、スフェロイド形成後に培地に含まれる二価イオン濃度依存的に、物理的な力を与えることなくスフェロイドを回収可能であることを見出した。更に、スフェロイド形成後にフィーダー細胞をシート化させることにより、フィーダー細胞とスフェロイドの接着性が変化し、非浸襲的にスフェロイドを回収することが可能であることを見出した。このような手法は本発明者の知る限り、文献未載のものである。この技術はこれまでのスフェロイド培養に存在した数々の問題点を解決する優れた手法であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に伴う細胞スフェロイドの調製および回収は、生体外での機能細胞の長期機能維持、生物機能シュミレーター、生体内環境モデル、生体外での細胞に対する機能付加後の生体内移植への適用等を主たる目的とするものである。
【００１２】
本発明にいう細胞は、接着性細胞であれば種および由来組織に限定されない。また、限定されるものではないが、本発明で扱うことを意図している細胞としては、生体より採取した直後の細胞および癌化した樹立細胞系が挙げられる。
【００１３】
本発明が目的とする細胞は、本発明の目的に沿う限り、いかなる細胞であってもよいが、好ましくは特定の臓器の機能発現および病態に関連する細胞であることができる。限定されるものではないが、目的細胞としては薬物代謝に関連する肝実質細胞、血糖値制御に関連する膵臓β細胞、骨再生に関連する骨芽細胞、軟骨細胞、神経伝達にかかわる神経幹細胞およびがん細胞を挙げることができる。またこれら細胞と相互作用する非実質細胞も用いることができる。
【００１４】
細胞接着性ドメインはスフェロイドを形成せしめるサイズであれば如何なるサイズでも可能であるが、好適には５〜１０００マイクロメートル、さらに好ましくは５０〜５００マイクロメートルが望ましい。
【００１５】
スフェロイド形成を促進させるためのフィーダー細胞として、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、肝臓および軟骨のスフェロイドを形成させる場合のフィーダー細胞としてはＣＯＳ−１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種である。
【００１６】
フィーダー細胞を用いた場合および用いていない場合にかかわらず、スフェロイドを回収するための手段として、培地成分の細胞−基質間接着にかかわる因子を取り除くことが挙げられる。限定されるものではないが、二価イオンのカルシウムおよびマグネシウムを含まない生理条件リン酸緩衝溶液がこの目的に供することが可能である。
【００１７】
フィーダー細胞を用いた場合のスフェロイドを回収するための手段として、フィーダー細胞間の接着を優先させることにより、スフェロイドとの接着を弱め、自発的にスフェロイドを遊離させる手法を用いることができる。その際には、細胞非接着性ドメインに生分解性を持たせ、培養時間の経過とともに細胞非接着性ポリマーが基板表面より脱離することにより可能となる。限定されるものではないが、生分解性を有する細胞非接着性ポリマーとして密度を制御したポリエチレングリコールブラシ表面、特にポリエチレングリコール−ポリラクチドブロック共重合体を用いることが可能である。また、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、ポリアクリルアミドなどの水溶性のポリマー基材を用いることも可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明で得られたスフェロイド調製および回収法は、マイクロメートルオーダーでの高密度培養が可能であるため、基板面積あたりのスフェロイド形成効率を著しく向上させることが可能である。また、高密度スフェロイド培養時においても、細胞への物理的ダメージを与えることなくスフェロイドの癒合を排除することが可能である。また、培地成分の変化により、非侵襲的にスフェロイドを回収することが可能である。また、フィーダー細胞同士の相互作用を促進させることにより、非侵襲的にスフェロイドを回収することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例などについて説明するが、発明を限定するものではない。
【００２０】
実施例１：ポリエチレングリコール−ポリラクチドブロック共重合体から調製したスフェロイド培養基板によるスフェロイドの培養および回収
【００２１】
３−メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン処理によって疎水化したスライドガラス上に、ポリラクチド（分子量３７０００）およびポリエチレングリコール−ポリラクチドブロックコポリマー（分子量６０００／８０００）のトルエン溶液を用いて順次スピンコーティングを行い、細胞非接着性のＰＥＧ化表面を得た。この表面上にプラズマエッチングにより１００μｍの円形細胞接着性ドメインを間隔１００μｍで作成した。この表面上にウシ血管内皮細胞（ＪＣＲＢ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ ｎａｍｅ：ＨＨ）を１０％血清入りダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて播種した。内皮細胞播種の一日後にウィスターラット（オス、４週齢）よりコラゲナーゼ潅流法により採取した肝細胞を播種し、経過を観察した。
【００２２】
プラズマエッチング後の表面を観察したところ、マスクにより規定された良好なマイクロパターンが作成されていることが確認できた（図１ａ）。内皮細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、内皮細胞はマイクロパターン内選択的に接着していることが確認できた（図１ｂ）。肝細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、肝細胞はフィーダー細胞である内皮細胞上選択的に接着していることが確認できた（図１ｃ）。このときの肝細胞は多数の細胞が凝集したスフェロイド形態をとっていることが確認され、その形成効率はほぼ１００％であった。
【００２３】
培養を継続したところ、ポリラクチド鎖の生分解に伴いポリエチレングリコールが基板より脱落していくことにより、内皮細胞は徐々にパターン外へと進展を開始した。（図１ｄ）肝細胞の播種から一週間程度が経過した時点で、内皮細胞は完全な細胞シートを形成し、それに伴い肝細胞スフェロイドが自発的に内皮細胞から脱離することが確認できた（図１ｅ）。
【００２４】
実施例２：細胞非接着性を有する光反応性ポリビニルアルコールによる実施例
【００２５】
アミノプロピルシラン処理したスライドガラス上に、細胞非接着性の感光樹脂（東洋合成工業（株）製：商標「ＡＷＰ」）をスピンコートにより塗布し、ガラスマスクを介したＵＶ露光、そのあとの現像により、基板表面上に細胞接着性のマイクロパターンを作成した。細胞接着性ドメインは１００μｍの円形であり、これを間隔１００μｍで方陣状に配列させたものを調製した。この表面上にウシ血管内皮細胞（ＪＣＲＢ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ ｎａｍｅ：ＨＨ）を１０％血清入りダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて播種した。内皮細胞播種の一日後にウィスターラット（オス、４週齢）よりコラゲナーゼ潅流法により採取した肝細胞を播種し、経過を観察した。
【００２６】
現像後の表面を観察したところ、マスクにより規定された良好なマイクロパターンが作成されていることが確認できた（図２ａ）。内皮細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、内皮細胞はマイクロパターン内選択的に接着していることが確認できた。肝細胞の播種から一日が経過した時点で顕微鏡観察を行ったところ、肝細胞はフィーダー細胞である内皮細胞上に多く接着していることが確認できた。このとき、内皮細胞上に接着した肝細胞は、多数の細胞が凝集したスフェロイド形態をとっていることが確認され、その形成効率はほぼ１００％であった。
【００２７】
培養を継続したところ、少なくとも２５日にわたって内皮細胞はパターンを維持しつづけ、また内皮細胞上に接着した肝細胞もスフェロイド形態を維持しつづけていることが確認できた（図２ｂ）。また、培養中任意の時点で二価イオンを含まない生理条件リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−））に培地を交換すると、スフェロイドは自発的に培養基との接着を解消し、浮遊状態にて容易に回収することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図１ａ：プラズマエッチング後のポリエチレングリコール表面の顕微鏡観察結果である。
図１ｂ：パターン化ポリエチレングリコール表面上に内皮細胞を播種してから一日が経過した時点での顕微鏡観察結果である
図１ｃ：パターン化された内皮細胞上にラット肝細胞を播種してから一日が経過した時点での顕微鏡観察結果である
図１ｄ：肝細胞播種から四日が経過した時点での顕微鏡観察結果である。
図１ｅ：肝細胞播種から一週間が経過した時点での顕微鏡観察結果である
図２ａ：光リソグラフィ法により作成した表面の顕微鏡観察結果である。
図２ｂ：光リソグラフィ法により作成した表面上での、肝細胞播種から２５日が経過した時点における位相差顕微鏡観察の結果である。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞非接着性基材表面上に、マイクロメートルオーダーで細胞接着性ドメインが存在する細胞培養用基材で形成した細胞スフェロイドを非侵襲的に回収する方法
【請求項２】
非接着表面が親水性ポリマーで覆われている請求項１の基材を利用した回収方法
【請求項３】
細胞スフェロイドがフィーダー細胞上に形成されることを特徴とする請求項１〜２の細胞スフェロイド回収方法
【請求項４】
フィーダー細胞が内皮細胞、ＣＯＳ１細胞、線維芽細胞であることを特徴とする請求項１〜３の細胞スフェロイド回収方法
【請求項５】
基材の細胞非接着性部位が親水性高分子で覆われ、これが分解あるいは溶解することによってフィーダー細胞がシート化するとともに形成したスフェロイドを切り離すことを特徴とする請求項１〜４の細胞スフェロイド回収方法
【請求項６】
適度な接着性を有する親水性高分子を利用し、時間経過とともにフィーダー細胞がシート化するとともに形成したスフェロイドを切り離すことを特徴とする請求項１〜４の細胞スフェロイド回収方法
【請求項７】
親水性高分子がポリエチレングリコールを一成分とする請求項５〜６の細胞スフェロイド回収方法
【請求項８】
親水性高分子がポリエチレングロコール・ポリ乳酸ブロック共重合体であることを特徴とする請求項１〜７記載の細胞スフェロイド回収方法
【請求項９】
親水性高分子が光効果型ポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項５〜６に記載の細胞スフェロイド回収方法
【請求項１０】
基板表面に細胞アレイを形成せしめ、二価イオンを含まない生理条件リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−））で培養することによって基板とスフェロイドを切り離すことを特徴とする請求項１〜９に記載の細胞スフェロイド回収方法
【請求項１１】
請求項１〜１０で調製された細胞スフェロイド
【請求項１】
細胞非接着性基材表面上に、マイクロメートルオーダーで細胞接着性ドメインが存在する細胞培養用基材で形成した細胞スフェロイドを非侵襲的に回収する方法
【請求項２】
非接着表面が親水性ポリマーで覆われている請求項１の基材を利用した回収方法
【請求項３】
細胞スフェロイドがフィーダー細胞上に形成されることを特徴とする請求項１〜２の細胞スフェロイド回収方法
【請求項４】
フィーダー細胞が内皮細胞、ＣＯＳ１細胞、線維芽細胞であることを特徴とする請求項１〜３の細胞スフェロイド回収方法
【請求項５】
基材の細胞非接着性部位が親水性高分子で覆われ、これが分解あるいは溶解することによってフィーダー細胞がシート化するとともに形成したスフェロイドを切り離すことを特徴とする請求項１〜４の細胞スフェロイド回収方法
【請求項６】
適度な接着性を有する親水性高分子を利用し、時間経過とともにフィーダー細胞がシート化するとともに形成したスフェロイドを切り離すことを特徴とする請求項１〜４の細胞スフェロイド回収方法
【請求項７】
親水性高分子がポリエチレングリコールを一成分とする請求項５〜６の細胞スフェロイド回収方法
【請求項８】
親水性高分子がポリエチレングロコール・ポリ乳酸ブロック共重合体であることを特徴とする請求項１〜７記載の細胞スフェロイド回収方法
【請求項９】
親水性高分子が光効果型ポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項５〜６に記載の細胞スフェロイド回収方法
【請求項１０】
基板表面に細胞アレイを形成せしめ、二価イオンを含まない生理条件リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−））で培養することによって基板とスフェロイドを切り離すことを特徴とする請求項１〜９に記載の細胞スフェロイド回収方法
【請求項１１】
請求項１〜１０で調製された細胞スフェロイド
【図１】（ａ）はプラズマエッチング後のポリエチレングリコール表面の顕微鏡観察結果の図、 （ｂ）はパターン化ポリエチレングリコール表面上に内皮細胞を播種してから一日が経過した時点での顕微鏡観察結果の図、 （ｃ）はパターン化された内皮細胞上にラット肝細胞を播種してから一日が経過した時点での顕微鏡観察結果の図、 （ｄ）は肝細胞播種から四日が経過した時点での顕微鏡観察結果の図、 （ｅ）は肝細胞播種から一週間が経過した時点での顕微鏡観察結果の図。
【図２】（ａ）は光リソグラフィ法により作成した表面の顕微鏡観察結果の図、 （ａ）は光リソグラフィ法により作成した表面上での、肝細胞播種から２５日が経過した時点における位相差顕微鏡観察の図。
【図２】（ａ）は光リソグラフィ法により作成した表面の顕微鏡観察結果の図、 （ａ）は光リソグラフィ法により作成した表面上での、肝細胞播種から２５日が経過した時点における位相差顕微鏡観察の図。
【公開番号】特開２００６−６７９８７（Ｐ２００６−６７９８７Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９０７５３（Ｐ２００４−２９０７５３）
【出願日】平成１６年９月１日（２００４．９．１）
【出願人】（５９７０５９０８５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１日（２００４．９．１）
【出願人】（５９７０５９０８５）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]