細胞培養における生存度及び生産性の改善方法
細胞内のＭＤＭ２のＤ３００Ａ変異型を過剰発現することによって、真核細胞の流加培養において分泌タンパク質の生存度及び産生を増加させる方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流加真核細胞培養において分泌タンパク質の生存度及び生産を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞培養物は、適正な翻訳後修飾を伴うタンパク質を産生するその能力により、多くの組換えタンパク質製造方法に選択されるシステムである。製造の需要の増加とともに、生成物の収量を増大させて製造効率を向上させたいという強い動機が存在する。商業的製造方法における生物学的療法剤のグラム／リットル生産レベルの達成は、哺乳動物細胞培養及び技術手法の両方の最適化に依存する。
【０００３】
高密度の培養を特徴とする無タンパク質哺乳動物細胞培養には、細胞死の問題があり、アポトーシスは、典型的な流加生物反応器で最大８０％を占める可能性があり、栄養素及び増殖因子の欠乏、酸素欠乏、毒素蓄積、及び剪断応力などのストレス要因に応答して誘発される（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６２：６３２〜６４０（１９９９））。アポトーシスは、最大生細胞密度を制限し、死滅期の開始を早め、異種タンパク質収量を潜在的に減少させる（Ｃｈｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｉｓｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：７７９〜７９２（２００５）、Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３：２１１〜２２２（２００１），Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：２３０〜２４５（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８５：５８９〜６００（２００４）、Ｍｅｒｃｉｌｌｅ ａｎｄ Ｍａｓｓｉｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４４：１１４０〜１１５４（１９９４））。
【０００４】
アポトーシスは、細胞内外の両方からのシグナル経路の複雑なネットワークの結果であり、細胞死の最終段階を行うカスパーゼの活性化に至る。哺乳動物細胞培養における長期生産工程中に細胞生存度を維持するために、アポトーシス阻止の様々な方法が用いられてきた（Ａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１７４〜１８０（２００４）；Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：１２４〜１３２（２００３））。増殖因子、加水分解産物、及び制限栄養素の培地補給を介して細胞外環境を変化させることによって、タンパク質生産が増加し、かつアポトーシスが減少した（Ｂｕｒｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３９：２９１〜２９６（２００３）；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４８：５９〜７４（２００５））。細胞内部からのアポトーシスシグナリングカスケードを阻害するために、他の研究者らは化学的及び遺伝子的戦略に取り組んできた（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７：７０４〜７１６（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１：３２９〜３４０（２００３））。研究者らは、癌細胞において増加していることが見出された遺伝子の過剰発現がカスパーゼ活性の上流のアポトーシスを阻害することによって生物反応器内で成長する細胞生存度を延長できることを見出した（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８８〜９５（１９９８）；Ｍｅｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８０：７０６〜７１６（２００２）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１４７〜１５９（２０００）ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１〜４３（２０００））。
【０００５】
ミトコンドリアアポトーシス経路で機能する抗アポトーシス遺伝子は、３つのグループ、即ち、１）経路の初期に作用するもの、例えば、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバー、２）経路の中間で作用してアポトソーム複合体を崩壊する又は阻害するもの、例えば、アベナ、及び３）経路の後期に作用するもの、例えば、カスパーゼ阻害剤、ＸＩＡＰに分類され得る。これら遺伝子の大部分の機能性は、これらを哺乳動物の発現システムで過剰発現させることにより研究されており、場合によっては、それぞれが経路の異なる部位から誘導された２つ以上の遺伝子の複合過剰発現の効果が解明されている。例には、１）ＣＨＯ細胞におけるＢｃｌ−ＸＬ及びＸＩＡＰの欠失変異体（ＸＩＡＰΔ）の相加効果（Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：２３０〜２４５（２００３））、２）ＢＨＫ細胞におけるＥ１Ｂ−１９Ｋ及びアベナ（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９８：８２５〜８４１（２００７））、及び３）Ｂｃｌ−ＸＬ、アベナ及びＸＩＡＰΔ（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１：３２９〜３４０（２００３））が挙げられる。
【０００６】
アポトーシスカスケードの主要活性化因子はｐ５３タンパク質である。ｐ５３がアポトーシスを活性化させる１つのメカニズムは、ＢＮＩＰ３などのプロアポトーシスタンパク質のサブセットの増加による（Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２４１５〜２１（１９９８））。したがって、ｐ５３の増加は、アポトーシスを誘発する主な要因の１つであり得る。ｐ５３は、ユビキチン介在性分解経路によってＭＤＭ２を介して細胞で分解され得る（Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ５：３〜８（２００５））。したがって、ＭＤＭ２の過剰発現は、ｐ５３レベルを低下させ、かつ拡大解釈すれば、アポトーシスを阻害する可能性を有する。これまでに、ストレスシグナルの存在下では、ＭＤＭ２を過剰発現するＣＨＯ細胞株は、バッチ培養における野生型ＣＨＯと比較して培養液中でより長く生存できることが示されている（Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：６０１〜６１４（２００７））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質生産性を上げるための上記の様々な手法は様々な程度に成功してきた。それでもなお、特に大規模商業生産において、タンパク質産生を上げるための方法を開発する継続的な必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、ＭＤＭ２D300Aを過剰発現する哺乳動物細胞株を培養することを含む、流加哺乳動物細胞培養において細胞生存度を増加させる方法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋを過剰発現する哺乳動物細胞株を培養することを含む、流加哺乳動物細胞培養において細胞生存度を増加させる方法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２D300A及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。
【００１１】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋ及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋ並びに分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。
【００１３】
本発明の別の態様は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の別の態様は、配列番号４に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】Ｂｃｌ−２Δ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図１Ｂ】Ｂｃｌ−２Δ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図２Ａ】Ｂｃｌ−ＸＬ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図２Ｂ】Ｂｃｌ−ＸＬ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図３】Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ−２の同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイルである。Ａ）生細胞密度、Ｂ）積算生細胞密度、Ｃ）カスパーゼ３／７の減少。
【図４Ａ】振盪フラスコバッチ培養でＭＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた細胞株の増殖プロファイル。
【００１６】
トランスフェクションされた宿主は１０１３Ａ。
【図４Ｂ】振盪フラスコバッチ培養でＭＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた細胞株の増殖プロファイル。
【００１７】
トランスフェクションされた宿主はＣ１８３５Ａ。
【図５Ａ】振盪フラスコ流加培養でＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた１０１３Ａ細胞株の増殖プロファイル。Ａ）生細胞密度、Ｂ）％生存度。
【図５Ｂ】振盪フラスコ流加培養でＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた１０１３Ａ細胞株の増殖プロファイル。Ａ）生細胞密度、Ｂ）％生存度。
【図６】流加ＣＨＯ培養中の抗体力価。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特許及び特許出願を含むがそれらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
【００１９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、文脈で明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は１つ以上のポリペプチドへの言及であり、当業者には既知のそれらの等価物を包含する。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「ＭＤＭ２」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２３８３（配列番号１及び２）に示されるポリペプチド配列を有するヒトＭＤＭ２（ＭＤＭ２ ｐ５３結合タンパク質ホモログ）を指す。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「Ｅ１Ｂ１９Ｋ」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００４３２２（配列番号５及び６）に示されるポリペプチド配列を有するヒトＥ１Ｂ１９Ｋタンパク質を指す。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「アポトーシスR遺伝子」は、細胞内で過剰発現すると、トランスフェクションされていない細胞と比べて、細胞死に対する増強された耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を指す。例示のアポトーシスR遺伝子は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｌｃ−ｗ又はＥ１Ｂ１９Ｋ等のＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー、カスパーゼ阻害剤、例えばＸＩＡＰ及びＸＩＡＰΔ等のＩＡＰファミリー（アポトーシス阻害物質）、及び細胞周期の調節に関与するその他のタンパク質、例えばｐ２７及びＭＤＭ２（Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ ２３〜２８（２００４）、Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．Ｓｕｍｍｅｒ ２００２，６１〜６８（２００２）、Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．９７：６０１〜６１４，（２００７））である。細胞死は、例えば生細胞密度（ＶＣＤ）及びパーセント（％）生存度を測定する、及び積算生細胞密度（ＩＶＣＣ）を算出するなど、当該技術分野において周知の方法によって測定することができる。アポトーシスの活性化は、周知の方法を用いてカスパーゼ活性を測定することによって測定することができる。
【００２３】
用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドを形成するためにペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個のアミノ酸未満の小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。ポリペプチドはまた、「タンパク質」とも呼ばれる場合がある。
【００２４】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型的な例である。
【００２５】
用語「相補配列」は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを含む第２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。典型的には、このような「相補配列」は、適切な条件下で第１の単離ポリヌクレオチド配列と組み合わされたときに、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡのような二本鎖のポリヌクレオチド分子を形成することができる。
【００２６】
用語「ベクター」は、生体系内で複製されることができる、又はこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生体系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化信号又は選択マーカーのような因子を含有する。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することのできる生物学的構成成分を利用して再構成された生体系を挙げることができる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
【００２７】
用語「発現ベクター」は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたペプチドの翻訳を命令するために利用することができるベクターを意味する。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「流加細胞培養」は、培養液への増殖制限栄養養基質の供給に基づく細胞培養プロセスを意味する。流加方式は、典型的には、生物反応器中で高細胞密度に達するための生物工業的方法で用いられる。流加細胞培養物の生存度及び最終的には生産性を向上させるために多くの方式が考案されてきた。本発明では、アポトーシスR遺伝子の組み合わせが宿主細胞内で過剰発現される代替的手法が記載される。分泌タンパク質の産生の予想外に高い増加は、ＭＤＭ−２単独の発現は生産性を最高２倍まで増加させ（Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．９７：６０１〜６１４，２００７）、Ｅ１Ｂ１９Ｋの発現は、アポトーシスを阻害しかつ細胞収量を向上させるが、細胞内の分泌タンパク質の産生を増加させない（ＷＯ２００７／１２４１０６Ａ２、Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ）ことを説明している公表された結果を踏まえて、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋの双方を過剰発現するように操作された細胞によって実証された。更に、以下の実施例に記載の研究の間に作成された、Ｅ１Ｂ１９Ｋのみを過剰発現した細胞株は、最適に満たない増殖特性及び低い発現レベルを有した。したがって、本発明は、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋの同時発現による哺乳動物細胞内の分泌タンパク質の産生の有意な利益を実証した。
【００２９】
本発明はまた、本発明の方法において有用な非自然発生的な変異ＭＤＭ２を記載している。
【００３０】
本発明の一実施形態は、１つ以上のアポトーシスR遺伝子を過剰発現する哺乳動物細胞株を培養することと、細胞生存度を評価することとを含む、流加哺乳動物細胞培養における細胞生存度を増加させる方法である。
【００３１】
本発明の方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞培養などの哺乳動物流加細胞培養において生存度を増加させるのに有用である。特に、本発明の方法は、ＣＨＯ細胞培養物の積算生細胞計数（ＩＶＣＣ）を増加させるのに有用である。本発明の方法に有用な細胞株は、１つ以上のアポトーシスR遺伝子を発現する。特に、ＭＤＭ２（配列番号１及び２）、ＭＤＭ２D300A（配列番号３及び４）、Ｅ１Ｂ１９Ｋ（配列番号５及び６）、アベナ（配列番号７及び８）、Ｂｃｌ−ＬＸ（配列番号９及び１０）、Ｂｃｌ−２Δ（配列番号１１及び１２），及びＸＩＡＰΔ（配列番号１３及び１４）をコードする遺伝子を使用することができる。アポトーシスR遺伝子の発現は、当業者に既知のトランスフェクション技術によって達成され得る。作成された細胞株は、ペプチド、ペプチド融合、増殖因子、ホルモン、抗体、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）及び治療、診断又は研究目的に有用なその他のポリペプチド等の目的のタンパク質を発現する生産細胞株の作成のための優れた宿主である。本発明の方法において有用なＣＨＯ細胞株には、ＣＨＯ−Ｋ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）が挙げられる。本発明の方法において有用な骨髄腫株には、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。
【００３２】
本発明において、アポトーシスR遺伝子を過剰発現する細胞株の使用は、これらの細胞株が、対照細胞よりも約２倍高いＩＶＣＣ値に達し、流加培養物の寿命を最大７日増加させ、分泌タンパク質の産生を２〜７倍改善するのを可能にする。このような改善された産生は有意であり、複雑な生物材料の生産コストを安くすることにつながり、同時に、溶解した細胞は生成物を分解するプロテアーゼを放出するので、非生細胞の細胞溶解の不在により優れた品質の生成物を作ることができる。したがって、これらの株は、目的のタンパク質（１つ又は複数）を発現する生産細胞株の成長のための優れた宿主である。例えば、ＭＤＭ２D300Aを過剰発現するＣＨＯ細胞株は、２倍に増加したＩＶＣＣ値に達し、対照細胞株と比べて培養液中で７日長く生存した。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つのアポトーシスR遺伝子及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することと、分泌タンパク質の力価を測定することとを含む、ＣＨＯ流加細胞培養における分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。本発明の方法において特に有用な細胞株は、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋを過剰発現するＣＨＯ細胞、及びＭＤＭ２D300Aのみを過剰発現する細胞株である。本発明の方法においてこれらの細胞株を使用することにより、最大２１日の流加培養において分泌タンパク質の力価が５〜７倍増加した。
【００３４】
細胞内でのタンパク質の過剰発現は、既知の方法によって、一時的に又は安定した発現によってのいずれかで達成され得る（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２nd ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３rd ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）。
【００３５】
本発明はまた、単離された変異ＭＤＭ２ポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを含むベクター、単離された宿主細胞、これらポリヌクレオチドの発現から得られるポリペプチド、本発明のポリペプチドを発現する方法、及び本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、様々な具体的な用途のために使用することができる。本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、変異ＭＤＭ２ポリペプチドをコードし、かつこれらポリペプチドを発現するのに用いることができるので、有用である。変異ＭＤＭ２ポリペプチドは、組み換え技術によって過剰発現されると、又は他の手段によって宿主動物又は組織の中に導入されると、細胞生存度を改善しかつ細胞内の分泌タンパク質の産生を増加させるために使用することができるので、有用である。
【００３６】
本発明の１つの態様は、配列番号３に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドである。配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列は、変異ヒトＭＤＭ２D300Aを含むポリペプチドをコードする。野生型ＭＤＭ２内で同定された推定カスパーゼ切断部位（ＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＣｙｓＬｙｓＬｙｓ）であるＭＤＭ２D300Aは、分解への更なる耐性をＭＤＭ２に付与し、かつ培養中の細胞内のＭＤＭ２レベルを更に増加させるために破壊された。本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成により生成されてよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成されてよい。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを生成する又は得るための技術は、当該技術分野において周知である。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが翻訳されていない配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン及びポリアデニル化シグナルなどの、少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、追加のアミノ酸をコードする追加の配列を含んでもよい。これら追加のポリヌクレオチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するヘキサヒスチジンペプチド（Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：８２１〜２８４（１９８９））又はＨＡペプチドタグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４））などのマーカー又はタグ配列をコードできる。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、配列番号３に示される配列を有する単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持し、ポリヌクレオチドを複製し、又は再構成された生体系を包含する生体系において本発明のベクターによりコードされたポリペプチドの発現を促進するために有用である。ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来のものであってよい。
【００３９】
本発明のベクターは、アジュバント、脂質、緩衝液又は特定用途に適当なその他の賦形剤とともに、微小粒子中に処方されることができる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは典型的に、このようなベクターによってコードされたポリペプチの発現を制御し、調整し、引き起こし又は許容することができる核酸配列因子を含む。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現システムにおけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現システムは、当該技術分野において周知の、細胞に基づく、又は無細胞のシステムであってよい。コードされたポリペプチドの発現に使用するのに好適な核酸配列因子及び親ベクター配列もまた、当該技術分野において周知である。本発明のポリペプチドの発現のために有用な代表的なプラスミド由来発現ベクターは、大腸菌複製起点、ａｐｈ（３’）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、イントロンＡを有するＨＣＭＶ前初期プロモーター、合成ポリＡ配列及びウシ成長ホルモンターミネータを含む。他の代表的なプラスミド由来の発現ベクターは、大腸菌複製起点、ａｎｔ（４’）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、ＨＣＭＶ前初期プロモーター及びＳＶ４０ ｌａｔｅポリＡ配列を含む。
【００４１】
本発明の他の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞、細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌、真菌細胞、例えばクリベロマイセス、サッカロミセス、担子菌、カンジダアルビカンス又はアスペルギルス、昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２及びスポドプテラＳｆ９、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ，ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１、ボーズメラノーマ及び骨髄腫、並びに植物細胞、例えば裸子植物又は被子植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個々の細胞として提供されても、細胞群として提供されてもよい。細胞群は、単離された培養された細胞群、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含んでよい。
【００４２】
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によって行われることができる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２nd ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３rd ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、衝撃導入及び感化が挙げられる。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、配列番号４に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。配列番号４は、Ｄ３００Ａ置換を有する変異型ヒトＭＤＭ２タンパク質を含むポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、自動ペプチド合成機で固相ペプチド合成などの化学合成により生成されてよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に基づく発現システム、小麦胚抽出物に基づく発現システム、及び大腸菌抽出物に基づく発現システムなどのセルフリー発現システムを使用することによって得ることができる。本発明のポリペプチドはまた、容易に単離されるアフィニティ標識されたポリペプチドの組み換え発現などの当該技術分野において周知の技術により、本発明の核酸配列を内包する細胞から発現及び単離することによって得ることもできる。当業者は、本発明のポリペプチドを得るための他の技術を認識するであろう。本発明のポリペプチドは、第２のポリペプチドと融合した本発明のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含むことができる。このような第２のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、プレ−若しくはプロ−又はプレプロ−タンパク質配列、並びに自然発生の、又は一部が自然発生の配列に由来する部分的に合成の配列又は全合成の配列であってよい。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を提供する工程と、配列番号４に示される配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの発現に十分な条件下でこの宿主細胞を培養する工程と、を含むポリペプチドの発現方法である。
【００４５】
宿主細胞は、所与のタイプの宿主細胞を維持し又は増殖させるのに好適な、かつポリペプチドを発現させるために十分なあらゆる条件下で培養されることができる。ポリペプチドの発現に十分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、多くの哺乳動物細胞タイプは、適切に緩衝されたＤＭＥＭ培地を用いて３７℃において好気的に培養することができ、一方、細菌、酵母及び他の細胞タイプは、ＬＢ培地中適切な雰囲気条件下で３７℃にて培養されてよい。
【００４６】
本発明の方法では、ポリペプチドの発現は、当該技術分野において周知の種々の異なる技術を用いて確認することができる。例えば、ＭＤＭ２A300Dの発現は、ウエスタンブロット法又はＭＤＭ２A300Dのカスパーゼに対する阻害能をアッセイすることによって確認することができる。
【００４７】
ここで、以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例では、アポトーシスR遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を、振盪フラスコ培養において、ピーク生細胞密度、寿命、カスパーゼ３／７活性、及び改善された分泌タンパク質の産生に関して分析した。
【００４９】
材料及び方法
細胞培養：
対照細胞株Ｃ１０１３Ａとして設計されたＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、及び対照細胞株Ｃ１８３５として設計されたＣＨＯＫ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）を、３０ｍＭのグルコースを含有し、６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３１３−０２１）で補足されたＣＤ−ＣＨＯ培地（カタログ番号１０７４３−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で培養した。場合によっては、６０ｍＭグルコースなどの様々な濃度を含有する他の動物タンパク質を含まない培地（高濃度グルコース培地と定義される）を用いた。ウシ胎児血清をＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ（カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）から購入した。Ｃｅｄｅｘ細胞自動計数装置（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞培養をモニターした。積算生細胞計数（ＩＶＣＣ、細胞−日数／ｍＬ）を、次の式を用いて算出した。
ＩＶＣＣ（ｄ１）＝［ＶＣＤ（ｄ０）＋ＶＣＤ（ｄ１）］／２＋ＶＣＤ（ｄ０）
（式中、ＶＣＤ＝生細胞密度）
【００５０】
発現ベクター：
Ｂｃｌ−２Δ（配列番号１１）のコード配列は、ＣＭＶプロモーター下でＮｅｏ（登録商標）を有するｐＣＤＮＡ（商標）３．１（＋）ベクターにクローニングされた。Ｂｃｌ−ＸＬ（配列番号９）のコード配列は、ＣＭＶプロモーター下でＺｅｏ（登録商標）を有するｐＣＤＮＡ（商標）３．１（＋）ベクターにクローニングされた。ＭＤＭ２（配列番号３）のコード配列は、ＣＭＶプロモーター下でＮｅｏ（登録商標）を有するｐＣＤＮＡ（商標）３．１（＋）ベクターにクローニングされた。単独で又はアベナ（ＣＭＶプロモーター）とともにＥ１Ｂ−１９Ｋ（ＥＦ−１ａプロモーター）を構成的に発現するように設計されたｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターが記載されている（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９８：８２５〜８４１（２００７））。ＸＩＡＰΔ（ＣＭＶプロモーター）を発現するベクターが記載されている（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７：７０４〜７１６（２００２））。ＭＤＭ２D300A発現ベクターは、ＭＤＭ２発現ベクターからインビトロ突然変異により作成された。モデル抗体（Ａｂ＃１）発現ベクターは、重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをグルタミンシンターゼ（ＧＳ）発現ベクター（研究許可を受けてＬｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫより入手）にクローニングすることによって構築された。
【００５１】
アポトーシスR細胞株の作成：
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株の対数期培養物を、表１に示される様々な組み合わせの発現ベクターでトランスフェクションした。４００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、４００μｇ／ｍＬゲンチシン、又は３００μｇ／ｍＬゼオシンの組み合わせを用いてトランスフェクトーマを選択した。約２００の得られたトランスフェクトーマを２４ウェルプレートに拡大培養し、カスパーゼ３／７活性をＡＰＯ−ＯＮＥアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって判定した。測定は２回、即ち、ａ）アポトーシスを誘発するためにスタウロスポリンで処理した後の増殖期初期（播種後３日まで）、及びｂ）野生型細胞のサブセットがアポトーシスに進行した増殖期後期（播種後１０日まで）に行われた。いずれの場合にもカスパーゼ３／７活性を低減したトランスフェクトーマを更に拡大培養し、上位２〜４つのクローンを振盪フラスコバッチ増殖プロファイル研究に供した。
【００５２】
有望な細胞株は凍結保存された。選択された株の振盪フラスコ培養物を、低減したカスパーゼ３活性に関して、カスパーゼ３特異的蛍光標識抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６８６５２Ｘ／５５０５５７）を用いてフローサイトメトリーによって試験した。選択した細胞株はＣコード化され、細胞バンクに提出された。これら細胞株は、選択剤として使用された抗生物質なしで１０〜１５継代安定性試験を受けた。作成された細胞株が表１に示されている。細胞株の選択セットにおけるそれぞれの導入遺伝子の発現がウエスタンブロット法によって確認された。
【００５３】
【表１】
【００５４】
アポトーシスR細胞株の振盪フラスコ培養：
選択されたアポトーシスR細胞株を、６ｍＭグルタミン及び必要な抗生物質選択剤で補足されたＣＤ−ＣＨＯ培地においてバッチモードで培養した。ＣＤ−ＣＨＯ培地には３０ｍＭグルコースを配合した。加えて、選択されたＡｂ発現細胞株は、６ｍＭグルタミン及び６０ｍＭグルコースで補足された、特別に配合された動物タンパク質を含まない培地で培養された。
【００５５】
カスパーゼ３／７活性アッセイ：
それぞれのクローンの約３×１０5細胞を、２４ウェルプレート中の増殖培地１ｍＬに播種した。播種後４日目（ｄ４）に、約１×１０5細胞を９６ウェルプレートの３つの穴に移した。スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）を添加し、ＡＰＯ−ＯＮＥキット（ＢＤ Ｌａｂｓ）でカスパーゼ３／７活性のアッセイを行う前に、細胞を１６時間インキュベートした。スタウロスポリンを加えなかったことを除き、この手順をｄ１０に繰り返した。この両日に有意に低いカスパーゼ３／７活性を有したクローンを振盪フラスコの中で拡大培養した。選択されたクローンのアポトーシスR性が、フローサイトメトリー分析によって確認された（以下を参照）。
【００５６】
フローサイトメトリーによるアポトーシスRクローンの分析：
対数期培養からの約１×１０6細胞を、それぞれの振盪フラスコから２４ウェルプレートに採取し、スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）とともに１６時間インキュベートし、収集してＰＢＳ中で１回洗浄した。次に、細胞をＣｙｔｏＰｅｒｍ（カタログ番号２０７５ＫＫ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）とともにインキュベートし、これらを固定しかつ透過処理した。ＰＢＳ洗浄後、細胞は、フローサイトメトリーによる分析に供される前に、ＦＩＴＣで標識された抗カスパーゼ３（カタログ番号６８６５４、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）抗体とともにインキュベートされた。
【００５７】
（実施例１）
ＭＤＭ２がＢｃｌ−２Δ発現細胞株に与える影響
Ｂｃｌ−２Δ、ＭＤＭ２及びＸＩＡＰΔを発現するＢＭＸ−１３及びＢＭＸ−３９、並びにＢｃｌ−２Δ及びＸＩＡＰΔを発現する二重トランスフェクトされた細胞株ＢＸ−６１、Ｂｃｌ−２Δのみを発現するＢ−３１、及び対照Ｃ１０１３Ａの増殖プロファイル（ＳＦ／バッチ）を分析した。対照細胞株のピーク生細胞計数（ＶＣＤ）は６×１０ｅ６細胞に達したのに対し、ＢＭＸクローンのピーク生細胞計数は約１１×１０ｅ６細胞／ｍＬに達した。Ｂｃｌ−２Δ及び／又はＸＩＡＰΔを発現する細胞株は中間ＶＣＤを有した（図１Ａ）。ＢＭＸクローンは、Ｂ−３１又はＢＸ−６１と比べてより高い積算生細胞計数（ＩＶＣＣ）を有した。ＢＭＸ−３９のＩＶＣＣは、Ｂ−３１の２３％と比べて、対照より４４％の増加であった。ＸＩＡＰΔは、Ｂｃｌ−２Δとともに用いられると、ＩＶＣＣに対する増加作用を有さなかった（図１Ｂ）。高いＩＶＣＣは、生物反応器中での長期培養における細胞の高い生存度と相関関係があり、生成物の収量増加をもたらす。更に、アポトーシスR宿主細胞株より誘導される生産細胞株から作成される生物医薬品は優れた品質であり得る。細胞株ＢＭＸ−１３及びＢＭＸ−３９は、対照Ｃ１０１３Ａと比べた場合に、カスパーゼ３／７の１０倍及び１６倍の減少をそれぞれ実証し、ＣＨＯ細胞株の遺伝子の抗アポトーシス効果が確認された。Ｂ−３１及びＢＸ−６１はカスパーゼの１２倍及び６倍の減少を有した。
【００５８】
（実施例２）
ＭＤＭ２がＢｃｌ−ＸＬ発現細胞株に与える影響
Ｂｃｌ−ＸＬのみを発現するＢｘ−５１並びに対照細胞株Ｃ１０１３と比較した、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＭＤＭ２、及びＸＩＡＰΔを発現する三重トランスフェクトされたＢｘＭＸ−０１、ＢｘＭＸ１１及びＢｘＭＸ−２５の増殖プロファイルを評価した。対照細胞株のピーク生細胞計数（ＶＣＤ）は６×１０ｅ６細胞／ｍＬに達したのに対し、ＢｘＭＸクローンのピーク生細胞計数は約１２×１０ｅ６細胞／ｍＬに達した（図２Ａ）。Ｂｃｌ−ＸＬを発現する細胞株は中間ＶＣＤを有したのみであった。例えば、細胞株Ｂｘ−５１のピークＶＣＤは１０×１０ｅ６細胞／ｍＬであった。Ｂｘ−５１の１８％と比べると、ＢｘＭＸクローンはＩＶＣＣが対照より３４％増加し、Ｂｘ−５１より高いＩＶＣＣを有した（図２Ｂ）。Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭＤＭ２のみ（ＸＩＡＰΔなし）の同時トランスフェクションは、高いＶＣＤ又は長い寿命を有する細胞株を作成できなかった（データは示されず）。したがって、ＸＩＡＰΔ及びＭＤＭ２は、ＢｘＭＸ−０１、ＢｘＭＸ−１１及びＢｘＭＸ−２５細胞株に見られる高いＩＶＣＣの達成に向けて相乗的に機能すると思われる。カスパーゼ３／７活性は、対照Ｃ１０１３Ａと比べて、ＢｘＭＸ−０１、ＢｘＭＸ−１１及びＢｘＭＸ−２５においてそれぞれ７倍、５倍、及び８倍減少した。
【００５９】
（実施例３）
ＭＤＭ２がＥ１Ｂ１９Ｋ発現細胞株に与える影響
Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ２を発現するＥＭ−１５及びＥＭ−７０の増殖プロファイルを図３に示す。比較の目的で、別の実験では、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びアベナ（ＥＡ−１６７）を発現する細胞株、又はＥ１Ｂ１９Ｋ、アベナ及びＸＩＡＰΔ（ＥＡＸ−１９７）を発現する細胞株、並びにトランスフェクション宿主細胞株を含んだ。対照細胞株のピーク生細胞密度（ＶＣＤ）は６×１０ｅ６細胞／ｍＬに達したのに対し、ＥＭクローンのピーク生細胞密度は約１２×１０ｅ６細胞／ｍＬ〜１６×１０ｅ６細胞／ｍＬに達した。ＥＡ−１６７及びＥＡＸ−１９７の最大ＶＣＤは、１３．６〜１３．９×１０ｅ６細胞／ｍＬであった。ＥＭクローンは、ＥＡ−１６７又はＥＡＸ−１９７と比べて高いＩＶＣＣを有した。ＥＭ−７０は、ＥＡ−１６７の対照より２３％の増加と比べて、ＩＶＣＣの１００％増加を有した。このデータは、Ｅ１Ｂ１９Ｋのみを発現する細胞株はこの実験で観察される高いＩＶＣＣを達成するのに十分でないという事実（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９８：８２５〜８４１（２００７））とともに、ＭＤＭ２がＥＭ−１５及びＥＭ−７０細胞株に見られるＩＶＣＣの増加に貢献したことを示唆する。Ｅ１Ｂ１９Ｋ、ＭＤＭ２、及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションは、と比べて高いＶＣＤ又はＩＶＣＣを有する細胞株を作成できなかった（データは示されず）。ＥＭ−１５及びＥＭ−７０細胞株のカスパーゼ３／７活性は、それぞれ、対照Ｃ１０１３Ａの１３％及び３０％であった。比較のために、ＥＡ−１６７及びＥＡＸ−１９７は、Ｃ１０１３Ａ対照のカスパーゼ３／７活性の３７％及び２０％であった。アポトーシスは、上記のようにフローサイトメトリーによっても確認された。対照細胞の９１％がカスパーゼ３／７陽性であるのに対して、アポトーシスR遺伝子を発現する細胞株内の１〜３０％がカスパーゼ３／７陽性細胞であった。カスパーゼ３／７活性が最も低い細胞株（例えばＢ−３１）は、必ずしも最も高いＩＶＣＣを有さなかった。
【００６０】
（実施例４）
変異ＭＤＭ２のクローニング及び発現
野生型ヒトＭＤＭ２完全長ｃＤＮＡを発現するベクター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９２４２４．１）をＪｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手した。ＭＤＭ２D300A発現ベクターを、変異誘発プライマ５’ｇｃｔｇａａｇａｇｇｇｃｔｔｔ ｇａｔｇｔｇｃｃｇｇｃｔｔｇｔ ａａａａａａａｃｔａｔａｇｔｇ ３’（配列番号１５）を使用してインビトロ突然変異誘発によって作成し、その結果、予測したＭＤＭ２D300Aタンパク質では位置８９９のＡがＣで置換され、アラニンがアスパラギン酸で置換された。突然変異生成はシークエンシングにより確認した。ＭＤＭ２D300AＤＮＡ配列は配列番号３に示され、予測したＭＤＭ２D300Aタンパク質配列は配列番号４に示される。この新しい変異ベクター並びにその野生型カウンターパートを一時的なトランスフェクション又は安定したトランスフェクションに使用した。
【００６１】
ＭＤＭ２D300A及びＭＤＭ２野生型タンパク質はＨｅｋ２９３細胞内で一時的に発現された。ウエスタンブロット法により、野生型ＭＤＭ２と比べて高レベルのＭＤＭ２D300Aが細胞内に存在することが実証され、変異タンパク質は野生型ＭＤＭ２よりもタンパク質分解に対してより耐性があることが示唆された。
【００６２】
（実施例５）
ＭＤＭ２D300A発現細胞株の作成
ＭＤＭ２D300A又は野生型ＭＤＭ２タンパク質を過剰発現する安定細胞株を、実施例１に記載の通りに作成した。２つの宿主細胞株、Ｃ１０１３Ａ及びＣ１８３５Ａ、を使用した。増殖プロファイル研究で使用した細胞株のリストを表２に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
（実施例６）
ＭＤＭ２がＣＨＯＫ１宿主細胞株の寿命及び生存度に与える影響
ＭＤＭ２Ｄ３００Ａ遺伝子を発現するＣ１０１３Ａ由来及びＣ１８３５Ａ由来の細胞株Ｄ６、Ｂ１及びＢ５の増殖プロファイル及び生存度（振盪フラスコ／バッチ）を図４に示す。Ｃｅｎｔｏｃｏｒが所有しているタンパク質を含まない培地を使用すると、Ｃ１０１３Ａ対照細胞株のピーク生細胞密度（ＶＣＤ）は８×１０6細胞／ｍＬであり、Ｃ１８３５Ａ対照細胞株のピーク生細胞密度は５×１０6細胞／ｍＬであった。ＭＤＭ２D300Aを過剰発現する細胞株は、対照細胞株と比べて寿命が長かった。流加培養では、Ｂ１及びＢ５細胞株は最大２０日間培養液中で維持されたのに対し、トランスフェクションされていない宿主細胞並びにＭＤＭ２D300Aでトランスフェクションした後にバルク選択集団から誘導された細胞は、培養の１４日目までに生存度を失った（図５）。
【００６５】
（実施例７）
ＭＤＭ２を過剰発現するＣＨＯ細胞株の安定性
ＭＤＭ２Ｄ３００Ａを過剰発現するＣ１０１３Ａ由来及びＣ１８３５Ａ由来のＣＨＯ細胞株Ｄ６及びＢ５を、選択剤であるゲネチシン（geneticin）を有して及び有さずに１５継代安定性研究に供した。安定性研究の最初と最後に細胞株の増殖曲線研究を行い、ピーク生細胞密度（細胞株安定性を示す）を記録した。ゲネチシンを選択しない培養物及び高い継代数の培養物は同等又は高いＶＣＤを有するので、選択試薬なしで非常に安定していると考えることができる（表３）。
【００６６】
【表３】
【００６７】
（実施例８）
ＭＤＭ２過剰発現宿主細胞株を使用した生産性研究
ＭＤＭ２を過剰発現する細胞株Ａ４及びＭＤＭ２D300Aを過剰発現する細胞株Ｂ１を、組み換え抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターでトランスフェクションした。トランスフェクション混合物を、まず、グルタミンシンセターゼサプリメントと２５μＭ ＭＳＸとを含有するグルタミンを含まない培地を使用してバルク選択した。続いて、個々のクローンを単離するために、混合物をＭｅｔｈｏＣｕｌｔに播いた。トランスフェクション当たり約１００の得られたトランスフェクトーマを２４ウェルプレートに拡大培養し、比濁法によって１４日後の力価を測定した。ＣＮＴＯ３２８を発現するＭＤＭ２及びＭＤＭ２Ｄ３００Ａ細胞株の平均力価は９０ｍｇ／Ｌであり、Ｃ１０１３Ａから誘導されたクローンの平均力価２１．３ｍｇ／Ｌより有意に高かった。
【００６８】
別の実験では、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞をＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクションし、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ２を安定発現する１つのクローンＥＭ７０を組み換え抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターでトランスフェクションした（Ｄｏｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０３：５９２〜６０８（２００９））。トランスフェクション混合物を、まず、グルタミンシンセターゼサプリメントと２５μＭ ＭＳＸとを含有するグルタミンを含まない培地を使用してバルク選択した。比較は、Ｃ１０１３Ａ（対照）、Ｃ１０１３Ｍ、Ｃ１０１３Ｊ、Ｃ１０１３Ｋ、Ａ４、Ｂ５、ＢＭＸ１３を含むいくつかのその他の細胞株。２９日間のバルク選択の後、生存する細胞を振盪フラスコ流加研究に供した。ＥＭ７０はｄ２３に７００ｍｇ／Ｌを超える抗体力価をもたらしたのに対し、残りの細胞株の力価は１００ｍｇ／Ｌを超えなかった（図６）。
【００６９】
ＣＨＯＫ１ＳＶの対数期培養物を、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ２を発現するベクターでトランスフェクションした。２日後に抗生物質選択プロトコルを開始した。２９日までに、トランスフェクションされていない細胞全てが排除されたのに対し、耐抗生物質の細胞（トランスフェクションされた集団）は生き残った。
【００７０】
これら細胞を、振盪フラスコ流加増殖プロファイル研究を実施するのに使用した。サプリメントを含有するＭａｃｈ−１培地に２ｅ５細胞／ｍＬを播種した。２日目から、グルコースとアミノ酸の栄養素混合物を培養物に毎日供給した。細胞数及び力価を毎日測定した。
【００７１】
本発明はここに完全に記述され、添付の本発明の請求項の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲での、本発明に対する多くの変更及び改良をなしうることは、当業者にとり明白である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流加真核細胞培養において分泌タンパク質の生存度及び生産を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞培養物は、適正な翻訳後修飾を伴うタンパク質を産生するその能力により、多くの組換えタンパク質製造方法に選択されるシステムである。製造の需要の増加とともに、生成物の収量を増大させて製造効率を向上させたいという強い動機が存在する。商業的製造方法における生物学的療法剤のグラム／リットル生産レベルの達成は、哺乳動物細胞培養及び技術手法の両方の最適化に依存する。
【０００３】
高密度の培養を特徴とする無タンパク質哺乳動物細胞培養には、細胞死の問題があり、アポトーシスは、典型的な流加生物反応器で最大８０％を占める可能性があり、栄養素及び増殖因子の欠乏、酸素欠乏、毒素蓄積、及び剪断応力などのストレス要因に応答して誘発される（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６２：６３２〜６４０（１９９９））。アポトーシスは、最大生細胞密度を制限し、死滅期の開始を早め、異種タンパク質収量を潜在的に減少させる（Ｃｈｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｉｓｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：７７９〜７９２（２００５）、Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３：２１１〜２２２（２００１），Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：２３０〜２４５（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８５：５８９〜６００（２００４）、Ｍｅｒｃｉｌｌｅ ａｎｄ Ｍａｓｓｉｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．４４：１１４０〜１１５４（１９９４））。
【０００４】
アポトーシスは、細胞内外の両方からのシグナル経路の複雑なネットワークの結果であり、細胞死の最終段階を行うカスパーゼの活性化に至る。哺乳動物細胞培養における長期生産工程中に細胞生存度を維持するために、アポトーシス阻止の様々な方法が用いられてきた（Ａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１７４〜１８０（２００４）；Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：１２４〜１３２（２００３））。増殖因子、加水分解産物、及び制限栄養素の培地補給を介して細胞外環境を変化させることによって、タンパク質生産が増加し、かつアポトーシスが減少した（Ｂｕｒｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３９：２９１〜２９６（２００３）；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４８：５９〜７４（２００５））。細胞内部からのアポトーシスシグナリングカスケードを阻害するために、他の研究者らは化学的及び遺伝子的戦略に取り組んできた（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７：７０４〜７１６（２００２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１：３２９〜３４０（２００３））。研究者らは、癌細胞において増加していることが見出された遺伝子の過剰発現がカスパーゼ活性の上流のアポトーシスを阻害することによって生物反応器内で成長する細胞生存度を延長できることを見出した（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８８〜９５（１９９８）；Ｍｅｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８０：７０６〜７１６（２００２）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１４７〜１５９（２０００）ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１〜４３（２０００））。
【０００５】
ミトコンドリアアポトーシス経路で機能する抗アポトーシス遺伝子は、３つのグループ、即ち、１）経路の初期に作用するもの、例えば、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバー、２）経路の中間で作用してアポトソーム複合体を崩壊する又は阻害するもの、例えば、アベナ、及び３）経路の後期に作用するもの、例えば、カスパーゼ阻害剤、ＸＩＡＰに分類され得る。これら遺伝子の大部分の機能性は、これらを哺乳動物の発現システムで過剰発現させることにより研究されており、場合によっては、それぞれが経路の異なる部位から誘導された２つ以上の遺伝子の複合過剰発現の効果が解明されている。例には、１）ＣＨＯ細胞におけるＢｃｌ−ＸＬ及びＸＩＡＰの欠失変異体（ＸＩＡＰΔ）の相加効果（Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．５：２３０〜２４５（２００３））、２）ＢＨＫ細胞におけるＥ１Ｂ−１９Ｋ及びアベナ（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９８：８２５〜８４１（２００７））、及び３）Ｂｃｌ−ＸＬ、アベナ及びＸＩＡＰΔ（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１：３２９〜３４０（２００３））が挙げられる。
【０００６】
アポトーシスカスケードの主要活性化因子はｐ５３タンパク質である。ｐ５３がアポトーシスを活性化させる１つのメカニズムは、ＢＮＩＰ３などのプロアポトーシスタンパク質のサブセットの増加による（Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２４１５〜２１（１９９８））。したがって、ｐ５３の増加は、アポトーシスを誘発する主な要因の１つであり得る。ｐ５３は、ユビキチン介在性分解経路によってＭＤＭ２を介して細胞で分解され得る（Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ５：３〜８（２００５））。したがって、ＭＤＭ２の過剰発現は、ｐ５３レベルを低下させ、かつ拡大解釈すれば、アポトーシスを阻害する可能性を有する。これまでに、ストレスシグナルの存在下では、ＭＤＭ２を過剰発現するＣＨＯ細胞株は、バッチ培養における野生型ＣＨＯと比較して培養液中でより長く生存できることが示されている（Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：６０１〜６１４（２００７））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質生産性を上げるための上記の様々な手法は様々な程度に成功してきた。それでもなお、特に大規模商業生産において、タンパク質産生を上げるための方法を開発する継続的な必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、ＭＤＭ２D300Aを過剰発現する哺乳動物細胞株を培養することを含む、流加哺乳動物細胞培養において細胞生存度を増加させる方法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋを過剰発現する哺乳動物細胞株を培養することを含む、流加哺乳動物細胞培養において細胞生存度を増加させる方法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２D300A及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。
【００１１】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋ及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋ並びに分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。
【００１３】
本発明の別の態様は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の別の態様は、配列番号４に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】Ｂｃｌ−２Δ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図１Ｂ】Ｂｃｌ−２Δ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図２Ａ】Ｂｃｌ−ＸＬ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図２Ｂ】Ｂｃｌ−ＸＬ、ＭＤＭ−２及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイル。
【図３】Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ−２の同時トランスフェクションから作成された細胞株の増殖プロファイルである。Ａ）生細胞密度、Ｂ）積算生細胞密度、Ｃ）カスパーゼ３／７の減少。
【図４Ａ】振盪フラスコバッチ培養でＭＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた細胞株の増殖プロファイル。
【００１６】
トランスフェクションされた宿主は１０１３Ａ。
【図４Ｂ】振盪フラスコバッチ培養でＭＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた細胞株の増殖プロファイル。
【００１７】
トランスフェクションされた宿主はＣ１８３５Ａ。
【図５Ａ】振盪フラスコ流加培養でＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた１０１３Ａ細胞株の増殖プロファイル。Ａ）生細胞密度、Ｂ）％生存度。
【図５Ｂ】振盪フラスコ流加培養でＤＭ２D300Aがトランスフェクションされた１０１３Ａ細胞株の増殖プロファイル。Ａ）生細胞密度、Ｂ）％生存度。
【図６】流加ＣＨＯ培養中の抗体力価。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
特許及び特許出願を含むがそれらには限定されない全ての刊行文献は、本明細書への参照により、完全に説明されているごとくに、本願に包含される。
【００１９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、文脈で明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」への言及は１つ以上のポリペプチドへの言及であり、当業者には既知のそれらの等価物を包含する。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「ＭＤＭ２」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２３８３（配列番号１及び２）に示されるポリペプチド配列を有するヒトＭＤＭ２（ＭＤＭ２ ｐ５３結合タンパク質ホモログ）を指す。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「Ｅ１Ｂ１９Ｋ」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００４３２２（配列番号５及び６）に示されるポリペプチド配列を有するヒトＥ１Ｂ１９Ｋタンパク質を指す。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「アポトーシスR遺伝子」は、細胞内で過剰発現すると、トランスフェクションされていない細胞と比べて、細胞死に対する増強された耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を指す。例示のアポトーシスR遺伝子は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｌｃ−ｗ又はＥ１Ｂ１９Ｋ等のＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバー、カスパーゼ阻害剤、例えばＸＩＡＰ及びＸＩＡＰΔ等のＩＡＰファミリー（アポトーシス阻害物質）、及び細胞周期の調節に関与するその他のタンパク質、例えばｐ２７及びＭＤＭ２（Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ ２３〜２８（２００４）、Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．Ｓｕｍｍｅｒ ２００２，６１〜６８（２００２）、Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．９７：６０１〜６１４，（２００７））である。細胞死は、例えば生細胞密度（ＶＣＤ）及びパーセント（％）生存度を測定する、及び積算生細胞密度（ＩＶＣＣ）を算出するなど、当該技術分野において周知の方法によって測定することができる。アポトーシスの活性化は、周知の方法を用いてカスパーゼ活性を測定することによって測定することができる。
【００２３】
用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドを形成するためにペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個のアミノ酸未満の小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。ポリペプチドはまた、「タンパク質」とも呼ばれる場合がある。
【００２４】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型的な例である。
【００２５】
用語「相補配列」は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを含む第２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。典型的には、このような「相補配列」は、適切な条件下で第１の単離ポリヌクレオチド配列と組み合わされたときに、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡのような二本鎖のポリヌクレオチド分子を形成することができる。
【００２６】
用語「ベクター」は、生体系内で複製されることができる、又はこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生体系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化信号又は選択マーカーのような因子を含有する。このような生体系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することのできる生物学的構成成分を利用して再構成された生体系を挙げることができる。ベクターを含むポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
【００２７】
用語「発現ベクター」は、生体系又は再構成された生体系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたペプチドの翻訳を命令するために利用することができるベクターを意味する。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「流加細胞培養」は、培養液への増殖制限栄養養基質の供給に基づく細胞培養プロセスを意味する。流加方式は、典型的には、生物反応器中で高細胞密度に達するための生物工業的方法で用いられる。流加細胞培養物の生存度及び最終的には生産性を向上させるために多くの方式が考案されてきた。本発明では、アポトーシスR遺伝子の組み合わせが宿主細胞内で過剰発現される代替的手法が記載される。分泌タンパク質の産生の予想外に高い増加は、ＭＤＭ−２単独の発現は生産性を最高２倍まで増加させ（Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．９７：６０１〜６１４，２００７）、Ｅ１Ｂ１９Ｋの発現は、アポトーシスを阻害しかつ細胞収量を向上させるが、細胞内の分泌タンパク質の産生を増加させない（ＷＯ２００７／１２４１０６Ａ２、Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ）ことを説明している公表された結果を踏まえて、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋの双方を過剰発現するように操作された細胞によって実証された。更に、以下の実施例に記載の研究の間に作成された、Ｅ１Ｂ１９Ｋのみを過剰発現した細胞株は、最適に満たない増殖特性及び低い発現レベルを有した。したがって、本発明は、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋの同時発現による哺乳動物細胞内の分泌タンパク質の産生の有意な利益を実証した。
【００２９】
本発明はまた、本発明の方法において有用な非自然発生的な変異ＭＤＭ２を記載している。
【００３０】
本発明の一実施形態は、１つ以上のアポトーシスR遺伝子を過剰発現する哺乳動物細胞株を培養することと、細胞生存度を評価することとを含む、流加哺乳動物細胞培養における細胞生存度を増加させる方法である。
【００３１】
本発明の方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞培養などの哺乳動物流加細胞培養において生存度を増加させるのに有用である。特に、本発明の方法は、ＣＨＯ細胞培養物の積算生細胞計数（ＩＶＣＣ）を増加させるのに有用である。本発明の方法に有用な細胞株は、１つ以上のアポトーシスR遺伝子を発現する。特に、ＭＤＭ２（配列番号１及び２）、ＭＤＭ２D300A（配列番号３及び４）、Ｅ１Ｂ１９Ｋ（配列番号５及び６）、アベナ（配列番号７及び８）、Ｂｃｌ−ＬＸ（配列番号９及び１０）、Ｂｃｌ−２Δ（配列番号１１及び１２），及びＸＩＡＰΔ（配列番号１３及び１４）をコードする遺伝子を使用することができる。アポトーシスR遺伝子の発現は、当業者に既知のトランスフェクション技術によって達成され得る。作成された細胞株は、ペプチド、ペプチド融合、増殖因子、ホルモン、抗体、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）及び治療、診断又は研究目的に有用なその他のポリペプチド等の目的のタンパク質を発現する生産細胞株の作成のための優れた宿主である。本発明の方法において有用なＣＨＯ細胞株には、ＣＨＯ−Ｋ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）が挙げられる。本発明の方法において有用な骨髄腫株には、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。
【００３２】
本発明において、アポトーシスR遺伝子を過剰発現する細胞株の使用は、これらの細胞株が、対照細胞よりも約２倍高いＩＶＣＣ値に達し、流加培養物の寿命を最大７日増加させ、分泌タンパク質の産生を２〜７倍改善するのを可能にする。このような改善された産生は有意であり、複雑な生物材料の生産コストを安くすることにつながり、同時に、溶解した細胞は生成物を分解するプロテアーゼを放出するので、非生細胞の細胞溶解の不在により優れた品質の生成物を作ることができる。したがって、これらの株は、目的のタンパク質（１つ又は複数）を発現する生産細胞株の成長のための優れた宿主である。例えば、ＭＤＭ２D300Aを過剰発現するＣＨＯ細胞株は、２倍に増加したＩＶＣＣ値に達し、対照細胞株と比べて培養液中で７日長く生存した。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つのアポトーシスR遺伝子及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することと、分泌タンパク質の力価を測定することとを含む、ＣＨＯ流加細胞培養における分泌タンパク質の産生を増加させる方法である。本発明の方法において特に有用な細胞株は、ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋを過剰発現するＣＨＯ細胞、及びＭＤＭ２D300Aのみを過剰発現する細胞株である。本発明の方法においてこれらの細胞株を使用することにより、最大２１日の流加培養において分泌タンパク質の力価が５〜７倍増加した。
【００３４】
細胞内でのタンパク質の過剰発現は、既知の方法によって、一時的に又は安定した発現によってのいずれかで達成され得る（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２nd ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３rd ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）。
【００３５】
本発明はまた、単離された変異ＭＤＭ２ポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを含むベクター、単離された宿主細胞、これらポリヌクレオチドの発現から得られるポリペプチド、本発明のポリペプチドを発現する方法、及び本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、様々な具体的な用途のために使用することができる。本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、変異ＭＤＭ２ポリペプチドをコードし、かつこれらポリペプチドを発現するのに用いることができるので、有用である。変異ＭＤＭ２ポリペプチドは、組み換え技術によって過剰発現されると、又は他の手段によって宿主動物又は組織の中に導入されると、細胞生存度を改善しかつ細胞内の分泌タンパク質の産生を増加させるために使用することができるので、有用である。
【００３６】
本発明の１つの態様は、配列番号３に示される配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドである。配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列は、変異ヒトＭＤＭ２D300Aを含むポリペプチドをコードする。野生型ＭＤＭ２内で同定された推定カスパーゼ切断部位（ＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＣｙｓＬｙｓＬｙｓ）であるＭＤＭ２D300Aは、分解への更なる耐性をＭＤＭ２に付与し、かつ培養中の細胞内のＭＤＭ２レベルを更に増加させるために破壊された。本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成により生成されてよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成されてよい。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを生成する又は得るための技術は、当該技術分野において周知である。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが翻訳されていない配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン及びポリアデニル化シグナルなどの、少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、追加のアミノ酸をコードする追加の配列を含んでもよい。これら追加のポリヌクレオチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するヘキサヒスチジンペプチド（Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：８２１〜２８４（１９８９））又はＨＡペプチドタグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４））などのマーカー又はタグ配列をコードできる。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、配列番号３に示される配列を有する単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持し、ポリヌクレオチドを複製し、又は再構成された生体系を包含する生体系において本発明のベクターによりコードされたポリペプチドの発現を促進するために有用である。ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来のものであってよい。
【００３９】
本発明のベクターは、アジュバント、脂質、緩衝液又は特定用途に適当なその他の賦形剤とともに、微小粒子中に処方されることができる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは典型的に、このようなベクターによってコードされたポリペプチの発現を制御し、調整し、引き起こし又は許容することができる核酸配列因子を含む。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現システムにおけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現システムは、当該技術分野において周知の、細胞に基づく、又は無細胞のシステムであってよい。コードされたポリペプチドの発現に使用するのに好適な核酸配列因子及び親ベクター配列もまた、当該技術分野において周知である。本発明のポリペプチドの発現のために有用な代表的なプラスミド由来発現ベクターは、大腸菌複製起点、ａｐｈ（３’）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、イントロンＡを有するＨＣＭＶ前初期プロモーター、合成ポリＡ配列及びウシ成長ホルモンターミネータを含む。他の代表的なプラスミド由来の発現ベクターは、大腸菌複製起点、ａｎｔ（４’）−１ａカナマイシン耐性遺伝子、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、ＨＣＭＶ前初期プロモーター及びＳＶ４０ ｌａｔｅポリＡ配列を含む。
【００４１】
本発明の他の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞、細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌、真菌細胞、例えばクリベロマイセス、サッカロミセス、担子菌、カンジダアルビカンス又はアスペルギルス、昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２及びスポドプテラＳｆ９、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ，ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１、ボーズメラノーマ及び骨髄腫、並びに植物細胞、例えば裸子植物又は被子植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個々の細胞として提供されても、細胞群として提供されてもよい。細胞群は、単離された培養された細胞群、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含んでよい。
【００４２】
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によって行われることができる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２nd ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３rd ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、衝撃導入及び感化が挙げられる。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、配列番号４に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドである。配列番号４は、Ｄ３００Ａ置換を有する変異型ヒトＭＤＭ２タンパク質を含むポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、自動ペプチド合成機で固相ペプチド合成などの化学合成により生成されてよい。あるいは、本発明のポリペプチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に基づく発現システム、小麦胚抽出物に基づく発現システム、及び大腸菌抽出物に基づく発現システムなどのセルフリー発現システムを使用することによって得ることができる。本発明のポリペプチドはまた、容易に単離されるアフィニティ標識されたポリペプチドの組み換え発現などの当該技術分野において周知の技術により、本発明の核酸配列を内包する細胞から発現及び単離することによって得ることもできる。当業者は、本発明のポリペプチドを得るための他の技術を認識するであろう。本発明のポリペプチドは、第２のポリペプチドと融合した本発明のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含むことができる。このような第２のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、プレ−若しくはプロ−又はプレプロ−タンパク質配列、並びに自然発生の、又は一部が自然発生の配列に由来する部分的に合成の配列又は全合成の配列であってよい。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を提供する工程と、配列番号４に示される配列を含む少なくとも１つのポリペプチドの発現に十分な条件下でこの宿主細胞を培養する工程と、を含むポリペプチドの発現方法である。
【００４５】
宿主細胞は、所与のタイプの宿主細胞を維持し又は増殖させるのに好適な、かつポリペプチドを発現させるために十分なあらゆる条件下で培養されることができる。ポリペプチドの発現に十分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、多くの哺乳動物細胞タイプは、適切に緩衝されたＤＭＥＭ培地を用いて３７℃において好気的に培養することができ、一方、細菌、酵母及び他の細胞タイプは、ＬＢ培地中適切な雰囲気条件下で３７℃にて培養されてよい。
【００４６】
本発明の方法では、ポリペプチドの発現は、当該技術分野において周知の種々の異なる技術を用いて確認することができる。例えば、ＭＤＭ２A300Dの発現は、ウエスタンブロット法又はＭＤＭ２A300Dのカスパーゼに対する阻害能をアッセイすることによって確認することができる。
【００４７】
ここで、以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例では、アポトーシスR遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を、振盪フラスコ培養において、ピーク生細胞密度、寿命、カスパーゼ３／７活性、及び改善された分泌タンパク質の産生に関して分析した。
【００４９】
材料及び方法
細胞培養：
対照細胞株Ｃ１０１３Ａとして設計されたＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、及び対照細胞株Ｃ１８３５として設計されたＣＨＯＫ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）を、３０ｍＭのグルコースを含有し、６ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３１３−０２１）で補足されたＣＤ−ＣＨＯ培地（カタログ番号１０７４３−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で培養した。場合によっては、６０ｍＭグルコースなどの様々な濃度を含有する他の動物タンパク質を含まない培地（高濃度グルコース培地と定義される）を用いた。ウシ胎児血清をＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ（カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）から購入した。Ｃｅｄｅｘ細胞自動計数装置（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞培養をモニターした。積算生細胞計数（ＩＶＣＣ、細胞−日数／ｍＬ）を、次の式を用いて算出した。
ＩＶＣＣ（ｄ１）＝［ＶＣＤ（ｄ０）＋ＶＣＤ（ｄ１）］／２＋ＶＣＤ（ｄ０）
（式中、ＶＣＤ＝生細胞密度）
【００５０】
発現ベクター：
Ｂｃｌ−２Δ（配列番号１１）のコード配列は、ＣＭＶプロモーター下でＮｅｏ（登録商標）を有するｐＣＤＮＡ（商標）３．１（＋）ベクターにクローニングされた。Ｂｃｌ−ＸＬ（配列番号９）のコード配列は、ＣＭＶプロモーター下でＺｅｏ（登録商標）を有するｐＣＤＮＡ（商標）３．１（＋）ベクターにクローニングされた。ＭＤＭ２（配列番号３）のコード配列は、ＣＭＶプロモーター下でＮｅｏ（登録商標）を有するｐＣＤＮＡ（商標）３．１（＋）ベクターにクローニングされた。単独で又はアベナ（ＣＭＶプロモーター）とともにＥ１Ｂ−１９Ｋ（ＥＦ−１ａプロモーター）を構成的に発現するように設計されたｐＢＵＤＣＥ４．１ベクターが記載されている（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９８：８２５〜８４１（２００７））。ＸＩＡＰΔ（ＣＭＶプロモーター）を発現するベクターが記載されている（Ｓａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７：７０４〜７１６（２００２））。ＭＤＭ２D300A発現ベクターは、ＭＤＭ２発現ベクターからインビトロ突然変異により作成された。モデル抗体（Ａｂ＃１）発現ベクターは、重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡをグルタミンシンターゼ（ＧＳ）発現ベクター（研究許可を受けてＬｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫより入手）にクローニングすることによって構築された。
【００５１】
アポトーシスR細胞株の作成：
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株の対数期培養物を、表１に示される様々な組み合わせの発現ベクターでトランスフェクションした。４００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、４００μｇ／ｍＬゲンチシン、又は３００μｇ／ｍＬゼオシンの組み合わせを用いてトランスフェクトーマを選択した。約２００の得られたトランスフェクトーマを２４ウェルプレートに拡大培養し、カスパーゼ３／７活性をＡＰＯ−ＯＮＥアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって判定した。測定は２回、即ち、ａ）アポトーシスを誘発するためにスタウロスポリンで処理した後の増殖期初期（播種後３日まで）、及びｂ）野生型細胞のサブセットがアポトーシスに進行した増殖期後期（播種後１０日まで）に行われた。いずれの場合にもカスパーゼ３／７活性を低減したトランスフェクトーマを更に拡大培養し、上位２〜４つのクローンを振盪フラスコバッチ増殖プロファイル研究に供した。
【００５２】
有望な細胞株は凍結保存された。選択された株の振盪フラスコ培養物を、低減したカスパーゼ３活性に関して、カスパーゼ３特異的蛍光標識抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６８６５２Ｘ／５５０５５７）を用いてフローサイトメトリーによって試験した。選択した細胞株はＣコード化され、細胞バンクに提出された。これら細胞株は、選択剤として使用された抗生物質なしで１０〜１５継代安定性試験を受けた。作成された細胞株が表１に示されている。細胞株の選択セットにおけるそれぞれの導入遺伝子の発現がウエスタンブロット法によって確認された。
【００５３】
【表１】
【００５４】
アポトーシスR細胞株の振盪フラスコ培養：
選択されたアポトーシスR細胞株を、６ｍＭグルタミン及び必要な抗生物質選択剤で補足されたＣＤ−ＣＨＯ培地においてバッチモードで培養した。ＣＤ−ＣＨＯ培地には３０ｍＭグルコースを配合した。加えて、選択されたＡｂ発現細胞株は、６ｍＭグルタミン及び６０ｍＭグルコースで補足された、特別に配合された動物タンパク質を含まない培地で培養された。
【００５５】
カスパーゼ３／７活性アッセイ：
それぞれのクローンの約３×１０5細胞を、２４ウェルプレート中の増殖培地１ｍＬに播種した。播種後４日目（ｄ４）に、約１×１０5細胞を９６ウェルプレートの３つの穴に移した。スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）を添加し、ＡＰＯ−ＯＮＥキット（ＢＤ Ｌａｂｓ）でカスパーゼ３／７活性のアッセイを行う前に、細胞を１６時間インキュベートした。スタウロスポリンを加えなかったことを除き、この手順をｄ１０に繰り返した。この両日に有意に低いカスパーゼ３／７活性を有したクローンを振盪フラスコの中で拡大培養した。選択されたクローンのアポトーシスR性が、フローサイトメトリー分析によって確認された（以下を参照）。
【００５６】
フローサイトメトリーによるアポトーシスRクローンの分析：
対数期培養からの約１×１０6細胞を、それぞれの振盪フラスコから２４ウェルプレートに採取し、スタウロスポリン（２μＭ ｆｃ）とともに１６時間インキュベートし、収集してＰＢＳ中で１回洗浄した。次に、細胞をＣｙｔｏＰｅｒｍ（カタログ番号２０７５ＫＫ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）とともにインキュベートし、これらを固定しかつ透過処理した。ＰＢＳ洗浄後、細胞は、フローサイトメトリーによる分析に供される前に、ＦＩＴＣで標識された抗カスパーゼ３（カタログ番号６８６５４、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）抗体とともにインキュベートされた。
【００５７】
（実施例１）
ＭＤＭ２がＢｃｌ−２Δ発現細胞株に与える影響
Ｂｃｌ−２Δ、ＭＤＭ２及びＸＩＡＰΔを発現するＢＭＸ−１３及びＢＭＸ−３９、並びにＢｃｌ−２Δ及びＸＩＡＰΔを発現する二重トランスフェクトされた細胞株ＢＸ−６１、Ｂｃｌ−２Δのみを発現するＢ−３１、及び対照Ｃ１０１３Ａの増殖プロファイル（ＳＦ／バッチ）を分析した。対照細胞株のピーク生細胞計数（ＶＣＤ）は６×１０ｅ６細胞に達したのに対し、ＢＭＸクローンのピーク生細胞計数は約１１×１０ｅ６細胞／ｍＬに達した。Ｂｃｌ−２Δ及び／又はＸＩＡＰΔを発現する細胞株は中間ＶＣＤを有した（図１Ａ）。ＢＭＸクローンは、Ｂ−３１又はＢＸ−６１と比べてより高い積算生細胞計数（ＩＶＣＣ）を有した。ＢＭＸ−３９のＩＶＣＣは、Ｂ−３１の２３％と比べて、対照より４４％の増加であった。ＸＩＡＰΔは、Ｂｃｌ−２Δとともに用いられると、ＩＶＣＣに対する増加作用を有さなかった（図１Ｂ）。高いＩＶＣＣは、生物反応器中での長期培養における細胞の高い生存度と相関関係があり、生成物の収量増加をもたらす。更に、アポトーシスR宿主細胞株より誘導される生産細胞株から作成される生物医薬品は優れた品質であり得る。細胞株ＢＭＸ−１３及びＢＭＸ−３９は、対照Ｃ１０１３Ａと比べた場合に、カスパーゼ３／７の１０倍及び１６倍の減少をそれぞれ実証し、ＣＨＯ細胞株の遺伝子の抗アポトーシス効果が確認された。Ｂ−３１及びＢＸ−６１はカスパーゼの１２倍及び６倍の減少を有した。
【００５８】
（実施例２）
ＭＤＭ２がＢｃｌ−ＸＬ発現細胞株に与える影響
Ｂｃｌ−ＸＬのみを発現するＢｘ−５１並びに対照細胞株Ｃ１０１３と比較した、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＭＤＭ２、及びＸＩＡＰΔを発現する三重トランスフェクトされたＢｘＭＸ−０１、ＢｘＭＸ１１及びＢｘＭＸ−２５の増殖プロファイルを評価した。対照細胞株のピーク生細胞計数（ＶＣＤ）は６×１０ｅ６細胞／ｍＬに達したのに対し、ＢｘＭＸクローンのピーク生細胞計数は約１２×１０ｅ６細胞／ｍＬに達した（図２Ａ）。Ｂｃｌ−ＸＬを発現する細胞株は中間ＶＣＤを有したのみであった。例えば、細胞株Ｂｘ−５１のピークＶＣＤは１０×１０ｅ６細胞／ｍＬであった。Ｂｘ−５１の１８％と比べると、ＢｘＭＸクローンはＩＶＣＣが対照より３４％増加し、Ｂｘ−５１より高いＩＶＣＣを有した（図２Ｂ）。Ｂｃｌ−ＸＬ及びＭＤＭ２のみ（ＸＩＡＰΔなし）の同時トランスフェクションは、高いＶＣＤ又は長い寿命を有する細胞株を作成できなかった（データは示されず）。したがって、ＸＩＡＰΔ及びＭＤＭ２は、ＢｘＭＸ−０１、ＢｘＭＸ−１１及びＢｘＭＸ−２５細胞株に見られる高いＩＶＣＣの達成に向けて相乗的に機能すると思われる。カスパーゼ３／７活性は、対照Ｃ１０１３Ａと比べて、ＢｘＭＸ−０１、ＢｘＭＸ−１１及びＢｘＭＸ−２５においてそれぞれ７倍、５倍、及び８倍減少した。
【００５９】
（実施例３）
ＭＤＭ２がＥ１Ｂ１９Ｋ発現細胞株に与える影響
Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ２を発現するＥＭ−１５及びＥＭ−７０の増殖プロファイルを図３に示す。比較の目的で、別の実験では、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びアベナ（ＥＡ−１６７）を発現する細胞株、又はＥ１Ｂ１９Ｋ、アベナ及びＸＩＡＰΔ（ＥＡＸ−１９７）を発現する細胞株、並びにトランスフェクション宿主細胞株を含んだ。対照細胞株のピーク生細胞密度（ＶＣＤ）は６×１０ｅ６細胞／ｍＬに達したのに対し、ＥＭクローンのピーク生細胞密度は約１２×１０ｅ６細胞／ｍＬ〜１６×１０ｅ６細胞／ｍＬに達した。ＥＡ−１６７及びＥＡＸ−１９７の最大ＶＣＤは、１３．６〜１３．９×１０ｅ６細胞／ｍＬであった。ＥＭクローンは、ＥＡ−１６７又はＥＡＸ−１９７と比べて高いＩＶＣＣを有した。ＥＭ−７０は、ＥＡ−１６７の対照より２３％の増加と比べて、ＩＶＣＣの１００％増加を有した。このデータは、Ｅ１Ｂ１９Ｋのみを発現する細胞株はこの実験で観察される高いＩＶＣＣを達成するのに十分でないという事実（Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９８：８２５〜８４１（２００７））とともに、ＭＤＭ２がＥＭ−１５及びＥＭ−７０細胞株に見られるＩＶＣＣの増加に貢献したことを示唆する。Ｅ１Ｂ１９Ｋ、ＭＤＭ２、及びＸＩＡＰΔの同時トランスフェクションは、と比べて高いＶＣＤ又はＩＶＣＣを有する細胞株を作成できなかった（データは示されず）。ＥＭ−１５及びＥＭ−７０細胞株のカスパーゼ３／７活性は、それぞれ、対照Ｃ１０１３Ａの１３％及び３０％であった。比較のために、ＥＡ−１６７及びＥＡＸ−１９７は、Ｃ１０１３Ａ対照のカスパーゼ３／７活性の３７％及び２０％であった。アポトーシスは、上記のようにフローサイトメトリーによっても確認された。対照細胞の９１％がカスパーゼ３／７陽性であるのに対して、アポトーシスR遺伝子を発現する細胞株内の１〜３０％がカスパーゼ３／７陽性細胞であった。カスパーゼ３／７活性が最も低い細胞株（例えばＢ−３１）は、必ずしも最も高いＩＶＣＣを有さなかった。
【００６０】
（実施例４）
変異ＭＤＭ２のクローニング及び発現
野生型ヒトＭＤＭ２完全長ｃＤＮＡを発現するベクター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９２４２４．１）をＪｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手した。ＭＤＭ２D300A発現ベクターを、変異誘発プライマ５’ｇｃｔｇａａｇａｇｇｇｃｔｔｔ ｇａｔｇｔｇｃｃｇｇｃｔｔｇｔ ａａａａａａａｃｔａｔａｇｔｇ ３’（配列番号１５）を使用してインビトロ突然変異誘発によって作成し、その結果、予測したＭＤＭ２D300Aタンパク質では位置８９９のＡがＣで置換され、アラニンがアスパラギン酸で置換された。突然変異生成はシークエンシングにより確認した。ＭＤＭ２D300AＤＮＡ配列は配列番号３に示され、予測したＭＤＭ２D300Aタンパク質配列は配列番号４に示される。この新しい変異ベクター並びにその野生型カウンターパートを一時的なトランスフェクション又は安定したトランスフェクションに使用した。
【００６１】
ＭＤＭ２D300A及びＭＤＭ２野生型タンパク質はＨｅｋ２９３細胞内で一時的に発現された。ウエスタンブロット法により、野生型ＭＤＭ２と比べて高レベルのＭＤＭ２D300Aが細胞内に存在することが実証され、変異タンパク質は野生型ＭＤＭ２よりもタンパク質分解に対してより耐性があることが示唆された。
【００６２】
（実施例５）
ＭＤＭ２D300A発現細胞株の作成
ＭＤＭ２D300A又は野生型ＭＤＭ２タンパク質を過剰発現する安定細胞株を、実施例１に記載の通りに作成した。２つの宿主細胞株、Ｃ１０１３Ａ及びＣ１８３５Ａ、を使用した。増殖プロファイル研究で使用した細胞株のリストを表２に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
（実施例６）
ＭＤＭ２がＣＨＯＫ１宿主細胞株の寿命及び生存度に与える影響
ＭＤＭ２Ｄ３００Ａ遺伝子を発現するＣ１０１３Ａ由来及びＣ１８３５Ａ由来の細胞株Ｄ６、Ｂ１及びＢ５の増殖プロファイル及び生存度（振盪フラスコ／バッチ）を図４に示す。Ｃｅｎｔｏｃｏｒが所有しているタンパク質を含まない培地を使用すると、Ｃ１０１３Ａ対照細胞株のピーク生細胞密度（ＶＣＤ）は８×１０6細胞／ｍＬであり、Ｃ１８３５Ａ対照細胞株のピーク生細胞密度は５×１０6細胞／ｍＬであった。ＭＤＭ２D300Aを過剰発現する細胞株は、対照細胞株と比べて寿命が長かった。流加培養では、Ｂ１及びＢ５細胞株は最大２０日間培養液中で維持されたのに対し、トランスフェクションされていない宿主細胞並びにＭＤＭ２D300Aでトランスフェクションした後にバルク選択集団から誘導された細胞は、培養の１４日目までに生存度を失った（図５）。
【００６５】
（実施例７）
ＭＤＭ２を過剰発現するＣＨＯ細胞株の安定性
ＭＤＭ２Ｄ３００Ａを過剰発現するＣ１０１３Ａ由来及びＣ１８３５Ａ由来のＣＨＯ細胞株Ｄ６及びＢ５を、選択剤であるゲネチシン（geneticin）を有して及び有さずに１５継代安定性研究に供した。安定性研究の最初と最後に細胞株の増殖曲線研究を行い、ピーク生細胞密度（細胞株安定性を示す）を記録した。ゲネチシンを選択しない培養物及び高い継代数の培養物は同等又は高いＶＣＤを有するので、選択試薬なしで非常に安定していると考えることができる（表３）。
【００６６】
【表３】
【００６７】
（実施例８）
ＭＤＭ２過剰発現宿主細胞株を使用した生産性研究
ＭＤＭ２を過剰発現する細胞株Ａ４及びＭＤＭ２D300Aを過剰発現する細胞株Ｂ１を、組み換え抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターでトランスフェクションした。トランスフェクション混合物を、まず、グルタミンシンセターゼサプリメントと２５μＭ ＭＳＸとを含有するグルタミンを含まない培地を使用してバルク選択した。続いて、個々のクローンを単離するために、混合物をＭｅｔｈｏＣｕｌｔに播いた。トランスフェクション当たり約１００の得られたトランスフェクトーマを２４ウェルプレートに拡大培養し、比濁法によって１４日後の力価を測定した。ＣＮＴＯ３２８を発現するＭＤＭ２及びＭＤＭ２Ｄ３００Ａ細胞株の平均力価は９０ｍｇ／Ｌであり、Ｃ１０１３Ａから誘導されたクローンの平均力価２１．３ｍｇ／Ｌより有意に高かった。
【００６８】
別の実験では、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞をＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクションし、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ２を安定発現する１つのクローンＥＭ７０を組み換え抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターでトランスフェクションした（Ｄｏｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０３：５９２〜６０８（２００９））。トランスフェクション混合物を、まず、グルタミンシンセターゼサプリメントと２５μＭ ＭＳＸとを含有するグルタミンを含まない培地を使用してバルク選択した。比較は、Ｃ１０１３Ａ（対照）、Ｃ１０１３Ｍ、Ｃ１０１３Ｊ、Ｃ１０１３Ｋ、Ａ４、Ｂ５、ＢＭＸ１３を含むいくつかのその他の細胞株。２９日間のバルク選択の後、生存する細胞を振盪フラスコ流加研究に供した。ＥＭ７０はｄ２３に７００ｍｇ／Ｌを超える抗体力価をもたらしたのに対し、残りの細胞株の力価は１００ｍｇ／Ｌを超えなかった（図６）。
【００６９】
ＣＨＯＫ１ＳＶの対数期培養物を、Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びＭＤＭ２を発現するベクターでトランスフェクションした。２日後に抗生物質選択プロトコルを開始した。２９日までに、トランスフェクションされていない細胞全てが排除されたのに対し、耐抗生物質の細胞（トランスフェクションされた集団）は生き残った。
【００７０】
これら細胞を、振盪フラスコ流加増殖プロファイル研究を実施するのに使用した。サプリメントを含有するＭａｃｈ−１培地に２ｅ５細胞／ｍＬを播種した。２日目から、グルコースとアミノ酸の栄養素混合物を培養物に毎日供給した。細胞数及び力価を毎日測定した。
【００７１】
本発明はここに完全に記述され、添付の本発明の請求項の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲での、本発明に対する多くの変更及び改良をなしうることは、当業者にとり明白である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＭ２D300Aを過剰発現する哺乳類細胞株を培養することを含む、流加哺乳類細胞培養において細胞生存度を増加させる方法。
【請求項２】
ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋを過剰発現する哺乳類細胞株を培養することを含む、流加哺乳類細胞培養において細胞生存度を増加させる方法。
【請求項３】
前記哺乳類細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類細胞株が、骨髄腫細胞株である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記骨髄腫細胞株が、ＮＳ０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄腫細胞株が、Ｓｐ２／０である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類細胞株が、ハイブリドーマ細胞株である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞生存度が、前記流加細胞培養の１４日目で少なくとも５０％である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞生存度が、前記流加細胞培養の２０日目で少なくとも４０％である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記生細胞密度が、前記流加細胞培養の１５日目で少なくとも４×１０6細胞／ｍＬである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＤＭ２D300A及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において該分泌タンパク質の産生を増加させる方法。
【請求項１４】
ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋ並びに分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において該分泌タンパク質の産生を増加させる方法。
【請求項１５】
ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋ並びに分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において該分泌タンパク質の産生を増加させる方法。
【請求項１６】
前記分泌タンパク質の力価が、少なくとも６００ｍｇ／Ｌである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記分泌タンパク質が、抗体重鎖及び抗体軽鎖である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号３に示される配列又はその相補配列を有する、請求項１９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号３に示される配列を有する単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
発現ベクターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項２１に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号４に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドを発現する方法であって、
ａ．請求項２３に記載の宿主細胞を提供する工程と、
ｂ．配列番号４に示される前記配列を含む前記ポリペプチドの前記発現に十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、を含む方法。
【請求項１】
ＭＤＭ２D300Aを過剰発現する哺乳類細胞株を培養することを含む、流加哺乳類細胞培養において細胞生存度を増加させる方法。
【請求項２】
ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋを過剰発現する哺乳類細胞株を培養することを含む、流加哺乳類細胞培養において細胞生存度を増加させる方法。
【請求項３】
前記哺乳類細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳類細胞株が、骨髄腫細胞株である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記骨髄腫細胞株が、ＮＳ０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄腫細胞株が、Ｓｐ２／０である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類細胞株が、ハイブリドーマ細胞株である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞生存度が、前記流加細胞培養の１４日目で少なくとも５０％である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞生存度が、前記流加細胞培養の２０日目で少なくとも４０％である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記生細胞密度が、前記流加細胞培養の１５日目で少なくとも４×１０6細胞／ｍＬである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＤＭ２D300A及び分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において該分泌タンパク質の産生を増加させる方法。
【請求項１４】
ＭＤＭ２D300A及びＥ１Ｂ１９Ｋ並びに分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において該分泌タンパク質の産生を増加させる方法。
【請求項１５】
ＭＤＭ２及びＥ１Ｂ１９Ｋ並びに分泌タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現するＣＨＯ細胞株を培養することを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）流加細胞培養において該分泌タンパク質の産生を増加させる方法。
【請求項１６】
前記分泌タンパク質の力価が、少なくとも６００ｍｇ／Ｌである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記分泌タンパク質が、抗体重鎖及び抗体軽鎖である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号３に示される配列又はその相補配列を有する、請求項１９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号３に示される配列を有する単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
発現ベクターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項２１に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号４に示される配列を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドを発現する方法であって、
ａ．請求項２３に記載の宿主細胞を提供する工程と、
ｂ．配列番号４に示される前記配列を含む前記ポリペプチドの前記発現に十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、を含む方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５２４１７３（Ｐ２０１１−５２４１７３Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３７２４（Ｐ２０１１−５１３７２４）
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７１８５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２４１７
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７１８５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２４１７
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５０９０８７７５９）セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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