細胞培養器具及び方法
本体と、本体を囲む外壁と、外壁に囲まれた一以上の容器とを備える細胞培養器具であって、該容器の上縁は外壁の上縁より下の位置にある。複数のウェルを備える培養皿で、ある物質を一以上の種類の細胞物質と反応させる方法は、異なる種類の細胞種を培養皿の独立ウェルに移入する段階と、ウェルの間を液体培地で連結する段階と、物質を液体培地に添加する段階からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織培養容器に関する。より詳しくは、多種の細胞及び組織を共培養するための新しく改良された組織培養容器と、創薬及び薬剤開発に応用する生物学研究分野での細胞培養器具の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ディッシュ、プレート、フラスコ、その他の容器などに代表される培養器具は、実験室で多様な用途に幅広く使用されている。通常の使用法では、細胞及び組織培養は、寒天又は培地を使用して行われる。この寒天又は培地はウェル底面を覆う。細胞培養は基礎生化学や細胞生物学分野の研究室において、自然の生物プロセスを解明するために日常的に行われる。近年、細胞培養システムは、創薬及び薬剤開発において、薬剤候補の薬理学・毒物学的効果の試験に使用されている。この作業は一般的に単独培養の試験プロセスである。即ち、一つの種類の細胞をウェル、プレート、フラスコ等の組織培養容器中で適切な培地上で生育させる。
【０００３】
通常の細胞培養プレートは、平底と平底のまわりを囲む垂直の壁を備えるチャンバと取外し可能なカバーからなる。チャンバ内には液体を充填可能であり、カバーは保湿を行ってコンタミネーションを防止する。図１Ａ及び図１Ｂに示す如く、一般に使用されるマルチウェル型プレート（１００）は、６つの同形状のウェル（１１０）を備える。ウェル（１１０）は、例えばインジェクション若しくはブロー成型により一体的に形成される。好適な製造の実施形態は、上部トレイ（１２０）と下部即ち底部トレイ（１３０）とを備えたプレート（１００）を形成することである。上部トレイ（１２０）は各ウェルの容積を規定し、底部トレイ（１３０）は各ウェルの底面を規定する。ウェル（１１０）の深さと、ウェル（１１０）の直径により、各ウェルの液体容量が決定される。典型的な例として、６つのウェルプレートにある各ウェル（１１０）は、直径約０．３５ｃｍ、深さ約２．０ｃｍで、２×３の方形配列に並ぶことが好ましい。
図１Ｂに示すように、細胞（１４０）は各ウェル（１１０）の底面に移入される。液体（１５０）は細胞（１４０）を覆うように添加される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞培養システムは一般には体外システムとして知られ、薬品特性を評価するために創薬及び薬剤開発に幅広く使用されている。例えば、細胞培養システムは薬物の効能、薬物代謝、薬物毒性を評価するために使用される。しかしながら、体外システムでは、生物プロセスの複雑性や相互作用を反映しないため、体内での効果を正確に予測し得ないと認識されている。例えば、培養液中に初代培養肝細胞（hepatocytes）を使用して、ある物質による肝細胞に対する効果が評価できる。しかしながら、体内では、物質は腎臓などの他の臓器により代謝される。結果的な代謝産物は、肝細胞を単独で使用したときには認められない、別の効果を肝細胞に対して与える。このため、細胞の共培養への関心が高まっている。共培養とはある細胞群を別の細胞群が存在する状態で生育することを示す。細胞共培養は、多くの生物学研究分野で適用されている。薬理学、毒物学分野では、がん細胞などの標的細胞を、基準臓器（肝臓など）からの細胞とともに共培養する。これにより基準臓器（肝臓など）で特定の薬剤または薬剤候補を代謝して、標的細胞を修飾した後の、化学物質による標的細胞に対する効果を評価することができる。通常の細胞培養プレートを使用して、共培養方法は実施される。即ち、異なる細胞種を混合したり、２つの細胞種を薄膜の両側での培養に使用する。物理的に混合した場合や薄膜を使用した場合、個別の細胞種の評価は、非常に困難かつ手間のかかる作業となる。したがって、細胞共培養を容易に実施できる新しい細胞培養器具の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一般的な形態では、細胞培養器具は本体、本体から延出する外壁、本体の構成により規定される一以上の容器を備える。各容器の上縁は外壁の上縁よりも下にある。
実施に際し、次のような一又は複数の技術的特徴を備える。例えば、本体は平坦な表面を備え、該本体の平坦な表面に凹部を備え、該凹部は一定量の液体が入るように設計されている。この容器は円筒型の壁面と円形の底面とを備えてもよい。本体の外側の表面は長方形でもよい。外壁の高さは約２０ｍｍがよい。
【０００６】
一実施形態において、各容器は本体に連結したカップを備え、該カップの上縁は外壁の上縁よりも下にある。またある実施形態においては、該容器はコンテナを備え、該コンテナはコンテナ壁を備え、該コンテナ壁は上縁を備える。該コンテナ壁の高さ（上縁の位置）は約４ｍｍである。更にある実施形態においては、各容器は仕切り板を備え、該仕切り板は上壁を備え、外壁で囲まれた空間を分割する。
また他の形態において、マルチウェル型培養皿は平坦な表面を備えた基部を備えるとともに、該複数のウェルと外壁が基部を取り囲む。各ウェルはコンテナ壁を備え、該コンテナ壁の高さは外壁の高さよりも低い。実施形態では上記の一又は複数の技術的特徴を備えてもよく、培養皿が６つのウェルを備えてもよい。
【０００７】
また他の実施形態において、複数の培養容器は管体で接続され、液体を循環させる装置（例、ポンプ）を備える又は備えない。
また他の実施形態において、複数のウェルを備えた培養皿において、ある物質と一以上の種類の細胞物質とを反応させる方法は、異なる種類の細胞物質を培養皿の独立ウェルに移入する段階と、ウェルの間を液体培地で連結する段階と、該液体培地に物質を添加する段階とからなる。様々な実施形態において、添加する物質は化学物質や薬剤で実施されてもよい。
また他の実施形態において、マルチウェル型培養皿における薬剤の代謝方法は、マルチウェル型培養皿の独立ウェル中に異なる種類の細胞物質を移入する段階と、独立ウェル間を液体培地で連結する段階と、薬剤を液体培地に添加する段階とからなる。
実施形態には、以下に示す特徴又は上記の特徴のいずれかを一又は複数備えてもよい。例えば、細胞物質は肝臓、腎臓、脾臓、肺細胞など培養可能な細胞及び／又は組織片、組織分画でもよい。
【０００８】
また他の実施形態において、６つのウェルを備えた本体と６つのウェルを囲む壁からなる細胞培養皿における薬剤の代謝方法は、６つのウェルのうち腎臓細胞を第一のウェルに移入する段階と、肝細胞を第二のウェルに移入する段階と、心臓細胞を第三のウェルに移入する段階と、肺細胞を第四のウェルに移入する段階と、脾臓細胞を第五のウェルに移入する段階と、脳細胞を第六のウェルに移入する段階と、培養皿を液体培地で充填して液体で６つのウェルの間を連結する段階と、薬剤を液体培地へ添加する段階とからなる。
また他の実施形態において、独立ウェルにおいて異なる細胞を共培養する方法は、各ウェルについて液体培地をあふれる程度に充填し、ウェル間を相互に液体で連結し、各ウェルにある、異なった細胞を、液体培地を介して反応させる段階からなる。
また該方法は多様な実施形態を備えてもよい。例えば、独立ウェル中に入れる、異なった細胞は第一ウェル中に肝細胞、第二ウェル中に腎臓細胞、第三ウェル中に心臓細胞、第四ウェル中に脾臓細胞、第五ウェル中に脳細胞、第六ウェル中に肺細胞を入れる。他の実施形態においては、各ウェルに入れる異なる細胞は、第一、第二、第三ウェル中に肝細胞、第四、第五、第六ウェル中に心臓細胞となる。更に他の実施形態においては、該方法は、独立ウェルにある異なる細胞が同一の物質に接触するように、その物質を共通液体培地に加える段階からなる。
【０００９】
また他の実施形態において、独立ウェルを備える培養皿において安全性及び薬剤の効能を試験する方法は、ある生物体の異なる細胞を培養皿の独立ウェルに移入する段階と、有害物質を別の独立ウェルに移入する段階と、独立ウェルを液体培地で連結する段階と、薬剤を液体培地に投与する段階とからなる。
該方法は、以下に示す特徴又は上記の特徴のいずれかを一又は複数備えてもよい。例えば、該方法は生物体の異なる複数の細胞が薬剤の投与によって害を受けるかを判定する段階と、有害物質が薬剤の投与によって減少するかを判定する段階と、及び／又は生物体の異なる複数の細胞が害を受けず、有害物質が減少しない場合は、薬剤の投与を増加させる段階とからなる。
有害物質は、腫瘍細胞でもよい。また薬剤は抗腫瘍剤でもよい。生物体の異なる複数の細胞は、人体の肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、及び／又は脳細胞でもよい。
該方法は、薬剤が生物体の異なる細胞に対して有害となるまで薬剤投与量を増加させる段階と、生物体の異なる細胞が害される投与量を有害投与レベルとして定める段階とからなる。該方法はまた、有害物質の効果が減少するまで薬剤投与量を増加させる段階と、有害物質の効果が減少する投与量を有効投与レベルとして定める段階とからなる。
有害物質は、コレステロールでもよい。薬剤は抗コレステロール剤でもよい。異なる細胞は肝細胞でもよい。別の実施形態において、有害物質はがん細胞で、薬剤は抗がん剤であってもよい。尚、抗がん剤は一定の投与量を超えると、望ましくない毒性をもつ。
【００１０】
また他の実施形態において、マルチウェル型培養皿における細胞共培養方法には、マルチウェル型培養皿の第一ウェル内で第一細胞種を培養する段階と、マルチウェル型培養皿の第二ウェル内で第二細胞種を培養する段階とからなる。第二ウェルで培養される細胞は、第一細胞種の生育を促進する代謝を提供してもよい。
また他の実施形態において、第一細胞種が第二細胞種の生育を促進する機能を有するかを評価する方法は、第一ウェル内で第一細胞種を培養する段階と、第二ウェル内で第二細胞種を培養する段階と、第一ウェルと第二ウェルとを液体で連結する段階と、第一細胞種による第二細胞種の生育に対する影響を検討する段階とからなる。
【発明の効果】
【００１１】
細胞培養器具は多種の細胞種を物理的に独立して共培養する有用な方法を提供する。これにより、共培養後の細胞種を、共培養に用いた細胞がない状態で、個別に評価することができる。
本発明による器具は、異なる条件下の独立ウェル内で細胞培養を可能とする。異なる条件とは例えば、異なる基質、異なる培地、異なる細胞種などがあげられる。続いてこれらの要素は、異なるウェル間を、共通培地を介して相互に反応する。統合した培養液として共通培地で培養した後、その培地は除去される。その後各ウェルは個別に特定の操作方法により扱われる。操作方法として例えば、特定の生化学物質を測定するための洗浄剤での溶解や、又は形態評価のための固定や染色があげられる。
【００１２】
該方法において上記に説明した如く、実際は、異なる臓器（例えば、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、神経、血管内膜細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、虹彩細胞、がん細胞）からの多種の一次細胞の培養に適用される。個別の細胞種の定着と液体培地が充填されたプレートは、あらゆる動物の生体内をあらわす実験モデルとなる。培養器具の別の適用例は、ある物質による多種の細胞種に対する影響を評価することである。創薬や薬剤開発において、この培養システムが、多種の臓器細胞による新規薬剤又は薬剤候補の代謝又は多種の臓器細胞の機能及び実行可能性に対する、薬剤又は薬剤候補による影響を評価するために使用されてもよい。この適用例は、多種の細胞からの細胞を腫瘍細胞とともに培養し、続いて抗がん物質で共培養処理を行い、がん細胞に対する毒性と比較して各臓器の細胞に対する抗がん物質の毒性を評価し、抗がん物質の治療指数を評価する。つまり、各プレートはあらゆる動物の抗がん物質での治療をシミュレートし、続いて各臓器の試験が行われる。多種の腫瘍細胞種も、被検薬剤及び薬剤候補による異なる種類の腫瘍細胞に対する効能を評価するために使用されてもよい。
【００１３】
本発明による器具は、物理的に複数の細胞種を混合することなく、他の細胞種からの外的要因が必要な細胞培養に活用される。異なるタイプの細胞は異なるウェル内に移入され、培地で覆うことで代謝及び／又は分泌される生体分子の交換を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図面中の符号は、参照の便宜上、詳細な記載中の番号と対応する。
本発明の実施形態における器具（２００）（３００）（４００）について、図２Ａ乃至５Ｂ及び図１０に示す。器具（２００）（３００）（４００）はそれぞれ内部で一つの細胞種を培養可能なマルチウェルを備えるが、複数のウェル中の細胞が一つの共通培地を共有するように、各ウェルは液体培地であふれる程度に充填されてもよい。これを実施するには、各ウェルをプレート内部にくぼみとして設けたり（図２Ａ、図２Ｂ参照）、プレート内部に短い仕切りを配したり（図３Ａ、図３Ｂ参照）、或いは大きなプレートの内側により小さなインサートを配する（図４Ａ、図４Ｂ参照）構成とする。本発明は、一つのプレートに対してウェルの数は幾つでもよく、どのようなマルチウェルの型式にも適用可能である。
【００１５】
図２Ａ及び図２Ｂによると、本発明によるマルチウェル型器具（２００）は、本体（２０５）からなり、該本体（２０５）は略平坦な上面（２１０）と、本体（２０５）から延出する外壁（２１５）とからなる。６つのウェル（２２０）は本体（２０５）の上面（２１０）に凹部を設けることにより形成される。各ウェル（２２０）はコンテナ壁（２２５）を備え、該コンテナ壁（２２５）は平坦な上面（２１０）から下方に傾斜するか、上面（２１０）に対して垂直となる。
【００１６】
器具（２００）の全体の寸法は、長さ約１２．６０ｃｍ、幅８．４０ｃｍがよい。本体（２０５）は高さ０．２０ｃｍで、上面（２１０）から上方に延出する外壁（２１５）は約０．１５ｃｍがよい。コンテナ壁（２２５）の高さは、０．０５ｃｍがよい。ウェル（２２０）は規則的な配列で並び、約０．０２ｃｍ間隔を空ける。別の実施形態において（図示せず）、ウェルは円を描くように等間隔に並べられる。この器具（２００）の寸法は説明のための例にすぎない。器具（２００）の寸法は各ウェル（２２０）が液体培地をあふれさせることができ、ウェル（２２０）の間が液体培地を介して連結される一方で、独立ウェル中の細胞が浮遊するのは防止するよう設計する。
【００１７】
図３Ａ及び図３Ｂによると、マルチウェル型器具（３００）は本体（３０５）を備え、該本体（３０５）は外壁（３１５）に囲まれた平坦な上面（３１０）を備える。仕切り板（３２０）は上面（３１０）上に配され、外壁（３１５）に囲まれた空間を区画して、６つのウェル（３２５）へと分割する。外壁（３１５）は上面（３１０）から上方へ０．１５ｃｍ延出する。仕切り板（３２０）の高さは約０．０５ｃｍである。こうして、各ウェル（３２５）の間が液体培地を介して連結されるように、各ウェルに液体培地をあふれる程度に充填させる。
仕切り板（３２０）は上面（３１０）及び外壁（３１５）に接着されてもよい。別の実施形態においては、仕切り板（３２０）は取外し可能でもよい。
【００１８】
図４Ａ及び図４Ｂによると、マルチウェル型器具（４００）は本体（４０５）を備え、該本体（４０５）は外壁（４１５）に囲まれた平坦な上面（４１０）を備える。インサート（４２０）は上面（４１０）上に配されるとともに、各インサートは底面（４２５）とコンテナ壁（４３０）により成型される。コンテナ壁の高さは約０．０５ｃｍであって、外壁の上面（４１０）から延出する外壁の高さは０．１５ｃｍとなる。その他の実施形態において、インサート（４２０）は、上面（３１０）から取外し可能なディッシュ又はトレイとしてもよい。
【００１９】
図２Ａ乃至４Ｂに示すように、マルチウェル型プレートは、細胞培養トレイ（５００）を形成するために統一し、単一の本体（５０５）としてもよい。本体（５０５）はマルチ・コンパートメント若しくはチャンバ（５１０）を備え（図５Ａ及び図５Ｂ参照）、各コンパートメント（５１０）はマルチウェル（５１５）を備える。これにより各コンパートメントで異なる細胞を選択して、異なる液体培地、外因性物質を用いて実験を行うことができる。各コンパートメント（５１０）を囲む隔壁（５２０）は、コンパートメント（５１０）内部の独立ウェル（５１５）のコンテナ壁（５２５）よりも高い。隔壁（５２０）の高さは０．２０ｃｍであり、より大きな本体（５０５）内部の各ウェル（５１５）の高さは０．０４ｃｍである。
【００２０】
器具（２００）乃至（５００）は多種の適当な材料で形成されてもよい。一実施形態として、器具（２００）乃至（５００）は略剛体材料から形成され、不水溶性且つ不透水性で、器具（２００）乃至（５００）で処理される試験で用いられる液体とは化学的に反応しないような代表的な熱可塑性の材料で形成される。先に記載した「略剛体材料」という語は、ある材料がある程度柔らかくてもよいが、略平坦な表面上を変形又はゆがませるような軽度の機械的、温熱的荷重に対して、耐性があるという意味で用いられている。適切な材料とは、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニルからなる。この材料に共重合体、ポリエチレン、ポリエチレン‐アクリロニトリル、ポリプロピレン、塩化ビニル樹脂、及びその類似物を含んでもよいし、含まなくてもよい。ポリスチレンは、非常に特異性の低いタンパク結合を有するという特徴から、細胞培養容器に使用される一般的なポリマーとして使用される。またポリスチレンは、一又は複数の所望のタンパク質を結合した試料（血液、ウィルス及び細菌など）とともに使用するのに適している。ガラスも、細胞培養容器に頻繁に使用される適当な材料であり、使用後に洗浄及び消毒処理を行うことができる。
【００２１】
細胞培養器具は、薬物代謝の試験に使用されてもよい。図６に示すように、薬物代謝を行うことで知られている主要な臓器は、肝臓（６１０）、腸及び腎臓（６２０）であり、心臓（６３０）、脾臓（６４０）、肺（６５０）、血管（６６０）などのその他の臓器も特有の代謝経路を持つ。図７によると、細胞培養器具の使用方法は、多種の細胞種（７００）による外的物質の代謝を評価する。器具を使用して、肝臓、腸、腎臓、心臓、脾臓、肺、脳を含む主要な臓器から採取した細胞は、マルチウェル型プレート内に置かれる。各臓器から採取された細胞は、独立ウェル内に分けて入れられる（手順７１０）。例えば、６ウェル型式では、肝臓細胞はウェル１内に配され、腸細胞はウェル２に、腎臓細胞はウェル３に、心臓細胞はウェル４に、脾臓細胞はウェル５に、肺細胞はウェル６に配される。各細胞種は、異なる付着基質及び培地を使用して培養される（手順７２０）。例えば、肝細胞はコラーゲンで最適に培養され、インスリン及びデキサメタゾンの添加が必要、脾臓細胞は寒天懸濁液で最適に培養される。各細胞種が定着した後、プレートは各ウェルを充填してあふれさせることで「水浸し」状態とすることができ（操作７３０）、別々のウェルに入れられた細胞が共通培地を共有する状態となる。薬剤、薬剤候補、環境汚染物質、天然物などの外的物質を培地に添加してもよい（手順７４０）。そして特定の時間培養される（操作７５０）。培養後、培地は採取され、代謝の程度（親物質の残存量）、代謝的運命（代謝の指標）について、確立された分析手法で検討される（手順７６０）。
【００２２】
図８によれば、細胞培養器具の別の使用方法（８００）は、外的物質による複数種の細胞に対する毒性を評価する。薬剤の毒性の影響を受けやすい主な臓器は、肝臓、腸、腎臓、心臓、脾臓、肺、脳である。この器具を使用して、肝臓、腸、腎臓、心臓、脾臓、肺、脳及び血管からの細胞は、マルチウェル型プレートに移入される（手順８１０）。各臓器からの細胞は、独立ウェル内に入れられる。例えば、８ウェル型式では、肝細胞をウェル１に入れ、腸細胞をウェル２に、腎臓細胞をウェル３に、心臓細胞をウェル４に、脾臓細胞をウェル５に、肺細胞をウェル６に、脳細胞をウェル７に、血管細胞をウェル８に入れる。例えば、６ウェル型式では、肝細胞をウェル１内に入れ、腸細胞をウェル２に、腎臓細胞をウェル３に、心臓細胞をウェル４に、脾臓細胞をウェル５に、肺細胞をウェル６に、脳細胞をウェル７に、血管細胞をウェル８に入れる。各細胞種は、異なる付着基質及び培地を使用して培養される（手順８２０）。例えば、肝細胞はコラーゲンで最適に培養され、インスリン及びデキサメタゾンの添加が必要で、脾臓細胞は寒天懸濁液で最適に培養される。各細胞種が定着した後、プレートは各ウェルを液体培地で充填して「水浸し」状態とすることができ（操作８３０）、複数のウェルにある細胞が共通培地を共有する状態となる。薬剤、薬剤候補、環境汚染物質、天然物などの外的物質が培地に添加される（手順８４０）。その混合物は特定の時間培養される（操作８５０）。培養後、培地は除去され、各ウェルにおいて、各細胞種は形態学的に（例えば顕微鏡で分析する）又は生化学的に（例えば細胞のＡＴＰ含有量の測定用の洗浄剤で溶解する）分析される（手順８６０）。
【００２３】
また細胞培養器具は、薬剤の効能や安全性を評価するために使用されてもよい。創薬においては、無傷細胞が薬剤効能の指標として使用される。例えば、肝細胞は、薬剤によるコレステロール合成に対する影響を評価するために使用され、これにより、新規コレステロール合成阻害物質が、コレステロール値の高い患者のコレステロール値を下げる薬剤として開発される。培養は上記の如く、様々な臓器から採取された細胞に適用することも可能で、これにより様々な臓器におけるコレステロール合成に対する薬剤候補による影響を評価することができる。上記の方法は、培養システムを用いて同時に効能、代謝、毒性を評価するために使用されてもよい。
【００２４】
例えば、高コレステロール値の治療の可能性を有する新規薬剤の「治療指数」は、肝細胞を指標細胞として使用し評価することが可能であって、薬剤による影響や毒性を判定することができる。全ての重要な要素となる細胞種の代謝が存在する中で、効能を測定することができるので、代謝が新規薬剤による効能を低下させる（若しくは増加させる）という生体内の状態をシミュレートできる。
【００２５】
図９によれば、薬剤の治療指数を定める方法（９００）は、マルチウェル型プレートの独立ウェル内に細胞を移入する段階（手順９１０）と、腫瘍細胞などの有害物質を別のウェルに入れる段階（手順９２０）と、ウェルの間を液体培地で連結する段階（手順９３０）と、液体培地に薬剤を添加する段階（手順９４０）とからなる。
安全性は薬剤による多種の臓器に対する影響を判定することで評価される（手順９５０）。薬剤が、臓器細胞のいずれかに悪影響を与える場合、薬剤投与量が安全レベルを超えていると考えられる（手順９６０）。正常な細胞が無傷である場合は、薬剤による有害物質を減少させる影響が検討される。有害物質が減少された場合は、結果は有効投与レベルとして記録される（手順９７０）。そして薬剤の投与を増加させ（手順９８０）、その処理が繰り返される。
【００２６】
器具はハイスループット・スクリーニング（High Throughput Screening、ＨＴＳ）処理中に使用されてもよい。これにより多数の潜在的な薬剤候補を評価することが可能となる。この方法では、実験を行うためにロボットシステムをマルチウェル型プレートとともに使用する。マルチ・コンパートメントを使用することで、共培養された多種の細胞でＨＴＳを、上述の効能、毒性、代謝の評価に実行できる。
更に共培養条件の評価を行う方法がある。細胞種の中には、培養が難しい他の細胞種の培養を促進する機能をもつものがある。これは日常的に、試行錯誤を通じて行われている。ＨＴＳ型式を使用して、異なる細胞種の、培養の難しい細胞種の生育への効果を検討することができる。例えば、どの細胞が培養される肝細胞の分化の維持に最適かを評価するために、肝細胞を、コンパートメント１で細胞種１（例、内皮細胞）とともに、コンパートメント２で細胞種２（例、３ｔ３細胞）とともに共培養するといったように行う。共培養の結果、肝臓細胞の特性を、細胞を共培養する複雑な手順を行うことなく、評価することができる。
【００２７】
図１０に、は薬物吸収の測定に適応した型式の細胞培養器具（１０００）を示す。細胞培養器具（１０００）は本体（１１０５）からなり、該本体（１１０５）は、外壁（１１１５）に囲まれた略平坦な上面（１１１０）を有する。６つのウェル（１１２０）は、本体（１１０５）内の上面（１１１０）内に凹部を設けることで成形される。各ウェル（１１２０）はコンテナ壁（１１２５）を備え、該コンテナ壁（１１２５）は平坦な上面（１１１０）に対して垂直である。
挿入トレイ（１１３０）は、外壁（１１１５）上部にある縁部（１１３５）上に配される。挿入トレイ（１１３０）は、チャンバ（１１３８）を備え、該チャンバ（１１３８）は多孔質薄膜（１１４５）を備え、該多孔質薄膜（１１４５）は外壁（１１１５）内部に配される。
【００２８】
腸細胞（１１４０）は薄膜（１１４５）の近傍のチャンバ（１１３８）の底面に置かれる。器具（１０００）を液体培地で充填すると、液体の水位が薄膜（１１４５）を超えて上昇し、薬剤（１１５０）がチャンバ（１１３８）に添加される。薬剤（１１５０）は薄膜（１１４５）を通過するときに「吸収」され、細胞（１１２０）と反応する。このように腸内の薬剤吸収をシミュレートして、吸収量を測定することができる。
【００２９】
上記装置及び処理に対して、本発明の範囲から逸脱しない範囲で任意の変更を加えてもよい。そのため、上記記載又は図面に示された全ての事項は理解を助けるための説明であり、限定するものではない。例えば、開示された技術が異なる順序で行われた場合及び／又は開示されたシステム内のチャンバが異なる方法で組み合わされた場合及び／又はその他の要素で代替又は補完された場合は、有利な結果が得られる可能性がある。従って、他の実施形態は本願の請求項の範囲内に属する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】従来のマルチウェル型培養プレートの透視図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示す従来のマルチウェル型培養プレートの断面図である。
【図２Ａ】細胞培養器具の透視図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図３Ａ】細胞培養器具の一実施形態の透視図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図４Ａ】細胞培養器具の別の実施形態の透視図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図５Ａ】区画されたチャンバと各チャンバにつき複数のウェルを備えた細胞培養器具の透視図である。
【図５Ｂ】図５Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図６】動物の臓器システムの一部である。
【図７】多種の細胞種による外的物質の代謝を評価するフローチャートである。
【図８】外因性物質による多種の細胞種に対する毒性を評価するフローチャートである。
【図９】薬剤の治療指数を設定するフローチャートである。
【図１０】挿入トレイを備えた細胞培養器具を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織培養容器に関する。より詳しくは、多種の細胞及び組織を共培養するための新しく改良された組織培養容器と、創薬及び薬剤開発に応用する生物学研究分野での細胞培養器具の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ディッシュ、プレート、フラスコ、その他の容器などに代表される培養器具は、実験室で多様な用途に幅広く使用されている。通常の使用法では、細胞及び組織培養は、寒天又は培地を使用して行われる。この寒天又は培地はウェル底面を覆う。細胞培養は基礎生化学や細胞生物学分野の研究室において、自然の生物プロセスを解明するために日常的に行われる。近年、細胞培養システムは、創薬及び薬剤開発において、薬剤候補の薬理学・毒物学的効果の試験に使用されている。この作業は一般的に単独培養の試験プロセスである。即ち、一つの種類の細胞をウェル、プレート、フラスコ等の組織培養容器中で適切な培地上で生育させる。
【０００３】
通常の細胞培養プレートは、平底と平底のまわりを囲む垂直の壁を備えるチャンバと取外し可能なカバーからなる。チャンバ内には液体を充填可能であり、カバーは保湿を行ってコンタミネーションを防止する。図１Ａ及び図１Ｂに示す如く、一般に使用されるマルチウェル型プレート（１００）は、６つの同形状のウェル（１１０）を備える。ウェル（１１０）は、例えばインジェクション若しくはブロー成型により一体的に形成される。好適な製造の実施形態は、上部トレイ（１２０）と下部即ち底部トレイ（１３０）とを備えたプレート（１００）を形成することである。上部トレイ（１２０）は各ウェルの容積を規定し、底部トレイ（１３０）は各ウェルの底面を規定する。ウェル（１１０）の深さと、ウェル（１１０）の直径により、各ウェルの液体容量が決定される。典型的な例として、６つのウェルプレートにある各ウェル（１１０）は、直径約０．３５ｃｍ、深さ約２．０ｃｍで、２×３の方形配列に並ぶことが好ましい。
図１Ｂに示すように、細胞（１４０）は各ウェル（１１０）の底面に移入される。液体（１５０）は細胞（１４０）を覆うように添加される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞培養システムは一般には体外システムとして知られ、薬品特性を評価するために創薬及び薬剤開発に幅広く使用されている。例えば、細胞培養システムは薬物の効能、薬物代謝、薬物毒性を評価するために使用される。しかしながら、体外システムでは、生物プロセスの複雑性や相互作用を反映しないため、体内での効果を正確に予測し得ないと認識されている。例えば、培養液中に初代培養肝細胞（hepatocytes）を使用して、ある物質による肝細胞に対する効果が評価できる。しかしながら、体内では、物質は腎臓などの他の臓器により代謝される。結果的な代謝産物は、肝細胞を単独で使用したときには認められない、別の効果を肝細胞に対して与える。このため、細胞の共培養への関心が高まっている。共培養とはある細胞群を別の細胞群が存在する状態で生育することを示す。細胞共培養は、多くの生物学研究分野で適用されている。薬理学、毒物学分野では、がん細胞などの標的細胞を、基準臓器（肝臓など）からの細胞とともに共培養する。これにより基準臓器（肝臓など）で特定の薬剤または薬剤候補を代謝して、標的細胞を修飾した後の、化学物質による標的細胞に対する効果を評価することができる。通常の細胞培養プレートを使用して、共培養方法は実施される。即ち、異なる細胞種を混合したり、２つの細胞種を薄膜の両側での培養に使用する。物理的に混合した場合や薄膜を使用した場合、個別の細胞種の評価は、非常に困難かつ手間のかかる作業となる。したがって、細胞共培養を容易に実施できる新しい細胞培養器具の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一般的な形態では、細胞培養器具は本体、本体から延出する外壁、本体の構成により規定される一以上の容器を備える。各容器の上縁は外壁の上縁よりも下にある。
実施に際し、次のような一又は複数の技術的特徴を備える。例えば、本体は平坦な表面を備え、該本体の平坦な表面に凹部を備え、該凹部は一定量の液体が入るように設計されている。この容器は円筒型の壁面と円形の底面とを備えてもよい。本体の外側の表面は長方形でもよい。外壁の高さは約２０ｍｍがよい。
【０００６】
一実施形態において、各容器は本体に連結したカップを備え、該カップの上縁は外壁の上縁よりも下にある。またある実施形態においては、該容器はコンテナを備え、該コンテナはコンテナ壁を備え、該コンテナ壁は上縁を備える。該コンテナ壁の高さ（上縁の位置）は約４ｍｍである。更にある実施形態においては、各容器は仕切り板を備え、該仕切り板は上壁を備え、外壁で囲まれた空間を分割する。
また他の形態において、マルチウェル型培養皿は平坦な表面を備えた基部を備えるとともに、該複数のウェルと外壁が基部を取り囲む。各ウェルはコンテナ壁を備え、該コンテナ壁の高さは外壁の高さよりも低い。実施形態では上記の一又は複数の技術的特徴を備えてもよく、培養皿が６つのウェルを備えてもよい。
【０００７】
また他の実施形態において、複数の培養容器は管体で接続され、液体を循環させる装置（例、ポンプ）を備える又は備えない。
また他の実施形態において、複数のウェルを備えた培養皿において、ある物質と一以上の種類の細胞物質とを反応させる方法は、異なる種類の細胞物質を培養皿の独立ウェルに移入する段階と、ウェルの間を液体培地で連結する段階と、該液体培地に物質を添加する段階とからなる。様々な実施形態において、添加する物質は化学物質や薬剤で実施されてもよい。
また他の実施形態において、マルチウェル型培養皿における薬剤の代謝方法は、マルチウェル型培養皿の独立ウェル中に異なる種類の細胞物質を移入する段階と、独立ウェル間を液体培地で連結する段階と、薬剤を液体培地に添加する段階とからなる。
実施形態には、以下に示す特徴又は上記の特徴のいずれかを一又は複数備えてもよい。例えば、細胞物質は肝臓、腎臓、脾臓、肺細胞など培養可能な細胞及び／又は組織片、組織分画でもよい。
【０００８】
また他の実施形態において、６つのウェルを備えた本体と６つのウェルを囲む壁からなる細胞培養皿における薬剤の代謝方法は、６つのウェルのうち腎臓細胞を第一のウェルに移入する段階と、肝細胞を第二のウェルに移入する段階と、心臓細胞を第三のウェルに移入する段階と、肺細胞を第四のウェルに移入する段階と、脾臓細胞を第五のウェルに移入する段階と、脳細胞を第六のウェルに移入する段階と、培養皿を液体培地で充填して液体で６つのウェルの間を連結する段階と、薬剤を液体培地へ添加する段階とからなる。
また他の実施形態において、独立ウェルにおいて異なる細胞を共培養する方法は、各ウェルについて液体培地をあふれる程度に充填し、ウェル間を相互に液体で連結し、各ウェルにある、異なった細胞を、液体培地を介して反応させる段階からなる。
また該方法は多様な実施形態を備えてもよい。例えば、独立ウェル中に入れる、異なった細胞は第一ウェル中に肝細胞、第二ウェル中に腎臓細胞、第三ウェル中に心臓細胞、第四ウェル中に脾臓細胞、第五ウェル中に脳細胞、第六ウェル中に肺細胞を入れる。他の実施形態においては、各ウェルに入れる異なる細胞は、第一、第二、第三ウェル中に肝細胞、第四、第五、第六ウェル中に心臓細胞となる。更に他の実施形態においては、該方法は、独立ウェルにある異なる細胞が同一の物質に接触するように、その物質を共通液体培地に加える段階からなる。
【０００９】
また他の実施形態において、独立ウェルを備える培養皿において安全性及び薬剤の効能を試験する方法は、ある生物体の異なる細胞を培養皿の独立ウェルに移入する段階と、有害物質を別の独立ウェルに移入する段階と、独立ウェルを液体培地で連結する段階と、薬剤を液体培地に投与する段階とからなる。
該方法は、以下に示す特徴又は上記の特徴のいずれかを一又は複数備えてもよい。例えば、該方法は生物体の異なる複数の細胞が薬剤の投与によって害を受けるかを判定する段階と、有害物質が薬剤の投与によって減少するかを判定する段階と、及び／又は生物体の異なる複数の細胞が害を受けず、有害物質が減少しない場合は、薬剤の投与を増加させる段階とからなる。
有害物質は、腫瘍細胞でもよい。また薬剤は抗腫瘍剤でもよい。生物体の異なる複数の細胞は、人体の肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、及び／又は脳細胞でもよい。
該方法は、薬剤が生物体の異なる細胞に対して有害となるまで薬剤投与量を増加させる段階と、生物体の異なる細胞が害される投与量を有害投与レベルとして定める段階とからなる。該方法はまた、有害物質の効果が減少するまで薬剤投与量を増加させる段階と、有害物質の効果が減少する投与量を有効投与レベルとして定める段階とからなる。
有害物質は、コレステロールでもよい。薬剤は抗コレステロール剤でもよい。異なる細胞は肝細胞でもよい。別の実施形態において、有害物質はがん細胞で、薬剤は抗がん剤であってもよい。尚、抗がん剤は一定の投与量を超えると、望ましくない毒性をもつ。
【００１０】
また他の実施形態において、マルチウェル型培養皿における細胞共培養方法には、マルチウェル型培養皿の第一ウェル内で第一細胞種を培養する段階と、マルチウェル型培養皿の第二ウェル内で第二細胞種を培養する段階とからなる。第二ウェルで培養される細胞は、第一細胞種の生育を促進する代謝を提供してもよい。
また他の実施形態において、第一細胞種が第二細胞種の生育を促進する機能を有するかを評価する方法は、第一ウェル内で第一細胞種を培養する段階と、第二ウェル内で第二細胞種を培養する段階と、第一ウェルと第二ウェルとを液体で連結する段階と、第一細胞種による第二細胞種の生育に対する影響を検討する段階とからなる。
【発明の効果】
【００１１】
細胞培養器具は多種の細胞種を物理的に独立して共培養する有用な方法を提供する。これにより、共培養後の細胞種を、共培養に用いた細胞がない状態で、個別に評価することができる。
本発明による器具は、異なる条件下の独立ウェル内で細胞培養を可能とする。異なる条件とは例えば、異なる基質、異なる培地、異なる細胞種などがあげられる。続いてこれらの要素は、異なるウェル間を、共通培地を介して相互に反応する。統合した培養液として共通培地で培養した後、その培地は除去される。その後各ウェルは個別に特定の操作方法により扱われる。操作方法として例えば、特定の生化学物質を測定するための洗浄剤での溶解や、又は形態評価のための固定や染色があげられる。
【００１２】
該方法において上記に説明した如く、実際は、異なる臓器（例えば、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、神経、血管内膜細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、虹彩細胞、がん細胞）からの多種の一次細胞の培養に適用される。個別の細胞種の定着と液体培地が充填されたプレートは、あらゆる動物の生体内をあらわす実験モデルとなる。培養器具の別の適用例は、ある物質による多種の細胞種に対する影響を評価することである。創薬や薬剤開発において、この培養システムが、多種の臓器細胞による新規薬剤又は薬剤候補の代謝又は多種の臓器細胞の機能及び実行可能性に対する、薬剤又は薬剤候補による影響を評価するために使用されてもよい。この適用例は、多種の細胞からの細胞を腫瘍細胞とともに培養し、続いて抗がん物質で共培養処理を行い、がん細胞に対する毒性と比較して各臓器の細胞に対する抗がん物質の毒性を評価し、抗がん物質の治療指数を評価する。つまり、各プレートはあらゆる動物の抗がん物質での治療をシミュレートし、続いて各臓器の試験が行われる。多種の腫瘍細胞種も、被検薬剤及び薬剤候補による異なる種類の腫瘍細胞に対する効能を評価するために使用されてもよい。
【００１３】
本発明による器具は、物理的に複数の細胞種を混合することなく、他の細胞種からの外的要因が必要な細胞培養に活用される。異なるタイプの細胞は異なるウェル内に移入され、培地で覆うことで代謝及び／又は分泌される生体分子の交換を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図面中の符号は、参照の便宜上、詳細な記載中の番号と対応する。
本発明の実施形態における器具（２００）（３００）（４００）について、図２Ａ乃至５Ｂ及び図１０に示す。器具（２００）（３００）（４００）はそれぞれ内部で一つの細胞種を培養可能なマルチウェルを備えるが、複数のウェル中の細胞が一つの共通培地を共有するように、各ウェルは液体培地であふれる程度に充填されてもよい。これを実施するには、各ウェルをプレート内部にくぼみとして設けたり（図２Ａ、図２Ｂ参照）、プレート内部に短い仕切りを配したり（図３Ａ、図３Ｂ参照）、或いは大きなプレートの内側により小さなインサートを配する（図４Ａ、図４Ｂ参照）構成とする。本発明は、一つのプレートに対してウェルの数は幾つでもよく、どのようなマルチウェルの型式にも適用可能である。
【００１５】
図２Ａ及び図２Ｂによると、本発明によるマルチウェル型器具（２００）は、本体（２０５）からなり、該本体（２０５）は略平坦な上面（２１０）と、本体（２０５）から延出する外壁（２１５）とからなる。６つのウェル（２２０）は本体（２０５）の上面（２１０）に凹部を設けることにより形成される。各ウェル（２２０）はコンテナ壁（２２５）を備え、該コンテナ壁（２２５）は平坦な上面（２１０）から下方に傾斜するか、上面（２１０）に対して垂直となる。
【００１６】
器具（２００）の全体の寸法は、長さ約１２．６０ｃｍ、幅８．４０ｃｍがよい。本体（２０５）は高さ０．２０ｃｍで、上面（２１０）から上方に延出する外壁（２１５）は約０．１５ｃｍがよい。コンテナ壁（２２５）の高さは、０．０５ｃｍがよい。ウェル（２２０）は規則的な配列で並び、約０．０２ｃｍ間隔を空ける。別の実施形態において（図示せず）、ウェルは円を描くように等間隔に並べられる。この器具（２００）の寸法は説明のための例にすぎない。器具（２００）の寸法は各ウェル（２２０）が液体培地をあふれさせることができ、ウェル（２２０）の間が液体培地を介して連結される一方で、独立ウェル中の細胞が浮遊するのは防止するよう設計する。
【００１７】
図３Ａ及び図３Ｂによると、マルチウェル型器具（３００）は本体（３０５）を備え、該本体（３０５）は外壁（３１５）に囲まれた平坦な上面（３１０）を備える。仕切り板（３２０）は上面（３１０）上に配され、外壁（３１５）に囲まれた空間を区画して、６つのウェル（３２５）へと分割する。外壁（３１５）は上面（３１０）から上方へ０．１５ｃｍ延出する。仕切り板（３２０）の高さは約０．０５ｃｍである。こうして、各ウェル（３２５）の間が液体培地を介して連結されるように、各ウェルに液体培地をあふれる程度に充填させる。
仕切り板（３２０）は上面（３１０）及び外壁（３１５）に接着されてもよい。別の実施形態においては、仕切り板（３２０）は取外し可能でもよい。
【００１８】
図４Ａ及び図４Ｂによると、マルチウェル型器具（４００）は本体（４０５）を備え、該本体（４０５）は外壁（４１５）に囲まれた平坦な上面（４１０）を備える。インサート（４２０）は上面（４１０）上に配されるとともに、各インサートは底面（４２５）とコンテナ壁（４３０）により成型される。コンテナ壁の高さは約０．０５ｃｍであって、外壁の上面（４１０）から延出する外壁の高さは０．１５ｃｍとなる。その他の実施形態において、インサート（４２０）は、上面（３１０）から取外し可能なディッシュ又はトレイとしてもよい。
【００１９】
図２Ａ乃至４Ｂに示すように、マルチウェル型プレートは、細胞培養トレイ（５００）を形成するために統一し、単一の本体（５０５）としてもよい。本体（５０５）はマルチ・コンパートメント若しくはチャンバ（５１０）を備え（図５Ａ及び図５Ｂ参照）、各コンパートメント（５１０）はマルチウェル（５１５）を備える。これにより各コンパートメントで異なる細胞を選択して、異なる液体培地、外因性物質を用いて実験を行うことができる。各コンパートメント（５１０）を囲む隔壁（５２０）は、コンパートメント（５１０）内部の独立ウェル（５１５）のコンテナ壁（５２５）よりも高い。隔壁（５２０）の高さは０．２０ｃｍであり、より大きな本体（５０５）内部の各ウェル（５１５）の高さは０．０４ｃｍである。
【００２０】
器具（２００）乃至（５００）は多種の適当な材料で形成されてもよい。一実施形態として、器具（２００）乃至（５００）は略剛体材料から形成され、不水溶性且つ不透水性で、器具（２００）乃至（５００）で処理される試験で用いられる液体とは化学的に反応しないような代表的な熱可塑性の材料で形成される。先に記載した「略剛体材料」という語は、ある材料がある程度柔らかくてもよいが、略平坦な表面上を変形又はゆがませるような軽度の機械的、温熱的荷重に対して、耐性があるという意味で用いられている。適切な材料とは、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニルからなる。この材料に共重合体、ポリエチレン、ポリエチレン‐アクリロニトリル、ポリプロピレン、塩化ビニル樹脂、及びその類似物を含んでもよいし、含まなくてもよい。ポリスチレンは、非常に特異性の低いタンパク結合を有するという特徴から、細胞培養容器に使用される一般的なポリマーとして使用される。またポリスチレンは、一又は複数の所望のタンパク質を結合した試料（血液、ウィルス及び細菌など）とともに使用するのに適している。ガラスも、細胞培養容器に頻繁に使用される適当な材料であり、使用後に洗浄及び消毒処理を行うことができる。
【００２１】
細胞培養器具は、薬物代謝の試験に使用されてもよい。図６に示すように、薬物代謝を行うことで知られている主要な臓器は、肝臓（６１０）、腸及び腎臓（６２０）であり、心臓（６３０）、脾臓（６４０）、肺（６５０）、血管（６６０）などのその他の臓器も特有の代謝経路を持つ。図７によると、細胞培養器具の使用方法は、多種の細胞種（７００）による外的物質の代謝を評価する。器具を使用して、肝臓、腸、腎臓、心臓、脾臓、肺、脳を含む主要な臓器から採取した細胞は、マルチウェル型プレート内に置かれる。各臓器から採取された細胞は、独立ウェル内に分けて入れられる（手順７１０）。例えば、６ウェル型式では、肝臓細胞はウェル１内に配され、腸細胞はウェル２に、腎臓細胞はウェル３に、心臓細胞はウェル４に、脾臓細胞はウェル５に、肺細胞はウェル６に配される。各細胞種は、異なる付着基質及び培地を使用して培養される（手順７２０）。例えば、肝細胞はコラーゲンで最適に培養され、インスリン及びデキサメタゾンの添加が必要、脾臓細胞は寒天懸濁液で最適に培養される。各細胞種が定着した後、プレートは各ウェルを充填してあふれさせることで「水浸し」状態とすることができ（操作７３０）、別々のウェルに入れられた細胞が共通培地を共有する状態となる。薬剤、薬剤候補、環境汚染物質、天然物などの外的物質を培地に添加してもよい（手順７４０）。そして特定の時間培養される（操作７５０）。培養後、培地は採取され、代謝の程度（親物質の残存量）、代謝的運命（代謝の指標）について、確立された分析手法で検討される（手順７６０）。
【００２２】
図８によれば、細胞培養器具の別の使用方法（８００）は、外的物質による複数種の細胞に対する毒性を評価する。薬剤の毒性の影響を受けやすい主な臓器は、肝臓、腸、腎臓、心臓、脾臓、肺、脳である。この器具を使用して、肝臓、腸、腎臓、心臓、脾臓、肺、脳及び血管からの細胞は、マルチウェル型プレートに移入される（手順８１０）。各臓器からの細胞は、独立ウェル内に入れられる。例えば、８ウェル型式では、肝細胞をウェル１に入れ、腸細胞をウェル２に、腎臓細胞をウェル３に、心臓細胞をウェル４に、脾臓細胞をウェル５に、肺細胞をウェル６に、脳細胞をウェル７に、血管細胞をウェル８に入れる。例えば、６ウェル型式では、肝細胞をウェル１内に入れ、腸細胞をウェル２に、腎臓細胞をウェル３に、心臓細胞をウェル４に、脾臓細胞をウェル５に、肺細胞をウェル６に、脳細胞をウェル７に、血管細胞をウェル８に入れる。各細胞種は、異なる付着基質及び培地を使用して培養される（手順８２０）。例えば、肝細胞はコラーゲンで最適に培養され、インスリン及びデキサメタゾンの添加が必要で、脾臓細胞は寒天懸濁液で最適に培養される。各細胞種が定着した後、プレートは各ウェルを液体培地で充填して「水浸し」状態とすることができ（操作８３０）、複数のウェルにある細胞が共通培地を共有する状態となる。薬剤、薬剤候補、環境汚染物質、天然物などの外的物質が培地に添加される（手順８４０）。その混合物は特定の時間培養される（操作８５０）。培養後、培地は除去され、各ウェルにおいて、各細胞種は形態学的に（例えば顕微鏡で分析する）又は生化学的に（例えば細胞のＡＴＰ含有量の測定用の洗浄剤で溶解する）分析される（手順８６０）。
【００２３】
また細胞培養器具は、薬剤の効能や安全性を評価するために使用されてもよい。創薬においては、無傷細胞が薬剤効能の指標として使用される。例えば、肝細胞は、薬剤によるコレステロール合成に対する影響を評価するために使用され、これにより、新規コレステロール合成阻害物質が、コレステロール値の高い患者のコレステロール値を下げる薬剤として開発される。培養は上記の如く、様々な臓器から採取された細胞に適用することも可能で、これにより様々な臓器におけるコレステロール合成に対する薬剤候補による影響を評価することができる。上記の方法は、培養システムを用いて同時に効能、代謝、毒性を評価するために使用されてもよい。
【００２４】
例えば、高コレステロール値の治療の可能性を有する新規薬剤の「治療指数」は、肝細胞を指標細胞として使用し評価することが可能であって、薬剤による影響や毒性を判定することができる。全ての重要な要素となる細胞種の代謝が存在する中で、効能を測定することができるので、代謝が新規薬剤による効能を低下させる（若しくは増加させる）という生体内の状態をシミュレートできる。
【００２５】
図９によれば、薬剤の治療指数を定める方法（９００）は、マルチウェル型プレートの独立ウェル内に細胞を移入する段階（手順９１０）と、腫瘍細胞などの有害物質を別のウェルに入れる段階（手順９２０）と、ウェルの間を液体培地で連結する段階（手順９３０）と、液体培地に薬剤を添加する段階（手順９４０）とからなる。
安全性は薬剤による多種の臓器に対する影響を判定することで評価される（手順９５０）。薬剤が、臓器細胞のいずれかに悪影響を与える場合、薬剤投与量が安全レベルを超えていると考えられる（手順９６０）。正常な細胞が無傷である場合は、薬剤による有害物質を減少させる影響が検討される。有害物質が減少された場合は、結果は有効投与レベルとして記録される（手順９７０）。そして薬剤の投与を増加させ（手順９８０）、その処理が繰り返される。
【００２６】
器具はハイスループット・スクリーニング（High Throughput Screening、ＨＴＳ）処理中に使用されてもよい。これにより多数の潜在的な薬剤候補を評価することが可能となる。この方法では、実験を行うためにロボットシステムをマルチウェル型プレートとともに使用する。マルチ・コンパートメントを使用することで、共培養された多種の細胞でＨＴＳを、上述の効能、毒性、代謝の評価に実行できる。
更に共培養条件の評価を行う方法がある。細胞種の中には、培養が難しい他の細胞種の培養を促進する機能をもつものがある。これは日常的に、試行錯誤を通じて行われている。ＨＴＳ型式を使用して、異なる細胞種の、培養の難しい細胞種の生育への効果を検討することができる。例えば、どの細胞が培養される肝細胞の分化の維持に最適かを評価するために、肝細胞を、コンパートメント１で細胞種１（例、内皮細胞）とともに、コンパートメント２で細胞種２（例、３ｔ３細胞）とともに共培養するといったように行う。共培養の結果、肝臓細胞の特性を、細胞を共培養する複雑な手順を行うことなく、評価することができる。
【００２７】
図１０に、は薬物吸収の測定に適応した型式の細胞培養器具（１０００）を示す。細胞培養器具（１０００）は本体（１１０５）からなり、該本体（１１０５）は、外壁（１１１５）に囲まれた略平坦な上面（１１１０）を有する。６つのウェル（１１２０）は、本体（１１０５）内の上面（１１１０）内に凹部を設けることで成形される。各ウェル（１１２０）はコンテナ壁（１１２５）を備え、該コンテナ壁（１１２５）は平坦な上面（１１１０）に対して垂直である。
挿入トレイ（１１３０）は、外壁（１１１５）上部にある縁部（１１３５）上に配される。挿入トレイ（１１３０）は、チャンバ（１１３８）を備え、該チャンバ（１１３８）は多孔質薄膜（１１４５）を備え、該多孔質薄膜（１１４５）は外壁（１１１５）内部に配される。
【００２８】
腸細胞（１１４０）は薄膜（１１４５）の近傍のチャンバ（１１３８）の底面に置かれる。器具（１０００）を液体培地で充填すると、液体の水位が薄膜（１１４５）を超えて上昇し、薬剤（１１５０）がチャンバ（１１３８）に添加される。薬剤（１１５０）は薄膜（１１４５）を通過するときに「吸収」され、細胞（１１２０）と反応する。このように腸内の薬剤吸収をシミュレートして、吸収量を測定することができる。
【００２９】
上記装置及び処理に対して、本発明の範囲から逸脱しない範囲で任意の変更を加えてもよい。そのため、上記記載又は図面に示された全ての事項は理解を助けるための説明であり、限定するものではない。例えば、開示された技術が異なる順序で行われた場合及び／又は開示されたシステム内のチャンバが異なる方法で組み合わされた場合及び／又はその他の要素で代替又は補完された場合は、有利な結果が得られる可能性がある。従って、他の実施形態は本願の請求項の範囲内に属する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】従来のマルチウェル型培養プレートの透視図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示す従来のマルチウェル型培養プレートの断面図である。
【図２Ａ】細胞培養器具の透視図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図３Ａ】細胞培養器具の一実施形態の透視図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図４Ａ】細胞培養器具の別の実施形態の透視図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図５Ａ】区画されたチャンバと各チャンバにつき複数のウェルを備えた細胞培養器具の透視図である。
【図５Ｂ】図５Ａに示す細胞培養器具の断面図である。
【図６】動物の臓器システムの一部である。
【図７】多種の細胞種による外的物質の代謝を評価するフローチャートである。
【図８】外因性物質による多種の細胞種に対する毒性を評価するフローチャートである。
【図９】薬剤の治療指数を設定するフローチャートである。
【図１０】挿入トレイを備えた細胞培養器具を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体が入るように設計された試験槽内に１以上のウェルを有する本体を備えることを特徴とする細胞培養器具。
【請求項２】
前記本体がトレイと複数のコンテナ壁と外壁とからなる細胞培養器具であって、
該トレイは略平坦な表面を有し、
前記複数のコンテナ壁が前記平坦な表面から延出することにより、１以上のウェルを形成し、
前記外壁が前記平坦な表面の周りを囲むことにより、試験槽を形成するとともに、該外壁の高さは前記コンテナ壁の高さよりも高いことを特徴とする請求項１記載の細胞培養器具。
【請求項３】
透水性薄膜を備えるディッシュを備え、該ディッシュは前記外壁上に載置されるように設けられ、前記試験槽内の前記薄膜のある位置を決定することを特徴とする請求項２記載の細胞培養器具。
【請求項４】
前記本体がプレートと壁部からなる細胞培養器具であって、
該プレートは１以上の凹部を備えた略平坦な表面を備え、該凹部はそれぞれ１以上のウェルを形成し、
前記壁部は前記プレートを囲むとともに前記平面状表面より高い位置に設けられ、試験槽を形成することを特徴とする請求項１記載の細胞培養器具。
【請求項５】
透水性薄膜を有するディッシュを備え、該ディッシュは前記壁部の上に載置されるように設けられて、前記試験槽内の前記薄膜のある位置を決定することを特徴とする請求項４記載の細胞培養器具。
【請求項６】
複数のウェルを有するとともに周りを壁部で囲まれた略平坦な表面を備える培養皿の中で、ある物質を１以上の種類の細胞物質と反応させる方法であって、該方法は、
独立ウェルの中で前記１以上の細胞物質を培養する段階と、
前記平坦な表面を上回る高さまで液体培地を添加して、ウェル間を液体で連結する段階と、
前記物質を、前記ウェル間を連結している前記液状培地中に注入する段階とからなることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記細胞物質を、前記液体培地中に注入する段階は、
前記物質を透水性薄膜の第１側面上に移入する段階と、
前記液体培地と接触する前記透水性薄膜の第２側面上の位置を特定する段階からなることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記物質を移入する段階は、前記透水性薄膜の前記第１側面上に腸上皮細胞を移入する段階からなることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記物質を注入する段階は、化学成分を添加する段階からなることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
ウェル内に細胞物質を移入する段階であって、
第１ウェル内に腎臓細胞を、
第２ウェル内に肝細胞を、
第３ウェル内に心臓細胞を、
第４ウェル内に肺細胞を、
第５ウェル内に脳細胞を、
第６ウェル内にがん細胞を移入する段階と、
前記物質を注入する段階であって、液体培地の中に薬剤又は薬剤候補を注入する段階を更に含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記物質を注入する段階は、薬剤及び薬剤候補を投与する段階からなることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤又は薬剤候補が複数種の細胞に対して望ましい効果を持つかどうかを判定する段階を更に含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤又は薬剤候補が望ましい効果をもつかどうかを判定する段階は、前記薬剤又は薬剤候補が、毒性ががん細胞に対して及ぼす抗がん効果を示すかどうかを判定する段階からなることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤又は薬剤候補が複数種の細胞に対して望ましくない効果を持つかどうかを判定する段階を更に含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤又は薬剤候補が望ましくない効果を持つかどうかを判定する段階は、前記薬剤又は薬剤候補が正常な細胞に対して毒性を示すかどうかを判定する段階からなることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記１以上の細胞物質内で前記注入された物質の分布を特定することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１７】
前記１以上の細胞物質との反応により前記注入された物質の生体内変換を測定することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１８】
複数のウェルを備えた１つのトレイの中で、第１細胞種による第２細胞種の特性に対する影響を評価する方法であって、該方法は
前記第１細胞種を第１ウェルの中で、前記第２細胞種を第２ウェルの中でそれぞれ独立して培養する段階と、
第１ウェルと第２ウェルを液体で連結することを特徴とする方法。
【請求項１】
液体が入るように設計された試験槽内に１以上のウェルを有する本体を備えることを特徴とする細胞培養器具。
【請求項２】
前記本体がトレイと複数のコンテナ壁と外壁とからなる細胞培養器具であって、
該トレイは略平坦な表面を有し、
前記複数のコンテナ壁が前記平坦な表面から延出することにより、１以上のウェルを形成し、
前記外壁が前記平坦な表面の周りを囲むことにより、試験槽を形成するとともに、該外壁の高さは前記コンテナ壁の高さよりも高いことを特徴とする請求項１記載の細胞培養器具。
【請求項３】
透水性薄膜を備えるディッシュを備え、該ディッシュは前記外壁上に載置されるように設けられ、前記試験槽内の前記薄膜のある位置を決定することを特徴とする請求項２記載の細胞培養器具。
【請求項４】
前記本体がプレートと壁部からなる細胞培養器具であって、
該プレートは１以上の凹部を備えた略平坦な表面を備え、該凹部はそれぞれ１以上のウェルを形成し、
前記壁部は前記プレートを囲むとともに前記平面状表面より高い位置に設けられ、試験槽を形成することを特徴とする請求項１記載の細胞培養器具。
【請求項５】
透水性薄膜を有するディッシュを備え、該ディッシュは前記壁部の上に載置されるように設けられて、前記試験槽内の前記薄膜のある位置を決定することを特徴とする請求項４記載の細胞培養器具。
【請求項６】
複数のウェルを有するとともに周りを壁部で囲まれた略平坦な表面を備える培養皿の中で、ある物質を１以上の種類の細胞物質と反応させる方法であって、該方法は、
独立ウェルの中で前記１以上の細胞物質を培養する段階と、
前記平坦な表面を上回る高さまで液体培地を添加して、ウェル間を液体で連結する段階と、
前記物質を、前記ウェル間を連結している前記液状培地中に注入する段階とからなることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記細胞物質を、前記液体培地中に注入する段階は、
前記物質を透水性薄膜の第１側面上に移入する段階と、
前記液体培地と接触する前記透水性薄膜の第２側面上の位置を特定する段階からなることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記物質を移入する段階は、前記透水性薄膜の前記第１側面上に腸上皮細胞を移入する段階からなることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記物質を注入する段階は、化学成分を添加する段階からなることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
ウェル内に細胞物質を移入する段階であって、
第１ウェル内に腎臓細胞を、
第２ウェル内に肝細胞を、
第３ウェル内に心臓細胞を、
第４ウェル内に肺細胞を、
第５ウェル内に脳細胞を、
第６ウェル内にがん細胞を移入する段階と、
前記物質を注入する段階であって、液体培地の中に薬剤又は薬剤候補を注入する段階を更に含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記物質を注入する段階は、薬剤及び薬剤候補を投与する段階からなることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤又は薬剤候補が複数種の細胞に対して望ましい効果を持つかどうかを判定する段階を更に含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤又は薬剤候補が望ましい効果をもつかどうかを判定する段階は、前記薬剤又は薬剤候補が、毒性ががん細胞に対して及ぼす抗がん効果を示すかどうかを判定する段階からなることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤又は薬剤候補が複数種の細胞に対して望ましくない効果を持つかどうかを判定する段階を更に含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤又は薬剤候補が望ましくない効果を持つかどうかを判定する段階は、前記薬剤又は薬剤候補が正常な細胞に対して毒性を示すかどうかを判定する段階からなることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記１以上の細胞物質内で前記注入された物質の分布を特定することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１７】
前記１以上の細胞物質との反応により前記注入された物質の生体内変換を測定することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１８】
複数のウェルを備えた１つのトレイの中で、第１細胞種による第２細胞種の特性に対する影響を評価する方法であって、該方法は
前記第１細胞種を第１ウェルの中で、前記第２細胞種を第２ウェルの中でそれぞれ独立して培養する段階と、
第１ウェルと第２ウェルを液体で連結することを特徴とする方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５１０４２９（Ｐ２００７−５１０４２９Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９６４５（Ｐ２００６−５３９６４５）
【出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６７４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４６４
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０６１４１６５０）アドヴァンスド ファーマスーティカル サイエンス インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月５日（２００４．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６７４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４６４
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０６１４１６５０）アドヴァンスド ファーマスーティカル サイエンス インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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