細胞培養担体及びその製造方法
【課題】肝細胞を均一なサイズに凝集化させ、その性質を保持しつつ培養することができ、かつ、凝集化させた細胞塊（スフェロイド）に薬剤を効率よく供給することができる細胞培養担体及びその製造方法を提供する。
【解決手段】上面に複数のウェルが形成されており、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されている肝細胞培養用の細胞培養担体を用いる。
【解決手段】上面に複数のウェルが形成されており、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されている肝細胞培養用の細胞培養担体を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、均一なサイズのヒト正常肝細胞の凝集体を得るのに好適な細胞培養担体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、新規の医薬品候補物質についての代謝・薬効・毒性の評価試験では、ヒト以外の動物が使用されていた。
しかしながら、ヒトと動物とでは、物質の代謝経路が異なる場合があり、動物試験での薬効・毒性評価結果が良好であっても、ヒトでの臨床試験において重大な問題が生じるおそれがあった。
また、１種類の物質の判定において多数の動物種を用いる必要があることから、倫理的な問題が唱えられ、動物実験に替わる方法が求められている。
【０００３】
近年、動物実験の代替法として、ヒト細胞を用いた試験が注目され、実用化に向けた研究が盛んに行われている。特に、生体内に投与された薬物は、肝臓で代謝後、排出されるため、薬効や毒性を調べるために肝細胞を用いたアッセイ法を確立することが重要とされている。
しかしながら、従来の細胞培養技術で培養した細胞は、基材に単層で接着するため、生体内と同様な三次元組織を構築しない。このため、組織細胞を体内から採取して生体外で培養しても、生体内で有していた機能を長時間維持することができないという問題があった。
【０００４】
この問題を解決する手段として、細胞同士を凝集させて細胞凝集塊（スフェロイド）を形成させ、細胞を生体内環境に近づけて培養する方法が注目されている。
なお、本明細書において、細胞同士が凝集して形成する凝集塊をスフェロイドと呼ぶ。
例えば、ヒトＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーを、均一なサイズに効率的に増殖させることができ、培養細胞が付着しにくく、かつ、その未分化状態を保持しつつ細胞を培養可能な細胞培養担体及び細胞の培養方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−３０６９８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に記載されているような培養基材を用いた場合、基材凹部でヒト正常肝細胞スフェロイドが形成されることが確認された。
しかしながら、このスフェロイドを用いて薬剤代謝酵素（ＣＹＰ酵素）の活性試験を行ったところ、ＣＹＰ活性が理論値よりも大きく下がった。この原因を調査したところ、前記基材を構成するセラミックス粒子にＣＹＰ酵素誘導試薬、ＣＹＰ酵素プローブ基質、プローブ基質反応物が吸着し、薬剤代謝酵素の活性試験を阻害しているためであることが分かった。
【０００７】
このように、従来のスフェロイド形成技術では、基材凹部に形成したスフェロイドに、ＣＹＰ酵素誘導試薬やＣＹＰ酵素プローブ基質を効率よく供給することができないため、創薬スクリーニング試験において、上記のような基材を用いることはできなかった。
したがって、均一なサイズのスフェロイドを効率よく形成させ、かつ、スフェロイドに薬剤を効率よく供給することができる培養基材及び培養方法が望まれている。
【０００８】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、肝細胞を均一なサイズに凝集化させ、その性質を保持しつつ培養することができ、かつ、凝集化させた細胞塊（スフェロイド）に薬剤を効率よく供給することができる細胞培養担体及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る細胞培養担体は、上面に複数のウェルが形成されている肝細胞培養用の細胞培養担体であって、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されていることを特徴とする。
このような担体によれば、均一なサイズの肝細胞スフェロイドを形成し、肝機能を長期的に維持可能な肝細胞を提供することができ、かつ、該肝細胞スフェロイドに対して効率的に薬剤を供給することが可能となる。
【００１０】
前記細胞培養担体は、薬剤代謝酵素の活性試験等において、担体への薬剤吸着量を抑制させる観点から、密度が２．４〜４ｇ／ｃｍ3であることが好ましい。
【００１１】
また、前記細胞培養担体の上面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであり、さらに、前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることが好ましい。
前記担体をこのような表面粗さとすることにより、ウェル内で好適にスフェロイドを形成することができる。
【００１２】
また、本発明に係る細胞培養担体の製造方法は、平均粒径が０．４〜１μｍのアルミナ１次粒子を造粒する工程と、前記アルミナ１次粒子により、開口径１００〜４００μｍ、深さ１００〜４００μｍの複数のウェルが配列する成形体を作製する工程と、前記成形体を１０〜６０℃で乾燥する工程と、前記工程において乾燥させた成形体を１０００〜１６００℃で１〜１０時間焼成する工程とを備えていることを特徴とする。
このような製造方法によれば、上記細胞培養担体を好適に製造することができる。
【００１３】
前記製造方法において、前記１次粒子は、平均粒径が０．１〜０．３μｍの粒子と平均粒径が０．４〜１μｍの粒子とが２：８〜８：２で混合されたものであることが好ましい。
このような混合粉を用いることにより、前記担体を、薬剤の吸着を防ぐのに適した比表面積で形成することができ、また、適度な連通性が得られる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る細胞培養担体を用いれば、肝細胞を均一なサイズに凝集化させ、その性質を保持しつつ培養することができ、かつ、凝集化させた細胞塊（スフェロイド）に薬剤を効率よく供給することができる。
したがって、本発明に係る細胞培養担体は、肝細胞の薬剤や毒性に対する応答性を向上させることが可能となり、代謝・薬効・毒性の評価試験に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（（ａ）１００倍、（ｂ）２００００倍）である。
【図２】実施例１に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図３】実施例１に係る細胞培養担体におけるＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現（誘導・非誘導）を示したグラフである。
【図４】実施例１に係る細胞培養担体におけるＣＹＰ３Ａ４の遺伝子活性を示したグラフである。
【図５】実施例１に係る細胞培養担体におけるアルブミン蛋白質量を示したグラフである。
【図６】実施例１に係る細胞培養担体におけるＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現の経時変化を示したグラフである。
【図７】比較例１に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図８】比較例１に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図９】比較例２に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１０】比較例２に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１１】比較例３に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１２】比較例３に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について、図面を参照して詳細に説明する。
本発明に係る細胞培養担体は、上面に複数のウェルが形成されている肝細胞培養用の細胞培養担体である。この担体は、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されている。
このように、本発明に係る担体は、アルミナセラミックスからなり、所定のサイズのアルミナ粒子により構成されていることを特徴としている。前記担体の少なくともウェル底面がこのようなアルミナ粒子により構成されるが、該担体上面の他の部分、さらに、該担体全体が同様なアルミナ粒子により構成されることが好ましい。
上記のような担体を用いれば、ウェル内で形成される肝細胞スフェロイドのサイズ制御が可能となり、かつ、薬剤が担体に吸着されにくく、前記肝細胞スフェロイドに効率的に薬剤が供給されるため、安定的に薬剤代謝試験を行うことができる。
【００１７】
前記担体は、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、また、前記担体を構成するアルミナ粒子は、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下である。
前記担体の比表面積が１ｍ2／ｇを超える場合、また、アルミナ粒子の平均粒径が２μｍを超える場合、薬剤代謝酵素の活性試験等の際、薬剤が担体に吸着されやすく、担体上の細胞に薬剤を効率的に供給することができない。一方、前記比表面積が０．０００１ｍ2／ｇ未満の場合、また、前記平均粒径が０．１μｍ未満の場合、ウェル内で形成されたスフェロイドに酸素や栄養等を十分に供給することが困難となる。
また、前記アルミナ粒子の最大粒径が５μｍを超える場合、ウェル内における均一なサイズのスフェロイド形成の妨げとなる。
なお、前記比表面積は、水銀ポロシメーターを用いた水銀圧入法により測定することができる。また、粒径は、電子顕微鏡観察により求めることができる。
【００１８】
前記担体の密度は、２．４〜４ｇ／ｃｍ3であることが好ましい。
ここでいう密度とは、水銀圧入法により測定された気孔率に基づいて、アルミナの真密度４．０ｇ／ｃｍ3として計算した見掛け密度の値である。
前記密度が上記数値範囲外の場合、気孔率が高くなりすぎ、担体への薬剤吸着量が多くなり、薬剤代謝酵素の活性試験等が困難となるおそれがある。
【００１９】
また、前記担体の上面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることが好ましい。
ここでいう２乗平均粗さＲｑは、ＪＩＳ Ｂ ０６０１に基づいて測定した値である。
上面がこのような表面粗さであることにより、扁平化した細胞が付着することなく、スフェロイドを効率的に形成することができる。
前記２乗平均粗さＲｑが０．１μｍ未満の場合、細胞と担体表面との接着力が大きくなり、スフェロイドが形成されないおそれがある。一方、前記２乗平均粗さＲｑが１μｍより大きい場合、細胞が担体表面に接着されないおそれがある。
【００２０】
さらに、前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることが好ましい。
前記ウェル底面の表面粗さが上記数値範囲外である場合、該ウェル内でのスフェロイドの接着性が不十分となり、スフェロイドが剥離しやすくなる。
【００２１】
上記のような細胞培養担体は、アルミナ１次粒子により複数のウェルが配列する成形体を作製し、これを乾燥した後、焼成することにより得ることができる。
前記アルミナ１次粒子としては、平均粒径が０．４〜１μｍのものが好適に用いられ、この１次粒子が焼結して、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下の前記担体を構成するアルミナ粒子となる。
【００２２】
上記のように、原料のアルミナ１次粒子は、焼結して上記のようなアルミナ粒子からなる担体とするために、平均粒径が０．４〜１μｍであるものが好適に用いられる。
平均粒径が０．４μｍ未満の場合、焼結体である担体の連通性が得られず、また、比表面積が所望の数値よりも大きくなるおそれがある。一方、平均粒径が１μｍを超える場合、得られる担体の強度が低下するおそれがある。
【００２３】
また、前記アルミナ１次粒子は、粒径の異なる２種類のアルミナ粒子を混合させて用いることが好ましい。
このような混合造粒粉を用いることにより、適度な連通性を有する担体を好適に得ることができる。
前記粒径の異なる２種類の粒子は、平均粒径が０．１〜０．３μｍの粒子と平均粒径が０．４〜１μｍの粒子とが２：８〜８：２で混合されたものであることが好ましい。
このような２種類の粒子によれば、前記担体を薬剤の吸着を防ぐのに適した比表面積で形成することができ、また、粒子間に適度な隙間が生じ、連通性を適度に調整することができる。
【００２４】
前記成形体は、サイズ制御されたスフェロイドを好適に形成させる観点から、パターン化された複数の凸形状を有する型を用いて、開口径１００〜４００μｍ、深さ１００〜４００μｍの複数のウェルが配列する表面状態となるように成形することが好ましい。
そして、前記成形体を１０〜６０℃で乾燥した後、１０００〜１６００℃で１〜１０時間焼成することにより、アルミナセラミックスからなる細胞培養担体を好適に作製することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
平均粒子径が０．５１μｍのアルミナ１次粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、１２００℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図１に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（（ａ）１００倍、（ｂ）２００００倍）を示す。
作製した担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、０．３５ｍ2／ｇであった。
また、作製した担体の電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ Ｓ−４８００；日立ハイテクノロジーズ製）観察写真（２００００倍）から、５０個のアルミナ粒子をランダムに選択し、平均粒径を測定したところ、０．６μｍであった。また、最大粒径は４μｍであった。
【００２６】
この担体を直径６ｍｍ、高さ１．５ｍｍの円柱状に加工し、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）の誘導剤である２５μＭリファンピシンを添加した肝細胞培養培地に３日間浸漬して吸着量を調べたところ、リファンピシンの吸着量は０．０５３μｇであった。
なお、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）とは、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の分子種であり、人体に存在する生体異物（ゼノバイオティクス）を代謝する酵素の主要なものの一つである。主に肝臓に存在するが、代謝に重要な役割を果たす他の器官や組織中にも見られるものである。
【００２７】
また、この担体を滅菌処理して、９６ウェルプレートの穴に入れ、ここに、ヒト正常肝細胞を１．０×１０5個撒種し、肝細胞培養培地を用いて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で培養した。６日間経過後、担体に接着した細胞をグルタルアルデヒドで固定処理し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
さらに、インドシニアングリーン（ＩＣＧ）１ｍｇ／ｍｌを培地に添加し、３０分間静置したところ、形成されたスフェロイドはＩＣＧ染色された。ＩＣＧは、正常肝細胞を選択的に取り込む性質を有することから、前記ウェル内で形成された肝細胞スフェロイドは、肝細胞の性質を維持していることが確認された。また、このように、染色によって肝細胞を生きたまま観察することが可能となった。
図２に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００２８】
また、前記細胞培養担体で肝細胞スフェロイドが形成されて３日後、２５μＭリファンピシンを肝細胞培養培地に添加した。７２時間経過後、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べるために、肝細胞培養培地を回収し、１００μＭテストステロンを添加したウィリアムＥ培地を加えて反応させた。２時間経過後、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり１５０ｐｍｏｌであった。
なお、６β−ヒドロキシテストステロンは、ＣＹＰ３Ａ４の指標基質であるテストステロンとの反応により生成した代謝物であり、活性評価の指標となる。
【００２９】
また、前記細胞培養担体で形成された肝細胞スフェロイドについて、６，２８日後のＣリファンピシンを添加した場合と未添加の場合におけるＹＰ３Ａ４遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲ法での定量により測定した。
図３に、その結果のグラフを示す。比較のため、コラーゲンコートシャーレ（ＢＤファルコン）で培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図３に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、従来のシャーレ上で培養した細胞よりも、１０倍以上のＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量を維持することが確認された。
【００３０】
また、前記細胞培養担体で形成された肝細胞スフェロイドについて、リファンピシンを添加した場合と未添加の場合における６日後のＣＹＰ３Ａ４活性評価を、培地中に１００μｍテストステロンを添加して１時間反応させた後、培地中の６β−ヒドロキシテストテロン濃度をＬＣ／ＭＳにて測定することにより行った。
図４に、その結果のグラフを示す。比較のため、上記と同様のコラーゲンコートシャーレで培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図４に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、従来のシャーレ上で培養した細胞よりも、４倍以上のＣＹＰ３Ａ４活性量を有していることが確認された。
【００３１】
また、前記細胞培養担体で形成された肝細胞スフェロイドについて、１，３，７，２８日後の培養上清に含まれるアルブミン蛋白質について、ヒトアルブミンＥＩＡキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて定量した。
図５に、その結果のグラフを示す。比較のため、上記と同様のコラーゲンコートシャーレで培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図５に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、従来のシャーレ上で培養した細胞よりも、２８日後においても３倍以上のアルブミン蛋白質が確認され、肝細胞の性質が長期間維持されることが認められた。
【００３２】
また、上記において培養した６，１４，２８日後の各肝細胞を溶解して、ＲＮＡを抽出後、薬物代謝酵素ｍＲＮＡの遺伝子量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
図６に、その結果のグラフを示す。比較のため、上記と同様のコラーゲンコートしたシャーレで培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図６に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、経時的な発現において解凍時のレベルをあまり低下させることなく維持することができた。
【００３３】
［比較例１］
平均粒子径が０．０８μｍのアルミナ１次粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、１０００℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図７に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。
また、この担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、１．８４ｍ2／ｇであった。
【００３４】
また、この担体を滅菌処理して、実施例１と同様にして、肝細胞を培養し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
図８に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００３５】
また、実施例１と同様にして、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べ、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり８２ｐｍｏｌであった。
［比較例２］
平均粒子径が０．２μｍのハイドロキシアパタイト粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、９００℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図９に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。
また、この担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、１．１３ｍ2／ｇであった。
【００３６】
また、この担体を滅菌処理して、実施例１と同様にして、肝細胞を培養し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
図１０に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００３７】
また、実施例１と同様にして、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べ、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり２０ｐｍｏｌであった。
［比較例３］
平均粒子径が０．６μｍのジルコニア粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、１１５０℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図１１に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。
また、この担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、０．５３ｍ2／ｇであった。
【００３８】
また、この担体を滅菌処理して、実施例１と同様にして、肝細胞を培養し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
図１２に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００３９】
また、実施例１と同様にして、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べ、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり６５ｐｍｏｌであった。
【００４０】
上記実施例及び比較例の評価結果を下記表１にまとめて示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表１から分かるように、本発明に係る細胞培養担体は、従来のセラミックス担体と比較して、連通性等の多孔性能を維持しつつ、比表面積を減少させることができ、薬剤代謝酵素（ＣＹＰ酵素）の活性試験に用いられる薬剤の吸着量が大幅に減少し、薬剤吸着によるＣＹＰ酵素活性も約５０％改善することができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、均一なサイズのヒト正常肝細胞の凝集体を得るのに好適な細胞培養担体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、新規の医薬品候補物質についての代謝・薬効・毒性の評価試験では、ヒト以外の動物が使用されていた。
しかしながら、ヒトと動物とでは、物質の代謝経路が異なる場合があり、動物試験での薬効・毒性評価結果が良好であっても、ヒトでの臨床試験において重大な問題が生じるおそれがあった。
また、１種類の物質の判定において多数の動物種を用いる必要があることから、倫理的な問題が唱えられ、動物実験に替わる方法が求められている。
【０００３】
近年、動物実験の代替法として、ヒト細胞を用いた試験が注目され、実用化に向けた研究が盛んに行われている。特に、生体内に投与された薬物は、肝臓で代謝後、排出されるため、薬効や毒性を調べるために肝細胞を用いたアッセイ法を確立することが重要とされている。
しかしながら、従来の細胞培養技術で培養した細胞は、基材に単層で接着するため、生体内と同様な三次元組織を構築しない。このため、組織細胞を体内から採取して生体外で培養しても、生体内で有していた機能を長時間維持することができないという問題があった。
【０００４】
この問題を解決する手段として、細胞同士を凝集させて細胞凝集塊（スフェロイド）を形成させ、細胞を生体内環境に近づけて培養する方法が注目されている。
なお、本明細書において、細胞同士が凝集して形成する凝集塊をスフェロイドと呼ぶ。
例えば、ヒトＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーを、均一なサイズに効率的に増殖させることができ、培養細胞が付着しにくく、かつ、その未分化状態を保持しつつ細胞を培養可能な細胞培養担体及び細胞の培養方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−３０６９８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に記載されているような培養基材を用いた場合、基材凹部でヒト正常肝細胞スフェロイドが形成されることが確認された。
しかしながら、このスフェロイドを用いて薬剤代謝酵素（ＣＹＰ酵素）の活性試験を行ったところ、ＣＹＰ活性が理論値よりも大きく下がった。この原因を調査したところ、前記基材を構成するセラミックス粒子にＣＹＰ酵素誘導試薬、ＣＹＰ酵素プローブ基質、プローブ基質反応物が吸着し、薬剤代謝酵素の活性試験を阻害しているためであることが分かった。
【０００７】
このように、従来のスフェロイド形成技術では、基材凹部に形成したスフェロイドに、ＣＹＰ酵素誘導試薬やＣＹＰ酵素プローブ基質を効率よく供給することができないため、創薬スクリーニング試験において、上記のような基材を用いることはできなかった。
したがって、均一なサイズのスフェロイドを効率よく形成させ、かつ、スフェロイドに薬剤を効率よく供給することができる培養基材及び培養方法が望まれている。
【０００８】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、肝細胞を均一なサイズに凝集化させ、その性質を保持しつつ培養することができ、かつ、凝集化させた細胞塊（スフェロイド）に薬剤を効率よく供給することができる細胞培養担体及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る細胞培養担体は、上面に複数のウェルが形成されている肝細胞培養用の細胞培養担体であって、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されていることを特徴とする。
このような担体によれば、均一なサイズの肝細胞スフェロイドを形成し、肝機能を長期的に維持可能な肝細胞を提供することができ、かつ、該肝細胞スフェロイドに対して効率的に薬剤を供給することが可能となる。
【００１０】
前記細胞培養担体は、薬剤代謝酵素の活性試験等において、担体への薬剤吸着量を抑制させる観点から、密度が２．４〜４ｇ／ｃｍ3であることが好ましい。
【００１１】
また、前記細胞培養担体の上面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであり、さらに、前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることが好ましい。
前記担体をこのような表面粗さとすることにより、ウェル内で好適にスフェロイドを形成することができる。
【００１２】
また、本発明に係る細胞培養担体の製造方法は、平均粒径が０．４〜１μｍのアルミナ１次粒子を造粒する工程と、前記アルミナ１次粒子により、開口径１００〜４００μｍ、深さ１００〜４００μｍの複数のウェルが配列する成形体を作製する工程と、前記成形体を１０〜６０℃で乾燥する工程と、前記工程において乾燥させた成形体を１０００〜１６００℃で１〜１０時間焼成する工程とを備えていることを特徴とする。
このような製造方法によれば、上記細胞培養担体を好適に製造することができる。
【００１３】
前記製造方法において、前記１次粒子は、平均粒径が０．１〜０．３μｍの粒子と平均粒径が０．４〜１μｍの粒子とが２：８〜８：２で混合されたものであることが好ましい。
このような混合粉を用いることにより、前記担体を、薬剤の吸着を防ぐのに適した比表面積で形成することができ、また、適度な連通性が得られる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る細胞培養担体を用いれば、肝細胞を均一なサイズに凝集化させ、その性質を保持しつつ培養することができ、かつ、凝集化させた細胞塊（スフェロイド）に薬剤を効率よく供給することができる。
したがって、本発明に係る細胞培養担体は、肝細胞の薬剤や毒性に対する応答性を向上させることが可能となり、代謝・薬効・毒性の評価試験に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（（ａ）１００倍、（ｂ）２００００倍）である。
【図２】実施例１に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図３】実施例１に係る細胞培養担体におけるＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現（誘導・非誘導）を示したグラフである。
【図４】実施例１に係る細胞培養担体におけるＣＹＰ３Ａ４の遺伝子活性を示したグラフである。
【図５】実施例１に係る細胞培養担体におけるアルブミン蛋白質量を示したグラフである。
【図６】実施例１に係る細胞培養担体におけるＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現の経時変化を示したグラフである。
【図７】比較例１に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図８】比較例１に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図９】比較例２に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１０】比較例２に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１１】比較例３に係る細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【図１２】比較例３に係る細胞培養担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について、図面を参照して詳細に説明する。
本発明に係る細胞培養担体は、上面に複数のウェルが形成されている肝細胞培養用の細胞培養担体である。この担体は、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されている。
このように、本発明に係る担体は、アルミナセラミックスからなり、所定のサイズのアルミナ粒子により構成されていることを特徴としている。前記担体の少なくともウェル底面がこのようなアルミナ粒子により構成されるが、該担体上面の他の部分、さらに、該担体全体が同様なアルミナ粒子により構成されることが好ましい。
上記のような担体を用いれば、ウェル内で形成される肝細胞スフェロイドのサイズ制御が可能となり、かつ、薬剤が担体に吸着されにくく、前記肝細胞スフェロイドに効率的に薬剤が供給されるため、安定的に薬剤代謝試験を行うことができる。
【００１７】
前記担体は、少なくとも前記ウェルの底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、また、前記担体を構成するアルミナ粒子は、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下である。
前記担体の比表面積が１ｍ2／ｇを超える場合、また、アルミナ粒子の平均粒径が２μｍを超える場合、薬剤代謝酵素の活性試験等の際、薬剤が担体に吸着されやすく、担体上の細胞に薬剤を効率的に供給することができない。一方、前記比表面積が０．０００１ｍ2／ｇ未満の場合、また、前記平均粒径が０．１μｍ未満の場合、ウェル内で形成されたスフェロイドに酸素や栄養等を十分に供給することが困難となる。
また、前記アルミナ粒子の最大粒径が５μｍを超える場合、ウェル内における均一なサイズのスフェロイド形成の妨げとなる。
なお、前記比表面積は、水銀ポロシメーターを用いた水銀圧入法により測定することができる。また、粒径は、電子顕微鏡観察により求めることができる。
【００１８】
前記担体の密度は、２．４〜４ｇ／ｃｍ3であることが好ましい。
ここでいう密度とは、水銀圧入法により測定された気孔率に基づいて、アルミナの真密度４．０ｇ／ｃｍ3として計算した見掛け密度の値である。
前記密度が上記数値範囲外の場合、気孔率が高くなりすぎ、担体への薬剤吸着量が多くなり、薬剤代謝酵素の活性試験等が困難となるおそれがある。
【００１９】
また、前記担体の上面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることが好ましい。
ここでいう２乗平均粗さＲｑは、ＪＩＳ Ｂ ０６０１に基づいて測定した値である。
上面がこのような表面粗さであることにより、扁平化した細胞が付着することなく、スフェロイドを効率的に形成することができる。
前記２乗平均粗さＲｑが０．１μｍ未満の場合、細胞と担体表面との接着力が大きくなり、スフェロイドが形成されないおそれがある。一方、前記２乗平均粗さＲｑが１μｍより大きい場合、細胞が担体表面に接着されないおそれがある。
【００２０】
さらに、前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることが好ましい。
前記ウェル底面の表面粗さが上記数値範囲外である場合、該ウェル内でのスフェロイドの接着性が不十分となり、スフェロイドが剥離しやすくなる。
【００２１】
上記のような細胞培養担体は、アルミナ１次粒子により複数のウェルが配列する成形体を作製し、これを乾燥した後、焼成することにより得ることができる。
前記アルミナ１次粒子としては、平均粒径が０．４〜１μｍのものが好適に用いられ、この１次粒子が焼結して、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下の前記担体を構成するアルミナ粒子となる。
【００２２】
上記のように、原料のアルミナ１次粒子は、焼結して上記のようなアルミナ粒子からなる担体とするために、平均粒径が０．４〜１μｍであるものが好適に用いられる。
平均粒径が０．４μｍ未満の場合、焼結体である担体の連通性が得られず、また、比表面積が所望の数値よりも大きくなるおそれがある。一方、平均粒径が１μｍを超える場合、得られる担体の強度が低下するおそれがある。
【００２３】
また、前記アルミナ１次粒子は、粒径の異なる２種類のアルミナ粒子を混合させて用いることが好ましい。
このような混合造粒粉を用いることにより、適度な連通性を有する担体を好適に得ることができる。
前記粒径の異なる２種類の粒子は、平均粒径が０．１〜０．３μｍの粒子と平均粒径が０．４〜１μｍの粒子とが２：８〜８：２で混合されたものであることが好ましい。
このような２種類の粒子によれば、前記担体を薬剤の吸着を防ぐのに適した比表面積で形成することができ、また、粒子間に適度な隙間が生じ、連通性を適度に調整することができる。
【００２４】
前記成形体は、サイズ制御されたスフェロイドを好適に形成させる観点から、パターン化された複数の凸形状を有する型を用いて、開口径１００〜４００μｍ、深さ１００〜４００μｍの複数のウェルが配列する表面状態となるように成形することが好ましい。
そして、前記成形体を１０〜６０℃で乾燥した後、１０００〜１６００℃で１〜１０時間焼成することにより、アルミナセラミックスからなる細胞培養担体を好適に作製することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
平均粒子径が０．５１μｍのアルミナ１次粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、１２００℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図１に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（（ａ）１００倍、（ｂ）２００００倍）を示す。
作製した担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、０．３５ｍ2／ｇであった。
また、作製した担体の電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ Ｓ−４８００；日立ハイテクノロジーズ製）観察写真（２００００倍）から、５０個のアルミナ粒子をランダムに選択し、平均粒径を測定したところ、０．６μｍであった。また、最大粒径は４μｍであった。
【００２６】
この担体を直径６ｍｍ、高さ１．５ｍｍの円柱状に加工し、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）の誘導剤である２５μＭリファンピシンを添加した肝細胞培養培地に３日間浸漬して吸着量を調べたところ、リファンピシンの吸着量は０．０５３μｇであった。
なお、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）とは、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の分子種であり、人体に存在する生体異物（ゼノバイオティクス）を代謝する酵素の主要なものの一つである。主に肝臓に存在するが、代謝に重要な役割を果たす他の器官や組織中にも見られるものである。
【００２７】
また、この担体を滅菌処理して、９６ウェルプレートの穴に入れ、ここに、ヒト正常肝細胞を１．０×１０5個撒種し、肝細胞培養培地を用いて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で培養した。６日間経過後、担体に接着した細胞をグルタルアルデヒドで固定処理し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
さらに、インドシニアングリーン（ＩＣＧ）１ｍｇ／ｍｌを培地に添加し、３０分間静置したところ、形成されたスフェロイドはＩＣＧ染色された。ＩＣＧは、正常肝細胞を選択的に取り込む性質を有することから、前記ウェル内で形成された肝細胞スフェロイドは、肝細胞の性質を維持していることが確認された。また、このように、染色によって肝細胞を生きたまま観察することが可能となった。
図２に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００２８】
また、前記細胞培養担体で肝細胞スフェロイドが形成されて３日後、２５μＭリファンピシンを肝細胞培養培地に添加した。７２時間経過後、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べるために、肝細胞培養培地を回収し、１００μＭテストステロンを添加したウィリアムＥ培地を加えて反応させた。２時間経過後、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり１５０ｐｍｏｌであった。
なお、６β−ヒドロキシテストステロンは、ＣＹＰ３Ａ４の指標基質であるテストステロンとの反応により生成した代謝物であり、活性評価の指標となる。
【００２９】
また、前記細胞培養担体で形成された肝細胞スフェロイドについて、６，２８日後のＣリファンピシンを添加した場合と未添加の場合におけるＹＰ３Ａ４遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲ法での定量により測定した。
図３に、その結果のグラフを示す。比較のため、コラーゲンコートシャーレ（ＢＤファルコン）で培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図３に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、従来のシャーレ上で培養した細胞よりも、１０倍以上のＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現量を維持することが確認された。
【００３０】
また、前記細胞培養担体で形成された肝細胞スフェロイドについて、リファンピシンを添加した場合と未添加の場合における６日後のＣＹＰ３Ａ４活性評価を、培地中に１００μｍテストステロンを添加して１時間反応させた後、培地中の６β−ヒドロキシテストテロン濃度をＬＣ／ＭＳにて測定することにより行った。
図４に、その結果のグラフを示す。比較のため、上記と同様のコラーゲンコートシャーレで培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図４に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、従来のシャーレ上で培養した細胞よりも、４倍以上のＣＹＰ３Ａ４活性量を有していることが確認された。
【００３１】
また、前記細胞培養担体で形成された肝細胞スフェロイドについて、１，３，７，２８日後の培養上清に含まれるアルブミン蛋白質について、ヒトアルブミンＥＩＡキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて定量した。
図５に、その結果のグラフを示す。比較のため、上記と同様のコラーゲンコートシャーレで培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図５に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、従来のシャーレ上で培養した細胞よりも、２８日後においても３倍以上のアルブミン蛋白質が確認され、肝細胞の性質が長期間維持されることが認められた。
【００３２】
また、上記において培養した６，１４，２８日後の各肝細胞を溶解して、ＲＮＡを抽出後、薬物代謝酵素ｍＲＮＡの遺伝子量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
図６に、その結果のグラフを示す。比較のため、上記と同様のコラーゲンコートしたシャーレで培養した肝細胞についての結果も併せて示す。
図６に示したグラフから分かるように、前記担体を用いて培養した肝細胞は、経時的な発現において解凍時のレベルをあまり低下させることなく維持することができた。
【００３３】
［比較例１］
平均粒子径が０．０８μｍのアルミナ１次粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、１０００℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図７に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。
また、この担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、１．８４ｍ2／ｇであった。
【００３４】
また、この担体を滅菌処理して、実施例１と同様にして、肝細胞を培養し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
図８に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００３５】
また、実施例１と同様にして、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べ、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり８２ｐｍｏｌであった。
［比較例２］
平均粒子径が０．２μｍのハイドロキシアパタイト粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、９００℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図９に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。
また、この担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、１．１３ｍ2／ｇであった。
【００３６】
また、この担体を滅菌処理して、実施例１と同様にして、肝細胞を培養し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
図１０に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００３７】
また、実施例１と同様にして、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べ、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり２０ｐｍｏｌであった。
［比較例３］
平均粒子径が０．６μｍのジルコニア粒子を用いて、開口径２００μｍ、深さ２００μｍの複数のウェルが配列するアルミナ平板を成形し、室温（２０℃）で乾燥した後、１１５０℃で２時間焼成して、細胞培養担体を作製した。
図１１に、作製した細胞培養担体の上面の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。
また、この担体の比表面積を水銀圧入法により測定したところ、０．５３ｍ2／ｇであった。
【００３８】
また、この担体を滅菌処理して、実施例１と同様にして、肝細胞を培養し、電子顕微鏡にて観察したところ、肝細胞がウェル内でスフェロイドを形成していることが認められた。
図１２に、前記担体上のスフェロイドの電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
【００３９】
また、実施例１と同様にして、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素活性を調べ、培地中の６β−ヒドロキシテストステロンをＨＰＬＣで分離定量したところ、１ウェル当たり６５ｐｍｏｌであった。
【００４０】
上記実施例及び比較例の評価結果を下記表１にまとめて示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表１から分かるように、本発明に係る細胞培養担体は、従来のセラミックス担体と比較して、連通性等の多孔性能を維持しつつ、比表面積を減少させることができ、薬剤代謝酵素（ＣＹＰ酵素）の活性試験に用いられる薬剤の吸着量が大幅に減少し、薬剤吸着によるＣＹＰ酵素活性も約５０％改善することができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面に複数のウェルが形成されている肝細胞培養用の細胞培養担体であって、前記ウェルの少なくとも底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
密度が２．４〜４ｇ／ｃｍ3であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記上面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
平均粒径が０．４〜１μｍのアルミナ１次粒子を造粒する工程と、
前記アルミナ１次粒子により、開口径１００〜４００μｍ、深さ１００〜４００μｍの複数のウェルが配列する成形体を作製する工程と、
前記成形体を１０〜６０℃で乾燥する工程と、
前記工程において乾燥させた成形体を１０００〜１６００℃で１〜１０時間焼成する工程と
を備えていることを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【請求項６】
前記１次粒子は、平均粒径が０．１〜０．３μｍの粒子と平均粒径が０．４〜０．６μｍの粒子とが２：８〜８：２で混合されたものであることを特徴とする請求項５記載の細胞培養担体の製造方法。
【請求項１】
上面に複数のウェルが形成されている肝細胞培養用の細胞培養担体であって、前記ウェルの少なくとも底面が、比表面積が０．０００１〜１ｍ2／ｇであり、平均粒径が０．１〜２μｍ、かつ、最大粒径が５μｍ以下のアルミナ粒子により構成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
密度が２．４〜４ｇ／ｃｍ3であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記上面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記ウェルの少なくとも底面は、２乗平均粗さＲｑが０．１〜１μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
平均粒径が０．４〜１μｍのアルミナ１次粒子を造粒する工程と、
前記アルミナ１次粒子により、開口径１００〜４００μｍ、深さ１００〜４００μｍの複数のウェルが配列する成形体を作製する工程と、
前記成形体を１０〜６０℃で乾燥する工程と、
前記工程において乾燥させた成形体を１０００〜１６００℃で１〜１０時間焼成する工程と
を備えていることを特徴とする細胞培養担体の製造方法。
【請求項６】
前記１次粒子は、平均粒径が０．１〜０．３μｍの粒子と平均粒径が０．４〜０．６μｍの粒子とが２：８〜８：２で混合されたものであることを特徴とする請求項５記載の細胞培養担体の製造方法。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１３−１０２７３７（Ｐ２０１３−１０２７３７Ａ）
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４９５９５（Ｐ２０１１−２４９５９５）
【出願日】平成２３年１１月１５日（２０１１．１１．１５）
【出願人】（５０７１８２８０７）コバレントマテリアル株式会社 (506)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１５日（２０１１．１１．１５）
【出願人】（５０７１８２８０７）コバレントマテリアル株式会社 (506)
【Ｆターム（参考）】
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