細胞接着性を増強する方法および組成物
本発明は、修飾されていない細胞の接着性と比較して高められた接着性を有する修飾された細胞であって、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする組換え核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする組換え核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする組換え核酸、および／またはｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せを含む細胞を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／５６６，６１３号の利益を主張する。
【０００２】
政府支援の明示
本発明に関連する研究は、ＮＩＨ／ＮＨＬＢＩによって与えられた米国政府補助金番号ＨＬ５１８１８によって少なくとも一部は支援されていた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細胞培養環境において接着性が増強された修飾された細胞ならびにこれらの細胞を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞は、主にその増殖の容易さと外来ＤＮＡにより効率的にトランスフェクトされるその能力のために、商業ベースと研究においての双方で広く用いられている多種多様な細胞のうちの一例である。しかし、２９３細胞の誘導体および種々のその他の細胞に関する１つの問題として、それらが組織培養容器に接着しにくいことが多いということがある。このことはこれらの細胞の操作を困難にする。この問題を克服するための１つの方法として細胞培養容器をビトロネクチンまたはポリリジンでコーティングすることがあるが、費用とこのような細胞培養物の取り扱いの容易さの双方に影響が生じ、このためこのアプローチは細胞の大規模製造には望ましくないものとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞がインテグリンを細胞表面に発現し、組織培養基材への接着を増強するよう修飾できる方法および組成物を提供することによって当分野におけるこれまでの欠点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む、前記組換え核酸からなる、または本質的に前記組換え核酸からなる、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞を提供する。
【０００７】
本明細書では、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）および（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む、からなる、および／または本質的にそれからなる２９３．０１細胞をさらに提供する。
【０００８】
本発明は、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る核酸を細胞に導入することと、ｂ）細胞が培養容器の表面と接着できる条件下で（ａ）の細胞を培養容器の表面と接触させることとを含む、からなる、または本質的にそれらからなる細胞を、培養容器の表面に接着させる方法をさらに提供する。
【０００９】
いっそうさらなる実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することを含む、からなる、または本質的にそれらからなる、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞を製造する方法を提供する。
【００１０】
本明細書ではまた、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せとからなる群から選択される組換え核酸を細胞に導入することと、ｂ）（ａ）の細胞を培養容器に入れることと、ｃ）ウイルス粒子が産生される条件下で、感染性ウイルス粒子を（ｂ）の培養容器に入れることとを含む、からなる、または本質的にそれらからなる、培養容器中の細胞においてウイルス粒子を製造する方法を提供する。
【００１１】
さらに、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を２９３．１０１細胞に導入することと、ｂ）培養容器に（ａ）の細胞を入れることと、ｃ）Ｉ）レンチウイルスｇａｇおよびレンチウイルスｐｏｌをコードするレンチウイルス核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれからなる第１のベクターであって、（１）レンチウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子に少なくとも１つ欠陥を含み、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む第１のベクターと、ＩＩ）ベクターゲノムの逆転写に必要なシス作用配列エレメントを含むレンチウイルス核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれからなる第２のベクターであって、（１）能力のあるパッケージングシグナルを含み、（２）異種遺伝子を含む第２のベクターと、ＩＩＩ）ウイルスの核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれらからなる第３のベクターであって、（１）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（２）欠陥のあるパッケージングシグナルを含む前記の第３のベクターとを、組換えレンチウイルス粒子が産生される条件下で（ｂ）の細胞に導入することとを含む、からなる、または本質的にそれらからなる、培養容器中の２９３．１０１細胞において組換えレンチウイルス粒子を製造する方法を提供する。
【００１２】
本明細書では、本発明の修飾された細胞を、レンチウイルス核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれからなるベクターであって、欠陥のあるパッケージングシグナルを含むベクターによりトランスフェクトすることを含む、からなる、または本質的にそれからなる、パッケージング細胞を作製する方法をさらに提供する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の修飾された細胞であって、パッケージングシグナルに欠陥がある、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードしているレンチウイルス核酸配列を含み、その結果、細胞自体が少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質を産生するが、複製能力のある感染性ウイルスは産生しない細胞を含むパッケージング細胞を提供する。
【００１４】
本発明の種々のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」または「その又は前記（ｔｈｅ）」は１以上を意味する場合がある。例えば、「一の」細胞は単一の細胞を意味する場合もあるし、多数の細胞を意味する場合がある。
【００１６】
また、本明細書において、「および／または」とは、１以上の関連記載事項のありとあらゆる可能性のある組合せを指し、包含し、ならびに代わりに（「または」）で解釈される場合には組合せの欠如を指し、包含する。
【００１７】
本発明は、細胞がインテグリンを発現するよう修飾することによって、修飾されていない細胞よりもはるかに強力に組織培養基材に接着される細胞が得られるという予期しない発見に基づいている。
【００１８】
したがって、一実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が高められた修飾された細胞を提供する。本細胞は、細胞においてインテグリンサブユニットコード配列が発現されるおよび／または過剰発現される条件下で維持する。いくつかの実施形態では、本発明のインテグリンサブユニットをコードする核酸の発現のタイミングおよび／または量を制御できるよう、核酸発現を調節するための当分野で周知の方法にしたがってインテグリンサブユニットコード配列を細胞で一過性に発現させる。
【００１９】
接着性の増加量は、修飾されていない細胞の接着性と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍であり得る。接着性の増加は、本明細書に記載される修飾された細胞か、修飾されていない細胞のいずれかを、組織培養基材［例えば、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアクリレート、ポリソルベートなど）、ガラス、寒天、コラーゲン、フィブロネクチン、セラミック、金属、生分解性または非生分解性ポリエステルスキャフォールド、管類など］と、細胞が基材と接着するのを可能にするのに十分な期間接触させることと、本明細書に記載された方法、ならびに細胞を定量するためのいずれかの技術分野で公知の方法にしたがって、基材に接着されている細胞量を求めることとによって測定する。修飾されていない細胞よりもより多数が組織培養基材に接着する修飾された細胞は、接着性が高められた細胞である。接着性の増加は、接着された細胞の増加数と相関があり、Ｘ倍増加（例えば、２倍、３倍など）として、パーセンテージ（例えば、修飾されていない細胞と比較して、基材に接着された１０％多くの修飾された細胞に基づく、接着性の１０％増加）として、および／またはベースライン測定値に対する増加を同定するいずれかの他の技術分野で公知の値にしたがって表すことができる。
【００２０】
本発明の細胞は、培養条件下で増殖できる、かつ／または維持できる、かつ、インテグリンをコードする組換え核酸を受け入れ、発現できる細胞種であればいずれでもあり得る。例えば、本発明の細胞は、それだけには限らないが、ＢｉＧ−４５細胞、２９３．１０１細胞、Ｂ−２４１細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｄａｍｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞およびＭＳ−５細胞であり得る。
【００２１】
本発明の細胞は単一で存在する細胞である場合もあるし、細胞集団で存在する場合もあり、本発明の細胞は組織培養容器に含めることができ、これらは、フラスコ、ボトル、ローラーボトル、バイアル、チューブ、チャンバー、フラスコ、ディッシュ、スライド、プレート、単一ウェルとして存在する場合もマルチプルウェルプレート中に存在する場合も、および／またはそれらの組合せである場合もある組織培養ウェルであり得るが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の細胞は、ヒトインテグリンであってもよく、インテグリンβ3サブユニット、インテグリンαvサブユニット、インテグリンαIIbサブユニット、および／または任意の順序のこれらのインテグリンサブユニットのいずれかの組合せであり得るが、これらに限定されないインテグリンをコードする組換え核酸の導入によって修飾される。本発明は、その上で細胞が増殖する基材上にコーティングされ得るか、細胞によって分泌され得る細胞外マトリックス分子と結合するインテグリンのいずれかの組合せをさらに提供する。いくつかの例として、コラーゲン受容体α２−β１、ラミニン受容体α６−β４、いくつかのビトロネクチン受容体αＶ−β５およびβ１が挙げられ、これらはフィブロネクチンなどの受容体細胞外マトリックス分子の種々のαサブユニットと組合せることができるが、これらに限定されない。本発明のインテグリンは、例として、ニワトリ、イヌ、マウスおよびラットのような、いずれの種由来のものであり得る。これらのインテグリンをコードする核酸は、一以上の核酸構築物で細胞に導入でき、それから核酸が発現されて細胞内でインテグリンタンパク質が産生され得る。
【００２３】
本明細書において、「核酸」とは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧからなるＤＮＡ、または塩基Ａ、Ｕ（Ｔの代わり）、ＣおよびＧからなるＲＮＡであり得る一本鎖または二本鎖分子を指す。本発明の核酸はコード鎖またはその相補物に相当し得る。本発明の核酸は、天然に存在する配列と順序どおり同一であり得るか、十分に特性決定された核酸コードの縮重のために、天然に存在する配列中に見られるものと同一のアミノ酸をコードする別のコドンを含み得るヌクレオチド配列を含み得る。さらに、本発明の核酸は、得られるポリペプチドの生物活性が保持されるような、当分野で周知であるようなアミノ酸の保存的置換に相当するコドンを含み得るヌクレオチド配列を含み得る。本発明の核酸は、核酸を単離するための当分野で周知の方法にしたがって細胞から単離できる。あるいは、本発明の核酸は、核酸の合成のための、文献に十分に記載されている標準プロトコールにしたがって合成できる。また、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの必須の構造および／または機能（すなわち、生物活性）は維持されるという条件で、この核酸への修飾が検討される。
【００２４】
「組換え」核酸とは、当分野で周知の遺伝子工学技術を用いて作製されたものである。
【００２５】
核酸配列の、用語「発現する」または「発現」（およびその文法上の同等物）とは、配列が転写され、場合によっては翻訳されることを意味する。
【００２６】
本発明のインテグリンをコードする核酸は、細胞内でのインテグリンの発現に向かわせるプロモーターをさらに含み得る。したがって、特定の実施形態では、プロモーターを機能し得る形で、インテグリンをコードしている組換え核酸に連結できる。プロモーターは、細胞におけるインテグリン核酸の構成的発現をもたらす、構成的プロモーターであり得、プロモーターは、プロモーターを活性化する誘導可能エレメントの存在下でのみ細胞におけるインテグリン核酸の発現をもたらし、それによって組換え核酸からのインテグリンタンパク質の産生が制御されるのを可能にする、誘導可能プロモーターであり得る。
【００２７】
本発明のプロモーターの例としては、それだけには限らないが、ＣＭＶ最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、伸長因子１α、βアクチン、真核細胞の開始因子４Ａ１、複合性ＣＭＶエンハンサー／βアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、複合性伸長因子１αプロモーター／ＨＴＬＶ５’非翻訳領域、複合性ＳＶ４０エンハンサー／ヒトフェリチン重鎖伸長因子１αプロモーター、複合性ＣＭＶエンハンサー／ヒトフェリチン軽鎖伸長因子１αプロモーターおよび複合性ＣＭＶプロモーター／テトラサイクリンオペレーターが挙げられる。本発明のプロモーターは、本発明の組換え核酸にいずれかの組合せおよび／または順序で存在し得る。
【００２８】
本発明の核酸は、それだけには限らないが、形質導入（例えば、ウイルスベクターによる感染）、トランスフェクション（エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクションなど）を含む当分野で周知の方法にしたがって細胞に導入できる。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）および（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む２９３．０１細胞を提供する。本明細書に記載したように、インテグリンをコードする核酸は、同一または異なる構築物に、いずれかの順序および／または組合せで存在し得、細胞に同時におよび／または順次導入できる。本核酸はまた、同時におよび／またはいずれかの順序および／または組合せで発現させることができる。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、インテグリンβ3サブユニットをコードする組換え核酸とインテグリンαvサブユニットをコードする組換え核酸とを含む２９３．１０１細胞を提供する。これらの組換え核酸は、同一または異なる構築物に存在し得、細胞に、いずれかの組合せおよび／または順序で同時におよび／または逐次導入することができ、同時におよび／またはいずれかの順序で発現させることができる。
【００３１】
本明細書では、本発明の細胞を製造するための種々の方法をさらに提供する。したがって、一実施形態では、本発明は細胞を培養容器の表面に接着させる方法であって、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る核酸を細胞に導入することと、ｂ）細胞が培養容器の表面に接着できる条件下で（ａ）の細胞を培養容器の表面と接触させることとを含む方法を提供する。
【００３２】
細胞が培養容器の表面と接着できる条件は、本明細書に記載されており、いずれかの所与の細胞種について当分野で周知であり、培養容器に含まれる培地、ならびに培養容器が維持される環境（例えば、温度、湿度、二酸化炭素含量など）に基づいている。本発明の細胞種の培地処方および培養条件は、当分野では十分に確立されている。一例として、ＨＥＫ２９３細胞は以下の条件下の培養で増殖され、維持される。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清を含有する「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭカタログ番号１１９９５−０６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）で、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で培養される。細胞が９０％コンフルエントになると、維持のために１：６希釈で継代される。
【００３３】
本明細書では、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することを含む、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が少なくとも２倍、少なくとも３倍および／または少なくとも４倍高められた修飾された細胞を製造する方法がさらに提供される。
【００３４】
本発明の細胞は、核酸取り込みを増加させるために一過性のトランスフェクションプロトコールにおいて通常用いられる処理（例えば、グリセロールショックまたはＤＭＳＯショック）に、より良好に抵抗することが本明細書に示される。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、トランスフェクションプロトコールに使用される処理に抵抗するための増強された能力を提供する本明細書に記載される修飾を用いて、核酸を取り込む能力が増強された本発明の細胞を提供し、本明細書に記載されるプロトコールにしたがってこのような細胞を作製する方法、ならびにウイルス粒子の製造のためにこのような細胞を使用する方法をさらに提供する。
【００３５】
本発明の細胞は、細胞内での種々の材料（例えば、タンパク質、ウイルスなど）の製造をはじめ、種々の商業適用および研究適用に使用でき、接着性の増加による製造に利用できる培養容器中の細胞数の増加によってその収率が改善される。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することと、ｂ）（ａ）の細胞を培養容器に入れることと、ｃ）ウイルス粒子が産生される条件下で、（ｂ）の培養容器に感染性ウイルス粒子を入れることを含む、培養容器中の細胞におけるウイルス粒子の製造方法を提供する。
【００３６】
本発明のウイルスは細胞培養で産生され得るウイルスであればいずれでもよく、それだけには限らないが、レンチウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、フラビウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、ブニアウイルス、オルビウイルス、ポックスウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルスおよびフィロウイルス、ならびに細胞培養で産生され得る現在公知のまたは後に同定されるいずれかのその他のウイルスが挙げられる。
【００３７】
本発明の特定の実施形態では、ウイルスはレンチウイルスであり得、これは霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ）、非霊長類レンチウイルス（例えば、ＦＩＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＣＥＶおよびビスナウイルス）、ならびに／または現在公知のまたは後に同定されるいずれかのその他のレンチウイルスであり得る。
【００３８】
したがって、本発明は、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することと、ｂ）培養容器に（ａ）の細胞を入れることと、ｃ）Ｉ）一以上のレンチウイルス構造タンパク質をコードするレンチウイルス核酸配列を含む第１のベクターであって、（１）レンチウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子に少なくとも１つの欠陥を含む、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記ベクターと、ＩＩ）ベクターゲノムの逆転写に必要なシス作用配列エレメントを含むレンチウイルス核酸配列を含む第２のベクターであって、能力のあるパッケージングシグナルを含む前記ベクターと、ＩＩＩ）ウイルスの核酸配列を含む第３のベクターであって、（１）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記の第３のベクターとを、組換えレンチウイルス粒子が産生される条件下で（ｂ）の細胞に導入することとを含む、培養容器中の細胞において組換えレンチウイルス粒子を製造する方法をさらに提供する。
【００３９】
特定の実施形態では、前記方法の第２のベクターが、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ）の発現に欠陥のあるものであり得る。もう１つの実施形態では、第１のベクターは、ｅｎｖ遺伝子を有さないか、第１のベクターから発現され得ないようにする欠陥を含むｅｎｖ遺伝子を有する、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターであり得る。ｅｎｖ遺伝子の欠陥は、遺伝子を第１のベクターから発現され得なくさせる欠失、置換および／または付加突然変異であり得る。
【００４０】
その他の実施形態では、第１および第２のベクターは双方ともｅｎｖ遺伝子を欠いているものである場合もあり、または双方とも、遺伝子を第１のベクターから発現され得なくさせる欠失、置換および／または付加突然変異であり得る欠陥を含むｅｎｖ遺伝子を含むものである場合もある。
【００４１】
前記方法の第３のベクターは、レンチウイルスｅｎｖ遺伝子であり得る、ウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む場合があり、および／または、第３のベクターは、レンチウイルスエンベロープタンパク質ではないウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む場合もある。例えば、第３のベクターの核酸によってコードされるエンベロープタンパク質は水泡性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）糖タンパク質であり得る。
【００４２】
前記方法の第２のベクターは、異種核酸配列が挿入され得るマルチプルクローニングサイトおよび／または一以上の異種核酸を含み得る。本発明の異種核酸は、異種核酸が導入されている細胞において産生された場合に抗原性、免疫原性および／または治療的であり得るタンパク質またはペプチドをコードし得る。
【００４３】
用語「異種核酸」とは、周知の専門用語であり、当業者には、導入されている細胞内には通常は存在しない核酸である、および／または細胞内には通常は存在しない調節エレメントの制御下で発現される核酸であると容易に理解される。本発明の異種核酸はまた、核酸が導入されている細胞において通常は存在しない量で存在するか、核酸が導入されている細胞において通常は存在しない量で発現される核酸であり得る。「異種核酸」は、通常、細胞中に天然には存在しない配列である。あるいは、異種ヌクレオチド配列とは、（例えば、天然には結合していないプロモーターとの結合によって）非天然環境に置かれている配列を指す場合もある。
【００４４】
本発明の第１のベクター、第２のベクターおよび第３のベクターは、ベクター構築物を製造するための標準的な核酸配列の操作方法にしたがって製造でき、特定の実施形態では、本発明の第１、第２および／または第３のベクターをレンチウイルスゲノムのｃＤＮＡクローンから得ることができる。
【００４５】
いくつかの例として、本発明の第１のベクターはプラスミドｐＥＶ５３、プラスミドｐＥＶ５３Ａおよび／またはプラスミドｐＥＶ５３Ｂであり得、本発明の第２のベクターはプラスミドｐＥＣ−ｌａｃＺ、プラスミドｐＥＣ−ｐｕｒｏ、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１Ｇ３Ｗ、プラスミドｐＥ１１．１Ｇ３Ｗおよび／またはプラスミドｐＥＳＩＮ１１．１Ｇ３Ｗであり得、本発明の第３のベクターはプラスミドｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇであり得る。
【００４６】
ｐＥＶ５３Ｂは、主要スプライス供与部位の３ｎｔ上流までの全てのＥＩＡＶリーダー配列が除去されている点を除いてｐＥＶ５３と同様である。ｐＥＶ５３Ｂを構築するために、以下のプライマーを用いるＰＣＲによってｇａｇ遺伝子およびｐｏｌの一部をｐＥＶ５３から増幅した。
【００４７】
【化１】
【００４８】
ＡｓｃＩ制限部位（下線が引かれている）をクローニング目的で順方向プライマーに含めた。順方向プライマーについては順方向プライマー中のｇａｇのＡＴＧ翻訳開始部位が太字で示されており、ＥＩＡＶ配列がイタリック体で示されている。得られた１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ＡｓｃＩ−ＢｓｒＧＩ消化したｐＥＶ５３Ａにクローニングした。これによってｐＥＶ５３Ｂが得られた。配列解析を用いてＰＣＲによって増幅されたｇａｇ−ｐｏｌ配列が正しいことを確認した。
【００４９】
本発明の第２のベクターの一実施例として、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ、ストレプトマイセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）ピューロマイシンリポーター遺伝子を発現するＥＩＡＶ由来の６８６６ｂｐのプラスミドがある。このプラスミドは、２つのＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域（ｂｐ１〜７３４および１８６３〜２３８４に位置する）、ＥＩＡＶロングターミナルリピート配列（ＬＴＲ）由来のＲ−Ｕ５配列ドメイン（ｂｐ７３５〜８５７）、ＥＩＡＶ ＲＮＡキャプシド形成シグナルを含有するリーダー配列（約ｂｐ８７０〜１２００）、突然変異したｔａｔ翻訳開始部位（ｂｐ９０９〜９１１のＣＴＧからＴＡＧ）、ｂｐ９９６〜９９７のスプライス供与部位、突然変異したｇａｇ翻訳開始部位（ｂｐ１０００〜１００３のＡＴＧからＴＡＧ、部分ＥＩＡＶ ｇａｇ配列（ｂｐ１００４〜１２００）、ＥＩＡＶセントラルポリプリントラクト（ｂｐ１３１４〜１３３０）およびセントラル終結シグナル配列（ｂｐ１４２２〜１４４８）を含有する「ＤＮＡフラップ」配列、ピューロマイシンコード配列（ｂｐ２４８０〜３１０５）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｂｐ３１１０〜３９９６）、ＥＩＡＶエンハンサー／プロモーター配列のＥＩＡＶ自己不活化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列欠失（ｂｐ４０３７〜４１８３）、ファージｆ１領域（ｂｐ４２８０〜４７３５）、アンピシリン耐性コード領域（ｂｐ５１７４〜６０３４）およびＤＮＡ複製のＣｏｌＥｌ開始点（ｂｐ５５５４〜６２２８）を含む。
【００５０】
第２のベクターのもう１つの実施例として、ｐＥ６．１ＣｐｕｒｏＷがあり、これはＳＩＮ ＬＴＲが野生型ＥＩＡＶ ＬＴＲで置き換わっている以外ｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷと同様である。その他の実施例として、ｐＥＳＩＮ６．１ＣＷおよびｐＥ６．１ＣＷが挙げられ、これらはピューロマイシン耐性遺伝子が、それ以外の注目する遺伝子または配列の好都合な挿入のために拡張されたマルチプルクローニングサイトによって置き換わっている以外は、それぞれｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷおよびｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷと同様である。第２のベクターのさらなる改良が可能である。例えば、ｐＥＳＩＮ１１．１ＣＷおよびｐＥ１１．１ＣＷが、高い力価を提供するようリーダー領域が再構成され、最適化されたベクターの実施例である。
【００５１】
本発明の方法にしたがって製造されたレンチウイルス粒子は、細胞に感染し、異種核酸を標的細胞に送達するプロセスにおいて単一ラウンドの複製を実施することができる。この技術の一態様は、ウイルス遺伝子の標的細胞への移動を排除する核酸送達システムである。これはウイルス構造タンパク質を、異種核酸をコードするベクターから物理的に分離することによって達成される。分離されたベクターを許容細胞（「パッケージング細胞」）に導入する。ウイルス構造タンパク質は、ウイルス粒子の製造に必須であるが、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、欠陥パッケージングシグナルを含むか、パッケージングシグナルを含まないベクターに存在し、その結果、構造タンパク質遺伝子はパッケージング細胞において産生されるウイルス粒子にパッケージングされない。得られたレンチウイルス粒子は、パッケージングされたベクターが粒子組立てに必要なウイルス構造タンパク質の全てをコードする核酸を含まないという点で「複製に欠陥がある」。
【００５２】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明の修飾された細胞を、レンチウイルス核酸配列を含むベクターであって、欠陥パッケージングシグナルを含むベクターによりトランスフェクトすることを含む、パッケージング細胞を作製する方法を提供する。このベクターはｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターであり得、特定の実施形態では、ベクターはプラスミドｐＥＶ５３Ｂであり得る。
【００５３】
本明細書では、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードするレンチウイルス核酸配列であって、パッケージングシグナルに欠陥がある核酸配列を含む、本発明の修飾された細胞を含むパッケージング細胞であって、その結果、細胞自体が少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質を産生するが、複製可能な感染性ウイルスを産生しないパッケージング細胞をさらに提供する。
【００５４】
特に、本発明のレンチウイルスベクターに関しては、特定の実施形態では、ベクターはＥＩＡＶ由来のものである。天然ＥＩＡＶ核酸はウイルスに感染した細胞から単離でき、それからベクターを調製する。ＥＩＡＶベクターを調製するための例示的方法は、Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６６：４０８５〜４０９７頁（１９９２）に提供されている。例えば、当分野で公知の方法を用い、リバーストランスクリプターゼによってｃＤＮＡをＥＩＡＶ ＲＮＡから製造できる。次いで、二本鎖ＥＩＡＶ ｃＤＮＡを製造でき、クローニングベクター、例えば、細菌クローニングベクターにクローニングできる。当業者に公知のおよび当業者に使用されるいずれのクローニングベクター、例えば、細菌、酵母または真核生物のベクターも使用できる。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、ＥＩＡＶゲノムの少なくとも一部と相補的であり、かつ、ゲノムの複製に必要なＲＮＡゲノムの一部を含む一以上の核酸配列を含み得るｃＤＮＡ分子を含み得、ｃＤＮＡ分子は標的細胞において機能的であるプロモーターの転写制御下に置かれている。
【００５５】
本発明のプロモーターは、細胞において遠位の配列（すなわち、プロモーター配列の５’末端に結合している配列）の転写に向けるのに十分な真核生物のおよび／または原核生物のプロモーターを含み得る。プロモーター領域はまた、転写の増強または抑制のための制御エレメントを含み得る。適したプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｐＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスロングターミナルリピートプロモーター（ｐＲＳＶ）およびＳＰ６、Ｔ３またはＴ７プロモーターがある。発現を容易にするために、プロモーターの上流のエンハンサー配列またはコード領域の下流のターミネーター配列を、本発明のベクターに場合によって含めてもよい。本発明のベクターはまた、さらなる核酸配列、例えば、細胞が効率的かつ効果的にベクターの異種核酸を発現するのを可能にするのに十分なポリアデニル化配列、局在化配列および／またはシグナル配列を含み得る。可能性あるポリアデニル化配列の例としては、ＳＶ４０初期領域ポリアデニル化部位（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０１（１９８３））およびＳＶ４０後期領域ポリアデニル化部位（ＣａｒｓｗｅｌｌおよびＡｌｗｉｎｅ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：４２４８（１９８９））がある。このようなさらなる配列は、転写が求められる場合にはそれらが機能し得る形でプロモーター配列と連結され、または翻訳およびプロセッシングが求められる場合にはさらに開始およびプロセッシング配列と連結されるようベクターに挿入する。あるいは、挿入された配列は、ベクター中のいずれの位置に位置してもよい。用語「機能し得る形で連結された」とは、機能し得る形で連結されたプロモーター配列によって核酸配列の転写が導かれ、配列の翻訳が機能し得る形で連結された翻訳調節配列によって導かれ、配列の翻訳後プロセシングが機能し得る形で連結されたプロセシング配列によって導かれるような、核酸配列とプロモーターおよび／またはその他の調節またはプロセシング配列間の結合を説明するために用いる。
【００５６】
本発明のベクターの構築のための標準的な技術は、当業者には周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）などの参照文献に見い出すことができる。ＤＮＡの断片を連結するためには種々の戦略が利用でき、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に応じて変わるが、当業者であればその選択は容易に行うことができる。
【００５７】
本発明の一実施形態では、組換えレンチウイルス発現系は３種のべクターを含む。第１のベクターはＥＩＡＶゲノムの少なくとも一部の核酸配列を含み、このベクターは（ｉ）ＥＩＡＶ構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子中に少なくとも１つの欠陥を含み、（ｉｉ）欠陥パッケージングシグナルを含む。第２のベクターはＥＩＡＶゲノムの少なくとも一部の核酸配列を含み、このベクターは（ｉ）能力のあるパッケージングシグナルを含み、（ｉｉ）異種遺伝子を挿入できるマルチプルクローニングサイトを含む。第３のベクターはウイルスの核酸配列を含み、このベクターは（ｉ）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（ｉｉ）欠陥パッケージングシグナルを含む。
【００５８】
本発明のもう１つの実施形態では、第１のベクターはｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクターである。Ｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクターは、細胞からのウイルス粒子の組立ておよび放出に必要なＥＩＡＶタンパク質を発現し、ウイルスポリタンパク質ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌをコードする遺伝子を含む。第１のベクターはまた、アクセサリータンパク質ＲｅｖおよびＴａｔをコードする遺伝子も発現できる。オープンリーディングフレームＳ２は、その機能が未知であるタンパク質をコードしているが、これをさらに第１のベクターに含めることができる。第１のベクターは、ウイルス遺伝子のレトロウイルス媒介性移動を排除する突然変異を含むよう構築される。このような突然変異は、ウイルスｅｎｖ遺伝子中の配列の欠失、したがって、複製可能なＥＩＡＶの作製を可能にすることを排除する形である場合もあり、またはウイルス逆転写および組込みに必要なゲノムの３’末端の特定のシス作用配列エレメントの欠失である場合もある。したがって、この構築物由来のウイルス遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされる場合でさえ、それらは複製されず、複製可能な野生型ウイルスは生じない。
【００５９】
さらなる実施形態では、この発現系の第１のベクターは１１８７４ｂｐのプラスミドであるプラスミドｐＥＶ５３Ｂおよび塩基対２０９〜８６３に、ＥＩＡＶ主要スプライス供与部位（ｂｐ９１５〜９１６）、ｇａｇコード領域（ｂｐ９２０〜２３８０）、ｐｏｌコード領域（ｂｐ２１３７〜５５７８）およびＯＲＦ Ｓ２コード領域（ｂｐ５７４１〜５９３８）の上流に位置するＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域を含むｃＤＮＡクローンである。このベクターはまた、部分ｅｎｖコード領域（ｂｐ５７６７〜７４３７）およびｒｅｖコード領域（ｂｐ５８９２〜５９９２および６９５４〜７３５８）を含む。ｒｅｖの第１コード領域内に公知のＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）が含まれている（ｂｐ５８９２〜５９９２）。このベクターはｔａｔの第１のエキソンの欠失のために機能的ｔａｔ遺伝子を発現しないが、ｔａｔの第２のエキソンはｂｐ５５９０〜５７３０に存在する。ファージｆ１領域（ｂｐ７７４１〜８１５４）、ＳＶ４０初期プロモーター領域および複製起点（ｂｐ８２１８〜８５４３）、ネオマイシン耐性コード領域（ｂｐ９３８９〜９６２８）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ｂｐ９３８９〜９６２８）、ＣｏｌＥｌ複製起点（ｂｐ１００６０〜１０７３３）およびβラクタマーゼ（アンピシリン耐性）コード領域（ｂｐ１０８７８〜１１７３９）と同様に、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルが提供されている。
【００６０】
本発明の発現系の第２のベクターは、核酸導入のためのベクターとして働くよう設計されており、キャプシド形成およびベクター核酸の逆転写（複製）を支持するのに必要な全てのシス作用配列エレメント、ならびに異種核酸をコードするｃＤＮＡの挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含む。本発明では、異種核酸を含むベクターは、標的細胞に形質導入される遺伝情報、ならびにウイルスゲノムのパッケージングおよび組込みに必要なシス作用配列エレメントを保持する組換えＥＩＡＶ由来ベクターである。第２のベクターは、ｇａｇ配列の特定の部分がＥＩＡＶゲノムのパッケージングにおいて役割を果たすと考えられているので、ｇａｇコード配列のいくつかの部分を含み得る。第２のベクターはまた、レンチウイルスＤＮＡ由来のシス作用配列であり、逆転写に関与するセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびセントラル終結部位（ＣＴＳ）配列を含む、いわゆるレンチウイルス「ＤＮＡフラップ」領域を含み得る。さらに、第２のベクターは、新しく合成されたＲＮＡの核から細胞質への効率的な搬出を促進するシス作用エレメントを含み得る。ＲＮＡ搬出シグナルの例としては、Ｒｅｖに呼応して作用する、相同レンチウイルスＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）、ＲＮＡ安定化またはその他の手段によって遺伝子発現も高め得る異種ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられる。さらに、ＬＴＲに含まれる５’スプライス供与部位は、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：３６４５〜３６５８頁（１９９６）に記載されるように、産生されたウイルスの力価を高める突然変異を含み得る。
【００６１】
本発明の第２のベクターの一例として、ストレプトマイセス・アルボニガーピューロマイシンリポーター遺伝子を発現する、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ、ＥＩＡＶ由来の６８６６ｂｐのプラスミドがある。このプラスミドは、２つのＣＭＶ最初期エンハンサープロモーター領域（ｂｐ１〜７３４および１８６３〜２３８４に位置する）、ＥＩＡＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）（ｂｐ７３５〜８５７）由来のＲ−Ｕ５配列ドメイン、ＥＩＡＶ ＲＮＡキャプシド形成シグナルを含有するリーダー配列（約ｂｐ８７０〜１２００）、突然変異したｔａｔ翻訳開始部位（ｂｐ９０９〜９１１のＣＴＧからＴＡＧ）、ｂｐ９９６〜９９７のスプライス供与部位、突然変異したｇａｇ翻訳開始部位（ｂｐ１０００〜１００３のＡＴＧからＴＡＧ、部分ＥＩＡＶ ｇａｇ配列（ｂｐ１００４〜１２００）、ＥＩＡＶセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ、ｂｐ１３１４〜１３３０）およびセントラル終結部位（ＣＴＳ）配列（ｂｐ１４２２〜１４４８）を含有する「ＤＮＡフラップ」配列、ウイルススプライス受容配列（ｂｐ１７５３〜１７５４）、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ、ｂｐ１７５５〜１８５７）、ピューロマイシンコード配列（ｂｐ２４８０〜３１０５）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｂｐ３１１０〜３９９６）、ＥＩＡＶエンハンサー／プロモーター配列のＥＩＡＶ自己不活化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列欠失（ｂｐ４０３７〜４１８３）、ファージｆ１領域（ｂｐ４２８０〜４７３５）、アンピシリン耐性コード領域（ｂｐ５１７４〜６０３４）および複製のＣｏｌＥ１開始点（ｂｐ５５５４〜６２２８）を含む。
【００６２】
当業者には当然であろうが、異種核酸のヌクレオチド配列はいずれのヌクレオチド配列であり得る。例えば、異種核酸はリポーター遺伝子配列または選択マーカー遺伝子配列であり得る。本明細書において、リポーター遺伝子配列は、発現されるとその存在または活性をモニターできるタンパク質の製造をもたらす、いずれかの遺伝子配列である。適したレポーター遺伝子の例としては、ガラクトキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼなどの遺伝子が挙げられる。あるいは、リポーター遺伝子配列は、その発現によって、何らかの検出可能な方法で細胞生理学に影響を及ぼす遺伝子産物が生じるいずれかの遺伝子配列であり得る。
【００６３】
選択マーカー遺伝子配列は、発現されてタンパク質が生じ得、その存在によってそれを含む細胞を選択的に増殖させることを可能にする、いずれかの遺伝子配列である。選択マーカー遺伝子の例としては、抗生物質（例えば、ピューロマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなど）に対する宿主耐性を付与できる、アミノ酸類似体に対する宿主耐性を付与できる、および／またはさらなる炭素源での、あるいは許容されない培養条件下での細菌の増殖を可能にできる遺伝子配列が挙げられる。遺伝子配列はリポーター遺伝子および選択マーカー遺伝子配列の双方であり得る。本発明のリポーター遺伝子の例としては、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼ活性をコードするｌａｃＺ遺伝子およびピューロマイシン耐性をコードする遺伝子がある。
【００６４】
本発明のリポーターまたは選択マーカー遺伝子配列は、通常細胞におけるベクターの認識または選択を可能にするのに十分であるものである。本発明の一実施形態では、リポーター遺伝子配列は、哺乳類細胞には通常存在せず、したがって、そのような細胞におけるその存在によってベクターの存在を決定的に証明することができる酵素またはその他のタンパク質をコードする。
【００６５】
本発明の異種核酸はまた、所望の生成物、例えば、適した生物活性タンパク質またはポリペプチド、免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはポリペプチド、または治療上活性なタンパク質もしくはポリペプチドのコード配列を含み得る。あるいは、異種核酸は、ＲＮＡ配列に相補的な配列、例えば、アンチセンスＲＮＡ配列を含み得、被験体の細胞における相補ポリヌクレオチドの発現を阻害するためにこのアンチセンス配列を被験体に投与できる。
【００６６】
異種核酸の発現によって、免疫原性および／または抗原性タンパク質および／またはポリペプチドを提供し、免疫応答を達成できるが、これとしては、抗体応答が挙げられる。このような抗体は、被験体においてワクチン接種との関連で治療効果を付与するのに効果的であり得、かつ／または抗体は、血液、血清または腹水などの体液において動物から集めることができる。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態では、第３のベクターはウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む。したがって、このようなベクターは、適したプロモーターの制御下にウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む。ウイルスエンベロープタンパク質はレンチウイルスエンベロープタンパク質であり得る。しかし、別のウイルスのエンベロープ遺伝子を利用することによって、本発明のウイルスベクターが感染できる細胞の宿主域を変更することが可能である。つまり、特定のウイルスのエンベロープタンパク質の、その他のウイルスのキャプシド形成に参加する能力をうまく利用することによって本発明のＥＩＡＶベクターの宿主域を拡大することが可能である。水泡性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ、例えば、ＲｏｓｅおよびＧｉｌｌｉｏｎｅ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．３９：５１９〜５２８頁（１９８１）、ＲｏｓｅおよびＢｅｒｇｍａｎｎ、Ｃｅｌｌ ３０：７５３〜７６２頁（１９８２）参照）は、他のウイルスのゲノムおよびマトリックス成分を含むシュードビリオンを効率的に形成する。これらのＶＳＶ−Ｇシュードベクターは極めて広い宿主域を有し、限外濾過によって高力価に濃縮できる。本明細書において、用語「シュード」とは、一のウイルスの核酸を含むが、別のウイルスのエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を指す。
【００６８】
本発明の第３のベクターの一例としては、プラスミドおよびｃＤＮＡクローンｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ、エンベロープ糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇの発現ベクターがある。このプラスミドは５６７９塩基対を含み、ＣＭＶ最初期エンハンサープロモーター領域（ｂｐ１〜７９５）、キメライントロン領域（ｂｐ８５７〜９８９）、ＶＳＶ−Ｇコード領域（ｂｐ１０８８〜２６３３）、ファージｆ１領域（３０９３〜３５４８）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ｂｐ２７８２〜３００３）、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１開始点（ｂｐ４９９２〜５６６６）およびアンピシリン耐性コード領域（ｂｐ３９８７〜４８４７）を含む。
【００６９】
本発明の一方法では、複製に欠陥のある感染性ＥＩＡＶ粒子を、本明細書に開示した方法にしたがい、当業者に公知の技術と組合せて調製できる。本方法は、レンチウイルス許容細胞を、本発明のベクターを用いてトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた細胞においてＥＩＡＶ由来粒子を製造することと、細胞からウイルス粒子を回収することとを含む。レンチウイルス許容細胞をトランスフェクトするステップは、当業者に公知のいずれかの適した手段にしたがって実施できる。例えば、本発明の一方法では、本明細書に記載した３種のプラスミド発現系を用い、一過性のトランスフェクションによってＥＩＡＶ由来のレトロウイルスベクター粒子を作製する。もう１つの実施例として、ベクターの細胞への取り込みは、例えば、細胞をＤＥＡＥデキストランで処理すること、ベクター由来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に添加する前にＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で処理することなどのいずれかの適した手段によって、またはエレクトロポレーションによって達成できる。これらの技術は当分野では周知である。
【００７０】
細胞における感染性ウイルス粒子の製造を容易にするステップは、従来技術を用いて、例えば、当分野で周知の標準的な細胞培養増殖技術によって実施する。
【００７１】
感染性ウイルス粒子を回収するステップもまた、従来技術を用いて実施する。例えば、当分野では公知のように、感染性粒子は細胞溶解または細胞培養物の上清の回収によって回収できる。場合によって、回収したウイルス粒子を所望であれば精製してもよい。適した精製技術は当業者には周知である。
【００７２】
当業者により所望であれば、本発明のベクターおよび方法を用いてレンチウイルス保存溶液を調製してもよい。ウイルス保存溶液を調製する方法は当分野では公知であり、例えば、Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８〜６３３頁（１９９５）およびＬａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０〜５１１３頁（１９９２）によって示されている。本発明において保存溶液を製造する方法では、本発明のレンチウイルス許容細胞を、本発明のベクターによりトランスフェクトする。次いで、細胞を適した細胞培養条件下で増殖させ、レンチウイルス粒子を前記のように細胞自体か細胞培地のいずれかから回収する。
【００７３】
本発明述べクターはまた、パッケージング細胞（すなわち、ＥＩＡＶウイルスタンパク質を発現する細胞であって、この細胞はそれ自体では感染性ウイルス粒子を作製できない）の調製において有用である。レトロウイルスタンパク質を発現するパッケージング細胞を調製する方法は当分野出は公知であり、例えば、Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，６５０，７６４号に示された方法によって例示されており、この参照文献はこれらの方法の教示のためにその全体が本明細書に組込まれる。本発明のパッケージング細胞は、少なくとも一のＥＩＡＶ構造タンパク質をコードするＥＩＡＶ核酸を含み、核酸がパッケージングシグナルに欠陥があり、したがって、細胞自体を少なくとも一のＥＩＡＶ構造タンパク質を産生できるが、複製可能な感染性ウイルスは産生できないようにする、本発明のレンチウイルス許容細胞を含み得る。次いで、パッケージング細胞は、導入されたその他の核酸配列（例えば、ｐＥＳＩＮ６１．ＣｐｕｒｏＷおよび／またはｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ）を有し、これは異種核酸と適当なパッケージングシグナルとを含み得る。さらなる一の配列または複数の配列によりトランスフェクトされると、異種核酸を含むが、そのウイルス自体は複製可能でないＥＩＡＶウイルスのストックを製造するためにパッケージング細胞が用いられる。
【００７４】
本発明を以下の実施例でより詳しく説明するが、その多数の改変および変法が当業者には明らかであるので、これは例示としてのみ意図されるものである。
【実施例１】
【００７５】
細胞
ＨＥＫ２９３細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。これらの細胞のクローンのライブラリーは制限希釈によって調製し、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを産生する最大の能力を示した細胞株をスクリーニングした（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｏｓｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇｅ ｏｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８８６１〜７２頁（１９９８））。これらのクローンのうちの１つ、２９３．１０１をＥＩＡＶヘルパー細胞株およびＥＩＡＶベクターパッケージング細胞を構築するために選択した。Ｂ−２４１細胞株はＥＩＡＶベクターヘルパー細胞株である。これらの細胞は２９３．１０１細胞から、ＥＩＡＶｇａｇ、ｐｏｌ、Ｓ２およびＣＭＶプロモーター由来のｒｅｖ遺伝子を発現する発現ベクター（ＥＶ５３Ｂ）での安定なトランスフェクションによって得られた。ＢｉＧ−４５細胞株はＥＩＡＶパッケージング細胞株である。これらの細胞は、テトラサイクリン調節可能ＶＳＶ−ＧエンベロープｃＤＮＡおよびＣＭＶプロモーター駆動テトラサイクリンレプレッサー遺伝子をコードするプラスミド発現ベクターでの安定なトランスフェクションによってＢ−２４１細胞から導いた。ＢｉＧ−４５／８Ｚ−２０細胞は、ｐＯＮＹ８Ｚ、細菌ｌａｃＺリポーター遺伝子をコードするＥＩＡＶ遺伝子導入ベクターでのＢｉＧ−４５細胞の安定なトランスフェクションにより得られた（Ｒｏｈｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓａｆｅｔｙ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｏｎｐｒｉｍａｔｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３４６：４６６−５００（２００２））。
【００７６】
インテグリン発現プラスミド
ヒトαIIbまたはαvインテグリンサブユニットを発現させるためにはｐＣＸＩＨ発現ベクターを用いた。野生型または突然変異したヒトβ3インテグリンサブユニットを発現させるためにはｐＣＸＩＰ発現ベクターを用いた。これらのベクターは、挿入されたｃＤＮＡを発現させるためにＣＭＶプロモーターを用い、動物細胞における選抜のためのハイグロマイシン耐性遺伝子（ｐＣＸＩＨ）またはピューロマイシン耐性遺伝子（ｐＣＸＩＰ）のいずれかに結合しているＩＲＥＳ配列を含む。
【００７７】
ｐＣＸＩＰプラスミドは５５６２ｂｐの長さであり、標的遺伝子ならびにピューロマイシン選択マーカーを発現するよう設計されたバイシストロニック発現ベクターである。このベクターはＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域（ｂｐ１〜５３２）、発現されようとする配列を挿入するためのマルチプルクローニングサイト領域（ｂｐ６３９〜６８７）、配列内リボソーム進入部位配列（ｂｐ６８９〜１２６１）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｂｐ１２９８〜１８９４）、ネズミ白血病ウイルス由来ポリＡ付加シグナル（ｂｐ２２６８〜２６９３）、ＤＮＡ複製のＳＶ４０開始点（ｂｐ２９７３〜３２５９）、ＤＮＡ複製領域のＣｏｌ Ｅ１開始点（ｂｐ３５８０〜４２００）およびアンピシリン耐性遺伝子（ｂｐ４３４０〜５２００）を含む。
【００７８】
ｐＣＸＩＨプラスミドは６１６１ｂｐの長さであり、標的遺伝子ならびにハイグロマイシン選択マーカーを発現するよう設計されたバイシストロニック発現ベクターである。このベクターはＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域（ｂｐ１〜５３２）、発現されようとする配列を挿入するためのマルチプルクローニングサイト領域（ｂｐ６４０〜６８０）、配列内リボソーム進入部位配列（ｂｐ６８９〜１２６３）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｂｐ１２８７〜２３２１）、ネズミ白血病ウイルス由来ポリＡ付加シグナル（ｂｐ２８６７〜３２９２）、ＤＮＡ複製のＳＶ４０開始点（ｂｐ３５７２〜３８５８）、ＤＮＡ複製領域のＣｏｌ Ｅ１開始点（ｂｐ４１７９〜４７９９）およびアンピシリン耐性遺伝子（ｂｐ４９３９〜５７９９）を含む。
【００７９】
ＢｉＧ−４５細胞におけるαvおよびβ3インテグリンサブユニットの双方の発現のために、ｐＶＩＴＲ０２−ｍｃｓ発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いた。このベクターは、ヒトαvインテグリンを発現させるために複合性ヒトフェリチン重鎖プロモーター／ＳＶ４０エンハンサー配列を用い、ヒトβ3インテグリンを発現させるために複合性ヒトフェリチン軽鎖プロモーター／ＣＭＶエンハンサー配列を用いる。
【００８０】
２９３ベースのＥＩＡＶ産生細胞におけるインテグリンサブユニットの発現
αIIb、αvおよびβ3サブユニットをコードするインテグリンｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを用いて発現ベクターにサブクローニングし、種々の組合せをＢ−２４１ ＥＩＡＶヘルパー細胞株に安定にトランスフェクトして一連の細胞株を作製した。１２日の薬物選抜後、各トランスフェクションから得られた細胞コロニーをプールし、個々のインテグリンサブユニットαIIb、αvおよびβ3の細胞表面発現について、またはフローサイトメトリーによる生細胞の免疫蛍光によってインテグリン受容体αIIbβ3、もしくはαvβ3として分析した（図１）。各インテグリンがＢ−２４１細胞の細胞表面に発現されていることがわかった。αおよびβサブユニット双方の発現が一緒になって、個々のサブユニットを発現することと比較して、細胞表面での全体的な発現を増強した。免疫蛍光研究によって、各インテグリンの発現が、内因性インテグリン発現と比べて大きく増強されることが確認された。
【００８１】
インテグリン修飾した２９３細胞の組織培養基材への接着
細胞接着アッセイを用いてβ3インテグリンサブユニット単独またはそのαIIbもしくはαv結合パートナーとの発現が組織培養基材への接着の増加をもたらすかどうかを調べた。このアッセイは、緑色蛍光タンパク質を発現する２９３ベースのＢｉＧ−４５ＥＩＡＶパッケージング細胞においてインテグリンサブユニットを一過性に発現させることを含んでいた。この細胞を１２ウェルプレート中のウェルあたり３×１０5個細胞でプレーティングした。プレーティングの１時間後、細胞の洗浄前後の細胞の蛍光を測定することによって細胞のコロニー形成率を求めた。β3インテグリンサブユニット単独の過剰発現は、修飾していない細胞と比較して、２９３細胞の未処理組織培養プレートへの接着の有意な増加をもたらした（図２）。αvとの同時発現は、２９３細胞接着をさらに増加させた。β3サブユニットの突然変異型も調べたが、血小板でαIIbと結合すると、αIIbβ3受容体を恒久的に活性化させる。突然変異β3サブユニットは、野生型β3サブユニットと比較して、単独でまたはαIIbもしくはαvと共同しても細胞接着において何の増加も提供しなかった（図２）。したがって、２９３由来細胞における野生型ヒトαvβ3インテグリン受容体の発現は、標準組織培養プレートに接着するその能力を有意に高めた。
【００８２】
２９３細胞のローラーボトル培養の際のインテグリン修飾の効果
レンチウイルスベクターを製造するために必要な時間と労力を低減するために、インテグリン修飾した細胞のローラーボトル培養において接着し増殖する能力を調べた。最初の実験では、インテグリンβ3修飾されたＢ−２４１細胞または修飾されていないＢ−２４１細胞をローラーボトルに播種した。翌日、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真を撮った（図３）。β3修飾された細胞は、修飾されていない細胞よりも有意に良好に接着したが、細胞の凝集がいくらか現れた。そのαv結合パートナーとのβ3発現の作用を調べるために、ＥＩＡＶ−ｌａｃＺベクターを産生するＢｉＧ−４５パッケージング細胞（ＢｉＧ−４５／８Ｚ−２０）を、両インテグリンを発現するｐＶＩＴＲＯ２ｍｃｓベクターにより安定にトランスフェクトし、ローラーボトルに播種した。播種の翌日、Ｘ−Ｇａｌを用いて細胞をｌａｃＺ遺伝子の発現について染色した。図３に示されるように、細胞はより均一な接着を示し、細胞凝集はβ3単独で修飾された細胞よりも少なかった。続く実験では、ローラーボトルに播種した２４時間後に、インテグリン修飾された、および修飾されていないＢ−２４１細胞のコロニー形成率を求めた。β3およびαvβ3修飾されたＢ−２４１細胞の双方について、コロニー形成率は９８．３％±１．５％（ｎ＝６）であった。一方、修飾されていないＢ−２４１細胞については、コロニー形成率はほんの４５．７％±１５．３％（ｎ＝３）であった。
【００８３】
レンチウイルスベクター産生に対するインテグリン発現の効果
ピューロマイシン遺伝子をコードするＥＩＡＶベクター（ＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ）ならびにＶＳＶ−ＧエンベロープをコードするベクターをＢ−２４１ヘルパー細胞株に同時トランスフェクションすることによって、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションを用いる一過性のベクター産生系におけるＥＩＡＶベクター産生に対するインテグリン発現の効果を調べた。αIIbまたはαvインテグリンサブユニットの発現は、単独ではベクター力価に対して全く効果がなかった（表１）。β3とのαIIbの同時発現は、一貫して、ベクター力価の４〜５倍の低下をもたらした。対照的に、β3の単独またはαvインテグリンと組合せた発現は、ベクター産生の３０〜６０％の増加をもたらした。
【００８４】
Ｂ−２４１細胞、またはその他の２９３ベースの細胞株のαvβ3インテグリンでの修飾は、細胞の平坦化をもたらし、その結果、インテグリン修飾された細胞は修飾されていない細胞よりも大きな表面積を占めた。最適化したトランスフェクションプロトコールは、通常、８０〜９０％コンフルエントである培養物を用いるので、これによりトランスフェクション実験に修飾されていない細胞よりも少ない数のインテグリン修飾された細胞がもたらされた。インテグリン修飾された細胞からのＥＩＡＶベクター産生をさらに特性決定するために、細胞あたりの感染性ベクターの収量を求め、修飾されていない細胞と比較した。さらに、ＤＮＡ取り込みの効率を高めるために用いられる薬剤（グリセロールまたはＤＭＳＯ）の効果を調べた（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ． １９８４．「Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｏｒ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｈｏｃｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １２：５７０７〜１７頁）。表２に示されるように、細胞あたりの産生されたベクターの収量は、αvβ3インテグリンで修飾された細胞を用いると３．６倍増加した。さらに、インテグリン修飾された細胞におけるベクターの収量は、ＤＮＡ取り込みを増強するためにプロトコールにグリセロールまたはＤＭＳＯショック処理を組込むことによって約３倍さらに高めることができる（表２）。対照的に、修飾されていない培養物からのベクター産生は、グリセロールまたはＤＭＳＯ処理によって増強されなかった。１つには、これは修飾されていない培養物による接着性が弱いことによる細胞の損失に起因していた。３０秒までのグリセロールまたはＤＭＳＯ処理期間の減少によって、修飾されていない培養物の細胞損失の低減がもたらされたが、ベクター収量は高まらなかった。
【実施例２】
【００８５】
ＨＥＫ２９３細胞インテグリン発現プロフィールの修飾によって、レンチウイルスベクターの好都合な大規模ローラーボトル製造が可能になる。
ローラーボトルを用いるＥＩＡＶおよびＨＩＶに基づくレンチウイルスベクター製造
インテグリン修飾された２９３細胞のローラーボトル培養を用いて大規模高力価ベクター製造が達成される可能性を調べた。これらの研究では、ローラーボトルを用いてレンチウイルスベクターを製造するための種々の方法を試験した。いくつかの実施例を表３に示す。一実施例では、ＥＩＡＶｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を安定に発現する、αvβ3修飾されたＢ−２４１ヘルパー細胞のローラーボトル培養物を、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするＥＩＡＶベクター（ＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ）とＶＳＶ−Ｇエンベロープ遺伝子を用いて同時トランスフェクションした。１０００倍濃縮した後、力価が１．２×１０9感染単位／ｍｌのベクター調製物が得られた。このレベルのベクター製造は、組織培養プレートで増殖させた修飾されていない細胞によって産生されたベクター製造のレベルに匹敵することが好都合である（表１）。
【００８６】
第２の実施例では、ＥＩＡＶ ｌａｃＺ遺伝子により安定にトランスフェクトされたＢｉＧ−４５ ＥＩＡＶパッケージング細胞株を誘導して、濃縮後に２×１０9という力価を有するウイルスを製造した。第３の実施例は、手順をスケールアップして、動物研究に適した多量のベクターを製造できることを示す。この場合には、目的はイヌ造血幹細胞へのエクスビボ遺伝子導入に必要なベクター量（＞３×１０9総感染単位）を製造することであった。αvβ3修飾された２９３Ｔ細胞を含む１２本のローラーボトルの３プラスミドトランスフェクションを実施しＨＩＶ−１ベクターを製造した。トランスフェクションの４８時間後に始まる３連日でベクター（９０ｍｌ／ローラーボトル）を回収した。合計３２４０ｍｌを回収し、約５５０倍に濃縮して６ｍｌとした。全収量は、動物研究を実施するのに十分なものより多い１．４×１０10感染ベクター粒子であった。
【００８７】
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）はウイルス遺伝子導入ベクターの製造のために最も広く用いられている細胞種である。それらは、組換えウイルスを一過性に発現させるためのいくつかのトランスフェクション試薬およびプロトコールを用いて、ウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡにより高効率にトランスフェクションすることが可能である。ウイルス製造のための種々の安定な２９３ベースのパッケージング細胞株も作製した。非霊長類レンチウイルスウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースにした遺伝子導入系を開発したが、これは高力価ウイルス製造のために、安定な２９３細胞ベースの誘導可能パッケージング細胞株（ＢｉＧ４５）を利用している。２９３細胞を用いるベクターの大規模製造は、それらが容易に標準組織培養プレートから離れるために困難であることが多い。これは、細胞に懸濁培養での増殖を適用することによって克服できるが、これによってウイルス力価の有意な損失がもたらされ得る。あるいは、フィブロネクチンまたはポリリジンなどの細胞接着基材で処理した容器で培養物を増殖させることができる。しかし、両戦略とも大規模ベクター製造の費用を有意に増大させる。
【００８８】
本研究では、２９３細胞のインテグリン発現プロフィールを修飾することによってその接着性を高める新規戦略を試験した。第１に試験したのは、インテグリンβ3サブユニットの単独またはその公知の結合パートナーαvもしくはαIIbと組合せた過剰発現の効果であった。細胞接着アッセイは、緑色蛍光タンパク質を発現する２９３ベースのＥＩＡＶパッケージング細胞における、一過性に発現するインテグリンサブユニットに関連していた。この細胞を２〜４×１０5個細胞／ウェルという密度で未処理のマルチウェルプレートにプレーティングした。プレーティングの１時間後に、細胞の洗浄の前後に細胞の蛍光を測定することによって細胞のコロニー形成率を調べた。２９３細胞におけるβ3インテグリンサブユニットの過剰発現は、細胞の未処理の組織培養プレートへの接着において、修飾されていない細胞と比較して有意な増大をもたらした。αvの同時発現は２９３細胞接着をさらに高めたが、αIIbは高めなかった。インテグリン修飾された２９３細胞からのＨＩＶおよびＥＩＡＶベースのレンチウイルスベクター双方の製造も調べた。この修飾の結果として標的細胞におけるベクター力価およびレポーター遺伝子発現が損なわれることはなく、これはインビボ実験のためのベクターを作製するためのローラーボトルにおけるベクター製造のスケールアップを導いた。
【００８９】
つまり、２９３細胞におけるαvおよびβ3の過剰発現は、ウイルスベクター産生を損なうことなく標準の未処理組織培養ディッシュへの接着を増大させる。
【００９０】
上記は本発明の原理の例示としてのみ考慮される。さらに、当業者には多数の改変および変法が容易に思い浮かぶので、本発明を本明細書に示され、記載された正確な構築物および操作に制限しようとは望まない。したがって、それに応じて、全ての適した改変および等価物は本発明の範囲内に含まれる。
【００９１】
本明細書に引用された、全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、参照文献が示される文および／または段落に関連する教示のために、参照によりその全体が組込まれる。
【００９２】
【表１】
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ−Ｆ】Ｂ−２４１細胞におけるヒトインテグリンｃＤＮＡの細胞表面発現。種々のヒトインテグリンｃＤＮＡにより安定にトランスフェクトされたＢ−２４１細胞株を組織培養プレートからトリプシン処理した。無傷の生細胞を、αサブユニットの検出のためのフルオレセイン（ＦＩＴＣ）か、β3サブユニットの検出のためのフィコエリテリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）（ＰＥ）のいずれかに結合しているマウスモノクローナル抗体で染色した。用いた抗体は、ヒトβ3インテグリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５７５４）、ヒトαvインテグリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、カタログ番号ＣＢＬ４９０Ｆ）およびインテグリンαIIbインテグリンサブユニットとしても知られているヒト血小板糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、カタログ番号ＣＢＬ５８９Ｆ）に特異的なものであった。パネルは種々のＢ−２４１細胞株誘導体の蛍光プロフィールを示す。パネルＡ：修飾されていないＢ−２４１細胞。パネルＢ：β3インテグリンサブユニットとしても知られているヒト血小板ＧＰＩＩＩａを発現するよう修飾された細胞。パネルＣ：ヒトαIIbインテグリンサブユニットを発現するよう修飾された細胞。パネルＤ：フィブリノゲン、フォンウィルブランド因子、フィブロネクチンおよびビトロネクチンを含むいくつかの細胞外マトリックス分子のαIIbβ3インテグリン受容体を発現するよう修飾された細胞。パネルＥ：αvインテグリンサブユニットを発現するよう修飾された細胞。パネルＦ：ビトロネクチンのαvβ3受容体を発現するよう修飾された細胞。
【図２】ヒトインテグリンを用いるトランスフェクション後のＢｉＧ−４５パッケージング細胞の接着の増加。ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターを含有する、ＢｉＧ−４５ＥＩＡＶパッケージング細胞を、種々のヒトインテグリンｃＤＮＡによりトランスフェクトした。細胞を標準組織培養プレートのウェルに播種した。播種の１時間後、各ウェルのＧＦＰ蛍光を、穏やかな洗浄の前後に測定し、プレートに接着している細胞のパーセンテージを求めた。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒプレートリーダーを用いて蛍光を測定した。
【図３】ヒトインテグリンｃＤＮＡを用いる修飾を含むか含まないＥＩＡＶベクター産生細胞株のローラーボトル培養。各ボトルに７．７５×１０7個細胞を播種した。
【図４】プラスミドｐＥＶ５３Ｂ。
【図５】プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ。
【図６】プラスミドｐＣＸＩＰおよびｐＣＸＩＨ。
【図７】プラスミドｐＥＶ５３。
【図８】プラスミドｐＥＶ５３Ａ。
【図９】プラスミドｐＥＣ−ｌａｃＺ。
【図１０】プラスミドｐＥＣ−ｐｕｒｏ。
【図１１】プラスミドｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ。
【図１】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／５６６，６１３号の利益を主張する。
【０００２】
政府支援の明示
本発明に関連する研究は、ＮＩＨ／ＮＨＬＢＩによって与えられた米国政府補助金番号ＨＬ５１８１８によって少なくとも一部は支援されていた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細胞培養環境において接着性が増強された修飾された細胞ならびにこれらの細胞を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞は、主にその増殖の容易さと外来ＤＮＡにより効率的にトランスフェクトされるその能力のために、商業ベースと研究においての双方で広く用いられている多種多様な細胞のうちの一例である。しかし、２９３細胞の誘導体および種々のその他の細胞に関する１つの問題として、それらが組織培養容器に接着しにくいことが多いということがある。このことはこれらの細胞の操作を困難にする。この問題を克服するための１つの方法として細胞培養容器をビトロネクチンまたはポリリジンでコーティングすることがあるが、費用とこのような細胞培養物の取り扱いの容易さの双方に影響が生じ、このためこのアプローチは細胞の大規模製造には望ましくないものとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞がインテグリンを細胞表面に発現し、組織培養基材への接着を増強するよう修飾できる方法および組成物を提供することによって当分野におけるこれまでの欠点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む、前記組換え核酸からなる、または本質的に前記組換え核酸からなる、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞を提供する。
【０００７】
本明細書では、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）および（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む、からなる、および／または本質的にそれからなる２９３．０１細胞をさらに提供する。
【０００８】
本発明は、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る核酸を細胞に導入することと、ｂ）細胞が培養容器の表面と接着できる条件下で（ａ）の細胞を培養容器の表面と接触させることとを含む、からなる、または本質的にそれらからなる細胞を、培養容器の表面に接着させる方法をさらに提供する。
【０００９】
いっそうさらなる実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することを含む、からなる、または本質的にそれらからなる、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞を製造する方法を提供する。
【００１０】
本明細書ではまた、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せとからなる群から選択される組換え核酸を細胞に導入することと、ｂ）（ａ）の細胞を培養容器に入れることと、ｃ）ウイルス粒子が産生される条件下で、感染性ウイルス粒子を（ｂ）の培養容器に入れることとを含む、からなる、または本質的にそれらからなる、培養容器中の細胞においてウイルス粒子を製造する方法を提供する。
【００１１】
さらに、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を２９３．１０１細胞に導入することと、ｂ）培養容器に（ａ）の細胞を入れることと、ｃ）Ｉ）レンチウイルスｇａｇおよびレンチウイルスｐｏｌをコードするレンチウイルス核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれからなる第１のベクターであって、（１）レンチウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子に少なくとも１つ欠陥を含み、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む第１のベクターと、ＩＩ）ベクターゲノムの逆転写に必要なシス作用配列エレメントを含むレンチウイルス核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれからなる第２のベクターであって、（１）能力のあるパッケージングシグナルを含み、（２）異種遺伝子を含む第２のベクターと、ＩＩＩ）ウイルスの核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれらからなる第３のベクターであって、（１）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（２）欠陥のあるパッケージングシグナルを含む前記の第３のベクターとを、組換えレンチウイルス粒子が産生される条件下で（ｂ）の細胞に導入することとを含む、からなる、または本質的にそれらからなる、培養容器中の２９３．１０１細胞において組換えレンチウイルス粒子を製造する方法を提供する。
【００１２】
本明細書では、本発明の修飾された細胞を、レンチウイルス核酸配列を含む、からなる、または本質的にそれからなるベクターであって、欠陥のあるパッケージングシグナルを含むベクターによりトランスフェクトすることを含む、からなる、または本質的にそれからなる、パッケージング細胞を作製する方法をさらに提供する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の修飾された細胞であって、パッケージングシグナルに欠陥がある、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードしているレンチウイルス核酸配列を含み、その結果、細胞自体が少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質を産生するが、複製能力のある感染性ウイルスは産生しない細胞を含むパッケージング細胞を提供する。
【００１４】
本発明の種々のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」または「その又は前記（ｔｈｅ）」は１以上を意味する場合がある。例えば、「一の」細胞は単一の細胞を意味する場合もあるし、多数の細胞を意味する場合がある。
【００１６】
また、本明細書において、「および／または」とは、１以上の関連記載事項のありとあらゆる可能性のある組合せを指し、包含し、ならびに代わりに（「または」）で解釈される場合には組合せの欠如を指し、包含する。
【００１７】
本発明は、細胞がインテグリンを発現するよう修飾することによって、修飾されていない細胞よりもはるかに強力に組織培養基材に接着される細胞が得られるという予期しない発見に基づいている。
【００１８】
したがって、一実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が高められた修飾された細胞を提供する。本細胞は、細胞においてインテグリンサブユニットコード配列が発現されるおよび／または過剰発現される条件下で維持する。いくつかの実施形態では、本発明のインテグリンサブユニットをコードする核酸の発現のタイミングおよび／または量を制御できるよう、核酸発現を調節するための当分野で周知の方法にしたがってインテグリンサブユニットコード配列を細胞で一過性に発現させる。
【００１９】
接着性の増加量は、修飾されていない細胞の接着性と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍であり得る。接着性の増加は、本明細書に記載される修飾された細胞か、修飾されていない細胞のいずれかを、組織培養基材［例えば、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアクリレート、ポリソルベートなど）、ガラス、寒天、コラーゲン、フィブロネクチン、セラミック、金属、生分解性または非生分解性ポリエステルスキャフォールド、管類など］と、細胞が基材と接着するのを可能にするのに十分な期間接触させることと、本明細書に記載された方法、ならびに細胞を定量するためのいずれかの技術分野で公知の方法にしたがって、基材に接着されている細胞量を求めることとによって測定する。修飾されていない細胞よりもより多数が組織培養基材に接着する修飾された細胞は、接着性が高められた細胞である。接着性の増加は、接着された細胞の増加数と相関があり、Ｘ倍増加（例えば、２倍、３倍など）として、パーセンテージ（例えば、修飾されていない細胞と比較して、基材に接着された１０％多くの修飾された細胞に基づく、接着性の１０％増加）として、および／またはベースライン測定値に対する増加を同定するいずれかの他の技術分野で公知の値にしたがって表すことができる。
【００２０】
本発明の細胞は、培養条件下で増殖できる、かつ／または維持できる、かつ、インテグリンをコードする組換え核酸を受け入れ、発現できる細胞種であればいずれでもあり得る。例えば、本発明の細胞は、それだけには限らないが、ＢｉＧ−４５細胞、２９３．１０１細胞、Ｂ−２４１細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｄａｍｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞およびＭＳ−５細胞であり得る。
【００２１】
本発明の細胞は単一で存在する細胞である場合もあるし、細胞集団で存在する場合もあり、本発明の細胞は組織培養容器に含めることができ、これらは、フラスコ、ボトル、ローラーボトル、バイアル、チューブ、チャンバー、フラスコ、ディッシュ、スライド、プレート、単一ウェルとして存在する場合もマルチプルウェルプレート中に存在する場合も、および／またはそれらの組合せである場合もある組織培養ウェルであり得るが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の細胞は、ヒトインテグリンであってもよく、インテグリンβ3サブユニット、インテグリンαvサブユニット、インテグリンαIIbサブユニット、および／または任意の順序のこれらのインテグリンサブユニットのいずれかの組合せであり得るが、これらに限定されないインテグリンをコードする組換え核酸の導入によって修飾される。本発明は、その上で細胞が増殖する基材上にコーティングされ得るか、細胞によって分泌され得る細胞外マトリックス分子と結合するインテグリンのいずれかの組合せをさらに提供する。いくつかの例として、コラーゲン受容体α２−β１、ラミニン受容体α６−β４、いくつかのビトロネクチン受容体αＶ−β５およびβ１が挙げられ、これらはフィブロネクチンなどの受容体細胞外マトリックス分子の種々のαサブユニットと組合せることができるが、これらに限定されない。本発明のインテグリンは、例として、ニワトリ、イヌ、マウスおよびラットのような、いずれの種由来のものであり得る。これらのインテグリンをコードする核酸は、一以上の核酸構築物で細胞に導入でき、それから核酸が発現されて細胞内でインテグリンタンパク質が産生され得る。
【００２３】
本明細書において、「核酸」とは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧからなるＤＮＡ、または塩基Ａ、Ｕ（Ｔの代わり）、ＣおよびＧからなるＲＮＡであり得る一本鎖または二本鎖分子を指す。本発明の核酸はコード鎖またはその相補物に相当し得る。本発明の核酸は、天然に存在する配列と順序どおり同一であり得るか、十分に特性決定された核酸コードの縮重のために、天然に存在する配列中に見られるものと同一のアミノ酸をコードする別のコドンを含み得るヌクレオチド配列を含み得る。さらに、本発明の核酸は、得られるポリペプチドの生物活性が保持されるような、当分野で周知であるようなアミノ酸の保存的置換に相当するコドンを含み得るヌクレオチド配列を含み得る。本発明の核酸は、核酸を単離するための当分野で周知の方法にしたがって細胞から単離できる。あるいは、本発明の核酸は、核酸の合成のための、文献に十分に記載されている標準プロトコールにしたがって合成できる。また、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの必須の構造および／または機能（すなわち、生物活性）は維持されるという条件で、この核酸への修飾が検討される。
【００２４】
「組換え」核酸とは、当分野で周知の遺伝子工学技術を用いて作製されたものである。
【００２５】
核酸配列の、用語「発現する」または「発現」（およびその文法上の同等物）とは、配列が転写され、場合によっては翻訳されることを意味する。
【００２６】
本発明のインテグリンをコードする核酸は、細胞内でのインテグリンの発現に向かわせるプロモーターをさらに含み得る。したがって、特定の実施形態では、プロモーターを機能し得る形で、インテグリンをコードしている組換え核酸に連結できる。プロモーターは、細胞におけるインテグリン核酸の構成的発現をもたらす、構成的プロモーターであり得、プロモーターは、プロモーターを活性化する誘導可能エレメントの存在下でのみ細胞におけるインテグリン核酸の発現をもたらし、それによって組換え核酸からのインテグリンタンパク質の産生が制御されるのを可能にする、誘導可能プロモーターであり得る。
【００２７】
本発明のプロモーターの例としては、それだけには限らないが、ＣＭＶ最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、伸長因子１α、βアクチン、真核細胞の開始因子４Ａ１、複合性ＣＭＶエンハンサー／βアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、複合性伸長因子１αプロモーター／ＨＴＬＶ５’非翻訳領域、複合性ＳＶ４０エンハンサー／ヒトフェリチン重鎖伸長因子１αプロモーター、複合性ＣＭＶエンハンサー／ヒトフェリチン軽鎖伸長因子１αプロモーターおよび複合性ＣＭＶプロモーター／テトラサイクリンオペレーターが挙げられる。本発明のプロモーターは、本発明の組換え核酸にいずれかの組合せおよび／または順序で存在し得る。
【００２８】
本発明の核酸は、それだけには限らないが、形質導入（例えば、ウイルスベクターによる感染）、トランスフェクション（エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクションなど）を含む当分野で周知の方法にしたがって細胞に導入できる。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｄ）（ａ）および（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を含む２９３．０１細胞を提供する。本明細書に記載したように、インテグリンをコードする核酸は、同一または異なる構築物に、いずれかの順序および／または組合せで存在し得、細胞に同時におよび／または順次導入できる。本核酸はまた、同時におよび／またはいずれかの順序および／または組合せで発現させることができる。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、インテグリンβ3サブユニットをコードする組換え核酸とインテグリンαvサブユニットをコードする組換え核酸とを含む２９３．１０１細胞を提供する。これらの組換え核酸は、同一または異なる構築物に存在し得、細胞に、いずれかの組合せおよび／または順序で同時におよび／または逐次導入することができ、同時におよび／またはいずれかの順序で発現させることができる。
【００３１】
本明細書では、本発明の細胞を製造するための種々の方法をさらに提供する。したがって、一実施形態では、本発明は細胞を培養容器の表面に接着させる方法であって、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る核酸を細胞に導入することと、ｂ）細胞が培養容器の表面に接着できる条件下で（ａ）の細胞を培養容器の表面と接触させることとを含む方法を提供する。
【００３２】
細胞が培養容器の表面と接着できる条件は、本明細書に記載されており、いずれかの所与の細胞種について当分野で周知であり、培養容器に含まれる培地、ならびに培養容器が維持される環境（例えば、温度、湿度、二酸化炭素含量など）に基づいている。本発明の細胞種の培地処方および培養条件は、当分野では十分に確立されている。一例として、ＨＥＫ２９３細胞は以下の条件下の培養で増殖され、維持される。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清を含有する「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭカタログ番号１１９９５−０６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）で、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で培養される。細胞が９０％コンフルエントになると、維持のために１：６希釈で継代される。
【００３３】
本明細書では、ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することを含む、修飾されていない細胞の接着性と比較して接着性が少なくとも２倍、少なくとも３倍および／または少なくとも４倍高められた修飾された細胞を製造する方法がさらに提供される。
【００３４】
本発明の細胞は、核酸取り込みを増加させるために一過性のトランスフェクションプロトコールにおいて通常用いられる処理（例えば、グリセロールショックまたはＤＭＳＯショック）に、より良好に抵抗することが本明細書に示される。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、トランスフェクションプロトコールに使用される処理に抵抗するための増強された能力を提供する本明細書に記載される修飾を用いて、核酸を取り込む能力が増強された本発明の細胞を提供し、本明細書に記載されるプロトコールにしたがってこのような細胞を作製する方法、ならびにウイルス粒子の製造のためにこのような細胞を使用する方法をさらに提供する。
【００３５】
本発明の細胞は、細胞内での種々の材料（例えば、タンパク質、ウイルスなど）の製造をはじめ、種々の商業適用および研究適用に使用でき、接着性の増加による製造に利用できる培養容器中の細胞数の増加によってその収率が改善される。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することと、ｂ）（ａ）の細胞を培養容器に入れることと、ｃ）ウイルス粒子が産生される条件下で、（ｂ）の培養容器に感染性ウイルス粒子を入れることを含む、培養容器中の細胞におけるウイルス粒子の製造方法を提供する。
【００３６】
本発明のウイルスは細胞培養で産生され得るウイルスであればいずれでもよく、それだけには限らないが、レンチウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、フラビウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、ブニアウイルス、オルビウイルス、ポックスウイルス、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルスおよびフィロウイルス、ならびに細胞培養で産生され得る現在公知のまたは後に同定されるいずれかのその他のウイルスが挙げられる。
【００３７】
本発明の特定の実施形態では、ウイルスはレンチウイルスであり得、これは霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ）、非霊長類レンチウイルス（例えば、ＦＩＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＣＥＶおよびビスナウイルス）、ならびに／または現在公知のまたは後に同定されるいずれかのその他のレンチウイルスであり得る。
【００３８】
したがって、本発明は、ａ）ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸、ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸、ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸、および／またはｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せであり得る組換え核酸を細胞に導入することと、ｂ）培養容器に（ａ）の細胞を入れることと、ｃ）Ｉ）一以上のレンチウイルス構造タンパク質をコードするレンチウイルス核酸配列を含む第１のベクターであって、（１）レンチウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子に少なくとも１つの欠陥を含む、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記ベクターと、ＩＩ）ベクターゲノムの逆転写に必要なシス作用配列エレメントを含むレンチウイルス核酸配列を含む第２のベクターであって、能力のあるパッケージングシグナルを含む前記ベクターと、ＩＩＩ）ウイルスの核酸配列を含む第３のベクターであって、（１）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記の第３のベクターとを、組換えレンチウイルス粒子が産生される条件下で（ｂ）の細胞に導入することとを含む、培養容器中の細胞において組換えレンチウイルス粒子を製造する方法をさらに提供する。
【００３９】
特定の実施形態では、前記方法の第２のベクターが、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖ）の発現に欠陥のあるものであり得る。もう１つの実施形態では、第１のベクターは、ｅｎｖ遺伝子を有さないか、第１のベクターから発現され得ないようにする欠陥を含むｅｎｖ遺伝子を有する、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターであり得る。ｅｎｖ遺伝子の欠陥は、遺伝子を第１のベクターから発現され得なくさせる欠失、置換および／または付加突然変異であり得る。
【００４０】
その他の実施形態では、第１および第２のベクターは双方ともｅｎｖ遺伝子を欠いているものである場合もあり、または双方とも、遺伝子を第１のベクターから発現され得なくさせる欠失、置換および／または付加突然変異であり得る欠陥を含むｅｎｖ遺伝子を含むものである場合もある。
【００４１】
前記方法の第３のベクターは、レンチウイルスｅｎｖ遺伝子であり得る、ウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む場合があり、および／または、第３のベクターは、レンチウイルスエンベロープタンパク質ではないウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む場合もある。例えば、第３のベクターの核酸によってコードされるエンベロープタンパク質は水泡性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）糖タンパク質であり得る。
【００４２】
前記方法の第２のベクターは、異種核酸配列が挿入され得るマルチプルクローニングサイトおよび／または一以上の異種核酸を含み得る。本発明の異種核酸は、異種核酸が導入されている細胞において産生された場合に抗原性、免疫原性および／または治療的であり得るタンパク質またはペプチドをコードし得る。
【００４３】
用語「異種核酸」とは、周知の専門用語であり、当業者には、導入されている細胞内には通常は存在しない核酸である、および／または細胞内には通常は存在しない調節エレメントの制御下で発現される核酸であると容易に理解される。本発明の異種核酸はまた、核酸が導入されている細胞において通常は存在しない量で存在するか、核酸が導入されている細胞において通常は存在しない量で発現される核酸であり得る。「異種核酸」は、通常、細胞中に天然には存在しない配列である。あるいは、異種ヌクレオチド配列とは、（例えば、天然には結合していないプロモーターとの結合によって）非天然環境に置かれている配列を指す場合もある。
【００４４】
本発明の第１のベクター、第２のベクターおよび第３のベクターは、ベクター構築物を製造するための標準的な核酸配列の操作方法にしたがって製造でき、特定の実施形態では、本発明の第１、第２および／または第３のベクターをレンチウイルスゲノムのｃＤＮＡクローンから得ることができる。
【００４５】
いくつかの例として、本発明の第１のベクターはプラスミドｐＥＶ５３、プラスミドｐＥＶ５３Ａおよび／またはプラスミドｐＥＶ５３Ｂであり得、本発明の第２のベクターはプラスミドｐＥＣ−ｌａｃＺ、プラスミドｐＥＣ−ｐｕｒｏ、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１Ｇ３Ｗ、プラスミドｐＥ１１．１Ｇ３Ｗおよび／またはプラスミドｐＥＳＩＮ１１．１Ｇ３Ｗであり得、本発明の第３のベクターはプラスミドｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇであり得る。
【００４６】
ｐＥＶ５３Ｂは、主要スプライス供与部位の３ｎｔ上流までの全てのＥＩＡＶリーダー配列が除去されている点を除いてｐＥＶ５３と同様である。ｐＥＶ５３Ｂを構築するために、以下のプライマーを用いるＰＣＲによってｇａｇ遺伝子およびｐｏｌの一部をｐＥＶ５３から増幅した。
【００４７】
【化１】
【００４８】
ＡｓｃＩ制限部位（下線が引かれている）をクローニング目的で順方向プライマーに含めた。順方向プライマーについては順方向プライマー中のｇａｇのＡＴＧ翻訳開始部位が太字で示されており、ＥＩＡＶ配列がイタリック体で示されている。得られた１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＢｓｒＧＩで消化し、ＡｓｃＩ−ＢｓｒＧＩ消化したｐＥＶ５３Ａにクローニングした。これによってｐＥＶ５３Ｂが得られた。配列解析を用いてＰＣＲによって増幅されたｇａｇ−ｐｏｌ配列が正しいことを確認した。
【００４９】
本発明の第２のベクターの一実施例として、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ、ストレプトマイセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）ピューロマイシンリポーター遺伝子を発現するＥＩＡＶ由来の６８６６ｂｐのプラスミドがある。このプラスミドは、２つのＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域（ｂｐ１〜７３４および１８６３〜２３８４に位置する）、ＥＩＡＶロングターミナルリピート配列（ＬＴＲ）由来のＲ−Ｕ５配列ドメイン（ｂｐ７３５〜８５７）、ＥＩＡＶ ＲＮＡキャプシド形成シグナルを含有するリーダー配列（約ｂｐ８７０〜１２００）、突然変異したｔａｔ翻訳開始部位（ｂｐ９０９〜９１１のＣＴＧからＴＡＧ）、ｂｐ９９６〜９９７のスプライス供与部位、突然変異したｇａｇ翻訳開始部位（ｂｐ１０００〜１００３のＡＴＧからＴＡＧ、部分ＥＩＡＶ ｇａｇ配列（ｂｐ１００４〜１２００）、ＥＩＡＶセントラルポリプリントラクト（ｂｐ１３１４〜１３３０）およびセントラル終結シグナル配列（ｂｐ１４２２〜１４４８）を含有する「ＤＮＡフラップ」配列、ピューロマイシンコード配列（ｂｐ２４８０〜３１０５）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｂｐ３１１０〜３９９６）、ＥＩＡＶエンハンサー／プロモーター配列のＥＩＡＶ自己不活化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列欠失（ｂｐ４０３７〜４１８３）、ファージｆ１領域（ｂｐ４２８０〜４７３５）、アンピシリン耐性コード領域（ｂｐ５１７４〜６０３４）およびＤＮＡ複製のＣｏｌＥｌ開始点（ｂｐ５５５４〜６２２８）を含む。
【００５０】
第２のベクターのもう１つの実施例として、ｐＥ６．１ＣｐｕｒｏＷがあり、これはＳＩＮ ＬＴＲが野生型ＥＩＡＶ ＬＴＲで置き換わっている以外ｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷと同様である。その他の実施例として、ｐＥＳＩＮ６．１ＣＷおよびｐＥ６．１ＣＷが挙げられ、これらはピューロマイシン耐性遺伝子が、それ以外の注目する遺伝子または配列の好都合な挿入のために拡張されたマルチプルクローニングサイトによって置き換わっている以外は、それぞれｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷおよびｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷと同様である。第２のベクターのさらなる改良が可能である。例えば、ｐＥＳＩＮ１１．１ＣＷおよびｐＥ１１．１ＣＷが、高い力価を提供するようリーダー領域が再構成され、最適化されたベクターの実施例である。
【００５１】
本発明の方法にしたがって製造されたレンチウイルス粒子は、細胞に感染し、異種核酸を標的細胞に送達するプロセスにおいて単一ラウンドの複製を実施することができる。この技術の一態様は、ウイルス遺伝子の標的細胞への移動を排除する核酸送達システムである。これはウイルス構造タンパク質を、異種核酸をコードするベクターから物理的に分離することによって達成される。分離されたベクターを許容細胞（「パッケージング細胞」）に導入する。ウイルス構造タンパク質は、ウイルス粒子の製造に必須であるが、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、欠陥パッケージングシグナルを含むか、パッケージングシグナルを含まないベクターに存在し、その結果、構造タンパク質遺伝子はパッケージング細胞において産生されるウイルス粒子にパッケージングされない。得られたレンチウイルス粒子は、パッケージングされたベクターが粒子組立てに必要なウイルス構造タンパク質の全てをコードする核酸を含まないという点で「複製に欠陥がある」。
【００５２】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明の修飾された細胞を、レンチウイルス核酸配列を含むベクターであって、欠陥パッケージングシグナルを含むベクターによりトランスフェクトすることを含む、パッケージング細胞を作製する方法を提供する。このベクターはｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターであり得、特定の実施形態では、ベクターはプラスミドｐＥＶ５３Ｂであり得る。
【００５３】
本明細書では、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードするレンチウイルス核酸配列であって、パッケージングシグナルに欠陥がある核酸配列を含む、本発明の修飾された細胞を含むパッケージング細胞であって、その結果、細胞自体が少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質を産生するが、複製可能な感染性ウイルスを産生しないパッケージング細胞をさらに提供する。
【００５４】
特に、本発明のレンチウイルスベクターに関しては、特定の実施形態では、ベクターはＥＩＡＶ由来のものである。天然ＥＩＡＶ核酸はウイルスに感染した細胞から単離でき、それからベクターを調製する。ＥＩＡＶベクターを調製するための例示的方法は、Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６６：４０８５〜４０９７頁（１９９２）に提供されている。例えば、当分野で公知の方法を用い、リバーストランスクリプターゼによってｃＤＮＡをＥＩＡＶ ＲＮＡから製造できる。次いで、二本鎖ＥＩＡＶ ｃＤＮＡを製造でき、クローニングベクター、例えば、細菌クローニングベクターにクローニングできる。当業者に公知のおよび当業者に使用されるいずれのクローニングベクター、例えば、細菌、酵母または真核生物のベクターも使用できる。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、ＥＩＡＶゲノムの少なくとも一部と相補的であり、かつ、ゲノムの複製に必要なＲＮＡゲノムの一部を含む一以上の核酸配列を含み得るｃＤＮＡ分子を含み得、ｃＤＮＡ分子は標的細胞において機能的であるプロモーターの転写制御下に置かれている。
【００５５】
本発明のプロモーターは、細胞において遠位の配列（すなわち、プロモーター配列の５’末端に結合している配列）の転写に向けるのに十分な真核生物のおよび／または原核生物のプロモーターを含み得る。プロモーター領域はまた、転写の増強または抑制のための制御エレメントを含み得る。適したプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｐＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスロングターミナルリピートプロモーター（ｐＲＳＶ）およびＳＰ６、Ｔ３またはＴ７プロモーターがある。発現を容易にするために、プロモーターの上流のエンハンサー配列またはコード領域の下流のターミネーター配列を、本発明のベクターに場合によって含めてもよい。本発明のベクターはまた、さらなる核酸配列、例えば、細胞が効率的かつ効果的にベクターの異種核酸を発現するのを可能にするのに十分なポリアデニル化配列、局在化配列および／またはシグナル配列を含み得る。可能性あるポリアデニル化配列の例としては、ＳＶ４０初期領域ポリアデニル化部位（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０１（１９８３））およびＳＶ４０後期領域ポリアデニル化部位（ＣａｒｓｗｅｌｌおよびＡｌｗｉｎｅ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：４２４８（１９８９））がある。このようなさらなる配列は、転写が求められる場合にはそれらが機能し得る形でプロモーター配列と連結され、または翻訳およびプロセッシングが求められる場合にはさらに開始およびプロセッシング配列と連結されるようベクターに挿入する。あるいは、挿入された配列は、ベクター中のいずれの位置に位置してもよい。用語「機能し得る形で連結された」とは、機能し得る形で連結されたプロモーター配列によって核酸配列の転写が導かれ、配列の翻訳が機能し得る形で連結された翻訳調節配列によって導かれ、配列の翻訳後プロセシングが機能し得る形で連結されたプロセシング配列によって導かれるような、核酸配列とプロモーターおよび／またはその他の調節またはプロセシング配列間の結合を説明するために用いる。
【００５６】
本発明のベクターの構築のための標準的な技術は、当業者には周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）などの参照文献に見い出すことができる。ＤＮＡの断片を連結するためには種々の戦略が利用でき、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に応じて変わるが、当業者であればその選択は容易に行うことができる。
【００５７】
本発明の一実施形態では、組換えレンチウイルス発現系は３種のべクターを含む。第１のベクターはＥＩＡＶゲノムの少なくとも一部の核酸配列を含み、このベクターは（ｉ）ＥＩＡＶ構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子中に少なくとも１つの欠陥を含み、（ｉｉ）欠陥パッケージングシグナルを含む。第２のベクターはＥＩＡＶゲノムの少なくとも一部の核酸配列を含み、このベクターは（ｉ）能力のあるパッケージングシグナルを含み、（ｉｉ）異種遺伝子を挿入できるマルチプルクローニングサイトを含む。第３のベクターはウイルスの核酸配列を含み、このベクターは（ｉ）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（ｉｉ）欠陥パッケージングシグナルを含む。
【００５８】
本発明のもう１つの実施形態では、第１のベクターはｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクターである。Ｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクターは、細胞からのウイルス粒子の組立ておよび放出に必要なＥＩＡＶタンパク質を発現し、ウイルスポリタンパク質ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌをコードする遺伝子を含む。第１のベクターはまた、アクセサリータンパク質ＲｅｖおよびＴａｔをコードする遺伝子も発現できる。オープンリーディングフレームＳ２は、その機能が未知であるタンパク質をコードしているが、これをさらに第１のベクターに含めることができる。第１のベクターは、ウイルス遺伝子のレトロウイルス媒介性移動を排除する突然変異を含むよう構築される。このような突然変異は、ウイルスｅｎｖ遺伝子中の配列の欠失、したがって、複製可能なＥＩＡＶの作製を可能にすることを排除する形である場合もあり、またはウイルス逆転写および組込みに必要なゲノムの３’末端の特定のシス作用配列エレメントの欠失である場合もある。したがって、この構築物由来のウイルス遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされる場合でさえ、それらは複製されず、複製可能な野生型ウイルスは生じない。
【００５９】
さらなる実施形態では、この発現系の第１のベクターは１１８７４ｂｐのプラスミドであるプラスミドｐＥＶ５３Ｂおよび塩基対２０９〜８６３に、ＥＩＡＶ主要スプライス供与部位（ｂｐ９１５〜９１６）、ｇａｇコード領域（ｂｐ９２０〜２３８０）、ｐｏｌコード領域（ｂｐ２１３７〜５５７８）およびＯＲＦ Ｓ２コード領域（ｂｐ５７４１〜５９３８）の上流に位置するＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域を含むｃＤＮＡクローンである。このベクターはまた、部分ｅｎｖコード領域（ｂｐ５７６７〜７４３７）およびｒｅｖコード領域（ｂｐ５８９２〜５９９２および６９５４〜７３５８）を含む。ｒｅｖの第１コード領域内に公知のＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）が含まれている（ｂｐ５８９２〜５９９２）。このベクターはｔａｔの第１のエキソンの欠失のために機能的ｔａｔ遺伝子を発現しないが、ｔａｔの第２のエキソンはｂｐ５５９０〜５７３０に存在する。ファージｆ１領域（ｂｐ７７４１〜８１５４）、ＳＶ４０初期プロモーター領域および複製起点（ｂｐ８２１８〜８５４３）、ネオマイシン耐性コード領域（ｂｐ９３８９〜９６２８）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ｂｐ９３８９〜９６２８）、ＣｏｌＥｌ複製起点（ｂｐ１００６０〜１０７３３）およびβラクタマーゼ（アンピシリン耐性）コード領域（ｂｐ１０８７８〜１１７３９）と同様に、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルが提供されている。
【００６０】
本発明の発現系の第２のベクターは、核酸導入のためのベクターとして働くよう設計されており、キャプシド形成およびベクター核酸の逆転写（複製）を支持するのに必要な全てのシス作用配列エレメント、ならびに異種核酸をコードするｃＤＮＡの挿入のためのマルチプルクローニングサイトを含む。本発明では、異種核酸を含むベクターは、標的細胞に形質導入される遺伝情報、ならびにウイルスゲノムのパッケージングおよび組込みに必要なシス作用配列エレメントを保持する組換えＥＩＡＶ由来ベクターである。第２のベクターは、ｇａｇ配列の特定の部分がＥＩＡＶゲノムのパッケージングにおいて役割を果たすと考えられているので、ｇａｇコード配列のいくつかの部分を含み得る。第２のベクターはまた、レンチウイルスＤＮＡ由来のシス作用配列であり、逆転写に関与するセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびセントラル終結部位（ＣＴＳ）配列を含む、いわゆるレンチウイルス「ＤＮＡフラップ」領域を含み得る。さらに、第２のベクターは、新しく合成されたＲＮＡの核から細胞質への効率的な搬出を促進するシス作用エレメントを含み得る。ＲＮＡ搬出シグナルの例としては、Ｒｅｖに呼応して作用する、相同レンチウイルスＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）、ＲＮＡ安定化またはその他の手段によって遺伝子発現も高め得る異種ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられる。さらに、ＬＴＲに含まれる５’スプライス供与部位は、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：３６４５〜３６５８頁（１９９６）に記載されるように、産生されたウイルスの力価を高める突然変異を含み得る。
【００６１】
本発明の第２のベクターの一例として、ストレプトマイセス・アルボニガーピューロマイシンリポーター遺伝子を発現する、プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ、ＥＩＡＶ由来の６８６６ｂｐのプラスミドがある。このプラスミドは、２つのＣＭＶ最初期エンハンサープロモーター領域（ｂｐ１〜７３４および１８６３〜２３８４に位置する）、ＥＩＡＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）（ｂｐ７３５〜８５７）由来のＲ−Ｕ５配列ドメイン、ＥＩＡＶ ＲＮＡキャプシド形成シグナルを含有するリーダー配列（約ｂｐ８７０〜１２００）、突然変異したｔａｔ翻訳開始部位（ｂｐ９０９〜９１１のＣＴＧからＴＡＧ）、ｂｐ９９６〜９９７のスプライス供与部位、突然変異したｇａｇ翻訳開始部位（ｂｐ１０００〜１００３のＡＴＧからＴＡＧ、部分ＥＩＡＶ ｇａｇ配列（ｂｐ１００４〜１２００）、ＥＩＡＶセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ、ｂｐ１３１４〜１３３０）およびセントラル終結部位（ＣＴＳ）配列（ｂｐ１４２２〜１４４８）を含有する「ＤＮＡフラップ」配列、ウイルススプライス受容配列（ｂｐ１７５３〜１７５４）、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ、ｂｐ１７５５〜１８５７）、ピューロマイシンコード配列（ｂｐ２４８０〜３１０５）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｂｐ３１１０〜３９９６）、ＥＩＡＶエンハンサー／プロモーター配列のＥＩＡＶ自己不活化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列欠失（ｂｐ４０３７〜４１８３）、ファージｆ１領域（ｂｐ４２８０〜４７３５）、アンピシリン耐性コード領域（ｂｐ５１７４〜６０３４）および複製のＣｏｌＥ１開始点（ｂｐ５５５４〜６２２８）を含む。
【００６２】
当業者には当然であろうが、異種核酸のヌクレオチド配列はいずれのヌクレオチド配列であり得る。例えば、異種核酸はリポーター遺伝子配列または選択マーカー遺伝子配列であり得る。本明細書において、リポーター遺伝子配列は、発現されるとその存在または活性をモニターできるタンパク質の製造をもたらす、いずれかの遺伝子配列である。適したレポーター遺伝子の例としては、ガラクトキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼなどの遺伝子が挙げられる。あるいは、リポーター遺伝子配列は、その発現によって、何らかの検出可能な方法で細胞生理学に影響を及ぼす遺伝子産物が生じるいずれかの遺伝子配列であり得る。
【００６３】
選択マーカー遺伝子配列は、発現されてタンパク質が生じ得、その存在によってそれを含む細胞を選択的に増殖させることを可能にする、いずれかの遺伝子配列である。選択マーカー遺伝子の例としては、抗生物質（例えば、ピューロマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなど）に対する宿主耐性を付与できる、アミノ酸類似体に対する宿主耐性を付与できる、および／またはさらなる炭素源での、あるいは許容されない培養条件下での細菌の増殖を可能にできる遺伝子配列が挙げられる。遺伝子配列はリポーター遺伝子および選択マーカー遺伝子配列の双方であり得る。本発明のリポーター遺伝子の例としては、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼ活性をコードするｌａｃＺ遺伝子およびピューロマイシン耐性をコードする遺伝子がある。
【００６４】
本発明のリポーターまたは選択マーカー遺伝子配列は、通常細胞におけるベクターの認識または選択を可能にするのに十分であるものである。本発明の一実施形態では、リポーター遺伝子配列は、哺乳類細胞には通常存在せず、したがって、そのような細胞におけるその存在によってベクターの存在を決定的に証明することができる酵素またはその他のタンパク質をコードする。
【００６５】
本発明の異種核酸はまた、所望の生成物、例えば、適した生物活性タンパク質またはポリペプチド、免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはポリペプチド、または治療上活性なタンパク質もしくはポリペプチドのコード配列を含み得る。あるいは、異種核酸は、ＲＮＡ配列に相補的な配列、例えば、アンチセンスＲＮＡ配列を含み得、被験体の細胞における相補ポリヌクレオチドの発現を阻害するためにこのアンチセンス配列を被験体に投与できる。
【００６６】
異種核酸の発現によって、免疫原性および／または抗原性タンパク質および／またはポリペプチドを提供し、免疫応答を達成できるが、これとしては、抗体応答が挙げられる。このような抗体は、被験体においてワクチン接種との関連で治療効果を付与するのに効果的であり得、かつ／または抗体は、血液、血清または腹水などの体液において動物から集めることができる。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態では、第３のベクターはウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む。したがって、このようなベクターは、適したプロモーターの制御下にウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む。ウイルスエンベロープタンパク質はレンチウイルスエンベロープタンパク質であり得る。しかし、別のウイルスのエンベロープ遺伝子を利用することによって、本発明のウイルスベクターが感染できる細胞の宿主域を変更することが可能である。つまり、特定のウイルスのエンベロープタンパク質の、その他のウイルスのキャプシド形成に参加する能力をうまく利用することによって本発明のＥＩＡＶベクターの宿主域を拡大することが可能である。水泡性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ、例えば、ＲｏｓｅおよびＧｉｌｌｉｏｎｅ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．３９：５１９〜５２８頁（１９８１）、ＲｏｓｅおよびＢｅｒｇｍａｎｎ、Ｃｅｌｌ ３０：７５３〜７６２頁（１９８２）参照）は、他のウイルスのゲノムおよびマトリックス成分を含むシュードビリオンを効率的に形成する。これらのＶＳＶ−Ｇシュードベクターは極めて広い宿主域を有し、限外濾過によって高力価に濃縮できる。本明細書において、用語「シュード」とは、一のウイルスの核酸を含むが、別のウイルスのエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を指す。
【００６８】
本発明の第３のベクターの一例としては、プラスミドおよびｃＤＮＡクローンｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ、エンベロープ糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇの発現ベクターがある。このプラスミドは５６７９塩基対を含み、ＣＭＶ最初期エンハンサープロモーター領域（ｂｐ１〜７９５）、キメライントロン領域（ｂｐ８５７〜９８９）、ＶＳＶ−Ｇコード領域（ｂｐ１０８８〜２６３３）、ファージｆ１領域（３０９３〜３５４８）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ｂｐ２７８２〜３００３）、ＤＮＡ複製のＣｏｌＥ１開始点（ｂｐ４９９２〜５６６６）およびアンピシリン耐性コード領域（ｂｐ３９８７〜４８４７）を含む。
【００６９】
本発明の一方法では、複製に欠陥のある感染性ＥＩＡＶ粒子を、本明細書に開示した方法にしたがい、当業者に公知の技術と組合せて調製できる。本方法は、レンチウイルス許容細胞を、本発明のベクターを用いてトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた細胞においてＥＩＡＶ由来粒子を製造することと、細胞からウイルス粒子を回収することとを含む。レンチウイルス許容細胞をトランスフェクトするステップは、当業者に公知のいずれかの適した手段にしたがって実施できる。例えば、本発明の一方法では、本明細書に記載した３種のプラスミド発現系を用い、一過性のトランスフェクションによってＥＩＡＶ由来のレトロウイルスベクター粒子を作製する。もう１つの実施例として、ベクターの細胞への取り込みは、例えば、細胞をＤＥＡＥデキストランで処理すること、ベクター由来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に添加する前にＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で処理することなどのいずれかの適した手段によって、またはエレクトロポレーションによって達成できる。これらの技術は当分野では周知である。
【００７０】
細胞における感染性ウイルス粒子の製造を容易にするステップは、従来技術を用いて、例えば、当分野で周知の標準的な細胞培養増殖技術によって実施する。
【００７１】
感染性ウイルス粒子を回収するステップもまた、従来技術を用いて実施する。例えば、当分野では公知のように、感染性粒子は細胞溶解または細胞培養物の上清の回収によって回収できる。場合によって、回収したウイルス粒子を所望であれば精製してもよい。適した精製技術は当業者には周知である。
【００７２】
当業者により所望であれば、本発明のベクターおよび方法を用いてレンチウイルス保存溶液を調製してもよい。ウイルス保存溶液を調製する方法は当分野では公知であり、例えば、Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８〜６３３頁（１９９５）およびＬａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０〜５１１３頁（１９９２）によって示されている。本発明において保存溶液を製造する方法では、本発明のレンチウイルス許容細胞を、本発明のベクターによりトランスフェクトする。次いで、細胞を適した細胞培養条件下で増殖させ、レンチウイルス粒子を前記のように細胞自体か細胞培地のいずれかから回収する。
【００７３】
本発明述べクターはまた、パッケージング細胞（すなわち、ＥＩＡＶウイルスタンパク質を発現する細胞であって、この細胞はそれ自体では感染性ウイルス粒子を作製できない）の調製において有用である。レトロウイルスタンパク質を発現するパッケージング細胞を調製する方法は当分野出は公知であり、例えば、Ｔｅｍｉｎらの米国特許第４，６５０，７６４号に示された方法によって例示されており、この参照文献はこれらの方法の教示のためにその全体が本明細書に組込まれる。本発明のパッケージング細胞は、少なくとも一のＥＩＡＶ構造タンパク質をコードするＥＩＡＶ核酸を含み、核酸がパッケージングシグナルに欠陥があり、したがって、細胞自体を少なくとも一のＥＩＡＶ構造タンパク質を産生できるが、複製可能な感染性ウイルスは産生できないようにする、本発明のレンチウイルス許容細胞を含み得る。次いで、パッケージング細胞は、導入されたその他の核酸配列（例えば、ｐＥＳＩＮ６１．ＣｐｕｒｏＷおよび／またはｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ）を有し、これは異種核酸と適当なパッケージングシグナルとを含み得る。さらなる一の配列または複数の配列によりトランスフェクトされると、異種核酸を含むが、そのウイルス自体は複製可能でないＥＩＡＶウイルスのストックを製造するためにパッケージング細胞が用いられる。
【００７４】
本発明を以下の実施例でより詳しく説明するが、その多数の改変および変法が当業者には明らかであるので、これは例示としてのみ意図されるものである。
【実施例１】
【００７５】
細胞
ＨＥＫ２９３細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。これらの細胞のクローンのライブラリーは制限希釈によって調製し、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを産生する最大の能力を示した細胞株をスクリーニングした（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｏｓｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇｅ ｏｎ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８８６１〜７２頁（１９９８））。これらのクローンのうちの１つ、２９３．１０１をＥＩＡＶヘルパー細胞株およびＥＩＡＶベクターパッケージング細胞を構築するために選択した。Ｂ−２４１細胞株はＥＩＡＶベクターヘルパー細胞株である。これらの細胞は２９３．１０１細胞から、ＥＩＡＶｇａｇ、ｐｏｌ、Ｓ２およびＣＭＶプロモーター由来のｒｅｖ遺伝子を発現する発現ベクター（ＥＶ５３Ｂ）での安定なトランスフェクションによって得られた。ＢｉＧ−４５細胞株はＥＩＡＶパッケージング細胞株である。これらの細胞は、テトラサイクリン調節可能ＶＳＶ−ＧエンベロープｃＤＮＡおよびＣＭＶプロモーター駆動テトラサイクリンレプレッサー遺伝子をコードするプラスミド発現ベクターでの安定なトランスフェクションによってＢ−２４１細胞から導いた。ＢｉＧ−４５／８Ｚ−２０細胞は、ｐＯＮＹ８Ｚ、細菌ｌａｃＺリポーター遺伝子をコードするＥＩＡＶ遺伝子導入ベクターでのＢｉＧ−４５細胞の安定なトランスフェクションにより得られた（Ｒｏｈｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓａｆｅｔｙ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｏｎｐｒｉｍａｔｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３４６：４６６−５００（２００２））。
【００７６】
インテグリン発現プラスミド
ヒトαIIbまたはαvインテグリンサブユニットを発現させるためにはｐＣＸＩＨ発現ベクターを用いた。野生型または突然変異したヒトβ3インテグリンサブユニットを発現させるためにはｐＣＸＩＰ発現ベクターを用いた。これらのベクターは、挿入されたｃＤＮＡを発現させるためにＣＭＶプロモーターを用い、動物細胞における選抜のためのハイグロマイシン耐性遺伝子（ｐＣＸＩＨ）またはピューロマイシン耐性遺伝子（ｐＣＸＩＰ）のいずれかに結合しているＩＲＥＳ配列を含む。
【００７７】
ｐＣＸＩＰプラスミドは５５６２ｂｐの長さであり、標的遺伝子ならびにピューロマイシン選択マーカーを発現するよう設計されたバイシストロニック発現ベクターである。このベクターはＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域（ｂｐ１〜５３２）、発現されようとする配列を挿入するためのマルチプルクローニングサイト領域（ｂｐ６３９〜６８７）、配列内リボソーム進入部位配列（ｂｐ６８９〜１２６１）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｂｐ１２９８〜１８９４）、ネズミ白血病ウイルス由来ポリＡ付加シグナル（ｂｐ２２６８〜２６９３）、ＤＮＡ複製のＳＶ４０開始点（ｂｐ２９７３〜３２５９）、ＤＮＡ複製領域のＣｏｌ Ｅ１開始点（ｂｐ３５８０〜４２００）およびアンピシリン耐性遺伝子（ｂｐ４３４０〜５２００）を含む。
【００７８】
ｐＣＸＩＨプラスミドは６１６１ｂｐの長さであり、標的遺伝子ならびにハイグロマイシン選択マーカーを発現するよう設計されたバイシストロニック発現ベクターである。このベクターはＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域（ｂｐ１〜５３２）、発現されようとする配列を挿入するためのマルチプルクローニングサイト領域（ｂｐ６４０〜６８０）、配列内リボソーム進入部位配列（ｂｐ６８９〜１２６３）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｂｐ１２８７〜２３２１）、ネズミ白血病ウイルス由来ポリＡ付加シグナル（ｂｐ２８６７〜３２９２）、ＤＮＡ複製のＳＶ４０開始点（ｂｐ３５７２〜３８５８）、ＤＮＡ複製領域のＣｏｌ Ｅ１開始点（ｂｐ４１７９〜４７９９）およびアンピシリン耐性遺伝子（ｂｐ４９３９〜５７９９）を含む。
【００７９】
ＢｉＧ−４５細胞におけるαvおよびβ3インテグリンサブユニットの双方の発現のために、ｐＶＩＴＲ０２−ｍｃｓ発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いた。このベクターは、ヒトαvインテグリンを発現させるために複合性ヒトフェリチン重鎖プロモーター／ＳＶ４０エンハンサー配列を用い、ヒトβ3インテグリンを発現させるために複合性ヒトフェリチン軽鎖プロモーター／ＣＭＶエンハンサー配列を用いる。
【００８０】
２９３ベースのＥＩＡＶ産生細胞におけるインテグリンサブユニットの発現
αIIb、αvおよびβ3サブユニットをコードするインテグリンｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを用いて発現ベクターにサブクローニングし、種々の組合せをＢ−２４１ ＥＩＡＶヘルパー細胞株に安定にトランスフェクトして一連の細胞株を作製した。１２日の薬物選抜後、各トランスフェクションから得られた細胞コロニーをプールし、個々のインテグリンサブユニットαIIb、αvおよびβ3の細胞表面発現について、またはフローサイトメトリーによる生細胞の免疫蛍光によってインテグリン受容体αIIbβ3、もしくはαvβ3として分析した（図１）。各インテグリンがＢ−２４１細胞の細胞表面に発現されていることがわかった。αおよびβサブユニット双方の発現が一緒になって、個々のサブユニットを発現することと比較して、細胞表面での全体的な発現を増強した。免疫蛍光研究によって、各インテグリンの発現が、内因性インテグリン発現と比べて大きく増強されることが確認された。
【００８１】
インテグリン修飾した２９３細胞の組織培養基材への接着
細胞接着アッセイを用いてβ3インテグリンサブユニット単独またはそのαIIbもしくはαv結合パートナーとの発現が組織培養基材への接着の増加をもたらすかどうかを調べた。このアッセイは、緑色蛍光タンパク質を発現する２９３ベースのＢｉＧ−４５ＥＩＡＶパッケージング細胞においてインテグリンサブユニットを一過性に発現させることを含んでいた。この細胞を１２ウェルプレート中のウェルあたり３×１０5個細胞でプレーティングした。プレーティングの１時間後、細胞の洗浄前後の細胞の蛍光を測定することによって細胞のコロニー形成率を求めた。β3インテグリンサブユニット単独の過剰発現は、修飾していない細胞と比較して、２９３細胞の未処理組織培養プレートへの接着の有意な増加をもたらした（図２）。αvとの同時発現は、２９３細胞接着をさらに増加させた。β3サブユニットの突然変異型も調べたが、血小板でαIIbと結合すると、αIIbβ3受容体を恒久的に活性化させる。突然変異β3サブユニットは、野生型β3サブユニットと比較して、単独でまたはαIIbもしくはαvと共同しても細胞接着において何の増加も提供しなかった（図２）。したがって、２９３由来細胞における野生型ヒトαvβ3インテグリン受容体の発現は、標準組織培養プレートに接着するその能力を有意に高めた。
【００８２】
２９３細胞のローラーボトル培養の際のインテグリン修飾の効果
レンチウイルスベクターを製造するために必要な時間と労力を低減するために、インテグリン修飾した細胞のローラーボトル培養において接着し増殖する能力を調べた。最初の実験では、インテグリンβ3修飾されたＢ−２４１細胞または修飾されていないＢ−２４１細胞をローラーボトルに播種した。翌日、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真を撮った（図３）。β3修飾された細胞は、修飾されていない細胞よりも有意に良好に接着したが、細胞の凝集がいくらか現れた。そのαv結合パートナーとのβ3発現の作用を調べるために、ＥＩＡＶ−ｌａｃＺベクターを産生するＢｉＧ−４５パッケージング細胞（ＢｉＧ−４５／８Ｚ−２０）を、両インテグリンを発現するｐＶＩＴＲＯ２ｍｃｓベクターにより安定にトランスフェクトし、ローラーボトルに播種した。播種の翌日、Ｘ−Ｇａｌを用いて細胞をｌａｃＺ遺伝子の発現について染色した。図３に示されるように、細胞はより均一な接着を示し、細胞凝集はβ3単独で修飾された細胞よりも少なかった。続く実験では、ローラーボトルに播種した２４時間後に、インテグリン修飾された、および修飾されていないＢ−２４１細胞のコロニー形成率を求めた。β3およびαvβ3修飾されたＢ−２４１細胞の双方について、コロニー形成率は９８．３％±１．５％（ｎ＝６）であった。一方、修飾されていないＢ−２４１細胞については、コロニー形成率はほんの４５．７％±１５．３％（ｎ＝３）であった。
【００８３】
レンチウイルスベクター産生に対するインテグリン発現の効果
ピューロマイシン遺伝子をコードするＥＩＡＶベクター（ＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ）ならびにＶＳＶ−ＧエンベロープをコードするベクターをＢ−２４１ヘルパー細胞株に同時トランスフェクションすることによって、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションを用いる一過性のベクター産生系におけるＥＩＡＶベクター産生に対するインテグリン発現の効果を調べた。αIIbまたはαvインテグリンサブユニットの発現は、単独ではベクター力価に対して全く効果がなかった（表１）。β3とのαIIbの同時発現は、一貫して、ベクター力価の４〜５倍の低下をもたらした。対照的に、β3の単独またはαvインテグリンと組合せた発現は、ベクター産生の３０〜６０％の増加をもたらした。
【００８４】
Ｂ−２４１細胞、またはその他の２９３ベースの細胞株のαvβ3インテグリンでの修飾は、細胞の平坦化をもたらし、その結果、インテグリン修飾された細胞は修飾されていない細胞よりも大きな表面積を占めた。最適化したトランスフェクションプロトコールは、通常、８０〜９０％コンフルエントである培養物を用いるので、これによりトランスフェクション実験に修飾されていない細胞よりも少ない数のインテグリン修飾された細胞がもたらされた。インテグリン修飾された細胞からのＥＩＡＶベクター産生をさらに特性決定するために、細胞あたりの感染性ベクターの収量を求め、修飾されていない細胞と比較した。さらに、ＤＮＡ取り込みの効率を高めるために用いられる薬剤（グリセロールまたはＤＭＳＯ）の効果を調べた（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ． １９８４．「Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｏｒ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｈｏｃｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １２：５７０７〜１７頁）。表２に示されるように、細胞あたりの産生されたベクターの収量は、αvβ3インテグリンで修飾された細胞を用いると３．６倍増加した。さらに、インテグリン修飾された細胞におけるベクターの収量は、ＤＮＡ取り込みを増強するためにプロトコールにグリセロールまたはＤＭＳＯショック処理を組込むことによって約３倍さらに高めることができる（表２）。対照的に、修飾されていない培養物からのベクター産生は、グリセロールまたはＤＭＳＯ処理によって増強されなかった。１つには、これは修飾されていない培養物による接着性が弱いことによる細胞の損失に起因していた。３０秒までのグリセロールまたはＤＭＳＯ処理期間の減少によって、修飾されていない培養物の細胞損失の低減がもたらされたが、ベクター収量は高まらなかった。
【実施例２】
【００８５】
ＨＥＫ２９３細胞インテグリン発現プロフィールの修飾によって、レンチウイルスベクターの好都合な大規模ローラーボトル製造が可能になる。
ローラーボトルを用いるＥＩＡＶおよびＨＩＶに基づくレンチウイルスベクター製造
インテグリン修飾された２９３細胞のローラーボトル培養を用いて大規模高力価ベクター製造が達成される可能性を調べた。これらの研究では、ローラーボトルを用いてレンチウイルスベクターを製造するための種々の方法を試験した。いくつかの実施例を表３に示す。一実施例では、ＥＩＡＶｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を安定に発現する、αvβ3修飾されたＢ−２４１ヘルパー細胞のローラーボトル培養物を、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするＥＩＡＶベクター（ＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ）とＶＳＶ−Ｇエンベロープ遺伝子を用いて同時トランスフェクションした。１０００倍濃縮した後、力価が１．２×１０9感染単位／ｍｌのベクター調製物が得られた。このレベルのベクター製造は、組織培養プレートで増殖させた修飾されていない細胞によって産生されたベクター製造のレベルに匹敵することが好都合である（表１）。
【００８６】
第２の実施例では、ＥＩＡＶ ｌａｃＺ遺伝子により安定にトランスフェクトされたＢｉＧ−４５ ＥＩＡＶパッケージング細胞株を誘導して、濃縮後に２×１０9という力価を有するウイルスを製造した。第３の実施例は、手順をスケールアップして、動物研究に適した多量のベクターを製造できることを示す。この場合には、目的はイヌ造血幹細胞へのエクスビボ遺伝子導入に必要なベクター量（＞３×１０9総感染単位）を製造することであった。αvβ3修飾された２９３Ｔ細胞を含む１２本のローラーボトルの３プラスミドトランスフェクションを実施しＨＩＶ−１ベクターを製造した。トランスフェクションの４８時間後に始まる３連日でベクター（９０ｍｌ／ローラーボトル）を回収した。合計３２４０ｍｌを回収し、約５５０倍に濃縮して６ｍｌとした。全収量は、動物研究を実施するのに十分なものより多い１．４×１０10感染ベクター粒子であった。
【００８７】
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）はウイルス遺伝子導入ベクターの製造のために最も広く用いられている細胞種である。それらは、組換えウイルスを一過性に発現させるためのいくつかのトランスフェクション試薬およびプロトコールを用いて、ウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡにより高効率にトランスフェクションすることが可能である。ウイルス製造のための種々の安定な２９３ベースのパッケージング細胞株も作製した。非霊長類レンチウイルスウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースにした遺伝子導入系を開発したが、これは高力価ウイルス製造のために、安定な２９３細胞ベースの誘導可能パッケージング細胞株（ＢｉＧ４５）を利用している。２９３細胞を用いるベクターの大規模製造は、それらが容易に標準組織培養プレートから離れるために困難であることが多い。これは、細胞に懸濁培養での増殖を適用することによって克服できるが、これによってウイルス力価の有意な損失がもたらされ得る。あるいは、フィブロネクチンまたはポリリジンなどの細胞接着基材で処理した容器で培養物を増殖させることができる。しかし、両戦略とも大規模ベクター製造の費用を有意に増大させる。
【００８８】
本研究では、２９３細胞のインテグリン発現プロフィールを修飾することによってその接着性を高める新規戦略を試験した。第１に試験したのは、インテグリンβ3サブユニットの単独またはその公知の結合パートナーαvもしくはαIIbと組合せた過剰発現の効果であった。細胞接着アッセイは、緑色蛍光タンパク質を発現する２９３ベースのＥＩＡＶパッケージング細胞における、一過性に発現するインテグリンサブユニットに関連していた。この細胞を２〜４×１０5個細胞／ウェルという密度で未処理のマルチウェルプレートにプレーティングした。プレーティングの１時間後に、細胞の洗浄の前後に細胞の蛍光を測定することによって細胞のコロニー形成率を調べた。２９３細胞におけるβ3インテグリンサブユニットの過剰発現は、細胞の未処理の組織培養プレートへの接着において、修飾されていない細胞と比較して有意な増大をもたらした。αvの同時発現は２９３細胞接着をさらに高めたが、αIIbは高めなかった。インテグリン修飾された２９３細胞からのＨＩＶおよびＥＩＡＶベースのレンチウイルスベクター双方の製造も調べた。この修飾の結果として標的細胞におけるベクター力価およびレポーター遺伝子発現が損なわれることはなく、これはインビボ実験のためのベクターを作製するためのローラーボトルにおけるベクター製造のスケールアップを導いた。
【００８９】
つまり、２９３細胞におけるαvおよびβ3の過剰発現は、ウイルスベクター産生を損なうことなく標準の未処理組織培養ディッシュへの接着を増大させる。
【００９０】
上記は本発明の原理の例示としてのみ考慮される。さらに、当業者には多数の改変および変法が容易に思い浮かぶので、本発明を本明細書に示され、記載された正確な構築物および操作に制限しようとは望まない。したがって、それに応じて、全ての適した改変および等価物は本発明の範囲内に含まれる。
【００９１】
本明細書に引用された、全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、参照文献が示される文および／または段落に関連する教示のために、参照によりその全体が組込まれる。
【００９２】
【表１】
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ−Ｆ】Ｂ−２４１細胞におけるヒトインテグリンｃＤＮＡの細胞表面発現。種々のヒトインテグリンｃＤＮＡにより安定にトランスフェクトされたＢ−２４１細胞株を組織培養プレートからトリプシン処理した。無傷の生細胞を、αサブユニットの検出のためのフルオレセイン（ＦＩＴＣ）か、β3サブユニットの検出のためのフィコエリテリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）（ＰＥ）のいずれかに結合しているマウスモノクローナル抗体で染色した。用いた抗体は、ヒトβ3インテグリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５７５４）、ヒトαvインテグリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、カタログ番号ＣＢＬ４９０Ｆ）およびインテグリンαIIbインテグリンサブユニットとしても知られているヒト血小板糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、カタログ番号ＣＢＬ５８９Ｆ）に特異的なものであった。パネルは種々のＢ−２４１細胞株誘導体の蛍光プロフィールを示す。パネルＡ：修飾されていないＢ−２４１細胞。パネルＢ：β3インテグリンサブユニットとしても知られているヒト血小板ＧＰＩＩＩａを発現するよう修飾された細胞。パネルＣ：ヒトαIIbインテグリンサブユニットを発現するよう修飾された細胞。パネルＤ：フィブリノゲン、フォンウィルブランド因子、フィブロネクチンおよびビトロネクチンを含むいくつかの細胞外マトリックス分子のαIIbβ3インテグリン受容体を発現するよう修飾された細胞。パネルＥ：αvインテグリンサブユニットを発現するよう修飾された細胞。パネルＦ：ビトロネクチンのαvβ3受容体を発現するよう修飾された細胞。
【図２】ヒトインテグリンを用いるトランスフェクション後のＢｉＧ−４５パッケージング細胞の接着の増加。ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターを含有する、ＢｉＧ−４５ＥＩＡＶパッケージング細胞を、種々のヒトインテグリンｃＤＮＡによりトランスフェクトした。細胞を標準組織培養プレートのウェルに播種した。播種の１時間後、各ウェルのＧＦＰ蛍光を、穏やかな洗浄の前後に測定し、プレートに接着している細胞のパーセンテージを求めた。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒプレートリーダーを用いて蛍光を測定した。
【図３】ヒトインテグリンｃＤＮＡを用いる修飾を含むか含まないＥＩＡＶベクター産生細胞株のローラーボトル培養。各ボトルに７．７５×１０7個細胞を播種した。
【図４】プラスミドｐＥＶ５３Ｂ。
【図５】プラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷ。
【図６】プラスミドｐＣＸＩＰおよびｐＣＸＩＨ。
【図７】プラスミドｐＥＶ５３。
【図８】プラスミドｐＥＶ５３Ａ。
【図９】プラスミドｐＥＣ−ｌａｃＺ。
【図１０】プラスミドｐＥＣ−ｐｕｒｏ。
【図１１】プラスミドｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇ。
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されていない細胞の接着性と比較して、接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞であって、
ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む、修飾された細胞。
【請求項２】
ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｄ）（ａ）および（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む、２９３．０１細胞。
【請求項３】
インテグリンβ3サブユニットをコードする組換え核酸と、インテグリンαvサブユニットをコードする組換え核酸とを含む、２９３．１０１細胞。
【請求項４】
請求項１、２または３の細胞を含む細胞集団。
【請求項５】
請求項４の集団を含む培養容器。
【請求項６】
フラスコ、ボトル、ローラーボトル、ディッシュ、スライド、チューブ、カバースリップ、プレートおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の培養容器。
【請求項７】
ＢｉＧ−４５細胞、２９３．１０１細胞、Ｂ−２４１細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｄａｍｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞およびＭＳ−５細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の細胞。
【請求項８】
前記組換え核酸に機能し得る形で連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターがＣＭＶ最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、伸長因子１α、β−アクチン、真核細胞の開始因子４Ａ１、複合性ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、複合性伸長因子１αプロモーター／ＨＴＬＶ５’非翻訳領域、複合性ＳＶ４０エンハンサー／ヒトフェリチン重鎖伸長因子１αプロモーター、複合性ＣＭＶエンハンサー／ヒトフェリチン軽鎖伸長因子１αプロモーターおよび複合性ＣＭＶプロモーター／テトラサイクリンオペレーターからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の細胞。
【請求項９】
細胞を培養容器の表面に接着させる方法であって、
ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む細胞を、細胞が培養容器の表面に接着できる条件下で培養容器の表面に接触させることを含む、方法。
【請求項１０】
修飾されていない細胞の接着性と比較して、接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞を製造する方法であって、
ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を細胞に導入することを含む、方法。
【請求項１１】
培養容器中の細胞においてウイルス粒子を製造する方法であって、培養容器中の、
ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む細胞に、ウイルス粒子が産生される条件下で感染性ウイルス粒子を導入することを含む、方法。
【請求項１２】
ウイルス粒子が、レンチウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、フラビウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルスおよびフィロウイルスからなる群から選択されるウイルスの粒子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、ＢｉＧ−４５細胞、２９３．１０１細胞、Ｂ−２４１細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｄａｍｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞およびＭＳ−５細胞からなる群から選択される、請求項９、１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
容器が、フラスコ、ボトル、ローラーボトル、ディッシュ、スライド、チューブ、カバースリップ、プレートおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項１５】
培養容器中の細胞において組換えレンチウイルス粒子を製造する方法であって、培養容器中の、
ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む細胞に、
組換えレンチウイルス粒子が産生される条件下で、
Ｉ）少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードするレンチウイルス核酸配列を含む第１のベクターであって、（１）レンチウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子に少なくとも１つの欠陥を含み、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記ベクターと、
ＩＩ）ベクターゲノムの逆転写に必要なシス作用配列エレメントを含む、レンチウイルス核酸配列を含む第２のベクターであって、能力のあるパッケージングシグナルを含む前記ベクターと、
ＩＩＩ）ウイルスの核酸配列を含む第３のベクターであって、（１）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記第３のベクターと
を導入することを含む、方法。
【請求項１６】
第２のベクターが、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質の発現に欠陥がある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が２９３．１０１細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
第１のベクターがｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターであって、ベクターがｅｎｖ遺伝子に欠陥を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ｅｎｖ遺伝子の欠陥が欠失突然変異である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１のベクターおよび第２のベクターが各々、ｅｎｖ遺伝子に欠陥を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第３のベクターが、レンチウイルスエンベロープタンパク質ではないウイルスエンベロープタンパク質をコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
第３のベクターが水泡性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第２のベクターが異種核酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
レンチウイルスが非霊長類レンチウイルスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
非霊長類レンチウイルスがウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１のベクターがプラスミドｐＥＶ５３Ｂであり、第２のベクターがプラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷであり、第３のベクターがプラスミドｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
容器が、フラスコ、ボトル、ローラーボトル、ディッシュ、スライド、チューブ、カバースリップ、プレートおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１、２または３の細胞を、レンチウイルス核酸配列を含むベクターであって欠陥パッケージングシグナルを含むベクターによりトランスフェクトすることを含む、パッケージング細胞を作製する方法。
【請求項２９】
ベクターがｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ベクターがプラスミドｐＥＶ５３Ｂである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１、２または３の細胞を含むパッケージング細胞であって、パッケージングシグナルに欠陥がある、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードしているレンチウイルス核酸配列を含み、その結果、細胞自体が少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質を産生するが、複製能力のある感染性ウイルスは産生しない、細胞。
【請求項１】
修飾されていない細胞の接着性と比較して、接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞であって、
ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む、修飾された細胞。
【請求項２】
ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｄ）（ａ）および（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む、２９３．０１細胞。
【請求項３】
インテグリンβ3サブユニットをコードする組換え核酸と、インテグリンαvサブユニットをコードする組換え核酸とを含む、２９３．１０１細胞。
【請求項４】
請求項１、２または３の細胞を含む細胞集団。
【請求項５】
請求項４の集団を含む培養容器。
【請求項６】
フラスコ、ボトル、ローラーボトル、ディッシュ、スライド、チューブ、カバースリップ、プレートおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の培養容器。
【請求項７】
ＢｉＧ−４５細胞、２９３．１０１細胞、Ｂ−２４１細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｄａｍｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞およびＭＳ−５細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の細胞。
【請求項８】
前記組換え核酸に機能し得る形で連結されたプロモーターをさらに含み、前記プロモーターがＣＭＶ最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、伸長因子１α、β−アクチン、真核細胞の開始因子４Ａ１、複合性ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、複合性伸長因子１αプロモーター／ＨＴＬＶ５’非翻訳領域、複合性ＳＶ４０エンハンサー／ヒトフェリチン重鎖伸長因子１αプロモーター、複合性ＣＭＶエンハンサー／ヒトフェリチン軽鎖伸長因子１αプロモーターおよび複合性ＣＭＶプロモーター／テトラサイクリンオペレーターからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の細胞。
【請求項９】
細胞を培養容器の表面に接着させる方法であって、
ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む細胞を、細胞が培養容器の表面に接着できる条件下で培養容器の表面に接触させることを含む、方法。
【請求項１０】
修飾されていない細胞の接着性と比較して、接着性が少なくとも３倍高められた修飾された細胞を製造する方法であって、
ａ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｂ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｃ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を細胞に導入することを含む、方法。
【請求項１１】
培養容器中の細胞においてウイルス粒子を製造する方法であって、培養容器中の、
ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む細胞に、ウイルス粒子が産生される条件下で感染性ウイルス粒子を導入することを含む、方法。
【請求項１２】
ウイルス粒子が、レンチウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、フラビウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルスおよびフィロウイルスからなる群から選択されるウイルスの粒子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、ＢｉＧ−４５細胞、２９３．１０１細胞、Ｂ−２４１細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｄａｍｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞およびＭＳ−５細胞からなる群から選択される、請求項９、１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
容器が、フラスコ、ボトル、ローラーボトル、ディッシュ、スライド、チューブ、カバースリップ、プレートおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項１５】
培養容器中の細胞において組換えレンチウイルス粒子を製造する方法であって、培養容器中の、
ｉ）インテグリンβ3サブユニットをコードする核酸と、
ｉｉ）インテグリンαvサブユニットをコードする核酸と、
ｉｉｉ）インテグリンαIIbサブユニットをコードする核酸と、
ｉｖ）（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のいずれかの組合せと
からなる群から選択される組換え核酸を含む細胞に、
組換えレンチウイルス粒子が産生される条件下で、
Ｉ）少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードするレンチウイルス核酸配列を含む第１のベクターであって、（１）レンチウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子に少なくとも１つの欠陥を含み、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記ベクターと、
ＩＩ）ベクターゲノムの逆転写に必要なシス作用配列エレメントを含む、レンチウイルス核酸配列を含む第２のベクターであって、能力のあるパッケージングシグナルを含む前記ベクターと、
ＩＩＩ）ウイルスの核酸配列を含む第３のベクターであって、（１）ウイルスエンベロープタンパク質を発現し、（２）欠陥パッケージングシグナルを含む前記第３のベクターと
を導入することを含む、方法。
【請求項１６】
第２のベクターが、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質の発現に欠陥がある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が２９３．１０１細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
第１のベクターがｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターであって、ベクターがｅｎｖ遺伝子に欠陥を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ｅｎｖ遺伝子の欠陥が欠失突然変異である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１のベクターおよび第２のベクターが各々、ｅｎｖ遺伝子に欠陥を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第３のベクターが、レンチウイルスエンベロープタンパク質ではないウイルスエンベロープタンパク質をコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
第３のベクターが水泡性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第２のベクターが異種核酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
レンチウイルスが非霊長類レンチウイルスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
非霊長類レンチウイルスがウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１のベクターがプラスミドｐＥＶ５３Ｂであり、第２のベクターがプラスミドｐＥＳＩＮ６．１ＣｐｕｒｏＷであり、第３のベクターがプラスミドｐＣＩ−ＶＳＶ−Ｇである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
容器が、フラスコ、ボトル、ローラーボトル、ディッシュ、スライド、チューブ、カバースリップ、プレートおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１、２または３の細胞を、レンチウイルス核酸配列を含むベクターであって欠陥パッケージングシグナルを含むベクターによりトランスフェクトすることを含む、パッケージング細胞を作製する方法。
【請求項２９】
ベクターがｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ベクターがプラスミドｐＥＶ５３Ｂである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１、２または３の細胞を含むパッケージング細胞であって、パッケージングシグナルに欠陥がある、少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質をコードしているレンチウイルス核酸配列を含み、その結果、細胞自体が少なくとも一のレンチウイルス構造タンパク質を産生するが、複製能力のある感染性ウイルスは産生しない、細胞。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００７−５３５３２９（Ｐ２００７−５３５３２９Ａ）
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１０７８（Ｐ２００７−５１１０７８）
【出願日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８０９
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０００９３８３４）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【出願人】（５０６３６４５０３）メディカル・カレッジ・オヴ・ウィスコンシン (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５１２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８０９
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０００９３８３４）ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル (14)
【出願人】（５０６３６４５０３）メディカル・カレッジ・オヴ・ウィスコンシン (1)
【Ｆターム（参考）】
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