細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法および電気的測定装置
【課題】 高速、正確かつ容易に細胞膜状態を電気的に測定可能な測定方法を提供する。
【解決手段】 細胞膜状態の電気的測定方法において、測定電極１２と、参照電極１３と、複数の細胞１７とを準備し、前記測定電極１２と前記各細胞１７内とを電気的に接続し、かつ前記参照電極１３と前記各細胞１７膜表面とを電気的に接続し、この状態で、前記測定電極１２に電圧を印加して前記両電極１２，１３間に流れる電流のゆらぎを測定する。前記複数の細胞における電流のゆらぎは、各細胞の電流のゆらぎを総和したものに相当する。この電流のゆらぎのパワースペクトルを解析することで、細胞膜の状態を評価できる。
【解決手段】 細胞膜状態の電気的測定方法において、測定電極１２と、参照電極１３と、複数の細胞１７とを準備し、前記測定電極１２と前記各細胞１７内とを電気的に接続し、かつ前記参照電極１３と前記各細胞１７膜表面とを電気的に接続し、この状態で、前記測定電極１２に電圧を印加して前記両電極１２，１３間に流れる電流のゆらぎを測定する。前記複数の細胞における電流のゆらぎは、各細胞の電流のゆらぎを総和したものに相当する。この電流のゆらぎのパワースペクトルを解析することで、細胞膜の状態を評価できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法および電気的測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気生理学の初期のころから、ガラス電極を細胞に刺入して細胞の膜電位を測定することが行われ、細胞膜におけるイオンチャネルの存在が予見されていた。そして、細胞膜電位の測定は、パッチクランプ法の開発により、大きく進展した。パッチクランプ法は、１９７６年にNeher および Sakmannによって開発され（非特許文献１）、これにより、実際にイオンチャンネルの存在を証明するという画期的成果を生み出した。さらに、１９８１年に、Hamill等によってホールセルクランプ(whole-cell-clamp)法が開発され、これにより細胞膜表面全体に存在するイオンチャネルの全電流の測定が可能となった。イオンチャネルの異常と疾病との関係が明らかになるにつれ、イオンチャネルの状態を測定できるホールセルパッチクランプ法が、医薬品開発において重要になってきており、これを高速で実施可能にするための技術が開発されている。例えば、ホールセルパッチクランプ法のための平板パッチデバイスおよびそのシステムがある（特許文献１〜４）。しかしながら、この方法では、つぎの問題がある。すなわち、パッチクランプ法は、記録用ピペットを細胞に密に接着させ、ギガオームを超える緊密なシールを形成させることが必要であるが、このシールが緩ければ、信頼性のあるデータが得られない。この他、パッチクランプ法においては、hole不良、ベースラインの不安定、イオンチャネルの発現量不足など、さまざまな要因で、測定が失敗に終わることがある。したがって、信頼性のあるデータを得るためには、ある程度の繰り返し実験が必要である。このため、例えば、測定装置が、一日当たり３０００個の細胞膜電位が測定可能であるとした場合、信頼性のあるデータを得るために、４回繰り返し測定が必要だとすれば、結局、７５０個のデータしか測定できないことになる。したがって、ホールセルクランプ法において、さらに高速かつ正確に測定可能な技術の開発が望まれている。
【特許文献１】WO00159447
【特許文献２】US 6488829
【特許文献３】US06315940
【特許文献４】WO00125769
【非特許文献１】Neher E & Sakmann B (1976) Single channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers. Nature 260 : 799-802
【非特許文献２】Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B & Sigworth FJ (1981) Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 391 : 85 - 100.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方を、従来よりも高速、正確および容易に測定可能な電気的測定方法および電気的測定装置の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法であって、測定電極と、参照電極と、複数の細胞とを準備し、前記測定電極と前記各細胞内とを電気的に接続し、かつ前記参照電極と前記各細胞膜表面とを電気的に接続し、この状態で、前記測定電極に電圧を印加して前記両電極間に流れる電流のゆらぎを測定する電気的測定方法である。
【０００５】
また、本発明の測定装置は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定装置であって、細胞を保持固定する孔を複数有する容器と、測定電極と、参照電極と、前記測定電極に電圧を印加する印加手段と、前記両電極間に流れる電流を検出する検出手段と、前記電流のゆらぎを測定する測定手段とを有し、前記測定電極と前記各細胞内とが電気的に接続可能であり、かつ前記参照電極と前記細胞膜表面とが電気的に接続可能であり、前記両電極が前記状態で電気的に接続された場合、前記印加手段により、前記測定電極に電圧が印加され、前記検出手段により、前記両電極間に流れる電流が検出され、前記測定手段により、前記電流のゆらぎが測定される電気的測定装置である。
【発明の効果】
【０００６】
このように、本発明の測定方法および測定装置では、複数の細胞の全体について、その細胞膜の特性および状態の少なくとも一方に起因する電流のゆらぎを測定する。後述のように、この電流のゆらぎは、前記複数の細胞の細胞膜の特性や状態を全体的に反映するものである。したがって、本発明によれば、複数の細胞の細胞膜状態等を全体的に同時に測定するので、個々の細胞の細胞膜状態等の測定の成功率が、仮に１００％でなくても、一回の測定で、信頼性の高い情報を得ることができる。また、複数の細胞について細胞膜状態等に起因する電流を測定する場合は、細胞毎に電極を配置し、細胞間を絶縁する等の条件が必要となるが、電流のゆらぎを測定する本発明によれば、各細胞間を絶縁する必要がなく、一対の電極（測定電極および参照電極）で、複数の細胞の細胞膜状態等を測定でき、電流の測定のような厳しい測定条件を適用する必要がない。したがって、本発明によれば、従来法よりも、高速、正確および容易に細胞膜の特性および状態の少なくとも一方を測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法において、さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定することが好ましい。同様に、本発明の電気的測定装置において、さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定するためのパワースペクトル測定手段を有することが好ましい。
【０００８】
本発明の電気的測定方法において、前記複数の細胞の数は、特に制限されず、種々の条件により適宜決定されるが、例えば、２〜１００個の範囲である。
【０００９】
本発明の電気的測定方法において、前記測定測定対象である細胞膜の特性および状態は、例えば、前記細胞膜に存在するイオンチャネルの特性および状態がある。前記イオンチャネルの特性および状態としては、例えば、イオンチャネルの個数およびイオンチャネルの開閉状態の少なくとも一方の状態がある。
【００１０】
本発明の電気的測定方法において、前記細胞は、例えば、個々に分離した細胞であってもよいし、組織内に存在する細胞であってもよい。
【００１１】
本発明の電気的測定方法において、化学物質を前記細胞に投与する前後で、前記電流のゆらぎを測定してもよい。このようにすれば、前記化学物質が、細胞膜に及ぼす影響を測定でき、例えば、医薬品の開発に有用である。同様に、本発明の電気的測定装置は、化学物質が細胞膜に与える影響を調べるために使用することが好ましい。
【００１２】
本発明の電気的測定装置において、例えば、前記容器には、電解質溶液が充填可能であり、この電解質溶液によって、前記測定電極と前記各細胞内との間および前記参照電極と前記各細胞膜表面との間が、電気的に接続されるという態様であってもよい。
【００１３】
本発明の細胞膜の電気的測定装置において、前記容器の孔の数は、特に制限されず、測定対象の細胞の数等により適宜決定されるが、例えば、２〜１００個の範囲である。
【００１４】
つぎに、本発明について、詳しく説明する。
【００１５】
本発明の特徴は、単一の細胞について、膜電位を測定するのではなく、複数の細胞について、細胞膜の特性や状態を反映する電流のゆらぎを、まとめて測定する点である。複数の細胞全体の電流のゆらぎは、各細胞の電流のゆらぎの総和である。そして、複数の細胞の膜電流のゆらぎのパワースペクトルを測定し、これを解析すれば、細胞膜の特性や状態を詳細に評価できる。その理論的根拠は、以下のとおりである。
（１） 等価電気回路モデル
図1に、１個の紬胞がデバイス孔にシールを形成している状態にあるときの等価回路モデルを示す。なお、モデルパラメータは、後述の表にまとめて示した。シール抵抗Ｒsealが十分大きく（＞＞1００ＭΩ）、デバイスと接触している細胞面の抵抗Ｒnysが十分小さいとき（＜＜２０ＭΩ）、基準電圧の取り方を適切にとれば、図１（ａ）の回路のうち容量成分Ｃdを除いた部分は図１（ｂ）のように簡約化することができる。この系のダイナミクスは、下記式（１）で示される。
【００１６】
【数１】
【００１７】
以下では、この簡約化されたモデル（図１（ｂ）参照）について解析を行うことにする。
【００１８】
図２に、多細胞を用いたｅＨＴＳデバイス系の等価回路モデルを示す。この系は、各細胞とシールを形成するデバイス孔系が並列接続された構造をなしている。細胞数をＮとすると、観測される電流Ｉtotalは、下記式（２）で与えられる。
【００１９】
【数２】
【００２０】
アンプによって容量電流（右辺第二項）を補正（キャンセル）することにより、下記式（３）のように表すことができ、すなわち、総電流は各細胞電流の和となる。
【００２１】
【数３】
【００２２】
以下では、まず、１個の細胞−デバイス孔を流れる電流とチャネルゆらぎの関係について線形近似を用いて説明し、ついで、それが合成された電流が呈するゆらぎのパワースペクトル密度について説明する。
（２） 線形近似
単一の紬胞−デバイス孔系の等価回路において、電位固定モードで記録された定常状態における電流のゆらぎは、イオンチャネルの開閉ゆらぎに伴って生じるコンダクタンスｇchの変化によって生じる膜抵抗の時間変動による。ただし、Ｒ＝１／（Ｒm＋１／ｇch）である。この抵抗成分と細胞膜の容量成分Ｃmやアクセス抵抗Ｒaccで構成されるフィルタ特性によって観測信号の帯域が制限される。この系の時定数は下記式（４）で与えられる。
【００２３】
【数４】
【００２４】
パラメータをＲacc≒２０ＭΩ、Ｒ＝１００ＭΩ、及びＣm≒３ｐＦとおくとτ≒０．０５ｍｓと計算される。これより遮断周波数はｆc＝１／（２πτ）≒３ｋＨｚと求まる。この場合、１ｋＨｚ（＝３ｋＨｚ／３）以下の信号成分については容量成分を無視することができることがわかる。膜電流のゆらぎ解析では１ｋＨｚ以下の帯域を対象とすることが多いため、以下では簡単のため、Ｃm＝０Ｆと近似する。
膜電流とチャネルゆらぎとの関係を調べる。膜電流を膜コンダクタンスｇの関数とみると、下記式（５）のように表すことができる。
【００２５】
【数５】
【００２６】
ただし、ｇ＝１／Ｒ＝ｇch＋ｇmとおいた、コンダクタンス変化（δｇ：ゆらぎ成分）が定常値（平均値）に比べて十分小さいと仮定すると、膜電流の微小変化分δＩ＝Ｉ（ｇ＋δｇ）−Ｉ（ｇ）は、下記式（６）に示すように近似できる。ただし、Ｋ＝Ｖcmd／（ｇＲacc＋１）2とおいた。
【００２７】
【数６】
【００２８】
コンダクタンス変化は開口チャネル数の変化に比例する。そのため、膜電流ゆらぎ信号のスペクトル解析を行うことによって、開口チャネル数のゆらぎを評価することができることが分かる。
（３） パワースペクトル
単一細胞の膜電流Ｉは膜コンダクタンスｇの関数である。膜コンダクタンスは、膜のリークコンダクタンスをｇm、単一イオンチャネルコンダクタンスをγ、イオンチャネルの開口数をｐとおくと、下記式（７）のように表すことができる。ここで、ｔは時間、ｓはチャネル開口確率を支配するバラメータである。
【００２９】
【数７】
【００３０】
例えば、電位依存性を持つチャネルは膜電位Ｖmがこのパラメータに含まれる。開口チャネル数は時間とともに変動する確率変数であることから、膜電流も確率過程となる。前述で示したように、膜電流の微小変化成分は開口チャネル数ゆらぎに比例するので、膜電流ゆらぎ成分（平均値との差、ｉ（ｔ）とおく）のパワースペクトルはチャネルゆらぎｐのパワースペクトルに比例する。そのため、以下ではこれらを同一視する。
【００３１】
複数の細胞系が並列回路をなすｅＨＴＳデバイスにおける観測電流は、各々の細胞膜電流の総和になる。まず簡単な例として、２個の孔を持つｅＨＴＳデバイスで観測される電流ゆらぎのスペクトルについて考察する。それぞれの電流ゆらぎをｘ（ｔ）及びｙ（ｔ）とすると、観測電流のゆらぎｚ（ｔ）は、下記式（８）で表すことができる。
【００３２】
【数８】
【００３３】
それぞれの細胞の膜電流ゆらぎのフーリエ変換を、下記式（９）および式（１０）とおくと、これより、下記式（１１）のように表すことができる。
【００３４】
【数９】
【００３５】
【数１０】
【００３６】
【数１１】
また、それぞれ電流ゆらぎのパワースペクトルは、下記式（１２）および式（１３）で与えられる。ここで、Ｔは観測時間、Ｘ’（ω）はＸ（ω）の複素共役を表す。
【００３７】
【数１２】
【００３８】
【数１３】
【００３９】
以上から、総電流のパワースペクトルはＳzz（ω）は、下記式（１４）で示すように計算される。
【００４０】
【数１４】
【００４１】
ここで、Ｓxy（ω）およびＳyx（ω）はｘとｙのクロススペクトルであり、下記式（１５）で表される。
【００４２】
【数１５】
【００４３】
一般に、膜電流ゆらぎは細胞ごとに無相関（相互相関関数：Ｃxy（τ）＝０）であると仮定できるので、下記式（１６）のようにおける。
【００４４】
【数１６】
【００４５】
これより、下記式（１７）が得られる。
【００４６】
【数１７】
【００４７】
一般に，Ｎ個の細胞膜電流Ｉjの和である総電流ＩのパワースペクトルＳI（ω）は、それらの電流ゆらぎの間に相関がないと仮定できる場合、各々の電流ゆらぎのパワースペクトルＳIj（ω）に等しい。つまり、下記式（１８）のように表すことができる。
【００４８】
【数１８】
【００４９】
仮に、すべての細胞の膜電流ゆらぎが同じ確率過程に従うのであれば、それぞれのパワースペクトルの期待値は一致する。このことから、同じ特性をもつN個の細胞の膜電流ゆらぎのパワースペクトルは単一の細胞の膜電流ゆらぎのパワースペクトルをN倍したものに等しくなる。もし、細胞ごとのパラメータのばらつきが小さく、その結果として膜電流ゆらぎのパワースペクトルがほぼ等しいとき、N個の細胞の並列回路の膜電流ゆらぎのパワースペクトルは単一の膜電流ゆらぎをN倍したものとなるため、信号／雑音比の向上が期待できる。
変数・パラメータ一覧
Ｎ：細胞数
ｔ：時間
ｒ：細胞半径（５μｍ）
Ｓ：細胞表面積（４πｒ2）
Ｃm：膜容量（＝１μＦ／ｃｍ2×Ｓ≒３ｐＦ）
Ｃd：デバイス孔付近の電気容量
Ｃchip：デバイスチップの電気容量
Ｒm：膜リーク抵抗（＝０．０３ｍＳ×Ｓ）
Ｅm：静止膜電位
ｐ（ｔ；ｓ）：開口チャネル数（ｓはパラメータ）
γ：単一チャネルコンダクタンス
ｇch：イオンチャネルによる膜コンダクタンス（＝ｐ（ｔ；ｓ）γ）
ｇ：膜チャネルコンダクタンス（ｇ＝ｇm＋ｇch）
Ｒch：イオンチャネルによる膜抵抗（＝１／ｇch）
Ｅch：イオンチャネル電流の平衡電位
Ｒnys：デバイス孔に接している部分の膜抵抗（エスタチン等による）
Ｒhole：デバイス孔部の抵抗
Ｒseal：細胞とデバイス接触部におけるシール抵抗
ＶCMD：指令電位（実験者が決定する）
Ｖm：細胞内電位（膜電位）
Ｒacc：アクセス抵抗（＝Ｒnys＋Ｒhole）
Ｒ：膜抵抗（＝Ｒm／／Ｒch＝ＲmＲch／（Ｒm＋Ｒch））
ｘ、ｙ：単一細胞の膜電流ゆらぎ成分
ｚ：総電流のゆらぎ成分
ω：信号の角周波数
Ｘ、Ｙ、Ｚ：各ｘ、ｙ、ｚのフーリエ変換
Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’：各Ｘ、Ｙ、Ｚの複素共役
Ｓxx、Ｓyy、Ｓzz：各ｘ、ｙ、ｚのパワースペクトル密度
Ｓxy：ｘとｙのクロススペクトル
つぎに、本発明の電気的測定装置の一例について、図３の断面図および図５の構成図に基づき説明する。
【００５０】
まず、図３は、測定に使用する容器１の断面図である。容器１の材質としては、例えば、シリコン、ガリウムヒ素、水晶などの単結晶基板の他、ガラス、石英、樹脂、などの各種基板材料が用いられる。図示のように、この容器１では、容器本体１１内部が、仕切りプレート１１Ａで上下に仕切られており、前記仕切りプレート１１Ａには、複数の孔１４が形成されており、各孔１４の上に、細胞１７が保持固定されている。ここで、この孔１４の径は細胞１７の大きさによって最適なものに決められるものであり、例えば、測定対象がHEK細胞の場合の前記孔１４の直径は、通常、直径0.5から10マイクロメートルであり、好ましくは直径1から５マイクロメートルである。また、孔１４の最適な数は、測定対象である細胞１７の活性度、細胞１７の孔１４への吸着度等によって影響されるものであり、後述される測定方法で最も効率よい測定となるよう決められる。さらに、前記仕切りプレート１１Ａ下側表面には、一つの測定電極１２が配置されており、この測定電極１２では、前記仕切りプレートの各孔１４に対応する部分に、孔１５が形成されている。この容器本体１１の上下に仕切られた内部は、共に電解質溶液１６で満たされている。そして、容器本体１１の上部には、前記電解質溶液１６中に侵入する状態で、一つの参照電極１３が配置されている。これら電極の材質には、例えば、金、銀、銅、アルミ、ステンレス、クロム、チタンなどの導体材料が用いられ、好ましくは、さらに、これら導体材料の一部に塩化銀が設けられていることである。これによって前記電解質溶液１６の電位変化をより正確に測定することが可能である。また、これら電極の形状、大きさは特に限定されるものではなく、図３の参照電極１３のように電解質溶液１６に浸水させるだけでもよく、図示した測定電極１２のように仕切りプレート１１Aあるいは容器１の内壁に密着させるように形成しても良い。内壁に密着した測定電極１２を形成するためには、電極材料である金、銀、銅、アルミ、ステンレス、クロム、チタン、塩化銀などを蒸着、スパッタ、メッキ、などの方法で、内壁表面上に電極を形成すればよい。さらに、細胞１７において、仕切りプレートの孔１４内に位置する部分の細胞膜は、一部破断している。このため、電解質溶液１６により、測定電極１２と細胞１７内部とが電気的に接続されている。また、電解質溶液１６により、細胞１７膜表面と参照電極１３とが電気的に接続されている。また、図示していないが、測定電極１２および参照電極１３は、コネクタを介し、電流／電圧変回路、Ａ／Ｄ変換回路、Ｄ／Ａ変換回路、ＣＰＵ、表示装置等に接続されている。すなわち、この容器１では、各細胞１７について、ホールセルクランプ法の状態が実現可能となっており、仮に、各細胞について等価回路が形成されると仮定すると、前述のように、その等価回路は、並列に接続した状態となっている。
【００５１】
図５は、測定に使用する測定装置の概略図である。電気的測定装置１８は、制御部１９、これに接続されたD/A変換回路２０、電流／電圧変換回路２１、A/D変換回路２２および溶液駆動部２３、載置部２４および刺激信号付与部２６を備える。なお、同図において、１は前記容器を示す。この装置を用いた細胞膜の電流のゆらぎの測定は、例えば、つぎのようにして実施される。すなわち、まず、載置部２４には容器１が載置される。載置部２４は載置された容器1を所定の温度、ガス濃度、湿度、気圧下に保持することが出来る。次に容器1の上面より単離した細胞17を投入する。このとき仕切りプレート下面に陰圧をかけることにより細胞17が孔14に保持される。仕切りプレート上側表面はpoly-L-lysine、gelatin、polyethylenimineもしくはgel等によるコーティングをされていてもよい。制御部１９は、電流／電圧変換回路から入力される信号に基づいて容器1の電極１２，１３間に流れる電流を検出、記録する。また制御部１９は設定された刺激条件に基づいてD/A変換回路２０ならびに電流／電圧変換回路２１を介して刺激信号付与部２６を制御する。刺激信号付与部２６により容器１上の細胞に、測定電極１２と参照電極１3間が任意の電圧になるように、電流を印加すると、測定電極１２および参照電極１３の間に電流が流れる。この電流は、複数の細胞１７全体の細胞膜状態を反映したものである。この電流を、前記測定電極１２および参照電極１３で検出し、電流／電圧変換回路２１およびＡ／Ｄ変換回路２２を介して、制御部１９に入力され、ＣＰＵにおいて、電流のゆらぎとして測定し、そのパワースペクトル解析する。この解析結果を、表示装置に表示する。前述のように、前記電流のゆらぎは、複数の細胞の全体の細胞膜状態等、例えば、イオンチャネルの数や開閉等を反映するものである。溶液駆動部２３は容器本体１１の内部の電解質溶液１６を排出し、あるいは容器本体１１の内部に電解質溶液１６を注入する機能を有し、必要に応じて制御部１９により駆動される。電解質溶液16は、例えば、下記のような組成のものを使用してもよい。
【００５２】
（電解質溶液組成例１）
NaCl 137 mM,
KCl 4 mM
CaCl2 1.8 mM
MgCl2 1 mM
glucose 10 mM
HEPES 10 mM
【００５３】
（電解質溶液組成例２）
KCl 130 mM
MgCl2 1 mM
EGTA 5 mM
ATP 5 mM
HEPES 10 mM
【００５４】
このように、複数の細胞の細胞膜の状態に起因する電流のゆらぎを測定することにより、高速かつ正確な細胞膜状態等の電気的測定が可能になる。図４のグラフに、電極あたりの細胞数と電流振幅の再現性を理論的に検討したグラフを示す。このグラフは、Hole 不良、シール不十分 、ベースライン不安定、そしてイオンチャンネル発現量過少等の要因で、測定の成功率が１．０（１００％）で無い場合に、まとめて測定する細胞数を増やすと変動係数が減少する、すなわち再現性が上昇することを示している。図示のように、例えば、成功率０．７であっても、１００個の細胞をまとめて測定すれば、成功率０．９の場合と遜色ない変動係数が得られることが分かる。図６のグラフは、細胞数２０個での電流値の標準偏差を用いて用量反応特性を理論的に求めたものであり、細胞に薬物を作用させた時のノイズ電流特性のシュミレーションを示すグラフである。膜電位依存性イオンチャネルを組込んだ細胞モデルにオープンチャネルブロッカを作用させた際の膜電流ゆらぎをシュミレーションし、定常状態においてブロッカ濃度とノイズ電流の標準偏差（ＳＤ）の関係を評価した。ブロッカの解離定数は１０μＭとした。ＳＤは、薬物濃度が解離定数のときに最大値をとっている。図示のように、この特性を利用することにより、ノイズ電流から薬物の解離定数を推定することができることがわかる。
【実施例１】
【００５５】
図３に示す容器１において、孔１４を２つとし、図５に示す電気的測定装置（図５）を用いて実際に電流ゆらぎを測定した。以下の操作は２５℃で行った。デバイス下面（容器１下側）には内側電解質溶液(KCl 130 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 5 mM, ATP 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4)を満たし、デバイス上面（容器１上側）は外側電解質溶液(NaCl 137 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 1 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4)で満たした。hERGチャネルを定常的に発現させたHEK細胞を別の容器に入れた外液中でピペッティングにより単離した後、デバイス上面に投入した。デバイス下面に吸引により陰圧（最大530mmHg）をかけることによりデバイスと細胞のシール抵抗を上昇させた。十分にシール抵抗が上がったところでデバイス下面の内側電解質溶液をニスタチン入り溶液（ニスタチン濃度250μg/ml）に置換し細胞膜にニスタチンによる穿孔を構築した。ニスタチンによって細胞膜に穿孔を形成した後、EPC-10増幅器（HEKA社製）を用いてhERG発現HEK細胞を、まず -80mVの電圧で固定し、その後固定電圧を0mVまで上げて6秒間電流ゆらぎを測定した。測定した電流ゆらぎは10kHzでデジタルサンプリングし（PATCHMASTER software, HEKA社製）、さらにそのうち最後の２秒間のデータを高速フーリエ変換してパワースペクトルを求めた（Origin7.0）。つぎに、デバイス上面の外側電解質液にhERGチャネル阻害薬であるE-4031（Sigma社製）を最終濃度1Mになるように加え、同様に電圧固定を
行って電流ゆらぎ測定、そしてパワースペクトルを求めた。これらのパワースペクトルを図７のグラフに示す。
【００５６】
図７に示すように、E-4031 を加える前（実線）に較べて、E-4031を加えた後（点線）では、１００Ｈｚ以下でパワーが低くなった。これはE-4031がhERGチャネル阻害剤であることを良く表しており、本発明の装置方法で電流ゆらぎのパワースペクトルを求めることにより、イオンチャンネルの挙動変化を測定できたことを示している。
【００５７】
以上のように、本発明の細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法および電気的測定装置は、複数の細胞の細胞膜の特性や状態に起因する電流のゆらぎを、まとめて測定するため、高速、正確および容易に細胞膜状態等の電気的測定が可能である。したがって、本発明の電気的測定方法および電気的測定装置は、イオンチャネル状態等の細胞膜の特性や状態を分析する全ての分野に有用であり、例えば、生物学、医学、薬学、農学等の分野に有用であり、特に、医薬品の開発に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１（ａ）は、細胞内外に形成されると推定される電気回路の一例を示す図であり、図１（ｂ）は、前記電気回路の簡略化モデルを示す図である。
【図２】図２は、複数の細胞に形成されると推定される電気回路の一例を示す図である。
【図３】図３は、本発明の電気的測定装置の一部を構成する容器の一例を示す断面図である。
【図４】図４は、本発明の電気的測定方法の一例において、電極あたりの細胞数と電流振幅の再現性を理論的に検討したグラフである。
【図５】図５は、本発明の電気的測定装置の一例を示す構成図である。
【図６】図６は、本発明の電気的測定方法の一例において、細胞数２０個での電流値の標準偏差を用いて用量反応特性を理論的に求めたグラフである。
【図７】図７は、本発明の電気的測定方法の一実施例におけるパワースペクトルのグラフである。
【符号の説明】
【００５９】
１ 容器
１１ 容器本体
１２ 測定電極
１３ 参照電極
１４、１５ 孔
１６ 電解質溶液
１７ 細胞
１８ 細胞膜の電気的測定装置
１９ 制御部
２０ Ｄ／Ａ変換回路
２１ 電流／電圧変換回路
２２ Ａ／Ｄ変換回路
２３ 溶液駆動部
２４ 載置部
２６ 刺激信号付与部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法および電気的測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気生理学の初期のころから、ガラス電極を細胞に刺入して細胞の膜電位を測定することが行われ、細胞膜におけるイオンチャネルの存在が予見されていた。そして、細胞膜電位の測定は、パッチクランプ法の開発により、大きく進展した。パッチクランプ法は、１９７６年にNeher および Sakmannによって開発され（非特許文献１）、これにより、実際にイオンチャンネルの存在を証明するという画期的成果を生み出した。さらに、１９８１年に、Hamill等によってホールセルクランプ(whole-cell-clamp)法が開発され、これにより細胞膜表面全体に存在するイオンチャネルの全電流の測定が可能となった。イオンチャネルの異常と疾病との関係が明らかになるにつれ、イオンチャネルの状態を測定できるホールセルパッチクランプ法が、医薬品開発において重要になってきており、これを高速で実施可能にするための技術が開発されている。例えば、ホールセルパッチクランプ法のための平板パッチデバイスおよびそのシステムがある（特許文献１〜４）。しかしながら、この方法では、つぎの問題がある。すなわち、パッチクランプ法は、記録用ピペットを細胞に密に接着させ、ギガオームを超える緊密なシールを形成させることが必要であるが、このシールが緩ければ、信頼性のあるデータが得られない。この他、パッチクランプ法においては、hole不良、ベースラインの不安定、イオンチャネルの発現量不足など、さまざまな要因で、測定が失敗に終わることがある。したがって、信頼性のあるデータを得るためには、ある程度の繰り返し実験が必要である。このため、例えば、測定装置が、一日当たり３０００個の細胞膜電位が測定可能であるとした場合、信頼性のあるデータを得るために、４回繰り返し測定が必要だとすれば、結局、７５０個のデータしか測定できないことになる。したがって、ホールセルクランプ法において、さらに高速かつ正確に測定可能な技術の開発が望まれている。
【特許文献１】WO00159447
【特許文献２】US 6488829
【特許文献３】US06315940
【特許文献４】WO00125769
【非特許文献１】Neher E & Sakmann B (1976) Single channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers. Nature 260 : 799-802
【非特許文献２】Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B & Sigworth FJ (1981) Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 391 : 85 - 100.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方を、従来よりも高速、正確および容易に測定可能な電気的測定方法および電気的測定装置の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法であって、測定電極と、参照電極と、複数の細胞とを準備し、前記測定電極と前記各細胞内とを電気的に接続し、かつ前記参照電極と前記各細胞膜表面とを電気的に接続し、この状態で、前記測定電極に電圧を印加して前記両電極間に流れる電流のゆらぎを測定する電気的測定方法である。
【０００５】
また、本発明の測定装置は、細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定装置であって、細胞を保持固定する孔を複数有する容器と、測定電極と、参照電極と、前記測定電極に電圧を印加する印加手段と、前記両電極間に流れる電流を検出する検出手段と、前記電流のゆらぎを測定する測定手段とを有し、前記測定電極と前記各細胞内とが電気的に接続可能であり、かつ前記参照電極と前記細胞膜表面とが電気的に接続可能であり、前記両電極が前記状態で電気的に接続された場合、前記印加手段により、前記測定電極に電圧が印加され、前記検出手段により、前記両電極間に流れる電流が検出され、前記測定手段により、前記電流のゆらぎが測定される電気的測定装置である。
【発明の効果】
【０００６】
このように、本発明の測定方法および測定装置では、複数の細胞の全体について、その細胞膜の特性および状態の少なくとも一方に起因する電流のゆらぎを測定する。後述のように、この電流のゆらぎは、前記複数の細胞の細胞膜の特性や状態を全体的に反映するものである。したがって、本発明によれば、複数の細胞の細胞膜状態等を全体的に同時に測定するので、個々の細胞の細胞膜状態等の測定の成功率が、仮に１００％でなくても、一回の測定で、信頼性の高い情報を得ることができる。また、複数の細胞について細胞膜状態等に起因する電流を測定する場合は、細胞毎に電極を配置し、細胞間を絶縁する等の条件が必要となるが、電流のゆらぎを測定する本発明によれば、各細胞間を絶縁する必要がなく、一対の電極（測定電極および参照電極）で、複数の細胞の細胞膜状態等を測定でき、電流の測定のような厳しい測定条件を適用する必要がない。したがって、本発明によれば、従来法よりも、高速、正確および容易に細胞膜の特性および状態の少なくとも一方を測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法において、さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定することが好ましい。同様に、本発明の電気的測定装置において、さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定するためのパワースペクトル測定手段を有することが好ましい。
【０００８】
本発明の電気的測定方法において、前記複数の細胞の数は、特に制限されず、種々の条件により適宜決定されるが、例えば、２〜１００個の範囲である。
【０００９】
本発明の電気的測定方法において、前記測定測定対象である細胞膜の特性および状態は、例えば、前記細胞膜に存在するイオンチャネルの特性および状態がある。前記イオンチャネルの特性および状態としては、例えば、イオンチャネルの個数およびイオンチャネルの開閉状態の少なくとも一方の状態がある。
【００１０】
本発明の電気的測定方法において、前記細胞は、例えば、個々に分離した細胞であってもよいし、組織内に存在する細胞であってもよい。
【００１１】
本発明の電気的測定方法において、化学物質を前記細胞に投与する前後で、前記電流のゆらぎを測定してもよい。このようにすれば、前記化学物質が、細胞膜に及ぼす影響を測定でき、例えば、医薬品の開発に有用である。同様に、本発明の電気的測定装置は、化学物質が細胞膜に与える影響を調べるために使用することが好ましい。
【００１２】
本発明の電気的測定装置において、例えば、前記容器には、電解質溶液が充填可能であり、この電解質溶液によって、前記測定電極と前記各細胞内との間および前記参照電極と前記各細胞膜表面との間が、電気的に接続されるという態様であってもよい。
【００１３】
本発明の細胞膜の電気的測定装置において、前記容器の孔の数は、特に制限されず、測定対象の細胞の数等により適宜決定されるが、例えば、２〜１００個の範囲である。
【００１４】
つぎに、本発明について、詳しく説明する。
【００１５】
本発明の特徴は、単一の細胞について、膜電位を測定するのではなく、複数の細胞について、細胞膜の特性や状態を反映する電流のゆらぎを、まとめて測定する点である。複数の細胞全体の電流のゆらぎは、各細胞の電流のゆらぎの総和である。そして、複数の細胞の膜電流のゆらぎのパワースペクトルを測定し、これを解析すれば、細胞膜の特性や状態を詳細に評価できる。その理論的根拠は、以下のとおりである。
（１） 等価電気回路モデル
図1に、１個の紬胞がデバイス孔にシールを形成している状態にあるときの等価回路モデルを示す。なお、モデルパラメータは、後述の表にまとめて示した。シール抵抗Ｒsealが十分大きく（＞＞1００ＭΩ）、デバイスと接触している細胞面の抵抗Ｒnysが十分小さいとき（＜＜２０ＭΩ）、基準電圧の取り方を適切にとれば、図１（ａ）の回路のうち容量成分Ｃdを除いた部分は図１（ｂ）のように簡約化することができる。この系のダイナミクスは、下記式（１）で示される。
【００１６】
【数１】
【００１７】
以下では、この簡約化されたモデル（図１（ｂ）参照）について解析を行うことにする。
【００１８】
図２に、多細胞を用いたｅＨＴＳデバイス系の等価回路モデルを示す。この系は、各細胞とシールを形成するデバイス孔系が並列接続された構造をなしている。細胞数をＮとすると、観測される電流Ｉtotalは、下記式（２）で与えられる。
【００１９】
【数２】
【００２０】
アンプによって容量電流（右辺第二項）を補正（キャンセル）することにより、下記式（３）のように表すことができ、すなわち、総電流は各細胞電流の和となる。
【００２１】
【数３】
【００２２】
以下では、まず、１個の細胞−デバイス孔を流れる電流とチャネルゆらぎの関係について線形近似を用いて説明し、ついで、それが合成された電流が呈するゆらぎのパワースペクトル密度について説明する。
（２） 線形近似
単一の紬胞−デバイス孔系の等価回路において、電位固定モードで記録された定常状態における電流のゆらぎは、イオンチャネルの開閉ゆらぎに伴って生じるコンダクタンスｇchの変化によって生じる膜抵抗の時間変動による。ただし、Ｒ＝１／（Ｒm＋１／ｇch）である。この抵抗成分と細胞膜の容量成分Ｃmやアクセス抵抗Ｒaccで構成されるフィルタ特性によって観測信号の帯域が制限される。この系の時定数は下記式（４）で与えられる。
【００２３】
【数４】
【００２４】
パラメータをＲacc≒２０ＭΩ、Ｒ＝１００ＭΩ、及びＣm≒３ｐＦとおくとτ≒０．０５ｍｓと計算される。これより遮断周波数はｆc＝１／（２πτ）≒３ｋＨｚと求まる。この場合、１ｋＨｚ（＝３ｋＨｚ／３）以下の信号成分については容量成分を無視することができることがわかる。膜電流のゆらぎ解析では１ｋＨｚ以下の帯域を対象とすることが多いため、以下では簡単のため、Ｃm＝０Ｆと近似する。
膜電流とチャネルゆらぎとの関係を調べる。膜電流を膜コンダクタンスｇの関数とみると、下記式（５）のように表すことができる。
【００２５】
【数５】
【００２６】
ただし、ｇ＝１／Ｒ＝ｇch＋ｇmとおいた、コンダクタンス変化（δｇ：ゆらぎ成分）が定常値（平均値）に比べて十分小さいと仮定すると、膜電流の微小変化分δＩ＝Ｉ（ｇ＋δｇ）−Ｉ（ｇ）は、下記式（６）に示すように近似できる。ただし、Ｋ＝Ｖcmd／（ｇＲacc＋１）2とおいた。
【００２７】
【数６】
【００２８】
コンダクタンス変化は開口チャネル数の変化に比例する。そのため、膜電流ゆらぎ信号のスペクトル解析を行うことによって、開口チャネル数のゆらぎを評価することができることが分かる。
（３） パワースペクトル
単一細胞の膜電流Ｉは膜コンダクタンスｇの関数である。膜コンダクタンスは、膜のリークコンダクタンスをｇm、単一イオンチャネルコンダクタンスをγ、イオンチャネルの開口数をｐとおくと、下記式（７）のように表すことができる。ここで、ｔは時間、ｓはチャネル開口確率を支配するバラメータである。
【００２９】
【数７】
【００３０】
例えば、電位依存性を持つチャネルは膜電位Ｖmがこのパラメータに含まれる。開口チャネル数は時間とともに変動する確率変数であることから、膜電流も確率過程となる。前述で示したように、膜電流の微小変化成分は開口チャネル数ゆらぎに比例するので、膜電流ゆらぎ成分（平均値との差、ｉ（ｔ）とおく）のパワースペクトルはチャネルゆらぎｐのパワースペクトルに比例する。そのため、以下ではこれらを同一視する。
【００３１】
複数の細胞系が並列回路をなすｅＨＴＳデバイスにおける観測電流は、各々の細胞膜電流の総和になる。まず簡単な例として、２個の孔を持つｅＨＴＳデバイスで観測される電流ゆらぎのスペクトルについて考察する。それぞれの電流ゆらぎをｘ（ｔ）及びｙ（ｔ）とすると、観測電流のゆらぎｚ（ｔ）は、下記式（８）で表すことができる。
【００３２】
【数８】
【００３３】
それぞれの細胞の膜電流ゆらぎのフーリエ変換を、下記式（９）および式（１０）とおくと、これより、下記式（１１）のように表すことができる。
【００３４】
【数９】
【００３５】
【数１０】
【００３６】
【数１１】
また、それぞれ電流ゆらぎのパワースペクトルは、下記式（１２）および式（１３）で与えられる。ここで、Ｔは観測時間、Ｘ’（ω）はＸ（ω）の複素共役を表す。
【００３７】
【数１２】
【００３８】
【数１３】
【００３９】
以上から、総電流のパワースペクトルはＳzz（ω）は、下記式（１４）で示すように計算される。
【００４０】
【数１４】
【００４１】
ここで、Ｓxy（ω）およびＳyx（ω）はｘとｙのクロススペクトルであり、下記式（１５）で表される。
【００４２】
【数１５】
【００４３】
一般に、膜電流ゆらぎは細胞ごとに無相関（相互相関関数：Ｃxy（τ）＝０）であると仮定できるので、下記式（１６）のようにおける。
【００４４】
【数１６】
【００４５】
これより、下記式（１７）が得られる。
【００４６】
【数１７】
【００４７】
一般に，Ｎ個の細胞膜電流Ｉjの和である総電流ＩのパワースペクトルＳI（ω）は、それらの電流ゆらぎの間に相関がないと仮定できる場合、各々の電流ゆらぎのパワースペクトルＳIj（ω）に等しい。つまり、下記式（１８）のように表すことができる。
【００４８】
【数１８】
【００４９】
仮に、すべての細胞の膜電流ゆらぎが同じ確率過程に従うのであれば、それぞれのパワースペクトルの期待値は一致する。このことから、同じ特性をもつN個の細胞の膜電流ゆらぎのパワースペクトルは単一の細胞の膜電流ゆらぎのパワースペクトルをN倍したものに等しくなる。もし、細胞ごとのパラメータのばらつきが小さく、その結果として膜電流ゆらぎのパワースペクトルがほぼ等しいとき、N個の細胞の並列回路の膜電流ゆらぎのパワースペクトルは単一の膜電流ゆらぎをN倍したものとなるため、信号／雑音比の向上が期待できる。
変数・パラメータ一覧
Ｎ：細胞数
ｔ：時間
ｒ：細胞半径（５μｍ）
Ｓ：細胞表面積（４πｒ2）
Ｃm：膜容量（＝１μＦ／ｃｍ2×Ｓ≒３ｐＦ）
Ｃd：デバイス孔付近の電気容量
Ｃchip：デバイスチップの電気容量
Ｒm：膜リーク抵抗（＝０．０３ｍＳ×Ｓ）
Ｅm：静止膜電位
ｐ（ｔ；ｓ）：開口チャネル数（ｓはパラメータ）
γ：単一チャネルコンダクタンス
ｇch：イオンチャネルによる膜コンダクタンス（＝ｐ（ｔ；ｓ）γ）
ｇ：膜チャネルコンダクタンス（ｇ＝ｇm＋ｇch）
Ｒch：イオンチャネルによる膜抵抗（＝１／ｇch）
Ｅch：イオンチャネル電流の平衡電位
Ｒnys：デバイス孔に接している部分の膜抵抗（エスタチン等による）
Ｒhole：デバイス孔部の抵抗
Ｒseal：細胞とデバイス接触部におけるシール抵抗
ＶCMD：指令電位（実験者が決定する）
Ｖm：細胞内電位（膜電位）
Ｒacc：アクセス抵抗（＝Ｒnys＋Ｒhole）
Ｒ：膜抵抗（＝Ｒm／／Ｒch＝ＲmＲch／（Ｒm＋Ｒch））
ｘ、ｙ：単一細胞の膜電流ゆらぎ成分
ｚ：総電流のゆらぎ成分
ω：信号の角周波数
Ｘ、Ｙ、Ｚ：各ｘ、ｙ、ｚのフーリエ変換
Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’：各Ｘ、Ｙ、Ｚの複素共役
Ｓxx、Ｓyy、Ｓzz：各ｘ、ｙ、ｚのパワースペクトル密度
Ｓxy：ｘとｙのクロススペクトル
つぎに、本発明の電気的測定装置の一例について、図３の断面図および図５の構成図に基づき説明する。
【００５０】
まず、図３は、測定に使用する容器１の断面図である。容器１の材質としては、例えば、シリコン、ガリウムヒ素、水晶などの単結晶基板の他、ガラス、石英、樹脂、などの各種基板材料が用いられる。図示のように、この容器１では、容器本体１１内部が、仕切りプレート１１Ａで上下に仕切られており、前記仕切りプレート１１Ａには、複数の孔１４が形成されており、各孔１４の上に、細胞１７が保持固定されている。ここで、この孔１４の径は細胞１７の大きさによって最適なものに決められるものであり、例えば、測定対象がHEK細胞の場合の前記孔１４の直径は、通常、直径0.5から10マイクロメートルであり、好ましくは直径1から５マイクロメートルである。また、孔１４の最適な数は、測定対象である細胞１７の活性度、細胞１７の孔１４への吸着度等によって影響されるものであり、後述される測定方法で最も効率よい測定となるよう決められる。さらに、前記仕切りプレート１１Ａ下側表面には、一つの測定電極１２が配置されており、この測定電極１２では、前記仕切りプレートの各孔１４に対応する部分に、孔１５が形成されている。この容器本体１１の上下に仕切られた内部は、共に電解質溶液１６で満たされている。そして、容器本体１１の上部には、前記電解質溶液１６中に侵入する状態で、一つの参照電極１３が配置されている。これら電極の材質には、例えば、金、銀、銅、アルミ、ステンレス、クロム、チタンなどの導体材料が用いられ、好ましくは、さらに、これら導体材料の一部に塩化銀が設けられていることである。これによって前記電解質溶液１６の電位変化をより正確に測定することが可能である。また、これら電極の形状、大きさは特に限定されるものではなく、図３の参照電極１３のように電解質溶液１６に浸水させるだけでもよく、図示した測定電極１２のように仕切りプレート１１Aあるいは容器１の内壁に密着させるように形成しても良い。内壁に密着した測定電極１２を形成するためには、電極材料である金、銀、銅、アルミ、ステンレス、クロム、チタン、塩化銀などを蒸着、スパッタ、メッキ、などの方法で、内壁表面上に電極を形成すればよい。さらに、細胞１７において、仕切りプレートの孔１４内に位置する部分の細胞膜は、一部破断している。このため、電解質溶液１６により、測定電極１２と細胞１７内部とが電気的に接続されている。また、電解質溶液１６により、細胞１７膜表面と参照電極１３とが電気的に接続されている。また、図示していないが、測定電極１２および参照電極１３は、コネクタを介し、電流／電圧変回路、Ａ／Ｄ変換回路、Ｄ／Ａ変換回路、ＣＰＵ、表示装置等に接続されている。すなわち、この容器１では、各細胞１７について、ホールセルクランプ法の状態が実現可能となっており、仮に、各細胞について等価回路が形成されると仮定すると、前述のように、その等価回路は、並列に接続した状態となっている。
【００５１】
図５は、測定に使用する測定装置の概略図である。電気的測定装置１８は、制御部１９、これに接続されたD/A変換回路２０、電流／電圧変換回路２１、A/D変換回路２２および溶液駆動部２３、載置部２４および刺激信号付与部２６を備える。なお、同図において、１は前記容器を示す。この装置を用いた細胞膜の電流のゆらぎの測定は、例えば、つぎのようにして実施される。すなわち、まず、載置部２４には容器１が載置される。載置部２４は載置された容器1を所定の温度、ガス濃度、湿度、気圧下に保持することが出来る。次に容器1の上面より単離した細胞17を投入する。このとき仕切りプレート下面に陰圧をかけることにより細胞17が孔14に保持される。仕切りプレート上側表面はpoly-L-lysine、gelatin、polyethylenimineもしくはgel等によるコーティングをされていてもよい。制御部１９は、電流／電圧変換回路から入力される信号に基づいて容器1の電極１２，１３間に流れる電流を検出、記録する。また制御部１９は設定された刺激条件に基づいてD/A変換回路２０ならびに電流／電圧変換回路２１を介して刺激信号付与部２６を制御する。刺激信号付与部２６により容器１上の細胞に、測定電極１２と参照電極１3間が任意の電圧になるように、電流を印加すると、測定電極１２および参照電極１３の間に電流が流れる。この電流は、複数の細胞１７全体の細胞膜状態を反映したものである。この電流を、前記測定電極１２および参照電極１３で検出し、電流／電圧変換回路２１およびＡ／Ｄ変換回路２２を介して、制御部１９に入力され、ＣＰＵにおいて、電流のゆらぎとして測定し、そのパワースペクトル解析する。この解析結果を、表示装置に表示する。前述のように、前記電流のゆらぎは、複数の細胞の全体の細胞膜状態等、例えば、イオンチャネルの数や開閉等を反映するものである。溶液駆動部２３は容器本体１１の内部の電解質溶液１６を排出し、あるいは容器本体１１の内部に電解質溶液１６を注入する機能を有し、必要に応じて制御部１９により駆動される。電解質溶液16は、例えば、下記のような組成のものを使用してもよい。
【００５２】
（電解質溶液組成例１）
NaCl 137 mM,
KCl 4 mM
CaCl2 1.8 mM
MgCl2 1 mM
glucose 10 mM
HEPES 10 mM
【００５３】
（電解質溶液組成例２）
KCl 130 mM
MgCl2 1 mM
EGTA 5 mM
ATP 5 mM
HEPES 10 mM
【００５４】
このように、複数の細胞の細胞膜の状態に起因する電流のゆらぎを測定することにより、高速かつ正確な細胞膜状態等の電気的測定が可能になる。図４のグラフに、電極あたりの細胞数と電流振幅の再現性を理論的に検討したグラフを示す。このグラフは、Hole 不良、シール不十分 、ベースライン不安定、そしてイオンチャンネル発現量過少等の要因で、測定の成功率が１．０（１００％）で無い場合に、まとめて測定する細胞数を増やすと変動係数が減少する、すなわち再現性が上昇することを示している。図示のように、例えば、成功率０．７であっても、１００個の細胞をまとめて測定すれば、成功率０．９の場合と遜色ない変動係数が得られることが分かる。図６のグラフは、細胞数２０個での電流値の標準偏差を用いて用量反応特性を理論的に求めたものであり、細胞に薬物を作用させた時のノイズ電流特性のシュミレーションを示すグラフである。膜電位依存性イオンチャネルを組込んだ細胞モデルにオープンチャネルブロッカを作用させた際の膜電流ゆらぎをシュミレーションし、定常状態においてブロッカ濃度とノイズ電流の標準偏差（ＳＤ）の関係を評価した。ブロッカの解離定数は１０μＭとした。ＳＤは、薬物濃度が解離定数のときに最大値をとっている。図示のように、この特性を利用することにより、ノイズ電流から薬物の解離定数を推定することができることがわかる。
【実施例１】
【００５５】
図３に示す容器１において、孔１４を２つとし、図５に示す電気的測定装置（図５）を用いて実際に電流ゆらぎを測定した。以下の操作は２５℃で行った。デバイス下面（容器１下側）には内側電解質溶液(KCl 130 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 5 mM, ATP 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4)を満たし、デバイス上面（容器１上側）は外側電解質溶液(NaCl 137 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 1 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4)で満たした。hERGチャネルを定常的に発現させたHEK細胞を別の容器に入れた外液中でピペッティングにより単離した後、デバイス上面に投入した。デバイス下面に吸引により陰圧（最大530mmHg）をかけることによりデバイスと細胞のシール抵抗を上昇させた。十分にシール抵抗が上がったところでデバイス下面の内側電解質溶液をニスタチン入り溶液（ニスタチン濃度250μg/ml）に置換し細胞膜にニスタチンによる穿孔を構築した。ニスタチンによって細胞膜に穿孔を形成した後、EPC-10増幅器（HEKA社製）を用いてhERG発現HEK細胞を、まず -80mVの電圧で固定し、その後固定電圧を0mVまで上げて6秒間電流ゆらぎを測定した。測定した電流ゆらぎは10kHzでデジタルサンプリングし（PATCHMASTER software, HEKA社製）、さらにそのうち最後の２秒間のデータを高速フーリエ変換してパワースペクトルを求めた（Origin7.0）。つぎに、デバイス上面の外側電解質液にhERGチャネル阻害薬であるE-4031（Sigma社製）を最終濃度1Mになるように加え、同様に電圧固定を
行って電流ゆらぎ測定、そしてパワースペクトルを求めた。これらのパワースペクトルを図７のグラフに示す。
【００５６】
図７に示すように、E-4031 を加える前（実線）に較べて、E-4031を加えた後（点線）では、１００Ｈｚ以下でパワーが低くなった。これはE-4031がhERGチャネル阻害剤であることを良く表しており、本発明の装置方法で電流ゆらぎのパワースペクトルを求めることにより、イオンチャンネルの挙動変化を測定できたことを示している。
【００５７】
以上のように、本発明の細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法および電気的測定装置は、複数の細胞の細胞膜の特性や状態に起因する電流のゆらぎを、まとめて測定するため、高速、正確および容易に細胞膜状態等の電気的測定が可能である。したがって、本発明の電気的測定方法および電気的測定装置は、イオンチャネル状態等の細胞膜の特性や状態を分析する全ての分野に有用であり、例えば、生物学、医学、薬学、農学等の分野に有用であり、特に、医薬品の開発に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１（ａ）は、細胞内外に形成されると推定される電気回路の一例を示す図であり、図１（ｂ）は、前記電気回路の簡略化モデルを示す図である。
【図２】図２は、複数の細胞に形成されると推定される電気回路の一例を示す図である。
【図３】図３は、本発明の電気的測定装置の一部を構成する容器の一例を示す断面図である。
【図４】図４は、本発明の電気的測定方法の一例において、電極あたりの細胞数と電流振幅の再現性を理論的に検討したグラフである。
【図５】図５は、本発明の電気的測定装置の一例を示す構成図である。
【図６】図６は、本発明の電気的測定方法の一例において、細胞数２０個での電流値の標準偏差を用いて用量反応特性を理論的に求めたグラフである。
【図７】図７は、本発明の電気的測定方法の一実施例におけるパワースペクトルのグラフである。
【符号の説明】
【００５９】
１ 容器
１１ 容器本体
１２ 測定電極
１３ 参照電極
１４、１５ 孔
１６ 電解質溶液
１７ 細胞
１８ 細胞膜の電気的測定装置
１９ 制御部
２０ Ｄ／Ａ変換回路
２１ 電流／電圧変換回路
２２ Ａ／Ｄ変換回路
２３ 溶液駆動部
２４ 載置部
２６ 刺激信号付与部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法であって、測定電極と、参照電極と、複数の細胞とを準備し、前記測定電極と前記各細胞内とを電気的に接続し、かつ前記参照電極と前記各細胞膜表面とを電気的に接続し、この状態で、前記測定電極に電圧を印加して前記両電極間に流れる電流のゆらぎを測定する電気的測定方法。
【請求項２】
さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定する請求項１記載の電気的測定方法。
【請求項３】
前記複数の細胞の数が、２〜１００個の範囲である請求項１または２記載の電気的測定方法。
【請求項４】
測定対象である細胞膜の特性および状態が、前記細胞膜に存在するイオンチャネルの特性および状態である請求項１から３のいずれか一項に記載の電気的測定方法。
【請求項５】
前記イオンチャネルの特性および状態が、前記イオンチャネルの個数およびイオンチャネルの開閉状態の少なくとも一方である請求項４記載の電気的測定方法。
【請求項６】
前記細胞が、組織内に存在する細胞である請求項１から５のいずれか一項に記載の電気的測定方法。
【請求項７】
化学物質を前記細胞に投与する前後において、前記電流のゆらぎを測定する請求項１から６のいずれか一に記載の電気的測定方法。
【請求項８】
細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定装置であって、細胞を保持固定する孔を複数有する容器と、測定電極と、参照電極と、前記測定電極に電圧を印加する印加手段と、前記両電極間に流れる電流を検出する検出手段と、前記電流のゆらぎを測定する測定手段とを有し、前記測定電極と前記各細胞内とが電気的に接続可能であり、かつ前記参照電極と前記細胞膜表面とが電気的に接続可能であり、前記両電極が前記状態で電気的に接続された場合、前記印加手段により、前記測定電極に電圧が印加され、前記検出手段により、前記両電極間に流れる電流が検出され、前記測定手段により、前記電流のゆらぎが測定される電気的測定装置。
【請求項９】
さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定するためのパワースペクトル測定手段を有する請求項８記載の電気的測定装置。
【請求項１０】
前記容器には、電解質溶液が充填可能であり、この電解質溶液によって、前記測定電極と前記各細胞内との間および前記参照電極と前記各細胞膜表面との間が、電気的に接続される請求項８または９記載の電気的測定装置。
【請求項１１】
前記容器の孔の数が、２〜１００個の範囲である請求項８から９のいずれか一項に記載の電気的測定装置。
【請求項１２】
化学物資が細胞膜に与える影響を調べるために使用する請求項８から１１のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１】
細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定方法であって、測定電極と、参照電極と、複数の細胞とを準備し、前記測定電極と前記各細胞内とを電気的に接続し、かつ前記参照電極と前記各細胞膜表面とを電気的に接続し、この状態で、前記測定電極に電圧を印加して前記両電極間に流れる電流のゆらぎを測定する電気的測定方法。
【請求項２】
さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定する請求項１記載の電気的測定方法。
【請求項３】
前記複数の細胞の数が、２〜１００個の範囲である請求項１または２記載の電気的測定方法。
【請求項４】
測定対象である細胞膜の特性および状態が、前記細胞膜に存在するイオンチャネルの特性および状態である請求項１から３のいずれか一項に記載の電気的測定方法。
【請求項５】
前記イオンチャネルの特性および状態が、前記イオンチャネルの個数およびイオンチャネルの開閉状態の少なくとも一方である請求項４記載の電気的測定方法。
【請求項６】
前記細胞が、組織内に存在する細胞である請求項１から５のいずれか一項に記載の電気的測定方法。
【請求項７】
化学物質を前記細胞に投与する前後において、前記電流のゆらぎを測定する請求項１から６のいずれか一に記載の電気的測定方法。
【請求項８】
細胞膜の特性および状態の少なくとも一方の電気的測定装置であって、細胞を保持固定する孔を複数有する容器と、測定電極と、参照電極と、前記測定電極に電圧を印加する印加手段と、前記両電極間に流れる電流を検出する検出手段と、前記電流のゆらぎを測定する測定手段とを有し、前記測定電極と前記各細胞内とが電気的に接続可能であり、かつ前記参照電極と前記細胞膜表面とが電気的に接続可能であり、前記両電極が前記状態で電気的に接続された場合、前記印加手段により、前記測定電極に電圧が印加され、前記検出手段により、前記両電極間に流れる電流が検出され、前記測定手段により、前記電流のゆらぎが測定される電気的測定装置。
【請求項９】
さらに、前記電流のゆらぎのパワースペクトルを測定するためのパワースペクトル測定手段を有する請求項８記載の電気的測定装置。
【請求項１０】
前記容器には、電解質溶液が充填可能であり、この電解質溶液によって、前記測定電極と前記各細胞内との間および前記参照電極と前記各細胞膜表面との間が、電気的に接続される請求項８または９記載の電気的測定装置。
【請求項１１】
前記容器の孔の数が、２〜１００個の範囲である請求項８から９のいずれか一項に記載の電気的測定装置。
【請求項１２】
化学物資が細胞膜に与える影響を調べるために使用する請求項８から１１のいずれか一項に記載の測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１８４２０７（Ｐ２００６−１８４２０７Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３８０２４５（Ｐ２００４−３８０２４５）
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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