細胞計測および分離チップ
【課題】基板上に形成する流路を用いる細胞分離用の安価で試料毎に取替えが可能なチップを用いた細胞分析分離装置を提供すること。
【解決手段】細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、前記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、前記第４の流路に前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けるとともに、前記第１の流路から第４の流路を流下する緩衝液が共通の液面位置を有するリザーバから供給され、前記第１の流路と第４の流路の幅あるいは断面積が実質的に等しい構造を有する。
【解決手段】細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、前記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、前記第４の流路に前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けるとともに、前記第１の流路から第４の流路を流下する緩衝液が共通の液面位置を有するリザーバから供給され、前記第１の流路と第４の流路の幅あるいは断面積が実質的に等しい構造を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置（セルソーター）に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物における生体組織は種々細胞が役割を分担して全体として調和の取れた機能を維持している。あるいは、細胞の一部ががん化（ここでは腫瘍も含め、一括してがんと呼ぶことにする）すると、周辺領域と異なる新生物となるが、がん領域とそこから遠く離れた正常組織部分とはある境界を持って必ずしも区切れるものではなく、がん周辺領域も何らかの影響を受けている。したがって、臓器組織における機能を解析するには狭い領域に存在する少数の細胞を分離する必要がある。
【０００３】
あるいは医療分野において、正常組織中のがんが疑われる領域を調べるには、バイオプシーで分離した組織片からがんが疑われる部分を分離する必要がある。このような特定細胞の分離には、細胞を固定し、種々細胞染色を施し、目的の部分を切り出すのが一般的で、最近ではレーザーマイクロダイセクションと呼ばれるレーザーをあてた領域のみの細胞を分離する方法が考案されている。
【０００４】
あるいは、再生医療の分野では、組織の中から幹細胞を分離し、これを培養して分化誘導し目的の組織、ひいては臓器を再生しようとする試みがなされている。
【０００５】
細胞を識別したり分離したりしようとすると、何らかの指標に従い区別する必要がある。一般に細胞の区別には、
１）目視による形態学的な細胞分類：これはたとえば尿中に出現する異型細胞検査による膀胱がんや尿道のがんなどの検査や血中の異型細胞分類、組織中における細胞診によるがん検査などをあげることができる、
２）蛍光抗体法による細胞表面抗原（マーカー）染色による細胞分類：一般にＣＤマーカと呼ばれる細胞表面抗原を、それに特異的な蛍光標識抗体で染色するもので、セルソーターによる細胞分離やフローサイトメーターや組織染色によるがん検査などに用いられている。もちろんこれらは、医療面のみならず、細胞生理研究用や、工業的な細胞利用の上でも多用されている。
３）あるいは、幹細胞の分離に関しては、細胞内に取り込まれる形の蛍光色素をレポーターとして幹細胞を含む細胞を大まかに分離し、更にその後で実際に培養を行うことで目的の幹細胞を分離する例がある。これは、幹細胞の有効なマーカーがまだ確立されていないので、実際に培養し、分化誘導したもののみを利用することで、実質的に目的細胞を分離しているのである。
【０００６】
このように培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の比重の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。この技術については、例えば、セルソーターがある。セルソーターは、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。
【０００７】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、近年、マイクロ加工技術を用いて微細な流路を作成し、流路内の層流中を流れる細胞を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されている（非特許文献２：Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）。しかし、このマイクロ加工技術を用いて作成するセルソーターでは観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い処理方法が必要であった。
【０００８】
本発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を出願している（特開２００３−１０７０９９、特開２００４−８５３２３、WO２００４／１０１７３１）。これは実験室レベルでは十分に実用的なセルソーターであるが、汎用的に使用するには、液搬送法や回収法、試料調製について新たな技術開発が必要である。
【０００９】
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【非特許文献２】Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)
【特許文献１】特開２００３−１０７０９９号公報
【特許文献２】特開２００４−８５３２３号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、基板上に形成する流路を用いる細胞分離あるいは検出用に、確実に所定の細胞の検出及び分離を行うことのできる細胞分離チップおよび細胞分離技術を確立し、安価で試料毎に取替えが可能なチップを用いた細胞分析分離装置を提供することを目的とする。
【００１１】
基板上にマイクロ流路を作成して液を流すと、一般的にはその中を流れる液は層流になる。一見すると、流路の断面積方向には液流速分布が無い様に錯覚するが、実際にこのようなマイクロ流路中に細胞懸濁液を流すと、細胞が流路内の壁に衝突する現象が頻発する。壁に衝突した細胞は流れに逆らう抵抗を受けることになるため流速が低下し、後方を流れてくる細胞と接触したりする。セルソーターやフローサイトメーターにおいてこのような現象が起きると、細胞の分離検出が困難になる。一般的にこのような現象を防止するにはシースフロー技術が用いられる。これは高速に流れる液流を鞘としてそのコア部分に細胞懸濁液を流し込むことで細胞を一列に整列させる技術で、鞘となるシース流とコア流を合体させた後、空気中にジェット流として流し出すことで達成される。この従来法ではそもそも壁が無いので細胞が壁に衝突する現象の無い理想的な状態で細胞を分離することができる。
【００１２】
しかし、シースを用いたジェット流を安定に形成するのは非常に難しく、実用的な装置はきわめて高価であり、シース形成用のセルは試料ごとに取り替えることができない。大型の装置に限らずチップ上に形成したセルソーターに関しても、本願の発明者らが開示している方法以外の従来の技術では、もれなく試料液搬送とシース液搬送のために独立したポンプを用いている。これらのポンプはチップとは別に配置され、チップを交換するごとに繋ぎ換える必要がある。また、チップを交換に伴う試料送液速度とシース送液のバランス変動を調整し直す必要がある。このような厳密な制御を行うため、大掛かりな高安定なポンプが必要である。
【００１３】
セルソーターをチップ上に構築するわけであるから、送液部分もチップ状に形成し、光学系以外の機能はチップのみでクローズドで行うことで使い勝手を改善し、低価格を実現することが重要な課題である。クローズドにすることで、セルソーターチップをサンプルごとの使い切りにする新たな使い方が発生する。たとえば、幹細胞の分離や臨床検査には、他の検体組織由来細胞のコンタミネーション防止が必須であるが、セルソーターチップを一回のみの使い切りにすることでコンタミネーションを考慮する必要が無くなる。このように、セルソーターの主要部分をチップ化することで、装置の小型化、低コスト化、試料ごとのチップ交換によるクロスコンタミネーションの完全な防止などが可能になり、医療分野での特に再生医療分野で必須なクロスコンタミネーションの無い細胞分離システムを構築することが本発明の第１の目的である。
【００１４】
チップ状のセルソーターを実現する上で重要な技術的な事項に微細流路内を流れてくる細胞の分離機構がある。分離機構には色々のものが提案されている。たとえば、超音波、磁界、バルブによる流路切り替え、レーザーピンセット、高周波電界、直流電界で細胞を任意の方向に移動させる機構を挙げることができる。このうち、細胞にダメージを与えずに、再現よく、特別な装置を用いずにできるのは低電圧の直流電界を用いる方法である。ところが直流電界を用いて高速な細胞分離を行うにおいて、通常の金属電極を用いると緩衝液の電気分解が起き、安定して長時間の使用ができない問題がある。最も実用化に近い方法がWO２００４／１０１７３１に記載されている。
【００１５】
WO２００４／１０１７３１に示されているマイクロ加工技術を用いて作成した量産可能なセルソーターチップでは、電気分解の影響をある程度防ぐために、細胞を分離する機構としてゲル電極を用いて細胞が流れる流路内に直流電界をかけて、電気泳動的に細胞を振り分けている。ゲル電極としては電解質を含むアガロースゲルなどを用いている。細胞の流れる流路近傍は細孔を介したゲルがあるのみなので、気泡発生の影響を所定時間防止することができるが、不十分である。またゲルは、電解質緩衝液を含む状態で供給保存する必要があるために、乾燥に弱く長期保存に適さない問題がある。さらに長期保存を行うために凍結保存しようとすると、ゲルが凍害を受けて破壊されるため、凍結保存はできない。
【００１６】
したがって、本発明は、電界を掛けている最中の気泡の発生を防止し、保存時に乾燥や凍結に耐性のあるゲル電極を提供し、真の意味での検体ごとの使いきり型セルソーターチップを提供することを第２の目的としている。
【００１７】
基板上に形成する流路を用いて細胞分離を行おうとすると、流路中の特定領域に細胞認識を行う部位を設け、何らかの手段で細胞を認識するアルゴリズムが必要となる。また、細胞分離を行うセルソーターとして使用しようとすると、細胞検出部の下流に分離部を設ける必要がある。一般的に、細胞検出には以下の３つの方法が存在する。
１）レーザーなどを流路上の検出部に照射し、細胞が横切るときの散乱光や細胞を蛍光染色できる場合はその蛍光を検出する、
２）検出部に電極を設け、細胞が電極を横切るときのインピーダンスやコンダクタンスの変化を検出する、
３）ＣＣＤカメラなどを用い、細胞を像として検出する。
【００１８】
ここで、１）の方法では細胞認識は実質的に一点で行われ、細胞が連続して高速に流れてきたときでも高速な処理が可能であるので、細胞を液滴に封じ込めることで一定速度で検出部と分離部の間を移動させる技術を用いた大型のセルソーターに使用されている。２）の方法はやはり高速な処理が可能であるが、検出後の細胞の移動速度が測定できないことと、分取機構と組み合わせるのが難しいため、一般的には細胞分類に用いるフローサイトメーターに採用されている。３）の方法は、一見、簡便のようであるが、流路中を常に移動する複数の細胞を取り扱う必要があるので、セルソーターでは画像処理の負荷が大きくなるため一般的には用いられていない。
【００１９】
しかし、基板上の狭い範囲に組み込んだ流路において、同様の細胞認識とそれに続く細胞分離を行おうとすると、種々問題が新たに発生する。まず、流路中を流れる細胞の移動速度はすべての細胞で同じではなく、細胞の形状や大きさ、流路の中心を流れるか壁近傍を流れるかなどの要因でまちまちとなる。このため、特に細胞を認識した後にその下流で細胞を分離するまでの時間にばらつきが発生する。次に、同じく細胞の移動速度がまちまちであるため、ある細胞が他の細胞を流路内で追い抜くといった現象も見られる。このため、細胞を１点で観察する上記１）や２）の方法では各細胞を確実に分離する必要がある場合の解決すべき問題となる。そこで本発明の第３の目的は、ＣＣＤカメラなどを用い、細胞を像として検出することで流路中を連続して高速で流れてくる細胞を識別して、必要な細胞をより分けるためのアルゴリズムを提供することにある。
【００２０】
従来のセルソーターでも、特定細胞領域を分離し、含まれるゲノムやトランスクリプトームの解析、あるいはイムノケミストリーを用いた検査を行う上では十分である。しかし、多くの方法では、染色や固定などの操作により、回収した細胞はすでにその生命機能を停止している。このため、回収した細胞の動的機能の解析や、さらに、これを培養し利用するといったことができない問題がある。特に今後実用化が期待される再生医療や、培養組織細胞片を用いる薬物動態検査などの材料としての細胞を得るには、臓器組織を細胞レベルで解剖し回収する技術の確立が重要である。
【００２１】
本発明の第４の目的として、臓器組織をその表面から順次細胞を遊離させて、細胞層ごとに大まかに細胞を分離する前処理部と、細胞分離領域を一体化したチップ状デバイスとそれを用いる細胞分離法を提供する。
【００２２】
このように、本発明では、チップ上にセルソーターないしフローサイトメーターを構築する上での具体的アーキテクチャーとして、特に、細胞用流路の形状と細胞懸濁液搬送部分の構造、長期保存に耐えて流通経路にのりうる電極部分の構造、分離アルゴリズム、試料としての組織断片や細胞塊からの細胞計測および分離チップを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明で想定している細胞は、小さいものではバクテリア、大きいものでは動物細胞でがん細胞のようなものである。したがって、細胞サイズとしては０．５μｍから３０μｍ程度の範囲となる。細胞分離を基板上に組み込んだ流路を用いて行おうとすると、まず問題になるのが流路幅（断面形状）である。また、流路は基板の厚み方向で１０〜１００μｍ内外のスペースに実質２次元平面状に作成することとなる。細胞の大きさからしてバクテリア用では５〜１０μｍ、動物細胞用では１０から５０μｍが適当なサイズとなる。前記したように、まず細胞が壁に衝突するのを防ぐ必要がある。細胞懸濁液が流れる流路の両側面から別の液を側流として流し込み、細胞が壁に衝突しないようにする。このような液の合流方法を検討した結果、液の合流前の細胞懸濁液を流す流路の幅（実質的に断面積）と合流後の流路の幅がほぼ等しく、前記両側から合流する流路の流路長が等しいときに最も効果が得られることがわかった。合流後の流路幅が広いと細胞を壁から遠ざける効果が小さくなり、合流後の流路幅が狭いと合流後に細胞の流れる速度が速くなりすぎ、検出しにくくなるし、流れてくる細胞そのものの頻度が極端に少なくなる。また、２本の側流の長さが異なると流路抵抗が変わるため、細胞を流れる中央の流路が片方によってしまう問題が生じる。
【００２４】
チップ上に、セルソーターなりフローサイトメーターを構築しようとすると、細胞懸濁液や上記側流の流速制御が非常に難しい問題として浮上する。大規模な無脈流ポンプで、しかも、数十ピコリットル／分の流速を安定して作れるものを使用すれば解決するが、使い切り形のチップを前提とすると、チップとポンプのコネクションを毎回行わなければならず、再現性と使い勝手の面で問題である。そこで、チップ上のポンプを組み込む研究がなされているが、本発明では、一切ポンプを使用せずに、液の自由落下で解決する。すなわち流路の入り口にリザーバを儲け、リザーバ内の液面より流路出口の液面を低くすることで無脈流での微量液送を実現している。
【００２５】
このような液面高さの違いを利用するシステムでは、複数の液を送液するときの液流速制御が困難である。液面の微妙な違いで細胞懸濁液と側流の流速比が変動してしまう問題が発生する。本発明では、細胞懸濁液を入れるリザーバと側流を形成する緩衝液を入れるリザーバを一体化することで両者の液面を厳密に一致させて解決している。すなわち、共通の液面からの高低差をドライビングフォースとして液送を行うことで細胞懸濁液と側流の流速比の変動をなくしている。このような構造のリザーバとして、一つのリザーバに仕切りがあり、一方の底に試料用流路が結合し、他方に側流用の流路が接合している構造を考案する。実質サイホンの原理で両リザーバの液面をそろえていると考えることができる。仕切りより高いところでは液がつながっていることになるが、細胞は緩衝液より比重が高いので、仕切りを乗り越えて側流のほうへ流れ込むことは無い。
【００２６】
本発明の検出部は、側流の合流した流路部分にある。合流後の流路部分をＣＣＤカメラで観測する部位を設け、必要に応じてその下流に細胞分離領域を設置する構造としている。必要に応じて、というのはセルソーターとしてのチップということで、フローサイトメーターとしては検出部の下流に直接ドレインを設ける。これにより、細胞が壁に衝突することなく、流路の中心部によった経路をほぼ一定の速度で流れるようになる。
【００２７】
セルソーターとして用いるには検出部の下流に細胞分離領域を設ける。分離部の入り口で細胞を移動させるための流路として細胞分離領域において緩衝液（あるいは培地）のみを流す流路が合流し、下流側で分離部から分岐している。分離部で細胞を分離するわけであるが、細胞分離領域に外部から細胞に外力を加えて細胞を移動させる手段として電極を設置し、細胞を分離して排出することのできる流路を設ける。電極に電圧をかけてイオンを流すことにより細胞の流路内での姿勢制御（流路変更）を行う時は、イオンの流れる方向と、流路内で液が流れる方向の合成ベクトルの方向に細胞が移動する。細胞はマイナスにチャージしているのでプラスの電極に向かって動く。よって合体後の流路の流れる方向に対してマイナス極を下流側、プラス極を上流側にずらした形で電極を設置することで移動のための合成ベクトルを制御し、少ない電流で細胞の流路変更を可能としている。流路変更する細胞と流路変更しない細胞は各々別の流路に流れ込み分離される。ここで試料が流れる方の流路は、もともとの試料用の流路に側流が合流した流路となっている。これに対して合流する緩衝液（あるいは培地）のみを流す流路では上流側で側流の合流は無い。試料流路と緩衝液のみの流路および合流後の流路は幅が等しい。合流後の試料流路は側流が乗っている分だけ、流速が早く、このため分離部においては若干緩衝液流路側からの流れの部分にはみ出す構造となっている。このことも、細胞を姿勢制御し、試料流路側から緩衝液流路側に乗り換えやすくする重要な効果である。電流を流さないときは、細胞は試料流路側の中心を流れているので、そのまま乗換えなしに試料液が流れ出て行く流路側に流れていく。
【００２８】
分離部に設置する電極は、液絡（空間と空間を満たす液を含む細管で、ここではゲルで満たされている）を介してゲルを充填した空間に金属電極が接する構造となっている。これをゲル電極と呼ぶことにする。マイナス電極側は生成するヒドロキシイオンを吸収するために低ｐＨの緩衝液、プラス電極側は生成する水素イオンを吸収するために高いｐＨの緩衝液を含むゲルマトリックスでできている。ゲルマトリックスとしてはアガロースやポリアクリルアミドのような生化学で一般的に使用されている網目構造をとるゲルを利用できる。これにより、ゲル電極部の電気分解によるガス発生を抑え安定に細胞分析分離を可能としている。もちろん、金属電極が細胞に直接触れることが無いので、電極表面で細胞を痛めないで済む。細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことを可能にしている。
【００２９】
ゲル電極は上記のように特開２００３−１０７０９９記載の金属電極に比べてメリットが大きいが、ユーザーにチップを供給する上で問題が残る。すなわち、ゲル電極は湿式の電極のため、貯蔵安定性が悪く、実質的にユーザーが使用直前にゲルをチップに充填してゲル電極を作成する必要がある。本発明では、トレハロースなどの非還元性二糖やグリセロール、エチレングリコールなどを加えることで一定期間の室温保存を可能としている。さらに、通常、ゲルは凍結するとゲル構造が壊れるため、凍結による長期保存が困難であるが、前記トレハロースなどを加えて急速冷凍することで、ゲル構造を壊す氷晶の出現を抑えることができ、結果的にゲル電極の冷凍保存による長期保存を可能としている。
【００３０】
更に、本発明の細胞分離装置は、細胞分離領域に導入される試料を含む流体が導入される流路の上流部で不純物を捕獲して流路の目詰まりを防ぐ手段を有することができる。
【００３１】
即ち、本発明は、細胞分離用空間、それに細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、それから流体を排出するための少なくとも２つの流路及び該細胞分離領域に外部から細胞に外力を加える手段から成る細胞分離装置であって、これらの流路が、細胞分離領域に外部から外力を加えた場合と加えない場合に、細胞が該細胞分離用空間からそれぞれ異なる流路へ排出されるよう配置されたことを特徴とする細胞分離装置である。
【００３２】
この細胞分離装置においては、細胞分離領域に外部から細胞に外力を加えるため、電極等が直接細胞を含む緩衝液に接することがなく、さらに、低い電圧で電流を流して(すなわちイオンを流して)細胞を振り分けるため、細胞に対するダメージを少なくしている。
【００３３】
細胞認識と分離のアルゴリズムに関しては次のような特徴がある。
【００３４】
一点での細胞認識が上記理由により不可能なため、測定範囲を面に広げ画像認識で細胞の識別を行い、追跡することでより確実な細胞分離を行う。このとき重要なのは、画像の取り込み速度である。一般の３０フレーム／秒のビデオレートのカメラでは、画像での細胞取りこぼしが生じる。最低２００フレーム／秒の取り込みレートがあれば、流路中をかなりの速度で流れる細胞を認識できる。
【００３５】
次に画像処理法であるが、取り込みレートが早いということはあまり複雑な画像処理を行うことはできない。まず、細胞認識であるが、前記したとおり、細胞の移動速度や細胞によりまちまちで、場合によっては細胞の追い越しがある。このため、各細胞が最初に画像フレームに現れたときに細胞にナンバリングを施し、以下、画像フレームから消えるまで同一ナンバーで管理を行うこととする。すなわち、連続する複数枚のフレームで細胞像が移動する状況をナンバーで管理する。各フレーム内での細胞は上流側にあったものから順に下流側に移行し、画像中に認識されるナンバリングされた特定細胞の移動速度はある範囲に収まるとの条件でフレーム間の細胞をリンクさせる。このようにすることで、たとえ、細胞の追い抜きがあったとしても各細胞を確実に追跡できるようにする。
【００３６】
これで、細胞の認識が可能となるが、細胞のナンバリングには、まず細胞像を２値化し、その重心を求める。２値化した細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径を求め、これらのパラメーターを用いて各細胞をナンバリングする。各細胞像をこの時点で画像として自動保存することも使用者にとって益があるので行えるようにする。
【００３７】
つぎに、細胞分離に使用する場合であるが、ナンバリングした細胞のうち、特定の細胞のみを分離しなくてはならない。分離の指標は上記した輝度重心、面積、周囲長、長径、短径などの情報でもよいし、検出部と画像処理部で蛍光検出を行い情報を得てもよい。いずれにせよ、検出部で得た細胞をナンバリングに従い分離する。具体的には、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して検出部から分離部までの距離を（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとすることでちょうど目的のナンバーの細胞が電極間に来た時に細胞を電気的に振り分けて分離する。
【００３８】
一般に、動物組織の細胞では、細胞間に細胞外マトリックスが存在し、細胞同士がばらばらにならないようになっている。細胞外マトリックスは周囲の細胞が分泌したタンパク質と多糖類が集合し、それらを分泌する細胞表面と結合し網状構造を形成したものである。細胞外マトリックスの実態は、プロテオグルカンやコラーゲンエラスチン、ファイブロネクチンやラミニンからなる。したがって、組織を形成する個々の細胞を得るには一般的にトリプシンなどのプロテアーゼ処理を行う。一般的には組織をなるべく小さな断片に切断した後にトリプシン処理を短時間行い、細胞にあまりダメージを与えないようにして細胞単体を得る。
【００３９】
本発明では、このプロテアーゼ処理を逆手に取り、プロテアーゼで組織表面から順次細胞を遊離させることで組織の深さ方向に分布を持つ一連の細胞群を得る機能と構造を含めたチップも提供する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明により、安定した細胞分離が可能な使いきり型の細胞分離チップが実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（実施例１）
図１は、本発明の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。セルソーター１００は基板１０１により構成されている。基板１０１の下面に流路を、上面にこの流路に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液の供給口とする。また、十分な緩衝液の供給と各流路での流量の調整のためにリザーバを設ける。流路の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することができる。チップ基板１０１全体のサイズは２０×３０×１ｍｍ（ｔ）である。チップ基板１０１の下面に刻まれた溝や貫通穴を流路やウェルの形状とするために、溝が刻まれた下面側に０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着してある。開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いて、０．１ｍｍのラミネートフィルムを通して流路内を流れる細胞を観察できる。もちろんこれより低倍率のレンズでは問題なく観察することができる。チップ基板１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’，２０２および２０２’が設けられるとともに、これらを包括するリザーバ２０３が設けられる。したがって、リザーバ２０３に十分な緩衝液を供給すると穴２０１，２０１’，２０２および２０２’は緩衝液でつながる。これにより、穴２０１および２０１’に連なる流路２０４と流路２０４’には同じ液面高さの緩衝液が供給される。したがって、両流路の流路幅（流路高さを等しいとすれば）、あるいは、断面積、さらに両流路の流路長を実質等しくすれば、両流路の流量を実質同量にすることができる。同様に、穴２０２，２０２’に連なる流路２０５，２０５’には同じ液面高さの緩衝液が供給され、流路２０５，２０５’を流れる緩衝液の流量を流路２０４に流れる流量と所定の比にそろえることができる。試料を含む緩衝液を導入する穴２０１の周辺には細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐための壁２５０が設けられている。壁２５０の高さは、リザーバ２０３の壁よりも低く、緩衝液は壁２５０より高い位置まで満たされている。
【００４２】
穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液は、マイクロ流路２０４（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞検出領域２２１および細胞分離領域２２２まで導入される。ここで、マイクロ流路２０４上には、マイクロ流路の目詰まりを防ぐために、チップ中に直接微細構造として組み込まれたフィルター２３０が配置されている。他方、穴２０２，２０２’に導入された細胞を含まない緩衝液は流路２０５，２０５’（幅１２μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液と合流する。２４０は合流後のマイクロ流路であり、細胞検出領域２２１となる。さらに、マイクロ流路２４０は細胞分離領域２２２まで導入される。
【００４３】
一方、穴２０１’に導入された細胞を含まない緩衝液は、マイクロ流路２０４’（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞分離領域２２２に導入され、マイクロ流路２４０と合流する。合流後の流路幅については、後述する。また、この合流した流路は、細胞分離領域２２２の出口で、マイクロ流路２１８（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）および２１９（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）に分流する。
【００４４】
２０６，２０６’および２０７，２０７’は電解質を含むゲルを導入する穴であり、それぞれ、穴２０６および２０７に導入されたゲルは基板１０１の下面のマイクロ構造２０８，２０９（幅２００μｍ×高さ１５μｍの折れ曲がった溝）を通して穴２０６’および２０７’に送り込まれる。したがって、マイクロ構造２０８，２０９は電解質を含むゲルで満たされている。マイクロ構造２０８，２０９の屈曲部はマイクロ流路２０４，２０４’との間で２０μｍ程度の長さの液絡構造の連結部２４１，２４２となっていて、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが、直接、接触できる構造とされる。ゲルと緩衝液が接触する面積は、１５μｍ（流路に沿った長さ）×１５μｍ（高さ）である。ゲルを導入する穴２０６および２０７には、黒丸で示す電極が挿入され、これらの電極は、配線１０６，１０７およびスイッチ２１６を通して電源２１５に接続される。スイッチ２１６は、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧をかける時のみＯＮとされる。
【００４５】
細胞分離領域２２２でマイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが接触する連結部２４１と２４２は、図に示すように、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７でのゲルとの接触位置が、連結部２４１のほうが流路の上流に位置する構造となっている。穴２０６の電極にプラス、穴２０７の電極にマイナスの電圧をかけたときに、マイクロ流路２４０を流れてくる細胞を流路２１１’に効率よく移動することができる。なぜなら電流を流したときにマイナスにチャージしている細胞は電気泳動的な力が働き、この力と流路内を流れる緩衝液から受けるベクトルと電気泳動的力のベクトルの合成ベクトルになるからである。これにより、連結部２４１と２４２を流路の流れに対して同位置（流れの線の対象位置）に作成した場合に比べ、効率のよい電界利用が可能となり、より低電圧で安定した細胞のマイクロ流路２１８あるいはマイクロ流路２１９への移動が可能となる。
【００４６】
マイクロ流路２１８，２１９の下流部には、細胞分離領域２２２で振り分けられた細胞の回収穴２１１，２１２が開けられている。それぞれの穴２１１，２１２には、回収された細胞を含む緩衝液の拡散を防ぐための壁２１１’，２１２’が設けられるとともに、さらに、これらを包括するリザーバ２１３が設けられる。リザーバ２１３は、細胞を含む緩衝液の拡散を防ぐための壁２１１’，２１２’の高さよりも高く、分離操作前に緩衝液は壁２１１’，２１２’より高い位置まで満たされているが、この高さは、リザーバ２０３に満たされている緩衝液の位置よりは低いものとされる。
【００４７】
リザーバ２０３の緩衝液の液位はリザーバ２１３のそれよりも高いから、この落差が流路を流れる緩衝液の移動の駆動力となるとともに、脈動のない安定した流れを作り出す。リザーバ２１３の緩衝液の貯蔵量を十分大きなものとしておけば、穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液を、全て、流路２０４に流入させることができる。
【００４８】
図２は、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流し、細胞検出領域２２１となるとともに、さらに、マイクロ流路２４０を流下し、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ流路２４７を流下して細胞分離領域２２２となる状況を説明する図である。
【００４９】
ここで、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０５，２０５’を流下する細胞を含まない緩衝液を、マイクロ流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液と合流させる理由を説明する。細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４には、細胞を含まない緩衝液の流れる流路２０５，２０５’が細胞検出領域２２１の上流部で合流するが、それぞれの流路の最上流に設けられた穴２０１および２０２，２０２’は、共通の液位の緩衝液のリザーバ２０３に開口している。したがって、それぞれの流路を流下する緩衝液の流量は、流路の高さが同じであるから、流路幅に比例したものとなる。これらの緩衝液が合流するが、合流後の流路２４０の幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の幅と実質的に等しい幅を持つものとする。実質的に等しいとは、加工精度を考慮して等しいということで、厳密に等しいというわけではない。これにより、流路２０４を流下する緩衝液は流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって、一定の比率で中央部に押しやられるので、流路２０４では側壁に衝突しながら流れてくる細胞が、合流後の流路２４０中では側壁に衝突しなくなる。
【００５０】
細胞分離領域２２２におけるマイクロ流路２４７は、流路２４０と流路２０４’をそれぞれ流下する緩衝液が、それぞれの流れの層を維持しながら、同じ幅の流路を持っているかのように流下している。細胞検出領域２２１の流路２０４で流下する細胞を検出して、細胞分離領域２２２で、ゲルが流下する緩衝液と接触する連結部２４１と２４２により電界を作用させて分離するのである。
【００５１】
図３は、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０４を流下する緩衝液が流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって中央部に押しやられた結果の合流後の流路２４０の細胞分布を説明する図である。図において２５５は流路の側壁である。すなわち、幅２０μｍの流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液の流れが、幅１２μｍの流路２０５，２０５’を流下する緩衝液の流れによって、幅２０μｍの流路２４０の中央部に押しやられる状況を、横軸に流路２０４の位置、縦軸に細胞の出現頻度で示す図である。曲線３０１は、流路２０５，２０５’のそれぞれを流下する緩衝液が、流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液細胞のほぼ半分、すなわち、流路２０５，２０５’の流路幅が流路２０４のほぼ半分である場合に、細胞が中央部のほぼ１０μｍの幅に分布することを示している。曲線３０２は流路２０５，２０５’の流路幅がより小さい場合の細胞分布、曲線３０３は流路２０５，２０５’を設けない場合の細胞分布をそれぞれ示す。曲線３０１から明らかなように、流路２０５，２０５’の流路幅を適切に設定することで、実質的に細胞を、流路壁から離して流すことができ、細胞が壁に衝突することを防止できる。
【００５２】
図３では、説明しなかったが、細胞分離領域２２２では流路２４０と流路２０４’とが合流する。したがって、図３に示す特性が、やや流路２０４’の流入する側に広がる傾向を示すが、流路２４０と流路２０４’を流下する緩衝液はそれぞれの流れの層を実質的に維持するので、それほど大きな変化はない。
【００５３】
ここで、図１では、流路２０４、２０４’、２０５および２０５’は、それぞれの全長で幅は等しいものとしたが、流路の抵抗を下げたいときは、リザーバ２０３に近い部分は幅を広げてよい。また、細胞分布を適切にするために流路幅を所定の幅にする長さは、例えば、１００μｍ程度有ればよいので、流路の抵抗を考慮して幅の広い範囲を長くしてよい。たとえば、細胞を含まない緩衝液の流れる側流を形成する流路２０５の流路幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の流路幅に比べ、広くし、且つ、所定の流路幅にする長さも短くすると、側流の流路２０５の流路抵抗は流路２０４に比べ小さくなる。その結果、合流後の流路２４０の、流路２０４からの液流幅を絞り込む働きが得られる。すなわち、図３の細胞分布曲線が、より先鋭なものとなる。
【００５４】
図４（Ａ）、（Ｂ）は流路の幅を広くすることに伴う問題と、その解決案の例を示す断面図である。図において、１０１は基板を示し、２６０は基板に形成された溝、４１０は溝２６０を覆うラミネートフィルムである。２０５は流路であり、溝２６０とこれを覆うラミネートフィルム４１０により形成される。図４（Ａ）に示すように、流路の幅を広くすると、流路２０５の幅の広い部分で、基板１０１にラミネートフィルムを圧着するときにラミネートフィルム４１０が溝２６０に落ち込んで、流路２０５をふさいでしまうことが起こる。これに対して、図４（Ｂ）では、溝２６０の幅の広い部分に梁４００を形成したものである。梁４００を設けることにより、ラミネートフィルムが溝２６０に落ち込んで流路２０５をふさぐことを防止できる。
【００５５】
図５は、図４で説明したリザーバ２０３と開口２０１，２０１’および流路２０４，２０４’の部分をより詳細に説明するために、図１のＡ−Ａ位置において、矢印方向に見た断面図である。チップ基板１０１の下面にはマイクロ流路２０４，２０４’に対応する溝が形成されていて、ラミネートフィルム４１０により覆われ、マイクロ流路２０４，２０４’が形成されている。マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１がマイクロ流路２０４の最上流端に開けられ、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’がマイクロ流路２０４’の最上流端に開けられている。穴２０１を取り囲むように、穴２０１に注入された細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐため壁またはリザーバ２５０が設けられている。穴２０１’および穴２０１に注入された細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐため壁またはリザーバ２５０、さらに、図５には表れない穴２０２，２０２’もリザーバ２０３内に設置される。リザーバ２０３内に緩衝液２００が満たされていて、すべての穴に緩衝液２００が供給されるから、マイクロ流路２０４，２０４’を流れる緩衝液の流量を、実質、同量にすることができる。また、マイクロ流路２０５、２０５’を流れる緩衝液の流量を、実質、同量にすることができる。さらに、マイクロ流路２０４とマイクロ流路２０５を流れる緩衝液の流量を所定比に安定に維持することができる。なお、穴２０１をすり鉢上にしたのは、試料細胞が流路２０４に確実に流入するようにするためである。また、壁２５０は図１に示すようにリザーバ２０３の中に配置する背の低い小型のリザーバ様のものでもよいし、単に仕切り板のような構造でもよい。なお、２３１はメンブレンフイルタであり、穴２０１の上面に設けられ、試料に含まれる塵を除く。壁２５０を設けることにより、細胞の分散を防げるので、穴２０１に直接細胞を含む試料緩衝液を注入しなくても良い。
【００５６】
各流路の最上流端に共通のリザーバを設ける構造は本発明の中核の一つをなすもので、共通の液面を有する構造にすることで複数の流路に同一の圧力で緩衝液を送ることができる構造で、基板上に組み込むことのできる最も簡単な構造の送液系である。さらに、各流路の送液物を区別するために、液面より背の低い仕切り板で仕切ることで種々緩衝液を異なる流路に同じ圧力で流すことができる。各仕切り板で仕切られた緩衝液には共通の液面を形成する緩衝液に比べて比重の高いものを用いれば、基本的にお互いが混ざり合うことは無い。また、細胞の場合はそれ自体が比重が高く、容器底面に沈むので基本的には問題ない。走化性の細胞では仕切り板を乗り越えることができない高さにすればよい。たとえば神経細胞などでは、数十μｍもあれば壁（仕切り板）を乗り越えることができないし、大腸菌のような細胞では、壁２５０の上に、緩衝液は自由に通り抜けることができるが細胞は通過できないようなスポンジ状の膜を設けることで細胞が他の流路に入り込むことを防止するのが良い。
【００５７】
（実施例２）
ゲル電極について具体的に説明する。ゲル電極部は、図１に示す、穴２０６，２０６’および２０７，２０７’、穴２０６と２０６’を結ぶマイクロ構造２０８、穴２０７，２０７’を結ぶマイクロ構造２０９と細胞分離領域２２２における液絡構造の連結部２４１，２４２のことを言う。射出成型でチップを作成した段階では、ゲル電極部にはゲルは含まれていない。ここでは電解質を含むアガロースゲルを電解液として使用するケースについて説明する。ゲルの組成はマイナス極側２０９、２４２に作成するのが０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２９６Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液、プラス電極側の２０８、２４１に作成するのが０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２８２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の組成を含む１％アガロースである。ｐＨが異なるのは電流を流したときに電気分解により気泡が発生する現象を防ぐためである。プラス極側で発生する水素イオンは水素分子になる前に高いｐＨの緩衝液で中和され、マイナス極側で発生するヒドロキシイオンは低いｐＨの緩衝液で中和され酸素分子の生成を阻害する。
【００５８】
なお、前記ゲル電極は糖類を含むゲル状物質からなるものとするのが良い。この場合、前記糖類は３％ないし５０％の非還元性二糖、１％ないし５０％のトレハロース、５％ないし３０％の濃度のグリセロール、５％ないし４０％の濃度のエチレングリコール、あるいは、５％ないし３０％の濃度のジメチルスルホキシドを含むものとするのが良い。
【００５９】
次に、射出成型でチップを作成し、穴２０６および２０７からゲルを注入して、ゲル電極付セルソーターチップを完成した後チップを使用しないで放置した状態を考える。ゲルは穴２０６と２０６’，２０７と２０７’の開放部、および、細胞分離領域２２２における流路と液絡構造の連結部２４１，２４２の部分で大気と接しているため、ここから乾燥が始まる。このため作成したゲル電極付セルソーターチップを保存するには下記のような工夫が必要である。まず、穴２０６と２０６’，２０７と２０７’の開放部からの乾燥防止は使用直前まで開口部にシールを貼ることで防げる。細胞分離領域２２２における流路と液絡構造の連結部２４１，２４２の部分では、ゲルが乾かないように水を含むシートとともに密閉容器中で保存することで、４℃で３ヶ月程度の保存が容易にできる。密閉容器としては空気部分をなるべく少なくするためにラミネートバックが適している。
【００６０】
さらに、乾燥を防ぎ長期保存を可能とするためにゲルには保湿剤を添加する。保湿剤としてはたとえば１％〜１０％程度のトレハロースやシュークロースなどの２糖類あるいはオリゴ糖、５％〜１０％程度のグリセリンを添加することで乾燥防止に効果がある。
【００６１】
さらに長期の保存にはゲル電極付セルソーターチップをラミネートバックに入れたまま凍結保存するのがよい。このときに問題となるのが、凍結時と融解時に氷晶ができてゲル構造を破壊する現象である。セルソーターチップのように微小な領域に作成するゲル電極で氷晶ができると、融解後にその部分が空洞となる。空洞ができると、電極に電界を印加したときに、空洞に細胞が入り込んだり、あるいは、入り込んだ細胞が不必要なときにセルソーターの流路に流れ出たりする問題が生じる。
【００６２】
これを防ぐには、ゲル電極部のゲルに氷の結晶成長を抑える物質を添加し、セルソーターチップを凍結状態で長期保存を可能にするのが本発明の最も重要な点である。結晶成長を抑える物質としては上記保湿材料と同様のものが利用できる。ゲル作成時にトレハロースやショ糖などの２糖類やオリゴ糖などを混ぜ込むのが最も有効である。このうちトレハロースは一般的な動物細胞に対してのファンクションは小さくきわめて有効である。濃度は１％でよい。上限濃度は５０％程度である。ショ糖でも効果が高いが、動物細胞に対してはバイオファンクションであることが考えられ、目的によっては不適切なケースがある。糖鎖の水酸基の一部を硫酸基に置き換えることで、凍結防止能を保持して生化学的な影響を低減できるので、これら２糖類の水酸基に硫酸基を導入して利用するとよい。このほかにグリセリンやエチレングリコールといった糖も効力がある。あるいはジメチルスルホキシドでも効果があるが、エチレングリコールやジメチルスルホキシドは細胞毒性が問題となるケースがあることを考慮しなければならないが、一般的にはセルソーティング流路に溶出するジメチルスルホキシドなどは微量なので無視できる。
【００６３】
具体的な実施例を示す。下記組成のカソード電解液とアノード電解液を電子レンジで過熱融解し緩衝液化させる。別途基板１０１を６０℃に加熱してあるホットプレートに乗せて加温する。緩衝液状態になっているカソード電解液とアノード電解液をシリンジで穴２０６、２０７に注入し、穴２０６’と２０７’から吸引し、マイクロ構造２０８、２０９と連結部２４１と２４２を満たす。連結部２４１と２４２には毛管現象で融解したゲルが入り込む。室温で１０分間放置することで、マイクロ構造２０８、２０９と連結部２２２と２４２内の緩衝液がゲル化する。流路２４７は連結部２４１と２４２に比べ断面積が広いので、ゲル緩衝液が入り込むことは無い。
【００６４】
改善されたゲル組成を示す。
マイナス電極液：１％トレハロース、０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２９６Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１％アガロース、
プラス電極液：１％トレハロース、０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２８２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１％アガロース、
上記のように調製したゲル電極付セルソーターチップの表面を粘着性テープでシールする。多孔質プラスチックタオルであるプラセームに水を浸し、しぼった２ｃｍ角の断片をゲル電極付セルソーターチップとともに３０ｍｍ×４０ｍｍのプラスチックバックにいれシーラーを用いてバックの口をふさぐ。
【００６５】
この状態で４℃あるいは−２０℃で保存する。
【００６６】
作成直後の凍結前のチップ、１ヵ月後、３ヶ月後、６ヵ月後の４℃および−２０℃保存のチップの電極部の状態を、顕微鏡を用いて観察する。また、リザーバ２０３に培養液を添加し、流路２０４と２０５，２０５’に培養液を満たし、穴２０１に赤血球を添加し、ゲル電極に電解をかけたり、切ったりして細胞が流路２１８，２１９に振り分けられることを確認する。まず、作成直後のチップではマイクロ構造２０８、２０９と連結部２４１と２４２にゲルが満たされており、ひび割れたり、乾いたりの外的損傷は無い。ゲル電極に電界をかけると細胞分離領域２２２の流路を流れている赤血球が流路２１９に移り、穴２１２を介してリザーバ２１２’に貯まる。電界をかけなければリザーバ２１１’に貯まる。凍結したものは６ヵ月後においても作成直後と同様にゲル電極に電界をかけることでリザーバ２１２に、電界を切ることでリザーバ２１１に細胞を集めることができる。４℃保存に関しては顕微鏡観察すると３ヶ月目に連結部１０８と１０９にゲルの後退が見られるが、実際に細胞を流してみると、作成直後と同様に分離することができる。
【００６７】
図６は、ゲル電極部分が別の構造とされたセルソーターチップを平面図の形で示す図である。ここでは、図１の配線１０６および１０７と電解質を含むゲルを導入する穴に挿入した電極を、基板１０１の下面に貼り付けるラミネートフィルム４１０に蒸着した導電膜により実現するものである。ラミネートフィルム４１０は、基板１０１の下面に貼り付けられるものであるから、導電膜に形成した電極等は、チップの平面図では見えないが、ここでは、他の構成要素との関係が分かりやすいように、重ねて表示した。
【００６８】
図６の構造では、図１に示したマイクロ構造２０８，２０９に代えて、五角形状のマイクロ構造２０８，２０９とした。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９には、基板１０１に設けられた開口２０６，２０７が連通していて、この開口を通してゲルが注入される。２０６’，２０７’はマイクロ構造２０８，２０９に連通している空気抜きの開口である。ゲル注入時に、空気抜きの開口２０６’，２０７’からゲルが溢れる状態になれば、ゲル注入は終わりとすれば良い。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９の突出部には、連結部２４１，２４２が形成され、流路２４７を流れる緩衝液とゲルが接触できるようにされる。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９に注入されたゲルと配線１０６および１０７に代える蒸着された導電膜１０６および１０７との十分な電気的接続を得るために、五角形状のマイクロ構造２０８，２０９に注入されたゲルが、適当な広さで、導電膜１０６および１０７の端部と接触する位置に、導電膜１０６および１０７は蒸着される。導電膜１０６および１０７の他の端部は、電源２１５に接続されるための端子を形成する。
【００６９】
ここで、ラミネートフィルム４１０は、基板１０１と貼り合わされるから、導電膜１０６および１０７の他の端部の端子は基板に隠されてしまう。図示しなかったが、この端子と接続され、基板１０１の表面で電源２１５と接続可能にするための構造が設けられる。
【００７０】
（実施例３）
図１のセルソーターチップ１００を用いて画像認識による細胞認識と分離のアルゴリズムを説明する。図１を参照しながら説明したように、細胞懸濁液は穴２０１に注入される。穴２０１の周辺には細胞懸濁液の拡散を防ぐための壁２５０が設けられている。壁２５０は、リザーバ２０３の中に作られ、穴２０１の液面は、リザーバ２０３の液面に等しい状態になっている。細胞は穴２０１から流路２０４に流れ、側流を形成する流路２０５と細胞検出領域２２１の前で合流する。これにより、細胞が流路の中心部に寄った状態を作れる（図３）。
【００７１】
流路２０４の細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像する。ＣＣＤカメラは、例えば、毎秒２００フレームで画像を取り込む能力のあるものを使用する。この撮影能力があれば、細胞検出領域２２１の流路を流下する緩衝液の流速が１ｍｍ／ｓｅｃ程度であっても、細胞単位で認識できる。
【００７２】
図７は、ＣＣＤカメラで取り込まれた画像から細胞を認識し、それぞれの細胞をナンバリングして識別するアルゴリズムを説明する図である。図７では、次々に取り込まれる画像をフレーム１，２，---，Ｎとして、それぞれのフレームに表れている細胞を表示している。フレーム１には黒丸で示す細胞のみが表れている。この黒丸で示す細胞を画像認識するとともにＮｏ．４２１とナンバリングする。次のフレーム２では、４２１細胞の他に白丸で示す細胞と星印で示す細胞が表れている。ここで、白丸で示す細胞と星印で示す細胞は、同時に、フレーム２に最初に現れている。これらの細胞を画像認識するとともに、下流側で最初に検出される細胞に若い番号をつける。ここでは白丸で示す細胞のほうが星印で示す細胞に比べて下流に出現しているので、白丸で示す細胞にＮｏ．４２２、星印で示す細胞にＮｏ．４２３とナンバリングする。次のフレーム３では、新しい細胞が認識されていない。フレーム２とフレーム３とを比較すると、４２２細胞は、細胞４２１および４２３細胞より移動速度が速いことが分かる。次のフレーム４でも、新しい細胞が認識されていない。４２２細胞は移動速度が速いのでフレーム４では、かろうじて現れている状態である。一方、細胞４２１および４２３細胞は、ほぼ同じ速度で移動していることが分かる。フレーム８まで認識できる。ここで、細胞の画像の認識は、指標として、各細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径に着目する。
【００７３】
このようにして、画像認識され、ナンバリングされた細胞の移動速度から、それぞれの細胞が細胞分離領域２２２（厳密には、連結部２４１，２４２）へ到達する時間を割りだし、連結部２４１のゲル電極にマイナス、連結部２４２の電極にプラスの電界をかけ、あるいは、電界をかけないで、細胞を回収用穴２１１と穴２１２に振り分ける。すなわち、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して予め入力した距離（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとして細胞を振り分ける。
【００７４】
(実施例４)
実施例４では、臓器組織をその表面から順次細胞を遊離させて、細胞層ごとに大まかに細胞を分離する前処理部と、細胞分離領域を一体化したチップ状デバイスとそれを用いる細胞分離の具体例を説明する。ここでは、内視鏡で採取した大腸ポリープ（直径３ｍｍ程度）をサンプルとしてセルソーティングにより平均的な細胞より大きな細胞を分離する。
【００７５】
図８は、実施例４のチップの平面図、図９は、図８のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。１０１は基板であり、基板下面には流路５０３が形成され、流路５０３の両端に開口を通して基板上面に設けたリザーバ５１２とリザーバ５０６と連通されている。流路５０３は基板下面に溝を掘った形で形成され、基板下面には、図４、図５で説明したのと同様に、ラミネートフィルム４１０が貼り付けられている。流路５０３の両端のリザーバ５１２，５０６は開口をあけた後に基板上面に貼り付ける形で作成される。また、流路５０３の途中には、フィルター５０４が設けられている。フィルター５０４は多数のピラー５０５が並んだ構造をしている。
【００７６】
基板１０１の下面には、基板１０１は、リザーバ５１２の下面に対応する位置に温調装置５２０が、流路５０３の下面に対応する位置に温調装置５２１が、それぞれ、設けられた基板１０２の上に載置される。それぞれの調温装置５２０，５２１は、リザーバ５１２、流路５０３を所定の異なる温度に保持している。それぞれの調温装置５２０，５２１の間には断熱のためにスリット５０１が設けてある。スリットは単なる切れ込みで空気の層になっていてもよいし、断熱性物質でできていてもよい。
【００７７】
使用に先立って、リザーバ５１２に所定量の緩衝液を入れ流路５０３を緩衝液で満たす。また、リザーバ５０７にはトリプシン活性を阻害するためのトリプシンインヒビターを含む緩衝液を入れる。次いで、リザーバ５１２に試料である組織断片５１０を入れ、リザーバ５１２内の緩衝液にピペット５２２を用いて、所定の量のトリプシンを含む液を加える。組織片表面の細胞マトリックスがトリプシンによって分解され、細胞５１１が組織断片５１０の表面から順次遊離する。調温装置５２０は、この処理が効率よく行われるように、リザーバ５１２を所定の温度に維持する。組織断片５１０の表面から遊離した細胞５１１は、リザーバ５１２と５０６の液面差による緩衝液の移動に応じて流路５０３に導かれる。流路５０３に設けられたフィルター５０４で、十分に分散していない細胞塊や構造物を除去し、分散した細胞をリザーバ５０６に導く。調温装置５２１は、流路５０３を細胞５１１が移動する際、トリプシンによる過剰な分解を防ぐために、流路５０３を所定の温度に維持する。
【００７８】
フィルター５０４とリザーバ５０６とを結ぶ流路にはリザーバ５０７に連なる流路が接続され、リザーバ５０７にはトリプシンインヒビターを含む緩衝液が入れられているから、フィルター５０４を通過した細胞５１１には、トリプシンインヒビターが作用する。そのため、細胞５１１はトリプシンの影響から開放されて安定な状態でリザーバ５０６に到達する。リザーバ５０６に到達した細胞５１１はピペット５２１で逐次回収できる。回収した分散細胞を実施例１で説明した図１記載のセルソーターチップ１００を用いて巨大細胞を分離する。あるサンプルでは、分離できる巨大細胞の８０％はがん化していることが判明する。なお、リザーバ５０７は一つでもよい。
【００７９】
図８、図９を参照して説明したチップ５００は、試料である組織片から経時的に剥離してくる分散細胞を順次分離するソーターの役割を担っていると言えるが、実施例１で説明した図１記載のセルソーターチップ１００の試料細胞を得るための前処理チップと見ることができる。
【００８０】
図１０はセルソーターチップの試料細胞を得るための前処理チップとして使用することに着目したチップの実施例を示す平面図である。図８と対比して明らかなように、リザーバ５１２内で試料である組織片から、細胞がトリプシン消化され、組織表面から分散細胞が流路５０３に流れ込み、フィルター５０４を通して流下し、リザーバ５０７からトリプシンインヒビターを含む緩衝液を供給されるのは、図８で説明したチップと同じである。
【００８１】
図１０に示すチップでは、流路５０３の最下流部５０３’で流路の先端が分岐している。さらに、分岐している各流路の末端は閉鎖されたリザーバ５０６−１〜５０６−４に連結されている。図９を参照して明らかなように、リザーバ５０６は上面が開放されている。これに対し、閉鎖されたリザーバとは、リザーバ上面がシールで覆われた構造をしており、このままでは流路から液が流れ込めない構造とされている。そのため、リザーバ上面のシールにピンで穴を明けると、穴が開いたリザーバにのみ流路から液が流入することになる。したがって、一つのリザーバに所定時間細胞を含む緩衝液回収した後、穴を粘着テープでふさぎ、次のリザーバのシールに穴を開け細胞を含む緩衝液を回収する、という操作を続けると、時系列的に分類した細胞を収集することができる。もっとも、最初から全てのリザーバをシールで閉鎖すると、最初に緩衝液を入れて流路を緩衝液で満たす操作ができない。したがって、一つのリザーバだけは開放しておくことが必要である。
【００８２】
図１０では、リザーバ５０６−１の上面シールに穴５３０−１を開けて細胞を含む緩衝液を回収し粘着テープ５３１で穴をふさぐ操作をした後、リザーバ５０６−２の上面シールに穴５３０−２を開けて細胞を含む緩衝液を回収している状態を示す。上面シールの穴を塞がれたときに分岐流路に残っている細胞は、そのまま分岐流路に残る。
【００８３】
(実施例５)
実施例５では、実施例４の前処理チップと実施例１記載のセルソーターチップを一体化したチップを用いることで、組織片をトリプシン処理し、組織片から順次細胞を分離するとともに、順次分散してくる細胞のうち特定の細胞群のみを回収することを可能としたセルソーターに関する。
【００８４】
図１１は、実施例５のセルソーターを模式的に示す平面図である。図１２（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、図１１のＣ−Ｃ，Ｄ−ＤおよびＥ−Ｅ位置で矢印方向に見た断面図である。図１１，１２において、既出の実施例で説明したものと同じもの、または、同等の機能を果たすものには同じ参照符号を付した。
【００８５】
６００は実施例５のセルソーターである。基板１０１の上には、トリプシン処理部６１０とセルソーティング部６５０が構築され、カスケードに接続されている。リザーバ６０１は６０２，６０３，６０４の三つの部屋に仕切られている。各部屋間の仕切り６０５の構造を図１２（Ａ）に示す。ここでは部屋６０２と６０３の関係で説明する。部屋６０２と６０３の仕切り６０５は、仕切り板６０５１，６０５２および６０５３で構成されている。各仕切り板６０５１，６０５２，６０５３は本実施例では１００μｍの間隔で配置され、仕切り板６０５１，と６０５３は部屋６０３の底面との間に１００μｍのギャップを持たせてある。したがって、部屋６０２と部屋６０３は１００μｍ幅の空間で連通したものとなっている。部屋６０３と６０４の仕切り６０５も同様である。三つの部屋の全体に緩衝液を入れる。このとき、液面が仕切り板６０５２の上面より高い位置で、６０５１，６０５３の上面より低い位置であることが重要である。液面の高さは１２から１５ｍｍである。
【００８６】
部屋６０２には、リザーバ５１２が構成されている。これは、図８で説明したリザーバ５１２と同じであるが、ここでは、部屋６０２に満たされた緩衝液の液面より低い高さ、例えば、１０ｍｍとする。リザーバ５１２内に組織片とトリプシン溶液をリザーバ５１２の体積の半分まで加える。トリプシン溶液はグリセリンで１．０４の比重をつけている。これで沈降しない組織片の場合は、比重を緩衝液と同じにして壁６１１の上面に厚さ１０μｍ程度のフィルターをのせる。これにより、リザーバ５１２内に存在する細胞やトリプシンが部屋６０２内にリークするのを防ぐ。それでも部屋６０２内にリークするトリプシンは部屋６０３に移行するのを防ぐ必要がある。仕切り板６０５はこのために設けられている。
【００８７】
セルソーター６００は、図９で説明したと同様の温調装置５２０，５２１が設けられている基板に載置されて使用されるが、図では、温調装置５２０，５２１が設けられている基板の表示は省略する。リザーバ５１２の下面には、流路５０３に連通する開口があり、図８で説明したように、フィルター５０４に連なっている。フィルター５０４の下流で、リザーバ５０７に連通する流路６２３，６２４が合流し、図８で説明したように、リザーバ５０７に入れられているトリプシンインヒビターを含む緩衝液が供給される。したがって、フィルター５０４を通過した細胞には、トリプシンインヒビターが作用し、細胞はトリプシンの影響から開放される。ここでは、リザーバ５０７は、部屋６０２と同様に、部屋６０３と仕切り板６０５で仕切られた部屋６０４内に設けられる。図１２（Ｂ）に部屋６０４とリザーバ５０７の部分を断面図で示す。部屋６０４は、仕切り板６１５で仕切られているから、部屋６０２と同様に、緩衝液の液面高さは、部屋６０２と同じである。また、リザーバ５０７は、リザーバ５１２と同じ高さとされ、リザーバ５１２の緩衝液の比重と同じ比重の緩衝液が入れられる。したがって、トリプシンインヒビターを含む緩衝液は、フィルター５０４の下流で、流路５０３を流下してきた細胞を含む緩衝液に合流し、細胞をトリプシンの影響から開放する。合流した緩衝液は、流路２０４を流下する。また、リザーバ５０７の下面には、図９で説明したように、温調装置５２１が設けられている。さらに、リザーバ５０７の上面には、リザーバ５１２と同様、必要に応じて、フィルター６０６が設けられる。
【００８８】
部屋６０２および部屋６０４は組織片をトリプシン処理し、組織片から順次細胞を分離するトリプシン処理部６１０を構成するとともに、セルソーティング部６５０に細胞を供給する機能を果たす。
【００８９】
一方、部屋６０３には、図１２（Ａ）に示すように、穴２０１’が設けられ、これに連通する流路２０４’が開口している。さらに、部屋６０３の部屋６０４より下流側に、穴２０２，２０２’が開けられ、これに、流路２０５，２０５’が連通している。これらの穴を介して、緩衝液が流路に供給される。流路２０４から供給される細胞を含む緩衝液、流路２０４’，２０５，２０５’から供給される緩衝液に対して構成されるシステムは、図６で説明したセルソーターと同じであり、セルソーティング部６５０を構成する。
【００９０】
流路２１８，２１９に得られる細胞を含む緩衝液は、リザーバ２１１，２１２で回収されるが、図１２（Ｃ）にリザーバ２１１，２１２を包括するリザーバ６６３について、Ｅ−Ｅ位置で矢印方向に見た断面図で示す。リザーバ６６３の緩衝液の液面は、部屋６０２−６０４の液面より低くされ、これが、流路を緩衝液が流下するときのエネルギーとなる。
【００９１】
図１２（Ａ）−（Ｃ）に示したように、基板１０１の下面は、ラミネートフィルム４１０で覆われ、基板１０１に掘られた溝を流路として閉じられたものとする。また、図６で説明したと同様に、配線１０６および１０７と電解質を含むゲルを導入する穴に挿入した電極をラミネートフィルムに蒸着した導電膜により実現することもできる。この場合は、図６で説明したと同様、ラミネートフィルム４１０は、基板１０１の下面に貼り付けられるものであるから、導電膜に形成した電極等は、チップの平面図では見えないが、ここでは、他の構成要素との関係が分かりやすいように、重ねて表示した。また、導電膜１０６および１０７の電源２１５に接続されるための端子を形成する端部が、基板１０１の表面で電源２１５と接続可能にするための構造が設けられる。
【００９２】
(実施例６)
実施例６は、実施例１の試料細胞の導入に工夫を施したものである。図１３は実施例６の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図であり、図１４（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、実施例６の試料細胞の導入部における工夫を説明するための部分的な断面図である。実施例１と同じ参照符号を付したものは同じものまたは同じ働きをするものである。
【００９３】
図１３と図１とを対比して明らかなように、実施例６のセルソーターは、実施例１の流路２０４をより上流部まで延長し、開口２９０を設けて、緩衝液を導入するようにした点において実施例１のセルソーターと異なるだけで、後は同じである。図１４（Ａ）から分かるように、流路２０４は開口２０１を通してリザーバ２５０に連通するのみならず、より上流まで延伸されて開口２９０とも連通している。
【００９４】
図１４（Ｂ）に、開口２０１および開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液および細胞を模式的に示したように、実施例６によれば、開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液の層によって、開口２０１から流路２０４に流入する緩衝液および細胞がラミネートフィルム４１０に接触することが阻止される。すなわち、開口２０１から流路２０４に流入する緩衝液および細胞は、開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液の層の上を流れることになる。したがって、細胞がラミネートフィルム４１０に接触して、それが原因となる滞留を防止することができる。
【００９５】
図１４（Ｃ）は、開口２０１から流路２０４に流入する細胞が、ラミネートフィルム４１０に接触して、それが原因となる滞留を生じている様子を模視的に示すものである。細胞の一つがラミネートフィルム４１０に接触して、そこに留まるようなことが起こると、それに他の細胞が引っ掛かり、次々と細胞が溜まってしまって、遂には、細胞の流下が停止してしまうことになる。
【００９６】
実施例６の説明を、実施例１の流路２０４をより上流部まで延長した例で説明したが、これは、実施例４，５の流路５０３についても同様にできることは明らかである。すなわち、細胞を導入する位置よりも上流側で緩衝液を導入して、緩衝液の流れの層を形成しておいて、細胞を導入することで、細胞が流路の底面に接触するのを防止するのである。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。
【図２】マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流して、マイクロ流路２４０を流下し、細胞検出領域２２１の直前で、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ２４０を流下する状況を説明する図である。
【図３】（Ａ）は、流路２０４を流下する緩衝液が流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって中央部に押しやられた結果の合流後の流路２４０の細胞分布を示す図、（Ｂ）は、合流後の流路２４０を流下する緩衝液が流路２０４’を流下する緩衝液と合流した結果の合流後の細胞検出領域２２１における流路内の細胞分布を示す図である。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）は流路の幅を広くすることに伴う問題と、その解決案の例を示す断面図である。
【図５】図４で説明したリザーバ２０３と開口２０１，２０１’および流路２０４，２０４’の部分をより詳細に説明するために、図１のＡ−Ａ位置において、矢印方向に見た断面図である。
【図６】ゲル電極部分が別の構造とされたセルソーターチップを平面図の形で示す図である。
【図７】ＣＣＤカメラで取り込まれた画像から細胞を認識し、それぞれの細胞をナンバリングして識別するアルゴリズムを説明する図である。
【図８】実施例４のチップの平面図である。
【図９】図８のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図１０】セルソーターチップの試料細胞を得るための前処理チップとして使用することに着目したチップの実施例を示す平面図である。
【図１１】実施例５のセルソーターを模式的に示す平面図である。
【図１２】（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、図１１のＣ−Ｃ，Ｄ−ＤおよびＥ−Ｅ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図１３】実施例６の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。
【図１４】（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、実施例６の試料細胞の導入部における工夫を説明するための部分的な断面図である。
【符号の説明】
【００９８】
１００…セルソーター、１０１…基板、１０６，１０７…配線、２０１，２０１’，２０２，２０２’，２０６，２０７…穴、２０６’，２０７’…空気抜き、２０３，２１３，５０６，５０７，５１２…リザーバ、２０４，２０４’，２０５，２０５’，２４０，２１８，２１９，２４７，５０３…流路、２０８，２０９…マイクロ構造、２１５…電源、２１６…スイッチ、２２１…細胞検出領域、２２２…細胞分離領域、２３０，５０４…フィルター、２４１，２４２…連結部、２５０…壁、２６０…溝、４１０，５２３…ラミネートフィルム、４２１，４２２，４２３…細胞像、５０５…ピラー、５２０，５２１…温調装置、５１０…組織断片、５２１，５２２…ピペット、５３１…粘着テープ、６００…セルソーター、６０１，６０２，６０３…部屋、６０５１，６０５２，６０５３…仕切り板、６０６…フィルター、６６３…リザーバ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置（セルソーター）に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物における生体組織は種々細胞が役割を分担して全体として調和の取れた機能を維持している。あるいは、細胞の一部ががん化（ここでは腫瘍も含め、一括してがんと呼ぶことにする）すると、周辺領域と異なる新生物となるが、がん領域とそこから遠く離れた正常組織部分とはある境界を持って必ずしも区切れるものではなく、がん周辺領域も何らかの影響を受けている。したがって、臓器組織における機能を解析するには狭い領域に存在する少数の細胞を分離する必要がある。
【０００３】
あるいは医療分野において、正常組織中のがんが疑われる領域を調べるには、バイオプシーで分離した組織片からがんが疑われる部分を分離する必要がある。このような特定細胞の分離には、細胞を固定し、種々細胞染色を施し、目的の部分を切り出すのが一般的で、最近ではレーザーマイクロダイセクションと呼ばれるレーザーをあてた領域のみの細胞を分離する方法が考案されている。
【０００４】
あるいは、再生医療の分野では、組織の中から幹細胞を分離し、これを培養して分化誘導し目的の組織、ひいては臓器を再生しようとする試みがなされている。
【０００５】
細胞を識別したり分離したりしようとすると、何らかの指標に従い区別する必要がある。一般に細胞の区別には、
１）目視による形態学的な細胞分類：これはたとえば尿中に出現する異型細胞検査による膀胱がんや尿道のがんなどの検査や血中の異型細胞分類、組織中における細胞診によるがん検査などをあげることができる、
２）蛍光抗体法による細胞表面抗原（マーカー）染色による細胞分類：一般にＣＤマーカと呼ばれる細胞表面抗原を、それに特異的な蛍光標識抗体で染色するもので、セルソーターによる細胞分離やフローサイトメーターや組織染色によるがん検査などに用いられている。もちろんこれらは、医療面のみならず、細胞生理研究用や、工業的な細胞利用の上でも多用されている。
３）あるいは、幹細胞の分離に関しては、細胞内に取り込まれる形の蛍光色素をレポーターとして幹細胞を含む細胞を大まかに分離し、更にその後で実際に培養を行うことで目的の幹細胞を分離する例がある。これは、幹細胞の有効なマーカーがまだ確立されていないので、実際に培養し、分化誘導したもののみを利用することで、実質的に目的細胞を分離しているのである。
【０００６】
このように培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の比重の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。この技術については、例えば、セルソーターがある。セルソーターは、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。
【０００７】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、近年、マイクロ加工技術を用いて微細な流路を作成し、流路内の層流中を流れる細胞を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されている（非特許文献２：Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）。しかし、このマイクロ加工技術を用いて作成するセルソーターでは観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い処理方法が必要であった。
【０００８】
本発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を出願している（特開２００３−１０７０９９、特開２００４−８５３２３、WO２００４／１０１７３１）。これは実験室レベルでは十分に実用的なセルソーターであるが、汎用的に使用するには、液搬送法や回収法、試料調製について新たな技術開発が必要である。
【０００９】
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【非特許文献２】Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)
【特許文献１】特開２００３−１０７０９９号公報
【特許文献２】特開２００４−８５３２３号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、基板上に形成する流路を用いる細胞分離あるいは検出用に、確実に所定の細胞の検出及び分離を行うことのできる細胞分離チップおよび細胞分離技術を確立し、安価で試料毎に取替えが可能なチップを用いた細胞分析分離装置を提供することを目的とする。
【００１１】
基板上にマイクロ流路を作成して液を流すと、一般的にはその中を流れる液は層流になる。一見すると、流路の断面積方向には液流速分布が無い様に錯覚するが、実際にこのようなマイクロ流路中に細胞懸濁液を流すと、細胞が流路内の壁に衝突する現象が頻発する。壁に衝突した細胞は流れに逆らう抵抗を受けることになるため流速が低下し、後方を流れてくる細胞と接触したりする。セルソーターやフローサイトメーターにおいてこのような現象が起きると、細胞の分離検出が困難になる。一般的にこのような現象を防止するにはシースフロー技術が用いられる。これは高速に流れる液流を鞘としてそのコア部分に細胞懸濁液を流し込むことで細胞を一列に整列させる技術で、鞘となるシース流とコア流を合体させた後、空気中にジェット流として流し出すことで達成される。この従来法ではそもそも壁が無いので細胞が壁に衝突する現象の無い理想的な状態で細胞を分離することができる。
【００１２】
しかし、シースを用いたジェット流を安定に形成するのは非常に難しく、実用的な装置はきわめて高価であり、シース形成用のセルは試料ごとに取り替えることができない。大型の装置に限らずチップ上に形成したセルソーターに関しても、本願の発明者らが開示している方法以外の従来の技術では、もれなく試料液搬送とシース液搬送のために独立したポンプを用いている。これらのポンプはチップとは別に配置され、チップを交換するごとに繋ぎ換える必要がある。また、チップを交換に伴う試料送液速度とシース送液のバランス変動を調整し直す必要がある。このような厳密な制御を行うため、大掛かりな高安定なポンプが必要である。
【００１３】
セルソーターをチップ上に構築するわけであるから、送液部分もチップ状に形成し、光学系以外の機能はチップのみでクローズドで行うことで使い勝手を改善し、低価格を実現することが重要な課題である。クローズドにすることで、セルソーターチップをサンプルごとの使い切りにする新たな使い方が発生する。たとえば、幹細胞の分離や臨床検査には、他の検体組織由来細胞のコンタミネーション防止が必須であるが、セルソーターチップを一回のみの使い切りにすることでコンタミネーションを考慮する必要が無くなる。このように、セルソーターの主要部分をチップ化することで、装置の小型化、低コスト化、試料ごとのチップ交換によるクロスコンタミネーションの完全な防止などが可能になり、医療分野での特に再生医療分野で必須なクロスコンタミネーションの無い細胞分離システムを構築することが本発明の第１の目的である。
【００１４】
チップ状のセルソーターを実現する上で重要な技術的な事項に微細流路内を流れてくる細胞の分離機構がある。分離機構には色々のものが提案されている。たとえば、超音波、磁界、バルブによる流路切り替え、レーザーピンセット、高周波電界、直流電界で細胞を任意の方向に移動させる機構を挙げることができる。このうち、細胞にダメージを与えずに、再現よく、特別な装置を用いずにできるのは低電圧の直流電界を用いる方法である。ところが直流電界を用いて高速な細胞分離を行うにおいて、通常の金属電極を用いると緩衝液の電気分解が起き、安定して長時間の使用ができない問題がある。最も実用化に近い方法がWO２００４／１０１７３１に記載されている。
【００１５】
WO２００４／１０１７３１に示されているマイクロ加工技術を用いて作成した量産可能なセルソーターチップでは、電気分解の影響をある程度防ぐために、細胞を分離する機構としてゲル電極を用いて細胞が流れる流路内に直流電界をかけて、電気泳動的に細胞を振り分けている。ゲル電極としては電解質を含むアガロースゲルなどを用いている。細胞の流れる流路近傍は細孔を介したゲルがあるのみなので、気泡発生の影響を所定時間防止することができるが、不十分である。またゲルは、電解質緩衝液を含む状態で供給保存する必要があるために、乾燥に弱く長期保存に適さない問題がある。さらに長期保存を行うために凍結保存しようとすると、ゲルが凍害を受けて破壊されるため、凍結保存はできない。
【００１６】
したがって、本発明は、電界を掛けている最中の気泡の発生を防止し、保存時に乾燥や凍結に耐性のあるゲル電極を提供し、真の意味での検体ごとの使いきり型セルソーターチップを提供することを第２の目的としている。
【００１７】
基板上に形成する流路を用いて細胞分離を行おうとすると、流路中の特定領域に細胞認識を行う部位を設け、何らかの手段で細胞を認識するアルゴリズムが必要となる。また、細胞分離を行うセルソーターとして使用しようとすると、細胞検出部の下流に分離部を設ける必要がある。一般的に、細胞検出には以下の３つの方法が存在する。
１）レーザーなどを流路上の検出部に照射し、細胞が横切るときの散乱光や細胞を蛍光染色できる場合はその蛍光を検出する、
２）検出部に電極を設け、細胞が電極を横切るときのインピーダンスやコンダクタンスの変化を検出する、
３）ＣＣＤカメラなどを用い、細胞を像として検出する。
【００１８】
ここで、１）の方法では細胞認識は実質的に一点で行われ、細胞が連続して高速に流れてきたときでも高速な処理が可能であるので、細胞を液滴に封じ込めることで一定速度で検出部と分離部の間を移動させる技術を用いた大型のセルソーターに使用されている。２）の方法はやはり高速な処理が可能であるが、検出後の細胞の移動速度が測定できないことと、分取機構と組み合わせるのが難しいため、一般的には細胞分類に用いるフローサイトメーターに採用されている。３）の方法は、一見、簡便のようであるが、流路中を常に移動する複数の細胞を取り扱う必要があるので、セルソーターでは画像処理の負荷が大きくなるため一般的には用いられていない。
【００１９】
しかし、基板上の狭い範囲に組み込んだ流路において、同様の細胞認識とそれに続く細胞分離を行おうとすると、種々問題が新たに発生する。まず、流路中を流れる細胞の移動速度はすべての細胞で同じではなく、細胞の形状や大きさ、流路の中心を流れるか壁近傍を流れるかなどの要因でまちまちとなる。このため、特に細胞を認識した後にその下流で細胞を分離するまでの時間にばらつきが発生する。次に、同じく細胞の移動速度がまちまちであるため、ある細胞が他の細胞を流路内で追い抜くといった現象も見られる。このため、細胞を１点で観察する上記１）や２）の方法では各細胞を確実に分離する必要がある場合の解決すべき問題となる。そこで本発明の第３の目的は、ＣＣＤカメラなどを用い、細胞を像として検出することで流路中を連続して高速で流れてくる細胞を識別して、必要な細胞をより分けるためのアルゴリズムを提供することにある。
【００２０】
従来のセルソーターでも、特定細胞領域を分離し、含まれるゲノムやトランスクリプトームの解析、あるいはイムノケミストリーを用いた検査を行う上では十分である。しかし、多くの方法では、染色や固定などの操作により、回収した細胞はすでにその生命機能を停止している。このため、回収した細胞の動的機能の解析や、さらに、これを培養し利用するといったことができない問題がある。特に今後実用化が期待される再生医療や、培養組織細胞片を用いる薬物動態検査などの材料としての細胞を得るには、臓器組織を細胞レベルで解剖し回収する技術の確立が重要である。
【００２１】
本発明の第４の目的として、臓器組織をその表面から順次細胞を遊離させて、細胞層ごとに大まかに細胞を分離する前処理部と、細胞分離領域を一体化したチップ状デバイスとそれを用いる細胞分離法を提供する。
【００２２】
このように、本発明では、チップ上にセルソーターないしフローサイトメーターを構築する上での具体的アーキテクチャーとして、特に、細胞用流路の形状と細胞懸濁液搬送部分の構造、長期保存に耐えて流通経路にのりうる電極部分の構造、分離アルゴリズム、試料としての組織断片や細胞塊からの細胞計測および分離チップを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明で想定している細胞は、小さいものではバクテリア、大きいものでは動物細胞でがん細胞のようなものである。したがって、細胞サイズとしては０．５μｍから３０μｍ程度の範囲となる。細胞分離を基板上に組み込んだ流路を用いて行おうとすると、まず問題になるのが流路幅（断面形状）である。また、流路は基板の厚み方向で１０〜１００μｍ内外のスペースに実質２次元平面状に作成することとなる。細胞の大きさからしてバクテリア用では５〜１０μｍ、動物細胞用では１０から５０μｍが適当なサイズとなる。前記したように、まず細胞が壁に衝突するのを防ぐ必要がある。細胞懸濁液が流れる流路の両側面から別の液を側流として流し込み、細胞が壁に衝突しないようにする。このような液の合流方法を検討した結果、液の合流前の細胞懸濁液を流す流路の幅（実質的に断面積）と合流後の流路の幅がほぼ等しく、前記両側から合流する流路の流路長が等しいときに最も効果が得られることがわかった。合流後の流路幅が広いと細胞を壁から遠ざける効果が小さくなり、合流後の流路幅が狭いと合流後に細胞の流れる速度が速くなりすぎ、検出しにくくなるし、流れてくる細胞そのものの頻度が極端に少なくなる。また、２本の側流の長さが異なると流路抵抗が変わるため、細胞を流れる中央の流路が片方によってしまう問題が生じる。
【００２４】
チップ上に、セルソーターなりフローサイトメーターを構築しようとすると、細胞懸濁液や上記側流の流速制御が非常に難しい問題として浮上する。大規模な無脈流ポンプで、しかも、数十ピコリットル／分の流速を安定して作れるものを使用すれば解決するが、使い切り形のチップを前提とすると、チップとポンプのコネクションを毎回行わなければならず、再現性と使い勝手の面で問題である。そこで、チップ上のポンプを組み込む研究がなされているが、本発明では、一切ポンプを使用せずに、液の自由落下で解決する。すなわち流路の入り口にリザーバを儲け、リザーバ内の液面より流路出口の液面を低くすることで無脈流での微量液送を実現している。
【００２５】
このような液面高さの違いを利用するシステムでは、複数の液を送液するときの液流速制御が困難である。液面の微妙な違いで細胞懸濁液と側流の流速比が変動してしまう問題が発生する。本発明では、細胞懸濁液を入れるリザーバと側流を形成する緩衝液を入れるリザーバを一体化することで両者の液面を厳密に一致させて解決している。すなわち、共通の液面からの高低差をドライビングフォースとして液送を行うことで細胞懸濁液と側流の流速比の変動をなくしている。このような構造のリザーバとして、一つのリザーバに仕切りがあり、一方の底に試料用流路が結合し、他方に側流用の流路が接合している構造を考案する。実質サイホンの原理で両リザーバの液面をそろえていると考えることができる。仕切りより高いところでは液がつながっていることになるが、細胞は緩衝液より比重が高いので、仕切りを乗り越えて側流のほうへ流れ込むことは無い。
【００２６】
本発明の検出部は、側流の合流した流路部分にある。合流後の流路部分をＣＣＤカメラで観測する部位を設け、必要に応じてその下流に細胞分離領域を設置する構造としている。必要に応じて、というのはセルソーターとしてのチップということで、フローサイトメーターとしては検出部の下流に直接ドレインを設ける。これにより、細胞が壁に衝突することなく、流路の中心部によった経路をほぼ一定の速度で流れるようになる。
【００２７】
セルソーターとして用いるには検出部の下流に細胞分離領域を設ける。分離部の入り口で細胞を移動させるための流路として細胞分離領域において緩衝液（あるいは培地）のみを流す流路が合流し、下流側で分離部から分岐している。分離部で細胞を分離するわけであるが、細胞分離領域に外部から細胞に外力を加えて細胞を移動させる手段として電極を設置し、細胞を分離して排出することのできる流路を設ける。電極に電圧をかけてイオンを流すことにより細胞の流路内での姿勢制御（流路変更）を行う時は、イオンの流れる方向と、流路内で液が流れる方向の合成ベクトルの方向に細胞が移動する。細胞はマイナスにチャージしているのでプラスの電極に向かって動く。よって合体後の流路の流れる方向に対してマイナス極を下流側、プラス極を上流側にずらした形で電極を設置することで移動のための合成ベクトルを制御し、少ない電流で細胞の流路変更を可能としている。流路変更する細胞と流路変更しない細胞は各々別の流路に流れ込み分離される。ここで試料が流れる方の流路は、もともとの試料用の流路に側流が合流した流路となっている。これに対して合流する緩衝液（あるいは培地）のみを流す流路では上流側で側流の合流は無い。試料流路と緩衝液のみの流路および合流後の流路は幅が等しい。合流後の試料流路は側流が乗っている分だけ、流速が早く、このため分離部においては若干緩衝液流路側からの流れの部分にはみ出す構造となっている。このことも、細胞を姿勢制御し、試料流路側から緩衝液流路側に乗り換えやすくする重要な効果である。電流を流さないときは、細胞は試料流路側の中心を流れているので、そのまま乗換えなしに試料液が流れ出て行く流路側に流れていく。
【００２８】
分離部に設置する電極は、液絡（空間と空間を満たす液を含む細管で、ここではゲルで満たされている）を介してゲルを充填した空間に金属電極が接する構造となっている。これをゲル電極と呼ぶことにする。マイナス電極側は生成するヒドロキシイオンを吸収するために低ｐＨの緩衝液、プラス電極側は生成する水素イオンを吸収するために高いｐＨの緩衝液を含むゲルマトリックスでできている。ゲルマトリックスとしてはアガロースやポリアクリルアミドのような生化学で一般的に使用されている網目構造をとるゲルを利用できる。これにより、ゲル電極部の電気分解によるガス発生を抑え安定に細胞分析分離を可能としている。もちろん、金属電極が細胞に直接触れることが無いので、電極表面で細胞を痛めないで済む。細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことを可能にしている。
【００２９】
ゲル電極は上記のように特開２００３−１０７０９９記載の金属電極に比べてメリットが大きいが、ユーザーにチップを供給する上で問題が残る。すなわち、ゲル電極は湿式の電極のため、貯蔵安定性が悪く、実質的にユーザーが使用直前にゲルをチップに充填してゲル電極を作成する必要がある。本発明では、トレハロースなどの非還元性二糖やグリセロール、エチレングリコールなどを加えることで一定期間の室温保存を可能としている。さらに、通常、ゲルは凍結するとゲル構造が壊れるため、凍結による長期保存が困難であるが、前記トレハロースなどを加えて急速冷凍することで、ゲル構造を壊す氷晶の出現を抑えることができ、結果的にゲル電極の冷凍保存による長期保存を可能としている。
【００３０】
更に、本発明の細胞分離装置は、細胞分離領域に導入される試料を含む流体が導入される流路の上流部で不純物を捕獲して流路の目詰まりを防ぐ手段を有することができる。
【００３１】
即ち、本発明は、細胞分離用空間、それに細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、それから流体を排出するための少なくとも２つの流路及び該細胞分離領域に外部から細胞に外力を加える手段から成る細胞分離装置であって、これらの流路が、細胞分離領域に外部から外力を加えた場合と加えない場合に、細胞が該細胞分離用空間からそれぞれ異なる流路へ排出されるよう配置されたことを特徴とする細胞分離装置である。
【００３２】
この細胞分離装置においては、細胞分離領域に外部から細胞に外力を加えるため、電極等が直接細胞を含む緩衝液に接することがなく、さらに、低い電圧で電流を流して(すなわちイオンを流して)細胞を振り分けるため、細胞に対するダメージを少なくしている。
【００３３】
細胞認識と分離のアルゴリズムに関しては次のような特徴がある。
【００３４】
一点での細胞認識が上記理由により不可能なため、測定範囲を面に広げ画像認識で細胞の識別を行い、追跡することでより確実な細胞分離を行う。このとき重要なのは、画像の取り込み速度である。一般の３０フレーム／秒のビデオレートのカメラでは、画像での細胞取りこぼしが生じる。最低２００フレーム／秒の取り込みレートがあれば、流路中をかなりの速度で流れる細胞を認識できる。
【００３５】
次に画像処理法であるが、取り込みレートが早いということはあまり複雑な画像処理を行うことはできない。まず、細胞認識であるが、前記したとおり、細胞の移動速度や細胞によりまちまちで、場合によっては細胞の追い越しがある。このため、各細胞が最初に画像フレームに現れたときに細胞にナンバリングを施し、以下、画像フレームから消えるまで同一ナンバーで管理を行うこととする。すなわち、連続する複数枚のフレームで細胞像が移動する状況をナンバーで管理する。各フレーム内での細胞は上流側にあったものから順に下流側に移行し、画像中に認識されるナンバリングされた特定細胞の移動速度はある範囲に収まるとの条件でフレーム間の細胞をリンクさせる。このようにすることで、たとえ、細胞の追い抜きがあったとしても各細胞を確実に追跡できるようにする。
【００３６】
これで、細胞の認識が可能となるが、細胞のナンバリングには、まず細胞像を２値化し、その重心を求める。２値化した細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径を求め、これらのパラメーターを用いて各細胞をナンバリングする。各細胞像をこの時点で画像として自動保存することも使用者にとって益があるので行えるようにする。
【００３７】
つぎに、細胞分離に使用する場合であるが、ナンバリングした細胞のうち、特定の細胞のみを分離しなくてはならない。分離の指標は上記した輝度重心、面積、周囲長、長径、短径などの情報でもよいし、検出部と画像処理部で蛍光検出を行い情報を得てもよい。いずれにせよ、検出部で得た細胞をナンバリングに従い分離する。具体的には、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して検出部から分離部までの距離を（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとすることでちょうど目的のナンバーの細胞が電極間に来た時に細胞を電気的に振り分けて分離する。
【００３８】
一般に、動物組織の細胞では、細胞間に細胞外マトリックスが存在し、細胞同士がばらばらにならないようになっている。細胞外マトリックスは周囲の細胞が分泌したタンパク質と多糖類が集合し、それらを分泌する細胞表面と結合し網状構造を形成したものである。細胞外マトリックスの実態は、プロテオグルカンやコラーゲンエラスチン、ファイブロネクチンやラミニンからなる。したがって、組織を形成する個々の細胞を得るには一般的にトリプシンなどのプロテアーゼ処理を行う。一般的には組織をなるべく小さな断片に切断した後にトリプシン処理を短時間行い、細胞にあまりダメージを与えないようにして細胞単体を得る。
【００３９】
本発明では、このプロテアーゼ処理を逆手に取り、プロテアーゼで組織表面から順次細胞を遊離させることで組織の深さ方向に分布を持つ一連の細胞群を得る機能と構造を含めたチップも提供する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明により、安定した細胞分離が可能な使いきり型の細胞分離チップが実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（実施例１）
図１は、本発明の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。セルソーター１００は基板１０１により構成されている。基板１０１の下面に流路を、上面にこの流路に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液の供給口とする。また、十分な緩衝液の供給と各流路での流量の調整のためにリザーバを設ける。流路の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することができる。チップ基板１０１全体のサイズは２０×３０×１ｍｍ（ｔ）である。チップ基板１０１の下面に刻まれた溝や貫通穴を流路やウェルの形状とするために、溝が刻まれた下面側に０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着してある。開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いて、０．１ｍｍのラミネートフィルムを通して流路内を流れる細胞を観察できる。もちろんこれより低倍率のレンズでは問題なく観察することができる。チップ基板１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’，２０２および２０２’が設けられるとともに、これらを包括するリザーバ２０３が設けられる。したがって、リザーバ２０３に十分な緩衝液を供給すると穴２０１，２０１’，２０２および２０２’は緩衝液でつながる。これにより、穴２０１および２０１’に連なる流路２０４と流路２０４’には同じ液面高さの緩衝液が供給される。したがって、両流路の流路幅（流路高さを等しいとすれば）、あるいは、断面積、さらに両流路の流路長を実質等しくすれば、両流路の流量を実質同量にすることができる。同様に、穴２０２，２０２’に連なる流路２０５，２０５’には同じ液面高さの緩衝液が供給され、流路２０５，２０５’を流れる緩衝液の流量を流路２０４に流れる流量と所定の比にそろえることができる。試料を含む緩衝液を導入する穴２０１の周辺には細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐための壁２５０が設けられている。壁２５０の高さは、リザーバ２０３の壁よりも低く、緩衝液は壁２５０より高い位置まで満たされている。
【００４２】
穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液は、マイクロ流路２０４（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞検出領域２２１および細胞分離領域２２２まで導入される。ここで、マイクロ流路２０４上には、マイクロ流路の目詰まりを防ぐために、チップ中に直接微細構造として組み込まれたフィルター２３０が配置されている。他方、穴２０２，２０２’に導入された細胞を含まない緩衝液は流路２０５，２０５’（幅１２μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液と合流する。２４０は合流後のマイクロ流路であり、細胞検出領域２２１となる。さらに、マイクロ流路２４０は細胞分離領域２２２まで導入される。
【００４３】
一方、穴２０１’に導入された細胞を含まない緩衝液は、マイクロ流路２０４’（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）を通過して、細胞分離領域２２２に導入され、マイクロ流路２４０と合流する。合流後の流路幅については、後述する。また、この合流した流路は、細胞分離領域２２２の出口で、マイクロ流路２１８（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）および２１９（幅２０μｍ、深さ１５μｍ）に分流する。
【００４４】
２０６，２０６’および２０７，２０７’は電解質を含むゲルを導入する穴であり、それぞれ、穴２０６および２０７に導入されたゲルは基板１０１の下面のマイクロ構造２０８，２０９（幅２００μｍ×高さ１５μｍの折れ曲がった溝）を通して穴２０６’および２０７’に送り込まれる。したがって、マイクロ構造２０８，２０９は電解質を含むゲルで満たされている。マイクロ構造２０８，２０９の屈曲部はマイクロ流路２０４，２０４’との間で２０μｍ程度の長さの液絡構造の連結部２４１，２４２となっていて、細胞分離領域２２２において、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが、直接、接触できる構造とされる。ゲルと緩衝液が接触する面積は、１５μｍ（流路に沿った長さ）×１５μｍ（高さ）である。ゲルを導入する穴２０６および２０７には、黒丸で示す電極が挿入され、これらの電極は、配線１０６，１０７およびスイッチ２１６を通して電源２１５に接続される。スイッチ２１６は、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に電圧をかける時のみＯＮとされる。
【００４５】
細胞分離領域２２２でマイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７を流れる緩衝液に、ゲルが接触する連結部２４１と２４２は、図に示すように、マイクロ流路２４０とマイクロ流路２０４’の合流した流路２４７でのゲルとの接触位置が、連結部２４１のほうが流路の上流に位置する構造となっている。穴２０６の電極にプラス、穴２０７の電極にマイナスの電圧をかけたときに、マイクロ流路２４０を流れてくる細胞を流路２１１’に効率よく移動することができる。なぜなら電流を流したときにマイナスにチャージしている細胞は電気泳動的な力が働き、この力と流路内を流れる緩衝液から受けるベクトルと電気泳動的力のベクトルの合成ベクトルになるからである。これにより、連結部２４１と２４２を流路の流れに対して同位置（流れの線の対象位置）に作成した場合に比べ、効率のよい電界利用が可能となり、より低電圧で安定した細胞のマイクロ流路２１８あるいはマイクロ流路２１９への移動が可能となる。
【００４６】
マイクロ流路２１８，２１９の下流部には、細胞分離領域２２２で振り分けられた細胞の回収穴２１１，２１２が開けられている。それぞれの穴２１１，２１２には、回収された細胞を含む緩衝液の拡散を防ぐための壁２１１’，２１２’が設けられるとともに、さらに、これらを包括するリザーバ２１３が設けられる。リザーバ２１３は、細胞を含む緩衝液の拡散を防ぐための壁２１１’，２１２’の高さよりも高く、分離操作前に緩衝液は壁２１１’，２１２’より高い位置まで満たされているが、この高さは、リザーバ２０３に満たされている緩衝液の位置よりは低いものとされる。
【００４７】
リザーバ２０３の緩衝液の液位はリザーバ２１３のそれよりも高いから、この落差が流路を流れる緩衝液の移動の駆動力となるとともに、脈動のない安定した流れを作り出す。リザーバ２１３の緩衝液の貯蔵量を十分大きなものとしておけば、穴２０１に導入された細胞を含む緩衝液を、全て、流路２０４に流入させることができる。
【００４８】
図２は、マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流し、細胞検出領域２２１となるとともに、さらに、マイクロ流路２４０を流下し、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ流路２４７を流下して細胞分離領域２２２となる状況を説明する図である。
【００４９】
ここで、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０５，２０５’を流下する細胞を含まない緩衝液を、マイクロ流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液と合流させる理由を説明する。細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４には、細胞を含まない緩衝液の流れる流路２０５，２０５’が細胞検出領域２２１の上流部で合流するが、それぞれの流路の最上流に設けられた穴２０１および２０２，２０２’は、共通の液位の緩衝液のリザーバ２０３に開口している。したがって、それぞれの流路を流下する緩衝液の流量は、流路の高さが同じであるから、流路幅に比例したものとなる。これらの緩衝液が合流するが、合流後の流路２４０の幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の幅と実質的に等しい幅を持つものとする。実質的に等しいとは、加工精度を考慮して等しいということで、厳密に等しいというわけではない。これにより、流路２０４を流下する緩衝液は流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって、一定の比率で中央部に押しやられるので、流路２０４では側壁に衝突しながら流れてくる細胞が、合流後の流路２４０中では側壁に衝突しなくなる。
【００５０】
細胞分離領域２２２におけるマイクロ流路２４７は、流路２４０と流路２０４’をそれぞれ流下する緩衝液が、それぞれの流れの層を維持しながら、同じ幅の流路を持っているかのように流下している。細胞検出領域２２１の流路２０４で流下する細胞を検出して、細胞分離領域２２２で、ゲルが流下する緩衝液と接触する連結部２４１と２４２により電界を作用させて分離するのである。
【００５１】
図３は、細胞検出領域２２１の上流部で、流路２０４を流下する緩衝液が流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって中央部に押しやられた結果の合流後の流路２４０の細胞分布を説明する図である。図において２５５は流路の側壁である。すなわち、幅２０μｍの流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液の流れが、幅１２μｍの流路２０５，２０５’を流下する緩衝液の流れによって、幅２０μｍの流路２４０の中央部に押しやられる状況を、横軸に流路２０４の位置、縦軸に細胞の出現頻度で示す図である。曲線３０１は、流路２０５，２０５’のそれぞれを流下する緩衝液が、流路２０４を流下する細胞を含む緩衝液細胞のほぼ半分、すなわち、流路２０５，２０５’の流路幅が流路２０４のほぼ半分である場合に、細胞が中央部のほぼ１０μｍの幅に分布することを示している。曲線３０２は流路２０５，２０５’の流路幅がより小さい場合の細胞分布、曲線３０３は流路２０５，２０５’を設けない場合の細胞分布をそれぞれ示す。曲線３０１から明らかなように、流路２０５，２０５’の流路幅を適切に設定することで、実質的に細胞を、流路壁から離して流すことができ、細胞が壁に衝突することを防止できる。
【００５２】
図３では、説明しなかったが、細胞分離領域２２２では流路２４０と流路２０４’とが合流する。したがって、図３に示す特性が、やや流路２０４’の流入する側に広がる傾向を示すが、流路２４０と流路２０４’を流下する緩衝液はそれぞれの流れの層を実質的に維持するので、それほど大きな変化はない。
【００５３】
ここで、図１では、流路２０４、２０４’、２０５および２０５’は、それぞれの全長で幅は等しいものとしたが、流路の抵抗を下げたいときは、リザーバ２０３に近い部分は幅を広げてよい。また、細胞分布を適切にするために流路幅を所定の幅にする長さは、例えば、１００μｍ程度有ればよいので、流路の抵抗を考慮して幅の広い範囲を長くしてよい。たとえば、細胞を含まない緩衝液の流れる側流を形成する流路２０５の流路幅を、細胞を含む緩衝液の流れる流路２０４の流路幅に比べ、広くし、且つ、所定の流路幅にする長さも短くすると、側流の流路２０５の流路抵抗は流路２０４に比べ小さくなる。その結果、合流後の流路２４０の、流路２０４からの液流幅を絞り込む働きが得られる。すなわち、図３の細胞分布曲線が、より先鋭なものとなる。
【００５４】
図４（Ａ）、（Ｂ）は流路の幅を広くすることに伴う問題と、その解決案の例を示す断面図である。図において、１０１は基板を示し、２６０は基板に形成された溝、４１０は溝２６０を覆うラミネートフィルムである。２０５は流路であり、溝２６０とこれを覆うラミネートフィルム４１０により形成される。図４（Ａ）に示すように、流路の幅を広くすると、流路２０５の幅の広い部分で、基板１０１にラミネートフィルムを圧着するときにラミネートフィルム４１０が溝２６０に落ち込んで、流路２０５をふさいでしまうことが起こる。これに対して、図４（Ｂ）では、溝２６０の幅の広い部分に梁４００を形成したものである。梁４００を設けることにより、ラミネートフィルムが溝２６０に落ち込んで流路２０５をふさぐことを防止できる。
【００５５】
図５は、図４で説明したリザーバ２０３と開口２０１，２０１’および流路２０４，２０４’の部分をより詳細に説明するために、図１のＡ−Ａ位置において、矢印方向に見た断面図である。チップ基板１０１の下面にはマイクロ流路２０４，２０４’に対応する溝が形成されていて、ラミネートフィルム４１０により覆われ、マイクロ流路２０４，２０４’が形成されている。マイクロ流路に細胞を含む試料緩衝液を導入する穴２０１がマイクロ流路２０４の最上流端に開けられ、細胞を含まない緩衝液を導入する穴２０１’がマイクロ流路２０４’の最上流端に開けられている。穴２０１を取り囲むように、穴２０１に注入された細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐため壁またはリザーバ２５０が設けられている。穴２０１’および穴２０１に注入された細胞を含む試料緩衝液の拡散を防ぐため壁またはリザーバ２５０、さらに、図５には表れない穴２０２，２０２’もリザーバ２０３内に設置される。リザーバ２０３内に緩衝液２００が満たされていて、すべての穴に緩衝液２００が供給されるから、マイクロ流路２０４，２０４’を流れる緩衝液の流量を、実質、同量にすることができる。また、マイクロ流路２０５、２０５’を流れる緩衝液の流量を、実質、同量にすることができる。さらに、マイクロ流路２０４とマイクロ流路２０５を流れる緩衝液の流量を所定比に安定に維持することができる。なお、穴２０１をすり鉢上にしたのは、試料細胞が流路２０４に確実に流入するようにするためである。また、壁２５０は図１に示すようにリザーバ２０３の中に配置する背の低い小型のリザーバ様のものでもよいし、単に仕切り板のような構造でもよい。なお、２３１はメンブレンフイルタであり、穴２０１の上面に設けられ、試料に含まれる塵を除く。壁２５０を設けることにより、細胞の分散を防げるので、穴２０１に直接細胞を含む試料緩衝液を注入しなくても良い。
【００５６】
各流路の最上流端に共通のリザーバを設ける構造は本発明の中核の一つをなすもので、共通の液面を有する構造にすることで複数の流路に同一の圧力で緩衝液を送ることができる構造で、基板上に組み込むことのできる最も簡単な構造の送液系である。さらに、各流路の送液物を区別するために、液面より背の低い仕切り板で仕切ることで種々緩衝液を異なる流路に同じ圧力で流すことができる。各仕切り板で仕切られた緩衝液には共通の液面を形成する緩衝液に比べて比重の高いものを用いれば、基本的にお互いが混ざり合うことは無い。また、細胞の場合はそれ自体が比重が高く、容器底面に沈むので基本的には問題ない。走化性の細胞では仕切り板を乗り越えることができない高さにすればよい。たとえば神経細胞などでは、数十μｍもあれば壁（仕切り板）を乗り越えることができないし、大腸菌のような細胞では、壁２５０の上に、緩衝液は自由に通り抜けることができるが細胞は通過できないようなスポンジ状の膜を設けることで細胞が他の流路に入り込むことを防止するのが良い。
【００５７】
（実施例２）
ゲル電極について具体的に説明する。ゲル電極部は、図１に示す、穴２０６，２０６’および２０７，２０７’、穴２０６と２０６’を結ぶマイクロ構造２０８、穴２０７，２０７’を結ぶマイクロ構造２０９と細胞分離領域２２２における液絡構造の連結部２４１，２４２のことを言う。射出成型でチップを作成した段階では、ゲル電極部にはゲルは含まれていない。ここでは電解質を含むアガロースゲルを電解液として使用するケースについて説明する。ゲルの組成はマイナス極側２０９、２４２に作成するのが０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２９６Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液、プラス電極側の２０８、２４１に作成するのが０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２８２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の組成を含む１％アガロースである。ｐＨが異なるのは電流を流したときに電気分解により気泡が発生する現象を防ぐためである。プラス極側で発生する水素イオンは水素分子になる前に高いｐＨの緩衝液で中和され、マイナス極側で発生するヒドロキシイオンは低いｐＨの緩衝液で中和され酸素分子の生成を阻害する。
【００５８】
なお、前記ゲル電極は糖類を含むゲル状物質からなるものとするのが良い。この場合、前記糖類は３％ないし５０％の非還元性二糖、１％ないし５０％のトレハロース、５％ないし３０％の濃度のグリセロール、５％ないし４０％の濃度のエチレングリコール、あるいは、５％ないし３０％の濃度のジメチルスルホキシドを含むものとするのが良い。
【００５９】
次に、射出成型でチップを作成し、穴２０６および２０７からゲルを注入して、ゲル電極付セルソーターチップを完成した後チップを使用しないで放置した状態を考える。ゲルは穴２０６と２０６’，２０７と２０７’の開放部、および、細胞分離領域２２２における流路と液絡構造の連結部２４１，２４２の部分で大気と接しているため、ここから乾燥が始まる。このため作成したゲル電極付セルソーターチップを保存するには下記のような工夫が必要である。まず、穴２０６と２０６’，２０７と２０７’の開放部からの乾燥防止は使用直前まで開口部にシールを貼ることで防げる。細胞分離領域２２２における流路と液絡構造の連結部２４１，２４２の部分では、ゲルが乾かないように水を含むシートとともに密閉容器中で保存することで、４℃で３ヶ月程度の保存が容易にできる。密閉容器としては空気部分をなるべく少なくするためにラミネートバックが適している。
【００６０】
さらに、乾燥を防ぎ長期保存を可能とするためにゲルには保湿剤を添加する。保湿剤としてはたとえば１％〜１０％程度のトレハロースやシュークロースなどの２糖類あるいはオリゴ糖、５％〜１０％程度のグリセリンを添加することで乾燥防止に効果がある。
【００６１】
さらに長期の保存にはゲル電極付セルソーターチップをラミネートバックに入れたまま凍結保存するのがよい。このときに問題となるのが、凍結時と融解時に氷晶ができてゲル構造を破壊する現象である。セルソーターチップのように微小な領域に作成するゲル電極で氷晶ができると、融解後にその部分が空洞となる。空洞ができると、電極に電界を印加したときに、空洞に細胞が入り込んだり、あるいは、入り込んだ細胞が不必要なときにセルソーターの流路に流れ出たりする問題が生じる。
【００６２】
これを防ぐには、ゲル電極部のゲルに氷の結晶成長を抑える物質を添加し、セルソーターチップを凍結状態で長期保存を可能にするのが本発明の最も重要な点である。結晶成長を抑える物質としては上記保湿材料と同様のものが利用できる。ゲル作成時にトレハロースやショ糖などの２糖類やオリゴ糖などを混ぜ込むのが最も有効である。このうちトレハロースは一般的な動物細胞に対してのファンクションは小さくきわめて有効である。濃度は１％でよい。上限濃度は５０％程度である。ショ糖でも効果が高いが、動物細胞に対してはバイオファンクションであることが考えられ、目的によっては不適切なケースがある。糖鎖の水酸基の一部を硫酸基に置き換えることで、凍結防止能を保持して生化学的な影響を低減できるので、これら２糖類の水酸基に硫酸基を導入して利用するとよい。このほかにグリセリンやエチレングリコールといった糖も効力がある。あるいはジメチルスルホキシドでも効果があるが、エチレングリコールやジメチルスルホキシドは細胞毒性が問題となるケースがあることを考慮しなければならないが、一般的にはセルソーティング流路に溶出するジメチルスルホキシドなどは微量なので無視できる。
【００６３】
具体的な実施例を示す。下記組成のカソード電解液とアノード電解液を電子レンジで過熱融解し緩衝液化させる。別途基板１０１を６０℃に加熱してあるホットプレートに乗せて加温する。緩衝液状態になっているカソード電解液とアノード電解液をシリンジで穴２０６、２０７に注入し、穴２０６’と２０７’から吸引し、マイクロ構造２０８、２０９と連結部２４１と２４２を満たす。連結部２４１と２４２には毛管現象で融解したゲルが入り込む。室温で１０分間放置することで、マイクロ構造２０８、２０９と連結部２２２と２４２内の緩衝液がゲル化する。流路２４７は連結部２４１と２４２に比べ断面積が広いので、ゲル緩衝液が入り込むことは無い。
【００６４】
改善されたゲル組成を示す。
マイナス電極液：１％トレハロース、０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２９６Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１％アガロース、
プラス電極液：１％トレハロース、０．２５Ｍ ＮａＣｌ，０．２８２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１％アガロース、
上記のように調製したゲル電極付セルソーターチップの表面を粘着性テープでシールする。多孔質プラスチックタオルであるプラセームに水を浸し、しぼった２ｃｍ角の断片をゲル電極付セルソーターチップとともに３０ｍｍ×４０ｍｍのプラスチックバックにいれシーラーを用いてバックの口をふさぐ。
【００６５】
この状態で４℃あるいは−２０℃で保存する。
【００６６】
作成直後の凍結前のチップ、１ヵ月後、３ヶ月後、６ヵ月後の４℃および−２０℃保存のチップの電極部の状態を、顕微鏡を用いて観察する。また、リザーバ２０３に培養液を添加し、流路２０４と２０５，２０５’に培養液を満たし、穴２０１に赤血球を添加し、ゲル電極に電解をかけたり、切ったりして細胞が流路２１８，２１９に振り分けられることを確認する。まず、作成直後のチップではマイクロ構造２０８、２０９と連結部２４１と２４２にゲルが満たされており、ひび割れたり、乾いたりの外的損傷は無い。ゲル電極に電界をかけると細胞分離領域２２２の流路を流れている赤血球が流路２１９に移り、穴２１２を介してリザーバ２１２’に貯まる。電界をかけなければリザーバ２１１’に貯まる。凍結したものは６ヵ月後においても作成直後と同様にゲル電極に電界をかけることでリザーバ２１２に、電界を切ることでリザーバ２１１に細胞を集めることができる。４℃保存に関しては顕微鏡観察すると３ヶ月目に連結部１０８と１０９にゲルの後退が見られるが、実際に細胞を流してみると、作成直後と同様に分離することができる。
【００６７】
図６は、ゲル電極部分が別の構造とされたセルソーターチップを平面図の形で示す図である。ここでは、図１の配線１０６および１０７と電解質を含むゲルを導入する穴に挿入した電極を、基板１０１の下面に貼り付けるラミネートフィルム４１０に蒸着した導電膜により実現するものである。ラミネートフィルム４１０は、基板１０１の下面に貼り付けられるものであるから、導電膜に形成した電極等は、チップの平面図では見えないが、ここでは、他の構成要素との関係が分かりやすいように、重ねて表示した。
【００６８】
図６の構造では、図１に示したマイクロ構造２０８，２０９に代えて、五角形状のマイクロ構造２０８，２０９とした。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９には、基板１０１に設けられた開口２０６，２０７が連通していて、この開口を通してゲルが注入される。２０６’，２０７’はマイクロ構造２０８，２０９に連通している空気抜きの開口である。ゲル注入時に、空気抜きの開口２０６’，２０７’からゲルが溢れる状態になれば、ゲル注入は終わりとすれば良い。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９の突出部には、連結部２４１，２４２が形成され、流路２４７を流れる緩衝液とゲルが接触できるようにされる。五角形状のマイクロ構造２０８，２０９に注入されたゲルと配線１０６および１０７に代える蒸着された導電膜１０６および１０７との十分な電気的接続を得るために、五角形状のマイクロ構造２０８，２０９に注入されたゲルが、適当な広さで、導電膜１０６および１０７の端部と接触する位置に、導電膜１０６および１０７は蒸着される。導電膜１０６および１０７の他の端部は、電源２１５に接続されるための端子を形成する。
【００６９】
ここで、ラミネートフィルム４１０は、基板１０１と貼り合わされるから、導電膜１０６および１０７の他の端部の端子は基板に隠されてしまう。図示しなかったが、この端子と接続され、基板１０１の表面で電源２１５と接続可能にするための構造が設けられる。
【００７０】
（実施例３）
図１のセルソーターチップ１００を用いて画像認識による細胞認識と分離のアルゴリズムを説明する。図１を参照しながら説明したように、細胞懸濁液は穴２０１に注入される。穴２０１の周辺には細胞懸濁液の拡散を防ぐための壁２５０が設けられている。壁２５０は、リザーバ２０３の中に作られ、穴２０１の液面は、リザーバ２０３の液面に等しい状態になっている。細胞は穴２０１から流路２０４に流れ、側流を形成する流路２０５と細胞検出領域２２１の前で合流する。これにより、細胞が流路の中心部に寄った状態を作れる（図３）。
【００７１】
流路２０４の細胞検出領域２２１を通過する細胞を、ＣＣＤカメラで撮像する。ＣＣＤカメラは、例えば、毎秒２００フレームで画像を取り込む能力のあるものを使用する。この撮影能力があれば、細胞検出領域２２１の流路を流下する緩衝液の流速が１ｍｍ／ｓｅｃ程度であっても、細胞単位で認識できる。
【００７２】
図７は、ＣＣＤカメラで取り込まれた画像から細胞を認識し、それぞれの細胞をナンバリングして識別するアルゴリズムを説明する図である。図７では、次々に取り込まれる画像をフレーム１，２，---，Ｎとして、それぞれのフレームに表れている細胞を表示している。フレーム１には黒丸で示す細胞のみが表れている。この黒丸で示す細胞を画像認識するとともにＮｏ．４２１とナンバリングする。次のフレーム２では、４２１細胞の他に白丸で示す細胞と星印で示す細胞が表れている。ここで、白丸で示す細胞と星印で示す細胞は、同時に、フレーム２に最初に現れている。これらの細胞を画像認識するとともに、下流側で最初に検出される細胞に若い番号をつける。ここでは白丸で示す細胞のほうが星印で示す細胞に比べて下流に出現しているので、白丸で示す細胞にＮｏ．４２２、星印で示す細胞にＮｏ．４２３とナンバリングする。次のフレーム３では、新しい細胞が認識されていない。フレーム２とフレーム３とを比較すると、４２２細胞は、細胞４２１および４２３細胞より移動速度が速いことが分かる。次のフレーム４でも、新しい細胞が認識されていない。４２２細胞は移動速度が速いのでフレーム４では、かろうじて現れている状態である。一方、細胞４２１および４２３細胞は、ほぼ同じ速度で移動していることが分かる。フレーム８まで認識できる。ここで、細胞の画像の認識は、指標として、各細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径に着目する。
【００７３】
このようにして、画像認識され、ナンバリングされた細胞の移動速度から、それぞれの細胞が細胞分離領域２２２（厳密には、連結部２４１，２４２）へ到達する時間を割りだし、連結部２４１のゲル電極にマイナス、連結部２４２の電極にプラスの電界をかけ、あるいは、電界をかけないで、細胞を回収用穴２１１と穴２１２に振り分ける。すなわち、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して予め入力した距離（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとして細胞を振り分ける。
【００７４】
(実施例４)
実施例４では、臓器組織をその表面から順次細胞を遊離させて、細胞層ごとに大まかに細胞を分離する前処理部と、細胞分離領域を一体化したチップ状デバイスとそれを用いる細胞分離の具体例を説明する。ここでは、内視鏡で採取した大腸ポリープ（直径３ｍｍ程度）をサンプルとしてセルソーティングにより平均的な細胞より大きな細胞を分離する。
【００７５】
図８は、実施例４のチップの平面図、図９は、図８のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。１０１は基板であり、基板下面には流路５０３が形成され、流路５０３の両端に開口を通して基板上面に設けたリザーバ５１２とリザーバ５０６と連通されている。流路５０３は基板下面に溝を掘った形で形成され、基板下面には、図４、図５で説明したのと同様に、ラミネートフィルム４１０が貼り付けられている。流路５０３の両端のリザーバ５１２，５０６は開口をあけた後に基板上面に貼り付ける形で作成される。また、流路５０３の途中には、フィルター５０４が設けられている。フィルター５０４は多数のピラー５０５が並んだ構造をしている。
【００７６】
基板１０１の下面には、基板１０１は、リザーバ５１２の下面に対応する位置に温調装置５２０が、流路５０３の下面に対応する位置に温調装置５２１が、それぞれ、設けられた基板１０２の上に載置される。それぞれの調温装置５２０，５２１は、リザーバ５１２、流路５０３を所定の異なる温度に保持している。それぞれの調温装置５２０，５２１の間には断熱のためにスリット５０１が設けてある。スリットは単なる切れ込みで空気の層になっていてもよいし、断熱性物質でできていてもよい。
【００７７】
使用に先立って、リザーバ５１２に所定量の緩衝液を入れ流路５０３を緩衝液で満たす。また、リザーバ５０７にはトリプシン活性を阻害するためのトリプシンインヒビターを含む緩衝液を入れる。次いで、リザーバ５１２に試料である組織断片５１０を入れ、リザーバ５１２内の緩衝液にピペット５２２を用いて、所定の量のトリプシンを含む液を加える。組織片表面の細胞マトリックスがトリプシンによって分解され、細胞５１１が組織断片５１０の表面から順次遊離する。調温装置５２０は、この処理が効率よく行われるように、リザーバ５１２を所定の温度に維持する。組織断片５１０の表面から遊離した細胞５１１は、リザーバ５１２と５０６の液面差による緩衝液の移動に応じて流路５０３に導かれる。流路５０３に設けられたフィルター５０４で、十分に分散していない細胞塊や構造物を除去し、分散した細胞をリザーバ５０６に導く。調温装置５２１は、流路５０３を細胞５１１が移動する際、トリプシンによる過剰な分解を防ぐために、流路５０３を所定の温度に維持する。
【００７８】
フィルター５０４とリザーバ５０６とを結ぶ流路にはリザーバ５０７に連なる流路が接続され、リザーバ５０７にはトリプシンインヒビターを含む緩衝液が入れられているから、フィルター５０４を通過した細胞５１１には、トリプシンインヒビターが作用する。そのため、細胞５１１はトリプシンの影響から開放されて安定な状態でリザーバ５０６に到達する。リザーバ５０６に到達した細胞５１１はピペット５２１で逐次回収できる。回収した分散細胞を実施例１で説明した図１記載のセルソーターチップ１００を用いて巨大細胞を分離する。あるサンプルでは、分離できる巨大細胞の８０％はがん化していることが判明する。なお、リザーバ５０７は一つでもよい。
【００７９】
図８、図９を参照して説明したチップ５００は、試料である組織片から経時的に剥離してくる分散細胞を順次分離するソーターの役割を担っていると言えるが、実施例１で説明した図１記載のセルソーターチップ１００の試料細胞を得るための前処理チップと見ることができる。
【００８０】
図１０はセルソーターチップの試料細胞を得るための前処理チップとして使用することに着目したチップの実施例を示す平面図である。図８と対比して明らかなように、リザーバ５１２内で試料である組織片から、細胞がトリプシン消化され、組織表面から分散細胞が流路５０３に流れ込み、フィルター５０４を通して流下し、リザーバ５０７からトリプシンインヒビターを含む緩衝液を供給されるのは、図８で説明したチップと同じである。
【００８１】
図１０に示すチップでは、流路５０３の最下流部５０３’で流路の先端が分岐している。さらに、分岐している各流路の末端は閉鎖されたリザーバ５０６−１〜５０６−４に連結されている。図９を参照して明らかなように、リザーバ５０６は上面が開放されている。これに対し、閉鎖されたリザーバとは、リザーバ上面がシールで覆われた構造をしており、このままでは流路から液が流れ込めない構造とされている。そのため、リザーバ上面のシールにピンで穴を明けると、穴が開いたリザーバにのみ流路から液が流入することになる。したがって、一つのリザーバに所定時間細胞を含む緩衝液回収した後、穴を粘着テープでふさぎ、次のリザーバのシールに穴を開け細胞を含む緩衝液を回収する、という操作を続けると、時系列的に分類した細胞を収集することができる。もっとも、最初から全てのリザーバをシールで閉鎖すると、最初に緩衝液を入れて流路を緩衝液で満たす操作ができない。したがって、一つのリザーバだけは開放しておくことが必要である。
【００８２】
図１０では、リザーバ５０６−１の上面シールに穴５３０−１を開けて細胞を含む緩衝液を回収し粘着テープ５３１で穴をふさぐ操作をした後、リザーバ５０６−２の上面シールに穴５３０−２を開けて細胞を含む緩衝液を回収している状態を示す。上面シールの穴を塞がれたときに分岐流路に残っている細胞は、そのまま分岐流路に残る。
【００８３】
(実施例５)
実施例５では、実施例４の前処理チップと実施例１記載のセルソーターチップを一体化したチップを用いることで、組織片をトリプシン処理し、組織片から順次細胞を分離するとともに、順次分散してくる細胞のうち特定の細胞群のみを回収することを可能としたセルソーターに関する。
【００８４】
図１１は、実施例５のセルソーターを模式的に示す平面図である。図１２（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、図１１のＣ−Ｃ，Ｄ−ＤおよびＥ−Ｅ位置で矢印方向に見た断面図である。図１１，１２において、既出の実施例で説明したものと同じもの、または、同等の機能を果たすものには同じ参照符号を付した。
【００８５】
６００は実施例５のセルソーターである。基板１０１の上には、トリプシン処理部６１０とセルソーティング部６５０が構築され、カスケードに接続されている。リザーバ６０１は６０２，６０３，６０４の三つの部屋に仕切られている。各部屋間の仕切り６０５の構造を図１２（Ａ）に示す。ここでは部屋６０２と６０３の関係で説明する。部屋６０２と６０３の仕切り６０５は、仕切り板６０５１，６０５２および６０５３で構成されている。各仕切り板６０５１，６０５２，６０５３は本実施例では１００μｍの間隔で配置され、仕切り板６０５１，と６０５３は部屋６０３の底面との間に１００μｍのギャップを持たせてある。したがって、部屋６０２と部屋６０３は１００μｍ幅の空間で連通したものとなっている。部屋６０３と６０４の仕切り６０５も同様である。三つの部屋の全体に緩衝液を入れる。このとき、液面が仕切り板６０５２の上面より高い位置で、６０５１，６０５３の上面より低い位置であることが重要である。液面の高さは１２から１５ｍｍである。
【００８６】
部屋６０２には、リザーバ５１２が構成されている。これは、図８で説明したリザーバ５１２と同じであるが、ここでは、部屋６０２に満たされた緩衝液の液面より低い高さ、例えば、１０ｍｍとする。リザーバ５１２内に組織片とトリプシン溶液をリザーバ５１２の体積の半分まで加える。トリプシン溶液はグリセリンで１．０４の比重をつけている。これで沈降しない組織片の場合は、比重を緩衝液と同じにして壁６１１の上面に厚さ１０μｍ程度のフィルターをのせる。これにより、リザーバ５１２内に存在する細胞やトリプシンが部屋６０２内にリークするのを防ぐ。それでも部屋６０２内にリークするトリプシンは部屋６０３に移行するのを防ぐ必要がある。仕切り板６０５はこのために設けられている。
【００８７】
セルソーター６００は、図９で説明したと同様の温調装置５２０，５２１が設けられている基板に載置されて使用されるが、図では、温調装置５２０，５２１が設けられている基板の表示は省略する。リザーバ５１２の下面には、流路５０３に連通する開口があり、図８で説明したように、フィルター５０４に連なっている。フィルター５０４の下流で、リザーバ５０７に連通する流路６２３，６２４が合流し、図８で説明したように、リザーバ５０７に入れられているトリプシンインヒビターを含む緩衝液が供給される。したがって、フィルター５０４を通過した細胞には、トリプシンインヒビターが作用し、細胞はトリプシンの影響から開放される。ここでは、リザーバ５０７は、部屋６０２と同様に、部屋６０３と仕切り板６０５で仕切られた部屋６０４内に設けられる。図１２（Ｂ）に部屋６０４とリザーバ５０７の部分を断面図で示す。部屋６０４は、仕切り板６１５で仕切られているから、部屋６０２と同様に、緩衝液の液面高さは、部屋６０２と同じである。また、リザーバ５０７は、リザーバ５１２と同じ高さとされ、リザーバ５１２の緩衝液の比重と同じ比重の緩衝液が入れられる。したがって、トリプシンインヒビターを含む緩衝液は、フィルター５０４の下流で、流路５０３を流下してきた細胞を含む緩衝液に合流し、細胞をトリプシンの影響から開放する。合流した緩衝液は、流路２０４を流下する。また、リザーバ５０７の下面には、図９で説明したように、温調装置５２１が設けられている。さらに、リザーバ５０７の上面には、リザーバ５１２と同様、必要に応じて、フィルター６０６が設けられる。
【００８８】
部屋６０２および部屋６０４は組織片をトリプシン処理し、組織片から順次細胞を分離するトリプシン処理部６１０を構成するとともに、セルソーティング部６５０に細胞を供給する機能を果たす。
【００８９】
一方、部屋６０３には、図１２（Ａ）に示すように、穴２０１’が設けられ、これに連通する流路２０４’が開口している。さらに、部屋６０３の部屋６０４より下流側に、穴２０２，２０２’が開けられ、これに、流路２０５，２０５’が連通している。これらの穴を介して、緩衝液が流路に供給される。流路２０４から供給される細胞を含む緩衝液、流路２０４’，２０５，２０５’から供給される緩衝液に対して構成されるシステムは、図６で説明したセルソーターと同じであり、セルソーティング部６５０を構成する。
【００９０】
流路２１８，２１９に得られる細胞を含む緩衝液は、リザーバ２１１，２１２で回収されるが、図１２（Ｃ）にリザーバ２１１，２１２を包括するリザーバ６６３について、Ｅ−Ｅ位置で矢印方向に見た断面図で示す。リザーバ６６３の緩衝液の液面は、部屋６０２−６０４の液面より低くされ、これが、流路を緩衝液が流下するときのエネルギーとなる。
【００９１】
図１２（Ａ）−（Ｃ）に示したように、基板１０１の下面は、ラミネートフィルム４１０で覆われ、基板１０１に掘られた溝を流路として閉じられたものとする。また、図６で説明したと同様に、配線１０６および１０７と電解質を含むゲルを導入する穴に挿入した電極をラミネートフィルムに蒸着した導電膜により実現することもできる。この場合は、図６で説明したと同様、ラミネートフィルム４１０は、基板１０１の下面に貼り付けられるものであるから、導電膜に形成した電極等は、チップの平面図では見えないが、ここでは、他の構成要素との関係が分かりやすいように、重ねて表示した。また、導電膜１０６および１０７の電源２１５に接続されるための端子を形成する端部が、基板１０１の表面で電源２１５と接続可能にするための構造が設けられる。
【００９２】
(実施例６)
実施例６は、実施例１の試料細胞の導入に工夫を施したものである。図１３は実施例６の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図であり、図１４（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、実施例６の試料細胞の導入部における工夫を説明するための部分的な断面図である。実施例１と同じ参照符号を付したものは同じものまたは同じ働きをするものである。
【００９３】
図１３と図１とを対比して明らかなように、実施例６のセルソーターは、実施例１の流路２０４をより上流部まで延長し、開口２９０を設けて、緩衝液を導入するようにした点において実施例１のセルソーターと異なるだけで、後は同じである。図１４（Ａ）から分かるように、流路２０４は開口２０１を通してリザーバ２５０に連通するのみならず、より上流まで延伸されて開口２９０とも連通している。
【００９４】
図１４（Ｂ）に、開口２０１および開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液および細胞を模式的に示したように、実施例６によれば、開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液の層によって、開口２０１から流路２０４に流入する緩衝液および細胞がラミネートフィルム４１０に接触することが阻止される。すなわち、開口２０１から流路２０４に流入する緩衝液および細胞は、開口２９０から流路２０４に流入する緩衝液の層の上を流れることになる。したがって、細胞がラミネートフィルム４１０に接触して、それが原因となる滞留を防止することができる。
【００９５】
図１４（Ｃ）は、開口２０１から流路２０４に流入する細胞が、ラミネートフィルム４１０に接触して、それが原因となる滞留を生じている様子を模視的に示すものである。細胞の一つがラミネートフィルム４１０に接触して、そこに留まるようなことが起こると、それに他の細胞が引っ掛かり、次々と細胞が溜まってしまって、遂には、細胞の流下が停止してしまうことになる。
【００９６】
実施例６の説明を、実施例１の流路２０４をより上流部まで延長した例で説明したが、これは、実施例４，５の流路５０３についても同様にできることは明らかである。すなわち、細胞を導入する位置よりも上流側で緩衝液を導入して、緩衝液の流れの層を形成しておいて、細胞を導入することで、細胞が流路の底面に接触するのを防止するのである。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。
【図２】マイクロ流路２０４の細胞を含む緩衝液に、マイクロ流路２０５，２０５’の緩衝液が合流して、マイクロ流路２４０を流下し、細胞検出領域２２１の直前で、マイクロ流路２０４’を流下する緩衝液と合流してマイクロ２４０を流下する状況を説明する図である。
【図３】（Ａ）は、流路２０４を流下する緩衝液が流路２０５，２０５’を流下する緩衝液によって中央部に押しやられた結果の合流後の流路２４０の細胞分布を示す図、（Ｂ）は、合流後の流路２４０を流下する緩衝液が流路２０４’を流下する緩衝液と合流した結果の合流後の細胞検出領域２２１における流路内の細胞分布を示す図である。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）は流路の幅を広くすることに伴う問題と、その解決案の例を示す断面図である。
【図５】図４で説明したリザーバ２０３と開口２０１，２０１’および流路２０４，２０４’の部分をより詳細に説明するために、図１のＡ−Ａ位置において、矢印方向に見た断面図である。
【図６】ゲル電極部分が別の構造とされたセルソーターチップを平面図の形で示す図である。
【図７】ＣＣＤカメラで取り込まれた画像から細胞を認識し、それぞれの細胞をナンバリングして識別するアルゴリズムを説明する図である。
【図８】実施例４のチップの平面図である。
【図９】図８のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図１０】セルソーターチップの試料細胞を得るための前処理チップとして使用することに着目したチップの実施例を示す平面図である。
【図１１】実施例５のセルソーターを模式的に示す平面図である。
【図１２】（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、図１１のＣ−Ｃ，Ｄ−ＤおよびＥ−Ｅ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図１３】実施例６の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す平面図である。
【図１４】（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、実施例６の試料細胞の導入部における工夫を説明するための部分的な断面図である。
【符号の説明】
【００９８】
１００…セルソーター、１０１…基板、１０６，１０７…配線、２０１，２０１’，２０２，２０２’，２０６，２０７…穴、２０６’，２０７’…空気抜き、２０３，２１３，５０６，５０７，５１２…リザーバ、２０４，２０４’，２０５，２０５’，２４０，２１８，２１９，２４７，５０３…流路、２０８，２０９…マイクロ構造、２１５…電源、２１６…スイッチ、２２１…細胞検出領域、２２２…細胞分離領域、２３０，５０４…フィルター、２４１，２４２…連結部、２５０…壁、２６０…溝、４１０，５２３…ラミネートフィルム、４２１，４２２，４２３…細胞像、５０５…ピラー、５２０，５２１…温調装置、５１０…組織断片、５２１，５２２…ピペット、５３１…粘着テープ、６００…セルソーター、６０１，６０２，６０３…部屋、６０５１，６０５２，６０５３…仕切り板、６０６…フィルター、６６３…リザーバ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板、該基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、前記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、前記第４の流路に前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けるとともに、前記第１の流路から第４の流路を流下する緩衝液が共通の液面位置を有するリザーバから供給され、前記第１の流路と第４の流路の幅あるいは断面積が実質的に等しい構造を有することを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項２】
前記四つの流路に加えて、第４の流路に合流する緩衝液を流下させる第５の流路を有し、前記第１の流路と第４の流路を加えた流路長と第５の流路長が実質等しく、前記第５の流路を流下する緩衝液が前記共通のリザーバから供給され、前記細胞検出領域および細胞分離領域が前記第５の流路の緩衝液合流位置より下流に設けられるとともに、前記第２及び第３の流路長が実質等しい請求項１記載の細胞分離チップ。
【請求項３】
前記細胞分離領域は、流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配される請求項１または２記載の細胞分離チップ。
【請求項４】
前記第１の流路に細胞を含む試料を供給するための緩衝液を保持する第１のリザーバ、前記第２の流路に細胞を含まない緩衝液を供給するための第２のリザーバを有し、前記第１のリザーバが第２のリザーバと共通の液面高さを維持するサイホンでつながれた、もしくは、前記第１のリザーバと第２のリザーバの底面部分が独立し、上部が共通に連結した構造である請求項１または２記載の細胞分離チップ。
【請求項５】
前記ゲル電極が糖類を含むゲル状物質からなる請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項６】
前記糖類が３％ないし５０％の非還元性二糖である請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項７】
前記糖類が１％ないし５０％のトレハロースである請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項８】
前記糖類が５％ないし３０％の濃度のグリセロールを含む請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項９】
前記糖類が５％ないし４０％の濃度のエチレングリコールを含む請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１０】
前記糖類が５％ないし３０％の濃度のジメチルスルホキシドを含む請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１１】
陽極側のゲル電極のゲル状物質の組成が中性より高いｐＨで、陰極側のゲル電極では中性より低いｐＨの組成の緩衝液からなる請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１２】
陽極側のゲル電極の組成がｐＨ８から９の緩衝液を含み、陰極側のゲル電極がｐＨ５から６の組成の緩衝液からなる請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１３】
基板、該基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、前記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、前記第４の流路に前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けた細胞分離装置であって、前記細胞検出領域は流路中を流れる細胞の所定区間を撮像して細胞検出領域に連続して流れ込む細胞画像を所定時間毎に連続して取得し、各細胞が最初に現れる画像上において各細胞をナンバリングし、それらの、それぞれの細胞の画像を認識し、サイズや形状などの指標を用いて判定を行い、ナンバリングされ判定された細胞が出現するすべての画像における細胞像を追跡することを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項１４】
前記所定時間毎に連続して取得した画像から、複数の細胞が同時に１枚の画像に現れ、かつ、前記複数の細胞のいずれもが以前の画像に現れない場合、最初に前記複数の細胞が現れる画像の流路の下流側の細胞から順に各細胞をナンバリングし、かつ、そのそれぞれの細胞の画像を認識し、サイズや形状などの指標を用いて判定を行い、ナンバリングされ判定された細胞が出現するすべての画像における細胞像を追跡する請求項１３記載の細胞分離チップ。
【請求項１５】
前記指標が各細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径の一つまたは組み合わせである請求項１３または１４記載の細胞分離チップ。
【請求項１６】
前記細胞画像を所定時間毎に経時的に取得する画像取り込み速度が毎秒２００フレーム以上である請求項１３または１４記載の細胞分離チップ。
【請求項１７】
前記細胞分離領域は、流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞検出領域で検出した細胞に対応して、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配される請求項１３記載の細胞分離チップ。
【請求項１８】
前記細胞分離領域の二つのゲル電極は、前記細胞検出領域で所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して予め入力した距離（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとされた電圧を印加するものである請求項１７記載の細胞分離チップ。
【請求項１９】
緩衝液中に臓器組織片を保持し、該組織に所定の処理剤を作用させて前記組織片を構成する細胞を剥離させる反応容器、前記容器底面から延長され前記処理剤を含む緩衝液とともに細胞を流下させる第１の流路、該第１の流路を流下する細胞に作用して前記細胞の剥離のための処理剤の作用を停止させる処理剤を含む緩衝液を前記第１の流路に合流させる第２の流路、該第２の流路の合流位置より下流に位置し、前記第１の流路と第２の流路の合流した第３の流路内を流下してくる細胞を任意の時間ごとに採取する複数の流路からなる細胞分離チップ。
【請求項２０】
基板、該基板上に構成され、緩衝液中に臓器組織片を保持し、該組織に所定の処理剤を作用させて前記組織片を構成する細胞を剥離させる反応容器、該容器底面から延長され前記処理剤を含む緩衝液とともに細胞を流下させる第１の流路、該第１の流路を流下する細胞に作用して前記細胞の剥離のための処理剤の作用を停止させる処理剤を含む緩衝液を前記第１の流路に合流させる第２の流路、該第２の流路の合流位置より下流に位置し、前記第１の流路と第２の流路の合流した第３の流路内を流下してくる細胞を認識するための細胞検出領域、該細胞検出領域の下流に設けられ、該細胞検出領域で検出した細胞を前記細胞検出領域での細胞の認識結果に応じて振り分ける細胞分離領域、該細胞分離領域の下流に設けられ、該細胞分離領域で振り分けられた細胞を選択的に流下させる第４、第５の流路を備え、前記細胞分離領域は、細胞分離領域を構成する流路の対向する側壁のそれぞれに対向する二つのゲル電極を備え、前記細胞検出領域で検出した細胞に対応して、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、前記第４、第５の流路に細胞を配分することを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項２１】
前記第１の流路に所定のサイズ以下の細胞のみを通過させるピラー群により構成されたフィルターを備える請求項１９または２０記載の細胞分離チップ。
【請求項２２】
前記ピラー群が流路内の断面方向に対して傾斜した角度の線上に並んだ構造をしている請求項２１記載の細胞分離チップ。
【請求項２３】
前記反応容器と第１の流路部位とをそれぞれ異なる温度に保つ温調器を有する１９または２０記載の細胞分離チップ。
【請求項２４】
基板、該基板上に構成され、緩衝液中に臓器組織片を保持し、該組織に所定の試薬を作用させて前記組織片を構成する細胞を分散させる第１の容器、該第１の容器底面から延長され前記試薬を含む緩衝液とともに細胞を流下させる第１の流路、前記細胞を分散させる試薬の阻害剤を保持する第２の容器、該第２の容器底面から延長され前記阻害剤を含む緩衝液を流下させ、前記第１の流路を流下する細胞に作用して前記細胞の分散のための試薬の作用を停止させる阻害剤を含む緩衝液を前記第１の流路に合流させる第２の流路、該第２の流路の合流位置より下流に位置し、前記第１の流路と第２の流路の合流した第３の流路内を流下してくる細胞を含む緩衝液の流れを両側から挟みこむように緩衝液を合流させる第４および第５の流路、該第４および第５の流路と前記第３の流路の合流した第６の流路、該第６の流路の下流に位置し、前記第６の流路を流下してくる細胞を認識するための細胞検出領域、該細胞検出領域の下流に設けられ、該細胞検出領域で検出した細胞を前記細胞検出領域での細胞の認識結果に応じて振り分ける細胞分離領域、該細胞分離領域の下流に設けられ、該細胞分離領域で振り分けられた細胞を選択的に流下させる第７および第８の流路を備えるとともに、緩衝液を供給する第３の容器を備え、該第３の容器は、前記第１の容器および第２の容器を包括して共通の液面の緩衝液を供給するものであり、且つ、前記第４および第５の流路は、前記第３の容器から緩衝液を供給されるものであることを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項２５】
前記細胞検出領域は前記第６の流路中を流れる細胞の所定区間を撮像して細胞検出領域に連続して流れ込む細胞画像を所定時間毎に連続して取得し、各細胞が最初に現れる画像上において各細胞をナンバリングし、それらの、それぞれの細胞の画像を認識し、サイズや形状などの指標を用いて判定を行い、ナンバリングされ判定された細胞が出現するすべての画像における細胞像を追跡する請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２６】
前記細胞分離領域は、前記第６の流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞検出領域で検出した細胞に対応して、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配される請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２７】
前記第１の容器および第２の容器は前記第３の容器と緩衝液は連通するが、前記第１の容器および第２の容器内の溶液が前記第３の容器に混入するのを防止するための仕切り壁で分離されている請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２８】
前記第７および第８の流路に振り分けられた細胞を選択的に導入する領域を有する細胞回収用容器を備え、該細胞回収用容器は、細胞を選択的に導入する領域を区分する仕切り壁で分離されるとともに、該仕切り壁より高い液位の緩衝液で連通されている請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２９】
前記第１の流路を、該第１の流路のより上流に延長して前記共通の液面位置を有するリザーバに連通させた請求項１，１３，１９，２０および２４のいずれかに記載の細胞分離チップ。
【請求項１】
基板、該基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、前記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、前記第４の流路に前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けるとともに、前記第１の流路から第４の流路を流下する緩衝液が共通の液面位置を有するリザーバから供給され、前記第１の流路と第４の流路の幅あるいは断面積が実質的に等しい構造を有することを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項２】
前記四つの流路に加えて、第４の流路に合流する緩衝液を流下させる第５の流路を有し、前記第１の流路と第４の流路を加えた流路長と第５の流路長が実質等しく、前記第５の流路を流下する緩衝液が前記共通のリザーバから供給され、前記細胞検出領域および細胞分離領域が前記第５の流路の緩衝液合流位置より下流に設けられるとともに、前記第２及び第３の流路長が実質等しい請求項１記載の細胞分離チップ。
【請求項３】
前記細胞分離領域は、流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配される請求項１または２記載の細胞分離チップ。
【請求項４】
前記第１の流路に細胞を含む試料を供給するための緩衝液を保持する第１のリザーバ、前記第２の流路に細胞を含まない緩衝液を供給するための第２のリザーバを有し、前記第１のリザーバが第２のリザーバと共通の液面高さを維持するサイホンでつながれた、もしくは、前記第１のリザーバと第２のリザーバの底面部分が独立し、上部が共通に連結した構造である請求項１または２記載の細胞分離チップ。
【請求項５】
前記ゲル電極が糖類を含むゲル状物質からなる請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項６】
前記糖類が３％ないし５０％の非還元性二糖である請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項７】
前記糖類が１％ないし５０％のトレハロースである請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項８】
前記糖類が５％ないし３０％の濃度のグリセロールを含む請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項９】
前記糖類が５％ないし４０％の濃度のエチレングリコールを含む請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１０】
前記糖類が５％ないし３０％の濃度のジメチルスルホキシドを含む請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１１】
陽極側のゲル電極のゲル状物質の組成が中性より高いｐＨで、陰極側のゲル電極では中性より低いｐＨの組成の緩衝液からなる請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１２】
陽極側のゲル電極の組成がｐＨ８から９の緩衝液を含み、陰極側のゲル電極がｐＨ５から６の組成の緩衝液からなる請求項３記載の細胞分離チップ。
【請求項１３】
基板、該基板上に構成される細胞を含む緩衝液を流下させるための第１の流路、該第１の流路を挟み該第１の流路の両側から細胞を含まない緩衝液を流下させる第２及び第３の流路、前記第１の流路の緩衝液と第２および第３の流路の緩衝液が合流して１本の流路となって緩衝液を流下させる第４の流路、前記第４の流路に前記緩衝液とともに流下する細胞を検出する細胞検出領域および検出した細胞に応じて細胞を分離する細胞分離領域をカスケードに設け、該細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路を設けた細胞分離装置であって、前記細胞検出領域は流路中を流れる細胞の所定区間を撮像して細胞検出領域に連続して流れ込む細胞画像を所定時間毎に連続して取得し、各細胞が最初に現れる画像上において各細胞をナンバリングし、それらの、それぞれの細胞の画像を認識し、サイズや形状などの指標を用いて判定を行い、ナンバリングされ判定された細胞が出現するすべての画像における細胞像を追跡することを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項１４】
前記所定時間毎に連続して取得した画像から、複数の細胞が同時に１枚の画像に現れ、かつ、前記複数の細胞のいずれもが以前の画像に現れない場合、最初に前記複数の細胞が現れる画像の流路の下流側の細胞から順に各細胞をナンバリングし、かつ、そのそれぞれの細胞の画像を認識し、サイズや形状などの指標を用いて判定を行い、ナンバリングされ判定された細胞が出現するすべての画像における細胞像を追跡する請求項１３記載の細胞分離チップ。
【請求項１５】
前記指標が各細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径の一つまたは組み合わせである請求項１３または１４記載の細胞分離チップ。
【請求項１６】
前記細胞画像を所定時間毎に経時的に取得する画像取り込み速度が毎秒２００フレーム以上である請求項１３または１４記載の細胞分離チップ。
【請求項１７】
前記細胞分離領域は、流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞検出領域で検出した細胞に対応して、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配される請求項１３記載の細胞分離チップ。
【請求項１８】
前記細胞分離領域の二つのゲル電極は、前記細胞検出領域で所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して予め入力した距離（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとされた電圧を印加するものである請求項１７記載の細胞分離チップ。
【請求項１９】
緩衝液中に臓器組織片を保持し、該組織に所定の処理剤を作用させて前記組織片を構成する細胞を剥離させる反応容器、前記容器底面から延長され前記処理剤を含む緩衝液とともに細胞を流下させる第１の流路、該第１の流路を流下する細胞に作用して前記細胞の剥離のための処理剤の作用を停止させる処理剤を含む緩衝液を前記第１の流路に合流させる第２の流路、該第２の流路の合流位置より下流に位置し、前記第１の流路と第２の流路の合流した第３の流路内を流下してくる細胞を任意の時間ごとに採取する複数の流路からなる細胞分離チップ。
【請求項２０】
基板、該基板上に構成され、緩衝液中に臓器組織片を保持し、該組織に所定の処理剤を作用させて前記組織片を構成する細胞を剥離させる反応容器、該容器底面から延長され前記処理剤を含む緩衝液とともに細胞を流下させる第１の流路、該第１の流路を流下する細胞に作用して前記細胞の剥離のための処理剤の作用を停止させる処理剤を含む緩衝液を前記第１の流路に合流させる第２の流路、該第２の流路の合流位置より下流に位置し、前記第１の流路と第２の流路の合流した第３の流路内を流下してくる細胞を認識するための細胞検出領域、該細胞検出領域の下流に設けられ、該細胞検出領域で検出した細胞を前記細胞検出領域での細胞の認識結果に応じて振り分ける細胞分離領域、該細胞分離領域の下流に設けられ、該細胞分離領域で振り分けられた細胞を選択的に流下させる第４、第５の流路を備え、前記細胞分離領域は、細胞分離領域を構成する流路の対向する側壁のそれぞれに対向する二つのゲル電極を備え、前記細胞検出領域で検出した細胞に対応して、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、前記第４、第５の流路に細胞を配分することを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項２１】
前記第１の流路に所定のサイズ以下の細胞のみを通過させるピラー群により構成されたフィルターを備える請求項１９または２０記載の細胞分離チップ。
【請求項２２】
前記ピラー群が流路内の断面方向に対して傾斜した角度の線上に並んだ構造をしている請求項２１記載の細胞分離チップ。
【請求項２３】
前記反応容器と第１の流路部位とをそれぞれ異なる温度に保つ温調器を有する１９または２０記載の細胞分離チップ。
【請求項２４】
基板、該基板上に構成され、緩衝液中に臓器組織片を保持し、該組織に所定の試薬を作用させて前記組織片を構成する細胞を分散させる第１の容器、該第１の容器底面から延長され前記試薬を含む緩衝液とともに細胞を流下させる第１の流路、前記細胞を分散させる試薬の阻害剤を保持する第２の容器、該第２の容器底面から延長され前記阻害剤を含む緩衝液を流下させ、前記第１の流路を流下する細胞に作用して前記細胞の分散のための試薬の作用を停止させる阻害剤を含む緩衝液を前記第１の流路に合流させる第２の流路、該第２の流路の合流位置より下流に位置し、前記第１の流路と第２の流路の合流した第３の流路内を流下してくる細胞を含む緩衝液の流れを両側から挟みこむように緩衝液を合流させる第４および第５の流路、該第４および第５の流路と前記第３の流路の合流した第６の流路、該第６の流路の下流に位置し、前記第６の流路を流下してくる細胞を認識するための細胞検出領域、該細胞検出領域の下流に設けられ、該細胞検出領域で検出した細胞を前記細胞検出領域での細胞の認識結果に応じて振り分ける細胞分離領域、該細胞分離領域の下流に設けられ、該細胞分離領域で振り分けられた細胞を選択的に流下させる第７および第８の流路を備えるとともに、緩衝液を供給する第３の容器を備え、該第３の容器は、前記第１の容器および第２の容器を包括して共通の液面の緩衝液を供給するものであり、且つ、前記第４および第５の流路は、前記第３の容器から緩衝液を供給されるものであることを特徴とする細胞分離チップ。
【請求項２５】
前記細胞検出領域は前記第６の流路中を流れる細胞の所定区間を撮像して細胞検出領域に連続して流れ込む細胞画像を所定時間毎に連続して取得し、各細胞が最初に現れる画像上において各細胞をナンバリングし、それらの、それぞれの細胞の画像を認識し、サイズや形状などの指標を用いて判定を行い、ナンバリングされ判定された細胞が出現するすべての画像における細胞像を追跡する請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２６】
前記細胞分離領域は、前記第６の流路の両側に対向し、かつ、緩衝液の流れに対して位置をずらして配置された電解質を含むゲルからなる二つのゲル電極の開口部が設けられ、前記細胞検出領域で検出した細胞に対応して、前記細胞分離領域において二つのゲル電極間に所定の電流を流した場合と流さない場合に応じて、細胞が前記細胞分離領域の下流に分離された細胞を流下させる二つの流路に分配される請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２７】
前記第１の容器および第２の容器は前記第３の容器と緩衝液は連通するが、前記第１の容器および第２の容器内の溶液が前記第３の容器に混入するのを防止するための仕切り壁で分離されている請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２８】
前記第７および第８の流路に振り分けられた細胞を選択的に導入する領域を有する細胞回収用容器を備え、該細胞回収用容器は、細胞を選択的に導入する領域を区分する仕切り壁で分離されるとともに、該仕切り壁より高い液位の緩衝液で連通されている請求項２４記載の細胞分離チップ。
【請求項２９】
前記第１の流路を、該第１の流路のより上流に延長して前記共通の液面位置を有するリザーバに連通させた請求項１，１３，１９，２０および２４のいずれかに記載の細胞分離チップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００６−１８０８１０（Ｐ２００６−１８０８１０Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３７９３２７（Ｐ２００４−３７９３２７）
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５２８１０２３）株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０５２８１０２３）株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ (8)
【Ｆターム（参考）】
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