細胞貯蔵培地
本発明は特に貯蔵中に細胞の生存率が維持される特にヒト細胞の貯蔵方法、細胞貯蔵用の細胞培地並びにこのような細胞貯蔵用細胞培地の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は貯蔵中に細胞の生存率が維持される、特にヒト細胞の貯蔵方法、細胞貯蔵用細胞培地及び細胞の貯蔵のためのこのような細胞培地の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
凍結保存は長期間にわたり生細胞を貯蔵するためにしばしば使用される方法である。凍結保存技術はここ数十年の間に絶えず開発され、改善されてきた。例えば臓器から単離した直後又は凍結の前もしくは凍結保存の後の細胞の解凍の際又はその後には、細胞を短期間貯蔵することが必要になる。こうした貯蔵の後に細胞を生体、特にヒトに再びそのまま投与することがしばしば必要である。この細胞投与は例えば細胞の静脈内適用によって行うことができる。特に凍結保存により貯蔵した細胞のヒトへの適用は、とりわけ臨床適用、特に治療的適用として利用することができる。例えば治療的適用のためにヒト肝細胞移植物を静脈内適用することができる。ところが凍結過程及び再解凍過程、並びに先行の又は直後のin vitro貯蔵は、特に臨床適用の場合、貯蔵される細胞の生存率及び生存細胞数に関してなお問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の根底にあるのは、動物細胞、とりわけヒト細胞、特に肝細胞又は肝細胞移植物の貯蔵のための、簡単に製造できるなるべく安価な細胞培地を提供するという技術的課題である。とりわけ凍結保存に関連して、凍結の前及び／又は解凍の後には細胞を貯蔵しなければならない。そこで本発明の根底にあるのは、細胞の生存率及び生存細胞数の損失をなるべく少なくして、動物細胞、とりわけヒト細胞、中でも肝細胞又は肝細胞移植物の短時間貯蔵を可能にし、そのため周知の細胞培地の代替物となりうる細胞培地を提供するという技術的課題である。
【０００４】
凍結保存に関連して、貯蔵及び再解凍のための細胞培地は周知である。しかしこの細胞培地は５〜２０％のウシ胎児血清（FCS）のような、ヒトへの適用、特に静脈内適用が法的に許されず、又は不適当でさえある成分を含む。そこでさらに本発明の根底には、細胞、とりわけヒト細胞、特に肝細胞又は肝細胞移植物の生存率及び生存細胞数の僅かな損失で動物、特にヒトへの細胞の安全な適用を可能にする培地を提供するという技術的課題がある。
【０００５】
例えばCustodiol（登録商標）は、初めに凍結保存され、解凍された細胞、例えば肝細胞の貯蔵のための細胞培地として効果的に使用され、臓器全体の臓器移植用の保存液として開発されたものである。ところがCustodiol（登録商標）はヒトの静脈内適用には法的に許されていない。そこでさらに本発明の根底には、ヒトへの静脈内適用が許可される、従って解凍の後に手数のかかる、生存細胞数を減少させる洗浄工程なしで、細胞をこの細胞培地でヒトに静脈内適用することができる、特に凍結保存に関連した細胞の短期貯蔵のための細胞培地を提供するという技術的課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は基本的には特許請求の範囲に記載の動物又はヒト細胞の短期間貯蔵のための方法を提供することによって、根底にある技術的課題を解決する。特に塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウムを含む塩溶液及び／又はリンガー乳酸塩溶液及び／又はリン酸緩衝化生理食塩水を含む塩溶液から選ばれた塩溶液、及び／又は高分子糖類、特にヒドロキシエチルデンプンの水溶液、並びにグルコース、さらには血清アルブミン及び／又は血漿を含む、液体細胞培地に細胞を収容し、この細胞培地中で細胞を貯蔵する方法を提供することが好ましい。
【０００７】
好ましい実施形態では、動物細胞は哺乳動物細胞である。例えばブタ、ウシ又はマウス細胞が挙げられる。とりわけヒト細胞が挙げられる。本発明によれば、細胞は細胞懸濁液及び細胞移植物をも意味する。細胞は１つの種類であってもよいが、様々な種類の細胞の組成物又は共存培養物を使用することもできる。
【０００８】
本発明に基づき動物細胞は治療的適用のための細胞であることが好ましい。別の好ましい実施形態では動物細胞はin vitro培養のための細胞である。動物細胞は例えば肝実質細胞、膵島、軟骨細胞（chondrocyte）、軟骨細胞（cartilage cell）、神経細胞、角化細胞又はリンパ球であってよい。細胞培地に貯蔵するための細胞はとりわけ肝細胞、特に肝実質細胞である。
【０００９】
本発明に関連して肝細胞とは、主として肝実質細胞からなる細胞混合物を意味する。但し様々な数量分のリンパ球、内皮細胞及びその他の非実質細胞群を含んでもよい。
【００１０】
栓球（血小板ともいう）の解凍及び／又は貯蔵は本発明から除外する。栓球は本発明の意味の動物細胞ではない。
【００１１】
本発明に関連して短時間貯蔵とは、２４時間以下、特に１０時間以下、とりわけ５時間以下、特に３時間以下の期間にわたる、本発明に基づく培地でのin vitro貯蔵を意味する。
【００１２】
凍結保存とは０℃以下、特に−２０℃〜−２００℃での細胞のたいてい長期の貯蔵を意味する。凍結は通常１℃/分の速度で行われる。
【００１３】
本発明に関連して細胞培地（培地、解凍培地又は栄養培地ともいう）とは、特に液状の水溶液を意味する。細胞培地はなるべく多い生存細胞数、即ちなるべく低い細胞死亡率及びなるべく高い生存能力又は生存率（当業者にはviabilityとしても知られている）を維持する生細胞のin vitro貯蔵のために利用される。
【００１４】
本発明に基づき使用される細胞培地の成分は、動物生体とりわけヒト生体への適用、特に静脈内適用が法的に許可されているものであることが好ましい。本発明によれば本発明に基づく培地で貯蔵した後の細胞を臨床適用、特に治療的適用、又はin vitro試験のために使用することができる。
【００１５】
本発明に関連して塩溶液とは、１つ又は複数の塩の水溶液を意味する。本発明に基づき好ましい塩溶液は塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウムを含み、それらの塩は水に溶解されている。利用される水は注射用の無菌水、とりわけ脱イオン水である。
【００１６】
本発明に基づき好ましい塩溶液はComposol（登録商標）又はComposol（登録商標）の組成に相当する溶液である。Composol（登録商標）は塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム六水和物及びクエン酸ナトリウムの水溶液である。１７３mmol/lのナトリウム、５mmol/lのカリウム、１．５mmol/lのマグネシウム、９８mmol/lの塩化物、１０．９mmol/lのクエン酸塩、２７mmol/lの酢酸塩及び２３mmol/lのグルコン酸塩を含み、とりわけ上記からなるものが好ましい。
【００１７】
そこで本発明に基づき塩溶液は０．４５〜０．６０重量％、特に０．５３重量％の塩化ナトリウム、０．４５〜０．５５重量％、とりわけ０．５０重量％のグルコン酸ナトリウム、０．２０〜０．２５重量％、とりわけ０．２２重量％の酢酸ナトリウム、０．０３〜０．０４重量％、とりわけ０．０３７重量％の塩化カリウム、０．０２５〜０．０３５重量％、とりわけ０．０３１重量％の塩化マグネシウム六水和物及び０．３１〜０．３３重量％、とりわけ０．３２重量％のクエン酸ナトリウムを含み、とりわけ上記からなることが好ましい。塩溶液は７．０〜７．４、とりわけ７．２のpH値を有することが好ましい。
【００１８】
別の実施形態では、塩溶液はリンガー乳酸塩溶液である。リンガー乳酸塩溶液の慣用の組成は当業者に周知である。リンガー乳酸塩溶液は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含む水溶液である。本発明に基づき使用されるリンガー乳酸塩溶液は７．０〜７．４、とりわけ７．２のpH値を有する。
【００１９】
別の実施形態では塩溶液はリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）である。PBSの慣用の組成は当業者に周知である。本発明に基づき使用されるPBSは７．０〜７．４、とりわけ７．２のpH値を有する。
【００２０】
別の実施形態では少なくとも１つの高分子糖類の水溶液が培地の成分である。本発明に基づく高分子糖類は例えばデキストラン、さらにはデキストラン溶液、例えばパーファデックス（Perfadex）、ヒドロキシエチルデンプン（HES）及びヒドロキシエチルデンプンの誘導体である。本発明に基づき高分子糖類としてヒドロキシエチルデンプンを使用することが好ましい。
【００２１】
本発明に基づき固形の又は水溶液としての細胞培地にグルコースを加える。
【００２２】
本発明に基づき血清アルブミンは細胞培地に溶解され、又は液状で加えられる。血清アルブミンは例えばウシ胎児血清（FCS）、ウシ血清アルブミン（BSA）又はヒト血清アルブミン（HAS）である。本発明によれば、ヒト血清アルブミンが好ましい。これはヒトへの静脈内適用が許可されているからである。
【００２３】
別の実施形態では血清アルブミンを血漿に替え、又は血漿を補充する。本発明に基づきヒト血漿、とりわけ自己血漿が好ましい。特に血漿及び／又はHSAは凍結保護剤としてとりわけ単独で又は他の周知の凍結保護剤、特にDMSOと組み合わせて使用される。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、本発明に基づき使用される培地はアミノ酸、ホルモン、ビタミン、プロビタミン及び抗アポトーシス作用物質から選ばれる少なくとも１つの別の成分を含む。
【００２５】
当業者は本発明の教示によって、培地組成物の成分を本発明に従って本発明に基づく濃度で使用するように促されるが、上記の成分を使用分野に応じてその専門知識に従って選択するであろう。
【００２６】
本発明に基づく方法はpH値６．４〜８、とりわけ７．０〜７．４、特に７．２の上記の細胞培地で行うことが好ましい。
【００２７】
細胞は凍結保存から解凍した後に本発明に基づく細胞培地で洗浄し、保存培地及び本発明に基づく細胞培地から分離し、その上で新しい本発明に基づく貯蔵用細胞培地に収容することが好ましい。その分離は遠心して行うことが好ましい。
【００２８】
本方法は２〜４０℃の温度で行うことが好ましい。細胞培地は２〜４０℃の温度を有することが好ましい。特に本方法を４℃で行い、さらに／又は使用する培地が４℃の温度を有することが好ましい。別の好ましい変法では本方法を１０℃で行い、さらに／又は使用する培地が１０℃の温度を有する。別の特に好ましい変法では、本方法を２５℃で行い、さらに／又は使用する培地が２５℃の温度を有する。別の特に好ましい変法では、本方法を３７℃で行い、さらに／又は使用する培地が３７℃の温度を有する。
【００２９】
特に、塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウム並びにグルコース、さらには血清アルブミン及び／又は血漿を含み、上記の成分が水に溶解されている液体細胞培地中で、特に凍結保存の後に解凍された、動物又はヒト細胞を、短時間貯蔵するための特殊な細胞培地も、もちろん本発明の対象である。
【００３０】
好ましい細胞培地は塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム六水和物及びクエン酸ナトリウム並びにグルコース、さらには血清アルブミン及び／又は血漿からなり、上記の成分が水に溶解されているものである。特に好ましい細胞培地は０．４５〜０．６０重量％塩化ナトリウム、０．４５〜０．５５重量％のグルコン酸ナトリウム、０．２０〜０．２５重量％の酢酸ナトリウム、０．０３〜０．０４重量％の塩化カリウム、０．０２５〜０．０３５重量％の塩化マグネシウム六水和物及び０．３１〜０．３３重量％のクエン酸ナトリウム並びにグルコース及びさらに血清アルブミン及び／又は血漿を含み、上記の成分は水に溶解されているものである。
【００３１】
細胞培地は０．０１〜０．５重量％のグルコース、とりわけ０．１〜０．２重量％のグルコースを含むことが好ましい。
【００３２】
本発明に基づき細胞培地はヒト血清アルブミンを含むことが好ましい。ヒト血清アルブミンは本発明に基づきヒト血漿、特に自己血漿に置き換えることができる。好ましい実施形態では培地は０．５〜５０重量％の血清アルブミン、とりわけ３〜５重量％の血清アルブミンを含む。別の好ましい実施形態では培地は０．５〜５０重量％の血漿、とりわけ３〜５重量％の血漿を含む。
【００３３】
本発明に基づく細胞培地は６．４〜８、とりわけ７．０〜７．４、特に７．２のpH値を有することが好ましい。
【００３４】
本発明に基づき本発明の細胞培地の成分は動物生体、とりわけヒト生体への適用、特に静脈内適用が法的に許可されているものであることが好ましい。
【００３５】
また本発明に基づき本発明の方法及び／又は本発明の細胞培地の本発明に基づく実施形態を組み合せることが好ましい。
【００３６】
また本発明は凍結保存の後に解凍された動物細胞の、特に本発明方法による短時間貯蔵のための上記の本発明細胞培地の使用を包含する。
【実施例】
【００３７】
特殊な凍結用バッグ／凍結用試験管由来の凍結保存した肝細胞を使用した。個別の細胞調製物の現存する凍結用試験管の数は研究の規模に比して十分でなかったので、それらはもっぱら結果の比較のために採用した。すべての作業段階を無菌条件で行った。細胞培地を加える前に細胞懸濁液を完全に解凍した。凍結用試験管の解凍はバッグの解凍と時間的に関係なく行った。仕込んだ細胞に細胞培地を徐々に加えた。
【００３８】
比較可能な結果を得るために、少なくとも２人、場合によっては３人の係員が異なる試験を平行して行った。
【００３９】
以下の解凍培地を調製した。
培地１： Custodiol（登録商標）（比較例）
培地２： ヒドロキシエチルデンプン（HES）＋１g/lグルコース＋４％HSA（本発明に基づく培地）
培地３： リンガー乳酸塩溶液＋１g/lグルコース＋４％HSA（本発明に基づく培地）
培地４： Composol（登録商標）＋１g/lグルコース＋４％HSA（本発明に基づく培地）
培地５： リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）＋１g/lグルコース＋４％HAS（本発明に基づく培地）
培地６： ヒト血漿（比較例）
【００４０】
継代（解凍したバッグ）ごとにそれぞれ約５０mlの細胞培地が必要であった。ヒト血漿を３７℃の温水浴で解凍した。
【００４１】
３つの試験で培地を３７℃の温水浴で少なくとも15分間熱処理した（＝“warm”）。２つの試験で細胞培地を冷蔵庫で少なくとも１５分間冷却した（＝“cold”）。
【００４２】
溶液に従ってラベル付けした６本の５０ml試験管を仕込んで、室温で保管した。
【００４３】
“warm”試験では１８℃及び５０ｇで５分間遠心し、“cold”試験では４℃及び５０gで遠心した。
【００４４】
凍結バッグをアルミニウムカセットから注意深く取り出した。凍結懸濁液を２〜５分、絶えず振りながら、氷晶がもはや見えなくなるまで解凍した。全操作が要した時間は５分以内であった。
【００４５】
黄色いキャップをバッグから除き、ベニャミックス（Benjamix）の穿刺針を隔膜に刺し通した。凍結バッグのベニャミックスに６０ml注射器を接続し、６０mlの細胞懸濁液を取り出した。
【００４６】
用意した６本の試験管にそれぞれ１０mlの細胞懸濁液を移した。さらにそれぞれ４０mlの該当する細胞培地を徐々に加えた。全操作の所要時間は５分以内であった。
【００４７】
遠心の後に細胞の洗浄を行った。パスツール・ピペットで上清を吸い出した。細胞ペレットを注意深く振って５mlの該当する細胞培地に完全に再懸濁した。
【００４８】
細胞数及び生存率に従って細胞数計測を行い、各細胞数計測に従って肝細胞培養物を仕込んだ。
【００４９】
３時間の総貯蔵時間の間に６０分ごとに上記の２つの段階を反復した。
【００５０】
凍結保存の前に生存率４０％以上の肝細胞だけを使用した。異なる個別細胞調製物（バッチ）を用いて試験を少なくとも３回繰り返した。その際バッチごとに少なくとも１個のバッグを解凍した。使用したそれぞれのバッチの凍結用試験管の解凍の結果を比較に採用した。
【００５１】
４つの個別細胞調製物（バッチ）を解凍液の影響に関してテストした。解凍後の生存率及び生存細胞数（LZZ）並びに貯蔵時の生存率及び生存細胞数の維持というパラメータに関して懸濁液でテストした。肝細胞移植物の場合、培地及び遠心時の温度を４℃に固定した。バッチHH142による試験は、一方では“warm”で行い、次に“cold”で繰り返した（図１及び図２を参照）。その他の評価のために２つの試験の平均値をとり、HH142と称した。
【００５２】
個々の結果を図３及び４に示す。
【００５３】
バッチに左右されない評価を保証するために、被検溶液での貯蔵時の生存細胞数の維持率というパラメータを定義した。これは２つの異なる基準点に関係した。すなわち一方では、維持率は凍結の前の生存細胞数に関係した（図５a）。他方では、維持率は洗浄の後（特定の貯蔵培地での０時間）の生存細胞数に関係した（図５b）。５つの溶液の比較のために、３つの被検バッチから上記のパラメータの中央値を計算し、図５にグラフで示した。
【００５４】
選ばれた２つの溶液−Composol（登録商標）及びHES−をさらに、４つのバッチの中央値に基づいて評価し、図６にグラフで示した。
【００５５】
上記の結果の分析の便宜上、次のアプローチを行った。凍結LZZの維持率であるパラメータをCustodiol（登録商標）１００％で試験した。５つの被検バッチ（比較例／本発明の例）について、Custodiol（登録商標）と比較したこのパラメータの偏差百分率を計算した（図７a及び７bを参照）。
【００５６】
細胞の洗浄の直後に３つの溶液（PBS、Composol（登録商標）及びHES）はLZZ維持率であるパラメータに関してCustodiol（登録商標）と同等の維持率（８０％以上一致）を示した。その場合Composol（登録商標）はCustodiol（登録商標）より良好な結果さえ示した（１００％以上の維持率）。１時間後にPBSは最良の結果を有したが、Composol（登録商標）及びヒト血漿は２時間後にCustodiol（登録商標）より約１０％良好な中央値結果を示した。
【００５７】
別の比較のために別の評価を行った。溶液ごとに４つのすべての時点の平均値を計算した（０時間〜３時間、図７ｃ）。
【００５８】
試験の時間的進行に関係なく、HESとリンガー乳酸塩溶液はCustodiol（登録商標）と比較して約２０％のLZZの損失を示し、またPBS、Composol（登録商標）及びヒト血漿はCustodiol（登録商標）と同等な（偏差が１０％以下の）結果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（凍結保存後の）貯蔵した細胞の生存率と貯蔵時間、使用した貯蔵培地及び貯蔵温度との関係を示す。凡例：“HH142”：個別細胞調製物（バッチ）の番号、“warm”：１８℃の貯蔵温度、“cold”：４℃の貯蔵温度、“HES”：培地２、“PBS”：培地５、“Custodiol（登録商標）”：培地１、“Composol（登録商標）”：培地４、“リンガー乳酸塩溶液”：培地３、“ヒト血漿”：培地６
【図２】（凍結保存前の）貯蔵した細胞の維持率と貯蔵時間、使用した貯蔵培地及び貯蔵温度との関係を示す。凡例は図１を参照。
【図３】（凍結保存後の）貯蔵した細胞の生存率と貯蔵時間、使用した貯蔵培地及び貯蔵温度との関係を示す。凡例は図１を参照。
【図４】（凍結保存後の）貯蔵した細胞の生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。凡例は図１を参照。
【図５】（凍結保存前の）貯蔵した細胞の生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。３つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。凡例は図１を参照。
【図６】（凍結保存前の）貯蔵した細胞の生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。４つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。凡例は図１を参照。
【図７】図７A〜C。（凍結保存前の）貯蔵した細胞の維持率、生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。３つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。図7C：Custodiol（＝１００％）との比較。４つの貯蔵時間の平均値。３つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。凡例は図１を参照。
【技術分野】
【０００１】
本発明は貯蔵中に細胞の生存率が維持される、特にヒト細胞の貯蔵方法、細胞貯蔵用細胞培地及び細胞の貯蔵のためのこのような細胞培地の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
凍結保存は長期間にわたり生細胞を貯蔵するためにしばしば使用される方法である。凍結保存技術はここ数十年の間に絶えず開発され、改善されてきた。例えば臓器から単離した直後又は凍結の前もしくは凍結保存の後の細胞の解凍の際又はその後には、細胞を短期間貯蔵することが必要になる。こうした貯蔵の後に細胞を生体、特にヒトに再びそのまま投与することがしばしば必要である。この細胞投与は例えば細胞の静脈内適用によって行うことができる。特に凍結保存により貯蔵した細胞のヒトへの適用は、とりわけ臨床適用、特に治療的適用として利用することができる。例えば治療的適用のためにヒト肝細胞移植物を静脈内適用することができる。ところが凍結過程及び再解凍過程、並びに先行の又は直後のin vitro貯蔵は、特に臨床適用の場合、貯蔵される細胞の生存率及び生存細胞数に関してなお問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の根底にあるのは、動物細胞、とりわけヒト細胞、特に肝細胞又は肝細胞移植物の貯蔵のための、簡単に製造できるなるべく安価な細胞培地を提供するという技術的課題である。とりわけ凍結保存に関連して、凍結の前及び／又は解凍の後には細胞を貯蔵しなければならない。そこで本発明の根底にあるのは、細胞の生存率及び生存細胞数の損失をなるべく少なくして、動物細胞、とりわけヒト細胞、中でも肝細胞又は肝細胞移植物の短時間貯蔵を可能にし、そのため周知の細胞培地の代替物となりうる細胞培地を提供するという技術的課題である。
【０００４】
凍結保存に関連して、貯蔵及び再解凍のための細胞培地は周知である。しかしこの細胞培地は５〜２０％のウシ胎児血清（FCS）のような、ヒトへの適用、特に静脈内適用が法的に許されず、又は不適当でさえある成分を含む。そこでさらに本発明の根底には、細胞、とりわけヒト細胞、特に肝細胞又は肝細胞移植物の生存率及び生存細胞数の僅かな損失で動物、特にヒトへの細胞の安全な適用を可能にする培地を提供するという技術的課題がある。
【０００５】
例えばCustodiol（登録商標）は、初めに凍結保存され、解凍された細胞、例えば肝細胞の貯蔵のための細胞培地として効果的に使用され、臓器全体の臓器移植用の保存液として開発されたものである。ところがCustodiol（登録商標）はヒトの静脈内適用には法的に許されていない。そこでさらに本発明の根底には、ヒトへの静脈内適用が許可される、従って解凍の後に手数のかかる、生存細胞数を減少させる洗浄工程なしで、細胞をこの細胞培地でヒトに静脈内適用することができる、特に凍結保存に関連した細胞の短期貯蔵のための細胞培地を提供するという技術的課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は基本的には特許請求の範囲に記載の動物又はヒト細胞の短期間貯蔵のための方法を提供することによって、根底にある技術的課題を解決する。特に塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウムを含む塩溶液及び／又はリンガー乳酸塩溶液及び／又はリン酸緩衝化生理食塩水を含む塩溶液から選ばれた塩溶液、及び／又は高分子糖類、特にヒドロキシエチルデンプンの水溶液、並びにグルコース、さらには血清アルブミン及び／又は血漿を含む、液体細胞培地に細胞を収容し、この細胞培地中で細胞を貯蔵する方法を提供することが好ましい。
【０００７】
好ましい実施形態では、動物細胞は哺乳動物細胞である。例えばブタ、ウシ又はマウス細胞が挙げられる。とりわけヒト細胞が挙げられる。本発明によれば、細胞は細胞懸濁液及び細胞移植物をも意味する。細胞は１つの種類であってもよいが、様々な種類の細胞の組成物又は共存培養物を使用することもできる。
【０００８】
本発明に基づき動物細胞は治療的適用のための細胞であることが好ましい。別の好ましい実施形態では動物細胞はin vitro培養のための細胞である。動物細胞は例えば肝実質細胞、膵島、軟骨細胞（chondrocyte）、軟骨細胞（cartilage cell）、神経細胞、角化細胞又はリンパ球であってよい。細胞培地に貯蔵するための細胞はとりわけ肝細胞、特に肝実質細胞である。
【０００９】
本発明に関連して肝細胞とは、主として肝実質細胞からなる細胞混合物を意味する。但し様々な数量分のリンパ球、内皮細胞及びその他の非実質細胞群を含んでもよい。
【００１０】
栓球（血小板ともいう）の解凍及び／又は貯蔵は本発明から除外する。栓球は本発明の意味の動物細胞ではない。
【００１１】
本発明に関連して短時間貯蔵とは、２４時間以下、特に１０時間以下、とりわけ５時間以下、特に３時間以下の期間にわたる、本発明に基づく培地でのin vitro貯蔵を意味する。
【００１２】
凍結保存とは０℃以下、特に−２０℃〜−２００℃での細胞のたいてい長期の貯蔵を意味する。凍結は通常１℃/分の速度で行われる。
【００１３】
本発明に関連して細胞培地（培地、解凍培地又は栄養培地ともいう）とは、特に液状の水溶液を意味する。細胞培地はなるべく多い生存細胞数、即ちなるべく低い細胞死亡率及びなるべく高い生存能力又は生存率（当業者にはviabilityとしても知られている）を維持する生細胞のin vitro貯蔵のために利用される。
【００１４】
本発明に基づき使用される細胞培地の成分は、動物生体とりわけヒト生体への適用、特に静脈内適用が法的に許可されているものであることが好ましい。本発明によれば本発明に基づく培地で貯蔵した後の細胞を臨床適用、特に治療的適用、又はin vitro試験のために使用することができる。
【００１５】
本発明に関連して塩溶液とは、１つ又は複数の塩の水溶液を意味する。本発明に基づき好ましい塩溶液は塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウムを含み、それらの塩は水に溶解されている。利用される水は注射用の無菌水、とりわけ脱イオン水である。
【００１６】
本発明に基づき好ましい塩溶液はComposol（登録商標）又はComposol（登録商標）の組成に相当する溶液である。Composol（登録商標）は塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム六水和物及びクエン酸ナトリウムの水溶液である。１７３mmol/lのナトリウム、５mmol/lのカリウム、１．５mmol/lのマグネシウム、９８mmol/lの塩化物、１０．９mmol/lのクエン酸塩、２７mmol/lの酢酸塩及び２３mmol/lのグルコン酸塩を含み、とりわけ上記からなるものが好ましい。
【００１７】
そこで本発明に基づき塩溶液は０．４５〜０．６０重量％、特に０．５３重量％の塩化ナトリウム、０．４５〜０．５５重量％、とりわけ０．５０重量％のグルコン酸ナトリウム、０．２０〜０．２５重量％、とりわけ０．２２重量％の酢酸ナトリウム、０．０３〜０．０４重量％、とりわけ０．０３７重量％の塩化カリウム、０．０２５〜０．０３５重量％、とりわけ０．０３１重量％の塩化マグネシウム六水和物及び０．３１〜０．３３重量％、とりわけ０．３２重量％のクエン酸ナトリウムを含み、とりわけ上記からなることが好ましい。塩溶液は７．０〜７．４、とりわけ７．２のpH値を有することが好ましい。
【００１８】
別の実施形態では、塩溶液はリンガー乳酸塩溶液である。リンガー乳酸塩溶液の慣用の組成は当業者に周知である。リンガー乳酸塩溶液は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含む水溶液である。本発明に基づき使用されるリンガー乳酸塩溶液は７．０〜７．４、とりわけ７．２のpH値を有する。
【００１９】
別の実施形態では塩溶液はリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）である。PBSの慣用の組成は当業者に周知である。本発明に基づき使用されるPBSは７．０〜７．４、とりわけ７．２のpH値を有する。
【００２０】
別の実施形態では少なくとも１つの高分子糖類の水溶液が培地の成分である。本発明に基づく高分子糖類は例えばデキストラン、さらにはデキストラン溶液、例えばパーファデックス（Perfadex）、ヒドロキシエチルデンプン（HES）及びヒドロキシエチルデンプンの誘導体である。本発明に基づき高分子糖類としてヒドロキシエチルデンプンを使用することが好ましい。
【００２１】
本発明に基づき固形の又は水溶液としての細胞培地にグルコースを加える。
【００２２】
本発明に基づき血清アルブミンは細胞培地に溶解され、又は液状で加えられる。血清アルブミンは例えばウシ胎児血清（FCS）、ウシ血清アルブミン（BSA）又はヒト血清アルブミン（HAS）である。本発明によれば、ヒト血清アルブミンが好ましい。これはヒトへの静脈内適用が許可されているからである。
【００２３】
別の実施形態では血清アルブミンを血漿に替え、又は血漿を補充する。本発明に基づきヒト血漿、とりわけ自己血漿が好ましい。特に血漿及び／又はHSAは凍結保護剤としてとりわけ単独で又は他の周知の凍結保護剤、特にDMSOと組み合わせて使用される。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、本発明に基づき使用される培地はアミノ酸、ホルモン、ビタミン、プロビタミン及び抗アポトーシス作用物質から選ばれる少なくとも１つの別の成分を含む。
【００２５】
当業者は本発明の教示によって、培地組成物の成分を本発明に従って本発明に基づく濃度で使用するように促されるが、上記の成分を使用分野に応じてその専門知識に従って選択するであろう。
【００２６】
本発明に基づく方法はpH値６．４〜８、とりわけ７．０〜７．４、特に７．２の上記の細胞培地で行うことが好ましい。
【００２７】
細胞は凍結保存から解凍した後に本発明に基づく細胞培地で洗浄し、保存培地及び本発明に基づく細胞培地から分離し、その上で新しい本発明に基づく貯蔵用細胞培地に収容することが好ましい。その分離は遠心して行うことが好ましい。
【００２８】
本方法は２〜４０℃の温度で行うことが好ましい。細胞培地は２〜４０℃の温度を有することが好ましい。特に本方法を４℃で行い、さらに／又は使用する培地が４℃の温度を有することが好ましい。別の好ましい変法では本方法を１０℃で行い、さらに／又は使用する培地が１０℃の温度を有する。別の特に好ましい変法では、本方法を２５℃で行い、さらに／又は使用する培地が２５℃の温度を有する。別の特に好ましい変法では、本方法を３７℃で行い、さらに／又は使用する培地が３７℃の温度を有する。
【００２９】
特に、塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウム並びにグルコース、さらには血清アルブミン及び／又は血漿を含み、上記の成分が水に溶解されている液体細胞培地中で、特に凍結保存の後に解凍された、動物又はヒト細胞を、短時間貯蔵するための特殊な細胞培地も、もちろん本発明の対象である。
【００３０】
好ましい細胞培地は塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム六水和物及びクエン酸ナトリウム並びにグルコース、さらには血清アルブミン及び／又は血漿からなり、上記の成分が水に溶解されているものである。特に好ましい細胞培地は０．４５〜０．６０重量％塩化ナトリウム、０．４５〜０．５５重量％のグルコン酸ナトリウム、０．２０〜０．２５重量％の酢酸ナトリウム、０．０３〜０．０４重量％の塩化カリウム、０．０２５〜０．０３５重量％の塩化マグネシウム六水和物及び０．３１〜０．３３重量％のクエン酸ナトリウム並びにグルコース及びさらに血清アルブミン及び／又は血漿を含み、上記の成分は水に溶解されているものである。
【００３１】
細胞培地は０．０１〜０．５重量％のグルコース、とりわけ０．１〜０．２重量％のグルコースを含むことが好ましい。
【００３２】
本発明に基づき細胞培地はヒト血清アルブミンを含むことが好ましい。ヒト血清アルブミンは本発明に基づきヒト血漿、特に自己血漿に置き換えることができる。好ましい実施形態では培地は０．５〜５０重量％の血清アルブミン、とりわけ３〜５重量％の血清アルブミンを含む。別の好ましい実施形態では培地は０．５〜５０重量％の血漿、とりわけ３〜５重量％の血漿を含む。
【００３３】
本発明に基づく細胞培地は６．４〜８、とりわけ７．０〜７．４、特に７．２のpH値を有することが好ましい。
【００３４】
本発明に基づき本発明の細胞培地の成分は動物生体、とりわけヒト生体への適用、特に静脈内適用が法的に許可されているものであることが好ましい。
【００３５】
また本発明に基づき本発明の方法及び／又は本発明の細胞培地の本発明に基づく実施形態を組み合せることが好ましい。
【００３６】
また本発明は凍結保存の後に解凍された動物細胞の、特に本発明方法による短時間貯蔵のための上記の本発明細胞培地の使用を包含する。
【実施例】
【００３７】
特殊な凍結用バッグ／凍結用試験管由来の凍結保存した肝細胞を使用した。個別の細胞調製物の現存する凍結用試験管の数は研究の規模に比して十分でなかったので、それらはもっぱら結果の比較のために採用した。すべての作業段階を無菌条件で行った。細胞培地を加える前に細胞懸濁液を完全に解凍した。凍結用試験管の解凍はバッグの解凍と時間的に関係なく行った。仕込んだ細胞に細胞培地を徐々に加えた。
【００３８】
比較可能な結果を得るために、少なくとも２人、場合によっては３人の係員が異なる試験を平行して行った。
【００３９】
以下の解凍培地を調製した。
培地１： Custodiol（登録商標）（比較例）
培地２： ヒドロキシエチルデンプン（HES）＋１g/lグルコース＋４％HSA（本発明に基づく培地）
培地３： リンガー乳酸塩溶液＋１g/lグルコース＋４％HSA（本発明に基づく培地）
培地４： Composol（登録商標）＋１g/lグルコース＋４％HSA（本発明に基づく培地）
培地５： リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）＋１g/lグルコース＋４％HAS（本発明に基づく培地）
培地６： ヒト血漿（比較例）
【００４０】
継代（解凍したバッグ）ごとにそれぞれ約５０mlの細胞培地が必要であった。ヒト血漿を３７℃の温水浴で解凍した。
【００４１】
３つの試験で培地を３７℃の温水浴で少なくとも15分間熱処理した（＝“warm”）。２つの試験で細胞培地を冷蔵庫で少なくとも１５分間冷却した（＝“cold”）。
【００４２】
溶液に従ってラベル付けした６本の５０ml試験管を仕込んで、室温で保管した。
【００４３】
“warm”試験では１８℃及び５０ｇで５分間遠心し、“cold”試験では４℃及び５０gで遠心した。
【００４４】
凍結バッグをアルミニウムカセットから注意深く取り出した。凍結懸濁液を２〜５分、絶えず振りながら、氷晶がもはや見えなくなるまで解凍した。全操作が要した時間は５分以内であった。
【００４５】
黄色いキャップをバッグから除き、ベニャミックス（Benjamix）の穿刺針を隔膜に刺し通した。凍結バッグのベニャミックスに６０ml注射器を接続し、６０mlの細胞懸濁液を取り出した。
【００４６】
用意した６本の試験管にそれぞれ１０mlの細胞懸濁液を移した。さらにそれぞれ４０mlの該当する細胞培地を徐々に加えた。全操作の所要時間は５分以内であった。
【００４７】
遠心の後に細胞の洗浄を行った。パスツール・ピペットで上清を吸い出した。細胞ペレットを注意深く振って５mlの該当する細胞培地に完全に再懸濁した。
【００４８】
細胞数及び生存率に従って細胞数計測を行い、各細胞数計測に従って肝細胞培養物を仕込んだ。
【００４９】
３時間の総貯蔵時間の間に６０分ごとに上記の２つの段階を反復した。
【００５０】
凍結保存の前に生存率４０％以上の肝細胞だけを使用した。異なる個別細胞調製物（バッチ）を用いて試験を少なくとも３回繰り返した。その際バッチごとに少なくとも１個のバッグを解凍した。使用したそれぞれのバッチの凍結用試験管の解凍の結果を比較に採用した。
【００５１】
４つの個別細胞調製物（バッチ）を解凍液の影響に関してテストした。解凍後の生存率及び生存細胞数（LZZ）並びに貯蔵時の生存率及び生存細胞数の維持というパラメータに関して懸濁液でテストした。肝細胞移植物の場合、培地及び遠心時の温度を４℃に固定した。バッチHH142による試験は、一方では“warm”で行い、次に“cold”で繰り返した（図１及び図２を参照）。その他の評価のために２つの試験の平均値をとり、HH142と称した。
【００５２】
個々の結果を図３及び４に示す。
【００５３】
バッチに左右されない評価を保証するために、被検溶液での貯蔵時の生存細胞数の維持率というパラメータを定義した。これは２つの異なる基準点に関係した。すなわち一方では、維持率は凍結の前の生存細胞数に関係した（図５a）。他方では、維持率は洗浄の後（特定の貯蔵培地での０時間）の生存細胞数に関係した（図５b）。５つの溶液の比較のために、３つの被検バッチから上記のパラメータの中央値を計算し、図５にグラフで示した。
【００５４】
選ばれた２つの溶液−Composol（登録商標）及びHES−をさらに、４つのバッチの中央値に基づいて評価し、図６にグラフで示した。
【００５５】
上記の結果の分析の便宜上、次のアプローチを行った。凍結LZZの維持率であるパラメータをCustodiol（登録商標）１００％で試験した。５つの被検バッチ（比較例／本発明の例）について、Custodiol（登録商標）と比較したこのパラメータの偏差百分率を計算した（図７a及び７bを参照）。
【００５６】
細胞の洗浄の直後に３つの溶液（PBS、Composol（登録商標）及びHES）はLZZ維持率であるパラメータに関してCustodiol（登録商標）と同等の維持率（８０％以上一致）を示した。その場合Composol（登録商標）はCustodiol（登録商標）より良好な結果さえ示した（１００％以上の維持率）。１時間後にPBSは最良の結果を有したが、Composol（登録商標）及びヒト血漿は２時間後にCustodiol（登録商標）より約１０％良好な中央値結果を示した。
【００５７】
別の比較のために別の評価を行った。溶液ごとに４つのすべての時点の平均値を計算した（０時間〜３時間、図７ｃ）。
【００５８】
試験の時間的進行に関係なく、HESとリンガー乳酸塩溶液はCustodiol（登録商標）と比較して約２０％のLZZの損失を示し、またPBS、Composol（登録商標）及びヒト血漿はCustodiol（登録商標）と同等な（偏差が１０％以下の）結果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（凍結保存後の）貯蔵した細胞の生存率と貯蔵時間、使用した貯蔵培地及び貯蔵温度との関係を示す。凡例：“HH142”：個別細胞調製物（バッチ）の番号、“warm”：１８℃の貯蔵温度、“cold”：４℃の貯蔵温度、“HES”：培地２、“PBS”：培地５、“Custodiol（登録商標）”：培地１、“Composol（登録商標）”：培地４、“リンガー乳酸塩溶液”：培地３、“ヒト血漿”：培地６
【図２】（凍結保存前の）貯蔵した細胞の維持率と貯蔵時間、使用した貯蔵培地及び貯蔵温度との関係を示す。凡例は図１を参照。
【図３】（凍結保存後の）貯蔵した細胞の生存率と貯蔵時間、使用した貯蔵培地及び貯蔵温度との関係を示す。凡例は図１を参照。
【図４】（凍結保存後の）貯蔵した細胞の生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。凡例は図１を参照。
【図５】（凍結保存前の）貯蔵した細胞の生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。３つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。凡例は図１を参照。
【図６】（凍結保存前の）貯蔵した細胞の生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。４つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。凡例は図１を参照。
【図７】図７A〜C。（凍結保存前の）貯蔵した細胞の維持率、生存細胞数（LZZ）と貯蔵時間及び使用した貯蔵培地との関係を示す。３つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。図7C：Custodiol（＝１００％）との比較。４つの貯蔵時間の平均値。３つの個別細胞調製物（バッチ）の中央値。凡例は図１を参照。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞の短時間貯蔵のための方法であって、
ａ）− 特に塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウムを含む塩溶液、
− リンガー乳酸塩溶液
− リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
から選ばれる塩溶液、及び／又は高分子糖類の水溶液、特にヒドロキシエチルデンプンの水溶液
ｂ）グルコース、並びに
ｃ）血清アルブミン及び／又は血漿
を含む液体細胞培地に細胞を収容し、この細胞培地中で貯蔵する方法。
【請求項２】
細胞が凍結保存細胞であり、該細胞を解凍し、解凍の後に細胞培地で洗浄し、細胞培地から分離し、その上で新しい貯蔵用細胞培地に収容する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞培地が２〜４０℃の温度を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が肝細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が肝実質細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞が哺乳動物細胞である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞がヒト細胞である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞が治療的適用のための細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
In vitro培養のための細胞を取り扱う請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
特に請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法による動物細胞の短時間貯蔵のための、請求項１で特徴づけた細胞培地の使用。
【請求項１１】
細胞培地が、水に溶解した
ａ）塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウム
ｂ）グルコース、並びに
ｃ）血清アルブミン及び／又は血漿
を含む、動物細胞の短時間貯蔵のための細胞培地。
【請求項１２】
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである請求項１１に記載の細胞培地。
【請求項１３】
血漿がヒト血漿である請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１４】
細胞培地が
０．４５〜０．６０重量％の塩化ナトリウム、
０．４５〜０．５５重量％のグルコン酸ナトリウム、
０．２０〜０．２５重量％の酢酸ナトリウム、
０．０３〜０．０４重量％の塩化カリウム、
０．０２５〜０．０３５重量％の塩化マグネシウム六水和物
及び０．３１〜０．３３重量％のクエン酸ナトリウム
を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１５】
細胞培地が０．０１〜０．５重量％、とりわけ０．１〜０．２重量％のグルコースを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１６】
細胞培地が０．５〜５０重量％、とりわけ３〜５重量％の血清アルブミンを含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１７】
細胞培地が０．５〜５０重量％、とりわけ３〜５重量％の血漿を含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１８】
細胞培地が６．４〜８、とりわけ７．０〜７．４のpH値を有する、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１９】
アミノ酸、ホルモン、ビタミン、プロビタミン及び抗アポトーシス作用物質から選ばれる少なくとも１つの別の成分を含む請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１】
動物細胞の短時間貯蔵のための方法であって、
ａ）− 特に塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウムを含む塩溶液、
− リンガー乳酸塩溶液
− リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
から選ばれる塩溶液、及び／又は高分子糖類の水溶液、特にヒドロキシエチルデンプンの水溶液
ｂ）グルコース、並びに
ｃ）血清アルブミン及び／又は血漿
を含む液体細胞培地に細胞を収容し、この細胞培地中で貯蔵する方法。
【請求項２】
細胞が凍結保存細胞であり、該細胞を解凍し、解凍の後に細胞培地で洗浄し、細胞培地から分離し、その上で新しい貯蔵用細胞培地に収容する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞培地が２〜４０℃の温度を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が肝細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が肝実質細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞が哺乳動物細胞である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞がヒト細胞である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞が治療的適用のための細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
In vitro培養のための細胞を取り扱う請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
特に請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法による動物細胞の短時間貯蔵のための、請求項１で特徴づけた細胞培地の使用。
【請求項１１】
細胞培地が、水に溶解した
ａ）塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及びクエン酸ナトリウム
ｂ）グルコース、並びに
ｃ）血清アルブミン及び／又は血漿
を含む、動物細胞の短時間貯蔵のための細胞培地。
【請求項１２】
血清アルブミンがヒト血清アルブミンである請求項１１に記載の細胞培地。
【請求項１３】
血漿がヒト血漿である請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１４】
細胞培地が
０．４５〜０．６０重量％の塩化ナトリウム、
０．４５〜０．５５重量％のグルコン酸ナトリウム、
０．２０〜０．２５重量％の酢酸ナトリウム、
０．０３〜０．０４重量％の塩化カリウム、
０．０２５〜０．０３５重量％の塩化マグネシウム六水和物
及び０．３１〜０．３３重量％のクエン酸ナトリウム
を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１５】
細胞培地が０．０１〜０．５重量％、とりわけ０．１〜０．２重量％のグルコースを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１６】
細胞培地が０．５〜５０重量％、とりわけ３〜５重量％の血清アルブミンを含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１７】
細胞培地が０．５〜５０重量％、とりわけ３〜５重量％の血漿を含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１８】
細胞培地が６．４〜８、とりわけ７．０〜７．４のpH値を有する、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の細胞培地。
【請求項１９】
アミノ酸、ホルモン、ビタミン、プロビタミン及び抗アポトーシス作用物質から選ばれる少なくとも１つの別の成分を含む請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の細胞培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５００００６（Ｐ２００９−５００００６Ａ）
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１８７４７（Ｐ２００８−５１８７４７）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６４０１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００３３８２
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０８０００４７８）シトネット ゲーエムベーハー ウント コー．カーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６４０１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００３３８２
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０８０００４７８）シトネット ゲーエムベーハー ウント コー．カーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
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