細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質、これをコードするポリヌクレオチド及びこれを有効成分として含有する癌転移抑制用組成物
本発明は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３に巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）が融合されて細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現ベクター及び前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有する癌転移抑制用薬学的組成物に関する。本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、癌転移抑制因子であるＮｍ２３を細胞内に高効率で導入してＫＳＲのリン酸化及び不活性化を誘導し、Ｒａｓ媒介性ＭＡＰＫカスケードを抑制させることによって、癌細胞の増殖、分化及び移動を抑制して癌転移を効果的に予防できる癌転移抑制剤として有用に用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌転移抑制因子（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｓｕｐｒｅｓｓｏｒ）Ｎｍ２３に巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されて細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現ベクター、及び前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有する癌転移抑制用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｍ２３遺伝子は、正常組織の発達及び分化に関与するタンパク質をコードし、様々な転移性細胞株においてその減少した発現が報告されている。一般に、１５０〜１８０個のアミノ酸からなるＮｍ２３タンパク質は、ロイシンジッパーモチーフ（ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｍｏｔｉｆ）を含み、二リン酸ヌクレオシドキナーゼ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ；ＮＤＰＫ）活性を有する。２つのヒトＮｍ２３異性体であるＮｍ２３−Ｈ１及びＮｍ２３−Ｈ２は、それぞれ１７，１４３及び１７，２９４の分子量を有する１５２個のアミノ酸からなる。特に、Ｎｍ２３−Ｈ１は、腫瘍の転移及び他の様々な細胞機構、例えば、細胞増殖、胚発達、分化、腫瘍形成などに重要な役割を担当することが究明されている。
【０００３】
Ｎｍ２３が癌転移及び発達に影響を及ぼす機構は、今のところ明確に明らかになってはいない。ＮＤＰＫは、共有結合性リン酸化酵素（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｚｙｍｅ）中間体を通じて三リン酸と二リン酸ヌクレオシドとの間にリン酸基を伝達するが、Ｎｍ２３−Ｈ１及びＮｍ２３−Ｈ２のヒスチジン１１８は、このような一時的なリン酸化部位として作用する。ＮＤＰＫ関連ヒスチジンリン酸化とは別個に、セリンの自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）がＮｍ２３で観察された（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＮＪら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５７８０−２５７８９（１９９３）（非特許文献１））。Ｎｍ２３でトランスフェクトされたマウスの黒色腫細胞を対照細胞と比較することにより、Ｎｍ２３のセリンの生体内リン酸化水準と腫瘍転移能の抑制との間に直接的な関連性が観察された。マウスＮｍ２３のセリンリン酸化は、生体内でｃＡＭＰにより、そして生体外でフォースコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）により抑制されるが、これは、前記リン酸化が信号伝達経路により調節されることを示す。
【０００４】
強力な癌転移抑制遺伝子としてのＮｍ２３は、もともとその発現が転移能の低いマウス黒色腫細胞株と密接に関連していると報告されている。Ｎｍ２３の減少した発現が腫瘍転移と関連しているというのは、Ｎｍ２３が癌転移抑制因子であることを示す直接的な証拠であると考えられている（Ｓｔｅｅｇ、Ｐ．Ｓ．、Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓ．１０：４７−５０（１９９８）（非特許文献２））。Ｎｍ２３の誘導性高発現は、高転移性癌細胞株において顕著に減少した転移能を示した。暫定的な癌転移抑制因子遺伝子としてクローニングされたＮｍ２３遺伝子は、ＮＤＰＫ活性以外に、セリン／トレオニン特異的ホスホトランスフェラーゼ（ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びヒスチジンタンパク質キナーゼ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）活性を有している。Ｎｍ２３の発現はまた、造血肝細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＨＳＣ）が分化される間に減少するが、これは、Ｎｍ２３が細胞において抗分化に重要な因子であることを立証するものである（Ｇｅｒｖａｓｉ、Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ７：１６８９−９５（１９９６）（非特許文献３））。Ｎｍ２３は、ヒト腫瘍の遺伝子強制誘導性発現及びインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転移モデルシステムにおいて、一時的感染の際、強力な癌転移抑制効果を示すことが確認された（Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１２４９−５０（１９９１）（非特許文献４）；Ｎａｋａｙａｍａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１３４９−５４（１９９２）（非特許文献５）；Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２３２５−３３（１９９３）（非特許文献６）； Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：８５５−６５（１９９３）（非特許文献７））。しかし、ＮＤＰＫ活性の消失をもたらすＮｍ２３の突然変異は、乳癌細胞においてＮｍ２３の抑制機能に影響を及ぼさなかった（ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５１０７−１６（１９９６）（非特許文献８））。
【０００５】
Ｎｍ２３が癌転移抑制因子であるという事実を立証する最も強力な証拠は、癌細胞株内へのＮｍ２３遺伝子のトランスフェクションである。転移適格細胞（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）において、Ｎｍ２３の細胞内高用量は、対照群のトランスフェクト体に比べて４０〜９８％減の転移活性を示した（Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ６５：２５−３５（１９９１）（非特許文献９）；Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２３２５−３３（１９９３）（非特許文献６））。
【０００６】
最近の研究によると、Ｎｍ２３は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）及び線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）システムで究明されたＲａｓキナーゼ抑制因子（ｋｉｎａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｒａｓ；ＫＳＲ）と相互作用することが報告されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ．Ｋ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：１６０９−１２（２００１）（非特許文献１０））。ＫＳＲは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫ）カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）のスキャフォールドタンパク質である（Ｂｕｒａｃｋ、Ｗ．Ｒ．及びＳｈａｗ、Ａ．Ｓ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２１１−６（２０００）（非特許文献１１）；Ｐａｗｓｏｎ、Ｔ．及びＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２０７５−８０（１９９７）（非特許文献１２））。スキャフォールドは、リン酸化の速度を向上させるだけでなく、経路の特異性及び安定化に寄与するのに必須である。一旦ＭＡＰＫ信号伝達機構が活性Ｒａｓにより活性化されると、ＫＳＲは強制的に脱リン酸化され、ＭＡＰＫカスケードの活性化のためのスキャフォールドとして作用するようになる。この過程で、Ｎｍ２３は、ＫＳＲの他の関連タンパク質の結合部位である、ＫＳＲセリン３９２をリン酸化させ、もしセリン３９２が突然変異される場合は、セリン４３４をリン酸化させる。Ｎｍ２３の転移抑制活性は、Ｎｍ２３遺伝子が注入された様々な腫瘍細胞で転移可能性を抑制することが明確に立証されている（Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３５：７６８−７４（２０００）（非特許文献１３））。ＭＡＰＫカスケードの刺激により活性化された細胞において、Ｎｍ２３及びＫＳＲの相互作用は、ヒスチジン依存性経路を通じてインビトロで複雑な方式でＫＳＲのリン酸化を誘導する（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ、Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２３８９−９９（２００２）（非特許文献１４））。また、ＫＳＲとＮｍ２３のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）結合は、ＭＡＰＫカスケードを活性化させる活性Ｒａｓの表現型効果を抑制する。
【０００７】
このような発見に基づいて、インビボでＮｍ２３タンパク質の細胞内への多量投与がＫＳＲをリン酸化させて不活性化させ、Ｒａｓ媒介性ＭＡＰＫカスケードを抑制させることができると仮定することができる。そこで、本発明者らは、ＫＳＲの再リン酸化により媒介されるＭＡＰＫ信号伝達カスケードの抑制が癌細胞において細胞増殖、分化及び移動の抑制を誘導し、様々な腫瘍において抗転移効果（ａｎｔｉ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を示すことができることを確信し、これを用いて癌転移抑制用製剤の開発のために鋭意研究努力した。
【０００８】
一方、合成化合物または天然物の小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できるが、タンパク質、ペプチド、核酸のような巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できない。これらは、分子量５００以上の巨大分子で、生きている細胞の原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、即ち、二重脂質膜構造（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を通過することができないことが広く知られている。これを克服するための方法として、「巨大分子細胞内伝達技術（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＭＩＴＴ）」が開発されたが（Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）（非特許文献１５））、これは疾病治療性巨大分子の生体内伝達を可能にすることによって、既存の医薬品開発技術では不可能であったペプチド、タンパク質、遺伝子自体を用いるバイオ新薬物の開発を可能にする。この技術によると、巨大分子は「疎水性巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）」と他の様々な細胞内運搬体と融合され、組換えタンパク質の形態で合成または発現、精製され、細胞内に伝達された後、特定位置に正確かつ迅速に運搬され、所要の様々な役割を効果的に発揮できる。このように巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成化合物などと融合されて細胞内に入れない多くの不透過性物質の伝達を可能にする。
【０００９】
そこで、本発明者は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３に巨大分子伝達ドメインを融合させて細胞透過性を付与したＮｍ２３組換えタンパク質を製造し、この組換えタンパク質がインビトロだけでなく、インビボ環境下でも細胞外部から大量の癌転移抑制因子であるＮｍ２３を細胞内に効果的に伝達し、ヒトの様々な癌で発生するＮｍ２３欠損または機能消失を治療できる癌転移抑制用製剤として使用できることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＮＪら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５７８０−２５７８９（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｔｅｅｇ、Ｐ．Ｓ．、Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓ．１０：４７−５０（１９９８）
【非特許文献３】Ｇｅｒｖａｓｉ、Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ７：１６８９−９５（１９９６）
【非特許文献４】Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１２４９−５０（１９９１）
【非特許文献５】Ｎａｋａｙａｍａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１３４９−５４（１９９２）
【非特許文献６】Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２３２５−３３（１９９３）
【非特許文献７】Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：８５５−６５（１９９３）
【非特許文献８】ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５１０７−１６（１９９６）
【非特許文献９】Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ６５：２５−３５（１９９１）
【非特許文献１０】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ．Ｋ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：１６０９−１２（２００１）
【非特許文献１１】Ｂｕｒａｃｋ、Ｗ．Ｒ．及びＳｈａｗ、Ａ．Ｓ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２１１−６（２０００）
【非特許文献１２】Ｐａｗｓｏｎ、Ｔ．及びＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２０７５−８０（１９９７）
【非特許文献１３】Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３５：７６８−７４（２０００）
【非特許文献１４】Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ、Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２３８９−９９（２００２）
【非特許文献１５】Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）
【発明の概要】
【００１１】
発明が解決しようとする課題
従って、本発明の目的は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３に細胞透過性を付与し、これを細胞内に高効率で導入することによって、様々な癌細胞で細胞増殖、分化及び移動の抑制を誘導し、優れた抗転移効果を奏することができる癌転移抑制剤としての細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を提供することである。
【００１２】
課題を解決するための手段
前記目的を達成するために、本発明は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合によって細胞透過性が付与され、Ｎｍ２３を細胞内に高効率で導入する細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びこの発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００１６】
最後に、本発明は、癌細胞の増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導して癌転移を予防するための、前記Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有する癌転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
発明の効果
本発明の細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質は、癌転移抑制因子であるＮｍ２３を細胞内に高効率で導入してＫＳＲのリン酸化及び不活性化を誘導し、Ｒａｓ−媒介ＭＡＰＫ連続段階を抑制することによって、癌細胞の増殖、分化及び移動を抑制し、癌転移を効果的に予防できる癌転移抑制剤として有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明によってｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤのいずれか１つが融合された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質の構造を示す。
【図２】図２ａは、図１で考案されたｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果であり、図２ｂは、図１で考案されたＪＯ−７６ＭＴＤまたはＪＯ−７７ＭＴＤが融合された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果である。
【図３】図３ａは、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターにＰＣＲ増幅産物をサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）する過程を示す模式図であり、図３ｂ及び３ｃは、それぞれ図２ａ及び２ｂのＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングされたことを確認した結果である。
【図４】図４ａは、組換え断片をｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにクローニングして組換え発現ベクターを作製する過程を示す模式図であり、図４ｂ及び４ｃは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換え断片がｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにクローニングされたことを確認した結果である。
【図５】図５は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現を様々な宿主細胞を対象に調査した結果である。
【図６】図６は、本発明の組換え発現ベクターが形質転換された細菌で発現された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を精製した結果である。
【図７】図７ａ及び７ｂは、それぞれ本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性をフローサイトメトリーで分析した結果である。
【図８】図８ａ〜８ｃは、それぞれ本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果である。
【図９】図９は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のＭＡＰＫ信号伝達抑制効果をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果である。
【図１０】図１０は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の癌転移抑制効果を浸潤分析（ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）で分析した結果である。
【図１１】図１１は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の癌転移抑制効果を創傷移動分析（ｗｏｕｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で分析した結果である。
【図１２】図１２ａは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織において癌転移抑制効果を肉眼で観察した結果であり、図１２ｂは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織において、転移マーカー（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の発現を免疫組織化学的（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に染色した結果である。
【図１３】図１３は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織においてアポトーシス誘導効果をＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）分析で観察した結果である。
【図１４】図１４は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織において遺伝子発現の変化をマイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）で分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合によって細胞透過性が付与され、Ｎｍ２３を細胞内に高効率で導入する細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＣＰ−Ｎｍ２３）及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明の特徴は、細胞内への導入が容易でない巨大分子である癌転移抑制因子Ｎｍ２３に特定の巨大分子伝達ドメイン（以下、「ＭＴＤ」と略称する。）を融合させて細胞透過性を付与することによって、Ｎｍ２３を細胞内に高効率で伝達することにある。この際、巨大分子伝達ドメインは、癌転移抑制因子であるＮｍ２３の片末端のみに融合されるか、あるいはその両末端の両方に融合されてもよい。
【００２１】
本発明では、癌転移抑制因子であるＮｍ２３に融合されてもよい巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）、すなわち、細胞内への巨大分子の伝達を可能にする３種のペプチドドメインそれぞれに前記Ｎｍ２３を融合して細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質を開発した。
【００２２】
本発明において「細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質」とは、巨大分子伝達ドメインと癌転移抑制因子Ｎｍ２３を含み、これらの遺伝的融合や化学的結合によって形成された共有結合複合体を意味する。ここで「遺伝的融合」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の遺伝的発現を通じて形成された線状の共有結合からなる連結を意味する。
【００２３】
ＫＳＲの再リン酸化により媒介されるＭＡＰＫ信号伝達カスケードを制御して癌細胞での細胞増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシスを誘導して様々な腫瘍において優れた抗転移活性を示すＮｍ２３は、配列番号：１の塩基配列及び配列番号：２のアミノ酸配列を有する癌転移抑制因子であって、ＫＳＲとＲａｓ媒介性ＭＡＰＫを含む信号伝達カスケードで重要な標的タンパク質として作用する。
【００２４】
Ｎｍ２３タンパク質は、内因性タンパク質であり、その機能についてはＮＤＰ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−キナーゼ酵素活性があることが報告されており（Ｂｉｇｇｓら、Ｃｅｌｌ ６３、９３３−９４０（１９９０））、転写活性化因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、細胞分化抑制剤（Ｉ ｆａｃｔｏｒ）としても知られている（Ｐｏｓｔｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１、４７８−４８０（１９９３）； Ｏｋａｂｅ−Ｋａｄｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２６７、１０１−１０６（１９９５））。
【００２５】
Ｎｍ２３タンパク質の遺伝子については、ヒトにおいて８種類のアイソタイプ（ｎｍ２３−Ｈ１、ｎｍ２３−Ｈ２、ＤＲ−ｎｍ２３、ｎｍ２３−Ｈ４、ｎｍ２３−Ｈ５、ｎｍ２３−Ｈ６、ｎｍ２３−Ｈ７、およびｎｍ２３−Ｈ８）が発見されたが、これらのいずれも癌転移抑制に関連していることが知られている（Ｒｏｓｅｎｇａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２、１７７−１８０（１９８９）；Ｃｈａｒｐｉｎ Ｃ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４、４１６−４２０（１９９７））。本発明の好ましい実施形態では、Ｎｍ２３−Ｈ１を対象に細胞透過性組換えタンパク質を製造するが、これに限定されない。
【００２６】
前記癌転移抑制因子Ｎｍ２３に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしては、配列番号：４、６、８及び３７〜２２７のアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む細胞透過性を有するポリペプチドを用いてもよい。前記配列番号：４、６、８及び３７〜２２７のアミノ酸配列のいずれか１つを有する巨大分子伝達ドメインは、細胞膜を貫通してポリペプチド、タンパク質ドメイン、または全長タンパク質を含む生物学的活性分子の細胞内への流入を媒介できる細胞透過性ポリペプチドである。本発明による巨大分子伝達ドメインは、Ｎ末端領域、疎水性領域及びＣ末端の分泌タンパク質切断部位（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）の３部分からなるシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）においてヘリックス（ｈｅｌｉｘ）を形成し、細胞膜標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）活性を付与する疎水性領域を有するように考案されたものである。このような巨大分子伝達ドメインは、細胞に損傷を加えず、かつ直接細胞膜を透過することによって、標的タンパク質を細胞内に移動させて目的とする機能を発揮させることができる。
【００２７】
本発明によって癌転移抑制因子Ｎｍ２３に融合されてもよい配列番号：４、６、８及び３７〜２２７で表されるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメインを下記表１ａ〜１ｌに示す。
【００２８】
【表１ａ】
【００２９】
【表１ｂ】
【００３０】
【表１ｃ】
【００３１】
【表１ｄ】
【００３２】
【表１ｅ】
【００３３】
【表１ｆ】
【００３４】
【表１ｇ】
【００３５】
【表１ｈ】
【００３６】
【表１ｉ】
【００３７】
【表１ｊ】
【００３８】
【表１ｋ】
【００３９】
【表１ｌ】
【００４０】
前記癌転移抑制因子Ｎｍ２３に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしては、カポジ線維芽細胞成長因子（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４；ｋＦＧＦ４）に由来する配列番号：３の塩基配列及び配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ１」と略称する。）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）として、配列番号：５の塩基配列及び配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ２」と略称する。）、及びヒトの子宮内膜出血関連因子プレプロタンパク質（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）由来の配列番号：７の塩基配列及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ３」として略称する。）を用いてもよい。
【００４１】
本発明の細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質は、巨大分子伝達ドメインとして前記３種類のＭＴＤ（ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ：ＭＴＤ１、ＪＯ−７６：ＭＴＤ２、ＪＯ−７７：ＭＴＤ３）のいずれか１つが癌転移抑制因子Ｎｍ２３の一方または両末端に融合され、この融合コンストラクトの片末端に配列番号：９の塩基配列を有するＳＶ４０巨大Ｔ抗原（ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）由来の核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ、配列番号：１０のアミノ酸配列）と、容易な精製のために、ヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ；Ｈｉｓ−Ｔａｇ）親和性ドメインが融合されている構造を有してもよい。
【００４２】
本発明の一実施形態では、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤのいずれか１つを用いたＮｍ２３組換えタンパク質として８つの全長形態（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｍｓ）を考案する。
【００４３】
本発明において、用語「全長形態」は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３の配列番号：２のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を含んでいない完全な形態のアミノ酸配列を含む形態を意味する。しかし、全長形態のＮｍ２３だけでなく、Ｎｍ２３の抗転移効果を損傷させない範囲内で、そのアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換による様々な変形を含むＮｍ２３誘導体を本発明に用いてもよい。
【００４４】
図１ａを参考とすれば、本発明によるＮｍ２３組換えタンパク質は、
１）全長のＮｍ２３のＮ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）、
２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）、
３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）、
４）そのＮ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）、
５）そのＣ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）、
６）そのＮ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）、
７）そのＣ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）、
８）その両末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）
である。
【００４５】
前記において、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）は配列番号：２２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）は配列番号：２４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）は配列番号：２６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４６】
前記において、ＪＯ−７６ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）は配列番号：２８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）は配列番号：３０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４７】
前記において、ＪＯ−７７ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）は配列番号：３２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）は配列番号：３４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）は配列番号：３６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４８】
本発明では、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の対照群として、ＭＴＤが融合されずに片末端にヒスチジン標識とＮＬＳのみが融合されたＮｍ２３組換えタンパク質Ｈｉｓ−Ｎｍ２３（ＨＮ）を製造する。この対照群タンパク質は、配列番号：２０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４９】
また、本発明は、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター及びこの組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００５０】
本発明において、「組換え発現ベクター」とは、適当な宿主細胞において標的タンパク質または標的ＲＮＡを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結されている必須の調節要素を含む遺伝子コンストラクトをいう。
【００５１】
本発明において、用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的機能を担うように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。例えば、プロモーターとタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が作動可能に連結されてコードする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換え発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野によく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造でき、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結には、当該技術分野に一般に知られた酵素などを用いる。
【００５２】
本発明に使用可能な発現ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。好適な発現ベクターは、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、終結コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、ポリアデニル化信号（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）のような発現調節配列以外にも、膜標的化または分泌のための信号配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、目的に応じて多様に製造されてもよい。発現ベクターのプロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製が可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。
【００５３】
このように製造された本発明の組換え発現ベクターは、例えば、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１であってもよい。前記組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１は、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＭＣＳ）のうちＮｄｅＩ制限酵素部位に、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質として全長のＮｍ２３のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質ＨＮＭ１をコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを意味する。
【００５４】
本発明の一実施例では、タンパク質の精製を容易にする目的で、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のＮ末端部位に、人為的に６つのヒスチジンタグを含めて発現させるために、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列を有しているｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）に本発明のヌクレオチドをクローニングする。
【００５５】
前記組換え発現ベクターから発現される細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、全長形態のＮｍ２３の一方または両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤの中の１つが融合され、そのＮ末端部位にヒスチジンタグとＮＬＳが連結されている。
【００５６】
本発明はまた、前記組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。本発明の形質転換細菌は、好ましくは大腸菌であってもよく、大腸菌を本発明の組換え発現ベクター、例えば、本発明による全長のＮｍ２３のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された細胞透過性組換えタンパク質ＨＮＭ１をコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１を用いることによって、多量の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を発現させることができる。形質転換には、核酸を宿主細胞に導入するいかなる方法も含まれ、当該分野の熟練者に公知となった形質転換技術により行ってもよい。好ましくは、微粒子銃法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、ＰＥＧ媒介性融合法（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｓｉｏｎ）、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びリポソーム媒介法（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）などが含まれるが、これに制限されない。
【００５７】
本発明の好ましい実施例では、前記方法で製造された全長のＮｍ２３のＮ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨＭ３Ｎと全長のＮｍ２３のＣ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨＮＭ３それぞれを含む組換え発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた形質転換細菌を２００８年８月２８日付で韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）内の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ−１１３８０ＢＰ及びＫＣＴＣ−１１３８１ＢＰとして寄託した。
【００５８】
本発明はまた、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００５９】
前記製造方法は、本発明の形質転換細菌に導入された組換え発現ベクターにおいて本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現されるように形質転換細菌を適切な培地及び条件下で培養することにより行われる。前記形質転換細菌を培養して組換えタンパク質を発現させる方法は、当該分野で公知となっており、例えば、形質転換細菌が成長できる適切な培地に接種して継代培養した後、これを本培養用培地に接種し、適切な条件、例えば、遺伝子発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）の存在下で培養することによって、タンパク質の発現を誘導できる。培養が完了すると、前記培養物から実質的に純粋な組換えタンパク質を回収できる。本発明において用語“実質的に純粋な”とは、本発明の組換えタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドの配列が宿主細胞由来の他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００６０】
前記形質転換細菌で発現された組換えタンパク質の回収は、当該分野で公知の様々な分離及び精製方法を通じて行ってもよく、通常、細胞残屑（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）、培養不純物などを除去するために、細胞溶解物を遠心分離した後、沈殿、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿及びリン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）などを行ってもよく、透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行ってもよい。前記クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、親和性カラムクロマトグラフィー及び限外ろ過などの技法を単独で用い、または併用してもよい（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍ．、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））。
【００６１】
一方、組換え発現ベクターで形質転換された細菌で発現された組換えタンパク質は、タンパク質分離の際、タンパク質の特性に応じて溶解性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶解性分画（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に区分され得る。発現されたタンパク質のほとんどが溶解性分画である場合には、前述の方法に従って容易にタンパク質を分離及び精製することができるが、発現されたタンパク質の大部分が不溶解性分画、即ち、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形態で存在する場合には、尿素（ｕｒｅａ）、界面活性剤などのタンパク質変性剤が含まれた溶液で最大限タンパク質を溶解させた後、遠心分離して透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行うことによって精製することができる。この際、タンパク質変性剤が含まれた溶液によりタンパク質の構造が変形されてその活性を失うことがあるので、不溶解性分画からタンパク質を精製する過程中には脱塩及びリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）段階が必要である。即ち、前記脱塩及びリフォールディング段階は、タンパク質変性剤が含まれていない溶液を用いて透析及び希釈を行うか、またはフィルターを用いて遠心分離してもよい。また、前記溶解性分画からタンパク質を精製する過程中にも、精製時に用いる溶液中の塩濃度が高い場合は、このような脱塩及びリフォールディング段階を行ってもよい。
【００６２】
本発明の一実施形態では、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が封入体の形態で不溶解性分画に存在することを確認し、不溶解性分画からこれを精製するために、不溶解性分画をトリトンＸ−１００のような非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液に溶解させた後、超音波で処理し、遠心分離して沈殿物を得る。前記得られた沈殿物を変性剤である尿素が含まれている溶液に溶解させた後、遠心分離して上清を得る。尿素を用いて不溶解性分画から最大限溶解した本発明の組換えタンパク質は、ヒスチジン結合精製キットを用いて精製し、その後精製されたタンパク質は、アミコンフィルターなどを用いた遠心分離により塩分の除去及びタンパク質構造のリフォールディング過程を行うことによって、本発明の組換えタンパク質を得ることができる。
【００６３】
さらに、本発明は、癌細胞の増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシスを誘導して癌転移を予防するのに効果的な、前記Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有する癌転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００６４】
癌転移抑制因子としてＫＳＲとＲａｓ媒介性ＭＡＰＫを含む信号伝達カスケードで重要な標的タンパク質として作用するＮｍ２３は、ＫＳＲの再リン酸化により媒介されるＭＡＰＫ信号伝達カスケードを制御して癌細胞での細胞増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシスを誘導することによって、ヒトの様々な癌において癌の転移を予防及び／又は治療するための癌転移抑制剤として有用に用いられる。
【００６５】
本発明による組換えタンパク質を有効成分として含有する組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体をさらに含んでもよい。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含む。経口投与用の場合、本発明による組換えタンパク質は、賦形剤と混合してチュアブル錠、バッカル剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ及びウエハーなどの形態で用いてもよい。また、非経口投与用担体は、水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含み、安定化剤及び保存剤をさらに含んでもよい。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロリド、メチル−またはプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にして用いてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５））。
【００６６】
本発明による組成物は、種々の非経口または経口投与の形態に剤形化してもよい。非経口投与用剤形の代表的なものは注射用剤形であり、等張性水溶液または懸濁液が好ましい。注射用剤形は、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて当業界に公知となった技術によって製造してもよい。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用に剤形化してもよい。また、経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン）と滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含んでもよい。前記錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリジンのような結合剤を含んでもよく、場合によって、澱粉、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤及び／又は甘味剤をさらに含んでもよい。前記剤形は、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造してもよい。
【００６７】
本発明の組成物は、防腐剤、水和剤、乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤のような補助剤とその他治療的に有用な物質をさらに含んでもよく、通常の方法に従って製剤化してもよい。
【００６８】
また、本発明による組成物の投与経路としては、経口的、または静脈内、皮下、鼻腔内または腹腔内などのように非経口的にヒトと動物に投与してもよい。経口投与は、舌下適用も含む。非経口的投与は、皮下注射、筋肉内注射及び静脈注射のような注射法及び点滴法を含む。
【００６９】
本発明の組成物において、本発明の組換えタンパク質の合計有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与してもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与してもよい。本発明の組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にしてもよいが、通常、成人を基準に１回投与時、５〜２０ｍｇの有効投与量で１日に数回繰り返し投与してもよい。しかし、前記組換えタンパク質の濃度は、薬物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重篤度、食餌及び排泄率等の様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量を決定してもよい。従って、このような点を考慮すると、当該分野の通常の知識を有する者であれば、前記組換えタンパク質の癌転移抑制剤としての特定の用途に応じる適切な有効投与量を決定できるであろう。本発明による組成物は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者に自明であろう。
【００７１】
実施例１：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＣＰ−Ｎｍ２３）の製造
ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）、ＪＯ−７６ＭＴＤ（ＭＴＤ２）及びＪＯ−７７ＭＴＤ（ＭＴＤ３）のいずれか１つを巨大分子伝達ドメインとして用いて細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を製造するために、全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として下記８つの遺伝子コンストラクトを製造した（図１）：
１）全長のＮｍ２３のＮ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）、
２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）、
３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）、
４）そのＮ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）、
５）そのＣ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）、
６）そのＮ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）、
７）そのＣ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）、及び
８）その両末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）。
【００７２】
前記組換えタンパク質の遺伝子コンストラクトを製造するために、それぞれに対して特異的に考案されたプライマー対とヒトＮｍ２３ ｃＤＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。この際、ＨＭ１Ｎの増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１２の塩基配列を有し；ＨＮＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１４の塩基配列を有し；ＨＭ１ＮＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１４の塩基配列を有し；ＨＭ２Ｎの増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１５及び１２の塩基配列を有し；ＨＮＭ２の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１６の塩基配列を有し；ＨＭ３Ｎの増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１７及び１２の塩基配列を有し；ＨＮＭ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１８の塩基配列を有し；ＨＭ３ＮＭ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１７及び１８の塩基配列を有する。
【００７３】
前記でそれぞれの組換え断片の増幅のために用いられた正方向及び逆方向プライマー対を下記表２に整理する。
【表２】
【００７４】
ＰＣＲ反応は、鋳型遺伝子としてヒトＮｍ２３ ｃＤＮＡ １００ｎｇ、各０．２ｍＭの終濃度ｄＮＴＰ混合物（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、各２ｍＭ）、０．６μＭの各プライマー、１０×Ｔａｑ緩衝溶液５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）１μｌを含む溶液を最終体積５０μｌの反応液として行った。ＰＣＲ反応条件は、まず９４℃で２分間熱変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）させた後、９４℃で４５秒、５３℃で４５秒及び７２℃で４５秒の反応を２５回繰り返し、最終的に７２℃で５分間増幅した。反応が終わった後、１．０％アガロースゲル電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行い、増幅された生成物を確認した。図２ａ及び２ｂに示すように、ＭＴＤが融合されたそれぞれの組換え断片が目的とする大きさに増幅されたことを確認した。
【００７５】
アガロースゲルで増幅された組換え断片を回収した後、これらのそれぞれを商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて抽出、精製した。抽出した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に挿入した後（図３ａ）、ＭＴＤが融合されたＮｍ２３組換えタンパク質遺伝子断片が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換させた。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含む平板ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養して形質転換された大腸菌を選別し、これを再度液体ＬＢ培地で培養した後、これからそれぞれのＮｍ２３組換えタンパク質遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを多量に得た。
【００７６】
図３ｂは、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）で分離し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００７７】
前記において、それぞれのＮｍ２３組換え断片を含むｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを、制限酵素ＮｄｅＩを用いて３７℃で６時間切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）してそれぞれの組換え断片を得た。一方、ヒスチジンタグとＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）も制限酵素ＮｄｅＩを用いて前記と同一の条件で切断した。前記組換え断片と、切断されたｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターとを電気泳動で分離し、商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて精製した。これらの混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ；Ｔａｋａｒａ、日本）を添加し、１６℃で１２時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換させて組換えタンパク質発現ベクターを得た（図４ａ）。
【００７８】
図４ｂは、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素で分離してアガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００７９】
このように得られた組換えタンパク質発現ベクターを、それぞれｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３と命名し、これらの中で組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３で大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて得られた形質転換細菌ＤＨ５α／ＨＭ３ＮとＤＨ５α／ＨＮＭ３を２００８年８月２８日付で韓国生命工学研究院内の遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１１３８０ＢＰ及びＫＣＴＣ−１１３８１ＢＰとして寄託した。
【００８０】
塩基配列の分析結果、前記でｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）は配列番号：２２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）は配列番号：２４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）は配列番号：２６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８１】
また、ＪＯ−７６ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）は配列番号：２８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）は配列番号：３０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８２】
さらに、ＪＯ−７７ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）は配列番号：３２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）は配列番号：３４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）は配列番号：３６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８３】
一方、本発明では、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の対照群として、全長のＮｍ２３にヒスチジンタグのみが融合されているＨｉｓ−Ｎｍ２３（ＨＮ）を製造した。この対照群タンパク質は、配列番号：２０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８４】
実施例２：組換えタンパク質の発現
＜２−１＞最適な宿主菌株の選抜
細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現誘導に最も適した宿主菌株を選抜するために、ＬａｃＩプロモーターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を対象に下記実験を行った。
【００８５】
まず、前記実施例１で製造された組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、及びｐＨＮ（対照群）それぞれを大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに、それぞれ熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法で形質転換させた。また、前記実施例１で製造された組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３それぞれを大腸菌菌株ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に熱ショック方法で形質転換させた。形質転換後、それぞれを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ平板培地に接種して培養した。前記培地に形成されたコロニーを１ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養した後、これを再度１００ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５に達するまで培養した。この培養液にタンパク質発現の誘導剤として０．７ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で２時間さらに培養した。この培養液を４℃で７，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。回収した菌体を溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波処理を行って細胞を破砕し、これを１４，０００×ｇで１５分間遠心分離して溶解性分画と不溶解性分画を得た。この溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００８６】
図５に示すように、様々な宿主菌株を対象に本発明の組換えタンパク質の発現を調査した結果、一部の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現がＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）菌株において低く観察されたが、ほとんどの細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現が前記菌株において高く示されることが確認された。前記結果から、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）菌株を本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現のための最適な菌株として選択した。
【００８７】
＜２−２＞組換えタンパク質の発現
前記実施例＜２−１＞で最適な菌株として確認された大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３それぞれを前記実施例＜２−１＞と同様の方法で形質転換させた後、０．７ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、これから得られた溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００８８】
図６に示すように、約１９〜２０ｋＤａの大きさを有する本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、封入体の形態でほとんど不溶解性分画に含まれており、ＩＰＴＧ無処理培養液（−）に比べてＩＰＴＧ処理培養液（＋）において目的のタンパク質の発現が顕著に増加したことを確認した。
【００８９】
実施例３：組換えタンパク質の精製及びリフォールディング
＜３−１＞組換えタンパク質の精製
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、封入体の形態で不溶解性分画に存在するので、これを精製するために、強力な変性剤として８Ｍ尿素を用いた。
【００９０】
まず、本発明の組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ（対照群）のそれぞれに形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）菌株を前記実施例２のように１ｌのＬＢ培地に培養した。それぞれの培養液を遠心分離して得た菌体を２０ｍｌの溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＮ及びＨＮＭ１：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０；他のＣＰ−Ｎｍ２３：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に気泡が生じないように注意しながら懸濁し、これをマイクロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）付きのソニケーターを用いて低温で菌体を破砕した。この際、処理時間は、装置の出力を最大出力の２５％に設定し、５分間３０秒処理後、１０秒放置を繰り返した。十分に溶菌された封入体を４℃で１分当り回転数４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を回収した。回収された上清をニトリロ三酢酸アガロース（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｇａｒｏｓｅ）にＮｉを付与したＮｉ−ＮＴＡアガロースレジンにローディングした。この際、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースレジンは、予め溶解緩衝液で２時間〜一晩中洗浄して平衡化させてから用いた。上清を４℃で８時間以上振盪機でゆっくり攪拌しながらレジンに吸着させた。組換えタンパク質が含まれた封入体が吸着したレジンを４℃で１分当り回転数１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して反応液を除去し、非特異的吸着物質を除去するために、レジンを洗浄緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＮ及びＨＮＭ１：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．３；他のＣＰ−Ｎｍ２３：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ６．３）を用いて５回洗浄した。洗浄されたレジンにｐＨ４．５の酸性条件でレジン容積２倍の溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＮ及びＨＮＭ１：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ４．５；他のＣＰ−Ｎｍ２３：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ４．５）をローディングし、振盪機で２時間以上を攪拌してタンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質の純度を検定するために、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで軽く振盪しながら染色し、目的のタンパク質のバンドが明確になるまで脱色液を用いて脱色した。
【００９１】
その結果、図６に示すように、マーカータンパク質の泳動位置と比較してｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤがそれぞれ融合された全ての細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が約１９〜２０ｋＤａの部位で単一バンドとして検出され、不溶解性分画から純粋に精製されたことを確認した。
【００９２】
＜３−２＞組換えタンパク質のリフォールディング
前記実施例＜３−１＞のように、不溶解性分画から精製された本発明の組換えタンパク質は、強力な変性剤である８Ｍ尿素により変性されたため、これを活性形態に転換するために、下記の通りリフォールディング過程を行った。
【００９３】
まず、精製された組換えタンパク質を、リフォールディング緩衝液（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．５５Ｍグアニジン［Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ］ＨＣｌ、０．８８Ｍ Ｌ−アルギニン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮＤＳＢ、１ｍＭ酸化型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ］及び１ｍＭ還元型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ］）を用いて４℃で２４時間透析して変性剤を除去することによって、組換えタンパク質を再活性、即ち、リフォールディングさせた。その後、活性化された組換えタンパク質を細胞培養用培地である１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）の中で透析膜（Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｐｌｅａｔｅｄ、ＰＩＥＲＣＥ）を用いて４℃で１０時間攪拌しながらろ過した。この際、３時間ごとに容器内のＤＭＥＭを交換した。前記リフォールディング過程により活性形態に転換された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を以後の実験に用いた。
【００９４】
実施例４：Ｎｍ２３組換えタンパク質の定量的細胞透過性分析
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性を定量的に検証するために、下記の通り、哺乳動物細胞におけるそれぞれの組換えタンパク質の細胞内流入を蛍光活性化細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）で分析した。
【００９５】
まず、前記において、可溶性形態に分離、精製された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を用いて蛍光標識した。２〜２０ｍｇの組換えタンパク質に３３３ｍｇ／ｍｌ濃度のＦＩＴＣ １μｌを混合した後、光を避けて常温で１時間振盪しながら結合させた。蛍光で標識された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、４℃で２日間ＤＭＥＭ培地に対して透析し、標識されていないＦＩＴＣを除去し、これから回収された組換えタンパク質は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質定量法でその濃度を分析した。その結果、それぞれの組換えタンパク質の濃度は約０．７μｇ／μｌと測定された。
【００９６】
一方、マウスのマクロファージに由来するＲＡＷ ２６４．７細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ＷｅｌＧＥＮＥ）５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地（ＷｅｌＧＥＮＥ）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で培養した。
【００９７】
培養後、前記で準備されたＦＩＴＣ−標識細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ１Ｎ、ＨＮＭ１、ＨＭ１ＮＭ１、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）それぞれを１０μＭの濃度でＲＡＷ ２６４．７細胞に処理した後、３７℃で１時間さらに培養した。次いで、組換えタンパク質が処理されたＲＡＷ ２６４．７細胞の細胞膜に露出されている遊離ＦＩＴＣを除去するために、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔ／Ｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理し、低温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。準備された細胞に対してセルクエストプロ細胞測定分析ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ）で分析した。この際、各試料の細胞濃度は１×１０４個／μｌであり、分析実験は２回以上行った。本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性は、ＭＴＤを含んでいない対照群タンパク質（ＨＮ）の細胞透過性と比較して決定した。
【００９８】
その結果、図７ａ及び７ｂに示すように、本発明による全ての細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、対照群に比べて遥かに高い水準の原形質膜透過能力を示すことを確認した。図７ａ及び７ｂにおいて、灰色の曲面は細胞単独、黒色の曲線はＦＩＴＣ単独、青色の曲線はＭＴＤが融合されていない対照群（ＨＮ）、赤色の曲線は細胞透過性組換えタンパク質ＨＭ１Ｎ、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３、緑色の曲線は細胞透過性組換えタンパク質ＨＮＭ１、そしてオレンジ色の曲線は、細胞透過性組換えタンパク質ＨＭ１ＮＭ１を示す。
【００９９】
実施例５：Ｎｍ２３組換えタンパク質の顕微鏡的細胞透過性分析
細胞内に伝達された本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞内位置を視覚的に確認するために、マウスの線維芽細胞に由来するＮＩＨ３Ｔ３細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）をＦＩＴＣ標識された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ１Ｎ、ＨＮＭ１、ＨＭ１ＮＭ１、ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）それぞれで処理した後、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
【０１００】
まず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を８ウェルチャンバースライド（８−ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅ、ＬａｂＴｅｋ、Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ）で２４時間培養した。この際、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％ＦＢＳ及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。培養された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ、ＦＩＴＣ含有無血清ＤＭＥＭ、またはＦＩＴＣ標識された組換えタンパク質それぞれを１０μＭ含有する無血清ＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ２の下で１時間処理した。１時間経過後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で室温で２０分間処理して固定させた。
【０１０１】
前記で固定された細胞は、ＭＴＤの細胞内伝達部位の区別が容易なように核を蛍光染色するヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）対比染色を通じて核への伝達及び細胞透過性の有無を確認した。１μｇ／ｍｌの濃度で５分間ＰＩで染色した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞内組換えタンパク質の蛍光標識を保存するために、１０μｌのＤＡＢＣＯ（Ｆｌｕｃａ）含有ポリビニルアルコール封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）をスライド上に点滴した後、１５分後に共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。この際、共焦点レーザー走査顕微鏡は、ノマルスキーフィルター（ｎｏｍａｒｓｋｉ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて細胞の原形、ＦＩＴＣ蛍光及びＰＩ蛍光を観察し、ＦＩＴＣは、４８８ｎｍで励起され、５３０ｎｍのバンドパスフィルタ（ｂａｎｄｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）で検出された。
【０１０２】
その結果、図８ａ〜８ｃに示すように、本発明によるＦＩＴＣ標識された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、細胞単独、ＦＩＴＣ単独及びＭＴＤ非存在の対照群に比べて核内に広範囲に分布していることが分かる。ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤまたはＪＯ−７７ＭＴＤに融合された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞内局在は、前記フローサイトメトリーの相対的細胞透過性結果に比例するものであり、前記結果は、本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性を再度立証するものである。
【０１０３】
実施例６：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理された癌細胞におけるＭＡＰＫ信号伝達抑制効果の確認
細胞透過性が立証されたＮｍ２３組換えタンパク質の細胞内機能を確認するために、３種類の癌細胞株を対象に前記組換えタンパク質の生化学的機能をウェスタンブロッティング分析で調査した。
【０１０４】
本実験に用いた高転移性ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、韓国細胞株銀行（ソウル、大韓民国）から入手した。これら細胞株は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）に接種して５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。ヒト肺癌細胞株であるＣＣＬ−１８５はＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＨａｍＦ−１２Ｋ培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１５００ｍｇ／ｌの重炭酸ナトリウム）に接種して５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。
【０１０５】
６−ウェルプレートに一つのウェル当り２ｍｌのＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＣＣＬ−１８５をそれぞれ５×１０６個／ｍｌの濃度で接種した。前記ウェルプレートを３７℃で１日間培養して、細胞がウェルプレートに付着して成長するようにした。培地を除去した後、ウェルプレートに付着した細胞を低温のＰＢＳで洗浄した。本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質及びＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）をそれぞれ１０μＭの濃度で各ウェルに５００μｌずつ処理した後、１時間５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで反応させた。この際、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に対しては、ＨＭ１Ｎ、ＨＮＭ１、ＨＭ１ＮＭ１、ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３組換えタンパク質を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＣＣＬ−１８５細胞に対しては、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３組換えタンパク質を処理した。１時間処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、血清の存在下で同一の条件でそれぞれ異なる時間（２、４、６及び８時間）培養した。
【０１０６】
培養が終結した後、細胞を２００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１％トリトン−Ｘ、１０％グリセロール及びタンパク分解酵素阻害剤［ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ］）を用いて氷で３０分間粉砕して集め、得られた細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を４℃で１分当り回転数１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。これから上清を慎重にとり、ペレットを除去した。細胞溶解物中のタンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質分析法で定量した。前記組換えタンパク質を２５μＭの濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、注：組成記載）に添加して細胞溶解物試料を製造し、これを９５℃で５分間加熱した後、使用前まで−２０℃で保管した。
【０１０７】
ウェスタンブロッティング分析のために、ｐ２１（２１ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５、５３ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ（Ｓｅｒ２１７／２２１、４５ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、４２／４４ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を一次抗体として用い、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた。前記で準備された細胞溶解物試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで１００Ｖで２時間電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に１００Ｖで９０分間転写させた。抗体との非特異的吸着を防止するために、前記膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）に溶解させた５％（ｗ／ｖ）脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で室温で１時間攪拌しながらブロッキング処理した。ブロッキング緩衝液を除去した後、膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で３回洗浄した。これに、一次抗体（新たに製造されたブロッキング緩衝液で１：１００００の比率に希釈される）それぞれを添加し、攪拌しながら４℃で一晩中反応させた。一次抗体溶液を除去した後、前記膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で１回当たり５分ずつ室温で５回洗浄した。次いで、前記膜に二次抗体（新たに製造されたブロッキング緩衝液で１：５０００の比率に希釈される）を添加し、攪拌しながら室温で１時間程度反応させた。反応が終結した後、膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で５回洗浄し、化学発光検出用ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＫ）試薬を用いてタンパク質を検出した。
【０１０８】
図９に示すように、全体的にＭＴＤが融合されていない対照群タンパク質に比べ、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理された細胞において、細胞内に透過されたＮｍ２３によりＭＡＰＫカスケードのスキャフォールドタンパク質であるＫＳＲのセリン３９２はリン酸化されるのに対し、腫瘍の細胞周期を活性化させるＥＲＫのリン酸化（Ｐ−ＥＲＫ）は減少した。特に、Ｎｍ２３のＮ及びＣ末端のそれぞれにＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質ＨＭ３Ｎ及びＨＮＭ３が３種のヒト癌細胞株の全てにおいてＥＲＫ及びＭＥＫのリン酸化に対して抑制効果を示すことを確認した。
【０１０９】
実施例７：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビトロ抗転移効果確認
＜７−１＞浸潤分析
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理された癌細胞において、癌細胞の移動が遮断されて癌転移が抑制されるかどうかを確認するために、下記のような浸潤分析を行った。
【０１１０】
まず、ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５を成長因子の添加なしに１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で一晩中培養した。その翌日、細胞をトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で処理して収穫した後、前記と同一のＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。これに対して、対照群としてＭＴＤに融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）と、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）により、それぞれ１０μＭの濃度で３７℃で１時間処理した。一方、３μｍの気孔サイズを有するトランスウェル（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ）ポリカーボネートメンブレンフィルター（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）の上部をマトリゲル（各ウェル当り４０μｇ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした。チャンバーの下部に付着基質（ａｄｈｅｓｉｖｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。０．１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に、前記でタンパク質処理された細胞を懸濁して細胞懸濁液を作った後、前記トランスウェルメンブレンフィルター（各ウェル当り１×１０５細胞）上に接種し、３７℃、５％ＣＯ２下で、２０〜２４時間培養した。フィルターをＰＢＳで洗浄し、上部表面に残っている非浸潤の細胞を綿棒で除去した。浸潤されてフィルターの下部表面に付着されている細胞を４％パラホルムアルデヒドで５〜１０分間固定させ、０．５％（ｗ／ｖ）ヘマカラー（ｈｅｍａｃｏｌｏｒ）で１０〜２０分間染色した。膜の基底面に移動した細胞の数（紫色）を光学顕微鏡で観察しながらカウントした。
【０１１１】
その結果、図１０に示すように、大部分の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質、特に、ＨＭ２Ｎ、ＨＭ３Ｎ及びＨＮＭ３組換えタンパク質で処理された場合、対照群タンパク質（ＨＮ）に比べて浸潤された細胞の数が顕著に減少したことが分かる。これから本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質により細胞内に流入したＮｍ２３が癌細胞の転移能を効果的に抑制できることをインビトロで確認した。
【０１１２】
＜７−２＞創傷移動分析
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が、移動能力に非常に優れた乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の移動を抑制できるかどうかを確認するために、創傷移動分析（ｗｏｕｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。
【０１１３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を６０ｍｍの培養容器に底が見えない程度まで培養した後、これに対して、対照群としてＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）と、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）により、それぞれ１０μＭの濃度で３７℃で１時間処理した。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、黄色チップ（ｙｅｌｌｏｗ ｔｉｐ）で培養容器の底の細胞を掻き出して基準線（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌｉｎｅ）を引き、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地を３ｍｌ添加し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでさらに培養した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した後、メタノールで１分間固定させ、ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で５分間染色して水で洗浄した後、倒立顕微鏡を用いて４０倍で観察し、基準線を超えて移動した細胞を観察した。
【０１１４】
その結果、図１１に示すように、前記浸潤分析結果に相応するように対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質、特に、ＨＭ２Ｎ、ＨＭ３Ｎ及びＨＮＭ３組換えタンパク質で処理された細胞で癌細胞の移動が顕著に抑制されることを確認した。
【０１１５】
実施例８：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビボ抗転移効果の確認
インビトロで立証された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の転移抑制効果をインビボでも確認するために、下記免疫組織化学的分析（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。
【０１１６】
まず、１×１０７細胞数の高転移性ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁した後、ＭＨＣに対する突然変異として免疫力が欠乏した５週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ）の外側尾静脈に注射した。実験は、ＪＯ−７７ＭＴＤが融合された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ、３００μｇ）、対照群として担体（ＰＢＳ、３００μｌ）とＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ、３００μｇ）、及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＨＭ３Ｅ、３００μｇ）を投与する計４群を対象に行った。この際、１群は５匹から構成されており、ＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰは、Ｎｍ２３に融合されるＪＯ−７７ＭＴＤがＮｍ２３の発現に影響を与えるかどうかを確認するための対照群として用いられた。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞をマウスに接種し、５週後、前記タンパク質を各群のマウスに２１日間毎日静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して投与した。２１日経過後、各群当り３匹のマウスを無作為に選別して犠牲にし、肺から組織を摘出した。この際、各群の残った２匹のマウスは、２１日間のタンパク質処理後、さらに１４日間の無処理観察期間を経てから前記と同様に肺から組織を摘出した。摘出された肺組織は、転移性コロニー（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ）の検出のために、ブアン固定液（Ｂｏｕｉｎ ｆｉｘａｔｉｏｎ）で一晩中固定した後、蒸留水で洗浄し、パラフィンに包理してパラフィンブロックを作製した。作製されたパラフィンブロックをマイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて厚さ５μｍに薄切りにしてスライドに付着させた後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）を５分ずつ３回処理してパラフィンを除去した。このように準備された組織スライドを対象に転移マーカー（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるビメンチンで免疫組織化学的染色を行った。
【０１１７】
免疫組織化学的染色のために、抗ビメンチン抗体（Ａｂｃａｍ）を一次抗体として用い、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた。抗体との非特異的吸着を防止するために、前記組織スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）に浸け、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で室温で１時間攪拌しながらブロッキング処理した。ブロッキング緩衝液を除去した後、スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液で３回洗浄し、一次抗体として抗ビメンチン抗体（ＰＢＳで１：２００の比率に希釈される）を添加し、攪拌しながら４℃で一晩中反応させた。一次抗体溶液を除去した後、前記スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液で１回当たり５分ずつ室温で５回洗浄した。次いで、前記スライドに二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＰＢＳで１：２００の比率に希釈される）を添加し、攪拌しながら室温で１時間程度反応させた。反応が終結した後、スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液（０．０２５％トリトン−Ｘ１００）で２回洗浄し、ＤＡＢ基質を用いて転移マーカーであるビメンチンの発現を検出した。
【０１１８】
図１２ａは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を２１日間投与したマウスから摘出した肺組織、及び前記投与を中止して１４日間の無処理期間を経たマウスから摘出した肺組織を肉眼で観察した結果を示す。図１２ａに示すように、担体、対照群タンパク質（ＨＮ）及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰ（ＨＭ３Ｅ）で処理されたマウスの肺組織では、２１日間のタンパク質の処理にもかかわらず、肉眼でも識別可能な大きさの腫瘍が形成されていることが分かる。また、タンパク質処理後、２週間の無処理期間を経た後にも腫瘍の大きさが減少しなかっただけでなく、周辺の他の組織にも新しい腫瘍が形成され、転移がなされたことが分かる。しかし、本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ）で処理されたマウスの肺組織では、３週間のタンパク質処理期間だけでなく、連続した２週間の無処理期間にも腫瘍形成が観察されず、腫瘍の形成及び転移が効果的に抑制されたことを確認した。
【０１１９】
また、図１２ｂは、タンパク質処理２１日目のマウスから摘出した肺組織、及び前記投与中止後２週間の無処理期間（３５日目）を経たマウスから摘出した肺組織において、転移マーカーであるビメンチンの発現を免疫組織化学的に染色した結果を示す。図１２ｂに示すように、担体、対照群タンパク質（ＨＮ）及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰ（ＨＭ３Ｅ）で処理されたマウスの肺組織では、２１日目及び３５日目の両方においてビメンチンが検出されたのに対し、本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ）で処理されたマウスの肺組織では、２１日目及び３５日目の両方においてビメンチンが検出されなかった。これから本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が癌転移を効果的に抑制できることをインビボで確認した。
【０１２０】
実施例９：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビボアポトーシス誘導効果の確認
細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の投与後、腫瘍組織内でアポトーシスが誘導されるかを確認するために、前記実施例８のマウス動物モデルを用いてＴＵＮＥＬ分析を行った。この際、ＴＵＮＥＬ分析は、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）であるＴＭＲレッド（ＴＭＲ ｒｅｄ、Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【０１２１】
具体的には、前記実施例８のように、４群のマウスに静脈注射で細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ）と、対照群として担体、ＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰタンパク質（ＨＭ３Ｅ）を２１日間処理した各群のマウス、及び前記投与中止後、１４日間の無処理期間を経た各群のマウスから摘出した肺組織に対してパラフィンブロックを作製した。作製されたパラフィンブロックをマイクロトームを用いて厚さ５μｍに薄切りにしてスライドに付着させた後、キシレンを５分間３回処理してパラフィンを除去した。次いで、無水エタノールで５分間２回、９０％、８０％及び７０％エタノールでそれぞれ３分間処理して含水させ、ＰＢＳで５分間保管した。その後、３７℃で８分間０．１％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液に溶かした０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｉｏｎ（登録商標））Ｘ−１００溶液で細胞を透過させた後、ＰＢＳで２分間２回洗浄した。ＴＵＮＥＬ反応緩衝液（５０μｌ、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）を前記組織スライド上に処理し、１時間３７℃の湿潤インキュベーターで培養した後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。
【０１２２】
その結果、図１３に示すように、担体、ＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰタンパク質を処理したマウスの全ての肺組織では特に変化が観察されなかったのに対し、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を処理したマウスの肺組織では、アポトーシスの際、赤く染色される変化が観察された。前記結果から本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビボアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。また、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週間後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されることが分かった。
【０１２３】
実施例１０：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の投与後のタンパク質発現様相の比較
細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与された組織におけるタンパク質発現様相の変化を確認するために、下記の通りマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析を行った。
【０１２４】
具体的には、前記実施例９と同様の方法で、３群のマウスに腫瘍直接注射によって細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質ＨＭ３Ｎと、対照群としてＨＮ及び担体を１４日間処理した後、この処理を中止して１４日間放置した。計２８日経過後、各群のマウスから腫瘍組織を分離した後、これを液体窒素で急速冷却させた。腫瘍組織から全ＲＮＡをトリゾル試薬（ＴＲＩＺＯＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの指針に従って分離し、これを無ＲＮａｓｅ ＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で処理して残存するゲノムＤＮＡを除去した。
【０１２５】
前記で分離されたＲＮＡに対して、標的ｃＲＮＡプローブの合成及びハイブリダイゼーションをメーカーの指針に従ってロー・ＲＮＡ・インプット・リニア・アンプリフィケーションキット（Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。簡略に説明すると、それぞれの計ＲＮＡ １μｇとＴ７プロモータープライマーを混合し、６５℃で１０分間反応させた。５×一本鎖緩衝液、０．１Ｍ ＤＴＴ、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ及びＭＭＬＶ−ＲＴ（逆転写酵素）を混合してｃＤＮＡマスタミックス（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）を製造した後、これを前記反応混合物に添加した。この混合物を４０℃で２時間反応させた後、６５℃で１５分間反応させて逆転写反応及びｄｓＤＮＡ合成を終結させた。メーカーの指針に従って、４×転写緩衝液（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＮＴＰミックス、５０％ＰＥＧ、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ、無機ピロホスファターゼ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、及びシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ、３／５−ＣＴＰ）を用いて転写マスタミックスを製造した。この転写マスタミックスをｄｓＤＮＡ反応混合物に添加し、４０℃で２時間反応させてｄｓＤＮＡの転写を行った。増幅されて標識されたｃＲＮＡをメーカーの指針に従って、ｃＲＮＡクリーンアップモジュール（ｃＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で精製した。
【０１２６】
標識されたｃＲＮＡ標的をＮＤ−１０００分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて定量した。標識効率を調査した後、ｃＲＮＡに１０×ブロッキング剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）及び２５×フラグメンテーション緩衝液（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、６０℃で３０分間反応させてｃＲＮＡの断片化を行った。断片化されたｃＲＮＡを２×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁した後、全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ（Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、４４Ｋ）上にピペットを用いて直接滴加した。ハイブリダイゼーションオーブン（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｖｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて前記マイクロアレイを６５℃で１７時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズしたマイクロアレイをメーカー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の洗浄指針に従って洗浄した。
【０１２７】
ハイブリダイゼーションパターンをＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて読み出し、特徴抽出ソフトウェア（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で定量した。倍率変化した（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ）遺伝子の全てのデータ標準化及び選別は、ジーンスプリングＧＸ（Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。標準化比率の平均は、標準化された信号チャンネル強度を標準化された対照群のチャンネル強度で割って計算した。遺伝子の機能的アノテーションは、遺伝子オントロジーコンソーシアム（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（商標） Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に従ってジーンスプリングＧＸにより行われた。
【０１２８】
前記マイクロアレイ分析結果を図１４及び下記表３〜９に示すが、表３は、アポトーシスに係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表４は、細胞付着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表５は、細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）の調節に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表６ａ及び６ｂは、細胞成長（ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）に係わる遺伝子の発現様相を示したものであって、表７は、細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表８ａ及び８ｂは、免疫反応（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表９は、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものである。
【０１２９】
【表３】
【０１３０】
【表４】
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
【表６ａ】
【０１３３】
【表６ｂ】
【０１３４】
【表７】
【０１３５】
【表８ａ】
【０１３６】
【表８ｂ】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
前記表３に示したように、アポトーシスに係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてカスパーゼ１４（Ｃａｓｐａｓｅ １４）の発現が約３．５倍程度、細胞死誘導ＤＦＦＡ類似エフェクタｃ（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＦＦＡ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃ、Ｃｉｄｅｃ）の発現が４倍以上、細胞死誘導ＤＮＡ断片因子（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、アルファサブユニット類似エフェクタＡ（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ａ、Ｃｉｄｅａ）の発現がそれぞれ約２．５倍以上上方調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されることが分かる。
【０１３９】
前記表４に示したように、細胞付着に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてカドヘリン類似２６（ｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ ２６）の発現が３倍以上下方調節されることが分かる。
【０１４０】
前記表５に示したように、細胞周期調節に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群において鳥類赤芽球症ウイルスＥ−２６癌遺伝子（Ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｅ−２６（ｖ−ｅｔｓ）ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の発現が４倍以上下方調節されることが分かる。
【０１４１】
前記表６ａ及び６ｂに示したように、細胞成長に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群において腫瘍壊死因子受容体（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ １７）の発現が６．８倍以上上方調節され、口蓋、肺及び鼻上皮癌関連遺伝子（ｐａｌａｔｅ、ｌｕｎｇ ａｎｄ ｎａｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ）の発現が約２６倍下方調節されることが分かる。
【０１４２】
前記表７に示したように、細胞増殖に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてトランスクリプション−６のシグナルトランスデューサ及び活性体（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ６）の発現が約５倍程度上方調節されることが分かる。
【０１４３】
前記表８ａ及び８ｂに示したように、免疫反応に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群において免疫グロブリン重鎖（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｊ５５８ ｆａｍｉｌｙ）、免疫グロブリン重鎖複合体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）及び免疫グロブリン連結鎖（ｊｏｉｎｉｎｇ ｃｈａｉｎ）の発現がそれぞれ１８倍、１５倍及び３０倍以上上方調節されることが分かる。
【０１４４】
前記表９に示したように、転移に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてＦａｓｃｉｎ同族体１（ｆａｓｃｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ １、ａｃｔｉｎ ｂｕｎｄｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現が２．５倍以上、プロスタグランジンエンドペルオキシド合成剤２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）の発現が２．５倍以上、及び血管細胞付着分子１（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）の発現が２倍以上上方調節されることが分かる。
【０１４５】
以上で本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるわけではない点は明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言える。
【０１４６】
受託証１
【０１４７】
受託証２
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌転移抑制因子（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｓｕｐｒｅｓｓｏｒ）Ｎｍ２３に巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されて細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現ベクター、及び前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有する癌転移抑制用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｍ２３遺伝子は、正常組織の発達及び分化に関与するタンパク質をコードし、様々な転移性細胞株においてその減少した発現が報告されている。一般に、１５０〜１８０個のアミノ酸からなるＮｍ２３タンパク質は、ロイシンジッパーモチーフ（ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｍｏｔｉｆ）を含み、二リン酸ヌクレオシドキナーゼ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ；ＮＤＰＫ）活性を有する。２つのヒトＮｍ２３異性体であるＮｍ２３−Ｈ１及びＮｍ２３−Ｈ２は、それぞれ１７，１４３及び１７，２９４の分子量を有する１５２個のアミノ酸からなる。特に、Ｎｍ２３−Ｈ１は、腫瘍の転移及び他の様々な細胞機構、例えば、細胞増殖、胚発達、分化、腫瘍形成などに重要な役割を担当することが究明されている。
【０００３】
Ｎｍ２３が癌転移及び発達に影響を及ぼす機構は、今のところ明確に明らかになってはいない。ＮＤＰＫは、共有結合性リン酸化酵素（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｚｙｍｅ）中間体を通じて三リン酸と二リン酸ヌクレオシドとの間にリン酸基を伝達するが、Ｎｍ２３−Ｈ１及びＮｍ２３−Ｈ２のヒスチジン１１８は、このような一時的なリン酸化部位として作用する。ＮＤＰＫ関連ヒスチジンリン酸化とは別個に、セリンの自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）がＮｍ２３で観察された（ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＮＪら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５７８０−２５７８９（１９９３）（非特許文献１））。Ｎｍ２３でトランスフェクトされたマウスの黒色腫細胞を対照細胞と比較することにより、Ｎｍ２３のセリンの生体内リン酸化水準と腫瘍転移能の抑制との間に直接的な関連性が観察された。マウスＮｍ２３のセリンリン酸化は、生体内でｃＡＭＰにより、そして生体外でフォースコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）により抑制されるが、これは、前記リン酸化が信号伝達経路により調節されることを示す。
【０００４】
強力な癌転移抑制遺伝子としてのＮｍ２３は、もともとその発現が転移能の低いマウス黒色腫細胞株と密接に関連していると報告されている。Ｎｍ２３の減少した発現が腫瘍転移と関連しているというのは、Ｎｍ２３が癌転移抑制因子であることを示す直接的な証拠であると考えられている（Ｓｔｅｅｇ、Ｐ．Ｓ．、Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓ．１０：４７−５０（１９９８）（非特許文献２））。Ｎｍ２３の誘導性高発現は、高転移性癌細胞株において顕著に減少した転移能を示した。暫定的な癌転移抑制因子遺伝子としてクローニングされたＮｍ２３遺伝子は、ＮＤＰＫ活性以外に、セリン／トレオニン特異的ホスホトランスフェラーゼ（ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びヒスチジンタンパク質キナーゼ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）活性を有している。Ｎｍ２３の発現はまた、造血肝細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＨＳＣ）が分化される間に減少するが、これは、Ｎｍ２３が細胞において抗分化に重要な因子であることを立証するものである（Ｇｅｒｖａｓｉ、Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ７：１６８９−９５（１９９６）（非特許文献３））。Ｎｍ２３は、ヒト腫瘍の遺伝子強制誘導性発現及びインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転移モデルシステムにおいて、一時的感染の際、強力な癌転移抑制効果を示すことが確認された（Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１２４９−５０（１９９１）（非特許文献４）；Ｎａｋａｙａｍａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１３４９−５４（１９９２）（非特許文献５）；Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２３２５−３３（１９９３）（非特許文献６）； Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：８５５−６５（１９９３）（非特許文献７））。しかし、ＮＤＰＫ活性の消失をもたらすＮｍ２３の突然変異は、乳癌細胞においてＮｍ２３の抑制機能に影響を及ぼさなかった（ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５１０７−１６（１９９６）（非特許文献８））。
【０００５】
Ｎｍ２３が癌転移抑制因子であるという事実を立証する最も強力な証拠は、癌細胞株内へのＮｍ２３遺伝子のトランスフェクションである。転移適格細胞（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）において、Ｎｍ２３の細胞内高用量は、対照群のトランスフェクト体に比べて４０〜９８％減の転移活性を示した（Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ６５：２５−３５（１９９１）（非特許文献９）；Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２３２５−３３（１９９３）（非特許文献６））。
【０００６】
最近の研究によると、Ｎｍ２３は、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）及び線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）システムで究明されたＲａｓキナーゼ抑制因子（ｋｉｎａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｒａｓ；ＫＳＲ）と相互作用することが報告されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ．Ｋ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：１６０９−１２（２００１）（非特許文献１０））。ＫＳＲは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫ）カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）のスキャフォールドタンパク質である（Ｂｕｒａｃｋ、Ｗ．Ｒ．及びＳｈａｗ、Ａ．Ｓ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２１１−６（２０００）（非特許文献１１）；Ｐａｗｓｏｎ、Ｔ．及びＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２０７５−８０（１９９７）（非特許文献１２））。スキャフォールドは、リン酸化の速度を向上させるだけでなく、経路の特異性及び安定化に寄与するのに必須である。一旦ＭＡＰＫ信号伝達機構が活性Ｒａｓにより活性化されると、ＫＳＲは強制的に脱リン酸化され、ＭＡＰＫカスケードの活性化のためのスキャフォールドとして作用するようになる。この過程で、Ｎｍ２３は、ＫＳＲの他の関連タンパク質の結合部位である、ＫＳＲセリン３９２をリン酸化させ、もしセリン３９２が突然変異される場合は、セリン４３４をリン酸化させる。Ｎｍ２３の転移抑制活性は、Ｎｍ２３遺伝子が注入された様々な腫瘍細胞で転移可能性を抑制することが明確に立証されている（Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３５：７６８−７４（２０００）（非特許文献１３））。ＭＡＰＫカスケードの刺激により活性化された細胞において、Ｎｍ２３及びＫＳＲの相互作用は、ヒスチジン依存性経路を通じてインビトロで複雑な方式でＫＳＲのリン酸化を誘導する（Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ、Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２３８９−９９（２００２）（非特許文献１４））。また、ＫＳＲとＮｍ２３のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）結合は、ＭＡＰＫカスケードを活性化させる活性Ｒａｓの表現型効果を抑制する。
【０００７】
このような発見に基づいて、インビボでＮｍ２３タンパク質の細胞内への多量投与がＫＳＲをリン酸化させて不活性化させ、Ｒａｓ媒介性ＭＡＰＫカスケードを抑制させることができると仮定することができる。そこで、本発明者らは、ＫＳＲの再リン酸化により媒介されるＭＡＰＫ信号伝達カスケードの抑制が癌細胞において細胞増殖、分化及び移動の抑制を誘導し、様々な腫瘍において抗転移効果（ａｎｔｉ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を示すことができることを確信し、これを用いて癌転移抑制用製剤の開発のために鋭意研究努力した。
【０００８】
一方、合成化合物または天然物の小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できるが、タンパク質、ペプチド、核酸のような巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できない。これらは、分子量５００以上の巨大分子で、生きている細胞の原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、即ち、二重脂質膜構造（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を通過することができないことが広く知られている。これを克服するための方法として、「巨大分子細胞内伝達技術（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＭＩＴＴ）」が開発されたが（Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）（非特許文献１５））、これは疾病治療性巨大分子の生体内伝達を可能にすることによって、既存の医薬品開発技術では不可能であったペプチド、タンパク質、遺伝子自体を用いるバイオ新薬物の開発を可能にする。この技術によると、巨大分子は「疎水性巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）」と他の様々な細胞内運搬体と融合され、組換えタンパク質の形態で合成または発現、精製され、細胞内に伝達された後、特定位置に正確かつ迅速に運搬され、所要の様々な役割を効果的に発揮できる。このように巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成化合物などと融合されて細胞内に入れない多くの不透過性物質の伝達を可能にする。
【０００９】
そこで、本発明者は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３に巨大分子伝達ドメインを融合させて細胞透過性を付与したＮｍ２３組換えタンパク質を製造し、この組換えタンパク質がインビトロだけでなく、インビボ環境下でも細胞外部から大量の癌転移抑制因子であるＮｍ２３を細胞内に効果的に伝達し、ヒトの様々な癌で発生するＮｍ２３欠損または機能消失を治療できる癌転移抑制用製剤として使用できることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＮＪら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５７８０−２５７８９（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｔｅｅｇ、Ｐ．Ｓ．、Ｂｒｅａｓｔ Ｄｉｓ．１０：４７−５０（１９９８）
【非特許文献３】Ｇｅｒｖａｓｉ、Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ７：１６８９−９５（１９９６）
【非特許文献４】Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１２４９−５０（１９９１）
【非特許文献５】Ｎａｋａｙａｍａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１３４９−５４（１９９２）
【非特許文献６】Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２３２５−３３（１９９３）
【非特許文献７】Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：８５５−６５（１９９３）
【非特許文献８】ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｎ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５１０７−１６（１９９６）
【非特許文献９】Ｌｅｏｎｅ、Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ６５：２５−３５（１９９１）
【非特許文献１０】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ．Ｋ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：１６０９−１２（２００１）
【非特許文献１１】Ｂｕｒａｃｋ、Ｗ．Ｒ．及びＳｈａｗ、Ａ．Ｓ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２１１−６（２０００）
【非特許文献１２】Ｐａｗｓｏｎ、Ｔ．及びＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２０７５−８０（１９９７）
【非特許文献１３】Ｙｏｓｈｉｄａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３５：７６８−７４（２０００）
【非特許文献１４】Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ、Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２３８９−９９（２００２）
【非特許文献１５】Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）
【発明の概要】
【００１１】
発明が解決しようとする課題
従って、本発明の目的は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３に細胞透過性を付与し、これを細胞内に高効率で導入することによって、様々な癌細胞で細胞増殖、分化及び移動の抑制を誘導し、優れた抗転移効果を奏することができる癌転移抑制剤としての細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を提供することである。
【００１２】
課題を解決するための手段
前記目的を達成するために、本発明は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合によって細胞透過性が付与され、Ｎｍ２３を細胞内に高効率で導入する細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びこの発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００１６】
最後に、本発明は、癌細胞の増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導して癌転移を予防するための、前記Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有する癌転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
発明の効果
本発明の細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質は、癌転移抑制因子であるＮｍ２３を細胞内に高効率で導入してＫＳＲのリン酸化及び不活性化を誘導し、Ｒａｓ−媒介ＭＡＰＫ連続段階を抑制することによって、癌細胞の増殖、分化及び移動を抑制し、癌転移を効果的に予防できる癌転移抑制剤として有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明によってｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤのいずれか１つが融合された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質の構造を示す。
【図２】図２ａは、図１で考案されたｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果であり、図２ｂは、図１で考案されたＪＯ−７６ＭＴＤまたはＪＯ−７７ＭＴＤが融合された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果である。
【図３】図３ａは、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターにＰＣＲ増幅産物をサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）する過程を示す模式図であり、図３ｂ及び３ｃは、それぞれ図２ａ及び２ｂのＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングされたことを確認した結果である。
【図４】図４ａは、組換え断片をｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにクローニングして組換え発現ベクターを作製する過程を示す模式図であり、図４ｂ及び４ｃは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換え断片がｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにクローニングされたことを確認した結果である。
【図５】図５は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現を様々な宿主細胞を対象に調査した結果である。
【図６】図６は、本発明の組換え発現ベクターが形質転換された細菌で発現された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を精製した結果である。
【図７】図７ａ及び７ｂは、それぞれ本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性をフローサイトメトリーで分析した結果である。
【図８】図８ａ〜８ｃは、それぞれ本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果である。
【図９】図９は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のＭＡＰＫ信号伝達抑制効果をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果である。
【図１０】図１０は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の癌転移抑制効果を浸潤分析（ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）で分析した結果である。
【図１１】図１１は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の癌転移抑制効果を創傷移動分析（ｗｏｕｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で分析した結果である。
【図１２】図１２ａは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織において癌転移抑制効果を肉眼で観察した結果であり、図１２ｂは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織において、転移マーカー（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）の発現を免疫組織化学的（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に染色した結果である。
【図１３】図１３は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織においてアポトーシス誘導効果をＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）分析で観察した結果である。
【図１４】図１４は、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与されたマウスの肺組織において遺伝子発現の変化をマイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）で分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合によって細胞透過性が付与され、Ｎｍ２３を細胞内に高効率で導入する細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＣＰ−Ｎｍ２３）及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明の特徴は、細胞内への導入が容易でない巨大分子である癌転移抑制因子Ｎｍ２３に特定の巨大分子伝達ドメイン（以下、「ＭＴＤ」と略称する。）を融合させて細胞透過性を付与することによって、Ｎｍ２３を細胞内に高効率で伝達することにある。この際、巨大分子伝達ドメインは、癌転移抑制因子であるＮｍ２３の片末端のみに融合されるか、あるいはその両末端の両方に融合されてもよい。
【００２１】
本発明では、癌転移抑制因子であるＮｍ２３に融合されてもよい巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）、すなわち、細胞内への巨大分子の伝達を可能にする３種のペプチドドメインそれぞれに前記Ｎｍ２３を融合して細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質を開発した。
【００２２】
本発明において「細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質」とは、巨大分子伝達ドメインと癌転移抑制因子Ｎｍ２３を含み、これらの遺伝的融合や化学的結合によって形成された共有結合複合体を意味する。ここで「遺伝的融合」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の遺伝的発現を通じて形成された線状の共有結合からなる連結を意味する。
【００２３】
ＫＳＲの再リン酸化により媒介されるＭＡＰＫ信号伝達カスケードを制御して癌細胞での細胞増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシスを誘導して様々な腫瘍において優れた抗転移活性を示すＮｍ２３は、配列番号：１の塩基配列及び配列番号：２のアミノ酸配列を有する癌転移抑制因子であって、ＫＳＲとＲａｓ媒介性ＭＡＰＫを含む信号伝達カスケードで重要な標的タンパク質として作用する。
【００２４】
Ｎｍ２３タンパク質は、内因性タンパク質であり、その機能についてはＮＤＰ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）−キナーゼ酵素活性があることが報告されており（Ｂｉｇｇｓら、Ｃｅｌｌ ６３、９３３−９４０（１９９０））、転写活性化因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、細胞分化抑制剤（Ｉ ｆａｃｔｏｒ）としても知られている（Ｐｏｓｔｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１、４７８−４８０（１９９３）； Ｏｋａｂｅ−Ｋａｄｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２６７、１０１−１０６（１９９５））。
【００２５】
Ｎｍ２３タンパク質の遺伝子については、ヒトにおいて８種類のアイソタイプ（ｎｍ２３−Ｈ１、ｎｍ２３−Ｈ２、ＤＲ−ｎｍ２３、ｎｍ２３−Ｈ４、ｎｍ２３−Ｈ５、ｎｍ２３−Ｈ６、ｎｍ２３−Ｈ７、およびｎｍ２３−Ｈ８）が発見されたが、これらのいずれも癌転移抑制に関連していることが知られている（Ｒｏｓｅｎｇａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２、１７７−１８０（１９８９）；Ｃｈａｒｐｉｎ Ｃ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４、４１６−４２０（１９９７））。本発明の好ましい実施形態では、Ｎｍ２３−Ｈ１を対象に細胞透過性組換えタンパク質を製造するが、これに限定されない。
【００２６】
前記癌転移抑制因子Ｎｍ２３に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしては、配列番号：４、６、８及び３７〜２２７のアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む細胞透過性を有するポリペプチドを用いてもよい。前記配列番号：４、６、８及び３７〜２２７のアミノ酸配列のいずれか１つを有する巨大分子伝達ドメインは、細胞膜を貫通してポリペプチド、タンパク質ドメイン、または全長タンパク質を含む生物学的活性分子の細胞内への流入を媒介できる細胞透過性ポリペプチドである。本発明による巨大分子伝達ドメインは、Ｎ末端領域、疎水性領域及びＣ末端の分泌タンパク質切断部位（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）の３部分からなるシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）においてヘリックス（ｈｅｌｉｘ）を形成し、細胞膜標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）活性を付与する疎水性領域を有するように考案されたものである。このような巨大分子伝達ドメインは、細胞に損傷を加えず、かつ直接細胞膜を透過することによって、標的タンパク質を細胞内に移動させて目的とする機能を発揮させることができる。
【００２７】
本発明によって癌転移抑制因子Ｎｍ２３に融合されてもよい配列番号：４、６、８及び３７〜２２７で表されるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメインを下記表１ａ〜１ｌに示す。
【００２８】
【表１ａ】
【００２９】
【表１ｂ】
【００３０】
【表１ｃ】
【００３１】
【表１ｄ】
【００３２】
【表１ｅ】
【００３３】
【表１ｆ】
【００３４】
【表１ｇ】
【００３５】
【表１ｈ】
【００３６】
【表１ｉ】
【００３７】
【表１ｊ】
【００３８】
【表１ｋ】
【００３９】
【表１ｌ】
【００４０】
前記癌転移抑制因子Ｎｍ２３に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしては、カポジ線維芽細胞成長因子（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４；ｋＦＧＦ４）に由来する配列番号：３の塩基配列及び配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ１」と略称する。）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）として、配列番号：５の塩基配列及び配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ２」と略称する。）、及びヒトの子宮内膜出血関連因子プレプロタンパク質（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）由来の配列番号：７の塩基配列及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ３」として略称する。）を用いてもよい。
【００４１】
本発明の細胞透過性を有するＮｍ２３組換えタンパク質は、巨大分子伝達ドメインとして前記３種類のＭＴＤ（ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ：ＭＴＤ１、ＪＯ−７６：ＭＴＤ２、ＪＯ−７７：ＭＴＤ３）のいずれか１つが癌転移抑制因子Ｎｍ２３の一方または両末端に融合され、この融合コンストラクトの片末端に配列番号：９の塩基配列を有するＳＶ４０巨大Ｔ抗原（ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）由来の核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ、配列番号：１０のアミノ酸配列）と、容易な精製のために、ヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ；Ｈｉｓ−Ｔａｇ）親和性ドメインが融合されている構造を有してもよい。
【００４２】
本発明の一実施形態では、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤのいずれか１つを用いたＮｍ２３組換えタンパク質として８つの全長形態（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｍｓ）を考案する。
【００４３】
本発明において、用語「全長形態」は、癌転移抑制因子Ｎｍ２３の配列番号：２のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換を含んでいない完全な形態のアミノ酸配列を含む形態を意味する。しかし、全長形態のＮｍ２３だけでなく、Ｎｍ２３の抗転移効果を損傷させない範囲内で、そのアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換による様々な変形を含むＮｍ２３誘導体を本発明に用いてもよい。
【００４４】
図１ａを参考とすれば、本発明によるＮｍ２３組換えタンパク質は、
１）全長のＮｍ２３のＮ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）、
２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）、
３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）、
４）そのＮ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）、
５）そのＣ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）、
６）そのＮ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）、
７）そのＣ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）、
８）その両末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）
である。
【００４５】
前記において、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）は配列番号：２２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）は配列番号：２４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）は配列番号：２６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４６】
前記において、ＪＯ−７６ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）は配列番号：２８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）は配列番号：３０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４７】
前記において、ＪＯ−７７ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）は配列番号：３２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）は配列番号：３４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）は配列番号：３６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４８】
本発明では、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の対照群として、ＭＴＤが融合されずに片末端にヒスチジン標識とＮＬＳのみが融合されたＮｍ２３組換えタンパク質Ｈｉｓ−Ｎｍ２３（ＨＮ）を製造する。この対照群タンパク質は、配列番号：２０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４９】
また、本発明は、前記細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター及びこの組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００５０】
本発明において、「組換え発現ベクター」とは、適当な宿主細胞において標的タンパク質または標的ＲＮＡを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結されている必須の調節要素を含む遺伝子コンストラクトをいう。
【００５１】
本発明において、用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的機能を担うように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。例えば、プロモーターとタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が作動可能に連結されてコードする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換え発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野によく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造でき、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結には、当該技術分野に一般に知られた酵素などを用いる。
【００５２】
本発明に使用可能な発現ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。好適な発現ベクターは、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、終結コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、ポリアデニル化信号（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）のような発現調節配列以外にも、膜標的化または分泌のための信号配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、目的に応じて多様に製造されてもよい。発現ベクターのプロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製が可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。
【００５３】
このように製造された本発明の組換え発現ベクターは、例えば、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１であってもよい。前記組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１は、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＭＣＳ）のうちＮｄｅＩ制限酵素部位に、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質として全長のＮｍ２３のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質ＨＮＭ１をコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを意味する。
【００５４】
本発明の一実施例では、タンパク質の精製を容易にする目的で、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のＮ末端部位に、人為的に６つのヒスチジンタグを含めて発現させるために、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列を有しているｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）に本発明のヌクレオチドをクローニングする。
【００５５】
前記組換え発現ベクターから発現される細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、全長形態のＮｍ２３の一方または両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤの中の１つが融合され、そのＮ末端部位にヒスチジンタグとＮＬＳが連結されている。
【００５６】
本発明はまた、前記組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。本発明の形質転換細菌は、好ましくは大腸菌であってもよく、大腸菌を本発明の組換え発現ベクター、例えば、本発明による全長のＮｍ２３のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された細胞透過性組換えタンパク質ＨＮＭ１をコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１を用いることによって、多量の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を発現させることができる。形質転換には、核酸を宿主細胞に導入するいかなる方法も含まれ、当該分野の熟練者に公知となった形質転換技術により行ってもよい。好ましくは、微粒子銃法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、ＰＥＧ媒介性融合法（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｓｉｏｎ）、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びリポソーム媒介法（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）などが含まれるが、これに制限されない。
【００５７】
本発明の好ましい実施例では、前記方法で製造された全長のＮｍ２３のＮ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨＭ３Ｎと全長のＮｍ２３のＣ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨＮＭ３それぞれを含む組換え発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた形質転換細菌を２００８年８月２８日付で韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）内の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ−１１３８０ＢＰ及びＫＣＴＣ−１１３８１ＢＰとして寄託した。
【００５８】
本発明はまた、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００５９】
前記製造方法は、本発明の形質転換細菌に導入された組換え発現ベクターにおいて本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現されるように形質転換細菌を適切な培地及び条件下で培養することにより行われる。前記形質転換細菌を培養して組換えタンパク質を発現させる方法は、当該分野で公知となっており、例えば、形質転換細菌が成長できる適切な培地に接種して継代培養した後、これを本培養用培地に接種し、適切な条件、例えば、遺伝子発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）の存在下で培養することによって、タンパク質の発現を誘導できる。培養が完了すると、前記培養物から実質的に純粋な組換えタンパク質を回収できる。本発明において用語“実質的に純粋な”とは、本発明の組換えタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドの配列が宿主細胞由来の他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００６０】
前記形質転換細菌で発現された組換えタンパク質の回収は、当該分野で公知の様々な分離及び精製方法を通じて行ってもよく、通常、細胞残屑（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）、培養不純物などを除去するために、細胞溶解物を遠心分離した後、沈殿、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿及びリン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）などを行ってもよく、透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行ってもよい。前記クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、親和性カラムクロマトグラフィー及び限外ろ過などの技法を単独で用い、または併用してもよい（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍ．、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））。
【００６１】
一方、組換え発現ベクターで形質転換された細菌で発現された組換えタンパク質は、タンパク質分離の際、タンパク質の特性に応じて溶解性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶解性分画（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に区分され得る。発現されたタンパク質のほとんどが溶解性分画である場合には、前述の方法に従って容易にタンパク質を分離及び精製することができるが、発現されたタンパク質の大部分が不溶解性分画、即ち、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形態で存在する場合には、尿素（ｕｒｅａ）、界面活性剤などのタンパク質変性剤が含まれた溶液で最大限タンパク質を溶解させた後、遠心分離して透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行うことによって精製することができる。この際、タンパク質変性剤が含まれた溶液によりタンパク質の構造が変形されてその活性を失うことがあるので、不溶解性分画からタンパク質を精製する過程中には脱塩及びリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）段階が必要である。即ち、前記脱塩及びリフォールディング段階は、タンパク質変性剤が含まれていない溶液を用いて透析及び希釈を行うか、またはフィルターを用いて遠心分離してもよい。また、前記溶解性分画からタンパク質を精製する過程中にも、精製時に用いる溶液中の塩濃度が高い場合は、このような脱塩及びリフォールディング段階を行ってもよい。
【００６２】
本発明の一実施形態では、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が封入体の形態で不溶解性分画に存在することを確認し、不溶解性分画からこれを精製するために、不溶解性分画をトリトンＸ−１００のような非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液に溶解させた後、超音波で処理し、遠心分離して沈殿物を得る。前記得られた沈殿物を変性剤である尿素が含まれている溶液に溶解させた後、遠心分離して上清を得る。尿素を用いて不溶解性分画から最大限溶解した本発明の組換えタンパク質は、ヒスチジン結合精製キットを用いて精製し、その後精製されたタンパク質は、アミコンフィルターなどを用いた遠心分離により塩分の除去及びタンパク質構造のリフォールディング過程を行うことによって、本発明の組換えタンパク質を得ることができる。
【００６３】
さらに、本発明は、癌細胞の増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシスを誘導して癌転移を予防するのに効果的な、前記Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有する癌転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００６４】
癌転移抑制因子としてＫＳＲとＲａｓ媒介性ＭＡＰＫを含む信号伝達カスケードで重要な標的タンパク質として作用するＮｍ２３は、ＫＳＲの再リン酸化により媒介されるＭＡＰＫ信号伝達カスケードを制御して癌細胞での細胞増殖、分化及び移動を抑制し、アポトーシスを誘導することによって、ヒトの様々な癌において癌の転移を予防及び／又は治療するための癌転移抑制剤として有用に用いられる。
【００６５】
本発明による組換えタンパク質を有効成分として含有する組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体をさらに含んでもよい。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含む。経口投与用の場合、本発明による組換えタンパク質は、賦形剤と混合してチュアブル錠、バッカル剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ及びウエハーなどの形態で用いてもよい。また、非経口投与用担体は、水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含み、安定化剤及び保存剤をさらに含んでもよい。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロリド、メチル−またはプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にして用いてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５））。
【００６６】
本発明による組成物は、種々の非経口または経口投与の形態に剤形化してもよい。非経口投与用剤形の代表的なものは注射用剤形であり、等張性水溶液または懸濁液が好ましい。注射用剤形は、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて当業界に公知となった技術によって製造してもよい。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用に剤形化してもよい。また、経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン）と滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含んでもよい。前記錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリジンのような結合剤を含んでもよく、場合によって、澱粉、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤及び／又は甘味剤をさらに含んでもよい。前記剤形は、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造してもよい。
【００６７】
本発明の組成物は、防腐剤、水和剤、乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤のような補助剤とその他治療的に有用な物質をさらに含んでもよく、通常の方法に従って製剤化してもよい。
【００６８】
また、本発明による組成物の投与経路としては、経口的、または静脈内、皮下、鼻腔内または腹腔内などのように非経口的にヒトと動物に投与してもよい。経口投与は、舌下適用も含む。非経口的投与は、皮下注射、筋肉内注射及び静脈注射のような注射法及び点滴法を含む。
【００６９】
本発明の組成物において、本発明の組換えタンパク質の合計有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与してもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与してもよい。本発明の組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にしてもよいが、通常、成人を基準に１回投与時、５〜２０ｍｇの有効投与量で１日に数回繰り返し投与してもよい。しかし、前記組換えタンパク質の濃度は、薬物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重篤度、食餌及び排泄率等の様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量を決定してもよい。従って、このような点を考慮すると、当該分野の通常の知識を有する者であれば、前記組換えタンパク質の癌転移抑制剤としての特定の用途に応じる適切な有効投与量を決定できるであろう。本発明による組成物は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者に自明であろう。
【００７１】
実施例１：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＣＰ−Ｎｍ２３）の製造
ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）、ＪＯ−７６ＭＴＤ（ＭＴＤ２）及びＪＯ−７７ＭＴＤ（ＭＴＤ３）のいずれか１つを巨大分子伝達ドメインとして用いて細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を製造するために、全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として下記８つの遺伝子コンストラクトを製造した（図１）：
１）全長のＮｍ２３のＮ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）、
２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）、
３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）、
４）そのＮ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）、
５）そのＣ末端にＪＯ−７６ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）、
６）そのＮ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）、
７）そのＣ末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）、及び
８）その両末端にＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＨｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）。
【００７２】
前記組換えタンパク質の遺伝子コンストラクトを製造するために、それぞれに対して特異的に考案されたプライマー対とヒトＮｍ２３ ｃＤＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。この際、ＨＭ１Ｎの増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１２の塩基配列を有し；ＨＮＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１４の塩基配列を有し；ＨＭ１ＮＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１４の塩基配列を有し；ＨＭ２Ｎの増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１５及び１２の塩基配列を有し；ＨＮＭ２の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１６の塩基配列を有し；ＨＭ３Ｎの増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１７及び１２の塩基配列を有し；ＨＮＭ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１８の塩基配列を有し；ＨＭ３ＮＭ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１７及び１８の塩基配列を有する。
【００７３】
前記でそれぞれの組換え断片の増幅のために用いられた正方向及び逆方向プライマー対を下記表２に整理する。
【表２】
【００７４】
ＰＣＲ反応は、鋳型遺伝子としてヒトＮｍ２３ ｃＤＮＡ １００ｎｇ、各０．２ｍＭの終濃度ｄＮＴＰ混合物（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、各２ｍＭ）、０．６μＭの各プライマー、１０×Ｔａｑ緩衝溶液５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）１μｌを含む溶液を最終体積５０μｌの反応液として行った。ＰＣＲ反応条件は、まず９４℃で２分間熱変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）させた後、９４℃で４５秒、５３℃で４５秒及び７２℃で４５秒の反応を２５回繰り返し、最終的に７２℃で５分間増幅した。反応が終わった後、１．０％アガロースゲル電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行い、増幅された生成物を確認した。図２ａ及び２ｂに示すように、ＭＴＤが融合されたそれぞれの組換え断片が目的とする大きさに増幅されたことを確認した。
【００７５】
アガロースゲルで増幅された組換え断片を回収した後、これらのそれぞれを商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて抽出、精製した。抽出した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に挿入した後（図３ａ）、ＭＴＤが融合されたＮｍ２３組換えタンパク質遺伝子断片が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換させた。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含む平板ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養して形質転換された大腸菌を選別し、これを再度液体ＬＢ培地で培養した後、これからそれぞれのＮｍ２３組換えタンパク質遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを多量に得た。
【００７６】
図３ｂは、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）で分離し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００７７】
前記において、それぞれのＮｍ２３組換え断片を含むｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを、制限酵素ＮｄｅＩを用いて３７℃で６時間切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）してそれぞれの組換え断片を得た。一方、ヒスチジンタグとＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）も制限酵素ＮｄｅＩを用いて前記と同一の条件で切断した。前記組換え断片と、切断されたｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターとを電気泳動で分離し、商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて精製した。これらの混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ；Ｔａｋａｒａ、日本）を添加し、１６℃で１２時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換させて組換えタンパク質発現ベクターを得た（図４ａ）。
【００７８】
図４ｂは、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素で分離してアガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００７９】
このように得られた組換えタンパク質発現ベクターを、それぞれｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３と命名し、これらの中で組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３で大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて得られた形質転換細菌ＤＨ５α／ＨＭ３ＮとＤＨ５α／ＨＮＭ３を２００８年８月２８日付で韓国生命工学研究院内の遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１１３８０ＢＰ及びＫＣＴＣ−１１３８１ＢＰとして寄託した。
【００８０】
塩基配列の分析結果、前記でｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３（ＨＭ１Ｎ）は配列番号：２２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＮＭ１）は配列番号：２４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ１−Ｎｍ２３−ＭＴＤ１（ＨＭ１ＮＭ１）は配列番号：２６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８１】
また、ＪＯ−７６ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ２−Ｎｍ２３（ＨＭ２Ｎ）は配列番号：２８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ２（ＨＮＭ２）は配列番号：３０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８２】
さらに、ＪＯ−７７ＭＴＤを用いて製造された全長形態のＮｍ２３組換えタンパク質として、Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３（ＨＭ３Ｎ）は配列番号：３２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＮＭ３）は配列番号：３４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｉｓ−ＭＴＤ３−Ｎｍ２３−ＭＴＤ３（ＨＭ３ＮＭ３）は配列番号：３６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８３】
一方、本発明では、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の対照群として、全長のＮｍ２３にヒスチジンタグのみが融合されているＨｉｓ−Ｎｍ２３（ＨＮ）を製造した。この対照群タンパク質は、配列番号：２０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００８４】
実施例２：組換えタンパク質の発現
＜２−１＞最適な宿主菌株の選抜
細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現誘導に最も適した宿主菌株を選抜するために、ＬａｃＩプロモーターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を対象に下記実験を行った。
【００８５】
まず、前記実施例１で製造された組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、及びｐＨＮ（対照群）それぞれを大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに、それぞれ熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法で形質転換させた。また、前記実施例１で製造された組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３それぞれを大腸菌菌株ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に熱ショック方法で形質転換させた。形質転換後、それぞれを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ平板培地に接種して培養した。前記培地に形成されたコロニーを１ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養した後、これを再度１００ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５に達するまで培養した。この培養液にタンパク質発現の誘導剤として０．７ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で２時間さらに培養した。この培養液を４℃で７，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。回収した菌体を溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波処理を行って細胞を破砕し、これを１４，０００×ｇで１５分間遠心分離して溶解性分画と不溶解性分画を得た。この溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００８６】
図５に示すように、様々な宿主菌株を対象に本発明の組換えタンパク質の発現を調査した結果、一部の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現がＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）菌株において低く観察されたが、ほとんどの細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現が前記菌株において高く示されることが確認された。前記結果から、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）菌株を本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の発現のための最適な菌株として選択した。
【００８７】
＜２−２＞組換えタンパク質の発現
前記実施例＜２−１＞で最適な菌株として確認された大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３それぞれを前記実施例＜２−１＞と同様の方法で形質転換させた後、０．７ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、これから得られた溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００８８】
図６に示すように、約１９〜２０ｋＤａの大きさを有する本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、封入体の形態でほとんど不溶解性分画に含まれており、ＩＰＴＧ無処理培養液（−）に比べてＩＰＴＧ処理培養液（＋）において目的のタンパク質の発現が顕著に増加したことを確認した。
【００８９】
実施例３：組換えタンパク質の精製及びリフォールディング
＜３−１＞組換えタンパク質の精製
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、封入体の形態で不溶解性分画に存在するので、これを精製するために、強力な変性剤として８Ｍ尿素を用いた。
【００９０】
まず、本発明の組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ（対照群）のそれぞれに形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）菌株を前記実施例２のように１ｌのＬＢ培地に培養した。それぞれの培養液を遠心分離して得た菌体を２０ｍｌの溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＮ及びＨＮＭ１：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０；他のＣＰ−Ｎｍ２３：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に気泡が生じないように注意しながら懸濁し、これをマイクロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）付きのソニケーターを用いて低温で菌体を破砕した。この際、処理時間は、装置の出力を最大出力の２５％に設定し、５分間３０秒処理後、１０秒放置を繰り返した。十分に溶菌された封入体を４℃で１分当り回転数４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を回収した。回収された上清をニトリロ三酢酸アガロース（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｇａｒｏｓｅ）にＮｉを付与したＮｉ−ＮＴＡアガロースレジンにローディングした。この際、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースレジンは、予め溶解緩衝液で２時間〜一晩中洗浄して平衡化させてから用いた。上清を４℃で８時間以上振盪機でゆっくり攪拌しながらレジンに吸着させた。組換えタンパク質が含まれた封入体が吸着したレジンを４℃で１分当り回転数１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して反応液を除去し、非特異的吸着物質を除去するために、レジンを洗浄緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＮ及びＨＮＭ１：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．３；他のＣＰ−Ｎｍ２３：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ６．３）を用いて５回洗浄した。洗浄されたレジンにｐＨ４．５の酸性条件でレジン容積２倍の溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＮ及びＨＮＭ１：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ４．５；他のＣＰ−Ｎｍ２３：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ４．５）をローディングし、振盪機で２時間以上を攪拌してタンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質の純度を検定するために、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで軽く振盪しながら染色し、目的のタンパク質のバンドが明確になるまで脱色液を用いて脱色した。
【００９１】
その結果、図６に示すように、マーカータンパク質の泳動位置と比較してｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤ及びＪＯ−７７ＭＴＤがそれぞれ融合された全ての細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が約１９〜２０ｋＤａの部位で単一バンドとして検出され、不溶解性分画から純粋に精製されたことを確認した。
【００９２】
＜３−２＞組換えタンパク質のリフォールディング
前記実施例＜３−１＞のように、不溶解性分画から精製された本発明の組換えタンパク質は、強力な変性剤である８Ｍ尿素により変性されたため、これを活性形態に転換するために、下記の通りリフォールディング過程を行った。
【００９３】
まず、精製された組換えタンパク質を、リフォールディング緩衝液（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．５５Ｍグアニジン［Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ］ＨＣｌ、０．８８Ｍ Ｌ−アルギニン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮＤＳＢ、１ｍＭ酸化型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ］及び１ｍＭ還元型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ］）を用いて４℃で２４時間透析して変性剤を除去することによって、組換えタンパク質を再活性、即ち、リフォールディングさせた。その後、活性化された組換えタンパク質を細胞培養用培地である１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）の中で透析膜（Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｐｌｅａｔｅｄ、ＰＩＥＲＣＥ）を用いて４℃で１０時間攪拌しながらろ過した。この際、３時間ごとに容器内のＤＭＥＭを交換した。前記リフォールディング過程により活性形態に転換された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を以後の実験に用いた。
【００９４】
実施例４：Ｎｍ２３組換えタンパク質の定量的細胞透過性分析
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性を定量的に検証するために、下記の通り、哺乳動物細胞におけるそれぞれの組換えタンパク質の細胞内流入を蛍光活性化細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）で分析した。
【００９５】
まず、前記において、可溶性形態に分離、精製された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を用いて蛍光標識した。２〜２０ｍｇの組換えタンパク質に３３３ｍｇ／ｍｌ濃度のＦＩＴＣ １μｌを混合した後、光を避けて常温で１時間振盪しながら結合させた。蛍光で標識された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、４℃で２日間ＤＭＥＭ培地に対して透析し、標識されていないＦＩＴＣを除去し、これから回収された組換えタンパク質は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質定量法でその濃度を分析した。その結果、それぞれの組換えタンパク質の濃度は約０．７μｇ／μｌと測定された。
【００９６】
一方、マウスのマクロファージに由来するＲＡＷ ２６４．７細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ＷｅｌＧＥＮＥ）５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地（ＷｅｌＧＥＮＥ）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤条件下で培養した。
【００９７】
培養後、前記で準備されたＦＩＴＣ−標識細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ１Ｎ、ＨＮＭ１、ＨＭ１ＮＭ１、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）それぞれを１０μＭの濃度でＲＡＷ ２６４．７細胞に処理した後、３７℃で１時間さらに培養した。次いで、組換えタンパク質が処理されたＲＡＷ ２６４．７細胞の細胞膜に露出されている遊離ＦＩＴＣを除去するために、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔ／Ｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理し、低温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。準備された細胞に対してセルクエストプロ細胞測定分析ソフトウェア（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ）で分析した。この際、各試料の細胞濃度は１×１０４個／μｌであり、分析実験は２回以上行った。本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性は、ＭＴＤを含んでいない対照群タンパク質（ＨＮ）の細胞透過性と比較して決定した。
【００９８】
その結果、図７ａ及び７ｂに示すように、本発明による全ての細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、対照群に比べて遥かに高い水準の原形質膜透過能力を示すことを確認した。図７ａ及び７ｂにおいて、灰色の曲面は細胞単独、黒色の曲線はＦＩＴＣ単独、青色の曲線はＭＴＤが融合されていない対照群（ＨＮ）、赤色の曲線は細胞透過性組換えタンパク質ＨＭ１Ｎ、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３、緑色の曲線は細胞透過性組換えタンパク質ＨＮＭ１、そしてオレンジ色の曲線は、細胞透過性組換えタンパク質ＨＭ１ＮＭ１を示す。
【００９９】
実施例５：Ｎｍ２３組換えタンパク質の顕微鏡的細胞透過性分析
細胞内に伝達された本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞内位置を視覚的に確認するために、マウスの線維芽細胞に由来するＮＩＨ３Ｔ３細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）をＦＩＴＣ標識された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ１Ｎ、ＨＮＭ１、ＨＭ１ＮＭ１、ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）それぞれで処理した後、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
【０１００】
まず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を８ウェルチャンバースライド（８−ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅ、ＬａｂＴｅｋ、Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ）で２４時間培養した。この際、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％ＦＢＳ及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。培養された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、無血清ＤＭＥＭ、ＦＩＴＣ含有無血清ＤＭＥＭ、またはＦＩＴＣ標識された組換えタンパク質それぞれを１０μＭ含有する無血清ＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ２の下で１時間処理した。１時間経過後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で室温で２０分間処理して固定させた。
【０１０１】
前記で固定された細胞は、ＭＴＤの細胞内伝達部位の区別が容易なように核を蛍光染色するヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）対比染色を通じて核への伝達及び細胞透過性の有無を確認した。１μｇ／ｍｌの濃度で５分間ＰＩで染色した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞内組換えタンパク質の蛍光標識を保存するために、１０μｌのＤＡＢＣＯ（Ｆｌｕｃａ）含有ポリビニルアルコール封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）をスライド上に点滴した後、１５分後に共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。この際、共焦点レーザー走査顕微鏡は、ノマルスキーフィルター（ｎｏｍａｒｓｋｉ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて細胞の原形、ＦＩＴＣ蛍光及びＰＩ蛍光を観察し、ＦＩＴＣは、４８８ｎｍで励起され、５３０ｎｍのバンドパスフィルタ（ｂａｎｄｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）で検出された。
【０１０２】
その結果、図８ａ〜８ｃに示すように、本発明によるＦＩＴＣ標識された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質は、細胞単独、ＦＩＴＣ単独及びＭＴＤ非存在の対照群に比べて核内に広範囲に分布していることが分かる。ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−７６ＭＴＤまたはＪＯ−７７ＭＴＤに融合された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞内局在は、前記フローサイトメトリーの相対的細胞透過性結果に比例するものであり、前記結果は、本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の細胞透過性を再度立証するものである。
【０１０３】
実施例６：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理された癌細胞におけるＭＡＰＫ信号伝達抑制効果の確認
細胞透過性が立証されたＮｍ２３組換えタンパク質の細胞内機能を確認するために、３種類の癌細胞株を対象に前記組換えタンパク質の生化学的機能をウェスタンブロッティング分析で調査した。
【０１０４】
本実験に用いた高転移性ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、韓国細胞株銀行（ソウル、大韓民国）から入手した。これら細胞株は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）に接種して５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。ヒト肺癌細胞株であるＣＣＬ−１８５はＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＨａｍＦ−１２Ｋ培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１５００ｍｇ／ｌの重炭酸ナトリウム）に接種して５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。
【０１０５】
６−ウェルプレートに一つのウェル当り２ｍｌのＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＣＣＬ−１８５をそれぞれ５×１０６個／ｍｌの濃度で接種した。前記ウェルプレートを３７℃で１日間培養して、細胞がウェルプレートに付着して成長するようにした。培地を除去した後、ウェルプレートに付着した細胞を低温のＰＢＳで洗浄した。本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質及びＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）をそれぞれ１０μＭの濃度で各ウェルに５００μｌずつ処理した後、１時間５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで反応させた。この際、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に対しては、ＨＭ１Ｎ、ＨＮＭ１、ＨＭ１ＮＭ１、ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３組換えタンパク質を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＣＣＬ−１８５細胞に対しては、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３組換えタンパク質を処理した。１時間処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、血清の存在下で同一の条件でそれぞれ異なる時間（２、４、６及び８時間）培養した。
【０１０６】
培養が終結した後、細胞を２００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１％トリトン−Ｘ、１０％グリセロール及びタンパク分解酵素阻害剤［ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ］）を用いて氷で３０分間粉砕して集め、得られた細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を４℃で１分当り回転数１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。これから上清を慎重にとり、ペレットを除去した。細胞溶解物中のタンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質分析法で定量した。前記組換えタンパク質を２５μＭの濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、注：組成記載）に添加して細胞溶解物試料を製造し、これを９５℃で５分間加熱した後、使用前まで−２０℃で保管した。
【０１０７】
ウェスタンブロッティング分析のために、ｐ２１（２１ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５、５３ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ（Ｓｅｒ２１７／２２１、４５ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、４２／４４ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を一次抗体として用い、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた。前記で準備された細胞溶解物試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで１００Ｖで２時間電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に１００Ｖで９０分間転写させた。抗体との非特異的吸着を防止するために、前記膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）に溶解させた５％（ｗ／ｖ）脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で室温で１時間攪拌しながらブロッキング処理した。ブロッキング緩衝液を除去した後、膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で３回洗浄した。これに、一次抗体（新たに製造されたブロッキング緩衝液で１：１００００の比率に希釈される）それぞれを添加し、攪拌しながら４℃で一晩中反応させた。一次抗体溶液を除去した後、前記膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で１回当たり５分ずつ室温で５回洗浄した。次いで、前記膜に二次抗体（新たに製造されたブロッキング緩衝液で１：５０００の比率に希釈される）を添加し、攪拌しながら室温で１時間程度反応させた。反応が終結した後、膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で５回洗浄し、化学発光検出用ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＫ）試薬を用いてタンパク質を検出した。
【０１０８】
図９に示すように、全体的にＭＴＤが融合されていない対照群タンパク質に比べ、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理された細胞において、細胞内に透過されたＮｍ２３によりＭＡＰＫカスケードのスキャフォールドタンパク質であるＫＳＲのセリン３９２はリン酸化されるのに対し、腫瘍の細胞周期を活性化させるＥＲＫのリン酸化（Ｐ−ＥＲＫ）は減少した。特に、Ｎｍ２３のＮ及びＣ末端のそれぞれにＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質ＨＭ３Ｎ及びＨＮＭ３が３種のヒト癌細胞株の全てにおいてＥＲＫ及びＭＥＫのリン酸化に対して抑制効果を示すことを確認した。
【０１０９】
実施例７：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビトロ抗転移効果確認
＜７−１＞浸潤分析
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理された癌細胞において、癌細胞の移動が遮断されて癌転移が抑制されるかどうかを確認するために、下記のような浸潤分析を行った。
【０１１０】
まず、ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５を成長因子の添加なしに１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で一晩中培養した。その翌日、細胞をトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で処理して収穫した後、前記と同一のＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。これに対して、対照群としてＭＴＤに融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）と、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）により、それぞれ１０μＭの濃度で３７℃で１時間処理した。一方、３μｍの気孔サイズを有するトランスウェル（ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ）ポリカーボネートメンブレンフィルター（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）の上部をマトリゲル（各ウェル当り４０μｇ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした。チャンバーの下部に付着基質（ａｄｈｅｓｉｖｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。０．１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に、前記でタンパク質処理された細胞を懸濁して細胞懸濁液を作った後、前記トランスウェルメンブレンフィルター（各ウェル当り１×１０５細胞）上に接種し、３７℃、５％ＣＯ２下で、２０〜２４時間培養した。フィルターをＰＢＳで洗浄し、上部表面に残っている非浸潤の細胞を綿棒で除去した。浸潤されてフィルターの下部表面に付着されている細胞を４％パラホルムアルデヒドで５〜１０分間固定させ、０．５％（ｗ／ｖ）ヘマカラー（ｈｅｍａｃｏｌｏｒ）で１０〜２０分間染色した。膜の基底面に移動した細胞の数（紫色）を光学顕微鏡で観察しながらカウントした。
【０１１１】
その結果、図１０に示すように、大部分の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質、特に、ＨＭ２Ｎ、ＨＭ３Ｎ及びＨＮＭ３組換えタンパク質で処理された場合、対照群タンパク質（ＨＮ）に比べて浸潤された細胞の数が顕著に減少したことが分かる。これから本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質により細胞内に流入したＮｍ２３が癌細胞の転移能を効果的に抑制できることをインビトロで確認した。
【０１１２】
＜７−２＞創傷移動分析
本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が、移動能力に非常に優れた乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の移動を抑制できるかどうかを確認するために、創傷移動分析（ｗｏｕｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。
【０１１３】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を６０ｍｍの培養容器に底が見えない程度まで培養した後、これに対して、対照群としてＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）と、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ２Ｎ、ＨＮＭ２、ＨＭ３Ｎ、ＨＮＭ３及びＨＭ３ＮＭ３）により、それぞれ１０μＭの濃度で３７℃で１時間処理した。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、黄色チップ（ｙｅｌｌｏｗ ｔｉｐ）で培養容器の底の細胞を掻き出して基準線（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌｉｎｅ）を引き、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地を３ｍｌ添加し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでさらに培養した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄した後、メタノールで１分間固定させ、ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で５分間染色して水で洗浄した後、倒立顕微鏡を用いて４０倍で観察し、基準線を超えて移動した細胞を観察した。
【０１１４】
その結果、図１１に示すように、前記浸潤分析結果に相応するように対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質、特に、ＨＭ２Ｎ、ＨＭ３Ｎ及びＨＮＭ３組換えタンパク質で処理された細胞で癌細胞の移動が顕著に抑制されることを確認した。
【０１１５】
実施例８：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビボ抗転移効果の確認
インビトロで立証された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の転移抑制効果をインビボでも確認するために、下記免疫組織化学的分析（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。
【０１１６】
まず、１×１０７細胞数の高転移性ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁した後、ＭＨＣに対する突然変異として免疫力が欠乏した５週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ）の外側尾静脈に注射した。実験は、ＪＯ−７７ＭＴＤが融合された細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ、３００μｇ）、対照群として担体（ＰＢＳ、３００μｌ）とＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ、３００μｇ）、及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＨＭ３Ｅ、３００μｇ）を投与する計４群を対象に行った。この際、１群は５匹から構成されており、ＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰは、Ｎｍ２３に融合されるＪＯ−７７ＭＴＤがＮｍ２３の発現に影響を与えるかどうかを確認するための対照群として用いられた。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞をマウスに接種し、５週後、前記タンパク質を各群のマウスに２１日間毎日静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して投与した。２１日経過後、各群当り３匹のマウスを無作為に選別して犠牲にし、肺から組織を摘出した。この際、各群の残った２匹のマウスは、２１日間のタンパク質処理後、さらに１４日間の無処理観察期間を経てから前記と同様に肺から組織を摘出した。摘出された肺組織は、転移性コロニー（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ）の検出のために、ブアン固定液（Ｂｏｕｉｎ ｆｉｘａｔｉｏｎ）で一晩中固定した後、蒸留水で洗浄し、パラフィンに包理してパラフィンブロックを作製した。作製されたパラフィンブロックをマイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて厚さ５μｍに薄切りにしてスライドに付着させた後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）を５分ずつ３回処理してパラフィンを除去した。このように準備された組織スライドを対象に転移マーカー（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）であるビメンチンで免疫組織化学的染色を行った。
【０１１７】
免疫組織化学的染色のために、抗ビメンチン抗体（Ａｂｃａｍ）を一次抗体として用い、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた。抗体との非特異的吸着を防止するために、前記組織スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）に浸け、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で室温で１時間攪拌しながらブロッキング処理した。ブロッキング緩衝液を除去した後、スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液で３回洗浄し、一次抗体として抗ビメンチン抗体（ＰＢＳで１：２００の比率に希釈される）を添加し、攪拌しながら４℃で一晩中反応させた。一次抗体溶液を除去した後、前記スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液で１回当たり５分ずつ室温で５回洗浄した。次いで、前記スライドに二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＰＢＳで１：２００の比率に希釈される）を添加し、攪拌しながら室温で１時間程度反応させた。反応が終結した後、スライドをＴＢＳ／Ｔ緩衝液（０．０２５％トリトン−Ｘ１００）で２回洗浄し、ＤＡＢ基質を用いて転移マーカーであるビメンチンの発現を検出した。
【０１１８】
図１２ａは、本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を２１日間投与したマウスから摘出した肺組織、及び前記投与を中止して１４日間の無処理期間を経たマウスから摘出した肺組織を肉眼で観察した結果を示す。図１２ａに示すように、担体、対照群タンパク質（ＨＮ）及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰ（ＨＭ３Ｅ）で処理されたマウスの肺組織では、２１日間のタンパク質の処理にもかかわらず、肉眼でも識別可能な大きさの腫瘍が形成されていることが分かる。また、タンパク質処理後、２週間の無処理期間を経た後にも腫瘍の大きさが減少しなかっただけでなく、周辺の他の組織にも新しい腫瘍が形成され、転移がなされたことが分かる。しかし、本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ）で処理されたマウスの肺組織では、３週間のタンパク質処理期間だけでなく、連続した２週間の無処理期間にも腫瘍形成が観察されず、腫瘍の形成及び転移が効果的に抑制されたことを確認した。
【０１１９】
また、図１２ｂは、タンパク質処理２１日目のマウスから摘出した肺組織、及び前記投与中止後２週間の無処理期間（３５日目）を経たマウスから摘出した肺組織において、転移マーカーであるビメンチンの発現を免疫組織化学的に染色した結果を示す。図１２ｂに示すように、担体、対照群タンパク質（ＨＮ）及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰ（ＨＭ３Ｅ）で処理されたマウスの肺組織では、２１日目及び３５日目の両方においてビメンチンが検出されたのに対し、本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ）で処理されたマウスの肺組織では、２１日目及び３５日目の両方においてビメンチンが検出されなかった。これから本発明の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が癌転移を効果的に抑制できることをインビボで確認した。
【０１２０】
実施例９：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビボアポトーシス誘導効果の確認
細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の投与後、腫瘍組織内でアポトーシスが誘導されるかを確認するために、前記実施例８のマウス動物モデルを用いてＴＵＮＥＬ分析を行った。この際、ＴＵＮＥＬ分析は、ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ｉｎ ｓｉｔｕ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）であるＴＭＲレッド（ＴＭＲ ｒｅｄ、Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【０１２１】
具体的には、前記実施例８のように、４群のマウスに静脈注射で細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質（ＨＭ３Ｎ）と、対照群として担体、ＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質（ＨＮ）及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰタンパク質（ＨＭ３Ｅ）を２１日間処理した各群のマウス、及び前記投与中止後、１４日間の無処理期間を経た各群のマウスから摘出した肺組織に対してパラフィンブロックを作製した。作製されたパラフィンブロックをマイクロトームを用いて厚さ５μｍに薄切りにしてスライドに付着させた後、キシレンを５分間３回処理してパラフィンを除去した。次いで、無水エタノールで５分間２回、９０％、８０％及び７０％エタノールでそれぞれ３分間処理して含水させ、ＰＢＳで５分間保管した。その後、３７℃で８分間０．１％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液に溶かした０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｉｏｎ（登録商標））Ｘ−１００溶液で細胞を透過させた後、ＰＢＳで２分間２回洗浄した。ＴＵＮＥＬ反応緩衝液（５０μｌ、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）を前記組織スライド上に処理し、１時間３７℃の湿潤インキュベーターで培養した後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。
【０１２２】
その結果、図１３に示すように、担体、ＭＴＤが融合されていないＮｍ２３タンパク質及びＪＯ−７７ＭＴＤが融合されたＥＧＦＰタンパク質を処理したマウスの全ての肺組織では特に変化が観察されなかったのに対し、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を処理したマウスの肺組織では、アポトーシスの際、赤く染色される変化が観察された。前記結果から本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質のインビボアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。また、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週間後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されることが分かった。
【０１２３】
実施例１０：細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質の投与後のタンパク質発現様相の比較
細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質が投与された組織におけるタンパク質発現様相の変化を確認するために、下記の通りマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析を行った。
【０１２４】
具体的には、前記実施例９と同様の方法で、３群のマウスに腫瘍直接注射によって細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質ＨＭ３Ｎと、対照群としてＨＮ及び担体を１４日間処理した後、この処理を中止して１４日間放置した。計２８日経過後、各群のマウスから腫瘍組織を分離した後、これを液体窒素で急速冷却させた。腫瘍組織から全ＲＮＡをトリゾル試薬（ＴＲＩＺＯＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの指針に従って分離し、これを無ＲＮａｓｅ ＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で処理して残存するゲノムＤＮＡを除去した。
【０１２５】
前記で分離されたＲＮＡに対して、標的ｃＲＮＡプローブの合成及びハイブリダイゼーションをメーカーの指針に従ってロー・ＲＮＡ・インプット・リニア・アンプリフィケーションキット（Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。簡略に説明すると、それぞれの計ＲＮＡ １μｇとＴ７プロモータープライマーを混合し、６５℃で１０分間反応させた。５×一本鎖緩衝液、０．１Ｍ ＤＴＴ、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ及びＭＭＬＶ−ＲＴ（逆転写酵素）を混合してｃＤＮＡマスタミックス（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）を製造した後、これを前記反応混合物に添加した。この混合物を４０℃で２時間反応させた後、６５℃で１５分間反応させて逆転写反応及びｄｓＤＮＡ合成を終結させた。メーカーの指針に従って、４×転写緩衝液（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＮＴＰミックス、５０％ＰＥＧ、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ、無機ピロホスファターゼ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、及びシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ、３／５−ＣＴＰ）を用いて転写マスタミックスを製造した。この転写マスタミックスをｄｓＤＮＡ反応混合物に添加し、４０℃で２時間反応させてｄｓＤＮＡの転写を行った。増幅されて標識されたｃＲＮＡをメーカーの指針に従って、ｃＲＮＡクリーンアップモジュール（ｃＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で精製した。
【０１２６】
標識されたｃＲＮＡ標的をＮＤ−１０００分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて定量した。標識効率を調査した後、ｃＲＮＡに１０×ブロッキング剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）及び２５×フラグメンテーション緩衝液（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、６０℃で３０分間反応させてｃＲＮＡの断片化を行った。断片化されたｃＲＮＡを２×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁した後、全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ（Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、４４Ｋ）上にピペットを用いて直接滴加した。ハイブリダイゼーションオーブン（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｖｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて前記マイクロアレイを６５℃で１７時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズしたマイクロアレイをメーカー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の洗浄指針に従って洗浄した。
【０１２７】
ハイブリダイゼーションパターンをＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて読み出し、特徴抽出ソフトウェア（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で定量した。倍率変化した（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ）遺伝子の全てのデータ標準化及び選別は、ジーンスプリングＧＸ（Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ＧＸ７．３、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。標準化比率の平均は、標準化された信号チャンネル強度を標準化された対照群のチャンネル強度で割って計算した。遺伝子の機能的アノテーションは、遺伝子オントロジーコンソーシアム（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（商標） Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に従ってジーンスプリングＧＸにより行われた。
【０１２８】
前記マイクロアレイ分析結果を図１４及び下記表３〜９に示すが、表３は、アポトーシスに係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表４は、細胞付着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表５は、細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）の調節に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表６ａ及び６ｂは、細胞成長（ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）に係わる遺伝子の発現様相を示したものであって、表７は、細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表８ａ及び８ｂは、免疫反応（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものであり、表９は、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）に係わる遺伝子の発現様相を示すものである。
【０１２９】
【表３】
【０１３０】
【表４】
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
【表６ａ】
【０１３３】
【表６ｂ】
【０１３４】
【表７】
【０１３５】
【表８ａ】
【０１３６】
【表８ｂ】
【０１３７】
【表９】
【０１３８】
前記表３に示したように、アポトーシスに係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてカスパーゼ１４（Ｃａｓｐａｓｅ １４）の発現が約３．５倍程度、細胞死誘導ＤＦＦＡ類似エフェクタｃ（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＦＦＡ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃ、Ｃｉｄｅｃ）の発現が４倍以上、細胞死誘導ＤＮＡ断片因子（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、アルファサブユニット類似エフェクタＡ（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ａ、Ｃｉｄｅａ）の発現がそれぞれ約２．５倍以上上方調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されることが分かる。
【０１３９】
前記表４に示したように、細胞付着に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてカドヘリン類似２６（ｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ ２６）の発現が３倍以上下方調節されることが分かる。
【０１４０】
前記表５に示したように、細胞周期調節に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群において鳥類赤芽球症ウイルスＥ−２６癌遺伝子（Ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｅ−２６（ｖ−ｅｔｓ）ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の発現が４倍以上下方調節されることが分かる。
【０１４１】
前記表６ａ及び６ｂに示したように、細胞成長に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群において腫瘍壊死因子受容体（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ １７）の発現が６．８倍以上上方調節され、口蓋、肺及び鼻上皮癌関連遺伝子（ｐａｌａｔｅ、ｌｕｎｇ ａｎｄ ｎａｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ）の発現が約２６倍下方調節されることが分かる。
【０１４２】
前記表７に示したように、細胞増殖に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてトランスクリプション−６のシグナルトランスデューサ及び活性体（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ６）の発現が約５倍程度上方調節されることが分かる。
【０１４３】
前記表８ａ及び８ｂに示したように、免疫反応に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群において免疫グロブリン重鎖（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｊ５５８ ｆａｍｉｌｙ）、免疫グロブリン重鎖複合体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）及び免疫グロブリン連結鎖（ｊｏｉｎｉｎｇ ｃｈａｉｎ）の発現がそれぞれ１８倍、１５倍及び３０倍以上上方調節されることが分かる。
【０１４４】
前記表９に示したように、転移に係わる遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質投与群においてＦａｓｃｉｎ同族体１（ｆａｓｃｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ １、ａｃｔｉｎ ｂｕｎｄｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現が２．５倍以上、プロスタグランジンエンドペルオキシド合成剤２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）の発現が２．５倍以上、及び血管細胞付着分子１（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）の発現が２倍以上上方調節されることが分かる。
【０１４５】
以上で本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるわけではない点は明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言える。
【０１４６】
受託証１
【０１４７】
受託証２
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒト癌転移抑制因子Ｎｍ２３タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または両末端に、配列番号：４、６、８及び３７〜２２７のアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されていることを特徴とする、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項２】
前記巨大分子伝達ドメインが、配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４）由来ＭＴＤ、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤ、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項３】
前記組換えタンパク質の片末端に核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）及びヒスチジンタグ親和性ドメインが共有結合されていることを特徴とする、請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項４】
下記からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の組換えタンパク質：
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＮ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＣ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３の両末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＮ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＣ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＮ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＣ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３の両末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質。
【請求項５】
配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６のアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項６】
請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列を有することを特徴とする、請求項６記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８記載の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌。
【請求項１１】
大腸菌ＤＨ５α／ＨＭ３Ｎｍ２３（ＫＣＴＣ−１１３８０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１０記載の形質転換細菌。
【請求項１２】
大腸菌ＤＨ５α／ＨＮｍ２３Ｍ３（ＫＣＴＣ−１１３８１ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１０記載の形質転換細菌。
【請求項１３】
請求項１０記載の形質転換細菌を培養する段階を含む細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項１４】
請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有し、薬学的に許容可能な担体を含む、癌細胞の増殖、分化または移動を遮断して転移を抑制するための癌転移抑制用薬学的組成物。
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒト癌転移抑制因子Ｎｍ２３タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または両末端に、配列番号：４、６、８及び３７〜２２７のアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されていることを特徴とする、細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項２】
前記巨大分子伝達ドメインが、配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４）由来ＭＴＤ、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤ、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項３】
前記組換えタンパク質の片末端に核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）及びヒスチジンタグ親和性ドメインが共有結合されていることを特徴とする、請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項４】
下記からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の組換えタンパク質：
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＮ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＣ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３の両末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＮ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＣ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−７６ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＮ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３のＣ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長Ｎｍ２３の両末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−７７ＭＴＤが融合された組換えタンパク質。
【請求項５】
配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６のアミノ酸配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質。
【請求項６】
請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５の塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列を有することを特徴とする、請求項６記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ１ＮＭ１、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ２Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ２、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３Ｎ、ｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＮＭ３及びｐＥＴ２８ａ（＋）−ＨＭ３ＮＭ３からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８記載の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌。
【請求項１１】
大腸菌ＤＨ５α／ＨＭ３Ｎｍ２３（ＫＣＴＣ−１１３８０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１０記載の形質転換細菌。
【請求項１２】
大腸菌ＤＨ５α／ＨＮｍ２３Ｍ３（ＫＣＴＣ−１１３８１ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１０記載の形質転換細菌。
【請求項１３】
請求項１０記載の形質転換細菌を培養する段階を含む細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項１４】
請求項１記載の細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質を有効成分として含有し、薬学的に許容可能な担体を含む、癌細胞の増殖、分化または移動を遮断して転移を抑制するための癌転移抑制用薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５３７６６５（Ｐ２０１０−５３７６６５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２３９５２（Ｐ２０１０−５２３９５２）
【出願日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５２２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３１８３５
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０９２１２７６４）プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５２２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３１８３５
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０９２１２７６４）プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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