細胞運命の解析方法
【課題】血液血管芽細胞から血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列への運命決定、分化を解析する方法の開発、特に血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列の細胞運命を同時に解析する方法の開発を目的とする。
【解決手段】幹細胞の単一細胞を調製し、得られた単一細胞を増幅する工程（第１工程）、増幅した細胞を培養し、コロニーを産生させる工程（第２工程）、及び産生されたコロニーの様式に基づいて単一細胞を群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定する工程（第３工程）を含む、幹細胞の細胞運命の解析方法、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ群に分類される単一細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ等。
【解決手段】幹細胞の単一細胞を調製し、得られた単一細胞を増幅する工程（第１工程）、増幅した細胞を培養し、コロニーを産生させる工程（第２工程）、及び産生されたコロニーの様式に基づいて単一細胞を群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定する工程（第３工程）を含む、幹細胞の細胞運命の解析方法、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ群に分類される単一細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞運命の解析方法、特に幹細胞の細胞運命を解析・評価する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液系及び血管系医学の分野において、ヒトの血液幹細胞含有分画であるＣＤ３４陽性細胞において血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cell=ＥＰＣ)が発見（非特許文献１）され、ＣＤ３４陽性細胞さらには早期血液幹細胞分画であるＣＤ１３３陽性細胞は、血液血管芽細胞(Hemangioblast=ＨＢ)含有分画として考えられるようになった。つまり、胎生期における血管島では、血液前駆細胞(hematopoietic stem/progenitor cell=ＨＳＰＣ)及びＥＰＣは共通の多能性幹細胞であるＨＢから分化することが明らかとなっている。成体内においても、このような未分化なＨＢの存在証拠が確認（非特許文献２〜４）され、ＥＰＣは骨髄幹細胞ニッチ内において、ＨＳＰＣと共にＨＢという共通の幹細胞から血液・血管細胞系列の運命決定(commitment)、分化(differentiation)が行われた結果であると推定されている。
【０００３】
血液系分野において、形態学的観察に基づいたＨＳＰＣの血液細胞系列への分化様式に関する解析法としては、１９７０年代に非接着系培養皿と半固形培地のメチルセルロースを用いた方法が開発され、以後、その意義は確立している（非特許文献５）。すなわち、コロニーのタイピング、数を評価する方法である。しかし、当然、血液系細胞に限られた解析法であり、ＨＢの細胞生物学的解析は不可能である。
ＥＰＣの分化様式評価系は、１９９７年の成体内ＥＰＣの発見以来、２つの細胞生物学的解析法が用いられてきた。一つは、未分化ＥＰＣ含有細胞（骨髄や末梢血のＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞、単核球）を内皮系細胞培養用の液体培地で培養し、接着細胞を獲得してこれを数的に評価するＥＰＣ培養アッセイ法（非特許文献６及び７）であり、二つ目は、メチルセルロースを用いたＥＰＣコロニーアッセイ法で、ＥＰＣのコロニーを数的に評価するものである（非特許文献８）。いずれの方法も、ＥＰＣの数的評価に止まり、その分化過程の評価は不可能である。特許文献１及び２ではＥＰＣの分化様式を解析する方法が記載されているが、内皮系細胞の解析に止まり、血液系細胞系列への分化との因果関係は不明である。
【非特許文献１】T. Asahara, T. Murohara, A. Sullivan et al., Science 275：964-967 (1997)
【非特許文献２】E. Pelosi, M. Valtieri et al., Blood 100(9): 3203-3208 (2002)
【非特許文献３】S. Loges, B. Fehse et al., Stem Cells Dev. 13(3): 229-242 (2004)
【非特許文献４】UM. Gehling, S. Ergun et al., Blood 95(10): 3106-3112 (2000)
【非特許文献５】A. Hirao, Y. Takaue et al., Journal of Clinical Apheresis 10: 17-22 (1995)
【非特許文献６】T. Asahara, T. Takahashi et al., EMBO J. 18(14): 3964-3972 (1999)
【非特許文献７】C. Kalka, H. Masuda et al., Circ Res. 86(12): 1198-1202 (2000)
【非特許文献８】B. Assmus, C. Urbich et al., Circ Res. 92(9): 1049-1055 (2003)
【特許文献１】ＷＯ２００６／０９０８８２号国際公開公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０９０８８６号国際公開公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、幹細胞、特に組織幹細胞の細胞運命の解析方法、具体的には血液血管芽細胞（ＨＢ）から血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列への運命決定、分化を解析する方法の開発、特に血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列の細胞運命を同時に解析する方法の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明者らは、まず、ＨＢから単離される単一細胞を培養し、血液系細胞系列あるいは内皮系細胞系列へと分化して産生されるコロニーの様式を調べ、その様式のパターンに基づいて細胞を群分けし、「細胞運命（commitment）」を定義づけた。次いで、得られた細胞運命のそれぞれについて、その頻度（すなわち該当する細胞運命を提示するようになる単一細胞の数）を測定した。細胞運命とその頻度を対応させることによって細胞運命の明確化、グラフ化が可能となり、定量化することが可能となった。
【０００６】
即ち、本発明は下記の通りである：
［１］幹細胞の単一細胞を調製し、得られた単一細胞を増幅する工程（第１工程）、
増幅した細胞を培養し、コロニーを産生させる工程（第２工程）、及び
産生されたコロニーの様式に基づいて単一細胞を群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定する工程（第３工程）
を含む、幹細胞の細胞運命の解析方法。
［２］幹細胞が血液血管芽細胞である、上記［１］記載の方法。
［３］血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、上記［２］記載の方法。
［４］血液血管芽細胞が、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性である、上記［２］記載の方法。
［５］産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、上記［２］記載の方法。
［６］血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［５］記載の方法。
［７］血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［５］記載の方法。
［８］第１工程が、添加因子の存在下又は非存在下で実施される、上記［１］記載の方法。
［９］添加因子が成長因子である、上記［８］記載の方法。
［１０］上記［１］記載の方法を実施することを含む、幹細胞の細胞運命に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法。
［１１］上記［１］記載の方法を実施することを含む、幹細胞から特定の細胞系列へ運命付けられた細胞の濃縮度を確認する方法。
［１２］幹細胞が血液血管芽細胞であり、特定の細胞系列へ運命付けられた細胞が血管内皮前駆細胞である、上記［１１］記載の方法。
［１３］幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定し、各群について、その群に属する単一細胞の数を対応させることによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
［１４］幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ群に分類される単一細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
［１５］幹細胞が血液血管芽細胞である、上記［１３］又は［１４］記載のグラフ。
［１６］産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、上記［１５］記載のグラフ。
［１７］血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［１６］記載のグラフ。
［１８］血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［１６］記載のグラフ。
【発明の効果】
【０００７】
組織幹細胞の細胞運命、具体的にはＨＢからの血液系及び血管内皮系細胞系列の細胞運命をグラフ化、定量化することが可能となる。特に血液系及び血管内皮系細胞系列の細胞運命を同時にグラフ化、定量化することにより、従来の単独細胞系列解析法では判別不可能であった細胞運命の明確化、その定量化が可能となる。また、本発明の方法は、単一細胞での評価であり、細胞系列決定評価が正確である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、幹細胞の細胞運命の解析方法、例えばＨＢから血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列への運命決定、分化を解析する方法の開発、特に血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列の細胞運命を同時に解析する方法を提供する。本発明の解析方法は、まず、その細胞運命の解析が所望される幹細胞の単一細胞を調製し培養する工程を含む。
【０００９】
幹細胞としては、所定の細胞へと分化し得る細胞運命を有するものであれば特に限定されないが、好ましくは組織幹細胞であり、神経系幹細胞、造血系・血管系幹細胞、間葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞等が例示される。特に好ましくは各細胞系列の表現型がよく研究されている造血系・血管系幹細胞であり、該幹細胞は、上記したＨＢ（血液血管芽細胞）に相当する。
【００１０】
本発明で用いられる「血液血管芽細胞(Hemangioblast=ＨＢ)」とは、血液系細胞及び血管内皮細胞両方の前駆細胞であって、血液幹細胞、血液前駆細胞を経て血液系細胞（例えば、赤血球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、巨核球）になり得、また、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を経て血管内皮細胞になり得る未分化な細胞であれば特に限定されない。ＨＢとしては、被検対象の骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞を使用できる。ＨＢはまた、単核球であり得る。
【００１１】
ＨＢはさらに、ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性であり得る。従って、ＨＢとして、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞のみ予め選別して用いることもまた好ましい。ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞の選別は、当分野で通常行われている細胞選別の手法が用いられ、具体的にはＣＤ３４抗原及び／又はＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質を用いた磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、蛍光細胞分離法（ＦＡＣＳ）等が挙げられる。かかる分離方法により、幹細胞を単一細胞とすることができる。
【００１２】
ＣＤ３４抗原あるいはＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質としては例えばこれらの蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質等で標識されていてもよい。
【００１３】
ＨＢはまた、ＨＢを動員可能な物質により動員されたものであり得る。ＨＢを動員可能な物質としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、エストロゲン、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、アンジオポエチン１及び２、ＨＧＦ、スタチン類（ｓｔａｔｉｎｓ）、エリスロポエチンが挙げられるが、なかでもＧ−ＣＳＦが好ましい。この場合、ＨＢを動員可能な物質の被検対象への投与により得られる、ＨＢを動員しておいた体液成分（例えば、末梢血）の形態で、ＨＢが提供されてもよい。ＨＢを動員可能な物質の被検対象への投与回数、投与期間、投与量は用いる物質の種類によっても異なり、ＨＢを動員可能である限り特に限定されないが、Ｇ−ＣＳＦの場合であれば、投与回数については、例えば通常１日１回〜３回、好ましくは２回であり、投与期間については、例えば約３〜７日間、好ましくは約４〜６日間、より好ましくは５日間であり、投与量については、約２〜５０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５〜２０μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日である。
【００１４】
ＨＢはさらに、ＨＢを動員可能な物質により動員されたＨＢを移植された被検対象から採取されるものであってもよい。
【００１５】
本発明において被検対象は、幹細胞の細胞運命を解析することが求められている動物であって、ヒトを含む哺乳動物一般を意味するが、臨床応用という本発明の目的に鑑みれば、被検対象は好ましくはヒトである。また、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル等の哺乳動物での使用も好ましい。
【００１６】
本発明の解析方法では、幹細胞、必要に応じて選別されたＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性の幹細胞の単一細胞を培養する。単一細胞の培養は、幹細胞の由来や所望する細胞系列に応じて、従来行なわれている方法あるいはそれに準じた方法で行なうことができる。例えば幹細胞がＨＢであり、所望する細胞系列が血管内皮細胞系列であれば、特許文献１及び特許文献２に開示されている方法が好適に用いられる。幹細胞がＨＢであり、所望する細胞系列が血液細胞系列の細胞であれば、非接着系培養皿と半固形培地のメチルセルロースを用いた方法（非特許文献５）が好適に用いられる。
【００１７】
本発明の方法においては、単一細胞の培養は、組織幹細胞の単一細胞を調製して増幅させる工程（第１工程）及び増幅させた細胞からコロニーを産生させる工程（第２工程）の、通常２工程によって行なわれる。第１工程は、幹細胞が効率よく増殖することができればその方法は特に限定されないが、組織幹細胞がＨＢの場合、特許文献１に記載の方法によって実施することが好ましい。具体的には、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含有する無血清培地でＨＢをインキュベートすることを含む。
【００１８】
第１工程で用いられる無血清培地は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている無血清培地を用いることができる。無血清培地として用いられる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が挙げられる。
【００１９】
無血清培地に含めうる幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、本発明で用いるＳＣＦはＨＢの培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明で用いられるインターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量２１万の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。本発明で用いるＩＬ−６は適宜選択されるが、ヒトＨＢの培養に用いる場合には、ヒトＩＬ−６が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＩＬ−６の濃度は、用いるＩＬ−６の種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−６の場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００２１】
本発明で用いられるＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。本発明で用いるＦｌｔ−３は、ＨＢの培養に有用である限り、いずれのタイプのＦｌｔ−３であってもよい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＦｌｔ−３の濃度は、用いるＦｌｔ−３の種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＦｌｔ−３リガンドの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００２２】
本発明で用いられるトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。本発明で用いるＴＰＯの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＴＰＯの場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００２３】
第１工程で用いられる無血清培地には、後述の実施例で示されるように、ＥＰＣをより効率的に増幅させる、あるいは増幅総細胞数をより増加させるという観点から、上記ＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｆｌｔ−３及びＴＰＯに加え、成長因子、特に血管内皮細胞増殖因子をさらに含有することが好ましい場合もある。
【００２４】
本発明で用いられ得る血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、本発明で用いるＶＥＧＦはＥＰＣをより効率的に増幅させる、あるいは増幅総細胞数をより増加させる限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００２５】
本発明において好ましい無血清培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３、約２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含有する無血清培地であり、約１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含有しているものが好ましい。
【００２６】
上記した各成分は無血清培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、無血清培地で所定の濃度に希釈することによって本発明において用いられるＨＢの単一細胞を増幅させる為の無血清培地を調製することができる。例えば市販の無血清培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の無血清培地に添加、希釈することによって調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０.２２μｍや０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
【００２７】
上述した因子を含有する無血清培地でのＨＢの培養は、ＨＢの単一細胞を、上述の因子を含有する無血清培地中に播種することにより行われる。ＨＢの培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で７日間程度培養される。
【００２８】
第１工程において、細胞の「増幅」とは、細胞の未分化状態をできる限り維持しつつ、その細胞数を増加させることを意味する。第１工程におけるＨＢの増幅は、上述の因子を例えば上述の濃度で用いてＨＢを培養することにより達成でき、血液前駆細胞（ＨＳＰＣ）や血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が増幅される。好ましくは本工程（第１工程）は、単一細胞の培養という性質上、９６ウェルプレートなど、単一細胞の培養に適した培養器中で行なう。
【００２９】
本発明では、組織幹細胞の単一細胞の調製ならびに増幅（第１工程）に続いて、増幅させた細胞からコロニーを産生させる工程（第２工程）を行なう。第２工程は、所望する細胞系列のコロニーが産生される限り、特にその方法は限定されないが、コロニーを産生させるという性質上、第１工程よりはより培養面積の広い培養器、例えば２４ウェルプレート等の培養器中で行なうことが好ましい。組織幹細胞がＨＢであり、細胞系列が血液系細胞系列である場合には、半固形培地である血液系細胞系列用のメチルセルロース培地を用いた方法が好適に用いられる。かかる培養によりＨＢから血液前駆細胞コロニー（ＨＳＰＣコロニー）が産生される。本発明では、細胞構成の異なる４種類のＨＳＰＣコロニーが出現する。このような４種類のＨＳＰＣコロニーが出現するのは第１工程で増幅させたＨＢの懸濁液を半固形培地上に播種してから通常１０日以上、例えば１２日経過した時点であるので、本発明においてＨＳＰＣのコロニーを形成させるには例えば１２日間培養される。形成される４種類のコロニーは、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）である。形成されるコロニーの種類はその色や形態から容易に識別することができる。また、個々のコロニーを採取してＲＴ−ＰＣＲを行い、遺伝子発現レベルで確認することもできる。
【００３０】
ＨＳＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地は、ＨＳＰＣコロニー形成を可能とするものである限り特に限定されないが、例えば、造血幹細胞等の未分化細胞の増殖用培地などとして知られている半固形培地を使用できる。このような半固形培地としては、例えば、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル、メビオールゲルなどが挙げられる。半固形培地としてメチルセルロース培地を用いる場合、培地中のメチルセルロース濃度は特に限定されるものではないが、例えば約０．５〜５％、好ましくは約０．７〜３％、より好ましくは約１％で用いられる。
【００３１】
また、組織幹細胞がＨＢ細胞であり、細胞系列が血管内皮細胞系列である場合には、特許文献１及び２に記載された方法に準じて好適に実施することができる。具体的には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する半固形培地でＨＢを培養することを含む。かかる培養により、ＨＢから血管内皮前駆細胞コロニー（ＥＰＣコロニー）が産生される。本発明では、構成細胞のサイズが異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現する。このような２種類のサイズのＥＰＣコロニーが出現するのは第１工程で増幅させたＨＢの懸濁液を半固形培地上に播種してから通常１０日以上、例えば１４〜１８日経過した時点であるので、本発明においてＥＰＣのコロニーを形成させるには例えば１４〜１８日間培養される。形成される２種類のコロニーのうち、大きい細胞で構成されるコロニー（内皮細胞様大細胞コロニー；ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ、大細胞コロニーともいう）は長径約５０〜２００μｍの細胞を主に含み、小さい細胞で構成されるコロニー（内皮細胞様小細胞コロニー；ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ、小細胞コロニーともいう）は直径約２０μｍ以下（例えば約１０〜２０μｍ）の細胞を主に含む。ここで「主に」とはコロニーを構成する細胞集団の約３０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約７０％が、長径約５０〜２００μｍの細胞（大細胞コロニーの場合）あるいは直径２０μｍ以下の細胞（小細胞コロニーの場合）であることを意味する。被検対象から経時的に骨髄液、臍帯血あるいは末梢血等を採取し、採取した試料についてＥＰＣコロニーアッセイを行うと、動員後のコロニー出現迄に要する時間が、大細胞コロニーと小細胞コロニーとでは異なっていることが判明している。大細胞コロニーは小細胞コロニーにやや遅れて出現する。即ち、分化段階の異なるＥＰＣが存在することが示唆される。早い段階で出現する内皮細胞様小細胞は早期分化段階のＥＰＣと言え、また遅い段階で出現する内皮細胞様大細胞は晩期分化段階のＥＰＣであると言える。本発明の解析方法では、上述の通りコロニーを形成する細胞サイズの差異に基づき分化度の異なるＥＰＣが区別可能である。
【００３２】
ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地は、ＥＰＣコロニー形成を可能とするものである限り特に限定されないが、例えば、造血幹細胞等の未分化細胞の増殖用培地などとして知られている半固形培地を使用できる。このような半固形培地としては、例えば、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル、メビオールゲルなどが挙げられる。半固形培地としてメチルセルロース培地を用いる場合、培地中のメチルセルロース濃度は特に限定されるものではないが、例えば約０．５〜５％、好ましくは約０．７〜３％、より好ましくは約１％で用いられる。
【００３３】
ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が含まれていることが好ましい。ここで用いられるＶＥＧＦとしては、上記第１工程で無血清培地に添加したものと同様なものが例示される。半固形培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニー産生に適切である限り特に限定されないが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。ここで用いられるｂＦＧＦは、約１８ｋＤａ、等電点９．０の一本鎖ペプチドであり、血管新生、種々の細胞増殖促進、分化誘導等の機能を有することが知られている。本発明で用いるｂＦＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のｂＦＧＦの濃度は、用いるｂＦＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニー産生に適切である限り特に限定されないが、ヒト組換えｂＦＧＦを用いる場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３４】
第２工程で、ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地には、さらにＥＰＣコロニーをより効率的に形成させるという観点から、上記ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦに加え、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）からなる群より選ばれる１又は２以上の因子、好ましくは３以上の因子、より好ましくは全ての因子をさらに含有することが好ましい。
【００３５】
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、上記第１工程で無血清培地に添加したものと同様なものが例示される。半固形培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００３６】
インターロイキン３（ＩＬ−３）は、造血幹細胞や各種血球系列の前駆細胞に作用し、その増殖、分化を促進するサイトカインとして知られている。ヒトで１５２残基、マウスで１６６残基のアミノ酸から成るが、糖鎖の修飾によって見かけ上２８，０００の分子量を有する。本発明で用いるＩＬ−３はコロニー産生を目的とするＥＰＣの由来に応じて適宜選択されるが、ヒトのＥＰＣのコロニー産生に用いる場合には、ヒトＩＬ−３が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＩＬ−３の濃度は、用いるＩＬ−３の種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−３を用いる場合であれば、約１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００３７】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、ソマトメジンとも称される、プロインスリンに類似した一次構造をもつ分子量約７０００のポリペプチドで互いに類似したＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの２種類が存在することが知られている。ともに類似した作用を有し、インビトロでは様々な細胞の増殖を促進することが知られている。本発明で用いるＩＧＦはＥＰＣのコロニー産生を可能にする限りいずれのタイプのＩＧＦでもよい。好ましくはＩＧＦ−Ｉである。ＩＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＩＧＦの濃度は、用いるＩＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉを用いる場合であれば、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３８】
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は、上皮細胞の分化・増殖を促進させる作用を有する、アミノ酸５３個のタンパク質であり、糖鎖は結合していないことが知られている。約６ｋＤａで３ヶ所のジスルフィド結合を有する。本発明で用いるＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＥＧＦの濃度は、用いるＥＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＥＧＦを用いる場合であれば、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３９】
ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地は、ＥＰＣコロニーをさらにより効率的に形成させるという観点から、上記ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ、並びにＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＧＦ及びＥＧＦからなる群より選ばれる１又は２以上の因子に加え、血清及び／又はヘパリンをさらに含有することが好ましい。
【００４０】
血清が使用される場合、その由来等は特に限定されないが、培地に添加されることから比較的使用量が多いことが予想される。従って、商業的に入手可能なウシ、ウマ、ヒト等の血清（例えば、胎児血清）が用いられる。より好ましくはウシ胎児血清（ＦＣＳ）である。当該血清は非働化して用いることが好ましい。半固形培地中の血清の濃度は、用いる血清の種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをさらにより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ＦＣＳの場合であれば、約１０〜５０％、好ましくは約１５〜４０％、より好ましくは約３０％である。
【００４１】
ヘパリンは、Ｄ−グルクロン酸、あるいはＬ−イズロン酸のいずれかを含むウロン酸残基と、Ｄ−グルコサミンとの二糖体の繰り返し構造を骨格に持つグルコサミノグリカンである。ヘパリンは哺乳類の小腸や肺に多く存在し、市販品はブタの腸由来の抽出物が多く、その分子量は７，０００〜２５，０００程度である。本発明で用いるヘパリンは動物組織由来のものであってもよいし、ＥＰＣのコロニー産生を可能にする限り、化学的、物理的に分解された低分子化ヘパリンであってもよい。例えば、ブタ腸由来ヘパリンが使用される。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のヘパリンの濃度は、用いるヘパリンの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをさらにより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ブタ腸由来ヘパリンの場合であれば、約０．２〜１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１〜５Ｕ／ｍＬ、より好ましくは約２Ｕ／ｍＬである。
【００４２】
上記した各生理活性物質は半固形培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各生理活性物質の濃縮液（ストック溶液）を調製し、半固形培地で所定の濃度に希釈することによって本発明で用いる、ＥＰＣコロニー産生用の半固形培地を調製できる。例えば市販の半固形培地に必要な生理活性物質を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の半固形培地に添加、希釈することによって本発明で用いる生理活性物質含有半固形培地を調製できる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０.２２μｍや０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
【００４３】
ＥＰＣコロニーの産生は目視で確認することができるが、得られるコロニーが本当にＥＰＣで構成されているか否かは、例えば、アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）の取り込み能やＵＥＡ−１レクチンとの結合能、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２とも称される）、ｖＷＦの発現（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより、あるいは蛍光免疫組織化学的方法により）等を確認することによって行われ得る。例えばＤｉＩで標識したアセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ−ＤｉＩ）及びＦＩＴＣ標識したＵＥＡ−１レクチン（ＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣ）でコロニーを二重染色した場合に、ＥＰＣであれば共に染色される。
【００４４】
本発明では、幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けする工程を含む。例えば幹細胞としてＨＢを用いた場合、ＥＰＣコロニーであればＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ、あるいはＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣが形成され、ＨＳＰＣコロニーであればＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＭあるいはＣＦＵ−Ｍｉｘが産生される。各単一細胞について、どのようなコロニーを産生するかを調べることによって群分けする。
【００４５】
例えば血管内皮細胞系列であれば、ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生するがＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生しない細胞（後述の実施例ではＬＶＺ領域に相当）、ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生しないがＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生する細胞（後述の実施例ではＥＶＺ領域に相当）、及び両方産生する細胞（後述の実施例ではＩＶＺ領域に相当）の３群に分けることができる。さらに血液細胞系列のそれぞれについて、産生されるコロニーの様式の一例を下記表１に示す。このようにして各様式に基づく群分けを可能とする個々の細胞が有している、あるいは有することになる特性を「細胞運命」と称し、本発明はそのような「細胞運命」の解析を可能とし、その応用を提供する。
【００４６】
【表１】
【００４７】
本発明では、産生されたコロニーの様式に基づいて群わけされた「細胞運命」に対して、同じ細胞運命を有する単一細胞の数を測定する（第３工程）。例えば、増幅、分化を経て（第１工程）、ＣＦＵ−Ｍｉｘ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍのコロニーを産生するようになる単一細胞は細胞運命１を有している、と言える（上記表１参照）。４種全てのコロニーを産生するようになる単一細胞は細胞運命１を有していて、その数を測定する。第１工程で例えば９６ウェルプレートにＨＢを播種した場合、各ウェルに１個ずつのＨＢが存在する。各ウェルに存在するＨＢから派生するコロニーがどの様な種類のものかを評価することによって、そのＨＢ単一細胞の細胞運命が決定されるので、細胞運命頻度とは同じコロニー産生様式を示す単一細胞の数、即ちウェルの数を測定することによって簡便に知ることができる。
【００４８】
本発明では組織幹細胞、特にＨＢの単一細胞から産生されるＥＰＣコロニー及びＨＳＰＣコロニーを同時にアッセイすることができ、本発明者らは、このようなアッセイをＨＥＬＩＣ（Hematopoietic and Endothelial Lineage Commitment）アッセイと命名した。ＨＥＬＩＣアッセイは、血液系細胞系列の細胞運命の解析と血管内皮系細胞系列の細胞運命の解析を同時に行なうことができる。
【００４９】
本発明の解析方法では、上記した単一細胞の培養に必要な因子以外に、細胞運命の決定に影響を与えるか否かを調べることを目的として、あるいは既に細胞運命の決定に影響を与えることが知られている因子を別途添加してもよい（以後、添加因子とも称する）。本発明において用いる添加因子としては、サイトカイン、成長因子、性ホルモンをはじめ抗悪性腫瘍剤、抗高脂質血症剤、降圧剤等を含む臨床応用薬剤或いは臨床応用予定薬剤が挙げられる。サイトカインとしては、血管形成促進作用を有するｓｔｒｏｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１（ＳＤＦ−１）、等が例示される。成長因子としては、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１等が例示される。性ホルモンとしては血管形成促進作用を有するエストロゲン、プロゲステロン等が例示される。臨床応用薬剤としては、特に生活習慣病の高脂質血症や高血圧症において血管内皮前駆細胞活性の低下が報告されている。そこで特に、これらの治療薬剤のＨＢから血管内皮細胞の運命決定に与える影響の解析が可能である。また、逆に血管形成能が高くなる色々の悪性腫瘍において抗悪性腫瘍薬のＨＢから血管内皮細胞への運命決定に与える影響をも解析可能である。
【００５０】
本発明はまた、本発明の解析方法を用いて、細胞運命に影響を与える化合物をスクリーニングする方法を提供する。
具体的には、以下のような方法が例示される。
（１）幹細胞の単一細胞を調製する。
上記した本発明の解析方法と同様、単一細胞の選別が必要な場合はこの段階で行なうことができる（例えばＣＤ１３３陽性細胞の選別）。
（２）上記（１）で得られた単一細胞を増幅・培養し、コロニーを産生させる。
第１工程：培養条件は幹細胞の由来に応じて適宜設定される。２群にわけ一方は試験化合物存在下で、他方は試験化合物非存在下で培養する。試験化合物が存在するか、あるいは存在しないか、という点を除いては、上記した本発明の解析方法に準じて本工程を実施する。
第２工程：試験化合物存在下あるいは非存在下で増幅させた幹細胞からコロニーを産生させる。上記した本発明の解析方法に準じて本工程を実施する。
（３）産生されるコロニーの様式に基づいて群わけ（細胞運命）し、同じ細胞運命を有する単一細胞の数（頻度）を測定する。上記した本発明の解析方法に準じて本工程を実施する。
（４）試験化合物存在下、及び非存在下で、細胞運命とその頻度の関係を調べることにより、細胞運命に影響を与える試験化合物であるか否かを判定する。例えば、試験化合物存在下、及び非存在下での細胞運命を、後述する様にグラフ化した場合、そのグラフの形状が有意に変動した場合、試験化合物が細胞運命に影響を及ぼしたと判断することができる。
【００５１】
存在させる試験化合物の量は細胞に致死的な影響を与えないよう設定され、好ましくは段階的に投与量を変えてスクリーニングを行なう。また、上記した例では幹細胞の増幅の段階（第１工程）で試験化合物を用いたが、目的に応じてコロニー産生の段階（第２工程）で試験化合物を用いることもできる。
【００５２】
本発明の解析方法は、幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ細胞運命を有する細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって、グラフ化することができる。グラフ化することによって、細胞運命を定量化することができ、上記した試験化合物の影響を数値化することも可能になる。グラフの種類は、細胞運命とその頻度とを対応させたものであれば特に限定されないが、細胞運命をＸ軸に頻度をＹ軸にそれぞれ展開して得られる折れ線グラフや、それを統計処理して得られる棒グラフ等が好ましい。
また、本発明の解析方法は、幹細胞から誘導される１つの細胞系列について実施されるものであってもよいが、好ましくは２つ以上の細胞系列について同時に実施される。２つの細胞系列について同時に実施される場合には、両細胞系列のグラフを重ね合わせることで、両細胞系列の因果関係を知ることができる。
【００５３】
本発明の細胞運命の解析用グラフは、上記した折れ線グラフや、棒グラフ以外に、細胞運命を分別し、その頻度を測定することによって得られる任意の種類のグラフを包含する。
【００５４】
本発明は、また、本発明の解析方法を応用することによって、特定の細胞系列へ運命付けられた細胞の濃縮度を確認する方法を提供する。例えば幹細胞がＨＢである場合、該幹細胞は将来的に血液系細胞系列あるいは血管内皮細胞系列へと分化が誘導される。いずれの細胞系列に運命付けられるかを本発明の解析方法によって解析するとともに、特定の細胞系列へ運命づけられた細胞を増幅する場合、その濃縮度（純度）を確認することもできる。ここで、「特定の細胞系列へ運命づけられた細胞を増幅及び濃縮する」とは、多分化能を有する幹細胞から目的とする細胞系列に運命付ける増幅培養により、目的とする細胞系列の純度を上げ（濃縮）、その細胞系列の細胞数を増やす（増幅）ことをいう。特定の細胞系列、例えば血管内皮系細胞系列へ運命付けられた細胞を増幅・濃縮する方法としては、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３及びトロンボポエチンを含有する無血清培地でインキュベートする方法（特許文献１）が挙げられる。特許文献１に記載の方法に準じてＨＢから血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増幅・濃縮を試みた場合、純度又は濃縮度をこの方法により調べることができる。増幅・濃縮を経て得られたＥＰＣ含有細胞集団について血管内皮細胞系列コロニーを産生させ、その頻度を調べる。増幅・濃縮が適切に行なわれていた場合には、ＥＰＣコロニーを産生する細胞の頻度が高くなる。グラフ化することにより、より簡便に判断することができ、また数量化が可能となる。
【実施例】
【００５５】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【００５６】
実施例１：ＨＥＬＩＣアッセイ
実験プロトコルを図１に示す。
（１）ＣＤ１３３陽性細胞の単離と増幅
幹細胞としてＨＢを用いた。ＨＢを含有する細胞懸濁液としては臍帯血（cord-blood：ＣＢ）由来の単核球を含有する細胞懸濁液を用いた。まず、採血した血液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に重層し、密度勾配遠心分離法にて単核球を分離した。分離した単核球をＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、血小板除去後の単核球を採取し、緩衝液中に懸濁して細胞懸濁液を調製した。
次いで、細胞懸濁液を抗ＣＤ１３３抗体を用いたＭＡＣＳに付してＣＤ１３３陽性細胞を回収した。詳細には、ＣＤ１３３陽性細胞単離キット（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、カタログＮｏ．１３０−０５０−８０１）を用いて、添付文書のプロトコルに準じて行った。
ＢＤ社製ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅシステムにより１ウェルあたりＣＤ１３３陽性細胞１個（単一細胞）ずつ、６０個（６０ウェル）を１プレートに播種した（図２ａ−１）。同様にして４プレート調製した。該プレートをＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２存在下、７日間培養した（図２ａ−２）。プレートは９６ウェルのＰｒｉｍａｒｉａ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ）を用いた。１ウェルあたり１００μＬのＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）添加、あるいは非添加培養液を用いた。培養液は、Ｓｔｅｍ ｓｐａｎ無血清培地に下記表２に示す成分を無菌的に添加したものを用いた。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表２中、「ｈ」はヒト由来であることを、「ｒ」は遺伝子工学的に製造された組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。
７日後に細胞が増幅したウェルにおける増幅細胞数をカウントした。
【００５９】
（２）コロニー産生
２４ウェルのｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１ウェルあたり３００μＬの血液細胞系列コロニー産生用のメチルセルロース培地（Ｈ４４３５，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ．）を入れた。
また、メチルセルロース培地（Ｈ４２３６，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ．）を用いて表３に示す組成に基づいて血管内皮細胞系列コロニー産生用のメチルセルロース培地を作製した。即ち、表３に示す各成分を所定の濃度となるようにメチルセルロース培地に無菌的に添加した。１ウェルあたり３００μｌずつ２４ウェルのＰｒｉｍａｒｉａ ｄｉｓｈ （ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ）に入れた。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３中、「ｈ」はヒト由来であることを、「ｒ」は遺伝子工学的に製造された組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。
上記単一細胞が増幅したウェルにつき、細胞培養液の半分ずつ（５０μＬずつ）をそのまま、さきに調製した血液細胞系列用及び血管内皮細胞系列用メチルセルロース培地に添加した。
ＨＳＰＣコロニー産生能及びＥＰＣコロニー産生能をそれぞれ、１２日、１４〜１８日後に評価した。
ＨＳＰＣコロニーは、ＣＦＵ−Ｍｉｘ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ、ＢＦＵ−Ｅを判定し（図２ａ−５，６，７，８）、ＥＰＣコロニーは、内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）を判定した（図２ａ−３，４）。
図２ａから明らかなように、単一のＣＤ１３３陽性細胞の中には、血液系ＨＳＰＣコロニー及び血管内皮系ＥＰＣコロニーの産生が認められるものが存在し、ＨＢ含有分画であることが確認された。
【００６２】
また、単一細胞から産生されたＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ及びＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣから、ＲＮＡを採取し、血管内皮系の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにて確認したところ、血管内皮細胞増殖因子受容体−２（vascular endothelial groth factor receptor-2；ＶＥＧＦＲ−２）、血管内皮細胞カドヘリン（vascular endothelial cadherin；ＶＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ）、内皮型ＮＯ合成酵素（endothelial nitric oxide syntase；ｅＮＯＳ）の発現がいずれのコロニーにも認められ、これらのコロニーが血管内皮系ＥＰＣコロニーであることが確認された（図２ｂ）。
ＲＴ−ＰＣＴについての手順を以下に示す。
RNeasy micro(Mini)kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAの抽出を行った。逆転写反応をsuper script (invitrogen) を用いて行いcDNAを作成した。PCR反応をEx Taq kit(TaKaRa)を用いて行った。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは以下の通り。
ｅＮＯＳ:
forward: 5’-AACCACATCAAGTATGCCACCAACC-3’（配列番号１）
reverse: 5’-CGTGCCGATCTCAGTGCTCA-3’（配列番号２）
ＶＥＧＦＲ−２:
forward: 5’-TGTGATATGTCTGAGACTGAATGCG-3’（配列番号３）
reverse: 5’-CCCAGCATTTCACACTATGGTACC-3’（配列番号４）
ＶＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ：
forward: 5’-ACACCAAGCTCACCCTTCGTC-3’（配列番号５)
reverse: 5’-CTTGTCATGCACCAGTTTGGC-3’（配列番号６）
【００６３】
さらに、１０００個のＣＤ１３３陽性細胞を滅菌した24mm x 24mmガラスプレート（松浪ガラス工業）を置いた３５ｍｍ Ｐｒｉｍａｒｉａ ｄｉｓｈを用いて血管内皮細胞系列コロニー産生用のメチルセルロース培地にて培養し、出現したＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ及びＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣコロニーをＶＥＧＦＲ−２、ｅＮＯＳ、ＶＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察したところ、いずれのコロニーも染色され血管内皮系ＥＰＣコロニーであることが確認された（図３）。
免疫染色についての手順を以下に示す。
氷冷した１ｍＬのＰＢＳ添加によりメチルセルロース除去後、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドを添加して、３時間４℃でインキュベーションを行った。その後、５分のＰＢＳでのインキュベーションによる洗浄を２回行った。5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100にて３０分ブロッキングを行った。各一次抗体mouse anti-human VEGFR-2 antibody (V9134, Sigma), mouse anti-human eNOS (NOS Type III 610296, BD Pharmingen)を各々、１：５０，１：５００の希釈倍率で5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100を用いて希釈した。mouse anti-human VE cadherin antibody (HM2032, Hycult)を、１：１０の倍率で2mM CaCl2含有5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100を用いて希釈した。希釈一次抗体を添加して4℃にて１２時間インキュベーションを行った。各染色において５分のＰＢＳでのインキュベーションによる洗浄を３回行った。Alexa488-goat anti-mouse IgG (H+L) (Molecular Probe)を１：５００の倍率で5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100で希釈後添加し、室温で１時間インキュベーションを行った。５分のＰＢＳでのインキュベーションによる洗浄を３回行った。VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI (H-1500, Vector Lab)を用いて染色されたコロニーのグラスを蛍光顕微鏡用スライドガラスに包埋した。confocal microscopy (FluoViewTMFV1000, Olympus)にて観察撮影した。
【００６４】
（３）グラフ作成及び解析
上記（２）で産生されたコロニーを解析した。ＨＳＰＣコロニーの単独評価において、単一細胞からの産生コロニーの様式からＶＥＧＦ非存在下（ＶＥＧＦ−）及びＶＥＧＦ存在下（ＶＥＧＦ＋）において合計１０個の細胞運命（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ）が存在していることがわかった（図４ａ，Ｘ軸方向）。Ｘ軸に細胞運命を展開し、Ｙ軸にはそのような細胞運命を有している細胞の数（頻度）をプロットした。いずれかの細胞運命に決定された単一細胞の頻度は、ＶＥＧＦ−及びＶＥＧＦ＋の２グループ（各６０個の単一細胞×４サンプル＝２４０個の単一細胞／グループ）において、有意差は認められなかった（図４ｂ）。
ＥＰＣコロニーの単独評価において、単一細胞からの産生コロニーの様式からＶＥＧＦ−及びＶＥＧＦ＋において合計３個の細胞運命が存在した（図４ｃ，Ｘ軸方向）。即ち、小細胞ＥＰＣコロニーのみを産生する単一細胞、大細胞ＥＰＣコロニーのみを単独で産生する単一細胞、両方のコロニーを産生する単一細胞の決定細胞運命領域３種類に分類された。このことから、ＥＰＣへと運命が決定された単一細胞の分化度は、ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ単独のｅａｒｌｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ＝ＥＶＺ、両方のｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ＝ＩＶＺ、ＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ単独のｌａｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ＝ＬＶＺに分類が可能であることが判明した。これに基づいてＨＢ単一細胞のＥＰＣへの運命決定頻度を評価したところ、ＶＥＧＦ−グループではＥＶＺからＬＶＺにかけて変化は認められなかったが、ＶＥＧＦ＋グループではＬＶＺにおいてＥＶＺの約２倍、ＶＥＧＦ−ｇｒｏｕｐのＬＶＺの約２倍の頻度が認められ、ＶＥＧＦにより、ＣＤ１３３陽性細胞の内皮系への分化が促進されることが判明した。また、ＨＢ単一細胞のＥＰＣへ決定頻度は、ＶＥＧＦ−グループに比較してＶＥＧＦ＋グループは約１．５倍となり、ＶＥＧＦはＣＤ１３３陽性細胞に対するＥＰＣへの細胞系列決定能を有することが明らかとなった（図４ｃ及びｄ）。
【００６５】
さらに、血液系及び血管内皮系における細胞系列決定法を重ね合わせることにより両細胞系列を同時に解析した。血液系及び血管内皮系の細胞運命を同時に評価することにより、細胞運命はＶＥＧＦ−及びＶＥＧＦ＋グループにおいて合計３４個存在することが判明した。血管内皮系細胞系列についてのみ言えばＥＶＺ、ＩＶＺ、ＬＶＺ及び血液系コロニー産生能のみでＥＰＣコロニーの産生能のないｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｚｏｎｅ＝ＨＺの４種類の決定細胞運命領域に分類された。ＶＥＧＦはＨＺの細胞運命頻度を約４０％程度に有意に減少させることが明らかとなった（図４ｅ及びｆ）。即ち、ＨＢから血液系細胞系列への分化を抑えて血管内皮系細胞系列への分化を促進していると考えられる。
【００６６】
ＨＥＬＩＣアッセイにより、ＶＥＧＦがＣＤ１３３陽性細胞の血管内皮系への細胞系列運命決定及び分化に促進的に作用し、また血液系単独への細胞運命決定を抑制することが示された。このようにＨＥＬＩＣアッセイは、ＨＢを含有する細胞分画の単一細胞の血液系、血管内皮系細胞運命決定の解析により、血液系又は血管内皮系の単独評価では解析が不可能な細胞運命決定を正確かつ定量的、簡便に評価できることが明らかとなった。本アッセイの開発は、血液学及び血管生物学の幹細胞生物学において画期的なものとなると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の解析方法は、血液系及び血管内皮系細胞系列の運命をグラフ化、定量化することが可能となり、特に血液系及び血管内皮系細胞系列の運命を同時にグラフ化、定量化することにより、従来の単独細胞系列解析法では判別不可能であった細胞運命の明確化、その定量化が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１ ｅＮＯＳ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２ ｅＮＯＳ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号３ ＶＥＧＦＲ−２検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号４ ＶＥＧＦＲ−２検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号５ ＶＥ Ｃａｄｈｅｒｉｎ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号６ ＶＥ Ｃａｄｈｅｒｉｎ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（リバース）
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、本発明の解析方法の手順を示す図である。
【図２】図２は、ＣＤ１３３陽性細胞の中に、血液系ＨＳＰＣコロニー及び血管内皮系ＥＰＣコロニーの産生が認められるものが存在し、ＨＢ含有分画であることを示す図である。図２ａは位相差像を示し、図２ｂはＲＴ−ＰＣＲによりＥＰＣコロニーの産生を確認した図である。図２ａ１は、ＣＤ１３３陽性単一細胞を播種した１２時間後の細胞の様子を示し、図２ａ２は、単一細胞を７日間増幅培養した後の細胞の様子を示している。図２ａ３，４はＥＰＣコロニー産生の様子を、図２ａ５，６，７，８はＨＳＰＣコロニーの産生の様子を示している。
【図３】図３は、産生されたコロニーがＥＰＣコロニーであることを示す蛍光染色の結果を示す像である。
【図４】図４は、細胞運命とその頻度との関係を示すグラフである。図４ａは、血液系細胞系列の細胞運命とその運命を有する細胞の頻度との関係をグラフ化したものである。１０種類の細胞運命に分けられる。図４ｂは、血液系細胞系列の運命決定に及ぼすＶＥＧＦの影響を調べた結果を示すグラフである。図４ｃは、血管内皮系細胞系列の細胞運命とその運命を有する細胞の頻度との関係をグラフ化したものである。３種類の細胞運命に分けられる。図４ｄは、血管内皮系細胞系列の運命決定に及ぼすＶＥＧＦの影響を調べた結果を示すグラフである。図４ｅは、血液系細胞系列と血管内皮系細胞系列の細胞運命とその運命を有する細胞の頻度との関係を重ねてグラフ化したものであり、３４種類の細胞運命に分けられる。図４ｆは、血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列の運命決定に及ぼすＶＥＧＦの影響を調べた結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞運命の解析方法、特に幹細胞の細胞運命を解析・評価する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液系及び血管系医学の分野において、ヒトの血液幹細胞含有分画であるＣＤ３４陽性細胞において血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cell=ＥＰＣ)が発見（非特許文献１）され、ＣＤ３４陽性細胞さらには早期血液幹細胞分画であるＣＤ１３３陽性細胞は、血液血管芽細胞(Hemangioblast=ＨＢ)含有分画として考えられるようになった。つまり、胎生期における血管島では、血液前駆細胞(hematopoietic stem/progenitor cell=ＨＳＰＣ)及びＥＰＣは共通の多能性幹細胞であるＨＢから分化することが明らかとなっている。成体内においても、このような未分化なＨＢの存在証拠が確認（非特許文献２〜４）され、ＥＰＣは骨髄幹細胞ニッチ内において、ＨＳＰＣと共にＨＢという共通の幹細胞から血液・血管細胞系列の運命決定(commitment)、分化(differentiation)が行われた結果であると推定されている。
【０００３】
血液系分野において、形態学的観察に基づいたＨＳＰＣの血液細胞系列への分化様式に関する解析法としては、１９７０年代に非接着系培養皿と半固形培地のメチルセルロースを用いた方法が開発され、以後、その意義は確立している（非特許文献５）。すなわち、コロニーのタイピング、数を評価する方法である。しかし、当然、血液系細胞に限られた解析法であり、ＨＢの細胞生物学的解析は不可能である。
ＥＰＣの分化様式評価系は、１９９７年の成体内ＥＰＣの発見以来、２つの細胞生物学的解析法が用いられてきた。一つは、未分化ＥＰＣ含有細胞（骨髄や末梢血のＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞、単核球）を内皮系細胞培養用の液体培地で培養し、接着細胞を獲得してこれを数的に評価するＥＰＣ培養アッセイ法（非特許文献６及び７）であり、二つ目は、メチルセルロースを用いたＥＰＣコロニーアッセイ法で、ＥＰＣのコロニーを数的に評価するものである（非特許文献８）。いずれの方法も、ＥＰＣの数的評価に止まり、その分化過程の評価は不可能である。特許文献１及び２ではＥＰＣの分化様式を解析する方法が記載されているが、内皮系細胞の解析に止まり、血液系細胞系列への分化との因果関係は不明である。
【非特許文献１】T. Asahara, T. Murohara, A. Sullivan et al., Science 275：964-967 (1997)
【非特許文献２】E. Pelosi, M. Valtieri et al., Blood 100(9): 3203-3208 (2002)
【非特許文献３】S. Loges, B. Fehse et al., Stem Cells Dev. 13(3): 229-242 (2004)
【非特許文献４】UM. Gehling, S. Ergun et al., Blood 95(10): 3106-3112 (2000)
【非特許文献５】A. Hirao, Y. Takaue et al., Journal of Clinical Apheresis 10: 17-22 (1995)
【非特許文献６】T. Asahara, T. Takahashi et al., EMBO J. 18(14): 3964-3972 (1999)
【非特許文献７】C. Kalka, H. Masuda et al., Circ Res. 86(12): 1198-1202 (2000)
【非特許文献８】B. Assmus, C. Urbich et al., Circ Res. 92(9): 1049-1055 (2003)
【特許文献１】ＷＯ２００６／０９０８８２号国際公開公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０９０８８６号国際公開公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、幹細胞、特に組織幹細胞の細胞運命の解析方法、具体的には血液血管芽細胞（ＨＢ）から血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列への運命決定、分化を解析する方法の開発、特に血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列の細胞運命を同時に解析する方法の開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明者らは、まず、ＨＢから単離される単一細胞を培養し、血液系細胞系列あるいは内皮系細胞系列へと分化して産生されるコロニーの様式を調べ、その様式のパターンに基づいて細胞を群分けし、「細胞運命（commitment）」を定義づけた。次いで、得られた細胞運命のそれぞれについて、その頻度（すなわち該当する細胞運命を提示するようになる単一細胞の数）を測定した。細胞運命とその頻度を対応させることによって細胞運命の明確化、グラフ化が可能となり、定量化することが可能となった。
【０００６】
即ち、本発明は下記の通りである：
［１］幹細胞の単一細胞を調製し、得られた単一細胞を増幅する工程（第１工程）、
増幅した細胞を培養し、コロニーを産生させる工程（第２工程）、及び
産生されたコロニーの様式に基づいて単一細胞を群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定する工程（第３工程）
を含む、幹細胞の細胞運命の解析方法。
［２］幹細胞が血液血管芽細胞である、上記［１］記載の方法。
［３］血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、上記［２］記載の方法。
［４］血液血管芽細胞が、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性である、上記［２］記載の方法。
［５］産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、上記［２］記載の方法。
［６］血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［５］記載の方法。
［７］血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［５］記載の方法。
［８］第１工程が、添加因子の存在下又は非存在下で実施される、上記［１］記載の方法。
［９］添加因子が成長因子である、上記［８］記載の方法。
［１０］上記［１］記載の方法を実施することを含む、幹細胞の細胞運命に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法。
［１１］上記［１］記載の方法を実施することを含む、幹細胞から特定の細胞系列へ運命付けられた細胞の濃縮度を確認する方法。
［１２］幹細胞が血液血管芽細胞であり、特定の細胞系列へ運命付けられた細胞が血管内皮前駆細胞である、上記［１１］記載の方法。
［１３］幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定し、各群について、その群に属する単一細胞の数を対応させることによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
［１４］幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ群に分類される単一細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
［１５］幹細胞が血液血管芽細胞である、上記［１３］又は［１４］記載のグラフ。
［１６］産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、上記［１５］記載のグラフ。
［１７］血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［１６］記載のグラフ。
［１８］血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［１６］記載のグラフ。
【発明の効果】
【０００７】
組織幹細胞の細胞運命、具体的にはＨＢからの血液系及び血管内皮系細胞系列の細胞運命をグラフ化、定量化することが可能となる。特に血液系及び血管内皮系細胞系列の細胞運命を同時にグラフ化、定量化することにより、従来の単独細胞系列解析法では判別不可能であった細胞運命の明確化、その定量化が可能となる。また、本発明の方法は、単一細胞での評価であり、細胞系列決定評価が正確である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、幹細胞の細胞運命の解析方法、例えばＨＢから血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列への運命決定、分化を解析する方法の開発、特に血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列の細胞運命を同時に解析する方法を提供する。本発明の解析方法は、まず、その細胞運命の解析が所望される幹細胞の単一細胞を調製し培養する工程を含む。
【０００９】
幹細胞としては、所定の細胞へと分化し得る細胞運命を有するものであれば特に限定されないが、好ましくは組織幹細胞であり、神経系幹細胞、造血系・血管系幹細胞、間葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞等が例示される。特に好ましくは各細胞系列の表現型がよく研究されている造血系・血管系幹細胞であり、該幹細胞は、上記したＨＢ（血液血管芽細胞）に相当する。
【００１０】
本発明で用いられる「血液血管芽細胞(Hemangioblast=ＨＢ)」とは、血液系細胞及び血管内皮細胞両方の前駆細胞であって、血液幹細胞、血液前駆細胞を経て血液系細胞（例えば、赤血球、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、巨核球）になり得、また、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を経て血管内皮細胞になり得る未分化な細胞であれば特に限定されない。ＨＢとしては、被検対象の骨髄、臍帯血又は末梢血由来の細胞を使用できる。ＨＢはまた、単核球であり得る。
【００１１】
ＨＢはさらに、ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性であり得る。従って、ＨＢとして、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞のみ予め選別して用いることもまた好ましい。ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性細胞の選別は、当分野で通常行われている細胞選別の手法が用いられ、具体的にはＣＤ３４抗原及び／又はＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質を用いた磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、蛍光細胞分離法（ＦＡＣＳ）等が挙げられる。かかる分離方法により、幹細胞を単一細胞とすることができる。
【００１２】
ＣＤ３４抗原あるいはＣＤ１３３抗原に特異的な親和性を有する物質としては例えばこれらの蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質等で標識されていてもよい。
【００１３】
ＨＢはまた、ＨＢを動員可能な物質により動員されたものであり得る。ＨＢを動員可能な物質としては、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１、エストロゲン、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、アンジオポエチン１及び２、ＨＧＦ、スタチン類（ｓｔａｔｉｎｓ）、エリスロポエチンが挙げられるが、なかでもＧ−ＣＳＦが好ましい。この場合、ＨＢを動員可能な物質の被検対象への投与により得られる、ＨＢを動員しておいた体液成分（例えば、末梢血）の形態で、ＨＢが提供されてもよい。ＨＢを動員可能な物質の被検対象への投与回数、投与期間、投与量は用いる物質の種類によっても異なり、ＨＢを動員可能である限り特に限定されないが、Ｇ−ＣＳＦの場合であれば、投与回数については、例えば通常１日１回〜３回、好ましくは２回であり、投与期間については、例えば約３〜７日間、好ましくは約４〜６日間、より好ましくは５日間であり、投与量については、約２〜５０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５〜２０μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日である。
【００１４】
ＨＢはさらに、ＨＢを動員可能な物質により動員されたＨＢを移植された被検対象から採取されるものであってもよい。
【００１５】
本発明において被検対象は、幹細胞の細胞運命を解析することが求められている動物であって、ヒトを含む哺乳動物一般を意味するが、臨床応用という本発明の目的に鑑みれば、被検対象は好ましくはヒトである。また、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル等の哺乳動物での使用も好ましい。
【００１６】
本発明の解析方法では、幹細胞、必要に応じて選別されたＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性の幹細胞の単一細胞を培養する。単一細胞の培養は、幹細胞の由来や所望する細胞系列に応じて、従来行なわれている方法あるいはそれに準じた方法で行なうことができる。例えば幹細胞がＨＢであり、所望する細胞系列が血管内皮細胞系列であれば、特許文献１及び特許文献２に開示されている方法が好適に用いられる。幹細胞がＨＢであり、所望する細胞系列が血液細胞系列の細胞であれば、非接着系培養皿と半固形培地のメチルセルロースを用いた方法（非特許文献５）が好適に用いられる。
【００１７】
本発明の方法においては、単一細胞の培養は、組織幹細胞の単一細胞を調製して増幅させる工程（第１工程）及び増幅させた細胞からコロニーを産生させる工程（第２工程）の、通常２工程によって行なわれる。第１工程は、幹細胞が効率よく増殖することができればその方法は特に限定されないが、組織幹細胞がＨＢの場合、特許文献１に記載の方法によって実施することが好ましい。具体的には、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含有する無血清培地でＨＢをインキュベートすることを含む。
【００１８】
第１工程で用いられる無血清培地は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている無血清培地を用いることができる。無血清培地として用いられる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が挙げられる。
【００１９】
無血清培地に含めうる幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、本発明で用いるＳＣＦはＨＢの培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００２０】
本発明で用いられるインターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量２１万の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。本発明で用いるＩＬ−６は適宜選択されるが、ヒトＨＢの培養に用いる場合には、ヒトＩＬ−６が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＩＬ−６の濃度は、用いるＩＬ−６の種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−６の場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００２１】
本発明で用いられるＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ−３）は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。本発明で用いるＦｌｔ−３は、ＨＢの培養に有用である限り、いずれのタイプのＦｌｔ−３であってもよい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＦｌｔ−３の濃度は、用いるＦｌｔ−３の種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＦｌｔ−３リガンドの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００２２】
本発明で用いられるトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。本発明で用いるＴＰＯの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＴＰＯの場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００２３】
第１工程で用いられる無血清培地には、後述の実施例で示されるように、ＥＰＣをより効率的に増幅させる、あるいは増幅総細胞数をより増加させるという観点から、上記ＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｆｌｔ−３及びＴＰＯに加え、成長因子、特に血管内皮細胞増殖因子をさらに含有することが好ましい場合もある。
【００２４】
本発明で用いられ得る血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、本発明で用いるＶＥＧＦはＥＰＣをより効率的に増幅させる、あるいは増幅総細胞数をより増加させる限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、ＨＢの培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００２５】
本発明において好ましい無血清培地は、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ−３、約２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含有する無血清培地であり、約１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含有しているものが好ましい。
【００２６】
上記した各成分は無血清培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、無血清培地で所定の濃度に希釈することによって本発明において用いられるＨＢの単一細胞を増幅させる為の無血清培地を調製することができる。例えば市販の無血清培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の無血清培地に添加、希釈することによって調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０.２２μｍや０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
【００２７】
上述した因子を含有する無血清培地でのＨＢの培養は、ＨＢの単一細胞を、上述の因子を含有する無血清培地中に播種することにより行われる。ＨＢの培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で７日間程度培養される。
【００２８】
第１工程において、細胞の「増幅」とは、細胞の未分化状態をできる限り維持しつつ、その細胞数を増加させることを意味する。第１工程におけるＨＢの増幅は、上述の因子を例えば上述の濃度で用いてＨＢを培養することにより達成でき、血液前駆細胞（ＨＳＰＣ）や血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が増幅される。好ましくは本工程（第１工程）は、単一細胞の培養という性質上、９６ウェルプレートなど、単一細胞の培養に適した培養器中で行なう。
【００２９】
本発明では、組織幹細胞の単一細胞の調製ならびに増幅（第１工程）に続いて、増幅させた細胞からコロニーを産生させる工程（第２工程）を行なう。第２工程は、所望する細胞系列のコロニーが産生される限り、特にその方法は限定されないが、コロニーを産生させるという性質上、第１工程よりはより培養面積の広い培養器、例えば２４ウェルプレート等の培養器中で行なうことが好ましい。組織幹細胞がＨＢであり、細胞系列が血液系細胞系列である場合には、半固形培地である血液系細胞系列用のメチルセルロース培地を用いた方法が好適に用いられる。かかる培養によりＨＢから血液前駆細胞コロニー（ＨＳＰＣコロニー）が産生される。本発明では、細胞構成の異なる４種類のＨＳＰＣコロニーが出現する。このような４種類のＨＳＰＣコロニーが出現するのは第１工程で増幅させたＨＢの懸濁液を半固形培地上に播種してから通常１０日以上、例えば１２日経過した時点であるので、本発明においてＨＳＰＣのコロニーを形成させるには例えば１２日間培養される。形成される４種類のコロニーは、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）である。形成されるコロニーの種類はその色や形態から容易に識別することができる。また、個々のコロニーを採取してＲＴ−ＰＣＲを行い、遺伝子発現レベルで確認することもできる。
【００３０】
ＨＳＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地は、ＨＳＰＣコロニー形成を可能とするものである限り特に限定されないが、例えば、造血幹細胞等の未分化細胞の増殖用培地などとして知られている半固形培地を使用できる。このような半固形培地としては、例えば、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル、メビオールゲルなどが挙げられる。半固形培地としてメチルセルロース培地を用いる場合、培地中のメチルセルロース濃度は特に限定されるものではないが、例えば約０．５〜５％、好ましくは約０．７〜３％、より好ましくは約１％で用いられる。
【００３１】
また、組織幹細胞がＨＢ細胞であり、細胞系列が血管内皮細胞系列である場合には、特許文献１及び２に記載された方法に準じて好適に実施することができる。具体的には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する半固形培地でＨＢを培養することを含む。かかる培養により、ＨＢから血管内皮前駆細胞コロニー（ＥＰＣコロニー）が産生される。本発明では、構成細胞のサイズが異なる２種類のＥＰＣコロニーが出現する。このような２種類のサイズのＥＰＣコロニーが出現するのは第１工程で増幅させたＨＢの懸濁液を半固形培地上に播種してから通常１０日以上、例えば１４〜１８日経過した時点であるので、本発明においてＥＰＣのコロニーを形成させるには例えば１４〜１８日間培養される。形成される２種類のコロニーのうち、大きい細胞で構成されるコロニー（内皮細胞様大細胞コロニー；ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ、大細胞コロニーともいう）は長径約５０〜２００μｍの細胞を主に含み、小さい細胞で構成されるコロニー（内皮細胞様小細胞コロニー；ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ、小細胞コロニーともいう）は直径約２０μｍ以下（例えば約１０〜２０μｍ）の細胞を主に含む。ここで「主に」とはコロニーを構成する細胞集団の約３０％、好ましくは約５０％、特に好ましくは約７０％が、長径約５０〜２００μｍの細胞（大細胞コロニーの場合）あるいは直径２０μｍ以下の細胞（小細胞コロニーの場合）であることを意味する。被検対象から経時的に骨髄液、臍帯血あるいは末梢血等を採取し、採取した試料についてＥＰＣコロニーアッセイを行うと、動員後のコロニー出現迄に要する時間が、大細胞コロニーと小細胞コロニーとでは異なっていることが判明している。大細胞コロニーは小細胞コロニーにやや遅れて出現する。即ち、分化段階の異なるＥＰＣが存在することが示唆される。早い段階で出現する内皮細胞様小細胞は早期分化段階のＥＰＣと言え、また遅い段階で出現する内皮細胞様大細胞は晩期分化段階のＥＰＣであると言える。本発明の解析方法では、上述の通りコロニーを形成する細胞サイズの差異に基づき分化度の異なるＥＰＣが区別可能である。
【００３２】
ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地は、ＥＰＣコロニー形成を可能とするものである限り特に限定されないが、例えば、造血幹細胞等の未分化細胞の増殖用培地などとして知られている半固形培地を使用できる。このような半固形培地としては、例えば、メチルセルロース培地、マトリゲル、コラーゲンゲル、メビオールゲルなどが挙げられる。半固形培地としてメチルセルロース培地を用いる場合、培地中のメチルセルロース濃度は特に限定されるものではないが、例えば約０．５〜５％、好ましくは約０．７〜３％、より好ましくは約１％で用いられる。
【００３３】
ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が含まれていることが好ましい。ここで用いられるＶＥＧＦとしては、上記第１工程で無血清培地に添加したものと同様なものが例示される。半固形培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニー産生に適切である限り特に限定されないが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。ここで用いられるｂＦＧＦは、約１８ｋＤａ、等電点９．０の一本鎖ペプチドであり、血管新生、種々の細胞増殖促進、分化誘導等の機能を有することが知られている。本発明で用いるｂＦＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のｂＦＧＦの濃度は、用いるｂＦＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニー産生に適切である限り特に限定されないが、ヒト組換えｂＦＧＦを用いる場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３４】
第２工程で、ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地には、さらにＥＰＣコロニーをより効率的に形成させるという観点から、上記ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦに加え、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）からなる群より選ばれる１又は２以上の因子、好ましくは３以上の因子、より好ましくは全ての因子をさらに含有することが好ましい。
【００３５】
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、上記第１工程で無血清培地に添加したものと同様なものが例示される。半固形培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に形成できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００３６】
インターロイキン３（ＩＬ−３）は、造血幹細胞や各種血球系列の前駆細胞に作用し、その増殖、分化を促進するサイトカインとして知られている。ヒトで１５２残基、マウスで１６６残基のアミノ酸から成るが、糖鎖の修飾によって見かけ上２８，０００の分子量を有する。本発明で用いるＩＬ−３はコロニー産生を目的とするＥＰＣの由来に応じて適宜選択されるが、ヒトのＥＰＣのコロニー産生に用いる場合には、ヒトＩＬ−３が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＩＬ−３の濃度は、用いるＩＬ−３の種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−３を用いる場合であれば、約１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
【００３７】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、ソマトメジンとも称される、プロインスリンに類似した一次構造をもつ分子量約７０００のポリペプチドで互いに類似したＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの２種類が存在することが知られている。ともに類似した作用を有し、インビトロでは様々な細胞の増殖を促進することが知られている。本発明で用いるＩＧＦはＥＰＣのコロニー産生を可能にする限りいずれのタイプのＩＧＦでもよい。好ましくはＩＧＦ−Ｉである。ＩＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＩＧＦの濃度は、用いるＩＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉを用いる場合であれば、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３８】
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は、上皮細胞の分化・増殖を促進させる作用を有する、アミノ酸５３個のタンパク質であり、糖鎖は結合していないことが知られている。約６ｋＤａで３ヶ所のジスルフィド結合を有する。本発明で用いるＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のＥＧＦの濃度は、用いるＥＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ヒト組換えＥＧＦを用いる場合であれば、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００３９】
ＥＰＣコロニー産生のために用いられる半固形培地は、ＥＰＣコロニーをさらにより効率的に形成させるという観点から、上記ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ、並びにＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＧＦ及びＥＧＦからなる群より選ばれる１又は２以上の因子に加え、血清及び／又はヘパリンをさらに含有することが好ましい。
【００４０】
血清が使用される場合、その由来等は特に限定されないが、培地に添加されることから比較的使用量が多いことが予想される。従って、商業的に入手可能なウシ、ウマ、ヒト等の血清（例えば、胎児血清）が用いられる。より好ましくはウシ胎児血清（ＦＣＳ）である。当該血清は非働化して用いることが好ましい。半固形培地中の血清の濃度は、用いる血清の種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをさらにより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ＦＣＳの場合であれば、約１０〜５０％、好ましくは約１５〜４０％、より好ましくは約３０％である。
【００４１】
ヘパリンは、Ｄ−グルクロン酸、あるいはＬ−イズロン酸のいずれかを含むウロン酸残基と、Ｄ−グルコサミンとの二糖体の繰り返し構造を骨格に持つグルコサミノグリカンである。ヘパリンは哺乳類の小腸や肺に多く存在し、市販品はブタの腸由来の抽出物が多く、その分子量は７，０００〜２５，０００程度である。本発明で用いるヘパリンは動物組織由来のものであってもよいし、ＥＰＣのコロニー産生を可能にする限り、化学的、物理的に分解された低分子化ヘパリンであってもよい。例えば、ブタ腸由来ヘパリンが使用される。商業的に入手可能なものが知られている。半固形培地中のヘパリンの濃度は、用いるヘパリンの種類によっても異なり、ＥＰＣコロニーをさらにより効率的に産生できる限り特に限定されないが、ブタ腸由来ヘパリンの場合であれば、約０．２〜１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは約１〜５Ｕ／ｍＬ、より好ましくは約２Ｕ／ｍＬである。
【００４２】
上記した各生理活性物質は半固形培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各生理活性物質の濃縮液（ストック溶液）を調製し、半固形培地で所定の濃度に希釈することによって本発明で用いる、ＥＰＣコロニー産生用の半固形培地を調製できる。例えば市販の半固形培地に必要な生理活性物質を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の半固形培地に添加、希釈することによって本発明で用いる生理活性物質含有半固形培地を調製できる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０.２２μｍや０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
【００４３】
ＥＰＣコロニーの産生は目視で確認することができるが、得られるコロニーが本当にＥＰＣで構成されているか否かは、例えば、アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）の取り込み能やＵＥＡ−１レクチンとの結合能、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２とも称される）、ｖＷＦの発現（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより、あるいは蛍光免疫組織化学的方法により）等を確認することによって行われ得る。例えばＤｉＩで標識したアセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ−ＤｉＩ）及びＦＩＴＣ標識したＵＥＡ−１レクチン（ＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣ）でコロニーを二重染色した場合に、ＥＰＣであれば共に染色される。
【００４４】
本発明では、幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けする工程を含む。例えば幹細胞としてＨＢを用いた場合、ＥＰＣコロニーであればＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ、あるいはＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣが形成され、ＨＳＰＣコロニーであればＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＭあるいはＣＦＵ−Ｍｉｘが産生される。各単一細胞について、どのようなコロニーを産生するかを調べることによって群分けする。
【００４５】
例えば血管内皮細胞系列であれば、ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生するがＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生しない細胞（後述の実施例ではＬＶＺ領域に相当）、ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生しないがＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣを産生する細胞（後述の実施例ではＥＶＺ領域に相当）、及び両方産生する細胞（後述の実施例ではＩＶＺ領域に相当）の３群に分けることができる。さらに血液細胞系列のそれぞれについて、産生されるコロニーの様式の一例を下記表１に示す。このようにして各様式に基づく群分けを可能とする個々の細胞が有している、あるいは有することになる特性を「細胞運命」と称し、本発明はそのような「細胞運命」の解析を可能とし、その応用を提供する。
【００４６】
【表１】
【００４７】
本発明では、産生されたコロニーの様式に基づいて群わけされた「細胞運命」に対して、同じ細胞運命を有する単一細胞の数を測定する（第３工程）。例えば、増幅、分化を経て（第１工程）、ＣＦＵ−Ｍｉｘ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍのコロニーを産生するようになる単一細胞は細胞運命１を有している、と言える（上記表１参照）。４種全てのコロニーを産生するようになる単一細胞は細胞運命１を有していて、その数を測定する。第１工程で例えば９６ウェルプレートにＨＢを播種した場合、各ウェルに１個ずつのＨＢが存在する。各ウェルに存在するＨＢから派生するコロニーがどの様な種類のものかを評価することによって、そのＨＢ単一細胞の細胞運命が決定されるので、細胞運命頻度とは同じコロニー産生様式を示す単一細胞の数、即ちウェルの数を測定することによって簡便に知ることができる。
【００４８】
本発明では組織幹細胞、特にＨＢの単一細胞から産生されるＥＰＣコロニー及びＨＳＰＣコロニーを同時にアッセイすることができ、本発明者らは、このようなアッセイをＨＥＬＩＣ（Hematopoietic and Endothelial Lineage Commitment）アッセイと命名した。ＨＥＬＩＣアッセイは、血液系細胞系列の細胞運命の解析と血管内皮系細胞系列の細胞運命の解析を同時に行なうことができる。
【００４９】
本発明の解析方法では、上記した単一細胞の培養に必要な因子以外に、細胞運命の決定に影響を与えるか否かを調べることを目的として、あるいは既に細胞運命の決定に影響を与えることが知られている因子を別途添加してもよい（以後、添加因子とも称する）。本発明において用いる添加因子としては、サイトカイン、成長因子、性ホルモンをはじめ抗悪性腫瘍剤、抗高脂質血症剤、降圧剤等を含む臨床応用薬剤或いは臨床応用予定薬剤が挙げられる。サイトカインとしては、血管形成促進作用を有するｓｔｒｏｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１（ＳＤＦ−１）、等が例示される。成長因子としては、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１等が例示される。性ホルモンとしては血管形成促進作用を有するエストロゲン、プロゲステロン等が例示される。臨床応用薬剤としては、特に生活習慣病の高脂質血症や高血圧症において血管内皮前駆細胞活性の低下が報告されている。そこで特に、これらの治療薬剤のＨＢから血管内皮細胞の運命決定に与える影響の解析が可能である。また、逆に血管形成能が高くなる色々の悪性腫瘍において抗悪性腫瘍薬のＨＢから血管内皮細胞への運命決定に与える影響をも解析可能である。
【００５０】
本発明はまた、本発明の解析方法を用いて、細胞運命に影響を与える化合物をスクリーニングする方法を提供する。
具体的には、以下のような方法が例示される。
（１）幹細胞の単一細胞を調製する。
上記した本発明の解析方法と同様、単一細胞の選別が必要な場合はこの段階で行なうことができる（例えばＣＤ１３３陽性細胞の選別）。
（２）上記（１）で得られた単一細胞を増幅・培養し、コロニーを産生させる。
第１工程：培養条件は幹細胞の由来に応じて適宜設定される。２群にわけ一方は試験化合物存在下で、他方は試験化合物非存在下で培養する。試験化合物が存在するか、あるいは存在しないか、という点を除いては、上記した本発明の解析方法に準じて本工程を実施する。
第２工程：試験化合物存在下あるいは非存在下で増幅させた幹細胞からコロニーを産生させる。上記した本発明の解析方法に準じて本工程を実施する。
（３）産生されるコロニーの様式に基づいて群わけ（細胞運命）し、同じ細胞運命を有する単一細胞の数（頻度）を測定する。上記した本発明の解析方法に準じて本工程を実施する。
（４）試験化合物存在下、及び非存在下で、細胞運命とその頻度の関係を調べることにより、細胞運命に影響を与える試験化合物であるか否かを判定する。例えば、試験化合物存在下、及び非存在下での細胞運命を、後述する様にグラフ化した場合、そのグラフの形状が有意に変動した場合、試験化合物が細胞運命に影響を及ぼしたと判断することができる。
【００５１】
存在させる試験化合物の量は細胞に致死的な影響を与えないよう設定され、好ましくは段階的に投与量を変えてスクリーニングを行なう。また、上記した例では幹細胞の増幅の段階（第１工程）で試験化合物を用いたが、目的に応じてコロニー産生の段階（第２工程）で試験化合物を用いることもできる。
【００５２】
本発明の解析方法は、幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ細胞運命を有する細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって、グラフ化することができる。グラフ化することによって、細胞運命を定量化することができ、上記した試験化合物の影響を数値化することも可能になる。グラフの種類は、細胞運命とその頻度とを対応させたものであれば特に限定されないが、細胞運命をＸ軸に頻度をＹ軸にそれぞれ展開して得られる折れ線グラフや、それを統計処理して得られる棒グラフ等が好ましい。
また、本発明の解析方法は、幹細胞から誘導される１つの細胞系列について実施されるものであってもよいが、好ましくは２つ以上の細胞系列について同時に実施される。２つの細胞系列について同時に実施される場合には、両細胞系列のグラフを重ね合わせることで、両細胞系列の因果関係を知ることができる。
【００５３】
本発明の細胞運命の解析用グラフは、上記した折れ線グラフや、棒グラフ以外に、細胞運命を分別し、その頻度を測定することによって得られる任意の種類のグラフを包含する。
【００５４】
本発明は、また、本発明の解析方法を応用することによって、特定の細胞系列へ運命付けられた細胞の濃縮度を確認する方法を提供する。例えば幹細胞がＨＢである場合、該幹細胞は将来的に血液系細胞系列あるいは血管内皮細胞系列へと分化が誘導される。いずれの細胞系列に運命付けられるかを本発明の解析方法によって解析するとともに、特定の細胞系列へ運命づけられた細胞を増幅する場合、その濃縮度（純度）を確認することもできる。ここで、「特定の細胞系列へ運命づけられた細胞を増幅及び濃縮する」とは、多分化能を有する幹細胞から目的とする細胞系列に運命付ける増幅培養により、目的とする細胞系列の純度を上げ（濃縮）、その細胞系列の細胞数を増やす（増幅）ことをいう。特定の細胞系列、例えば血管内皮系細胞系列へ運命付けられた細胞を増幅・濃縮する方法としては、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３及びトロンボポエチンを含有する無血清培地でインキュベートする方法（特許文献１）が挙げられる。特許文献１に記載の方法に準じてＨＢから血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増幅・濃縮を試みた場合、純度又は濃縮度をこの方法により調べることができる。増幅・濃縮を経て得られたＥＰＣ含有細胞集団について血管内皮細胞系列コロニーを産生させ、その頻度を調べる。増幅・濃縮が適切に行なわれていた場合には、ＥＰＣコロニーを産生する細胞の頻度が高くなる。グラフ化することにより、より簡便に判断することができ、また数量化が可能となる。
【実施例】
【００５５】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【００５６】
実施例１：ＨＥＬＩＣアッセイ
実験プロトコルを図１に示す。
（１）ＣＤ１３３陽性細胞の単離と増幅
幹細胞としてＨＢを用いた。ＨＢを含有する細胞懸濁液としては臍帯血（cord-blood：ＣＢ）由来の単核球を含有する細胞懸濁液を用いた。まず、採血した血液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に重層し、密度勾配遠心分離法にて単核球を分離した。分離した単核球をＰＢＳ−ＥＤＴＡで洗浄し、血小板除去後の単核球を採取し、緩衝液中に懸濁して細胞懸濁液を調製した。
次いで、細胞懸濁液を抗ＣＤ１３３抗体を用いたＭＡＣＳに付してＣＤ１３３陽性細胞を回収した。詳細には、ＣＤ１３３陽性細胞単離キット（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、カタログＮｏ．１３０−０５０−８０１）を用いて、添付文書のプロトコルに準じて行った。
ＢＤ社製ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅシステムにより１ウェルあたりＣＤ１３３陽性細胞１個（単一細胞）ずつ、６０個（６０ウェル）を１プレートに播種した（図２ａ−１）。同様にして４プレート調製した。該プレートをＣＯ２インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ２存在下、７日間培養した（図２ａ−２）。プレートは９６ウェルのＰｒｉｍａｒｉａ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ）を用いた。１ウェルあたり１００μＬのＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）添加、あるいは非添加培養液を用いた。培養液は、Ｓｔｅｍ ｓｐａｎ無血清培地に下記表２に示す成分を無菌的に添加したものを用いた。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表２中、「ｈ」はヒト由来であることを、「ｒ」は遺伝子工学的に製造された組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。
７日後に細胞が増幅したウェルにおける増幅細胞数をカウントした。
【００５９】
（２）コロニー産生
２４ウェルのｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１ウェルあたり３００μＬの血液細胞系列コロニー産生用のメチルセルロース培地（Ｈ４４３５，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ．）を入れた。
また、メチルセルロース培地（Ｈ４２３６，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃ．）を用いて表３に示す組成に基づいて血管内皮細胞系列コロニー産生用のメチルセルロース培地を作製した。即ち、表３に示す各成分を所定の濃度となるようにメチルセルロース培地に無菌的に添加した。１ウェルあたり３００μｌずつ２４ウェルのＰｒｉｍａｒｉａ ｄｉｓｈ （ＢＤ Ｌａｂｗａｒｅ）に入れた。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３中、「ｈ」はヒト由来であることを、「ｒ」は遺伝子工学的に製造された組換え体であることを示す。それ以外の各略語は上述の通りである。
上記単一細胞が増幅したウェルにつき、細胞培養液の半分ずつ（５０μＬずつ）をそのまま、さきに調製した血液細胞系列用及び血管内皮細胞系列用メチルセルロース培地に添加した。
ＨＳＰＣコロニー産生能及びＥＰＣコロニー産生能をそれぞれ、１２日、１４〜１８日後に評価した。
ＨＳＰＣコロニーは、ＣＦＵ−Ｍｉｘ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ、ＢＦＵ−Ｅを判定し（図２ａ−５，６，７，８）、ＥＰＣコロニーは、内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）を判定した（図２ａ−３，４）。
図２ａから明らかなように、単一のＣＤ１３３陽性細胞の中には、血液系ＨＳＰＣコロニー及び血管内皮系ＥＰＣコロニーの産生が認められるものが存在し、ＨＢ含有分画であることが確認された。
【００６２】
また、単一細胞から産生されたＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ及びＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣから、ＲＮＡを採取し、血管内皮系の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにて確認したところ、血管内皮細胞増殖因子受容体−２（vascular endothelial groth factor receptor-2；ＶＥＧＦＲ−２）、血管内皮細胞カドヘリン（vascular endothelial cadherin；ＶＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ）、内皮型ＮＯ合成酵素（endothelial nitric oxide syntase；ｅＮＯＳ）の発現がいずれのコロニーにも認められ、これらのコロニーが血管内皮系ＥＰＣコロニーであることが確認された（図２ｂ）。
ＲＴ−ＰＣＴについての手順を以下に示す。
RNeasy micro(Mini)kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAの抽出を行った。逆転写反応をsuper script (invitrogen) を用いて行いcDNAを作成した。PCR反応をEx Taq kit(TaKaRa)を用いて行った。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは以下の通り。
ｅＮＯＳ:
forward: 5’-AACCACATCAAGTATGCCACCAACC-3’（配列番号１）
reverse: 5’-CGTGCCGATCTCAGTGCTCA-3’（配列番号２）
ＶＥＧＦＲ−２:
forward: 5’-TGTGATATGTCTGAGACTGAATGCG-3’（配列番号３）
reverse: 5’-CCCAGCATTTCACACTATGGTACC-3’（配列番号４）
ＶＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ：
forward: 5’-ACACCAAGCTCACCCTTCGTC-3’（配列番号５)
reverse: 5’-CTTGTCATGCACCAGTTTGGC-3’（配列番号６）
【００６３】
さらに、１０００個のＣＤ１３３陽性細胞を滅菌した24mm x 24mmガラスプレート（松浪ガラス工業）を置いた３５ｍｍ Ｐｒｉｍａｒｉａ ｄｉｓｈを用いて血管内皮細胞系列コロニー産生用のメチルセルロース培地にて培養し、出現したＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ及びＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣコロニーをＶＥＧＦＲ−２、ｅＮＯＳ、ＶＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察したところ、いずれのコロニーも染色され血管内皮系ＥＰＣコロニーであることが確認された（図３）。
免疫染色についての手順を以下に示す。
氷冷した１ｍＬのＰＢＳ添加によりメチルセルロース除去後、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドを添加して、３時間４℃でインキュベーションを行った。その後、５分のＰＢＳでのインキュベーションによる洗浄を２回行った。5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100にて３０分ブロッキングを行った。各一次抗体mouse anti-human VEGFR-2 antibody (V9134, Sigma), mouse anti-human eNOS (NOS Type III 610296, BD Pharmingen)を各々、１：５０，１：５００の希釈倍率で5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100を用いて希釈した。mouse anti-human VE cadherin antibody (HM2032, Hycult)を、１：１０の倍率で2mM CaCl2含有5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100を用いて希釈した。希釈一次抗体を添加して4℃にて１２時間インキュベーションを行った。各染色において５分のＰＢＳでのインキュベーションによる洗浄を３回行った。Alexa488-goat anti-mouse IgG (H+L) (Molecular Probe)を１：５００の倍率で5% goat serum-PBS-0.1%Triton-X100で希釈後添加し、室温で１時間インキュベーションを行った。５分のＰＢＳでのインキュベーションによる洗浄を３回行った。VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI (H-1500, Vector Lab)を用いて染色されたコロニーのグラスを蛍光顕微鏡用スライドガラスに包埋した。confocal microscopy (FluoViewTMFV1000, Olympus)にて観察撮影した。
【００６４】
（３）グラフ作成及び解析
上記（２）で産生されたコロニーを解析した。ＨＳＰＣコロニーの単独評価において、単一細胞からの産生コロニーの様式からＶＥＧＦ非存在下（ＶＥＧＦ−）及びＶＥＧＦ存在下（ＶＥＧＦ＋）において合計１０個の細胞運命（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ）が存在していることがわかった（図４ａ，Ｘ軸方向）。Ｘ軸に細胞運命を展開し、Ｙ軸にはそのような細胞運命を有している細胞の数（頻度）をプロットした。いずれかの細胞運命に決定された単一細胞の頻度は、ＶＥＧＦ−及びＶＥＧＦ＋の２グループ（各６０個の単一細胞×４サンプル＝２４０個の単一細胞／グループ）において、有意差は認められなかった（図４ｂ）。
ＥＰＣコロニーの単独評価において、単一細胞からの産生コロニーの様式からＶＥＧＦ−及びＶＥＧＦ＋において合計３個の細胞運命が存在した（図４ｃ，Ｘ軸方向）。即ち、小細胞ＥＰＣコロニーのみを産生する単一細胞、大細胞ＥＰＣコロニーのみを単独で産生する単一細胞、両方のコロニーを産生する単一細胞の決定細胞運命領域３種類に分類された。このことから、ＥＰＣへと運命が決定された単一細胞の分化度は、ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ単独のｅａｒｌｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ＝ＥＶＺ、両方のｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ＝ＩＶＺ、ＣＦＵ−ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ単独のｌａｔｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ＝ＬＶＺに分類が可能であることが判明した。これに基づいてＨＢ単一細胞のＥＰＣへの運命決定頻度を評価したところ、ＶＥＧＦ−グループではＥＶＺからＬＶＺにかけて変化は認められなかったが、ＶＥＧＦ＋グループではＬＶＺにおいてＥＶＺの約２倍、ＶＥＧＦ−ｇｒｏｕｐのＬＶＺの約２倍の頻度が認められ、ＶＥＧＦにより、ＣＤ１３３陽性細胞の内皮系への分化が促進されることが判明した。また、ＨＢ単一細胞のＥＰＣへ決定頻度は、ＶＥＧＦ−グループに比較してＶＥＧＦ＋グループは約１．５倍となり、ＶＥＧＦはＣＤ１３３陽性細胞に対するＥＰＣへの細胞系列決定能を有することが明らかとなった（図４ｃ及びｄ）。
【００６５】
さらに、血液系及び血管内皮系における細胞系列決定法を重ね合わせることにより両細胞系列を同時に解析した。血液系及び血管内皮系の細胞運命を同時に評価することにより、細胞運命はＶＥＧＦ−及びＶＥＧＦ＋グループにおいて合計３４個存在することが判明した。血管内皮系細胞系列についてのみ言えばＥＶＺ、ＩＶＺ、ＬＶＺ及び血液系コロニー産生能のみでＥＰＣコロニーの産生能のないｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｚｏｎｅ＝ＨＺの４種類の決定細胞運命領域に分類された。ＶＥＧＦはＨＺの細胞運命頻度を約４０％程度に有意に減少させることが明らかとなった（図４ｅ及びｆ）。即ち、ＨＢから血液系細胞系列への分化を抑えて血管内皮系細胞系列への分化を促進していると考えられる。
【００６６】
ＨＥＬＩＣアッセイにより、ＶＥＧＦがＣＤ１３３陽性細胞の血管内皮系への細胞系列運命決定及び分化に促進的に作用し、また血液系単独への細胞運命決定を抑制することが示された。このようにＨＥＬＩＣアッセイは、ＨＢを含有する細胞分画の単一細胞の血液系、血管内皮系細胞運命決定の解析により、血液系又は血管内皮系の単独評価では解析が不可能な細胞運命決定を正確かつ定量的、簡便に評価できることが明らかとなった。本アッセイの開発は、血液学及び血管生物学の幹細胞生物学において画期的なものとなると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の解析方法は、血液系及び血管内皮系細胞系列の運命をグラフ化、定量化することが可能となり、特に血液系及び血管内皮系細胞系列の運命を同時にグラフ化、定量化することにより、従来の単独細胞系列解析法では判別不可能であった細胞運命の明確化、その定量化が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１ ｅＮＯＳ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２ ｅＮＯＳ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号３ ＶＥＧＦＲ−２検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号４ ＶＥＧＦＲ−２検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号５ ＶＥ Ｃａｄｈｅｒｉｎ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号６ ＶＥ Ｃａｄｈｅｒｉｎ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（リバース）
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、本発明の解析方法の手順を示す図である。
【図２】図２は、ＣＤ１３３陽性細胞の中に、血液系ＨＳＰＣコロニー及び血管内皮系ＥＰＣコロニーの産生が認められるものが存在し、ＨＢ含有分画であることを示す図である。図２ａは位相差像を示し、図２ｂはＲＴ−ＰＣＲによりＥＰＣコロニーの産生を確認した図である。図２ａ１は、ＣＤ１３３陽性単一細胞を播種した１２時間後の細胞の様子を示し、図２ａ２は、単一細胞を７日間増幅培養した後の細胞の様子を示している。図２ａ３，４はＥＰＣコロニー産生の様子を、図２ａ５，６，７，８はＨＳＰＣコロニーの産生の様子を示している。
【図３】図３は、産生されたコロニーがＥＰＣコロニーであることを示す蛍光染色の結果を示す像である。
【図４】図４は、細胞運命とその頻度との関係を示すグラフである。図４ａは、血液系細胞系列の細胞運命とその運命を有する細胞の頻度との関係をグラフ化したものである。１０種類の細胞運命に分けられる。図４ｂは、血液系細胞系列の運命決定に及ぼすＶＥＧＦの影響を調べた結果を示すグラフである。図４ｃは、血管内皮系細胞系列の細胞運命とその運命を有する細胞の頻度との関係をグラフ化したものである。３種類の細胞運命に分けられる。図４ｄは、血管内皮系細胞系列の運命決定に及ぼすＶＥＧＦの影響を調べた結果を示すグラフである。図４ｅは、血液系細胞系列と血管内皮系細胞系列の細胞運命とその運命を有する細胞の頻度との関係を重ねてグラフ化したものであり、３４種類の細胞運命に分けられる。図４ｆは、血液系細胞系列及び血管内皮系細胞系列の運命決定に及ぼすＶＥＧＦの影響を調べた結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の単一細胞を調製し、得られた単一細胞を増幅する工程（第１工程）、
増幅した細胞を培養し、コロニーを産生させる工程（第２工程）、及び
産生されたコロニーの様式に基づいて単一細胞を群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定する工程（第３工程）
を含む、幹細胞の細胞運命の解析方法。
【請求項２】
幹細胞が血液血管芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
血液血管芽細胞が、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
第１工程が、添加因子の存在下又は非存在下で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
添加因子が成長因子である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法を実施することを含む、幹細胞の細胞運命に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法を実施することを含む、幹細胞から特定の細胞系列へ運命付けられた細胞の濃縮度を確認する方法。
【請求項１２】
幹細胞が血液血管芽細胞であり、特定の細胞系列へ運命付けられた細胞が血管内皮前駆細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定し、各群について、その群に属する単一細胞の数を対応させることによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
【請求項１４】
幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ群に分類される単一細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
【請求項１５】
幹細胞が血液血管芽細胞である、請求項１３又は１４記載のグラフ。
【請求項１６】
産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、請求項１５記載のグラフ。
【請求項１７】
血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１６記載のグラフ。
【請求項１８】
血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１６記載のグラフ。
【請求項１】
幹細胞の単一細胞を調製し、得られた単一細胞を増幅する工程（第１工程）、
増幅した細胞を培養し、コロニーを産生させる工程（第２工程）、及び
産生されたコロニーの様式に基づいて単一細胞を群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定する工程（第３工程）
を含む、幹細胞の細胞運命の解析方法。
【請求項２】
幹細胞が血液血管芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血液血管芽細胞が、骨髄、臍帯血又は末梢血由来である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
血液血管芽細胞が、ＣＤ３４陽性及び／又はＣＤ１３３陽性である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
第１工程が、添加因子の存在下又は非存在下で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
添加因子が成長因子である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法を実施することを含む、幹細胞の細胞運命に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法を実施することを含む、幹細胞から特定の細胞系列へ運命付けられた細胞の濃縮度を確認する方法。
【請求項１２】
幹細胞が血液血管芽細胞であり、特定の細胞系列へ運命付けられた細胞が血管内皮前駆細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、同じ群に分類される単一細胞の数を測定し、各群について、その群に属する単一細胞の数を対応させることによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
【請求項１４】
幹細胞の単一細胞を培養し、該単一細胞から産生されるコロニーの様式に基づいて群分けし、得られた群の種類を細胞運命としてＸ軸方向に展開し、同じ群に分類される単一細胞の数を頻度としてＹ軸方向に展開することによって得られる、幹細胞の細胞運命の解析用グラフ。
【請求項１５】
幹細胞が血液血管芽細胞である、請求項１３又は１４記載のグラフ。
【請求項１６】
産生されるコロニーが、血液系細胞コロニー又は血管内皮系細胞コロニーのいずれかである、請求項１５記載のグラフ。
【請求項１７】
血液系細胞コロニーが、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球・マクロファージ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、マクロファージコロニー（ＣＦＵ−Ｍ）及び混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１６記載のグラフ。
【請求項１８】
血管内皮系細胞コロニーが、内皮細胞様大細胞コロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）及び内皮細胞様小細胞コロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＰＣ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１６記載のグラフ。
【図４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−５５８１７（Ｐ２００９−５５８１７Ａ）
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２４７８２（Ｐ２００７−２２４７８２）
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年３月１日社団法人日本循環器学会発行の「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．７１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ」において「Ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ ｉｎ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ １３３ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ」を発表、平成１９年３月１５日 社団法人日本循環器学会主催の第７１回日本循環器学会総会・学術集会において文書をもって発表
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年３月１日社団法人日本循環器学会発行の「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．７１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ」において「Ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ ｉｎ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ ＣＤ １３３ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ」を発表、平成１９年３月１５日 社団法人日本循環器学会主催の第７１回日本循環器学会総会・学術集会において文書をもって発表
【出願人】（０００１２５３６９）学校法人東海大学 (352)
【Ｆターム（参考）】
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