細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法
【課題】細胞障害抑制活性を有するペプチドのスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、グルタチオンペロキシダーゼ活性を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法。
【解決手段】アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、グルタチオンペロキシダーゼ活性を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、新たな機能を有するペプチドに関する。詳細には、低細胞毒性であって且つ細胞障害抑制活性を示すセレノシステイン含有ペプチドに関し、さらに詳細には、好適な一態様としてのセレノプロテインＰに由来する細胞障害抑制活性を有するペプチドまたはペプチド群並びに当該活性を有する分子種のスクリーニング方法に関する。本願発明は細胞障害に関連した各種疾病に対する病態悪化阻止、予防または治療剤等医薬品並びに当該活性を有する分子種を含有する化粧品の提供を可能ならしめるものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、高等生物の神経系、内分泌系、免疫系における基本的な制御に重要な働きをしているばかりでなく、多くの疾病に深く関わっていることが指摘されている(非特許文献１)。たとえば、全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患、神経細胞障害による神経変性疾患、臓器移植に伴う臓器移植傷害等、これらはアポトーシスが関与する細胞死の影響による疾患として捉えることができる。
【０００３】
ところで、細胞障害を引き起こす要因には外的要因と内的要因がある。外的要因としては、細胞障害を促進するものとして実体的に物質として捉えられているものは、免疫系に関与するＴＮＦ(非特許文献２)、Ｆａｓリガンド(非特許文献３)、グルココルチコイド(非特許文献４)等があり、主としてこれらに起因するもの、他にも細胞増殖に必要なエリスロポエチン、インターロイキン、神経成長因子等の増殖因子や栄養因子の欠乏によるもの等があり、生理的条件の変化によってアポトーシスによる細胞障害が惹起される。さらに、放射線、温度、制癌剤、カルシウムイオノフォア、活性酸素等による非生理的なストレスが情報となってアポトーシスが誘導される場合がある。他にも、火傷、毒物、虚血、補体攻撃、溶解性ウイルス感染、過剰な薬物投与や放射線投与によりネクローシスが生じる。
【０００４】
内的要因としては、細胞内Ｃａ２＋濃度、核酸代謝、アミノ酸代謝、エネルギー代謝等の代謝系の変化などがあり、これら要因により細胞を死に至らしめる。これらのアポトーシスシグナルをコントロールすることができれば各種疾患の病態悪化阻止、予防または治療に利用可能なはずであるが、機序が単純ではないため現在確認されている物質・要因の制御だけでは医療への応用は実現困難な状況にある。
【０００５】
一方、現在までに確認されている細胞障害を抑制する物質としては、ほとんどのアポトーシスシグナルを抑制するとされている細胞内因子であるｂｃｌ−２やｂｃｌｘＬ等が知られているが(非特許文献５)、これらは細胞内に発現される必要があり細胞外に添加してもほとんど意味をなさない。それに対して、細胞外の因子としては、活性酸素によるアポトーシスを抑制するスーパーオキサイドディスムターゼ(以下、「ＳＯＤ」と称することがある)(非特許文献６)、カタラーゼ(非特許文献７)、グルタチオンペロキシダーゼ(非特許文献８)等が報告されているが、これらだけで全ての細胞障害を効果的に抑制することはできない。
【非特許文献１】Thompson C. B., Science, vol. 267, p. 1456-1462 (1995)
【非特許文献２】Zheng L.ら、Nature, vol. 377, p. 348-351 (1995)
【非特許文献３】Suda T.ら、Cell, vol. 75, p. 1169-1178 (1993)
【非特許文献４】Wyllie A. H., Nature, vol. 284, p. 555-556 (1980)
【非特許文献５】Boise L. H.ら、Cell, vol. 74, p. 597-608 (1993)
【非特許文献６】Greenlund L. J.ら、Neuron, vol. 14, p. 303-315 (1995)
【非特許文献７】Sandstrom P. A.およびButtke T. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, p. 4708-4712 (1993)
【非特許文献８】Kayanoki Y.ら、J. Biochem., vol. 119, p. 817-822 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞を培養する際、主として培養細胞自身由来もしくは添加物由来の物質による細胞に対するストレスが原因で細胞障害が誘導されるが、同じ条件で全ての細胞に対する細胞障害が誘導されるわけではない。通常、そのような環境に適応する細胞には、ストレスによる細胞障害誘導シグナルを閾値以下に保つために必要な蛋白質が、細胞内外にすでに発現されているか、新たに誘導されている筈である。それらの蛋白質としては転写因子、合成酵素、代謝酵素、酸化還元酵素、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、転移酵素、アポトーシス抑制蛋白等が考えられる。つまり、個々の細胞でストレスに対する感受性に差が生じるのは、それらの蛋白質の発現量に差があるためであると予想される。そこで、細胞障害の機序がそれぞれ異なるにせよ、あるストレスによる細胞障害に対して抑制する因子を外から添加することにより、その細胞障害誘導のシグナルを閾値以下に保つことが可能であれば、培養細胞の場合だけではなく、生体内でも同様のストレスが生じた場合に起こる細胞障害を抑制することが可能と考えられる。
【０００７】
細胞障害と疾患には密接な関係が存在しているため、生体内の細胞障害抑制効果を示す物質を数多く同定することにより多くの細胞障害をコントロールすることができれば、疾患の治療等、医療への応用が実現できるばかりでなく、同様に、培養細胞の効果的培養系への応用も可能となる。実際、前述のように細胞内の細胞障害抑制因子としてｂｃｌ−２、ｂｃｌ−Ｘ等が、細胞外の細胞障害を抑制する因子としては活性酸素によるアポトーシスを抑制するＳＯＤ、カタラーゼ、グルタチオンペロキシダーゼ等が存在するが、これらの因子を細胞外に添加することにより全ての細胞障害が抑制されることは難しい。それは、その作用機序の差異により、細胞障害の発生過程が異なるためである。そのことを考慮すれば、種々の細胞障害に対して、有意に、そしてより特異的に細胞障害を抑制する活性を同定する必要がある。つまり、既知の物質により抑制を受けない細胞障害に対しては、細胞障害を有意に抑制する物質を探索することが必要とされている。また、生体内の細胞障害抑制物質は生体の恒常性を保つ働きを有する物質として存在している可能性は高く、それらを同定する意味は大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の状況の下、本願発明者らは先に、血液成分由来の蛋白質であるセレノプロテインＰのＣ末端側ペプチド断片に従来報告されていなかった細胞死抑制活性が認められることを見出し、この知見を基に特許出願した(ＰＣＴ/ＪＰ９９/０６３２２)。細胞の無血清培養時もしくは特殊な条件下での培養時には、培養時のストレスにより起こるアポトーシスが度々観察される。前述の特許出願では、このような細胞障害が誘導される条件で細胞培養を実施し、細胞障害を抑制する活性を指標に、細胞障害抑制活性を有する新たな分子種をスクリーニングすることができた。
【０００９】
本願発明者らはさらに鋭意研究を重ね、当該細胞障害抑制活性を評価するいくつかの指標を見出し、これを基に新たなスクリーニング方法を開発した。また、前記スクリーニング方法を駆使して、セレノプロテインＰのＣ末端側ペプチド断片中に存在する細胞障害抑制活性に密接に関係する主要領域を見出し、これら知見を基に、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本願発明の目的は、セレノシスチンより細胞毒性が低く且つ細胞障害抑制活性を示す、１個以上のセレノシステインを含有するペプチドまたは当該ペプチド群を提供することにある。
【００１１】
本願発明によるペプチドまたは当該ペプチド群は、好ましくは、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するものである。
【００１２】
さらに好ましくは、本願発明によるペプチドまたは当該ペプチド群は、次式：Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys(式中、Xaaはセレノシステインを表す)（配列番号１）で表されるアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記いずれかのアミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本願発明はさらに、アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、過酸化脂質の生成を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
本願発明はまた、アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、グルタチオンペロキシダーゼ（ＧＰＸ）活性を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本願発明によって提供される、低細胞毒性であって且つ細胞障害抑制活性を示すセレノシステイン含有ペプチドまたは当該ペプチド群とは、セレンを分子内に少なくとも１個のセレノシステインの形態で含有するペプチドであって、顕著な細胞毒性を示すことなく好ましい細胞障害抑制活性を有するペプチドまたは当該ペプチド群である。一態様として、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有する、細胞障害抑制活性を示すペプチドまたは当該ペプチド群があり、これらには完全分子型のセレノプロテインＰをはじめこれに起因するＣ末端側ペプチド等が含まれる。
【００１６】
本願発明によるペプチドまたは当該ペプチド群を構成するアミノ酸は、通常、天然の蛋白質やペプチドを構成しているＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸が含まれていてもよい。
【００１７】
そもそも、本願発明に関係するセレンは、微量必須元素の一つであり、それが欠乏した場合には心筋症などを伴う重篤な欠乏症が知られている。また、無血清培養の培地に亜セレン酸ナトリウムの添加が必須であることから、セレンが細胞レベルでの生存維持・増殖に必須であることが示されている。しかしながら、セレン化合物が毒物指定されていることから理解されるように、有効量と危険量の幅、つまり安全域の濃度幅が狭く、適量以上のセレン化合物は一般的には細胞にとって毒性を示し、逆に細胞死を誘導する。例えば、セレンの急性中毒症状として、顔面蒼白、神経症状、神経障害、皮膚炎、胃腸障害などが知られている。無機セレン化合物等も本願発明と同様の細胞障害抑制活性が期待できる可能性が報告されている(B. Chem. J. (1998) vol. 232, p. 231-236)。しかしながら、実際上、これら物質は強い毒性を発現するため、毒性を伴わない活性が必要とされている。
【００１８】
また、セレンは生体内において主にセレノシステインの形で蛋白質に取り込まれているが、細胞培養にセレノシステインの２量体であるセレノシスチンを添加すると、単独ではかなり強い毒性を示す。これに対して、セレノプロテインＰや本願発明の好適な態様であるセレノプロテインＰのＣ末端側断片は、その構造中に９〜１０個のセレノシステインを含むにも拘わらず、強い毒性は観察されなかった。このことから、セレノプロテインＰの毒性の低減には当該分子がペプチド中に含有されていることの重要性が示唆され、実際に、４〜１４アミノ酸のセレノシステインを含有した合成ペプチドにおいてもセレノシスチンが毒性を示す濃度において毒性を示すことは無かった。
【００１９】
本願発明のペプチドまたは当該ペプチド群は、毒性の低減というセレン化合物に対する命題を克服するのみならず、予期し得ない細胞障害抑制活性をもたらすことを可能とするものである。
【００２０】
本願の先の出願に係るＰＣＴ/ＪＰ９９/０６３２２においては、以下の活性スクリーニング法が用いられた。
【００２１】
細胞障害抑制活性を有する因子をスクリーニングするためには、先ず細胞障害を誘導する培養系を構築する必要があり、好適な一例としてアルブミン添加無血清培地を用いたヒト巨核芽球系のＤａｍｉ細胞の培養系をスクリーニング方法として用いた。Ｄａｍｉ細胞はＲＰＭＩ １６４０、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２を１：２：２の比率で混合した培地(０.１％ＢＳＡおよび０.０５μＭ２−メルカプトエタノール含)により継代可能であるが、アルブミン不含培地では殆ど増殖しない。この時、培地中に０.０１から０.５％のヒト血清アルブミンが存在する条件下においては細胞は正常に増殖するが、４日目以降に全ての細胞が徐々にではなく突然死する。この培養系に活性画分の希釈試料を添加することにより細胞障害抑制活性の大小を比較することが可能であった。
【００２２】
さらに、細胞障害が誘導される際に少なからぬ役割を演じる物質が脂肪酸であることを見出し、前述のアルブミン添加に代わり細胞培養系に脂肪酸を添加することを試みた。
【００２３】
種々の二重結合を分子内に２個以上有する長鎖の脂肪酸(例えば、Eicosadienoic acid, Dihomo-γ-linolenic acid, Docosadienoic acid, Docosatrienoic acid, Adrenic acid, Eicosapentaenoic acid, Docosahexaenoic acid, Linoleic acid, Linolenic acid, Arachidonic acid)は全て、セレノプロテインＰのペプチド断片のような細胞障害抑制活性を有する分子種非存在下の無血清培養において１０μＭの濃度で細胞障害を誘導した。
【００２４】
本願発明では、先の評価系で使用された培養細胞を用い、新たに、細胞障害に密接に関連する培養細胞系での「過酸化脂質の生成」、細胞障害を抑制する「細胞内ＧＰＸ(グルタチオンペロキシダーゼ)活性」に着眼し、それらを指標とする細胞障害抑制活性を有する分子種のスクリーニング方法を構築するに至った。
【００２５】
先ず第１の指標は、評価系中の過酸化脂質の蓄積であり、長鎖脂肪酸が加えられ細胞障害が誘起される培養細胞系では過酸化脂質量が顕著に増加するが、一方、同じ系に細胞障害抑制活性を有する分子種が加えられた系では細胞障害が抑制され、同時に過酸化脂質量の増加が抑えられた。
【００２６】
第２は、評価系中の細胞内ＧＰＸ活性を指標とするものである。細胞内での抗酸化作用の主体であるＧＰＸ量は細胞障害に密接に関連し、負の相関がある。すなわち、高いＧＰＸ量の状態は細胞障害に抗し、この現象を細胞障害抑制活性の評価系に用いることができる。
【００２７】
本願発明では、上述の指標に着眼した細胞障害抑制活性の評価系を駆使して、セレノプロテインＰに由来するＣ末端側ペプチド断片に存在する細胞障害抑制活性に密接に関係する主要領域を見出すことができた。
【００２８】
本願発明者は、予備実験により、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位のアミノ酸より始まる配列を有するペプチドに細胞障害抑制活性を有することを確認し、これを基にさらなる検討を加えた。その結果、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列に由来するペプチドまたは当該ペプチド群に顕著な細胞障害抑制活性が認められることが判明した。なお、前記ペプチドまたは当該ペプチド群は、天然のセレノプロテインＰが有するアミノ酸配列に加えて、当該アミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたもの、または前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するものを包含する。すなわち、本願発明のペプチドは、セレノプロテインＰのＣ末端側アミノ酸配列に由来し、細胞障害抑制活性を有するものであればその分子形態に特段の制約はない。本願発明のペプチドの好適な例としては、セレノプロテインＰに由来するＣ末端側ペプチドのうち、とりわけ２７９位アミノ酸から２９２位アミノ酸までのアミノ酸配列を有するペプチドにおいてＣｙｓがＳｅｒに置換された態様のものが顕著な細胞障害抑制効果を示すことが判った。上述の知見に基づき得られた本願発明のペプチドは、ペプチド合成機を用いて常法に従って調製することもできるし、また、本願発明のペプチドをリード物質として、化学合成物をデザインすることも可能である。
【００２９】
一般的に、何らかのストレス(例えば、止血状態、炎症の発生、臓器障害、細胞の損傷、血管の損傷、細菌感染、ウイルス感染など)が生じると遊離の脂肪酸量が３倍以上も増加し細胞毒性が出現すると報告されている(「脂質の化学」、ｐ.１７０-１７９、中村治雄編 朝倉書店；「脳卒中実験ハンドブック」、ｐ.４３７-４７１、佐野圭司監修 アイピーシー)。この知見からも、ストレス状態が維持される環境では、種々の細胞の感受性の差があるにせよ、脂肪酸による細胞への悪影響が出現すると予想される。つまり、手術時のストレス(出血、止血、虚血)、疾患や臓器移植などに伴う虚血後の再灌流のストレス、持続的な炎症によるストレスなどに対して、本願発明のセレノプロテインＰに由来する活性ペプチドまたはペプチド群が細胞の抗酸化能を上げることにより細胞への悪影響を低減させ、病態悪化を防ぐことができる。また、同様の機序で細胞内の酸化ストレスを上昇させる現象に対して、当該活性ペプチドまたはペプチド群は細胞内の抗酸化能を上昇させることにより細胞を安定化する働きが期待できる。
【００３０】
本願発明中の活性ペプチドまたはペプチド群は生体内においてプロセスされた活性フォームとして血中で機能しており、ストレス由来により起こる細胞障害を防御し、細胞の安定維持に働いていると予想される。つまり、過剰のストレスを防御しきれない場合などには細胞障害が生じるはずであるから、このような時、本願発明の活性ペプチドまたはペプチド群を外部から補給することが可能であれば、重篤な疾患への移行を未然に防ぐことも可能であるし、治療につなげることができる。具体的には、酸化ストレスに起因して影響を受ける疾患として、ＡＩＤＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病等があり、これらの疾患の軽減に働く可能性がある。その他にも動脈硬化の原因因子として酸化ＬＤＬが関与していることから、動脈硬化の病態悪化の阻止、治療、予防等への使用も考えられる。あるいは心筋梗塞、脳梗塞や臓器移植等再灌流傷害が観察される疾病にも有効である。その他にも、Ｂ細胞およびＴ細胞系の培養においても、この活性ペプチドまたはペプチド群が有効に働いていることは明らかであるから、免疫細胞系の安定化、制御等を行なうことによる、免疫促進、制御薬等への応用も可能である。さらに、医薬品への応用のみならず、細胞の酸化・還元状態のアンバランス、日焼け等に起因するストレスを減少させ得る化粧品の成分として使用することもできる。また、培養細胞においても過剰のストレス由来の細胞障害を防ぐことにより、有用な生体物質を産生させる場合などにおける培養条件の効率化などに利用可能である。
【００３１】
実際、本願発明者らは、脳虚血再潅流障害モデル動物を用いて、本願発明のシステイン含有ペプチドまたは当該ペプチド群が、細胞障害が深く関与する虚血・再灌流障害に対する有望な抑制剤としての用途を明らかにした。
【００３２】
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、これらは本願発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびNew England BioLabs社製の試薬を使用した。
【００３３】
調製例
(ヒト血漿からの細胞死抑制活性成分の精製)
以下の精製工程における活性の追跡は、すべて参考例１に記載のアッセイ法に拠った。血漿中の細胞死抑制活性はヘパリン結合性を示す。そこで、先ず、血漿中のヘパリン結合画分を集めるためにヘパリンカラムを用いた分画を行なった。ヒト血漿を出発原料とし、血漿中のヘパリン結合蛋白をヘパリンカラム(Heparin Sepharose: Pharmacia 社製)に吸着させた後、０.３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウムにより吸着画分を溶出した。目的の細胞死抑制活性の殆どは０.３Ｍ塩化ナトリウム洗浄画分に回収されるが、活性物質の精製には２Ｍ塩化ナトリウム溶出画分を用いた。
【００３４】
ヘパリンに結合した細胞死抑制活性の粗分画を実施するために、硫酸アンモニウム沈殿による分画を行なった。２Ｍ塩化ナトリウムヘパリン溶出画分の総量に対して３１.３％Ｗ/Ｖ(約２Ｍ)の硫酸アンモニウムを添加し、沈澱物を回収した。沈殿物を水に溶解し、分子量３,５００カットの透析膜を用いて水に対して透析した。透析の完了した溶液を回収後、その総量に対して１/５０量の１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を添加し、さらに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用いてＯＤ２８０の値で２０〜３０になるように溶液濃度を調整した。この溶液から不溶物質を除去するため、１.０μｍ及び０.４５μｍの濾過フィルターを用いて濾過した。
【００３５】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)により平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー担体(Macro-prep High Q: BioRad 社製)に、濾過済みの蛋白溶液を通液し、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。この時、非吸着画分及び５０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分に活性が存在していたため、この画分を回収し混合した。陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性画分に対して、１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)と１Ｍクエン酸を６：４の割合で混合した溶液を総量の１/５０量添加し、２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ約４.０)となるように蛋白溶液を調製した。
【００３６】
２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)により平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー担体(Macro-prep High S: BioRad 社製)に、前述の蛋白溶液を通液し、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。２２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)で洗浄後、５５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)により溶出される画分に活性が存在したため、この画分を回収した。
【００３７】
得られた５５０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分の総量に対して１Ｍ Ｔｒｉｓアミノメタン溶液を１/３０量添加し、ｐＨを約７.５に調整した。この溶液に対して３.５Ｍ 硫酸アンモニウム溶液(１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.５)を１/５０量添加しｐＨを約７.５に調整)を２/３量添加後、硫酸アンモニウム濃度が１.４Ｍ、塩化ナトリウム濃度が３３０ｍＭになるように塩濃度を調整した。さらに、不溶物質を除去するために、０.４５μmの濾過フィルターを用いて濾過した。
【００３８】
次に１.４Ｍ硫酸アンモニウム及び３３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)で平衡化した疎水クロマトグラフィー担体(Macro-prep Methyl HIC: BioRad 社製)に前述の濾過済み蛋白溶液を通液し、疎水クロマトグラフィーを実施した。非吸着画分及び平衡化緩衝液(ｐＨ７.５)洗浄画分に活性が存在したため、この画分を回収した。吸着画分には殆ど活性は存在しなかった。活性画分を疎水クロマトグラフィー担体に結合させるために、活性画分に対して硫酸アンモニウム濃度が２.０Ｍになるように上記の約ｐＨ７.５の３.５Ｍ硫酸アンモニウム溶液を添加した。２.０Ｍ硫酸アンモニウム及び２４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)により平衡化した疎水クロマトグラフィー担体(Macro-prep Methyl HIC: BioRad 社製)に試料を通液し、活性成分を吸着させた。平衡化緩衝液により洗浄後、吸着している活性を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)により溶出した。回収した活性画分を水に対して１昼夜透析し、この回収した活性画分をヘパリンカラムに確実に吸着させるために、１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４.５)を１/５０量添加し、ｐＨを約５.０に調整した。
【００３９】
２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.５)(緩衝液Ａ)及び２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.２)(緩衝液Ｂ)を調製し、緩衝液Ａで平衡化したヘパリンカラム(Hi-Trap Heparin: Pharmacia 社製)にｐＨ調整した活性画分を通液した。その後、緩衝液Ｂを緩衝液Ａに対して５％混合した溶液(０.１Ｍ ＮａＣｌ)によりカラムの２倍量洗浄した後、さらに、緩衝液Ｂの緩衝液Ａに対して２０％混合した溶液(０.４Ｍ ＮａＣｌ)により溶出し、活性画分を回収した。ここで得られた活性画分を１５ｍｇ/ｍｌ程度の濃度まで膜濃縮器(Centriprep 3: Amicon 社製)により濃縮した。濃縮した活性画分の総量に対して２％の酢酸を添加後、０.４５μｍの濾過フィルターにより不溶物の除去を行なった。
【００４０】
２％酢酸及び５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶液により平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー担体(Superdex 200pg: Pharmacia 社製)に活性画分を１ｍｌ通液し、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施し、活性を分画後、回収した。
【００４１】
０.１％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロパノールを含む１％アセトニトリルにより平衡化したＣ４逆相ＨＰＬＣ(Wakosil 5C4-200 ６ｍｍ×１５０ｍｍ：和光純薬社製)に前述の画分を通液し、平衡化溶媒で洗浄後、０.１％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロパノールを含む条件下で１％から４０％アセトニトリルのリニアグラジエント溶出により得られた活性画分を回収した。ここまでの各精製工程における活性及び比活性の推移を表１にまとめる。
【００４２】
表１
【００４３】
得られた活性画分をさらに細かく分画するためにイオン交換クロマトグラフィー担体ＭｉｎｉＱ(Pharmacia 社製)による分画を実施した。２０ｍＭエタノールアミン(ｐＨ９.１５)の条件下で塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を行なった。分画された画分には全て活性が存在していた。
【００４４】
参考例１
(アルブミン添加に起因する細胞障害抑制活性の評価系)
０.０５μＭ ２ＭＥおよび０.１％ＢＳＡを含有する無血清培地ＳＦＯ３(三光純薬社製)で継代可能なＤａｍｉ細胞(Greenberg S. M.ら、Blood vol. 72, p. 1968-1977 (1988)に記載：１×１０６細胞/ｄｉｓｈ/３ｍｌ)１ｍｌにＲＰＭＩ １６４０/Ｄ−ＭＥＭ/Ｆ−１２の１：２：２混合培地(ＳＡ培地)を２ｍｌ添加後、３日間培養し、アッセイ時に当該細胞を回収した。細胞を５０％ＰＢＳ/ＳＡ/０.０３％ＨＳＡ(ＳＩＧＭＡ社製)により２回洗浄し、同培地で３×１０４細胞/ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ウエルのみ２００μｌ、段階希釈のためのウエルには１００μｌずつを９６ウエルプレートに分注した。サンプル添加ウエルにアッセイ試料を２μｌ添加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウエルに対して段階希釈した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し判定した。
【００４５】
アッセイの評価法としては培養４日目以降、活性のないウエルの細胞は死滅し、活性のあるウエルの細胞は生存し続けることから、生細胞が被検試料の何倍希釈まで存在するかで評価した。
【００４６】
参考例２
(脂肪酸により誘導される細胞障害とそれに対する抑制活性)
種々の二重結合を分子内に２個以上有する長鎖の脂肪酸(例えば、Eicosadienoic acid, Dihomo-γ-linolenic acid, Docosadienoic acid, Docosatrienoic acid, Adrenic acid, Eicosapentaenoic acid, Docosahexaenoic acid, Linoleic acid, Linolenic acid, Arachidonic acid)は全て、セレノプロテインＰ非存在下の無血清培養において１０μＭの濃度で細胞障害を誘導した。この中で、強く細胞障害を誘導するアラキドン酸(Arachidonic acid)、リノール酸(Linoleic acid)およびリノレン酸(Linolenic acid)についてそれらが細胞障害を誘導する濃度、並びにそれを抑制するセレノプロテインＰの濃度について詳細に検討した。
【００４７】
無血清培地ＳＦＯ３(三光純薬)(０.０５μＭ２ＭＥ加、０.１％ＢＳＡ含)で継代可能なＤａｍｉ細胞(１×１０６細胞／ｄｉｓｈ／３ｍｌ)１ｍｌにＲＰＭＩ １６４０／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１：２：２混合培地(ＳＡ培地)を２ｍｌ添加後、３日間培養し、アッセイ時にその細胞を回収した。その細胞をＳＡ／０.０５％脱脂肪酸ＢＳＡ(ＷＡＫＯ社)により２回洗浄し、２〜１６μＭのアラキドン酸、リノール酸およびリノレン酸を含有する同培地で３×１０４／ｍｌになるように懸濁後、細胞懸濁液をサンプル添加ウエルのみ１９８μｌ、段階希釈のためのウエルには１００μｌずつを９６ウエルプレートに分注した。これに１００μＭのアッセイ試料をそれぞれサンプル添加ウエルに２μｌずつ添加し攪拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウエルに対して段階希釈した。培養は３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間行い、細胞障害誘導とセレノプロテインＰ断片による細胞障害抑制の評価を上記調製例で得た１μＭのセレノプロテインＰ断片およびその希釈倍率による有効濃度を比較した。
【００４８】
アラキドン酸、リノール酸等の多価の不飽和脂肪酸が４μＭ以上存在する条件下で細胞の無血清培養を実施すると細胞障害が誘導され、１μＭのセレノプロテインＰ断片によって完全に細胞障害を抑制し得ることが判明した。４μＭのリノール酸が存在する条件下でビタミンＥが細胞障害を抑制する有効濃度が１００ｎＭ程度であるのに対し、全長セレノプロテインＰが同等の約１００ｎＭ程度、セレノプロテインＰに由来するペプチドが１０ｐＭであり、セレノプロテインＰに由来するペプチドが最も低濃度で有効性を示した。抗酸化剤であるビタミンＥを添加することにより細胞障害を抑制したことから、おそらく細胞内外で過酸化を受けた脂肪酸が細胞に損傷を与えることにより細胞障害が惹起され、セレノプロテインＰに由来するペプチドは効率的にこれを抑制しているものと考えられる。
【００４９】
また、４μＭのリノール酸またはリノレン酸存在下で生じるＤａｍｉ細胞の細胞障害の抑制効果の有無を種々の酸化還元に関する酵素類(グルタチオンペロキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、カタラーゼ)について検討したところ、グルタチオンペロキシダーゼにおいて、リノール酸存在下で生じる細胞障害を２５０ｎＭ以上で抑制し、リノレン酸存在下で生じる細胞障害を５００ｎＭ以上で抑制したが、他の酵素類は１μＭの濃度でも細胞障害抑制効果は観察されなかった。同条件下でセレノプロテインＰ断片が１０ｐＭという低濃度でも細胞障害を抑制することから、セレノプロテインＰ断片の際だった有効性が明らかとなった。また、この細胞障害を誘導する脂肪酸の濃度を変化させることにより、感受性の異なる種々の細胞への脂肪酸の影響およびセレノプロテインＰの影響を観察することができた。通常、２０μＭのリノール酸を添加すると細胞障害が誘導され、この濃度で細胞障害が誘導されない細胞はセレノプロテインＰが発現している可能性が高い。この系を利用することにより、種々の細胞における脂肪酸によって誘導される細胞障害の抑制効果を評価することができる。この系は、ＨＳＡ(ＳＩＧＭＡ社)添加時に誘導される細胞障害と同じ現象を反映していると推察された。
【００５０】
これまでの実験により、巨核球系細胞株（Dami）、Ｔ細胞系細胞株（Molt4、CEM、jurkat）、Ｂ細胞系細胞株（P3X63AG8.653、P3X63AG8.U1）、肝臓系細胞株（HepG2）、神経系細胞株（IMR32）、腎臓系細胞株（CRL1932）等でセレノプロテインＰ断片の効果が確認された。このことから、セレノプロテインＰ断片は、免疫系、神経系、造血系の細胞および臓器由来の細胞に対して細胞障害抑制の有効性を示すことが強く期待される。
【実施例１】
【００５１】
(ペプチド合成)
セレノシステインは、Ｆｍｏｃ(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)、ＭＢｚｌ(p-Methoxybenzyl)で保護したアミノ酸を合成し、ペプチド合成機を用いたＦｍｏｃ法により所望のペプチドを合成した。その後、脱保護を行ない、逆相ＨＰＬＣにより精製した。
【００５２】
本願発明者らは、細胞障害抑制活性を示すセレノプロテインＰ断片のアミノ酸配列：260Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys Thr Gly Ser Ala Ile Thr Xaa Gln Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gln Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn Ile Thr Glu Ser Cys Gln Xaa Arg Leu Pro Pro Ala Ala Xaa Gln Ile Ser Gln Gln Leu Ile Pro Thr Glu Ala Ser Ala Ser Xaa Arg Xaa Lys Asn Gln Ala Lys Lys Xaa Glu Xaa Pro Ser Asn362（式中、Xaaはセレノシステインを表す）（配列番号２）から還元状態で精製されたペプチド Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号３）も細胞障害抑制活性を有することを確認した。そこで、この知見を基に以下の配列を有するペプチド断片を合成した。
【００５３】
表２
ペプチド１：
Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser（配列番号４）
ペプチド２：
Arg Ser Ser Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号５）
ペプチド３：
Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号１）
ペプチド４：
Arg Ser Xaa Ser Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号６）
ペプチド５：
Arg Ser Xaa Ser Ser His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号７）
ペプチド６：
Arg Ser Xaa Ser Ser His Ser Arg His Leu Ile Phe Glu Lys （配列番号８）
ペプチド７：
Arg Ser Xaa Ser（配列番号９）
ペプチド８：
Thr Gly Ser Ala Ile Thr Xaa Gln Ser Lys（配列番号１０）
ペプチド９：
Glu Asn Leu Pro Ser Leu Ser Ser Xaa Gln Gly Leu Arg（配列番号１１）
ペプチド１０：
Ala Glu Glu Asn Ile Thr Glu Ser Ser Gln Xaa Arg（配列番号１２）
ペプチド１１：
Leu Ile Pro Thr Glu Ala Ser Ala Ser Xaa Arg（配列番号１３）
ペプチド１２：
Lys Asn Gln Ala Lys Lys Xaa Glu（配列番号１４）
ペプチド１３：
Xaa Pro Ser Asn（配列番号１５）
ペプチド１４：
Lys Glu Phe Ile Leu His Arg Ser His Ser Ser Xaa Ser Arg（配列番号１６）
ペプチド１５：
Ser Xaa Ser
ペプチド１６：
Leu Pro Pro Ala Ala Xaa Gln Ile Ser Gln Gln（配列番号１７）
（ペプチド１４のアミノ酸配列はペプチド６のＣ末端からＮ末端方向へのアミノ酸配列に対応する）
【実施例２】
【００５４】
(最低細胞毒性濃度)
細胞障害抑制活性のアッセイ系に使用するＤａｍｉ細胞(Greenberg S. M.ら、Blood vol. 72, p. 1968-1977 (1988)に記載)を用いて、アッセイ培地(５０％ＰＢＳ/ＳＡ/０.０３％ＨＳＡ(ＳＩＧＭＡ社製))またはＳＡ／０.０５％脱脂肪酸ＢＳＡ(ＷＡＫＯ社)／４μＭの長鎖多価脂肪酸(アラキドン酸、リノール酸またはリノレン酸等)により２回洗浄して３×１０４細胞/ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ウエルのみ２００μｌ、段階希釈のためのウエルには１００μｌずつを９６ウエルプレートに分注した。サンプル添加ウエルにアッセイ試料として実施例１で合成したペプチド、およびセレノシスチン、セレノメチオニン、エブセレン、亜セレン酸ナトリウムについて同一濃度の溶液を調製し、それらを２μｌ添加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウエルに対して段階希釈した。そして、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し判定した。
【００５５】
毒性の評価法としては、培養開始後、毒性の存在するウエルの細胞は死滅もしくは明らかな細胞数の減少が観察され、その物質の毒性を細胞障害抑制活性が凌ぐウエルの細胞は細胞数も多くそのまま生存し続けることから、これを比較することにより毒性を示す濃度を評価した。セレノシスチン、エブセレンについてはそれぞれ含有セレン濃度で２００ｎＭ程度、亜セレン酸ナトリウムについては５００ｎＭ程度でも毒性を示したのに対し、セレノプロテインＰ断片、セレノメチオニン、セレノシステイン含有ペプチドは１μＭ以上でも毒性を示さなかった。８０％以上の細胞障害を抑制する有効セレン最小濃度は、セレノプロテインＰ断片が２００〜５００ｐＭ、合成ペプチドＮｏ.６が５００ｐＭ〜１ｎＭ程度、セレノメチオニンが１μＭ程度であり、比較的毒性が低いと言われているエブセレンでさえ、培養細胞に添加する際は強い毒性を示し有効ではなかった。その結果、毒性が低く有効であるのは、セレノプロテインＰ断片と合成ペプチドであることが確認された。図１参照。
【実施例３】
【００５６】
（有効ペプチドのスクリーニング）
前記ペプチドについて、参考例１記載および参考例２に準じた方法により細胞障害抑制活性を測定したところ、セレノシステイン含有ペプチド(Ｎｏ.３〜Ｎｏ.１６)は基本的に細胞障害抑制活性を有することが確認できた。この中でもＣｙｓをＳｅｒに全て置換したＮｏ.６のペプチドが最も低濃度で効果的に細胞障害を抑制した。セレン含有物質は全てに細胞障害抑制活性を示すが、ペプチド結合を有するセレノシステインは毒性が明らかに低下した。このことから、細胞毒性を低下させ、効果的な細胞障害抑制活性を示すペプチドをこの方法によりスクリーニング可能であることが判明した。図２および表３参照。
【００５７】
表３
ペプチド名 アミノ酸配列 活性/1mM Sec
ペプチド１：ＫＲＣＩＮＱＬＬＣＫＬＰＴＤＳＥＬＡＰＲＳ 0
（配列番号４）
ペプチド２：ＲＳＳＣＣＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号５） 0
ペプチド３：ＲＳＵＣＣＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号１） 95,000
ペプチド４：ＲＳＵＳＣＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号６） 24,000
ペプチド５：ＲＳＵＳＳＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号７） 16,000
ペプチド６：ＲＳＵＳＳＨＳＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号８） 395,000
ペプチド７：ＲＳＵＳ （配列番号９） 95,000
ペプチド８：ＴＧＳＡＩＴＵＱＳＫ （配列番号１０） 79,000
ペプチド９：ＥＮＬＰＳＬＳＳＵＱＧＬＲ （配列番号１１） 24,000
ペプチド１０：ＡＥＥＮＩＴＥＳＳＱＵＲ （配列番号１２） 6,000
ペプチド１１：ＬＩＰＴＥＡＳＡＳＵＲ （配列番号１３） 28,000
ペプチド１２：ＫＮＱＡＫＫＵＥ （配列番号１４） 24,000
ペプチド１３：ＵＰＳＮ （配列番号１５） 24,000
ペプチド１４：ＫＥＦＩＬＨＲＳＨＳＳＵＳＲ(配列番号１６) 95,000
ペプチド１５：ＳＵＳ 95,000
ペプチド１６：ＬＰＰＡＡＵＱＩＳＱＱ （配列番号１７） 24,000
精製セレノプロテインＰ断片 470,000
（上記アミノ酸配列中、Ｕはセレノシステインを表す）
【実施例４】
【００５８】
(過酸化脂質生成抑制活性)
細胞障害の原因因子として過酸化脂肪酸の蓄積の可能性を想定し、リノール酸存在下で培養した細胞内の過酸化脂質の量がセレノプロテインＰ断片の有無によって変化するか否かを検討するため、細胞内の過酸化脂質をアッセイキットを用いて測定した。また、細胞障害が生じた細胞は自然酸化により過酸化脂質が上昇する可能性も否定できないため、ＵＶ照射、室温放置により細胞障害を誘導させ、リノール酸により誘導される細胞障害との過酸化脂質の生成割合の比較検討を行なった。
【００５９】
まず、ＳＡ(−)で培養したＤａｍｉ細胞を遠心回収洗浄後、ＳＡ(−)で２.５×１０５／ｍｌで再懸濁し、１５ｃｍディッシュ６枚に２０ｍｌずつ分注し、１ｍｇ／ｍｌの濃度でリノール酸を混合した１０％ＢＳＡを０.０５％ＢＳＡ(−)になるように４枚のディッシュに添加した。続いて、リノール酸を添加した４枚のディッシュのうち２枚にのみ５０μｌのセレノプロテインＰ断片２.５ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃、１６時間培養した。６枚のディッシュを回収し、Lipid hydroxide assay kit(Cyman)により過酸化脂質の定量を行なった。
【００６０】
別途、ＵＶ照射による細胞障害を検討するために、ＳＡ(−)で培養したＤａｍｉ細胞を遠心回収洗浄後、ＳＡ(−)で２.５×１０５／ｍｌで再懸濁し、１５ｃｍディッシュ２枚に２０ｍｌずつ分注し、１５分間ＵＶ照射を実施し、３７℃で１６時間培養した。２枚のディッシュを回収し、Lipid hydroxide assay kit(Cyman)により過酸化脂質の定量を行なった。
【００６１】
また、室温放置による細胞障害を検討するために、ＳＡ(−)で培養したＤａｍｉ細胞を遠心回収洗浄後、ＳＡ(−)で５×１０５／ｍｌで再懸濁し、１５ｃｍディッシュ１枚に２０ｍｌずつ分注し、室温で２４時間放置した。１枚のディッシュを回収し、Lipid hydroperoxide assay kit(Cyman)により過酸化脂質の定量を行なった。
【００６２】
その結果、リノール酸存在条件下でセレノプロテインＰ断片を添加していない系では過酸化脂質量が増加していたが、セレノプロテインＰ断片が添加された系では過酸化脂質量の増加が抑えられていた。また、室温放置、ＵＶ照射により生じた細胞障害の場合には過酸化脂質の上昇は認められなかった。このことから、セレノプロテインＰ断片はリノール酸添加により生じる過酸化脂質の生成を抑制することが確認され、また、過酸化脂質量が細胞障害の指標の一つになり得ることが明らかになった。図３参照。
【実施例５】
【００６３】
(細胞内ＧＰＸ(グルタチオンペロキシダーゼ)活性の上昇)
０.０５μＭ ２ＭＥおよび０.１％ＢＳＡを含有する無血清培地ＳＦＯ３(三光純薬社製)で継代可能なＤａｍｉ細胞をＳＡ/０.０１％ＢＳＡで９６時間以上培養し、細胞内のＧＰＸ活性を低下させ、この細胞をＳＡ/０.０１％ＢＳＡで５×１０５細胞/ｍｌになるように懸濁した。この細胞懸濁液１ｍｌに対し試料を所定の濃度になるように添加して、試料のＧＰＸ活性上昇に有効である濃度を比較した。
【００６４】
試料はセレノプロテインＰ断片、合成ペプチド、セレノシスチン、セレノメチオニン、エブセレンおよび亜セレン酸ナトリウムであり、それぞれの効果を比較した。その結果、セレノプロテインＰ断片および合成ペプチドが１ｎＭでも有意に細胞内ＧＰＸ活性を上昇させるのに対し、セレノシスチンおよび亜セレン酸ナトリウムで５０％程度の活性上昇しか認められず、エブセレンおよびセレノメチオニンは１０ｎＭでも活性の上昇は殆ど観察されなかった。図４参照。ここで、横軸は、Ｄａｍｉ細胞培養時、１０ｎＭのセレノプロテインＰ断片添加時に誘導されるＧＰＸ活性を１００％とした時の各種試料の活性で誘起されるＧＰＸ活性を％で示したものである。
【００６５】
上記記載で明らかなように、細胞に対し有効に機能するセレン化合物をスクリーニングすることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は本願発明のペプチドおよびその他の各種試料に対する細胞障害抑制活性と最低細胞毒性濃度の検討結果を示す図である。
【００６７】
【図２】図２は本願発明のペプチドの細胞障害抑制活性の検討結果を示す図である。
【００６８】
【図３】図３は細胞障害抑制活性の評価に際して過酸化脂質の生成抑制が細胞障害の指標となり得ることを示す図である。
【００６９】
【図４】図４は本願発明の細胞障害抑制活性の評価に際してＧＰＸ(グルタチオンペロキシダーゼ)活性の上昇が細胞障害の指標となり得ることを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、新たな機能を有するペプチドに関する。詳細には、低細胞毒性であって且つ細胞障害抑制活性を示すセレノシステイン含有ペプチドに関し、さらに詳細には、好適な一態様としてのセレノプロテインＰに由来する細胞障害抑制活性を有するペプチドまたはペプチド群並びに当該活性を有する分子種のスクリーニング方法に関する。本願発明は細胞障害に関連した各種疾病に対する病態悪化阻止、予防または治療剤等医薬品並びに当該活性を有する分子種を含有する化粧品の提供を可能ならしめるものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞死は、高等生物の神経系、内分泌系、免疫系における基本的な制御に重要な働きをしているばかりでなく、多くの疾病に深く関わっていることが指摘されている(非特許文献１)。たとえば、全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患、神経細胞障害による神経変性疾患、臓器移植に伴う臓器移植傷害等、これらはアポトーシスが関与する細胞死の影響による疾患として捉えることができる。
【０００３】
ところで、細胞障害を引き起こす要因には外的要因と内的要因がある。外的要因としては、細胞障害を促進するものとして実体的に物質として捉えられているものは、免疫系に関与するＴＮＦ(非特許文献２)、Ｆａｓリガンド(非特許文献３)、グルココルチコイド(非特許文献４)等があり、主としてこれらに起因するもの、他にも細胞増殖に必要なエリスロポエチン、インターロイキン、神経成長因子等の増殖因子や栄養因子の欠乏によるもの等があり、生理的条件の変化によってアポトーシスによる細胞障害が惹起される。さらに、放射線、温度、制癌剤、カルシウムイオノフォア、活性酸素等による非生理的なストレスが情報となってアポトーシスが誘導される場合がある。他にも、火傷、毒物、虚血、補体攻撃、溶解性ウイルス感染、過剰な薬物投与や放射線投与によりネクローシスが生じる。
【０００４】
内的要因としては、細胞内Ｃａ２＋濃度、核酸代謝、アミノ酸代謝、エネルギー代謝等の代謝系の変化などがあり、これら要因により細胞を死に至らしめる。これらのアポトーシスシグナルをコントロールすることができれば各種疾患の病態悪化阻止、予防または治療に利用可能なはずであるが、機序が単純ではないため現在確認されている物質・要因の制御だけでは医療への応用は実現困難な状況にある。
【０００５】
一方、現在までに確認されている細胞障害を抑制する物質としては、ほとんどのアポトーシスシグナルを抑制するとされている細胞内因子であるｂｃｌ−２やｂｃｌｘＬ等が知られているが(非特許文献５)、これらは細胞内に発現される必要があり細胞外に添加してもほとんど意味をなさない。それに対して、細胞外の因子としては、活性酸素によるアポトーシスを抑制するスーパーオキサイドディスムターゼ(以下、「ＳＯＤ」と称することがある)(非特許文献６)、カタラーゼ(非特許文献７)、グルタチオンペロキシダーゼ(非特許文献８)等が報告されているが、これらだけで全ての細胞障害を効果的に抑制することはできない。
【非特許文献１】Thompson C. B., Science, vol. 267, p. 1456-1462 (1995)
【非特許文献２】Zheng L.ら、Nature, vol. 377, p. 348-351 (1995)
【非特許文献３】Suda T.ら、Cell, vol. 75, p. 1169-1178 (1993)
【非特許文献４】Wyllie A. H., Nature, vol. 284, p. 555-556 (1980)
【非特許文献５】Boise L. H.ら、Cell, vol. 74, p. 597-608 (1993)
【非特許文献６】Greenlund L. J.ら、Neuron, vol. 14, p. 303-315 (1995)
【非特許文献７】Sandstrom P. A.およびButtke T. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, p. 4708-4712 (1993)
【非特許文献８】Kayanoki Y.ら、J. Biochem., vol. 119, p. 817-822 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞を培養する際、主として培養細胞自身由来もしくは添加物由来の物質による細胞に対するストレスが原因で細胞障害が誘導されるが、同じ条件で全ての細胞に対する細胞障害が誘導されるわけではない。通常、そのような環境に適応する細胞には、ストレスによる細胞障害誘導シグナルを閾値以下に保つために必要な蛋白質が、細胞内外にすでに発現されているか、新たに誘導されている筈である。それらの蛋白質としては転写因子、合成酵素、代謝酵素、酸化還元酵素、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、転移酵素、アポトーシス抑制蛋白等が考えられる。つまり、個々の細胞でストレスに対する感受性に差が生じるのは、それらの蛋白質の発現量に差があるためであると予想される。そこで、細胞障害の機序がそれぞれ異なるにせよ、あるストレスによる細胞障害に対して抑制する因子を外から添加することにより、その細胞障害誘導のシグナルを閾値以下に保つことが可能であれば、培養細胞の場合だけではなく、生体内でも同様のストレスが生じた場合に起こる細胞障害を抑制することが可能と考えられる。
【０００７】
細胞障害と疾患には密接な関係が存在しているため、生体内の細胞障害抑制効果を示す物質を数多く同定することにより多くの細胞障害をコントロールすることができれば、疾患の治療等、医療への応用が実現できるばかりでなく、同様に、培養細胞の効果的培養系への応用も可能となる。実際、前述のように細胞内の細胞障害抑制因子としてｂｃｌ−２、ｂｃｌ−Ｘ等が、細胞外の細胞障害を抑制する因子としては活性酸素によるアポトーシスを抑制するＳＯＤ、カタラーゼ、グルタチオンペロキシダーゼ等が存在するが、これらの因子を細胞外に添加することにより全ての細胞障害が抑制されることは難しい。それは、その作用機序の差異により、細胞障害の発生過程が異なるためである。そのことを考慮すれば、種々の細胞障害に対して、有意に、そしてより特異的に細胞障害を抑制する活性を同定する必要がある。つまり、既知の物質により抑制を受けない細胞障害に対しては、細胞障害を有意に抑制する物質を探索することが必要とされている。また、生体内の細胞障害抑制物質は生体の恒常性を保つ働きを有する物質として存在している可能性は高く、それらを同定する意味は大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の状況の下、本願発明者らは先に、血液成分由来の蛋白質であるセレノプロテインＰのＣ末端側ペプチド断片に従来報告されていなかった細胞死抑制活性が認められることを見出し、この知見を基に特許出願した(ＰＣＴ/ＪＰ９９/０６３２２)。細胞の無血清培養時もしくは特殊な条件下での培養時には、培養時のストレスにより起こるアポトーシスが度々観察される。前述の特許出願では、このような細胞障害が誘導される条件で細胞培養を実施し、細胞障害を抑制する活性を指標に、細胞障害抑制活性を有する新たな分子種をスクリーニングすることができた。
【０００９】
本願発明者らはさらに鋭意研究を重ね、当該細胞障害抑制活性を評価するいくつかの指標を見出し、これを基に新たなスクリーニング方法を開発した。また、前記スクリーニング方法を駆使して、セレノプロテインＰのＣ末端側ペプチド断片中に存在する細胞障害抑制活性に密接に関係する主要領域を見出し、これら知見を基に、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本願発明の目的は、セレノシスチンより細胞毒性が低く且つ細胞障害抑制活性を示す、１個以上のセレノシステインを含有するペプチドまたは当該ペプチド群を提供することにある。
【００１１】
本願発明によるペプチドまたは当該ペプチド群は、好ましくは、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するものである。
【００１２】
さらに好ましくは、本願発明によるペプチドまたは当該ペプチド群は、次式：Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys(式中、Xaaはセレノシステインを表す)（配列番号１）で表されるアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記いずれかのアミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本願発明はさらに、アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、過酸化脂質の生成を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
本願発明はまた、アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、グルタチオンペロキシダーゼ（ＧＰＸ）活性を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本願発明によって提供される、低細胞毒性であって且つ細胞障害抑制活性を示すセレノシステイン含有ペプチドまたは当該ペプチド群とは、セレンを分子内に少なくとも１個のセレノシステインの形態で含有するペプチドであって、顕著な細胞毒性を示すことなく好ましい細胞障害抑制活性を有するペプチドまたは当該ペプチド群である。一態様として、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有する、細胞障害抑制活性を示すペプチドまたは当該ペプチド群があり、これらには完全分子型のセレノプロテインＰをはじめこれに起因するＣ末端側ペプチド等が含まれる。
【００１６】
本願発明によるペプチドまたは当該ペプチド群を構成するアミノ酸は、通常、天然の蛋白質やペプチドを構成しているＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸が含まれていてもよい。
【００１７】
そもそも、本願発明に関係するセレンは、微量必須元素の一つであり、それが欠乏した場合には心筋症などを伴う重篤な欠乏症が知られている。また、無血清培養の培地に亜セレン酸ナトリウムの添加が必須であることから、セレンが細胞レベルでの生存維持・増殖に必須であることが示されている。しかしながら、セレン化合物が毒物指定されていることから理解されるように、有効量と危険量の幅、つまり安全域の濃度幅が狭く、適量以上のセレン化合物は一般的には細胞にとって毒性を示し、逆に細胞死を誘導する。例えば、セレンの急性中毒症状として、顔面蒼白、神経症状、神経障害、皮膚炎、胃腸障害などが知られている。無機セレン化合物等も本願発明と同様の細胞障害抑制活性が期待できる可能性が報告されている(B. Chem. J. (1998) vol. 232, p. 231-236)。しかしながら、実際上、これら物質は強い毒性を発現するため、毒性を伴わない活性が必要とされている。
【００１８】
また、セレンは生体内において主にセレノシステインの形で蛋白質に取り込まれているが、細胞培養にセレノシステインの２量体であるセレノシスチンを添加すると、単独ではかなり強い毒性を示す。これに対して、セレノプロテインＰや本願発明の好適な態様であるセレノプロテインＰのＣ末端側断片は、その構造中に９〜１０個のセレノシステインを含むにも拘わらず、強い毒性は観察されなかった。このことから、セレノプロテインＰの毒性の低減には当該分子がペプチド中に含有されていることの重要性が示唆され、実際に、４〜１４アミノ酸のセレノシステインを含有した合成ペプチドにおいてもセレノシスチンが毒性を示す濃度において毒性を示すことは無かった。
【００１９】
本願発明のペプチドまたは当該ペプチド群は、毒性の低減というセレン化合物に対する命題を克服するのみならず、予期し得ない細胞障害抑制活性をもたらすことを可能とするものである。
【００２０】
本願の先の出願に係るＰＣＴ/ＪＰ９９/０６３２２においては、以下の活性スクリーニング法が用いられた。
【００２１】
細胞障害抑制活性を有する因子をスクリーニングするためには、先ず細胞障害を誘導する培養系を構築する必要があり、好適な一例としてアルブミン添加無血清培地を用いたヒト巨核芽球系のＤａｍｉ細胞の培養系をスクリーニング方法として用いた。Ｄａｍｉ細胞はＲＰＭＩ １６４０、Ｄ−ＭＥＭ、Ｆ−１２を１：２：２の比率で混合した培地(０.１％ＢＳＡおよび０.０５μＭ２−メルカプトエタノール含)により継代可能であるが、アルブミン不含培地では殆ど増殖しない。この時、培地中に０.０１から０.５％のヒト血清アルブミンが存在する条件下においては細胞は正常に増殖するが、４日目以降に全ての細胞が徐々にではなく突然死する。この培養系に活性画分の希釈試料を添加することにより細胞障害抑制活性の大小を比較することが可能であった。
【００２２】
さらに、細胞障害が誘導される際に少なからぬ役割を演じる物質が脂肪酸であることを見出し、前述のアルブミン添加に代わり細胞培養系に脂肪酸を添加することを試みた。
【００２３】
種々の二重結合を分子内に２個以上有する長鎖の脂肪酸(例えば、Eicosadienoic acid, Dihomo-γ-linolenic acid, Docosadienoic acid, Docosatrienoic acid, Adrenic acid, Eicosapentaenoic acid, Docosahexaenoic acid, Linoleic acid, Linolenic acid, Arachidonic acid)は全て、セレノプロテインＰのペプチド断片のような細胞障害抑制活性を有する分子種非存在下の無血清培養において１０μＭの濃度で細胞障害を誘導した。
【００２４】
本願発明では、先の評価系で使用された培養細胞を用い、新たに、細胞障害に密接に関連する培養細胞系での「過酸化脂質の生成」、細胞障害を抑制する「細胞内ＧＰＸ(グルタチオンペロキシダーゼ)活性」に着眼し、それらを指標とする細胞障害抑制活性を有する分子種のスクリーニング方法を構築するに至った。
【００２５】
先ず第１の指標は、評価系中の過酸化脂質の蓄積であり、長鎖脂肪酸が加えられ細胞障害が誘起される培養細胞系では過酸化脂質量が顕著に増加するが、一方、同じ系に細胞障害抑制活性を有する分子種が加えられた系では細胞障害が抑制され、同時に過酸化脂質量の増加が抑えられた。
【００２６】
第２は、評価系中の細胞内ＧＰＸ活性を指標とするものである。細胞内での抗酸化作用の主体であるＧＰＸ量は細胞障害に密接に関連し、負の相関がある。すなわち、高いＧＰＸ量の状態は細胞障害に抗し、この現象を細胞障害抑制活性の評価系に用いることができる。
【００２７】
本願発明では、上述の指標に着眼した細胞障害抑制活性の評価系を駆使して、セレノプロテインＰに由来するＣ末端側ペプチド断片に存在する細胞障害抑制活性に密接に関係する主要領域を見出すことができた。
【００２８】
本願発明者は、予備実験により、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位のアミノ酸より始まる配列を有するペプチドに細胞障害抑制活性を有することを確認し、これを基にさらなる検討を加えた。その結果、セレノプロテインＰのＣ末端側２６０位アミノ酸から３６２位アミノ酸までのアミノ酸配列に由来するペプチドまたは当該ペプチド群に顕著な細胞障害抑制活性が認められることが判明した。なお、前記ペプチドまたは当該ペプチド群は、天然のセレノプロテインＰが有するアミノ酸配列に加えて、当該アミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたもの、または前記いずれかのアミノ酸配列の部分配列または前記アミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するものを包含する。すなわち、本願発明のペプチドは、セレノプロテインＰのＣ末端側アミノ酸配列に由来し、細胞障害抑制活性を有するものであればその分子形態に特段の制約はない。本願発明のペプチドの好適な例としては、セレノプロテインＰに由来するＣ末端側ペプチドのうち、とりわけ２７９位アミノ酸から２９２位アミノ酸までのアミノ酸配列を有するペプチドにおいてＣｙｓがＳｅｒに置換された態様のものが顕著な細胞障害抑制効果を示すことが判った。上述の知見に基づき得られた本願発明のペプチドは、ペプチド合成機を用いて常法に従って調製することもできるし、また、本願発明のペプチドをリード物質として、化学合成物をデザインすることも可能である。
【００２９】
一般的に、何らかのストレス(例えば、止血状態、炎症の発生、臓器障害、細胞の損傷、血管の損傷、細菌感染、ウイルス感染など)が生じると遊離の脂肪酸量が３倍以上も増加し細胞毒性が出現すると報告されている(「脂質の化学」、ｐ.１７０-１７９、中村治雄編 朝倉書店；「脳卒中実験ハンドブック」、ｐ.４３７-４７１、佐野圭司監修 アイピーシー)。この知見からも、ストレス状態が維持される環境では、種々の細胞の感受性の差があるにせよ、脂肪酸による細胞への悪影響が出現すると予想される。つまり、手術時のストレス(出血、止血、虚血)、疾患や臓器移植などに伴う虚血後の再灌流のストレス、持続的な炎症によるストレスなどに対して、本願発明のセレノプロテインＰに由来する活性ペプチドまたはペプチド群が細胞の抗酸化能を上げることにより細胞への悪影響を低減させ、病態悪化を防ぐことができる。また、同様の機序で細胞内の酸化ストレスを上昇させる現象に対して、当該活性ペプチドまたはペプチド群は細胞内の抗酸化能を上昇させることにより細胞を安定化する働きが期待できる。
【００３０】
本願発明中の活性ペプチドまたはペプチド群は生体内においてプロセスされた活性フォームとして血中で機能しており、ストレス由来により起こる細胞障害を防御し、細胞の安定維持に働いていると予想される。つまり、過剰のストレスを防御しきれない場合などには細胞障害が生じるはずであるから、このような時、本願発明の活性ペプチドまたはペプチド群を外部から補給することが可能であれば、重篤な疾患への移行を未然に防ぐことも可能であるし、治療につなげることができる。具体的には、酸化ストレスに起因して影響を受ける疾患として、ＡＩＤＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病等があり、これらの疾患の軽減に働く可能性がある。その他にも動脈硬化の原因因子として酸化ＬＤＬが関与していることから、動脈硬化の病態悪化の阻止、治療、予防等への使用も考えられる。あるいは心筋梗塞、脳梗塞や臓器移植等再灌流傷害が観察される疾病にも有効である。その他にも、Ｂ細胞およびＴ細胞系の培養においても、この活性ペプチドまたはペプチド群が有効に働いていることは明らかであるから、免疫細胞系の安定化、制御等を行なうことによる、免疫促進、制御薬等への応用も可能である。さらに、医薬品への応用のみならず、細胞の酸化・還元状態のアンバランス、日焼け等に起因するストレスを減少させ得る化粧品の成分として使用することもできる。また、培養細胞においても過剰のストレス由来の細胞障害を防ぐことにより、有用な生体物質を産生させる場合などにおける培養条件の効率化などに利用可能である。
【００３１】
実際、本願発明者らは、脳虚血再潅流障害モデル動物を用いて、本願発明のシステイン含有ペプチドまたは当該ペプチド群が、細胞障害が深く関与する虚血・再灌流障害に対する有望な抑制剤としての用途を明らかにした。
【００３２】
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、これらは本願発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびNew England BioLabs社製の試薬を使用した。
【００３３】
調製例
(ヒト血漿からの細胞死抑制活性成分の精製)
以下の精製工程における活性の追跡は、すべて参考例１に記載のアッセイ法に拠った。血漿中の細胞死抑制活性はヘパリン結合性を示す。そこで、先ず、血漿中のヘパリン結合画分を集めるためにヘパリンカラムを用いた分画を行なった。ヒト血漿を出発原料とし、血漿中のヘパリン結合蛋白をヘパリンカラム(Heparin Sepharose: Pharmacia 社製)に吸着させた後、０.３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウムにより吸着画分を溶出した。目的の細胞死抑制活性の殆どは０.３Ｍ塩化ナトリウム洗浄画分に回収されるが、活性物質の精製には２Ｍ塩化ナトリウム溶出画分を用いた。
【００３４】
ヘパリンに結合した細胞死抑制活性の粗分画を実施するために、硫酸アンモニウム沈殿による分画を行なった。２Ｍ塩化ナトリウムヘパリン溶出画分の総量に対して３１.３％Ｗ/Ｖ(約２Ｍ)の硫酸アンモニウムを添加し、沈澱物を回収した。沈殿物を水に溶解し、分子量３,５００カットの透析膜を用いて水に対して透析した。透析の完了した溶液を回収後、その総量に対して１/５０量の１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を添加し、さらに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)を用いてＯＤ２８０の値で２０〜３０になるように溶液濃度を調整した。この溶液から不溶物質を除去するため、１.０μｍ及び０.４５μｍの濾過フィルターを用いて濾過した。
【００３５】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)により平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィー担体(Macro-prep High Q: BioRad 社製)に、濾過済みの蛋白溶液を通液し、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。この時、非吸着画分及び５０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分に活性が存在していたため、この画分を回収し混合した。陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性画分に対して、１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)と１Ｍクエン酸を６：４の割合で混合した溶液を総量の１/５０量添加し、２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ約４.０)となるように蛋白溶液を調製した。
【００３６】
２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)により平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー担体(Macro-prep High S: BioRad 社製)に、前述の蛋白溶液を通液し、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。２２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)で洗浄後、５５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)により溶出される画分に活性が存在したため、この画分を回収した。
【００３７】
得られた５５０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分の総量に対して１Ｍ Ｔｒｉｓアミノメタン溶液を１/３０量添加し、ｐＨを約７.５に調整した。この溶液に対して３.５Ｍ 硫酸アンモニウム溶液(１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.５)を１/５０量添加しｐＨを約７.５に調整)を２/３量添加後、硫酸アンモニウム濃度が１.４Ｍ、塩化ナトリウム濃度が３３０ｍＭになるように塩濃度を調整した。さらに、不溶物質を除去するために、０.４５μmの濾過フィルターを用いて濾過した。
【００３８】
次に１.４Ｍ硫酸アンモニウム及び３３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)で平衡化した疎水クロマトグラフィー担体(Macro-prep Methyl HIC: BioRad 社製)に前述の濾過済み蛋白溶液を通液し、疎水クロマトグラフィーを実施した。非吸着画分及び平衡化緩衝液(ｐＨ７.５)洗浄画分に活性が存在したため、この画分を回収した。吸着画分には殆ど活性は存在しなかった。活性画分を疎水クロマトグラフィー担体に結合させるために、活性画分に対して硫酸アンモニウム濃度が２.０Ｍになるように上記の約ｐＨ７.５の３.５Ｍ硫酸アンモニウム溶液を添加した。２.０Ｍ硫酸アンモニウム及び２４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ７.５)により平衡化した疎水クロマトグラフィー担体(Macro-prep Methyl HIC: BioRad 社製)に試料を通液し、活性成分を吸着させた。平衡化緩衝液により洗浄後、吸着している活性を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液(ｐＨ８.０)により溶出した。回収した活性画分を水に対して１昼夜透析し、この回収した活性画分をヘパリンカラムに確実に吸着させるために、１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４.５)を１/５０量添加し、ｐＨを約５.０に調整した。
【００３９】
２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.５)(緩衝液Ａ)及び２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.２)(緩衝液Ｂ)を調製し、緩衝液Ａで平衡化したヘパリンカラム(Hi-Trap Heparin: Pharmacia 社製)にｐＨ調整した活性画分を通液した。その後、緩衝液Ｂを緩衝液Ａに対して５％混合した溶液(０.１Ｍ ＮａＣｌ)によりカラムの２倍量洗浄した後、さらに、緩衝液Ｂの緩衝液Ａに対して２０％混合した溶液(０.４Ｍ ＮａＣｌ)により溶出し、活性画分を回収した。ここで得られた活性画分を１５ｍｇ/ｍｌ程度の濃度まで膜濃縮器(Centriprep 3: Amicon 社製)により濃縮した。濃縮した活性画分の総量に対して２％の酢酸を添加後、０.４５μｍの濾過フィルターにより不溶物の除去を行なった。
【００４０】
２％酢酸及び５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む溶液により平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー担体(Superdex 200pg: Pharmacia 社製)に活性画分を１ｍｌ通液し、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施し、活性を分画後、回収した。
【００４１】
０.１％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロパノールを含む１％アセトニトリルにより平衡化したＣ４逆相ＨＰＬＣ(Wakosil 5C4-200 ６ｍｍ×１５０ｍｍ：和光純薬社製)に前述の画分を通液し、平衡化溶媒で洗浄後、０.１％トリフルオロ酢酸及び１％イソプロパノールを含む条件下で１％から４０％アセトニトリルのリニアグラジエント溶出により得られた活性画分を回収した。ここまでの各精製工程における活性及び比活性の推移を表１にまとめる。
【００４２】
表１
【００４３】
得られた活性画分をさらに細かく分画するためにイオン交換クロマトグラフィー担体ＭｉｎｉＱ(Pharmacia 社製)による分画を実施した。２０ｍＭエタノールアミン(ｐＨ９.１５)の条件下で塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を行なった。分画された画分には全て活性が存在していた。
【００４４】
参考例１
(アルブミン添加に起因する細胞障害抑制活性の評価系)
０.０５μＭ ２ＭＥおよび０.１％ＢＳＡを含有する無血清培地ＳＦＯ３(三光純薬社製)で継代可能なＤａｍｉ細胞(Greenberg S. M.ら、Blood vol. 72, p. 1968-1977 (1988)に記載：１×１０６細胞/ｄｉｓｈ/３ｍｌ)１ｍｌにＲＰＭＩ １６４０/Ｄ−ＭＥＭ/Ｆ−１２の１：２：２混合培地(ＳＡ培地)を２ｍｌ添加後、３日間培養し、アッセイ時に当該細胞を回収した。細胞を５０％ＰＢＳ/ＳＡ/０.０３％ＨＳＡ(ＳＩＧＭＡ社製)により２回洗浄し、同培地で３×１０４細胞/ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ウエルのみ２００μｌ、段階希釈のためのウエルには１００μｌずつを９６ウエルプレートに分注した。サンプル添加ウエルにアッセイ試料を２μｌ添加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウエルに対して段階希釈した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し判定した。
【００４５】
アッセイの評価法としては培養４日目以降、活性のないウエルの細胞は死滅し、活性のあるウエルの細胞は生存し続けることから、生細胞が被検試料の何倍希釈まで存在するかで評価した。
【００４６】
参考例２
(脂肪酸により誘導される細胞障害とそれに対する抑制活性)
種々の二重結合を分子内に２個以上有する長鎖の脂肪酸(例えば、Eicosadienoic acid, Dihomo-γ-linolenic acid, Docosadienoic acid, Docosatrienoic acid, Adrenic acid, Eicosapentaenoic acid, Docosahexaenoic acid, Linoleic acid, Linolenic acid, Arachidonic acid)は全て、セレノプロテインＰ非存在下の無血清培養において１０μＭの濃度で細胞障害を誘導した。この中で、強く細胞障害を誘導するアラキドン酸(Arachidonic acid)、リノール酸(Linoleic acid)およびリノレン酸(Linolenic acid)についてそれらが細胞障害を誘導する濃度、並びにそれを抑制するセレノプロテインＰの濃度について詳細に検討した。
【００４７】
無血清培地ＳＦＯ３(三光純薬)(０.０５μＭ２ＭＥ加、０.１％ＢＳＡ含)で継代可能なＤａｍｉ細胞(１×１０６細胞／ｄｉｓｈ／３ｍｌ)１ｍｌにＲＰＭＩ １６４０／Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１：２：２混合培地(ＳＡ培地)を２ｍｌ添加後、３日間培養し、アッセイ時にその細胞を回収した。その細胞をＳＡ／０.０５％脱脂肪酸ＢＳＡ(ＷＡＫＯ社)により２回洗浄し、２〜１６μＭのアラキドン酸、リノール酸およびリノレン酸を含有する同培地で３×１０４／ｍｌになるように懸濁後、細胞懸濁液をサンプル添加ウエルのみ１９８μｌ、段階希釈のためのウエルには１００μｌずつを９６ウエルプレートに分注した。これに１００μＭのアッセイ試料をそれぞれサンプル添加ウエルに２μｌずつ添加し攪拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウエルに対して段階希釈した。培養は３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間行い、細胞障害誘導とセレノプロテインＰ断片による細胞障害抑制の評価を上記調製例で得た１μＭのセレノプロテインＰ断片およびその希釈倍率による有効濃度を比較した。
【００４８】
アラキドン酸、リノール酸等の多価の不飽和脂肪酸が４μＭ以上存在する条件下で細胞の無血清培養を実施すると細胞障害が誘導され、１μＭのセレノプロテインＰ断片によって完全に細胞障害を抑制し得ることが判明した。４μＭのリノール酸が存在する条件下でビタミンＥが細胞障害を抑制する有効濃度が１００ｎＭ程度であるのに対し、全長セレノプロテインＰが同等の約１００ｎＭ程度、セレノプロテインＰに由来するペプチドが１０ｐＭであり、セレノプロテインＰに由来するペプチドが最も低濃度で有効性を示した。抗酸化剤であるビタミンＥを添加することにより細胞障害を抑制したことから、おそらく細胞内外で過酸化を受けた脂肪酸が細胞に損傷を与えることにより細胞障害が惹起され、セレノプロテインＰに由来するペプチドは効率的にこれを抑制しているものと考えられる。
【００４９】
また、４μＭのリノール酸またはリノレン酸存在下で生じるＤａｍｉ細胞の細胞障害の抑制効果の有無を種々の酸化還元に関する酵素類(グルタチオンペロキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、カタラーゼ)について検討したところ、グルタチオンペロキシダーゼにおいて、リノール酸存在下で生じる細胞障害を２５０ｎＭ以上で抑制し、リノレン酸存在下で生じる細胞障害を５００ｎＭ以上で抑制したが、他の酵素類は１μＭの濃度でも細胞障害抑制効果は観察されなかった。同条件下でセレノプロテインＰ断片が１０ｐＭという低濃度でも細胞障害を抑制することから、セレノプロテインＰ断片の際だった有効性が明らかとなった。また、この細胞障害を誘導する脂肪酸の濃度を変化させることにより、感受性の異なる種々の細胞への脂肪酸の影響およびセレノプロテインＰの影響を観察することができた。通常、２０μＭのリノール酸を添加すると細胞障害が誘導され、この濃度で細胞障害が誘導されない細胞はセレノプロテインＰが発現している可能性が高い。この系を利用することにより、種々の細胞における脂肪酸によって誘導される細胞障害の抑制効果を評価することができる。この系は、ＨＳＡ(ＳＩＧＭＡ社)添加時に誘導される細胞障害と同じ現象を反映していると推察された。
【００５０】
これまでの実験により、巨核球系細胞株（Dami）、Ｔ細胞系細胞株（Molt4、CEM、jurkat）、Ｂ細胞系細胞株（P3X63AG8.653、P3X63AG8.U1）、肝臓系細胞株（HepG2）、神経系細胞株（IMR32）、腎臓系細胞株（CRL1932）等でセレノプロテインＰ断片の効果が確認された。このことから、セレノプロテインＰ断片は、免疫系、神経系、造血系の細胞および臓器由来の細胞に対して細胞障害抑制の有効性を示すことが強く期待される。
【実施例１】
【００５１】
(ペプチド合成)
セレノシステインは、Ｆｍｏｃ(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)、ＭＢｚｌ(p-Methoxybenzyl)で保護したアミノ酸を合成し、ペプチド合成機を用いたＦｍｏｃ法により所望のペプチドを合成した。その後、脱保護を行ない、逆相ＨＰＬＣにより精製した。
【００５２】
本願発明者らは、細胞障害抑制活性を示すセレノプロテインＰ断片のアミノ酸配列：260Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys Thr Gly Ser Ala Ile Thr Xaa Gln Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gln Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn Ile Thr Glu Ser Cys Gln Xaa Arg Leu Pro Pro Ala Ala Xaa Gln Ile Ser Gln Gln Leu Ile Pro Thr Glu Ala Ser Ala Ser Xaa Arg Xaa Lys Asn Gln Ala Lys Lys Xaa Glu Xaa Pro Ser Asn362（式中、Xaaはセレノシステインを表す）（配列番号２）から還元状態で精製されたペプチド Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号３）も細胞障害抑制活性を有することを確認した。そこで、この知見を基に以下の配列を有するペプチド断片を合成した。
【００５３】
表２
ペプチド１：
Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser（配列番号４）
ペプチド２：
Arg Ser Ser Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号５）
ペプチド３：
Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号１）
ペプチド４：
Arg Ser Xaa Ser Cys His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号６）
ペプチド５：
Arg Ser Xaa Ser Ser His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys（配列番号７）
ペプチド６：
Arg Ser Xaa Ser Ser His Ser Arg His Leu Ile Phe Glu Lys （配列番号８）
ペプチド７：
Arg Ser Xaa Ser（配列番号９）
ペプチド８：
Thr Gly Ser Ala Ile Thr Xaa Gln Ser Lys（配列番号１０）
ペプチド９：
Glu Asn Leu Pro Ser Leu Ser Ser Xaa Gln Gly Leu Arg（配列番号１１）
ペプチド１０：
Ala Glu Glu Asn Ile Thr Glu Ser Ser Gln Xaa Arg（配列番号１２）
ペプチド１１：
Leu Ile Pro Thr Glu Ala Ser Ala Ser Xaa Arg（配列番号１３）
ペプチド１２：
Lys Asn Gln Ala Lys Lys Xaa Glu（配列番号１４）
ペプチド１３：
Xaa Pro Ser Asn（配列番号１５）
ペプチド１４：
Lys Glu Phe Ile Leu His Arg Ser His Ser Ser Xaa Ser Arg（配列番号１６）
ペプチド１５：
Ser Xaa Ser
ペプチド１６：
Leu Pro Pro Ala Ala Xaa Gln Ile Ser Gln Gln（配列番号１７）
（ペプチド１４のアミノ酸配列はペプチド６のＣ末端からＮ末端方向へのアミノ酸配列に対応する）
【実施例２】
【００５４】
(最低細胞毒性濃度)
細胞障害抑制活性のアッセイ系に使用するＤａｍｉ細胞(Greenberg S. M.ら、Blood vol. 72, p. 1968-1977 (1988)に記載)を用いて、アッセイ培地(５０％ＰＢＳ/ＳＡ/０.０３％ＨＳＡ(ＳＩＧＭＡ社製))またはＳＡ／０.０５％脱脂肪酸ＢＳＡ(ＷＡＫＯ社)／４μＭの長鎖多価脂肪酸(アラキドン酸、リノール酸またはリノレン酸等)により２回洗浄して３×１０４細胞/ｍｌになるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ウエルのみ２００μｌ、段階希釈のためのウエルには１００μｌずつを９６ウエルプレートに分注した。サンプル添加ウエルにアッセイ試料として実施例１で合成したペプチド、およびセレノシスチン、セレノメチオニン、エブセレン、亜セレン酸ナトリウムについて同一濃度の溶液を調製し、それらを２μｌ添加し撹拌後、１００μｌ細胞懸濁液が入ったウエルに対して段階希釈した。そして、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４〜５日間培養し判定した。
【００５５】
毒性の評価法としては、培養開始後、毒性の存在するウエルの細胞は死滅もしくは明らかな細胞数の減少が観察され、その物質の毒性を細胞障害抑制活性が凌ぐウエルの細胞は細胞数も多くそのまま生存し続けることから、これを比較することにより毒性を示す濃度を評価した。セレノシスチン、エブセレンについてはそれぞれ含有セレン濃度で２００ｎＭ程度、亜セレン酸ナトリウムについては５００ｎＭ程度でも毒性を示したのに対し、セレノプロテインＰ断片、セレノメチオニン、セレノシステイン含有ペプチドは１μＭ以上でも毒性を示さなかった。８０％以上の細胞障害を抑制する有効セレン最小濃度は、セレノプロテインＰ断片が２００〜５００ｐＭ、合成ペプチドＮｏ.６が５００ｐＭ〜１ｎＭ程度、セレノメチオニンが１μＭ程度であり、比較的毒性が低いと言われているエブセレンでさえ、培養細胞に添加する際は強い毒性を示し有効ではなかった。その結果、毒性が低く有効であるのは、セレノプロテインＰ断片と合成ペプチドであることが確認された。図１参照。
【実施例３】
【００５６】
（有効ペプチドのスクリーニング）
前記ペプチドについて、参考例１記載および参考例２に準じた方法により細胞障害抑制活性を測定したところ、セレノシステイン含有ペプチド(Ｎｏ.３〜Ｎｏ.１６)は基本的に細胞障害抑制活性を有することが確認できた。この中でもＣｙｓをＳｅｒに全て置換したＮｏ.６のペプチドが最も低濃度で効果的に細胞障害を抑制した。セレン含有物質は全てに細胞障害抑制活性を示すが、ペプチド結合を有するセレノシステインは毒性が明らかに低下した。このことから、細胞毒性を低下させ、効果的な細胞障害抑制活性を示すペプチドをこの方法によりスクリーニング可能であることが判明した。図２および表３参照。
【００５７】
表３
ペプチド名 アミノ酸配列 活性/1mM Sec
ペプチド１：ＫＲＣＩＮＱＬＬＣＫＬＰＴＤＳＥＬＡＰＲＳ 0
（配列番号４）
ペプチド２：ＲＳＳＣＣＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号５） 0
ペプチド３：ＲＳＵＣＣＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号１） 95,000
ペプチド４：ＲＳＵＳＣＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号６） 24,000
ペプチド５：ＲＳＵＳＳＨＣＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号７） 16,000
ペプチド６：ＲＳＵＳＳＨＳＲＨＬＩＦＥＫ（配列番号８） 395,000
ペプチド７：ＲＳＵＳ （配列番号９） 95,000
ペプチド８：ＴＧＳＡＩＴＵＱＳＫ （配列番号１０） 79,000
ペプチド９：ＥＮＬＰＳＬＳＳＵＱＧＬＲ （配列番号１１） 24,000
ペプチド１０：ＡＥＥＮＩＴＥＳＳＱＵＲ （配列番号１２） 6,000
ペプチド１１：ＬＩＰＴＥＡＳＡＳＵＲ （配列番号１３） 28,000
ペプチド１２：ＫＮＱＡＫＫＵＥ （配列番号１４） 24,000
ペプチド１３：ＵＰＳＮ （配列番号１５） 24,000
ペプチド１４：ＫＥＦＩＬＨＲＳＨＳＳＵＳＲ(配列番号１６) 95,000
ペプチド１５：ＳＵＳ 95,000
ペプチド１６：ＬＰＰＡＡＵＱＩＳＱＱ （配列番号１７） 24,000
精製セレノプロテインＰ断片 470,000
（上記アミノ酸配列中、Ｕはセレノシステインを表す）
【実施例４】
【００５８】
(過酸化脂質生成抑制活性)
細胞障害の原因因子として過酸化脂肪酸の蓄積の可能性を想定し、リノール酸存在下で培養した細胞内の過酸化脂質の量がセレノプロテインＰ断片の有無によって変化するか否かを検討するため、細胞内の過酸化脂質をアッセイキットを用いて測定した。また、細胞障害が生じた細胞は自然酸化により過酸化脂質が上昇する可能性も否定できないため、ＵＶ照射、室温放置により細胞障害を誘導させ、リノール酸により誘導される細胞障害との過酸化脂質の生成割合の比較検討を行なった。
【００５９】
まず、ＳＡ(−)で培養したＤａｍｉ細胞を遠心回収洗浄後、ＳＡ(−)で２.５×１０５／ｍｌで再懸濁し、１５ｃｍディッシュ６枚に２０ｍｌずつ分注し、１ｍｇ／ｍｌの濃度でリノール酸を混合した１０％ＢＳＡを０.０５％ＢＳＡ(−)になるように４枚のディッシュに添加した。続いて、リノール酸を添加した４枚のディッシュのうち２枚にのみ５０μｌのセレノプロテインＰ断片２.５ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃、１６時間培養した。６枚のディッシュを回収し、Lipid hydroxide assay kit(Cyman)により過酸化脂質の定量を行なった。
【００６０】
別途、ＵＶ照射による細胞障害を検討するために、ＳＡ(−)で培養したＤａｍｉ細胞を遠心回収洗浄後、ＳＡ(−)で２.５×１０５／ｍｌで再懸濁し、１５ｃｍディッシュ２枚に２０ｍｌずつ分注し、１５分間ＵＶ照射を実施し、３７℃で１６時間培養した。２枚のディッシュを回収し、Lipid hydroxide assay kit(Cyman)により過酸化脂質の定量を行なった。
【００６１】
また、室温放置による細胞障害を検討するために、ＳＡ(−)で培養したＤａｍｉ細胞を遠心回収洗浄後、ＳＡ(−)で５×１０５／ｍｌで再懸濁し、１５ｃｍディッシュ１枚に２０ｍｌずつ分注し、室温で２４時間放置した。１枚のディッシュを回収し、Lipid hydroperoxide assay kit(Cyman)により過酸化脂質の定量を行なった。
【００６２】
その結果、リノール酸存在条件下でセレノプロテインＰ断片を添加していない系では過酸化脂質量が増加していたが、セレノプロテインＰ断片が添加された系では過酸化脂質量の増加が抑えられていた。また、室温放置、ＵＶ照射により生じた細胞障害の場合には過酸化脂質の上昇は認められなかった。このことから、セレノプロテインＰ断片はリノール酸添加により生じる過酸化脂質の生成を抑制することが確認され、また、過酸化脂質量が細胞障害の指標の一つになり得ることが明らかになった。図３参照。
【実施例５】
【００６３】
(細胞内ＧＰＸ(グルタチオンペロキシダーゼ)活性の上昇)
０.０５μＭ ２ＭＥおよび０.１％ＢＳＡを含有する無血清培地ＳＦＯ３(三光純薬社製)で継代可能なＤａｍｉ細胞をＳＡ/０.０１％ＢＳＡで９６時間以上培養し、細胞内のＧＰＸ活性を低下させ、この細胞をＳＡ/０.０１％ＢＳＡで５×１０５細胞/ｍｌになるように懸濁した。この細胞懸濁液１ｍｌに対し試料を所定の濃度になるように添加して、試料のＧＰＸ活性上昇に有効である濃度を比較した。
【００６４】
試料はセレノプロテインＰ断片、合成ペプチド、セレノシスチン、セレノメチオニン、エブセレンおよび亜セレン酸ナトリウムであり、それぞれの効果を比較した。その結果、セレノプロテインＰ断片および合成ペプチドが１ｎＭでも有意に細胞内ＧＰＸ活性を上昇させるのに対し、セレノシスチンおよび亜セレン酸ナトリウムで５０％程度の活性上昇しか認められず、エブセレンおよびセレノメチオニンは１０ｎＭでも活性の上昇は殆ど観察されなかった。図４参照。ここで、横軸は、Ｄａｍｉ細胞培養時、１０ｎＭのセレノプロテインＰ断片添加時に誘導されるＧＰＸ活性を１００％とした時の各種試料の活性で誘起されるＧＰＸ活性を％で示したものである。
【００６５】
上記記載で明らかなように、細胞に対し有効に機能するセレン化合物をスクリーニングすることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は本願発明のペプチドおよびその他の各種試料に対する細胞障害抑制活性と最低細胞毒性濃度の検討結果を示す図である。
【００６７】
【図２】図２は本願発明のペプチドの細胞障害抑制活性の検討結果を示す図である。
【００６８】
【図３】図３は細胞障害抑制活性の評価に際して過酸化脂質の生成抑制が細胞障害の指標となり得ることを示す図である。
【００６９】
【図４】図４は本願発明の細胞障害抑制活性の評価に際してＧＰＸ(グルタチオンペロキシダーゼ)活性の上昇が細胞障害の指標となり得ることを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、グルタチオンペロキシダーゼ活性を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１】
アルブミンまたは脂肪酸添加無血清培地を用いた細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、該細胞培養系に細胞障害抑制活性を有すると思われる物質を添加したときの細胞障害抑制の程度を評価することを含み、その際、グルタチオンペロキシダーゼ活性を指標として細胞障害抑制の程度を評価することを特徴とする細胞障害抑制活性を有する物質のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−５０２６６（Ｐ２００９−５０２６６Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４２７７９（Ｐ２００８−２４２７７９）
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【分割の表示】特願２００２−５８９６７７（Ｐ２００２−５８９６７７）の分割
【原出願日】平成１４年５月１０日（２００２．５．１０）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２２日（２００８．９．２２）
【分割の表示】特願２００２−５８９６７７（Ｐ２００２−５８９６７７）の分割
【原出願日】平成１４年５月１０日（２００２．５．１０）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【Ｆターム（参考）】
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