細菌を単離するための方法
本発明は、新規細菌及びそれに由来する代謝物を同定するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、目的の代謝物を産生する細菌を環境サンプルから単離するための新規方法を記載する。特に、本発明は、稀な抗生物質産生細菌を選択するための方法を開示する。本発明は、任意のサンプルから使用することができ、例えば、医薬的又は農薬的な利益を有する細菌の単離を可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規細菌及びそれに由来する代謝物を同定するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、目的の代謝物を産生する細菌を環境サンプルから単離するための新規方法を記載する。特に、本発明は、新規の抗生物質産生細菌を選択するための方法を開示する。本発明は、任意のサンプルから使用することができ、例えば、医薬的又は農薬的な利益を有する細菌の単離を可能にする。
【０００２】
背景
太古の時代から、人類は、治療目的のために周囲の生物を供給源にしてきた。市販の抗生物質の大半は依然として天然起原を有する。過去１０年間に、抗菌薬発見プロセスを合理化し、加速するための努力において、産業界は、天然産物及び分子指向の発見戦略から合成分子及び標的指向の戦略に移っている。
【０００３】
何年もの抗生物質Ｒ＆Ｄプロセスの一意化（前例がない高い摩擦率を伴う）後、天然資源に戻ることが必要である。実際に、天然産物ライブラリーのスクリーニングは、通常、化学的ライブラリーのそれより高い抗生物質ヒットのパーセンテージをもたらし、結果的に、治療法を得るより高い確率を提供する。第１の理由は、恐らくは、抗生物質の生態学的な役割にあり、それは他の生きている生物から植物、動物、及び微生物を防御するように進化の過程を通じて最適化されてきた。さらに、天然産物は、一般的に、組み合わせ化合物と同程度に親油性であるが、しかし、それらは比類ない構造的な多様性及び化学空間における分散を有する。これは、インビボでの適用のために最適化することができる稀な親水性ヒットを見いだすのに役立つ。
【０００４】
一般的に、環境供給源（例えば土壌又は水など）から単離される細菌の２０〜３０パーセントが抗生物質産生株であると想定される（Berdy, 2005）。明白な理由のため、より適当なもの及び最も代表される細菌が、最も頻繁に単離される。これによって、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）により産生される多くの抗生物質がなぜ既に記録されているのか、及び、これらの属により産生される新たな分子実体を見出すことがなぜますます困難であるのかが説明される。低く表される細菌の他の科は、抗生物質産生により適応され、より大きなゲノムのために、適応された技術を用いて簡単に単離することができる。これはアクチノミセターレスの場合であり、はるかに最善の抗生物質産生株である（Berdy, 2005）。それらは、医薬産業により１９５０〜１９８０年の間に広範囲に試験され、現在、非冗長分子を産生する株を同定することは困難である。
【０００５】
過去１０年、努力は、医薬目的の新たな化学実体を見出すために、稀な細菌を単離することに捧げられてきた。粘液細菌は、例えば、１９４０年代から公知であるが、しかし、それらを単離する際に遭遇する困難のために、それらはコレクションにおいて低く表された。Reichenbach H及び共同研究者により行われた広範囲のコレクションキャンペーンのおかげで、現在までに、粘液細菌により産生される約８０の異なる化合物及び４５０の構造バリアントが特徴付けられている（Reichenbach, 2001）。それらの化合物の多くが新しかった。それらの中には抗新生物薬エポチロンがあり、現在、臨床試験において評価されている。
【０００６】
しかし、細菌学者が大半の土壌微生物を培養できないことが一般的に認識されている（Schoenborn et al, 2005）。土壌中の培養可能な細胞の数は、しばしば、存在する細胞の総数のわずか約１%である。これらの細菌の大半は、標準的な単離技術を使用して検出及び単離することが困難である。なぜなら、それらは環境中でまれであるからである。又は、それらは、他の細菌（シュードモナス属又はバチルス属など）ほどには環境に適応せず、迅速に過成長するからである。単離株の多様性を増加させることを目的とするいくつかの単離技術が発表されている。例えば、連続液体希釈培養が成功裏に使用されており、培養可能性が改善され（Schoenborn et al, 2005）、多様な環境からの細菌の単離が促進されてきた。Yang et al., 2008には、稀な放線菌を単離するためのマイクロ波処理の使用も記載された。ＷＯ０２／０５９３５１は、例えば温泉水を使用して自然環境から微生物集団を濃縮するための方法に関する。
【０００７】
しかし、環境微生物は、依然として、新規化合物及び活性の豊富な未開発の資源を表し、当技術分野において、目的の細菌を同定するための改善された又は代わりの方法についての必要性がある。
【０００８】
発明の要約
本願は、環境サンプルから細菌を同定又は単離するための新規アプローチを提供する。特に、本発明は、ＤＮＡ損傷処理を使用して環境サンプルから稀な（rare）細菌を同定又は単離する効率的で迅速な方法を開示する。
【０００９】
本発明の目的は、従って、（二次）代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法にあり、方法は、特徴付けされていない細菌を含むサンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供すること、及び、前記の処理サンプルから、（二次）代謝物を産生する細菌を同定又は単離することを含む。好ましい実施態様において、処理は繰り返し照射処理である。
【００１０】
この点に関して、本発明の特定の目的は、代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む。
【００１１】
特定の実施態様において、処理は、連続ＵＶ処理、例えば、本質的に一定間隔での少なくとも２、好ましくは３又はそれ以上の照射の繰り返しを含む。
【００１２】
特定の実施態様において、処理は繰り返しＵＶ照射を含む。
【００１３】
別の特定の実施態様に従い、本発明は、代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法に関し、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルにブレオマイシンファミリーの抗生物質を加えること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む。
【００１４】
ブレオマイシンファミリーの好ましい抗生物質は、ブレオシンである。
【００１５】
代謝物は、任意の医薬的産物、例えば抗生物質、静菌性化合物、抗代謝薬剤、化学療法化合物、抗真菌薬剤、抗ウイルス化合物、サイトカイン活性化合物、又は細胞増殖因子などでありうる。
【００１６】
本発明の別の目的は、抗生物質又は静菌性化合物を産生する細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理、好ましくは繰り返しＵＶ処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、参照細菌株に暴露すること、及び、抗生物質活性又は静菌活性を示す細菌を同定又は単離すること
を含む。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、前記の細菌により産生された代謝物を単離又は精製するさらなる工程を含む。
【００１８】
さらに、本発明の方法は、場合により、遺伝的、生物学的、又は化学的のいずれかで、同定又は単離された細菌又はそのＤＮＡを、それ自体が当業者に公知である任意の技術プロセスにより改変するさらなる工程を含み、前記の改変は、例えば、抗生物質活性又は産生を改善するために、例えば、前記細菌の生存、増殖、又は機能を改善することを目的とする。これは、限定なしに、細胞融合、加速進化、ＤＮＡシャッフリング技術、別の系統からの真核、原核、又は合成核酸（例、ＤＮＡ）の挿入、あるいは任意の遺伝子操作技術を含む。前記の改変工程は、単離された細菌で、又はプロセスの任意のより初期の段階で、例えば、工程ａ）のサンプルで行うことができる。
【００１９】
本発明の別の目的は、上で開示する方法により得られる野生型又は改変細菌、あるいはその抽出物にある。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、代謝物、特に医薬的化合物を産生する方法であって、方法は、（ｉ）前記の代謝物を産生する細菌を、上で定義する方法を使用して同定又は単離すること、及び（ｉｉ）前記の抗生物質を産生することを含む。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、医薬的化合物（例えば抗生物質など）を、野生型又は改変ディノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）細菌株を使用して単離又は産生する方法である。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、医薬的化合物（例えば抗生物質など）を産生するための野生型又は改変ディノコッカス細菌の使用にある。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、野生型又は改変ディノコッカス細菌に由来する抗生物質である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、組換え宿主細胞を産生する方法であって、方法は、上で定義する方法に従って細菌を同定又は単離すること、及び、１つ又はいくつかの遺伝子（又は対応する合成もしくは組換え核酸）を、別の宿主細胞において前記細菌からクローニングすることを含み、それにより組換え宿主細胞を産生する。
【００２５】
本発明の方法を、種々のサンプル（例えば環境サンプルなど）と使用することができ、有利な医薬的及び／又は農薬的特性を有する新規細菌を単離するために成功裏に使用されてきた。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ａ）１回のＵＶ暴露（０、４、及び１７mJ/cm2）及びｂ）ＵＶ処理（４mJ/cm2）への繰り返し暴露後に得られた細菌マット暗色コロニーはＤラジオパグナンス（ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）である。他の細菌は土壌群集に属する。
【００２７】
発明の詳細な説明
本願は、サンプルから細菌を同定又は単離するための新規方法を記載する。特に、本発明は、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理を使用して環境サンプルから稀な細菌を同定又は単離する効率的で迅速な方法を開示する。
【００２８】
ＵＶ又は照射に対する細菌の耐性が広範囲に試験され、細菌がそのような侵食環境においてどのようにして生存することができるのかが理解されてきた（Makarova et al, 2001）。Rainey et al, 2005は、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｌｕｓ属及びディノコッカス属が、ソノラ砂漠土壌から回収された最も放射線耐性な細菌であることを示した。他の細菌も単離された（即ち、ディノコッカス、ヒメノバクター（Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、キネオコッカス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、及びメチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））。
【００２９】
本発明は、今回、代謝物を産生する新規の（低く表される（under-represented））細菌を単離するための細胞破壊ＤＮＡ損傷処理の使用を提案する。本発明は、実際に、そのような処理（通常は実質的な細胞死を起こしうる）によって、予想外に、貴重な代謝物を産生する顕著な特性を有する低く表される細菌の選択が可能になることを示す。
【００３０】
本発明は、今回、初めて、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理後、貴重な二次代謝物を産生することができる多くの細菌を単離することが可能であることを示す。
【００３１】
本発明の目的は、従って、代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法にあり、方法は、特徴付けされていない細菌を含むサンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供すること、及び、前記の処理サンプルから、代謝物を産生する細菌を同定又は単離することを含む。
【００３２】
特定の実施態様において、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む。
【００３３】
方法は、特徴付けられていない細菌を含む種々のサンプルを用いて、特に環境サンプルからである又はそれに由来するサンプルを用いて実行することができる。本発明の関連内で、環境サンプルは、（複数の）特徴付けられていない（微）生物、特に未培養の微生物（例、意図的に培養され、単離形態で増殖されていない微生物）を含む任意のサンプルを含む。サンプルは、天然環境から又は人工のもしくは特別に作製された環境から得られうる又はそれに由来しうる。
【００３４】
示す通り、サンプルは、任意の環境サンプル、例えば、土壌、水、植物抽出物、生物学的材料、沈殿物、泥炭地、工場廃水又は用地、無機抽出物、砂などから得られる又はそれに由来するものなどでありうる。サンプルは、種々の地域又は状況、例えば、限定はされないが、熱帯地域、火山地域、森林、農場、工業地域などから回収されうる。サンプルは、通常、（特徴付けられていない未培養の）微生物の種々の種、例えば陸生微生物、海洋微生物、淡水微生物、共生微生物などを含む。そのような環境微生物の種は、細菌、藻類、菌類、酵母、カビ、ウイルスなどを含む。微生物は、好極限性生物（例えば、好熱菌など）を含みうる。サンプルは、典型的には、そのような（未培養の）微生物の種々の種、ならびにその種々の量を含む。さらに、サンプルは、加えて、公知の及び／又は培養可能な微生物（例、原核又は真核）を含みうる。
【００３５】
本発明が、サンプルの任意の特定の型又は環境微生物に限定されず、未培養の微生物を含む任意のサンプルを使用して実施することができることを理解すべきである。
【００３６】
好ましい実施態様において、サンプルは、土壌、水、温泉、海洋環境、泥、木、石、コケ、植物抽出物、地衣、生物学的物質、沈殿物、バイオフィルム、工場排液、ガス、砂、油、汚水、又は動物もしくはヒト排泄物である又はそれに由来する。
【００３７】
本発明における使用のために、サンプルは、湿潤、可溶性、乾燥、懸濁液の形態、ペーストなどでありうる。さらに、方法の工程ｂ）の前に、サンプルを処理し、例えば微生物を濃縮するためのプロセスを改善してもよい（例、ろ過、洗浄、濃縮、希釈、撹拌、乾燥などを通じて）。
【００３８】
特定の実施態様において、サンプルはろ過された懸濁液の形態である。特に、サンプルを、処理工程ｂ）の前に、滅菌濾過してもよい及び／又は滅菌水中に置いてもよい。
【００３９】
プロセスの工程ｂ）は、サンプル（即ち、サンプル中に含まれる微生物）を、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供することを含む。
【００４０】
細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、ＤＮＡ改変を導入する単なる突然変異処理とは対照的に、サンプルにおいて実質的な細胞死を起こす処理を指す。特に、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、Ｅ． ｃｏｌｉ細菌の培養において９０%細胞死又はそれ以上を起こすために十分である処理である。さらにより好ましくは、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、Ｅ． ｃｏｌｉの培養において細菌力価を少なくとも２対数だけ低下させるために十分である処理である。驚くべきことに、本発明は、そのような処理（通常、大半の細胞集団に対して致死的であり得る）は、種々の型のサンプルからの新規微生物の効率的で迅速な単離を可能にし、その微生物は貴重な（二次）代謝物を産生する。この結果は特に驚くべきことである。なぜなら、微生物をそのような細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供することによって、生きた微生物の単離を予防することが期待されてきたであろうからである。驚くべきことに、本発明は、サンプルからの稀な微生物、特に、そのゲノムを再構成する又はＤＮＡ損傷に耐性にする能力を有する微生物の選択を可能にする。
【００４１】
本発明は、このように、初めて、高効率で、貴重な（二次）代謝物を産生する低く表される細菌を選択するための細胞破壊ＤＮＡ損傷処理の使用を開示する。実施例において例示される通り、本発明は、ディノコッカス属、バチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、テピヂモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）属、トルーペラ（Ｔｒｕｅｐｅｒａ）属、ポルフィロバクター（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属、エキシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キネオコッカス属、及びウィリアムシア（Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ）属の新規細菌株の単離を可能にした。
【００４２】
ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを照射及び／又は１つもしくはいくつかの遺伝毒性薬剤に供することを含みうる。処理は、サンプル中に存在する微生物において実質的な細胞死を誘導するために十分な条件下で及び／又は時間にわたり行う。
【００４３】
好ましい実施態様において、ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを１つ又はいくつかの照射に供することを含む。好ましい処理は、サンプル（即ち、サンプル中の微生物）を繰り返し（例、連続的な）照射処理に供することを含む。
【００４４】
照射は、ＵＶ、ガンマ、及び／又はＸ線照射（単独又は組み合わせのいずれかで）より選択され、最も好ましくはＵＶ照射でありうる。照射処理は、典型的には、微生物を１つ又はいくつかの連続的な照射（例、１〜５）に供することを含み、それは同じ又は異なる性質、好ましくは同じ性質でありうる。繰り返し照射処理は、典型的には、１〜８時間、好ましくは３〜５時間、より好ましくは約４時間の間隔で行う。
【００４５】
特に好ましい処理は、サンプルを細胞破壊ＵＶ照射に供することを含む。本発明は、実際に、そのような処理によって、高効率で、環境（例、土壌又は水）サンプルから、（二次）代謝物（例えば抗生物質など）を産生する低く表される細菌種を単離することが可能になることを示す。細胞破壊ＵＶ処理は、典型的には、０．５〜４００mJ/cm2、より好ましくは１〜２００mJ/cm2、典型的には１〜１００mJ/cm2であり、約５''〜５’の時間にわたり適用される。好ましいＵＶ処理は、３０秒にわたり４mJ/cm2である。
【００４６】
特定の実施態様において、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回のＵＶ処理（各々が０．５〜４００mJ/cm2、好ましくは各々が約４mJ/cm2）に供することを含み、１〜８時間、好ましくは３〜５時間、より好ましくは約４時間の間隔で行う。
【００４７】
代替方法において、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを遺伝毒性薬剤（例えば溶媒、マイトマイシン、ブレオマイシン抗生物質、又はＨ２Ｏ２）と接触させることを含む。遺伝毒性薬剤は、また、照射と組み合わせて使用してもよいことを理解すべきである。特定の実施態様において、処理工程ｂ）は、サンプルに有効量のブレオシン、ブレオマイシンファミリー抗生物質を加えることを含む。実施例において例示される通り、ブレオシンの添加は実質的な細菌細胞死を起こし、稀な代謝物産生細菌が増殖することを可能にする。
【００４８】
処理段階の間に、サンプルを、好ましくは、適した培養培地、例えば、限定なしに、ＰＧＹ（バクトペプトン１０g/L、酵母抽出物５g/L、グルコース２０g/L）又はＬＢ（バクトトリプトン１０g/L、酵母抽出物２．５g/L、塩化ナトリウム１０g/L）などに置く。他の適した培養培地が当業者に公知である（Buchanan et al, 1974, Difco, 1995）又は当業者によりそのような公知の培地から調製されうることを理解すべきである。
【００４９】
処理工程ｂ）は、典型的には、固形又は半固形培地において、例えばゲル（例、寒天）などの存在において実施する。最も好ましい処理培地は、寒天培養培地、例えば軟寒天培養培地などを含む。特定の実施態様において、ＴＧＹ寒天培地を使用して細菌を増殖させる。しかし、炭素源、窒素源、及び無機塩を含む異なる固形培地も使用することができる。連続希釈技術も、Schoenborn et al 2004に従って使用することができる。
【００５０】
工程ｃ）において、生きた又は増殖する細菌を、処理サンプルから同定又は単離する。生きた又は増殖する細菌を、当技術分野においてそれ自体が公知である様々な手段により同定してもよい。特定の実施態様において、培養培地中で形成するコロニーを同定する。生きた又は増殖する細菌を、さらなる培養又は増殖のために新鮮培地中で単離し、その中に置くことができる。
【００５１】
上で言及した通り、本発明の方法は、好ましくは、同定又は単離された生きた又は増殖する細菌（特定の代謝物を産生する）から１つ又はいくつかの細菌を選択する工程ｄ）を含む。この点において、工程ｃ）及びｄ）を連続的、任意の順番で、又は同時に実施することができることに留意されたい。例えば、サンプル中の細菌を、工程ｂ）又はｃ）において所望の活性を選択するために適した条件下に置いてもよく、工程ｃ）において同定又は単離された増殖する又は生きた細菌は、所望の活性を示すようにする。あるいは、工程ｃ）において同定又は単離された細菌を、工程ｄ）において所望の活性を選択するために適した条件下のみに置いてもよく、増殖する又は生きた細菌を、最初に、工程ｃ）において同定又は単離し、次に、所望の活性について選択するようにする。
【００５２】
代謝物は、医薬的及び／又は農薬的な目的を有する任意の化合物でありうる。特定の実施態様において、代謝物は、医薬的化合物（ヒト又は獣医学における使用のため）であって、好ましくは、抗生物質、静菌性化合物、抗代謝薬剤、化学療法化合物、抗寄生虫薬剤、抗真菌薬剤、抗ウイルス化合物、サイトカイン活性化合物、又は細胞増殖因子より選択される。
【００５３】
代謝物は、また、例えば、化粧品又は農業、例えば顔料、殺虫剤、農薬、化学分解化合物などにおける有用性を有しうる。
【００５４】
選択された代謝物を産生する細菌の同定又は選択は、当技術分野においてそれ自体が公知である技術に従って作製することができる。特定の実施態様において、工程ｄ）は、工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかの指標細胞に暴露すること、及び、前記の指標細胞の少なくとも１つの生存、増殖、代謝、移動、ＲＮＡ発現、タンパク質発現、タンパク質分泌、又はウイルス産生に影響を及ぼす細菌を選択することを含む。
【００５５】
抗生物質薬剤又は抗生物静力学的（ａｎｔｉｂｉｏｓｔａｔｉｃ）薬剤の場合において、指標細胞は、典型的には、参照細菌株であり、増殖を阻害する又は前記の参照株を殺す試験細菌が選択される。
【００５６】
例えば、抗ウイルス化合物の場合において、指標細胞は、典型的には、ウイルス産生細胞であり、ウイルスの産生又はウイルス感染細胞の生存に影響を与える細菌が選択される。
【００５７】
この点において、特定の実施態様において、本発明の方法は、前記の細菌により産生される代謝物を単離又は精製する工程をさらに含む。
【００５８】
好ましい実施態様において、選択された活性は、抗生物質活性又は静菌活性の産生である。本発明は、抗生物質産生細菌を、高効率で、本発明に従って処理された環境サンプルから単離することができることを示す。特に、実施例において例示される通り、バチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム属、セルロシミクロビウム属、テピヂモナス属、ノカルジア属、ディノコッカス属、トルーペラ属、ポルフィロバクター属、ノボスフィンゴビウム属、エキシグオバクテリウム属、クロモバクテリウム属、アルスロバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、キネオコッカス属、及びウィリアムシア属の抗生物質産生細菌が、異なる環境サンプル（水、土壌、動物排泄物、木などを含む）より単離されている。
【００５９】
抗生物質産生細菌の選択は、当技術分野においてそれ自体が公知である異なる技術を使用して実施することができる（Singh, 2008, Janssen, 2002, Hamaki, 2005, Schoenborn L et al 2005）。特定の実施態様において、試験された細菌（又はその抽出物）を、１つ又はいくつかの参照細菌株と接触させて置き、参照株の増殖を阻害する又はそれを殺す試験細菌の能力を、抗生物質活性の指標として測定する。参照株の例は、限定なしに、Ｅ． ｃｏｌｉ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、又はカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を含む（Lorian, 1996）。
【００６０】
この点において、本発明は、抗生物質又は静菌薬剤を産生する細菌を同定又は単離するための方法に関し、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理（例、ＵＶ処理）に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、参照細菌株に暴露すること、及び、抗生物質活性又は静菌活性を示す細菌を同定又は単離すること
を含む。
【００６１】
方法は、前記の細菌により産生される抗生物質を単離又は精製する工程をさらに含みうる。
【００６２】
本発明のさらなる目的は、抗代謝又は化学療法又は抗真菌又はサイトカイン活性又は細胞増殖因子産生細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理（例、ＵＶ処理）に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかの参照真核細胞型に暴露すること、及び、真核細胞型の一部の生存、増殖、代謝、移動、ＲＮＡ発現、タンパク質発現、又はタンパク質分泌に影響を及ぼす選択された細菌を同定すること
を含む。
【００６３】
方法は、前記の細菌により産生される抗代謝又は化学療法又は抗真菌又はサイトカイン活性又は細胞増殖因子を単離又は精製する工程をさらに含みうる。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、抗ウイルス化合物産生細菌を同定又は単離するための方法にあり、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理（例、ＵＶ処理）に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかのウイルス産生細胞型に暴露し、ウイルスの産生又はウイルス感染細胞の生存に影響を及ぼす細菌を選択すること
を含む。
【００６５】
方法は、前記の細菌により産生される抗ウイルス薬剤を単離又は精製する工程をさらに含みうる。
【００６６】
本発明の方法は、また、同定又は単離された細菌の属／種を決定する工程を含みうる。この点において、本発明は、選択された代謝物を産生するディノコッカス細菌を同定又は単離するために特に適する。
【００６７】
したがって、特定の実施態様において、本発明は、選択された活性を示す（例、目的の代謝物を産生する）細菌を同定又は単離するための方法に関し、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖するディノコッカス細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）選択された活性を示す工程ｃ）のディノコッカス細菌を選択すること
を含む。
【００６８】
細菌を、例えば、Hirsch, 2004及びKampfer, 2008に従って特徴付け、分類することができる。生理学的な特徴付けは、例えば、脂肪酸、呼吸鎖キノン、極性脂質、及びポリアミンパターンの決定、異なる炭素源の代謝プロファイリング、及び／又は１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列の決定を含む。
【００６９】
さらに、本発明の方法は、特定の特性を有する細菌を選択する１つ又はいくつかの追加の工程を含むことができる。特に、好ましい実施態様において、方法は、選択された培養条件（例えば培地、温度、ｐＨ、塩分、栄養分、酸素化、又は炭素源など）下で生存可能である又は増殖する細菌を選択する１つ又はいくつかの工程をさらに含む。この目的のために、サンプル又は細菌を、工程ｂ）、ｃ）、又はｄ）のいずれか１つの間、あるいは先の又は続く工程の間に、適切な選択条件下に置くことができ、結果として得られる特性をこれらの工程のいずれかの間に選択する。
【００７０】
本発明の特定の局面において、細菌を、温度幅約４〜７０℃において生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、特定の温度条件下で培養する。特に、所望の温度で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択された温度で維持する。
【００７１】
本発明の別の特定の局面において、細菌を、恐らくはおよそ５%重量／容積に達するＮａＣｌ又は等価の塩の濃度条件下で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、特定の塩条件下で培養する。特に、所望の塩度で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択された塩分で維持する。
【００７２】
本発明のさらなる特定の好ましい実施態様において、約３〜９．５、好ましくは４〜８のｐＨで生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、細菌を特定のｐＨ条件下で培養する。特に、所望のｐＨで生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択されたｐＨで維持する。
【００７３】
本発明のさらなる特定の実施態様において、好気及び／又は嫌気条件下で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、細菌を特定の酸素化条件下で培養する。特に、所望の条件で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択された酸素化条件下で維持する。
【００７４】
本発明のさらなる特定の実施態様において、選択された炭素源の存在において生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、細菌を特定の培養培地中で培養する。特に、所望の炭素源を使用して生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を培地下で維持する。
【００７５】
上の特徴を個々に又は任意の組み合わせで選択することができることを理解すべきである。例えば、この方法を使用して、所望の温度及び塩分で、又は所望の温度及びｐＨで、又は所望の温度、ｐＨ、及び酸素化条件で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定することができる。
【００７６】
さらに、本発明の方法は、例えば、生物学的、遺伝学的、及び／又は化学的のいずれかで、同定又は単離された細菌を、又はそのＤＮＡを、当技術分野においてそれ自体が公知である任意のプロセスにより改変するさらなる工程を含みうる。前記の改変は、例えば、抗生物質活性を改善するために、例えば、前記の細菌の生存、増殖、又は機能を改善することを目的とする。そのような改変工程は、限定なしに、細胞融合、加速進化、ＤＮＡシャッフリング、突然変異誘発、別の株からの真核生物、原核生物、もしくは合成核酸（例、ＤＮＡ）の挿入、又は任意の遺伝子操作技術を含む。改変は、また、細菌においてマーカー遺伝子（例、カナマイシン耐性）を導入する工程を含みうる。
【００７７】
多くの（市販の）抗菌薬は、天然産物の半合成アナログであり、最初の発酵産物の修飾から得られる。これは、ケトライド系（βラクタム群の抗生物質）について当てはまる。抗生物質の生合成に関与する酵素の半合成又はさらには、操作は、従って、最初のヒットを改善するために使用することができる（Von Nusssbaum, 2006, Marsden, 1998）。
【００７８】
したがって、特定の実施態様において、本発明は、選択された活性を有する細菌を産生する方法にある。この方法は、上記の方法のいずれかに従って細菌を単離すること及び前記の細菌を、例えば、遺伝学的、生物学的、又は化学的処理により改変し、前記の活性を改善することを含む。
【００７９】
実施例において例示される通り、本発明の方法によって、二次代謝物（例、抗生物質）を産生するＵＶ耐性細菌の効率的かつ迅速な単離が可能になっている。これらの細菌は以前に公知であったが、治療的又は他の産業的な目的のために抗生物質活性（又は他の二次代謝物）の多様性及びスペクトルを拡大することができる。
【００８０】
本発明のさらなる局面は、従って、また、上で開示する方法により入手可能な細菌、又はその抽出物にある。抽出物は、細胞培養に由来する任意の調製物、例えば上清、ライセート、細胞膜、又はそれに由来し、好ましくは二次代謝物を含む濃縮／精製調製物などでありうる。
【００８１】
細菌は、異なる属、例えばバチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム属、セルロシミクロビウム属、テピヂモナス属、ノカルジア属、ディノコッカス属、トルーペラ属、ポルフィロバクター属、ノボスフィンゴビウム属、エキシグオバクテリウム属、クロモバクテリウム属、アルスロバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、キネオコッカス属、及びウィリアムシア属などに属しうる。
【００８２】
本発明は、また、組換え宿主細胞を産生する方法に関し、方法は、上で定義する方法のいずれか１つに従って細菌を同定又は単離又は産生すること及び遺伝子（又は遺伝子クラスターもしくはオペロン、又は対応する合成もしくは組換え核酸）を、前記の細菌から別の宿主細胞中にクローニングし、それにより組換え宿主細胞を産生することを含む。宿主細胞は、原核又は真核宿主細胞、好ましくは原核宿主細胞でありうる。クローニングを、当技術分野においてそれ自体が公知である技術に従って、例えばクローニングベクター（例、プラスミド、ファージ、細菌染色体など）を使用して行うことができる。好ましい実施態様において、生合成経路の全部又は部分をコードする遺伝子又は遺伝子クラスター（例、そのような経路に関与する酵素をコードする遺伝子）を、同定された細菌より単離し、適切なベクター中にクローニングし、選択された宿主細胞中に挿入し、新たな生合成経路を構築する。
【００８３】
本発明は、また、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を産生する方法に関し、この方法は、上の方法のいずれか１つに従って細菌を同定又は単離又は産生すること（それにおいて前記の細菌は医薬的薬剤を産生する）、及び前記の抗生物質を産生することを含む。医薬的薬剤の産生は、細菌（又はその子孫もしくは派生体）を適した条件下で培養すること及び薬剤を回収又は精製することを含みうる。薬剤の産生は、また、人工合成（例、化学的、組換え、酵素など）を含みうる。
【００８４】
本発明のさらなる目的は、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を、野生型ディノコッカス細菌株を使用して同定、単離、又は産生する方法である。
【００８５】
本発明のさらなる目的は、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を、改変ディノコッカス細菌株を使用して同定、単離、又は産生する方法である。
【００８６】
本発明のさらなる目的は、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を産生するためのディノコッカス細菌の使用にある。
【００８７】
本発明のさらなる目的は、ディノコッカス細菌に由来する抗生物質である。
【００８８】
また、本発明を使用して、細菌を選択し、メタゲノムライブラリーを生成することができる。典型的には、そのような細菌からのゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡの大きなフラグメントをシャトルベクターに（直接的に）クローニングし、前記の細菌を代表するメタゲノムライブラリーを作製する。このメタゲノムライブラリーを異なる宿主細菌中に移して、二次代謝物産生株を同定することができる。例として、ポリケチド産生に関与する酵素を、Ginolhac, 2007に従ってスクリーニングすることができる。
【００８９】
さらに、本発明は、また、微生物を使用する改善された工業的方法に関する。実際に、本発明は、また、潜在的な混入細菌を除去するために、１つ又はいくつかの細胞破壊ＤＮＡ損傷処理を工業的プロセス中の含むことを提案する。実際に、本発明の細菌は、増殖して、そのような細胞破壊処理を生き残ることができるため、後者を、例えば、任意の工業発酵又は培養デバイスもしくは装置において使用し、混入を回避してもよい。この点において、本発明の特定の目的は、また、発酵又は連続培養において上記の方法により入手可能な細菌を使用するプロセスにあり、ここでプロセスは、発酵又は連続培養の開始の前又はそれに続く細菌の照射の工程を含み、他の細菌又は細胞による混入を限定する。本発明のさらなる目的は、発酵又は連続培養においてディノコッカス細菌を使用するプロセスであり、ここでプロセスは、発酵又は連続培養の開始の前又はそれに続く細菌の照射の工程を含み、他の細菌又は細胞による混入を限定する。照射を繰り返し、典型的には、上記の条件下で実施してもよい。
【００９０】
本発明のさらなる局面及び利点が、以下の実施例において開示され、それらは例示的であり、限定的ではないと見なすべきである。本願において引用される全ての参考文献（特許出願、特許、科学刊行物）が、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９１】
実施例
実施例１−代謝物産生細菌を選択するための改善条件の決定
予備工程において、５株を、ＵＶに対するそれらの耐性について試験した。これらの株は、Ｅ． ｃｏｌｉ、ディノコッカス・ラジオパグナンス、ディノコッカス・ラディオデュランス（ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、ディノコッカス属、及びディノコッカス・ゲオサーマリス（ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）であった。
【００９２】
５つの試験株の静止期培養物を、１００から１０−８まで連続希釈した。全ての希釈物を寒天リッチ培地ＴＧＹ（トリプトン１０g/L、グルコース２．５g/L、及び酵母抽出物５g/L）上にスポットし（５μL）、異なるＵＶ処理を適用した：BioLinkクロスリンカー（Vilbert Lourmat）を用いた０mJ/cm2、４mJ/cm2、１７mJ/cm2、４２mJ/cm2、及び１６７mJ/cm2。
【００９３】
下の表１には、異なるＵＶ処理後での細菌密度を提示する。
【００９４】
【表１】
【００９５】
見られる通り、４mJ/cm2の処理によってＥ． ｃｏｌｉの培養において細菌力価が３対数だけ低下する。１７mJ/cm2の処理でもＥ． ｃｏｌｉとディノコッカス細菌の間で区別される。
【００９６】
第２の工程において、土壌懸濁液を、表１の結果に基づき、異なる照射処理に供した。土壌懸濁液を以下の通りに調製した：５gの湿潤土壌を２０mLの蒸留水中に希釈した。ボルテックス及び超音波処理（１分）後、土壌上清を回収し、静止増殖期の３５０μLのＤラジオパグナンス培養物と混合した。一定分量（５０μL）を、抗真菌薬（シクロヘキシミド、１００μg/mL）を含むＴＧＹ寒天上に広げ、異なる繰り返し連続照射処理を試験した：１回の処理、２回の処理、及び３回の処理。４時間の間隔を、各々のＵＶ処理の間で順守した。
【００９７】
図１ａは、０mJ/cm2、４mJ/cm2、及び１７mJ/cm2での１回の暴露後に得られた結果を示す。図１ｂは、４mJ/cm2に対する１、２、及び３回の暴露後に得られた結果を示す。
【００９８】
見られる通り、最善の試験条件は、各々４mJ/cm2のＵＶ照射に対する３回の暴露である。そのような条件は、処理された土壌サンプルから最高量の増殖ディノコッカス細菌を提供する。相当量のディノコッカス細菌が、また、１７mJ/cm2のＵＶ処理に対するサンプルの１回の暴露後に得られる。
【００９９】
実施例２．水サンプルからのＵＶ耐性細菌の単離
水サンプルを、０．２２μmのニトロセルロースフィルター（Millipore, France）上でのろ過により濃縮し、次に、１０mlの滅菌水中に懸濁した。ろ過した溶液を、次に、約６０秒間にわたり超音波処理し、細菌を再懸濁した。
【０１００】
超音波処理に続き、１５０μl〜２mlの懸濁液を、オートクレーブにより滅菌し（１２０℃で２０分）、グルコース（Sigma-Aldrich, France）１g/L、ペプトン（Fluka, France）１０g/L、及び酵母抽出物（Fluka, France）５g/Lを含む固形ＰＧＹ寒天濃縮培養培地上に広げる。播種された培養物は、次に、BLX-E254 biolink（Vilber-Lourmat, France）を使用し、４時間の間隔で行われる各々４mJ/cm2の３回のＵＶ処理を受ける。３０〜５０℃での３〜４日間にわたるインキュベーション後、目的の生存コロニーが目に見えた。
【０１０１】
同定されたコロニーの例を、下の表２中に列挙する。
【０１０２】
実施例３．木及び小石サンプルからのＵＶ耐性細菌の単離
木及び小石サンプルを滅菌水中に浸し、次に、ボルテックスし、約６０秒間にわたり超音波処理した。
【０１０３】
超音波処理に続き、１５０μL〜２mlの懸濁液を、オートクレーブにより滅菌し（１２０℃で２０分）、グルコース（Sigma-Aldrich, France）１g/L、ペプトン（Fluka, France）１０g/L、及び酵母抽出物（Fluka, France）５g/Lを含む固形ＰＧＹ寒天濃縮培養培地上に広げる。播種された培養培地は、次に、BLX-E254 biolink（Vilber-Lourmat, France）を使用し、４時間の間隔で行われる各々４mJ/cm2の３回のＵＶ処理を受ける。３０〜５０℃での３〜４日間にわたるインキュベーション後、目的の生存コロニーが目に見えた。
【０１０４】
同定されたコロニーの例を、下の表２中に列挙する。
【０１０５】
実施例４．石、コケ、地衣、泥、沈澱物、バイオフィルム、土壌、及び動物排泄物からのＵＶ耐性細菌の単離
コケ、地衣、泥、土壌、及び動物排泄物のサンプルを滅菌水（Ｖ／Ｖ）中に懸濁し、次にボルテックスした。サンプルを次に約６０秒間にわたり超音波処理した。
【０１０６】
超音波処理に続き、１５０μL〜２mlの懸濁液を、オートクレーブにより滅菌し（１２０℃で２０分）、グルコース（Sigma-Aldrich, France）１g/L、ペプトン（Fluka, France）１０g/L、及び酵母抽出物（Fluka, France）５g/Lを含む固形ＰＧＹ寒天濃縮培養培地上に広げる。播種された培養培地は、次に、BLX-E254 biolink（Vilber-Lourmat, France）を使用し、４時間の間隔で行われる各々４mJ/cm2の３回のＵＶ処理を受ける。３０〜５０℃での３〜４日間にわたるインキュベーション後、目的の生存コロニーが目に見える。
【０１０７】
同定されたコロニーの例を、表２中に列挙する。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
実施例５．ブレオシン処理されたサンプルからの細菌の単離
ディノコッカス・ラジオパグナンス株ＤＲＨ４０を含む土壌サンプルを、実施例２と同様の条件下で懸濁した。照射の代わりに、懸濁液を、５０μg/ml又は１００μg/mlのブレオシンの非存在（コントロール）又は存在において維持した。
【０１１０】
ブレオシンの非存在において、増殖中のピンクコロニー（ディノコッカス）は観察されず、しかし、常在性細菌叢だけが観察された。５０μg/mlのブレオシンの存在において、常在性細菌叢は劇的に減少し、ピンクコロニーが存在する。同じ現象が１００μg/mlのブレオシンで観察される。
【０１１１】
実施例６．抗生物質産生細菌の同定
表２に開示するＵＶ耐性株を、細菌のいくつかの参照株の増殖を阻害するそれらの能力について試験した。簡単には、発酵を、ペプトン５g/L、酵母抽出物２．５g/L、及びグルコース０．５g/Lを含む１０mlのＰＧＹ培地中で、３０〜５０℃でエアレーション及び撹拌を伴い行った。３日後、試験株の抗生物質産生を制御し、ＬＢ培地上で培養されたいくつかの参照株に対する拡散試験寒天により定量化した。
【０１１２】
ＬＢ：バクトトリプトン１０g/L、酵母抽出物５g/L、塩化ナトリウム１０g/L
ＰＧＹ：ペプトン５g/L、酵母抽出物２．５g/L、グルコース０．５g/L
参照株：
スタフィロコッカス・アウレウスＣＩＰ ７６．２５
エシェリキア・コリＣＩＰ ７６．２４
カンジダ・トロピカリスＣＩＰ １２７５
【０１１３】
結果を下の表３に描写する。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
結果は、抗生物質活性を示すいくつかの株が単離されていることを示す。これらの株は、スタフィロコッカス・アウレウス、エシェリキア・コリ、及び／又はカンジダ・トロピカリスに対して活性である抗生物質活性を産生する。産生株はＵＶに対して耐性であり、上昇温度で増殖することができ、それにより、本発明の方法の有効性を例示する。
【０１１６】
実施例７．抗生物質産生スクリーニングアッセイ
７．２．材料及び方法
培養培地
異なる培地を調製し、抗生物質産生を試験した。
１００mLの溶液Ａは、ＭｎＣｌ２、４Ｈ２Ｏ ０．１g、ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ０．１g、及びＦｅＣｌ３ ０．１gにより構成される。
培地１は、カゼイン５g/L、バクト酵母抽出物３g/Lからのバクトペプトンにより構成され、ｐＨ ７．１に調整される。
培地２は、セロビオース１０g/L、Ｋ２ＨＰＯ４ １g/L、ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ １g/L、ＮａＣｌ １g/L、（ＮＨ４）２ ＳＯ４ ２g/L、ＣａＣＯ３ ２g/Lにより構成され、ｐＨ ７．２に調整される。溶液Ａを１ml/Lで加える。
培地３は、オートミール２０g/L及び１ml/Lの溶液Ａにより構成される。
【０１１７】
試験株の培養調製
株を５mLのＰＧＹ液体培地中に接種した。前培養物を、次に、３０℃又は４５℃で４８時間にわたり１５０rpmでの撹拌下でインキュベートした。
【０１１８】
１５mLガラスチューブ中で、１００μLの前培養物を５mLの培地１〜３中に接種した。培養物を、次に、３０℃又は４５℃で４８時間、９６時間、１６８時間、及び３３６時間にわたり１５０rpmでの撹拌下でインキュベートした。
【０１１９】
標的株の培養調製
標的株は、スタフィロコッカス・アウレウスＣＩＰ７６．２５、エシェリキア・コリＣＩＰ ７６．２４、シュードモナス・エルギノーサＣＩＰ ７６．１１０、ストレプトコッカス・ニューモニエＣＩＰ １０４４８５、及びカンジダ・トロピカリスＤＳＭ １３４６であった。
【０１２０】
それらをＬＢ培地上で、３７℃で１８時間にわたり培養した。次に、１０mLの軟寒天（７g/Lの寒天を伴うＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地）に、ペトリ皿中の標的株の前培養物を２%（ｖ／ｖ）で接種した。
【０１２１】
抗生物質産生の評価
３０℃又は４５℃で４８時間、９６時間、１６８時間、及び３３６時間にわたるインキュベーション後、１mL試験培養物を１３０００rpmで３分間にわたり遠心した。上清を、次に、０．２２μmフィルター上でろ過した。１０μLのろ過された培養上清を、標的株を含む軟寒天上に接種した。３７℃で１８時間にわたるインキュベーション後、溶解プラークを観察することができた。
【０１２２】
７．２．結果
表４には、異なる得られた抗生物質プロファイルの例を提示する。キネオコッカス株Ｍ１０−５Ｈは、グラム陽性試験株及びＥ． ｃｏｌｉ ＣＩＰ ７６．２４に対する抗生物質を産生した。ディノコッカス株ＭＣ５−７Ｆは、ＳアウレウスＣＩＰ ７６．２５に対する抗生物質を産生した。ミクロバクテリウム株ＭＡ３−７Ｇは、ＣトロピカリスＣＩＰ １２７５に対する抗生物質を産生し、及びウィリアムシア株ＭＡ３−６Ｂは、グラム陽性試験株及びＰエルギノーサＣＩＰ ７６．１１０に対する抗生物質を産生した。
【０１２３】
【表４】
【０１２４】
【表５】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規細菌及びそれに由来する代謝物を同定するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、目的の代謝物を産生する細菌を環境サンプルから単離するための新規方法を記載する。特に、本発明は、新規の抗生物質産生細菌を選択するための方法を開示する。本発明は、任意のサンプルから使用することができ、例えば、医薬的又は農薬的な利益を有する細菌の単離を可能にする。
【０００２】
背景
太古の時代から、人類は、治療目的のために周囲の生物を供給源にしてきた。市販の抗生物質の大半は依然として天然起原を有する。過去１０年間に、抗菌薬発見プロセスを合理化し、加速するための努力において、産業界は、天然産物及び分子指向の発見戦略から合成分子及び標的指向の戦略に移っている。
【０００３】
何年もの抗生物質Ｒ＆Ｄプロセスの一意化（前例がない高い摩擦率を伴う）後、天然資源に戻ることが必要である。実際に、天然産物ライブラリーのスクリーニングは、通常、化学的ライブラリーのそれより高い抗生物質ヒットのパーセンテージをもたらし、結果的に、治療法を得るより高い確率を提供する。第１の理由は、恐らくは、抗生物質の生態学的な役割にあり、それは他の生きている生物から植物、動物、及び微生物を防御するように進化の過程を通じて最適化されてきた。さらに、天然産物は、一般的に、組み合わせ化合物と同程度に親油性であるが、しかし、それらは比類ない構造的な多様性及び化学空間における分散を有する。これは、インビボでの適用のために最適化することができる稀な親水性ヒットを見いだすのに役立つ。
【０００４】
一般的に、環境供給源（例えば土壌又は水など）から単離される細菌の２０〜３０パーセントが抗生物質産生株であると想定される（Berdy, 2005）。明白な理由のため、より適当なもの及び最も代表される細菌が、最も頻繁に単離される。これによって、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）により産生される多くの抗生物質がなぜ既に記録されているのか、及び、これらの属により産生される新たな分子実体を見出すことがなぜますます困難であるのかが説明される。低く表される細菌の他の科は、抗生物質産生により適応され、より大きなゲノムのために、適応された技術を用いて簡単に単離することができる。これはアクチノミセターレスの場合であり、はるかに最善の抗生物質産生株である（Berdy, 2005）。それらは、医薬産業により１９５０〜１９８０年の間に広範囲に試験され、現在、非冗長分子を産生する株を同定することは困難である。
【０００５】
過去１０年、努力は、医薬目的の新たな化学実体を見出すために、稀な細菌を単離することに捧げられてきた。粘液細菌は、例えば、１９４０年代から公知であるが、しかし、それらを単離する際に遭遇する困難のために、それらはコレクションにおいて低く表された。Reichenbach H及び共同研究者により行われた広範囲のコレクションキャンペーンのおかげで、現在までに、粘液細菌により産生される約８０の異なる化合物及び４５０の構造バリアントが特徴付けられている（Reichenbach, 2001）。それらの化合物の多くが新しかった。それらの中には抗新生物薬エポチロンがあり、現在、臨床試験において評価されている。
【０００６】
しかし、細菌学者が大半の土壌微生物を培養できないことが一般的に認識されている（Schoenborn et al, 2005）。土壌中の培養可能な細胞の数は、しばしば、存在する細胞の総数のわずか約１%である。これらの細菌の大半は、標準的な単離技術を使用して検出及び単離することが困難である。なぜなら、それらは環境中でまれであるからである。又は、それらは、他の細菌（シュードモナス属又はバチルス属など）ほどには環境に適応せず、迅速に過成長するからである。単離株の多様性を増加させることを目的とするいくつかの単離技術が発表されている。例えば、連続液体希釈培養が成功裏に使用されており、培養可能性が改善され（Schoenborn et al, 2005）、多様な環境からの細菌の単離が促進されてきた。Yang et al., 2008には、稀な放線菌を単離するためのマイクロ波処理の使用も記載された。ＷＯ０２／０５９３５１は、例えば温泉水を使用して自然環境から微生物集団を濃縮するための方法に関する。
【０００７】
しかし、環境微生物は、依然として、新規化合物及び活性の豊富な未開発の資源を表し、当技術分野において、目的の細菌を同定するための改善された又は代わりの方法についての必要性がある。
【０００８】
発明の要約
本願は、環境サンプルから細菌を同定又は単離するための新規アプローチを提供する。特に、本発明は、ＤＮＡ損傷処理を使用して環境サンプルから稀な（rare）細菌を同定又は単離する効率的で迅速な方法を開示する。
【０００９】
本発明の目的は、従って、（二次）代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法にあり、方法は、特徴付けされていない細菌を含むサンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供すること、及び、前記の処理サンプルから、（二次）代謝物を産生する細菌を同定又は単離することを含む。好ましい実施態様において、処理は繰り返し照射処理である。
【００１０】
この点に関して、本発明の特定の目的は、代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む。
【００１１】
特定の実施態様において、処理は、連続ＵＶ処理、例えば、本質的に一定間隔での少なくとも２、好ましくは３又はそれ以上の照射の繰り返しを含む。
【００１２】
特定の実施態様において、処理は繰り返しＵＶ照射を含む。
【００１３】
別の特定の実施態様に従い、本発明は、代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法に関し、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルにブレオマイシンファミリーの抗生物質を加えること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む。
【００１４】
ブレオマイシンファミリーの好ましい抗生物質は、ブレオシンである。
【００１５】
代謝物は、任意の医薬的産物、例えば抗生物質、静菌性化合物、抗代謝薬剤、化学療法化合物、抗真菌薬剤、抗ウイルス化合物、サイトカイン活性化合物、又は細胞増殖因子などでありうる。
【００１６】
本発明の別の目的は、抗生物質又は静菌性化合物を産生する細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理、好ましくは繰り返しＵＶ処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、参照細菌株に暴露すること、及び、抗生物質活性又は静菌活性を示す細菌を同定又は単離すること
を含む。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、前記の細菌により産生された代謝物を単離又は精製するさらなる工程を含む。
【００１８】
さらに、本発明の方法は、場合により、遺伝的、生物学的、又は化学的のいずれかで、同定又は単離された細菌又はそのＤＮＡを、それ自体が当業者に公知である任意の技術プロセスにより改変するさらなる工程を含み、前記の改変は、例えば、抗生物質活性又は産生を改善するために、例えば、前記細菌の生存、増殖、又は機能を改善することを目的とする。これは、限定なしに、細胞融合、加速進化、ＤＮＡシャッフリング技術、別の系統からの真核、原核、又は合成核酸（例、ＤＮＡ）の挿入、あるいは任意の遺伝子操作技術を含む。前記の改変工程は、単離された細菌で、又はプロセスの任意のより初期の段階で、例えば、工程ａ）のサンプルで行うことができる。
【００１９】
本発明の別の目的は、上で開示する方法により得られる野生型又は改変細菌、あるいはその抽出物にある。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、代謝物、特に医薬的化合物を産生する方法であって、方法は、（ｉ）前記の代謝物を産生する細菌を、上で定義する方法を使用して同定又は単離すること、及び（ｉｉ）前記の抗生物質を産生することを含む。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、医薬的化合物（例えば抗生物質など）を、野生型又は改変ディノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）細菌株を使用して単離又は産生する方法である。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、医薬的化合物（例えば抗生物質など）を産生するための野生型又は改変ディノコッカス細菌の使用にある。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、野生型又は改変ディノコッカス細菌に由来する抗生物質である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、組換え宿主細胞を産生する方法であって、方法は、上で定義する方法に従って細菌を同定又は単離すること、及び、１つ又はいくつかの遺伝子（又は対応する合成もしくは組換え核酸）を、別の宿主細胞において前記細菌からクローニングすることを含み、それにより組換え宿主細胞を産生する。
【００２５】
本発明の方法を、種々のサンプル（例えば環境サンプルなど）と使用することができ、有利な医薬的及び／又は農薬的特性を有する新規細菌を単離するために成功裏に使用されてきた。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ａ）１回のＵＶ暴露（０、４、及び１７mJ/cm2）及びｂ）ＵＶ処理（４mJ/cm2）への繰り返し暴露後に得られた細菌マット暗色コロニーはＤラジオパグナンス（ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）である。他の細菌は土壌群集に属する。
【００２７】
発明の詳細な説明
本願は、サンプルから細菌を同定又は単離するための新規方法を記載する。特に、本発明は、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理を使用して環境サンプルから稀な細菌を同定又は単離する効率的で迅速な方法を開示する。
【００２８】
ＵＶ又は照射に対する細菌の耐性が広範囲に試験され、細菌がそのような侵食環境においてどのようにして生存することができるのかが理解されてきた（Makarova et al, 2001）。Rainey et al, 2005は、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｌｕｓ属及びディノコッカス属が、ソノラ砂漠土壌から回収された最も放射線耐性な細菌であることを示した。他の細菌も単離された（即ち、ディノコッカス、ヒメノバクター（Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、キネオコッカス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、及びメチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））。
【００２９】
本発明は、今回、代謝物を産生する新規の（低く表される（under-represented））細菌を単離するための細胞破壊ＤＮＡ損傷処理の使用を提案する。本発明は、実際に、そのような処理（通常は実質的な細胞死を起こしうる）によって、予想外に、貴重な代謝物を産生する顕著な特性を有する低く表される細菌の選択が可能になることを示す。
【００３０】
本発明は、今回、初めて、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理後、貴重な二次代謝物を産生することができる多くの細菌を単離することが可能であることを示す。
【００３１】
本発明の目的は、従って、代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法にあり、方法は、特徴付けされていない細菌を含むサンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供すること、及び、前記の処理サンプルから、代謝物を産生する細菌を同定又は単離することを含む。
【００３２】
特定の実施態様において、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む。
【００３３】
方法は、特徴付けられていない細菌を含む種々のサンプルを用いて、特に環境サンプルからである又はそれに由来するサンプルを用いて実行することができる。本発明の関連内で、環境サンプルは、（複数の）特徴付けられていない（微）生物、特に未培養の微生物（例、意図的に培養され、単離形態で増殖されていない微生物）を含む任意のサンプルを含む。サンプルは、天然環境から又は人工のもしくは特別に作製された環境から得られうる又はそれに由来しうる。
【００３４】
示す通り、サンプルは、任意の環境サンプル、例えば、土壌、水、植物抽出物、生物学的材料、沈殿物、泥炭地、工場廃水又は用地、無機抽出物、砂などから得られる又はそれに由来するものなどでありうる。サンプルは、種々の地域又は状況、例えば、限定はされないが、熱帯地域、火山地域、森林、農場、工業地域などから回収されうる。サンプルは、通常、（特徴付けられていない未培養の）微生物の種々の種、例えば陸生微生物、海洋微生物、淡水微生物、共生微生物などを含む。そのような環境微生物の種は、細菌、藻類、菌類、酵母、カビ、ウイルスなどを含む。微生物は、好極限性生物（例えば、好熱菌など）を含みうる。サンプルは、典型的には、そのような（未培養の）微生物の種々の種、ならびにその種々の量を含む。さらに、サンプルは、加えて、公知の及び／又は培養可能な微生物（例、原核又は真核）を含みうる。
【００３５】
本発明が、サンプルの任意の特定の型又は環境微生物に限定されず、未培養の微生物を含む任意のサンプルを使用して実施することができることを理解すべきである。
【００３６】
好ましい実施態様において、サンプルは、土壌、水、温泉、海洋環境、泥、木、石、コケ、植物抽出物、地衣、生物学的物質、沈殿物、バイオフィルム、工場排液、ガス、砂、油、汚水、又は動物もしくはヒト排泄物である又はそれに由来する。
【００３７】
本発明における使用のために、サンプルは、湿潤、可溶性、乾燥、懸濁液の形態、ペーストなどでありうる。さらに、方法の工程ｂ）の前に、サンプルを処理し、例えば微生物を濃縮するためのプロセスを改善してもよい（例、ろ過、洗浄、濃縮、希釈、撹拌、乾燥などを通じて）。
【００３８】
特定の実施態様において、サンプルはろ過された懸濁液の形態である。特に、サンプルを、処理工程ｂ）の前に、滅菌濾過してもよい及び／又は滅菌水中に置いてもよい。
【００３９】
プロセスの工程ｂ）は、サンプル（即ち、サンプル中に含まれる微生物）を、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供することを含む。
【００４０】
細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、ＤＮＡ改変を導入する単なる突然変異処理とは対照的に、サンプルにおいて実質的な細胞死を起こす処理を指す。特に、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、Ｅ． ｃｏｌｉ細菌の培養において９０%細胞死又はそれ以上を起こすために十分である処理である。さらにより好ましくは、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、Ｅ． ｃｏｌｉの培養において細菌力価を少なくとも２対数だけ低下させるために十分である処理である。驚くべきことに、本発明は、そのような処理（通常、大半の細胞集団に対して致死的であり得る）は、種々の型のサンプルからの新規微生物の効率的で迅速な単離を可能にし、その微生物は貴重な（二次）代謝物を産生する。この結果は特に驚くべきことである。なぜなら、微生物をそのような細胞破壊ＤＮＡ損傷処理に供することによって、生きた微生物の単離を予防することが期待されてきたであろうからである。驚くべきことに、本発明は、サンプルからの稀な微生物、特に、そのゲノムを再構成する又はＤＮＡ損傷に耐性にする能力を有する微生物の選択を可能にする。
【００４１】
本発明は、このように、初めて、高効率で、貴重な（二次）代謝物を産生する低く表される細菌を選択するための細胞破壊ＤＮＡ損傷処理の使用を開示する。実施例において例示される通り、本発明は、ディノコッカス属、バチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、テピヂモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）属、トルーペラ（Ｔｒｕｅｐｅｒａ）属、ポルフィロバクター（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属、エキシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、キネオコッカス属、及びウィリアムシア（Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａ）属の新規細菌株の単離を可能にした。
【００４２】
ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを照射及び／又は１つもしくはいくつかの遺伝毒性薬剤に供することを含みうる。処理は、サンプル中に存在する微生物において実質的な細胞死を誘導するために十分な条件下で及び／又は時間にわたり行う。
【００４３】
好ましい実施態様において、ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを１つ又はいくつかの照射に供することを含む。好ましい処理は、サンプル（即ち、サンプル中の微生物）を繰り返し（例、連続的な）照射処理に供することを含む。
【００４４】
照射は、ＵＶ、ガンマ、及び／又はＸ線照射（単独又は組み合わせのいずれかで）より選択され、最も好ましくはＵＶ照射でありうる。照射処理は、典型的には、微生物を１つ又はいくつかの連続的な照射（例、１〜５）に供することを含み、それは同じ又は異なる性質、好ましくは同じ性質でありうる。繰り返し照射処理は、典型的には、１〜８時間、好ましくは３〜５時間、より好ましくは約４時間の間隔で行う。
【００４５】
特に好ましい処理は、サンプルを細胞破壊ＵＶ照射に供することを含む。本発明は、実際に、そのような処理によって、高効率で、環境（例、土壌又は水）サンプルから、（二次）代謝物（例えば抗生物質など）を産生する低く表される細菌種を単離することが可能になることを示す。細胞破壊ＵＶ処理は、典型的には、０．５〜４００mJ/cm2、より好ましくは１〜２００mJ/cm2、典型的には１〜１００mJ/cm2であり、約５''〜５’の時間にわたり適用される。好ましいＵＶ処理は、３０秒にわたり４mJ/cm2である。
【００４６】
特定の実施態様において、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回のＵＶ処理（各々が０．５〜４００mJ/cm2、好ましくは各々が約４mJ/cm2）に供することを含み、１〜８時間、好ましくは３〜５時間、より好ましくは約４時間の間隔で行う。
【００４７】
代替方法において、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理は、サンプルを遺伝毒性薬剤（例えば溶媒、マイトマイシン、ブレオマイシン抗生物質、又はＨ２Ｏ２）と接触させることを含む。遺伝毒性薬剤は、また、照射と組み合わせて使用してもよいことを理解すべきである。特定の実施態様において、処理工程ｂ）は、サンプルに有効量のブレオシン、ブレオマイシンファミリー抗生物質を加えることを含む。実施例において例示される通り、ブレオシンの添加は実質的な細菌細胞死を起こし、稀な代謝物産生細菌が増殖することを可能にする。
【００４８】
処理段階の間に、サンプルを、好ましくは、適した培養培地、例えば、限定なしに、ＰＧＹ（バクトペプトン１０g/L、酵母抽出物５g/L、グルコース２０g/L）又はＬＢ（バクトトリプトン１０g/L、酵母抽出物２．５g/L、塩化ナトリウム１０g/L）などに置く。他の適した培養培地が当業者に公知である（Buchanan et al, 1974, Difco, 1995）又は当業者によりそのような公知の培地から調製されうることを理解すべきである。
【００４９】
処理工程ｂ）は、典型的には、固形又は半固形培地において、例えばゲル（例、寒天）などの存在において実施する。最も好ましい処理培地は、寒天培養培地、例えば軟寒天培養培地などを含む。特定の実施態様において、ＴＧＹ寒天培地を使用して細菌を増殖させる。しかし、炭素源、窒素源、及び無機塩を含む異なる固形培地も使用することができる。連続希釈技術も、Schoenborn et al 2004に従って使用することができる。
【００５０】
工程ｃ）において、生きた又は増殖する細菌を、処理サンプルから同定又は単離する。生きた又は増殖する細菌を、当技術分野においてそれ自体が公知である様々な手段により同定してもよい。特定の実施態様において、培養培地中で形成するコロニーを同定する。生きた又は増殖する細菌を、さらなる培養又は増殖のために新鮮培地中で単離し、その中に置くことができる。
【００５１】
上で言及した通り、本発明の方法は、好ましくは、同定又は単離された生きた又は増殖する細菌（特定の代謝物を産生する）から１つ又はいくつかの細菌を選択する工程ｄ）を含む。この点において、工程ｃ）及びｄ）を連続的、任意の順番で、又は同時に実施することができることに留意されたい。例えば、サンプル中の細菌を、工程ｂ）又はｃ）において所望の活性を選択するために適した条件下に置いてもよく、工程ｃ）において同定又は単離された増殖する又は生きた細菌は、所望の活性を示すようにする。あるいは、工程ｃ）において同定又は単離された細菌を、工程ｄ）において所望の活性を選択するために適した条件下のみに置いてもよく、増殖する又は生きた細菌を、最初に、工程ｃ）において同定又は単離し、次に、所望の活性について選択するようにする。
【００５２】
代謝物は、医薬的及び／又は農薬的な目的を有する任意の化合物でありうる。特定の実施態様において、代謝物は、医薬的化合物（ヒト又は獣医学における使用のため）であって、好ましくは、抗生物質、静菌性化合物、抗代謝薬剤、化学療法化合物、抗寄生虫薬剤、抗真菌薬剤、抗ウイルス化合物、サイトカイン活性化合物、又は細胞増殖因子より選択される。
【００５３】
代謝物は、また、例えば、化粧品又は農業、例えば顔料、殺虫剤、農薬、化学分解化合物などにおける有用性を有しうる。
【００５４】
選択された代謝物を産生する細菌の同定又は選択は、当技術分野においてそれ自体が公知である技術に従って作製することができる。特定の実施態様において、工程ｄ）は、工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかの指標細胞に暴露すること、及び、前記の指標細胞の少なくとも１つの生存、増殖、代謝、移動、ＲＮＡ発現、タンパク質発現、タンパク質分泌、又はウイルス産生に影響を及ぼす細菌を選択することを含む。
【００５５】
抗生物質薬剤又は抗生物静力学的（ａｎｔｉｂｉｏｓｔａｔｉｃ）薬剤の場合において、指標細胞は、典型的には、参照細菌株であり、増殖を阻害する又は前記の参照株を殺す試験細菌が選択される。
【００５６】
例えば、抗ウイルス化合物の場合において、指標細胞は、典型的には、ウイルス産生細胞であり、ウイルスの産生又はウイルス感染細胞の生存に影響を与える細菌が選択される。
【００５７】
この点において、特定の実施態様において、本発明の方法は、前記の細菌により産生される代謝物を単離又は精製する工程をさらに含む。
【００５８】
好ましい実施態様において、選択された活性は、抗生物質活性又は静菌活性の産生である。本発明は、抗生物質産生細菌を、高効率で、本発明に従って処理された環境サンプルから単離することができることを示す。特に、実施例において例示される通り、バチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム属、セルロシミクロビウム属、テピヂモナス属、ノカルジア属、ディノコッカス属、トルーペラ属、ポルフィロバクター属、ノボスフィンゴビウム属、エキシグオバクテリウム属、クロモバクテリウム属、アルスロバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、キネオコッカス属、及びウィリアムシア属の抗生物質産生細菌が、異なる環境サンプル（水、土壌、動物排泄物、木などを含む）より単離されている。
【００５９】
抗生物質産生細菌の選択は、当技術分野においてそれ自体が公知である異なる技術を使用して実施することができる（Singh, 2008, Janssen, 2002, Hamaki, 2005, Schoenborn L et al 2005）。特定の実施態様において、試験された細菌（又はその抽出物）を、１つ又はいくつかの参照細菌株と接触させて置き、参照株の増殖を阻害する又はそれを殺す試験細菌の能力を、抗生物質活性の指標として測定する。参照株の例は、限定なしに、Ｅ． ｃｏｌｉ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、又はカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）を含む（Lorian, 1996）。
【００６０】
この点において、本発明は、抗生物質又は静菌薬剤を産生する細菌を同定又は単離するための方法に関し、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理（例、ＵＶ処理）に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、参照細菌株に暴露すること、及び、抗生物質活性又は静菌活性を示す細菌を同定又は単離すること
を含む。
【００６１】
方法は、前記の細菌により産生される抗生物質を単離又は精製する工程をさらに含みうる。
【００６２】
本発明のさらなる目的は、抗代謝又は化学療法又は抗真菌又はサイトカイン活性又は細胞増殖因子産生細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理（例、ＵＶ処理）に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかの参照真核細胞型に暴露すること、及び、真核細胞型の一部の生存、増殖、代謝、移動、ＲＮＡ発現、タンパク質発現、又はタンパク質分泌に影響を及ぼす選択された細菌を同定すること
を含む。
【００６３】
方法は、前記の細菌により産生される抗代謝又は化学療法又は抗真菌又はサイトカイン活性又は細胞増殖因子を単離又は精製する工程をさらに含みうる。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、抗ウイルス化合物産生細菌を同定又は単離するための方法にあり、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理（例、ＵＶ処理）に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかのウイルス産生細胞型に暴露し、ウイルスの産生又はウイルス感染細胞の生存に影響を及ぼす細菌を選択すること
を含む。
【００６５】
方法は、前記の細菌により産生される抗ウイルス薬剤を単離又は精製する工程をさらに含みうる。
【００６６】
本発明の方法は、また、同定又は単離された細菌の属／種を決定する工程を含みうる。この点において、本発明は、選択された代謝物を産生するディノコッカス細菌を同定又は単離するために特に適する。
【００６７】
したがって、特定の実施態様において、本発明は、選択された活性を示す（例、目的の代謝物を産生する）細菌を同定又は単離するための方法に関し、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを、細胞破壊ＤＮＡ損傷処理、好ましくは繰り返し照射処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖するディノコッカス細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）選択された活性を示す工程ｃ）のディノコッカス細菌を選択すること
を含む。
【００６８】
細菌を、例えば、Hirsch, 2004及びKampfer, 2008に従って特徴付け、分類することができる。生理学的な特徴付けは、例えば、脂肪酸、呼吸鎖キノン、極性脂質、及びポリアミンパターンの決定、異なる炭素源の代謝プロファイリング、及び／又は１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列の決定を含む。
【００６９】
さらに、本発明の方法は、特定の特性を有する細菌を選択する１つ又はいくつかの追加の工程を含むことができる。特に、好ましい実施態様において、方法は、選択された培養条件（例えば培地、温度、ｐＨ、塩分、栄養分、酸素化、又は炭素源など）下で生存可能である又は増殖する細菌を選択する１つ又はいくつかの工程をさらに含む。この目的のために、サンプル又は細菌を、工程ｂ）、ｃ）、又はｄ）のいずれか１つの間、あるいは先の又は続く工程の間に、適切な選択条件下に置くことができ、結果として得られる特性をこれらの工程のいずれかの間に選択する。
【００７０】
本発明の特定の局面において、細菌を、温度幅約４〜７０℃において生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、特定の温度条件下で培養する。特に、所望の温度で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択された温度で維持する。
【００７１】
本発明の別の特定の局面において、細菌を、恐らくはおよそ５%重量／容積に達するＮａＣｌ又は等価の塩の濃度条件下で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、特定の塩条件下で培養する。特に、所望の塩度で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択された塩分で維持する。
【００７２】
本発明のさらなる特定の好ましい実施態様において、約３〜９．５、好ましくは４〜８のｐＨで生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、細菌を特定のｐＨ条件下で培養する。特に、所望のｐＨで生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択されたｐＨで維持する。
【００７３】
本発明のさらなる特定の実施態様において、好気及び／又は嫌気条件下で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、細菌を特定の酸素化条件下で培養する。特に、所望の条件で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を選択された酸素化条件下で維持する。
【００７４】
本発明のさらなる特定の実施態様において、選択された炭素源の存在において生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、細菌を特定の培養培地中で培養する。特に、所望の炭素源を使用して生存可能である又は増殖することができる細菌を同定又は単離するために、工程ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の間；及び／又は追加工程ｅ）の間に、細菌を培地下で維持する。
【００７５】
上の特徴を個々に又は任意の組み合わせで選択することができることを理解すべきである。例えば、この方法を使用して、所望の温度及び塩分で、又は所望の温度及びｐＨで、又は所望の温度、ｐＨ、及び酸素化条件で生存可能である又は増殖することができる細菌を同定することができる。
【００７６】
さらに、本発明の方法は、例えば、生物学的、遺伝学的、及び／又は化学的のいずれかで、同定又は単離された細菌を、又はそのＤＮＡを、当技術分野においてそれ自体が公知である任意のプロセスにより改変するさらなる工程を含みうる。前記の改変は、例えば、抗生物質活性を改善するために、例えば、前記の細菌の生存、増殖、又は機能を改善することを目的とする。そのような改変工程は、限定なしに、細胞融合、加速進化、ＤＮＡシャッフリング、突然変異誘発、別の株からの真核生物、原核生物、もしくは合成核酸（例、ＤＮＡ）の挿入、又は任意の遺伝子操作技術を含む。改変は、また、細菌においてマーカー遺伝子（例、カナマイシン耐性）を導入する工程を含みうる。
【００７７】
多くの（市販の）抗菌薬は、天然産物の半合成アナログであり、最初の発酵産物の修飾から得られる。これは、ケトライド系（βラクタム群の抗生物質）について当てはまる。抗生物質の生合成に関与する酵素の半合成又はさらには、操作は、従って、最初のヒットを改善するために使用することができる（Von Nusssbaum, 2006, Marsden, 1998）。
【００７８】
したがって、特定の実施態様において、本発明は、選択された活性を有する細菌を産生する方法にある。この方法は、上記の方法のいずれかに従って細菌を単離すること及び前記の細菌を、例えば、遺伝学的、生物学的、又は化学的処理により改変し、前記の活性を改善することを含む。
【００７９】
実施例において例示される通り、本発明の方法によって、二次代謝物（例、抗生物質）を産生するＵＶ耐性細菌の効率的かつ迅速な単離が可能になっている。これらの細菌は以前に公知であったが、治療的又は他の産業的な目的のために抗生物質活性（又は他の二次代謝物）の多様性及びスペクトルを拡大することができる。
【００８０】
本発明のさらなる局面は、従って、また、上で開示する方法により入手可能な細菌、又はその抽出物にある。抽出物は、細胞培養に由来する任意の調製物、例えば上清、ライセート、細胞膜、又はそれに由来し、好ましくは二次代謝物を含む濃縮／精製調製物などでありうる。
【００８１】
細菌は、異なる属、例えばバチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム属、セルロシミクロビウム属、テピヂモナス属、ノカルジア属、ディノコッカス属、トルーペラ属、ポルフィロバクター属、ノボスフィンゴビウム属、エキシグオバクテリウム属、クロモバクテリウム属、アルスロバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、キネオコッカス属、及びウィリアムシア属などに属しうる。
【００８２】
本発明は、また、組換え宿主細胞を産生する方法に関し、方法は、上で定義する方法のいずれか１つに従って細菌を同定又は単離又は産生すること及び遺伝子（又は遺伝子クラスターもしくはオペロン、又は対応する合成もしくは組換え核酸）を、前記の細菌から別の宿主細胞中にクローニングし、それにより組換え宿主細胞を産生することを含む。宿主細胞は、原核又は真核宿主細胞、好ましくは原核宿主細胞でありうる。クローニングを、当技術分野においてそれ自体が公知である技術に従って、例えばクローニングベクター（例、プラスミド、ファージ、細菌染色体など）を使用して行うことができる。好ましい実施態様において、生合成経路の全部又は部分をコードする遺伝子又は遺伝子クラスター（例、そのような経路に関与する酵素をコードする遺伝子）を、同定された細菌より単離し、適切なベクター中にクローニングし、選択された宿主細胞中に挿入し、新たな生合成経路を構築する。
【００８３】
本発明は、また、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を産生する方法に関し、この方法は、上の方法のいずれか１つに従って細菌を同定又は単離又は産生すること（それにおいて前記の細菌は医薬的薬剤を産生する）、及び前記の抗生物質を産生することを含む。医薬的薬剤の産生は、細菌（又はその子孫もしくは派生体）を適した条件下で培養すること及び薬剤を回収又は精製することを含みうる。薬剤の産生は、また、人工合成（例、化学的、組換え、酵素など）を含みうる。
【００８４】
本発明のさらなる目的は、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を、野生型ディノコッカス細菌株を使用して同定、単離、又は産生する方法である。
【００８５】
本発明のさらなる目的は、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を、改変ディノコッカス細菌株を使用して同定、単離、又は産生する方法である。
【００８６】
本発明のさらなる目的は、医薬的薬剤（例えば抗生物質など）を産生するためのディノコッカス細菌の使用にある。
【００８７】
本発明のさらなる目的は、ディノコッカス細菌に由来する抗生物質である。
【００８８】
また、本発明を使用して、細菌を選択し、メタゲノムライブラリーを生成することができる。典型的には、そのような細菌からのゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡの大きなフラグメントをシャトルベクターに（直接的に）クローニングし、前記の細菌を代表するメタゲノムライブラリーを作製する。このメタゲノムライブラリーを異なる宿主細菌中に移して、二次代謝物産生株を同定することができる。例として、ポリケチド産生に関与する酵素を、Ginolhac, 2007に従ってスクリーニングすることができる。
【００８９】
さらに、本発明は、また、微生物を使用する改善された工業的方法に関する。実際に、本発明は、また、潜在的な混入細菌を除去するために、１つ又はいくつかの細胞破壊ＤＮＡ損傷処理を工業的プロセス中の含むことを提案する。実際に、本発明の細菌は、増殖して、そのような細胞破壊処理を生き残ることができるため、後者を、例えば、任意の工業発酵又は培養デバイスもしくは装置において使用し、混入を回避してもよい。この点において、本発明の特定の目的は、また、発酵又は連続培養において上記の方法により入手可能な細菌を使用するプロセスにあり、ここでプロセスは、発酵又は連続培養の開始の前又はそれに続く細菌の照射の工程を含み、他の細菌又は細胞による混入を限定する。本発明のさらなる目的は、発酵又は連続培養においてディノコッカス細菌を使用するプロセスであり、ここでプロセスは、発酵又は連続培養の開始の前又はそれに続く細菌の照射の工程を含み、他の細菌又は細胞による混入を限定する。照射を繰り返し、典型的には、上記の条件下で実施してもよい。
【００９０】
本発明のさらなる局面及び利点が、以下の実施例において開示され、それらは例示的であり、限定的ではないと見なすべきである。本願において引用される全ての参考文献（特許出願、特許、科学刊行物）が、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９１】
実施例
実施例１−代謝物産生細菌を選択するための改善条件の決定
予備工程において、５株を、ＵＶに対するそれらの耐性について試験した。これらの株は、Ｅ． ｃｏｌｉ、ディノコッカス・ラジオパグナンス、ディノコッカス・ラディオデュランス（ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、ディノコッカス属、及びディノコッカス・ゲオサーマリス（ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）であった。
【００９２】
５つの試験株の静止期培養物を、１００から１０−８まで連続希釈した。全ての希釈物を寒天リッチ培地ＴＧＹ（トリプトン１０g/L、グルコース２．５g/L、及び酵母抽出物５g/L）上にスポットし（５μL）、異なるＵＶ処理を適用した：BioLinkクロスリンカー（Vilbert Lourmat）を用いた０mJ/cm2、４mJ/cm2、１７mJ/cm2、４２mJ/cm2、及び１６７mJ/cm2。
【００９３】
下の表１には、異なるＵＶ処理後での細菌密度を提示する。
【００９４】
【表１】
【００９５】
見られる通り、４mJ/cm2の処理によってＥ． ｃｏｌｉの培養において細菌力価が３対数だけ低下する。１７mJ/cm2の処理でもＥ． ｃｏｌｉとディノコッカス細菌の間で区別される。
【００９６】
第２の工程において、土壌懸濁液を、表１の結果に基づき、異なる照射処理に供した。土壌懸濁液を以下の通りに調製した：５gの湿潤土壌を２０mLの蒸留水中に希釈した。ボルテックス及び超音波処理（１分）後、土壌上清を回収し、静止増殖期の３５０μLのＤラジオパグナンス培養物と混合した。一定分量（５０μL）を、抗真菌薬（シクロヘキシミド、１００μg/mL）を含むＴＧＹ寒天上に広げ、異なる繰り返し連続照射処理を試験した：１回の処理、２回の処理、及び３回の処理。４時間の間隔を、各々のＵＶ処理の間で順守した。
【００９７】
図１ａは、０mJ/cm2、４mJ/cm2、及び１７mJ/cm2での１回の暴露後に得られた結果を示す。図１ｂは、４mJ/cm2に対する１、２、及び３回の暴露後に得られた結果を示す。
【００９８】
見られる通り、最善の試験条件は、各々４mJ/cm2のＵＶ照射に対する３回の暴露である。そのような条件は、処理された土壌サンプルから最高量の増殖ディノコッカス細菌を提供する。相当量のディノコッカス細菌が、また、１７mJ/cm2のＵＶ処理に対するサンプルの１回の暴露後に得られる。
【００９９】
実施例２．水サンプルからのＵＶ耐性細菌の単離
水サンプルを、０．２２μmのニトロセルロースフィルター（Millipore, France）上でのろ過により濃縮し、次に、１０mlの滅菌水中に懸濁した。ろ過した溶液を、次に、約６０秒間にわたり超音波処理し、細菌を再懸濁した。
【０１００】
超音波処理に続き、１５０μl〜２mlの懸濁液を、オートクレーブにより滅菌し（１２０℃で２０分）、グルコース（Sigma-Aldrich, France）１g/L、ペプトン（Fluka, France）１０g/L、及び酵母抽出物（Fluka, France）５g/Lを含む固形ＰＧＹ寒天濃縮培養培地上に広げる。播種された培養物は、次に、BLX-E254 biolink（Vilber-Lourmat, France）を使用し、４時間の間隔で行われる各々４mJ/cm2の３回のＵＶ処理を受ける。３０〜５０℃での３〜４日間にわたるインキュベーション後、目的の生存コロニーが目に見えた。
【０１０１】
同定されたコロニーの例を、下の表２中に列挙する。
【０１０２】
実施例３．木及び小石サンプルからのＵＶ耐性細菌の単離
木及び小石サンプルを滅菌水中に浸し、次に、ボルテックスし、約６０秒間にわたり超音波処理した。
【０１０３】
超音波処理に続き、１５０μL〜２mlの懸濁液を、オートクレーブにより滅菌し（１２０℃で２０分）、グルコース（Sigma-Aldrich, France）１g/L、ペプトン（Fluka, France）１０g/L、及び酵母抽出物（Fluka, France）５g/Lを含む固形ＰＧＹ寒天濃縮培養培地上に広げる。播種された培養培地は、次に、BLX-E254 biolink（Vilber-Lourmat, France）を使用し、４時間の間隔で行われる各々４mJ/cm2の３回のＵＶ処理を受ける。３０〜５０℃での３〜４日間にわたるインキュベーション後、目的の生存コロニーが目に見えた。
【０１０４】
同定されたコロニーの例を、下の表２中に列挙する。
【０１０５】
実施例４．石、コケ、地衣、泥、沈澱物、バイオフィルム、土壌、及び動物排泄物からのＵＶ耐性細菌の単離
コケ、地衣、泥、土壌、及び動物排泄物のサンプルを滅菌水（Ｖ／Ｖ）中に懸濁し、次にボルテックスした。サンプルを次に約６０秒間にわたり超音波処理した。
【０１０６】
超音波処理に続き、１５０μL〜２mlの懸濁液を、オートクレーブにより滅菌し（１２０℃で２０分）、グルコース（Sigma-Aldrich, France）１g/L、ペプトン（Fluka, France）１０g/L、及び酵母抽出物（Fluka, France）５g/Lを含む固形ＰＧＹ寒天濃縮培養培地上に広げる。播種された培養培地は、次に、BLX-E254 biolink（Vilber-Lourmat, France）を使用し、４時間の間隔で行われる各々４mJ/cm2の３回のＵＶ処理を受ける。３０〜５０℃での３〜４日間にわたるインキュベーション後、目的の生存コロニーが目に見える。
【０１０７】
同定されたコロニーの例を、表２中に列挙する。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
実施例５．ブレオシン処理されたサンプルからの細菌の単離
ディノコッカス・ラジオパグナンス株ＤＲＨ４０を含む土壌サンプルを、実施例２と同様の条件下で懸濁した。照射の代わりに、懸濁液を、５０μg/ml又は１００μg/mlのブレオシンの非存在（コントロール）又は存在において維持した。
【０１１０】
ブレオシンの非存在において、増殖中のピンクコロニー（ディノコッカス）は観察されず、しかし、常在性細菌叢だけが観察された。５０μg/mlのブレオシンの存在において、常在性細菌叢は劇的に減少し、ピンクコロニーが存在する。同じ現象が１００μg/mlのブレオシンで観察される。
【０１１１】
実施例６．抗生物質産生細菌の同定
表２に開示するＵＶ耐性株を、細菌のいくつかの参照株の増殖を阻害するそれらの能力について試験した。簡単には、発酵を、ペプトン５g/L、酵母抽出物２．５g/L、及びグルコース０．５g/Lを含む１０mlのＰＧＹ培地中で、３０〜５０℃でエアレーション及び撹拌を伴い行った。３日後、試験株の抗生物質産生を制御し、ＬＢ培地上で培養されたいくつかの参照株に対する拡散試験寒天により定量化した。
【０１１２】
ＬＢ：バクトトリプトン１０g/L、酵母抽出物５g/L、塩化ナトリウム１０g/L
ＰＧＹ：ペプトン５g/L、酵母抽出物２．５g/L、グルコース０．５g/L
参照株：
スタフィロコッカス・アウレウスＣＩＰ ７６．２５
エシェリキア・コリＣＩＰ ７６．２４
カンジダ・トロピカリスＣＩＰ １２７５
【０１１３】
結果を下の表３に描写する。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
結果は、抗生物質活性を示すいくつかの株が単離されていることを示す。これらの株は、スタフィロコッカス・アウレウス、エシェリキア・コリ、及び／又はカンジダ・トロピカリスに対して活性である抗生物質活性を産生する。産生株はＵＶに対して耐性であり、上昇温度で増殖することができ、それにより、本発明の方法の有効性を例示する。
【０１１６】
実施例７．抗生物質産生スクリーニングアッセイ
７．２．材料及び方法
培養培地
異なる培地を調製し、抗生物質産生を試験した。
１００mLの溶液Ａは、ＭｎＣｌ２、４Ｈ２Ｏ ０．１g、ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ０．１g、及びＦｅＣｌ３ ０．１gにより構成される。
培地１は、カゼイン５g/L、バクト酵母抽出物３g/Lからのバクトペプトンにより構成され、ｐＨ ７．１に調整される。
培地２は、セロビオース１０g/L、Ｋ２ＨＰＯ４ １g/L、ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ １g/L、ＮａＣｌ １g/L、（ＮＨ４）２ ＳＯ４ ２g/L、ＣａＣＯ３ ２g/Lにより構成され、ｐＨ ７．２に調整される。溶液Ａを１ml/Lで加える。
培地３は、オートミール２０g/L及び１ml/Lの溶液Ａにより構成される。
【０１１７】
試験株の培養調製
株を５mLのＰＧＹ液体培地中に接種した。前培養物を、次に、３０℃又は４５℃で４８時間にわたり１５０rpmでの撹拌下でインキュベートした。
【０１１８】
１５mLガラスチューブ中で、１００μLの前培養物を５mLの培地１〜３中に接種した。培養物を、次に、３０℃又は４５℃で４８時間、９６時間、１６８時間、及び３３６時間にわたり１５０rpmでの撹拌下でインキュベートした。
【０１１９】
標的株の培養調製
標的株は、スタフィロコッカス・アウレウスＣＩＰ７６．２５、エシェリキア・コリＣＩＰ ７６．２４、シュードモナス・エルギノーサＣＩＰ ７６．１１０、ストレプトコッカス・ニューモニエＣＩＰ １０４４８５、及びカンジダ・トロピカリスＤＳＭ １３４６であった。
【０１２０】
それらをＬＢ培地上で、３７℃で１８時間にわたり培養した。次に、１０mLの軟寒天（７g/Lの寒天を伴うＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ培地）に、ペトリ皿中の標的株の前培養物を２%（ｖ／ｖ）で接種した。
【０１２１】
抗生物質産生の評価
３０℃又は４５℃で４８時間、９６時間、１６８時間、及び３３６時間にわたるインキュベーション後、１mL試験培養物を１３０００rpmで３分間にわたり遠心した。上清を、次に、０．２２μmフィルター上でろ過した。１０μLのろ過された培養上清を、標的株を含む軟寒天上に接種した。３７℃で１８時間にわたるインキュベーション後、溶解プラークを観察することができた。
【０１２２】
７．２．結果
表４には、異なる得られた抗生物質プロファイルの例を提示する。キネオコッカス株Ｍ１０−５Ｈは、グラム陽性試験株及びＥ． ｃｏｌｉ ＣＩＰ ７６．２４に対する抗生物質を産生した。ディノコッカス株ＭＣ５−７Ｆは、ＳアウレウスＣＩＰ ７６．２５に対する抗生物質を産生した。ミクロバクテリウム株ＭＡ３−７Ｇは、ＣトロピカリスＣＩＰ １２７５に対する抗生物質を産生し、及びウィリアムシア株ＭＡ３−６Ｂは、グラム陽性試験株及びＰエルギノーサＣＩＰ ７６．１１０に対する抗生物質を産生した。
【０１２３】
【表４】
【０１２４】
【表５】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む、方法。
【請求項２】
サンプルが、環境サンプルである又はそれに由来する、好ましくは、土壌、水、温泉、海洋環境、泥、木、石、コケ、植物抽出物、地衣、生物学的物質、沈殿物、泥炭地、バイオフィルム、工場排液、ガス、砂、油、汚水、又は動物もしくはヒト排泄物より得られる又はそれに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
繰り返し照射処理が、Ｅ． ｃｏｌｉの培養において細菌力価を少なくとも２対数だけ低下させる処理である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
処理が、ＵＶ、ガンマ、及び／又はＸ線照射（単独又は組み合わせのいずれかで）より選択される繰り返し照射、最も好ましくは繰り返しＵＶ照射を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
処理が、１〜８時間、好ましくは３〜５時間、最も好ましくは約４時間の間隔での繰り返し処理を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
処理が、サンプルを少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回のＵＶ処理（各々が０．５〜４００mJ/cm2、より好ましくは１〜２００mJ/cm2、典型的には１〜１００mJ/cm2）に供することを含み、１〜８時間の間隔で行われる、請求項４又は５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ディノコッカス細菌を選択する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）が固形培養培地中で実施される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
工程ｃ）において、コロニーが同定又は単離される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）及びｄ）が、連続的、任意の順番で、又は同時に実施される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）が、工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかの指標細胞に暴露すること、及び、該指標細胞の少なくとも１つの生存、増殖、代謝、移動、ＲＮＡ発現、タンパク質発現、タンパク質分泌、又はウイルス産生に影響を及ぼす細菌を選択することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
方法が、代謝物を単離又は精製するさらなる工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
代謝物が、医薬的化合物、好ましくは、抗生物質、静菌性化合物、抗代謝薬剤、化学療法化合物、抗寄生虫薬剤、抗真菌薬剤、抗ウイルス化合物、サイトカイン活性化合物、又は細胞増殖因子より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
抗生物質又は静菌性化合物を産生する細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理、好ましくは繰り返しＵＶ処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を該処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、参照細菌株に暴露させること、及び、抗生物質活性又は静菌活性を示す細菌を同定又は単離すること
を含む、方法。
【請求項１５】
細菌により産生される抗生物質又は静菌性化合物を単離又は精製する工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
選択された培養条件（例えば培地、栄養分、温度、ｐＨ、塩分、酸素化、共培養、バイオリアクター、又は炭素源など）下で生存可能である又は増殖する細菌を選択する工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
細菌の生存、増殖、又は機能を改善するために、生物学的、遺伝学的、及び／又は化学的のいずれかで、同定又は単離された細菌を改変する工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法により入手可能な細菌、又はその抽出物。
【請求項１９】
バチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム属、セルロシミクロビウム属、テピヂモナス属、ノカルジア属、ディノコッカス属、トルーペラ属、ポルフィロバクター属、ノボスフィンゴビウム属、エキシグオバクテリウム属、クロモバクテリウム属、アルスロバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、キネオコッカス属、又はウィリアムシア属に属する、請求項１８記載の細菌。
【請求項２０】
好ましくは、抗生物質薬剤又は静菌性薬剤又は抗真菌薬剤又は抗寄生虫薬剤又は抗ウイルス薬剤又は抗代謝薬剤又は化学療法薬剤又はサイトカイン活性化合物又は細胞増殖因子より選択される医薬的化合物を産生する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法に従って医薬的化合物産生細菌を同定又は単離すること及び該医薬的化合物を産生することを含む方法。
【請求項２１】
好ましくは、抗生物質薬剤又は静菌性薬剤又は抗寄生虫薬剤又は抗真菌薬剤又は抗ウイルス薬剤又は抗代謝薬剤又は化学療法薬剤又はサイトカイン活性化合物又は細胞増殖因子より選択される医薬的化合物を産生するためのディノコッカス細菌の使用。
【請求項２２】
組換え宿主細胞を産生する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法に従って細菌を同定又は単離すること及び１つ又はいくつかの遺伝子、又は対応する合成もしくは組換え核酸を、別の宿主細胞中の該細菌からクローニングし、それにより組換え宿主細胞を産生することを含む方法。
【請求項１】
代謝物産生細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を前記の処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）代謝物を産生する工程ｃ）の細菌を選択すること
を含む、方法。
【請求項２】
サンプルが、環境サンプルである又はそれに由来する、好ましくは、土壌、水、温泉、海洋環境、泥、木、石、コケ、植物抽出物、地衣、生物学的物質、沈殿物、泥炭地、バイオフィルム、工場排液、ガス、砂、油、汚水、又は動物もしくはヒト排泄物より得られる又はそれに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
繰り返し照射処理が、Ｅ． ｃｏｌｉの培養において細菌力価を少なくとも２対数だけ低下させる処理である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
処理が、ＵＶ、ガンマ、及び／又はＸ線照射（単独又は組み合わせのいずれかで）より選択される繰り返し照射、最も好ましくは繰り返しＵＶ照射を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
処理が、１〜８時間、好ましくは３〜５時間、最も好ましくは約４時間の間隔での繰り返し処理を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
処理が、サンプルを少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回のＵＶ処理（各々が０．５〜４００mJ/cm2、より好ましくは１〜２００mJ/cm2、典型的には１〜１００mJ/cm2）に供することを含み、１〜８時間の間隔で行われる、請求項４又は５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ディノコッカス細菌を選択する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）が固形培養培地中で実施される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
工程ｃ）において、コロニーが同定又は単離される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃ）及びｄ）が、連続的、任意の順番で、又は同時に実施される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）が、工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、１つ又はいくつかの指標細胞に暴露すること、及び、該指標細胞の少なくとも１つの生存、増殖、代謝、移動、ＲＮＡ発現、タンパク質発現、タンパク質分泌、又はウイルス産生に影響を及ぼす細菌を選択することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
方法が、代謝物を単離又は精製するさらなる工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
代謝物が、医薬的化合物、好ましくは、抗生物質、静菌性化合物、抗代謝薬剤、化学療法化合物、抗寄生虫薬剤、抗真菌薬剤、抗ウイルス化合物、サイトカイン活性化合物、又は細胞増殖因子より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
抗生物質又は静菌性化合物を産生する細菌を同定又は単離するための方法であって、方法は以下：
ａ）特徴付けられていない細菌を含むサンプルを提供すること；
ｂ）サンプルを繰り返し照射処理、好ましくは繰り返しＵＶ処理に供すること；
ｃ）生きた又は増殖する細菌を該処理サンプルから同定又は単離すること；及び
ｄ）工程ｃ）の同定又は単離された細菌、あるいはその抽出物を、参照細菌株に暴露させること、及び、抗生物質活性又は静菌活性を示す細菌を同定又は単離すること
を含む、方法。
【請求項１５】
細菌により産生される抗生物質又は静菌性化合物を単離又は精製する工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
選択された培養条件（例えば培地、栄養分、温度、ｐＨ、塩分、酸素化、共培養、バイオリアクター、又は炭素源など）下で生存可能である又は増殖する細菌を選択する工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
細菌の生存、増殖、又は機能を改善するために、生物学的、遺伝学的、及び／又は化学的のいずれかで、同定又は単離された細菌を改変する工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法により入手可能な細菌、又はその抽出物。
【請求項１９】
バチルス属、メチロバクテリウム属、スフィンゴバクテリウム属、セルロシミクロビウム属、テピヂモナス属、ノカルジア属、ディノコッカス属、トルーペラ属、ポルフィロバクター属、ノボスフィンゴビウム属、エキシグオバクテリウム属、クロモバクテリウム属、アルスロバクター属、ロドコッカス属、ミクロバクテリウム属、キネオコッカス属、又はウィリアムシア属に属する、請求項１８記載の細菌。
【請求項２０】
好ましくは、抗生物質薬剤又は静菌性薬剤又は抗真菌薬剤又は抗寄生虫薬剤又は抗ウイルス薬剤又は抗代謝薬剤又は化学療法薬剤又はサイトカイン活性化合物又は細胞増殖因子より選択される医薬的化合物を産生する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法に従って医薬的化合物産生細菌を同定又は単離すること及び該医薬的化合物を産生することを含む方法。
【請求項２１】
好ましくは、抗生物質薬剤又は静菌性薬剤又は抗寄生虫薬剤又は抗真菌薬剤又は抗ウイルス薬剤又は抗代謝薬剤又は化学療法薬剤又はサイトカイン活性化合物又は細胞増殖因子より選択される医薬的化合物を産生するためのディノコッカス細菌の使用。
【請求項２２】
組換え宿主細胞を産生する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法に従って細菌を同定又は単離すること及び１つ又はいくつかの遺伝子、又は対応する合成もしくは組換え核酸を、別の宿主細胞中の該細菌からクローニングし、それにより組換え宿主細胞を産生することを含む方法。
【公表番号】特表２０１２−５１４９９１（Ｐ２０１２−５１４９９１Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４５７５５（Ｐ２０１１−５４５７５５）
【出願日】平成２２年１月１８日（２０１０．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０５１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１８９９
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１１１７４４５４）
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＩＮＯＶＥ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１８日（２０１０．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０５１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１８９９
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１１１７４４５４）
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＩＮＯＶＥ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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