組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法
【課題】培地中のリン酸濃度を制御することで、外来性の遺伝子から組換えタンパク質を容易に製造できる、組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【解決手段】培地中のリン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域とを組み込んだ、組換えタンパク質発現用ベクター。プロモーター領域は、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む。
【解決手段】培地中のリン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域とを組み込んだ、組換えタンパク質発現用ベクター。プロモーター領域は、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地中のリン酸濃度を制御することで組換えタンパク質を容易に製造することができる組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術を用いて、有用なタンパク質が生産されている。遺伝子組換え技術を用いた有用タンパク質生産において、生産性を向上させるためには、遺伝子組換え体を高濃度に培養し、かつ組換え体あたりの発現量を増大させることが必要である。大腸菌や哺乳類細胞において、遺伝子を発現させる主要な調整領域は、転写に関わる領域である。このため、転写に関わる領域に含まれるプロモーターは重要な役割を果たす。大腸菌などの原核生物では、ＲＮＡポリメラーゼが、プロモーターを認識し、この部位に特異的に結合して転写を開始する。
【０００３】
大腸菌を用いて有用タンパク質を生産する際に機能するプロモーターの活性化方法は、2種類に大別される。１つは、組換えタンパク質合成誘導剤を添加する方法である。もう一つは、培地成分から特定の物質を消費する、あるいは除去する方法である。具体的には、前者は、組換えタンパク質合成誘導剤であるイソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加してプロモーターを活性化させて、遺伝子を発現させ、組換えタンパク質を合成する（例えば、非特許文献１参照）。後者は、例えばトリプトファンやグルコースなどの培地中に含まれる栄養源の濃度を低下させることで、プロモーターを活性化させて、遺伝子を発現させ、組換えタンパク質を合成する（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００４】
ＩＰＴＧを添加して活性化されるプロモーターとしては、ｔａｃプロモーターやＴ７プロモーターなどが知られている。Ｔ７プロモーターを用いた組換えタンパク質の生産には、ＤＥ３溶原菌などのＴ７ポリメラーゼを産生する宿主大腸菌を用いる必要がある。一方、Ｔ７プロモーターを用いると、組換えタンパク質の発現量は高いとされている。
【０００５】
しかし、組換えタンパク質合成誘導剤を添加してプロモーターを活性化させる方法では、組換えタンパク質合成誘導剤であるＩＰＴＧが高価である。このため、この方法は、コスト面に問題がある。
【０００６】
培地成分から、特定の物質を消費する、あるいは除去する方法に使用されるプロモーターとしては、ｔｒｐプロモーターやホスホグリセレートキナーゼのプロモーターなどが知られている。
【０００７】
ｔｒｐプロモーターを用いた組換えタンパク質の生産には、通常の大腸菌を宿主として用いることができる。非特許文献２には、ｔｒｐプロモーターを用いると、培地中のトリプトファンを除去することで、組換えタンパク質が生産されることが開示されている。
【０００８】
しかし、トリプトファンは、構成タンパク質および組換えタンパク質の発現において必須のアミノ酸である。このため、培地からトリプトファンを除去することは、タンパク質の生産性や製造されるタンパク質の品質に悪影響を及ぼすおそれがある。
【０００９】
一方、培地にインドールアクリル酸を添加すると、トリプトファンを除去せずに、ｔｒｐプロモーターを稼動させることができる。しかし、上記したＩＰＴＧの添加と同様に、コストの面で問題がある。さらに、インドールアクリル酸は有機溶媒に溶解して添加する必要がある。このため、菌体増殖に悪影響を及ぼす。
【００１０】
また、解糖系の酵素であるホスホグリセレートキナーゼのプロモーターを用いた組換えタンパク質の生産には、酵母を宿主として用いる。非特許文献３には、ホスホグリセレートキナーゼのプロモーターを用いると、グルコース濃度を低濃度に維持することで、組換えタンパク質の発現誘導が可能であることが開示されている。
【００１１】
しかし、グルコースは、菌体構成成分であり、かつエネルギー代謝に必須の成分である。このため、グルコースを培地から除去することは、菌体増殖を抑制することになる。すなわち、グルコースを培地から除去すると、組換えタンパク質の生産性を低下させるおそれがある。
【００１２】
上記したように、非特許文献２、３に記載のプロモーターを用いると、菌体増殖を抑制するので、宿主である菌体を高濃度に培養してから組換えタンパク質の発現量を最大にすることが困難である。
【００１３】
リン酸結合タンパク質を用いて有用物質を製造する方法が提案されている（例えば、特許文献１、非特許文献４参照）。リン酸は、菌体増殖に必須の物質である。しかし、リン酸は、ｔｒｐやグルコースに比べ、菌体増殖に要求される必要量は少ない。また、菌体増殖時には適当なリン酸を添加して、タンパク質生産時にはリン酸濃度を低下させることで対応できる可能性がある。
【００１４】
細胞内へのリン酸の取り込みは、リン酸結合タンパク質を用いて行われる。具体的には、リン酸結合タンパク質は、培地中のリン酸と結合して、細胞質内にリン酸を送り込む。
【００１５】
特許文献１には、リン酸結合タンパク質遺伝子であるｐｈｏＳ、ｐｈｏＴ、ｐｈｏＵの遺伝子（それぞれのプロモーターとリン酸結合タンパク質遺伝子）に係るＤＮＡ断片を連係したプラスミドが開示されている（非特許文献４参照）。特許文献１の実施例では、導入したリン酸結合タンパク質（ｐｈｏＳ、ｐｈｏＴ、ｐｈｏＵのそれぞれのプロモーター下流に存在するリン酸結合タンパク質）が宿主の大腸菌内で発現する。発現したリン酸結合タンパク質により、宿主の大腸菌のｐｈｏＡが活性化される。これによりアルカリホスファターゼが誘発される。ｐｈｏＡは、アルカリホスファターゼのプロモーターを含む遺伝子である。
【００１６】
この文献には、生理活性物質、タンパク質などの二次代謝産物などの生産に利用できることは記載されている。しかし、この文献の実施例では、具体的な外来性の遺伝子を導入して、それが発現して、タンパク質を産生することを確認しているわけではない。具体的には、上記ｐｈｏＳ、ｐｈｏＴ、ｐｈｏＵの遺伝子を有するベクターにより、大腸菌を形質転換する。そして、形質転換された大腸菌自身が本来有するアルカリホスファターゼの発現が誘導されるかどうかで、リン酸結合タンパク質遺伝子が導入されたかどうかを評価しているにすぎない。すなわち、この文献では、生理活性物質、タンパク質などの組換えタンパク質などが実際に生産することを開示していない。
【非特許文献１】イシダら、「遺伝子発現実験マニュアル」、講談社、１９９４年
【非特許文献２】イイジマら、アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ドイツ、スプリンガーリンク（ＳｐｒｉｎｇｅｒＬｉｎｋ）、１９８７年、第２６巻、ｐ．５４２−５４５
【非特許文献３】イイジマら、化学工学論文集、社団法人化学工学会、１９９１年、第１７巻、ｐ．６８０−６８６
【非特許文献４】ミツコ アメムラ（ＭＩＴＳＵＫＯ ＡＭＥＭＵＲＡ）、他４名、「大腸菌のアルカリホスファターゼ調整遺伝子（ｐｈｏＳとｐｈｏＴ）のクローニングと相補性検定（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｓ（ｐｈｏＳ ａｎｄ ｐｈｏＴ） ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ）、米国、アメリカン ソサイティ フォア マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８２、第１５２巻、第２号、ｐ．６９２−７０１
【特許文献１】特公平１−１６１５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、培地中のリン酸濃度を制御することで、外来性の遺伝子から組換えタンパク質を容易に製造できる、組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域とリボソーム結合領域とを組み込んだ組換えタンパク質発現用ベクターとすることで、外来性の遺伝子から組換えタンパク質を容易に製造できる、組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法を提供できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１９】
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターは、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域と、目的タンパク質遺伝子領域とを含む。
【００２０】
前記プロモーター領域は、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む。前記プロモーター領域は、前記コンセンサス配列が２つ結合していると好ましい。さらに、前記プロモーター領域は、配列番号1に記載の配列を含むとよい。
【００２１】
前記リボソーム結合領域は、シャイン・ダルガノ配列を含むと好ましい。
【００２２】
前記目的タンパク質遺伝子は、酵素、生理活性タンパク質、または非生理活性タンパク質の遺伝子であるとよい。
【００２３】
本発明の組換え微生物は、上記組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換されている。また、組換え微生物が、大腸菌であるとよい。
【００２４】
本発明の組換えタンパク質の製造方法は、上記組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物を用いて、培地中のリン酸濃度を制御してタンパク質を製造する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明では、組換えタンパク質発現用ベクター中に、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域を含む。このベクターは、培地中のリン酸濃度が低下すると、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域が活性化される。すなわち、培地中のリン酸濃度を制御することで、組換えタンパク質の発現を制御することができる。
【００２６】
まず、このような組換えタンパク質発現用ベクターを導入された組変え微生物を適当なリン酸濃度のもとで培養すると、組換えタンパク質は発現せず、組換えタンパク質発現用ベクターを入れた菌体が増殖する。次に、組換えタンパク質を発現させる際には、培地中のリン酸濃度を低下させる。これにより、リン酸結合タンパク質遺伝子のプロモーター領域が活性化されて、目的タンパク質遺伝子領域が発現する。この結果、組換えタンパク質を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
［組換えタンパク質発現用ベクター］
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターは、培地中のリン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域と、目的タンパク質遺伝子領域とを含む。
【００２９】
（ベクター）
本発明で用いられるベクターとしては、既知、未知のベクターを使用することができる。また、ｐＵＣ１０８／１０９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＫＮ４１０などの公知のベクターを用いてもよい。
【００３０】
（リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域）
リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域に該当する遺伝子部分は、大腸菌から得る。用いる大腸菌としては、大腸菌Ｋ−１２株由来、中でもＫＬＦ４８／ＫＬ１５９株が好ましい。
【００３１】
まず、上記大腸菌株からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、公知の方法による。例えば、アルカリ法による抽出（ヌクレイック アシッド リサーチ 第７巻、第６号、１５１３−１５２３）、非フェノール性試薬とタンパク質凝集剤を使用し、相配分に基づいて比重の違いにより中間に凝集層を形成させる凝集分配法（新生化学実験講座２ 核酸１ 分離精製 丸善株式会社：１３−５１(１９９１)）などの方法から、適当な方法を選択すればよい。
【００３２】
次に、得られたゲノムＤＮＡから、リン酸結合タンパク質遺伝子ｐｈｏＳ上流域に存在するｐｈｏＢｏｘを含むＤＮＡ配列を得る。具体的には、得られたゲノムＤＮＡを元に、リン酸結合タンパク遺伝子の上流域の５’及び３’末端配列を付加したプライマーを設計してポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行う。
【００３３】
リン酸結合タンパク質は、細胞外からのリン酸の取り込みに関係するタンパク質である。リン酸結合タンパク質は、リン酸と結合して、リン酸を細胞質内に取り込む機能を有している。リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域には、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む。このコンセンサス配列は、ｐｈｏＢｏｘと呼ばれている。
【００３４】
リン酸結合タンパク質のリン酸結合タンパク質遺伝子に対する転写制御は以下のように行われる。リン酸化されたリン酸結合タンパク質は、細胞質内に取り込まれ、上記ｐｈｏＢｏｘに結合する。培地内のリン酸濃度が高い場合は、リン酸化されたリン酸結合タンパク質の量が増加する。これにより細胞質内に取り込まれるリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も増加する。これにより、ｐｈｏＢｏｘに結合するリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も増加する。この結果、リン酸結合タンパク質遺伝子に対する転写が制限される。一方、培地内のリン酸濃度が低い場合は、リン酸化されたリン酸結合タンパク質の量が減少する。これにより細胞質内に取り込まれるリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も減少する。これにより、ｐｈｏＢｏｘに結合するリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も減少する。この結果、リン酸結合タンパク質遺伝子に対する転写が増進される。
【００３５】
本発明では、ｐｈｏＢｏｘを含むプロモーター領域を含むベクターを用いる。この結果、培地中のリン酸濃度を変えることで、プロモーターの活性化・不活性化が行われ、ベクターに組み込まれた組換えタンパク質の発現を制御することができる。
【００３６】
プロモーター領域に含まれるｐｈｏＢｏｘは、１個に限られず、２個あってもよい。ｐｈｏＢｏｘを２個有すれば、培地中のリン酸濃度が減少した場合に、プロモーターの活性化が効果的に行える。この結果、ベクターに組み込まれた組換えタンパク質の発現を向上させることができる。例えば、ｐｈｏＳの遺伝子の上流域には、異なるコンセンサス配列を有するｐｈｏＢｏｘを２個含む。このため、ｐｈｏＳの遺伝子の上流域をプロモーター領域として用いると好ましい。本発明でプロモーター領域として使用できるのは、ｐｈｏＳの遺伝子の上流域に限られない。例えば、ｕｇｐＢなどのリン酸結合タンパク質遺伝子の上流域である、約２００−１０００ｂｐの領域が挙げられる。この上流域においても、ｐｈｏＢｏｘを２個含んでいる。あるいは、ｐｈｏＡ、ｐｈｏＢなどのｐｈｏＢｏｘを１個含んでいるリン酸結合タンパク質遺伝子の上流域から、ｐｈｏＢｏｘを含む部位を任意に選択して連結して用いてもよい。
【００３７】
プロモーター領域は、ｐｈｏＢｏｘを含むものであれば、他の配列を含んでいてもよい。例えば、下記配列番号１に示すｐｈｏＳの遺伝子の上流域を含むものであってもよい。このプロモーター領域には、−ＴＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴ−と、−ＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＴ−の２種類のｐｈｏＢｏｘを含んでいる。
【表１】
【００３８】
（リボソーム結合領域）
リボソーム結合領域は、原核生物のｍＲＮＡにおいて開始コドンの上流に位置する配列であって、リボソームが結合する配列を含む領域をいう。リボソームが結合する配列は、シャイン・ダルガノ配列（Ｓ−Ｄ配列）ともいう。ベクター中にリボソーム結合領域を設けることで、ｍＲＮＡから効率よく翻訳され、組換えタンパク質の発現量を増加させることができる。リボソーム結合領域は、プロモーター領域の下流と、開始コドンの間に設ければよい。
【００３９】
シャイン・ダルガノ配列（Ｓ−Ｄ配列）は、例えば、−ＡＧＧＡＧＧ−のようにプリン塩基（アデニン、グアニン）に富む３〜９塩基の配列をいう。また、プリン塩基に富む配列の５’側には、ピリジミン塩基を含む他の配列を含んでいてもよい。リボソーム結合領域は、具体的には、−ＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴ−や−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡ−（ｐＴ７ベクター由来）などのＳ−Ｄ配列を含む配列が挙げられる。
【００４０】
このように、Ｓ−Ｄ配列の前後には、組換えタンパク質の発現を阻害しない範囲で他の塩基配列を含んでいてもよい。一方、組換えタンパク質の発現量を向上させるには、プロモーターの強さに加えて、プロモーター下流から開始コドンまでの間のＳ−Ｄ配列を含む塩基の塩基数の影響を受ける。プロモーター下流から開始コドンまでの間のＳ−Ｄ配列を含む塩基の塩基数は、特に制限はないが、組換えタンパク質の発現量が向上するように設定すればよい。具体的には、リボソーム結合領域は、塩基数の合計が９〜１５塩基であれば、組換えタンパク質の発現量が最大となる。上記したリボソーム結合領域では、前者が１０塩基、後者が１１塩基であり、塩基数の合計が９〜１５塩基の範囲に含まれる。
【００４１】
（目的タンパク質遺伝子領域）
本発明において、目的タンパク質遺伝子とは、好ましくは酵素、生理活性タンパク質、またはワクチンタンパク質の遺伝子である。発現させる組換えタンパク質の種類は特に制限はない。酵素としては、例えばプロテアーゼやアミラーゼやリパーゼなどが挙げられる。生理活性タンパク質としては、例えば、成長ホルモン、サイトカイン（インターフェロンなど）、増殖因子、細胞骨格タンパク質などの、ヒトや哺乳類が産生するタンパク質などが挙げられる。ワクチンタンパク質としては、種々の疾患に関係する抗原タンパク質や抗原タンパク質の内のエピトープ部分のタンパク質が該当し、例えばＡ型肝炎ウイルスのキャプシドタンパク質やポリオウイルスのキャプシドタンパク質などが挙げられる。あるいは、微生物、植物、昆虫などが産生する酵素や種々のタンパク質であってもよい。
【００４２】
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターには、マルチクローニングサイトを含んでいてもよい。マルチクローニングサイトとは、複数個の制限酵素認識部位を持つ合成二本鎖核酸である。ベクター中にマルチクローニングサイトを組み込んでおくことで、目的タンパク質遺伝子領域である外来遺伝子を容易に導入することができる。
【００４３】
また、本発明の組換えタンパク質発現用ベクターには、転写の終結部位に転写終結領域を設けていてもよい。転写終結領域では、転写終結因子（ρ因子）が転写終了シグナルを認識して、ＲＮＡポリメラーゼ・ＲＮＡ・ＤＮＡ複合体からＲＮＡが乖離して転写が終了する。このような転写終結領域としては、リン酸結合タンパク質をコードする領域の下流の遺伝子配列、ポリアデニル化部位、他のベクターに用いられている転写終結領域などを転用することができる。例えば、リボソーム結合領域に、ｐＴ７ベクター由来のリボソーム結合領域を用いる場合は、ｐＴ７ベクター由来の転写終結領域を使用することができる。
【００４４】
［組換えタンパク質発現用ベクターの作成］
本発明の組換えタンパク質発現ベクターの作製は、定法の遺伝子組換え技術を利用して行う。例えば、リン酸結合タンパク遺伝子の上流域の遺伝子、ＳＤ配列、マルチクローニングサイト、転写終結領域を含む遺伝子とベクターＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、フェノール抽出を行い、各遺伝子を調製する。これらの遺伝子を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行う。遺伝子が導入されたベクターを、大腸菌に形質転換する。この形質転換体をスクリーニングすることにより組換えタンパク質発現用ベクターの構築が可能になる。目的タンパク質遺伝子の導入は、このベクターに対して行う。
【００４５】
上記ベクターは、具体的には、以下のようにして作成する。まず、リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域配列、ＳＤ配列、マルチクローニングサイト、転写終結領域の順序で、ベクターに挿入する。すなわち、リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域のＤＮＡ配列に、ＳＤ配列・マルチクローニングサイト・転写終結領域のＤＮＡ配列をＰＣＲにより挿入する。この遺伝子を用いてさらに、ベクターに組込みが可能なように適切な制限酵素サイトを付与するためにＰＣＲを行う。次に、本遺伝子とベクターＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、フェノール抽出を行い、各遺伝子を調製する。次に、調整された各遺伝子を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする。その後、このようにして得られたベクターを大腸菌に形質転換する。この形質転換体をスクリーニングして、リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域配列が導入されたベクターを選択する。
【００４６】
次に、上記リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域配列が導入されたベクターと目的とするタンパク質遺伝子とを制限酵素で処理する。次に、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行いマルチクローニングサイトに、目的タンパク質遺伝子を導入する。これにより、本発明の組換えタンパク質発現用ベクターが得られる。
【００４７】
［組換え微生物］
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物は、上記組換えタンパク質発現用ベクターを微生物に導入して得る。導入方法としては、通常のベクター導入方法を用いればよい。例えば、塩化カルシウム法で調製したコンピテントセル（前処理によりＤＮＡを取り込む能力が上昇した細菌）と組換えタンパク質発現用ベクターを混合し、４２度で３０−６０秒処理する。この後、この混合液を選択薬剤（アンピシリンなど）を含むプレートに広げ、培養後プレート培地上に形成されるコロニーを回収する方法を用いることができる。その他、エレクトロポレーションによる電気穿孔法などを用いてもよい。
【００４８】
組換え微生物としては、特に制限はないが、大腸菌を用いるのが好ましい。使用できる大腸菌の菌株には特に制限はない。例えば、大腸菌Ｋ１２株、Ｃ２株が適応される。
【００４９】
［組換え微生物の培養方法］
本発明の組換え微生物は、宿主となる微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類からなる培地あるいはそれを改変した培地を用いて公知の培養方法あるいはそれを改変した方法により培養することができる。組換え微生物が大腸菌である場合の培養方法としては、液体培養が好適に使用される。培養温度は、大腸菌が生育可能な温度範囲で培養可能であり、通常は２０℃から４０℃の範囲が好適に用いられる。培養時間は目的とする有用タンパク質の生産にとって最も適切な時間を選ぶことが可能である。
【００５０】
［組換えタンパク質の製造方法］
組換えタンパク質を製造する場合には、上述したようにこれらの菌体が資化可能な炭素源、窒素源に加え、適当な濃度になるようにリン酸を添加して、数時間培養する。その後、リン酸のみを除去する。リン酸濃度の低下により、ｐｈｏＢｏｘを含むプロモーター領域が活性化され、目的タンパク質遺伝子の発現が促進される。この結果、目的タンパク質を製造することができる。
【００５１】
リン酸の除去方法としては、培養液を回収・遠心操作により培地成分を一度除去した後、生理食塩水を用いてスタベーションを行い、リン酸を含まない培地を再度加え、数時間培養する。または膜型バイオリアクターを使用してもよい。すなわち、濾過培養により、リン酸を含む培地を除去しながら、リン酸を含まない培地を添加し、さらに数時間培養する。培養温度は本発明の大腸菌が生育可能な温度範囲で培養可能であり、通常は２０度から４０度の範囲が好適に用いられる。培養時間は目的とする有用タンパク質の生産にとって最も適切な時間を選ぶことが可能である。
【００５２】
例えば、プロモーター領域にｐｈｏ ＳのｐｈｏＢｏｘを含む配列を用いると、培地中のリン酸濃度を１ｍＭ以下にすることで、目的タンパク質を有意に製造することができる。
【００５３】
本発明の組換えタンパク質の製造方法では、組換えタンパク質の製造を制御するのは、リン酸に限られない。例えば、ヘキサメタリン酸などのメタリン酸を用いることもできる。プロモーター領域にｐｈｏ ＳのｐｈｏＢｏｘを含む配列を用いると、培地中のメタリン酸濃度を１ｇ／Ｌ以下にすることで、目的タンパク質を有意に製造することができる。
【実施例】
【００５４】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（実施例１） リン酸結合タンパク遺伝子（ｐｈｏＳ）の上流域遺伝子を含む新規ベクターの構築
（１） 大腸菌Ｋ−１２株のゲノムＤＮＡの調製
大腸菌Ｋ−１２株であるＫＬＦ４８／ＫＬ１５９株（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｃｏｌｉ． ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ ＣＧＳＣ Ｓｔｒａｉｎ＃４３０２）をＴ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で終日培養後、遠心操作により沈殿とし、Ｓｅｐａｇｅｎｅ（三光純薬社製）を用いてゲノムＤＮＡを回収した。
【００５６】
ゲノムＤＮＡの回収は、具体的には、以下のように行った。まず、トリス緩衝液で構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬１を沈殿に添加し、撹拌後室温で１０分間静置した。次にチオシアン酸グアニジンで構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬２を添加してゆるやかに混和した後、吸着剤とクロロホルムで構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬３を添加し激しく混和した。その後、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心操作した。その後、上清を回収し酢酸緩衝液で構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬５を加え、さらにイソプロパノール加え転倒混和した。１２０００ｒｐｍ，１５分遠心後、上清を除去し沈殿物を滅菌蒸留水に溶解した。
【００５７】
（２） リン酸結合タンパク質ｐｈｏＳ上流配列遺伝子の取得
大腸菌Ｋ１２株ゲノム配列情報（ＭＥＤＬＩＮＥ）を元に、以下の配列番号３と４の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号３）
５’−ＴＧＣＧＣＧＧＣＴＧ ＧＴＣＡＡＣＧＴＣＧ−３’
（配列番号４）
５’−ＧＡＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣ−３’
【００５８】
上記（１）より得られたゲノムＤＮＡを０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、１分、プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、下記配列番号１の約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【表２】
【００５９】
次に、下記配列番号５と６の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号５）
５’−ＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧ−３’
（配列番号６）
５’−ＡＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＡＴ−３’
上記アガロースゲルより調製したＤＮＡ断片を０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、１分、プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００６０】
得られたＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られたＤＮＡ断片が大腸菌Ｋ１２株由来の遺伝子をコードする配列であることを確認した。
【００６１】
（３） リン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＳ）上流配列およびＳＤ配列を含む配列を付加したベクターの構築
上記（２）で調製したリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターを用いて、リン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子の３’末にＳＤ配列を付加した。
【００６２】
まず、配列番号５、７に示すセンス側プライマーとアンチセンス側プライマー（ＳＤ配列を有する）を作成した。
（配列番号５）
センス側のプライマー：５’−ＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧ−３’
（配列番号７）
アンチセンス側のプライマー：５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＡＴ−３’
【００６３】
次に、配列番号５と配列番号７のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを実施した。すなわち、上記ベクターＤＮＡを０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、１分、プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００６４】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。ＤＮＡ断片が導入されたベクターを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られたＤＮＡ断片が、配列番号２に示す大腸菌Ｋ１２株由来の遺伝子をコードする配列であることを確認した。
【表３】
【００６５】
上記（２）で調製したリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターおよびタカラバイオ社のｐＢＲ３２２をそれぞれＥｃｏＲＩによる制限酵素処理を行った。ぞれぞれを、アガロースゲル電気泳動を行い、常法に従い遺伝子を切り出した。ｐＢＲ３２２についてはＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ Ｓｈｒｉｍｐ（日本ロシュ社製）による脱リン酸化処理後、リン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子と宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子および新たに付加したＳＤ配列を含む配列をコードする配列であることを確認した。以下では、配列番号２の配列を有するベクターをｐＰｈｏ２と呼ぶ。
【００６６】
（実施例２） イヌＩＦＮ−γ遺伝子の取得
（１） イヌｃＤＮＡの調製
イヌ末梢血よりイヌリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍＬの終濃度で４８時間刺激した。その後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち滅菌した０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μＬにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ ＭｇＣｌ２を２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μＬおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μＬそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを１μＬ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間おいた。この反応液に１μＬのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００６７】
（２） イヌＩＦＮ−γ遺伝子の取得
イヌＩＦＮ−γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ２０００ Ｎｏｖ ２０，１０１５−１０２２）をもとに、配列番号９、１０に示す、２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号９）
５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ−３’
（配列番号１０）
５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＣＧＡＡＡ−３’
【００６８】
上記（１）のイヌリンパ球より得られたｃＤＮＡを０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００６９】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られたＤＮＡ断片が、配列番号８に示すイヌＩＦＮ−γをコードする配列であることを確認した。
【表４】
【００７０】
（３） イヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子の取得
イヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子は、イヌＩＦＮ−γタンパク質のＣ末端を１６残基欠損させたものである。まず、イヌＩＦＮ−γ遺伝子のＮ末端及びＣ末端の塩基配列を基に、配列番号１１、１２に示す、２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号１１）
５’−ＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡ３’−
（配列番号１２）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＴＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＧＡ−３’
【００７１】
上記（１）のイヌリンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（２）と同様にして約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌＩＦＮ−γをコードする配列であることを確認した。
【００７２】
（実施例３） イヌＩＦＮ−γを含む発現ベクターを用いたＳＤ配列を含む配列の最適化検討
実施例２で調製したｐＢＲ３２２中のリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターと、実施例３で調整したイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子とを、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩによる制限酵素処理を行った。次に、これらを宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、次に、このプラスミドＤＮＡを用いて常法に従い大腸菌ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ社より購入）に形質転換した。宿主/ベクターを、ｐＰｈｏ２−γ／ＪＭ１０９、 ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１とする。
【００７３】
得られた２種類の形質転換体を表５に示す培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地（リン酸カリウムなし）で２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、電気泳動し、抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。結果を図１に示す。図１において、一番左側のレーンは、分子量の大きさを示すマーカーを泳動したレーンであり、（１）、（２）のレーンは、ｐＰｈｏ２−γ／ＪＭ１０９、 ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１により生産されたタンパク質を電気泳動させたレーンを示し、ＳＴＤは、標準となるイヌＩＦＮ−γを電気泳動させたレーンを示す。矢印は、イヌＩＦＮ−γの位置を意味する。図１から、ｐＰｈｏ２−γ／ＪＭ１０９及びｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１のいずれを用いても、イヌＩＦＮ−γ変異体が発現することが確認できた。
【表５】
【表６】
【００７４】
（参考例） イヌＩＦＮ−γ変異体を含む他のベクターの構築および発現
実施例２で調製したイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子を含むＴ ｖｅｃｔｏｒ プラスミドＤＮＡを常法に従い調製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、イヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子を調製した。同様に、発現ベクターであるｐＣＷｏｒｉベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、開裂したベクターＤＮＡを調製した。ｐＣＷｏｒｉベクターとイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子を宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに次にこのプラスミドＤＮＡを用いて常法に従い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社製）に形質転換した。各宿主/ベクターを、ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＪＭ１０９、 ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＢＬ２１とした。
【００７５】
得られた２種類の形質転換体をＬＢ培地下で培養し、ＯＤ６００（波長６００ｎｍにおける吸光度）＝０．６で０．２ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、８時間培養した。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、上記実施例３と同様に、電気泳動し抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。その結果、ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＪＭ１０９、 ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＢＬ２１ともに発現を確認できた。これにより、実施例２で調製したイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子は、非特許文献１に記載の方法によっても、発現されることがわかった。
【００７６】
（実施例４） イヌＩＦＮ−γ変異体の発現制御
（１）リン酸濃度の最適化
実施例３で得られたｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、表５の培地条件下リン酸濃度の最適化を行った。すなわち、表５の培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地およびリン酸カリウムを１０ｍＭ，５ｍＭ，１ｍＭ，０．１ｍＭおよび０ｍＭ添加しで２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、実施例３と同様に、電気泳動し抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。結果を図２に示す。図２において、一番左側のレーンは、分子量の大きさを示すマーカーを電気泳動したレーンを示し、レーン（１）、（２）、（３）、（４）、（５）は、それぞれリン酸カリウムの添加量が、０ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭのものを電気泳動したレーンを示す。矢印は、イヌＩＦＮ−γの矢印は、イヌＩＦＮ−γの位置を意味する。図２では、レーン（１）、（２）、（３）、（４）、（５）のいずれにおいても、イヌＩＦＮ−γされたことが確認できた。レーン（４）、（５）は、レーン（１）、（２）、（３）に比べ、イヌＩＦＮ−γの誘導量が少なかった。すなわち、レーン（４）、（５）におけるイヌＩＦＮ−γのイムノブロッティングによる発色が薄かった。このことから、リン酸カリウム濃度が１ｍＭ以下の時有意にイヌＩＦＮ−γが誘導されていることがわかる。
【００７７】
（２） メタリン酸による発現制御
実施例３で得られたｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、表５の培地条件下メタリン酸濃度の最適化を行った。すなわち、表５の培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地およびヘキサメタリン酸ナトリウムを１０ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ，１ｇ／Ｌ，０．１ｇ／Ｌ及び０ｍＭ添加しで２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、ソニケーション処理し、その上清を実施例３と同様にＩＦＮ−γ活性を測定した。結果を図３に示す。図３において、一番左側のレーンは、分子量の大きさを示すマーカーを電気泳動したレーンであり、レーン（１）、（２）は、リン酸カリウムの添加量が、０ｍＭ、１０ｍＭのものを電気泳動したレーンであり、レーン（３）、（４）、（５）、（６）は、ヘキサメタリン酸ナトリウムの添加量が、０．１ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌのものを電気泳動したレーンであり、レーン（７）は、ＳＴＤすなわち、標準となるイヌＩＦＮ−γを電気泳動させたレーンである。矢印は、イヌＩＦＮ−γの位置を意味する。なお、図３の例では、各レーンとも、イヌＩＦＮ−γのイムノブロッティングによる発色が薄かった。その位置を、図中の楕円で囲った部分に示す。各レーンにおける図３では、図３から、ヘキサメタリン酸ナトリウム濃度が１ｇ／Ｌ以下の時有意にイヌＩＦＮ−γが誘導されていることが明らかになった。
【００７８】
（比較例） リン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＡ）上流配列およびＳＤ配列を含む配列を付加したベクターによるイヌＩＦＮ−γ変異体の発現について
実施例１の（１）により得られた大腸菌Ｋ−１２株のゲノムＤＮＡおよび下記に示す配列番号１３および配列番号１４に示すプライマーを用いて、配列番号１５に示すリン酸結合タンパク質ｐｈｏＡ上流配列遺伝子の取得を行った。
（配列番号１３）
５’−ＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧ−３’
（配列番号１４）
５’−ＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＡ−３’
【表７】
【００７９】
得られたｐｈｏＡ遺伝子、下記に示す配列番号１６および配列番号１７を用いて、実施例１の（３）に示すＳＤ配列を含む配列とリン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＡ）上流配列を含むベクターを構築した。
（配列番号１６）
５’−ＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧ−３’
（配列番号１７）
５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣ−３’
【００８０】
さらに、実施例３に示すように、イヌＩＦＮ−γ変異体を含むベクターおよび組換え体を作出した。これらの宿主/ベクターを、ｐＰｈｏＡ−γ／ＪＭ１０９，ｐＰｈｏＡ−γ／ＭＣ１０６１とする。得られた２種類の形質転換体を表５に示す培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地（リン酸カリウムなし）で２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、電気泳動し抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。その結果、両組換え体とも、イヌＩＦＮ−γ変異体の発現はほとんどみられなかった。このことから、ｐｈｏＢｏｘを含まないリン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＡ）上流配列では、リン酸濃度の制御により、組換えタンパク質の製造ができないことがわかった。
【００８１】
（実施例５） ヒトＩＦＮ−β遺伝子の取得
（１） ヒトＩＦＮ−β遺伝子の取得
ヒトＩＦＮ−βのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、下記配列番号１９、２０に示す２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号１９）
５’−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＧＧＡＴ−３’
（配列番号２０）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡＧＡ−３’
【００８２】
ヒトリンパ節ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００８３】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られた、配列番号１８のＤＮＡ断片がヒトＩＦＮ−βをコードする配列であることを確認した。
【表８】
【００８４】
（実施例６） ヒトＩＦＮ−βを含む発現ベクターの作製および発現
実施例２および実施例３で調製したｐＢＲ３２２中のリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターｐＰｈｏ２ベクターおよび実施例５で調整した配列番号１９で示す、ヒトＩＦＮ−β遺伝子を、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩによる制限酵素処理を行った。その後、ｐＰｈｏ２ベクター遺伝子とヒトＩＦＮ−β遺伝子を宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに次にこのプラスミドＤＮＡを用いて常法に従い大腸菌ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ社より購入）に形質転換した。宿主/ベクターを、ｐＰｈｏ２−β／ＪＭ１０９，ｐＰｈｏ２−β／ＭＣ１０６１とする。
【００８５】
得られた２種類の形質転換体を、表５に示す培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加したもので、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地（リン酸カリウムなし）で２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、電気泳動し抗ヒトＩＦＮ−β抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。その結果、ｐＰｈｏ２−β／ＪＭ１０９、ｐＰｈｏ２−β／ＭＣ１０６９のいずれにおいても、ヒトＩＦＮ−βの発現を確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、培地中のリン酸濃度の制御により組換えタンパク質の発現が可能になり、従来までに知られている発現系における高価な各種誘導剤（ＩＰＴＧ、インドールアクリル酸）を使用することなく低コストに組換えタンパク質の提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、実施例３でリン酸結合遺伝子ｐｈｏＳの上流域遺伝子とＳＤ配列を有するベクターを用いて、イヌＩＦＮ−γの発現を検討した結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例３で得られたイヌＩＦＮ−γ形質転換体ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、種々のリン酸濃度を変えた場合の、イヌＩＦＮ−γの発現を検討した結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例３で得られたイヌＩＦＮ−γ形質転換体ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、種々のメタリン酸濃度を変えた場合の、イヌＩＦＮ−γの発現を検討した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地中のリン酸濃度を制御することで組換えタンパク質を容易に製造することができる組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術を用いて、有用なタンパク質が生産されている。遺伝子組換え技術を用いた有用タンパク質生産において、生産性を向上させるためには、遺伝子組換え体を高濃度に培養し、かつ組換え体あたりの発現量を増大させることが必要である。大腸菌や哺乳類細胞において、遺伝子を発現させる主要な調整領域は、転写に関わる領域である。このため、転写に関わる領域に含まれるプロモーターは重要な役割を果たす。大腸菌などの原核生物では、ＲＮＡポリメラーゼが、プロモーターを認識し、この部位に特異的に結合して転写を開始する。
【０００３】
大腸菌を用いて有用タンパク質を生産する際に機能するプロモーターの活性化方法は、2種類に大別される。１つは、組換えタンパク質合成誘導剤を添加する方法である。もう一つは、培地成分から特定の物質を消費する、あるいは除去する方法である。具体的には、前者は、組換えタンパク質合成誘導剤であるイソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加してプロモーターを活性化させて、遺伝子を発現させ、組換えタンパク質を合成する（例えば、非特許文献１参照）。後者は、例えばトリプトファンやグルコースなどの培地中に含まれる栄養源の濃度を低下させることで、プロモーターを活性化させて、遺伝子を発現させ、組換えタンパク質を合成する（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００４】
ＩＰＴＧを添加して活性化されるプロモーターとしては、ｔａｃプロモーターやＴ７プロモーターなどが知られている。Ｔ７プロモーターを用いた組換えタンパク質の生産には、ＤＥ３溶原菌などのＴ７ポリメラーゼを産生する宿主大腸菌を用いる必要がある。一方、Ｔ７プロモーターを用いると、組換えタンパク質の発現量は高いとされている。
【０００５】
しかし、組換えタンパク質合成誘導剤を添加してプロモーターを活性化させる方法では、組換えタンパク質合成誘導剤であるＩＰＴＧが高価である。このため、この方法は、コスト面に問題がある。
【０００６】
培地成分から、特定の物質を消費する、あるいは除去する方法に使用されるプロモーターとしては、ｔｒｐプロモーターやホスホグリセレートキナーゼのプロモーターなどが知られている。
【０００７】
ｔｒｐプロモーターを用いた組換えタンパク質の生産には、通常の大腸菌を宿主として用いることができる。非特許文献２には、ｔｒｐプロモーターを用いると、培地中のトリプトファンを除去することで、組換えタンパク質が生産されることが開示されている。
【０００８】
しかし、トリプトファンは、構成タンパク質および組換えタンパク質の発現において必須のアミノ酸である。このため、培地からトリプトファンを除去することは、タンパク質の生産性や製造されるタンパク質の品質に悪影響を及ぼすおそれがある。
【０００９】
一方、培地にインドールアクリル酸を添加すると、トリプトファンを除去せずに、ｔｒｐプロモーターを稼動させることができる。しかし、上記したＩＰＴＧの添加と同様に、コストの面で問題がある。さらに、インドールアクリル酸は有機溶媒に溶解して添加する必要がある。このため、菌体増殖に悪影響を及ぼす。
【００１０】
また、解糖系の酵素であるホスホグリセレートキナーゼのプロモーターを用いた組換えタンパク質の生産には、酵母を宿主として用いる。非特許文献３には、ホスホグリセレートキナーゼのプロモーターを用いると、グルコース濃度を低濃度に維持することで、組換えタンパク質の発現誘導が可能であることが開示されている。
【００１１】
しかし、グルコースは、菌体構成成分であり、かつエネルギー代謝に必須の成分である。このため、グルコースを培地から除去することは、菌体増殖を抑制することになる。すなわち、グルコースを培地から除去すると、組換えタンパク質の生産性を低下させるおそれがある。
【００１２】
上記したように、非特許文献２、３に記載のプロモーターを用いると、菌体増殖を抑制するので、宿主である菌体を高濃度に培養してから組換えタンパク質の発現量を最大にすることが困難である。
【００１３】
リン酸結合タンパク質を用いて有用物質を製造する方法が提案されている（例えば、特許文献１、非特許文献４参照）。リン酸は、菌体増殖に必須の物質である。しかし、リン酸は、ｔｒｐやグルコースに比べ、菌体増殖に要求される必要量は少ない。また、菌体増殖時には適当なリン酸を添加して、タンパク質生産時にはリン酸濃度を低下させることで対応できる可能性がある。
【００１４】
細胞内へのリン酸の取り込みは、リン酸結合タンパク質を用いて行われる。具体的には、リン酸結合タンパク質は、培地中のリン酸と結合して、細胞質内にリン酸を送り込む。
【００１５】
特許文献１には、リン酸結合タンパク質遺伝子であるｐｈｏＳ、ｐｈｏＴ、ｐｈｏＵの遺伝子（それぞれのプロモーターとリン酸結合タンパク質遺伝子）に係るＤＮＡ断片を連係したプラスミドが開示されている（非特許文献４参照）。特許文献１の実施例では、導入したリン酸結合タンパク質（ｐｈｏＳ、ｐｈｏＴ、ｐｈｏＵのそれぞれのプロモーター下流に存在するリン酸結合タンパク質）が宿主の大腸菌内で発現する。発現したリン酸結合タンパク質により、宿主の大腸菌のｐｈｏＡが活性化される。これによりアルカリホスファターゼが誘発される。ｐｈｏＡは、アルカリホスファターゼのプロモーターを含む遺伝子である。
【００１６】
この文献には、生理活性物質、タンパク質などの二次代謝産物などの生産に利用できることは記載されている。しかし、この文献の実施例では、具体的な外来性の遺伝子を導入して、それが発現して、タンパク質を産生することを確認しているわけではない。具体的には、上記ｐｈｏＳ、ｐｈｏＴ、ｐｈｏＵの遺伝子を有するベクターにより、大腸菌を形質転換する。そして、形質転換された大腸菌自身が本来有するアルカリホスファターゼの発現が誘導されるかどうかで、リン酸結合タンパク質遺伝子が導入されたかどうかを評価しているにすぎない。すなわち、この文献では、生理活性物質、タンパク質などの組換えタンパク質などが実際に生産することを開示していない。
【非特許文献１】イシダら、「遺伝子発現実験マニュアル」、講談社、１９９４年
【非特許文献２】イイジマら、アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ドイツ、スプリンガーリンク（ＳｐｒｉｎｇｅｒＬｉｎｋ）、１９８７年、第２６巻、ｐ．５４２−５４５
【非特許文献３】イイジマら、化学工学論文集、社団法人化学工学会、１９９１年、第１７巻、ｐ．６８０−６８６
【非特許文献４】ミツコ アメムラ（ＭＩＴＳＵＫＯ ＡＭＥＭＵＲＡ）、他４名、「大腸菌のアルカリホスファターゼ調整遺伝子（ｐｈｏＳとｐｈｏＴ）のクローニングと相補性検定（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｓ（ｐｈｏＳ ａｎｄ ｐｈｏＴ） ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ）、米国、アメリカン ソサイティ フォア マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８２、第１５２巻、第２号、ｐ．６９２−７０１
【特許文献１】特公平１−１６１５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、培地中のリン酸濃度を制御することで、外来性の遺伝子から組換えタンパク質を容易に製造できる、組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域とリボソーム結合領域とを組み込んだ組換えタンパク質発現用ベクターとすることで、外来性の遺伝子から組換えタンパク質を容易に製造できる、組換えタンパク質発現用ベクター、組換え微生物、および組換えタンパク質の製造方法を提供できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１９】
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターは、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域と、目的タンパク質遺伝子領域とを含む。
【００２０】
前記プロモーター領域は、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む。前記プロモーター領域は、前記コンセンサス配列が２つ結合していると好ましい。さらに、前記プロモーター領域は、配列番号1に記載の配列を含むとよい。
【００２１】
前記リボソーム結合領域は、シャイン・ダルガノ配列を含むと好ましい。
【００２２】
前記目的タンパク質遺伝子は、酵素、生理活性タンパク質、または非生理活性タンパク質の遺伝子であるとよい。
【００２３】
本発明の組換え微生物は、上記組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換されている。また、組換え微生物が、大腸菌であるとよい。
【００２４】
本発明の組換えタンパク質の製造方法は、上記組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物を用いて、培地中のリン酸濃度を制御してタンパク質を製造する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明では、組換えタンパク質発現用ベクター中に、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域を含む。このベクターは、培地中のリン酸濃度が低下すると、リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域が活性化される。すなわち、培地中のリン酸濃度を制御することで、組換えタンパク質の発現を制御することができる。
【００２６】
まず、このような組換えタンパク質発現用ベクターを導入された組変え微生物を適当なリン酸濃度のもとで培養すると、組換えタンパク質は発現せず、組換えタンパク質発現用ベクターを入れた菌体が増殖する。次に、組換えタンパク質を発現させる際には、培地中のリン酸濃度を低下させる。これにより、リン酸結合タンパク質遺伝子のプロモーター領域が活性化されて、目的タンパク質遺伝子領域が発現する。この結果、組換えタンパク質を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
［組換えタンパク質発現用ベクター］
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターは、培地中のリン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域と、目的タンパク質遺伝子領域とを含む。
【００２９】
（ベクター）
本発明で用いられるベクターとしては、既知、未知のベクターを使用することができる。また、ｐＵＣ１０８／１０９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＫＮ４１０などの公知のベクターを用いてもよい。
【００３０】
（リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域）
リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域に該当する遺伝子部分は、大腸菌から得る。用いる大腸菌としては、大腸菌Ｋ−１２株由来、中でもＫＬＦ４８／ＫＬ１５９株が好ましい。
【００３１】
まず、上記大腸菌株からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、公知の方法による。例えば、アルカリ法による抽出（ヌクレイック アシッド リサーチ 第７巻、第６号、１５１３−１５２３）、非フェノール性試薬とタンパク質凝集剤を使用し、相配分に基づいて比重の違いにより中間に凝集層を形成させる凝集分配法（新生化学実験講座２ 核酸１ 分離精製 丸善株式会社：１３−５１(１９９１)）などの方法から、適当な方法を選択すればよい。
【００３２】
次に、得られたゲノムＤＮＡから、リン酸結合タンパク質遺伝子ｐｈｏＳ上流域に存在するｐｈｏＢｏｘを含むＤＮＡ配列を得る。具体的には、得られたゲノムＤＮＡを元に、リン酸結合タンパク遺伝子の上流域の５’及び３’末端配列を付加したプライマーを設計してポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行う。
【００３３】
リン酸結合タンパク質は、細胞外からのリン酸の取り込みに関係するタンパク質である。リン酸結合タンパク質は、リン酸と結合して、リン酸を細胞質内に取り込む機能を有している。リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域には、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む。このコンセンサス配列は、ｐｈｏＢｏｘと呼ばれている。
【００３４】
リン酸結合タンパク質のリン酸結合タンパク質遺伝子に対する転写制御は以下のように行われる。リン酸化されたリン酸結合タンパク質は、細胞質内に取り込まれ、上記ｐｈｏＢｏｘに結合する。培地内のリン酸濃度が高い場合は、リン酸化されたリン酸結合タンパク質の量が増加する。これにより細胞質内に取り込まれるリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も増加する。これにより、ｐｈｏＢｏｘに結合するリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も増加する。この結果、リン酸結合タンパク質遺伝子に対する転写が制限される。一方、培地内のリン酸濃度が低い場合は、リン酸化されたリン酸結合タンパク質の量が減少する。これにより細胞質内に取り込まれるリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も減少する。これにより、ｐｈｏＢｏｘに結合するリン酸化されたリン酸結合タンパク質の量も減少する。この結果、リン酸結合タンパク質遺伝子に対する転写が増進される。
【００３５】
本発明では、ｐｈｏＢｏｘを含むプロモーター領域を含むベクターを用いる。この結果、培地中のリン酸濃度を変えることで、プロモーターの活性化・不活性化が行われ、ベクターに組み込まれた組換えタンパク質の発現を制御することができる。
【００３６】
プロモーター領域に含まれるｐｈｏＢｏｘは、１個に限られず、２個あってもよい。ｐｈｏＢｏｘを２個有すれば、培地中のリン酸濃度が減少した場合に、プロモーターの活性化が効果的に行える。この結果、ベクターに組み込まれた組換えタンパク質の発現を向上させることができる。例えば、ｐｈｏＳの遺伝子の上流域には、異なるコンセンサス配列を有するｐｈｏＢｏｘを２個含む。このため、ｐｈｏＳの遺伝子の上流域をプロモーター領域として用いると好ましい。本発明でプロモーター領域として使用できるのは、ｐｈｏＳの遺伝子の上流域に限られない。例えば、ｕｇｐＢなどのリン酸結合タンパク質遺伝子の上流域である、約２００−１０００ｂｐの領域が挙げられる。この上流域においても、ｐｈｏＢｏｘを２個含んでいる。あるいは、ｐｈｏＡ、ｐｈｏＢなどのｐｈｏＢｏｘを１個含んでいるリン酸結合タンパク質遺伝子の上流域から、ｐｈｏＢｏｘを含む部位を任意に選択して連結して用いてもよい。
【００３７】
プロモーター領域は、ｐｈｏＢｏｘを含むものであれば、他の配列を含んでいてもよい。例えば、下記配列番号１に示すｐｈｏＳの遺伝子の上流域を含むものであってもよい。このプロモーター領域には、−ＴＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＣＡＡＣＧＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴ−と、−ＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＴ−の２種類のｐｈｏＢｏｘを含んでいる。
【表１】
【００３８】
（リボソーム結合領域）
リボソーム結合領域は、原核生物のｍＲＮＡにおいて開始コドンの上流に位置する配列であって、リボソームが結合する配列を含む領域をいう。リボソームが結合する配列は、シャイン・ダルガノ配列（Ｓ−Ｄ配列）ともいう。ベクター中にリボソーム結合領域を設けることで、ｍＲＮＡから効率よく翻訳され、組換えタンパク質の発現量を増加させることができる。リボソーム結合領域は、プロモーター領域の下流と、開始コドンの間に設ければよい。
【００３９】
シャイン・ダルガノ配列（Ｓ−Ｄ配列）は、例えば、−ＡＧＧＡＧＧ−のようにプリン塩基（アデニン、グアニン）に富む３〜９塩基の配列をいう。また、プリン塩基に富む配列の５’側には、ピリジミン塩基を含む他の配列を含んでいてもよい。リボソーム結合領域は、具体的には、−ＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴ−や−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡ−（ｐＴ７ベクター由来）などのＳ−Ｄ配列を含む配列が挙げられる。
【００４０】
このように、Ｓ−Ｄ配列の前後には、組換えタンパク質の発現を阻害しない範囲で他の塩基配列を含んでいてもよい。一方、組換えタンパク質の発現量を向上させるには、プロモーターの強さに加えて、プロモーター下流から開始コドンまでの間のＳ−Ｄ配列を含む塩基の塩基数の影響を受ける。プロモーター下流から開始コドンまでの間のＳ−Ｄ配列を含む塩基の塩基数は、特に制限はないが、組換えタンパク質の発現量が向上するように設定すればよい。具体的には、リボソーム結合領域は、塩基数の合計が９〜１５塩基であれば、組換えタンパク質の発現量が最大となる。上記したリボソーム結合領域では、前者が１０塩基、後者が１１塩基であり、塩基数の合計が９〜１５塩基の範囲に含まれる。
【００４１】
（目的タンパク質遺伝子領域）
本発明において、目的タンパク質遺伝子とは、好ましくは酵素、生理活性タンパク質、またはワクチンタンパク質の遺伝子である。発現させる組換えタンパク質の種類は特に制限はない。酵素としては、例えばプロテアーゼやアミラーゼやリパーゼなどが挙げられる。生理活性タンパク質としては、例えば、成長ホルモン、サイトカイン（インターフェロンなど）、増殖因子、細胞骨格タンパク質などの、ヒトや哺乳類が産生するタンパク質などが挙げられる。ワクチンタンパク質としては、種々の疾患に関係する抗原タンパク質や抗原タンパク質の内のエピトープ部分のタンパク質が該当し、例えばＡ型肝炎ウイルスのキャプシドタンパク質やポリオウイルスのキャプシドタンパク質などが挙げられる。あるいは、微生物、植物、昆虫などが産生する酵素や種々のタンパク質であってもよい。
【００４２】
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターには、マルチクローニングサイトを含んでいてもよい。マルチクローニングサイトとは、複数個の制限酵素認識部位を持つ合成二本鎖核酸である。ベクター中にマルチクローニングサイトを組み込んでおくことで、目的タンパク質遺伝子領域である外来遺伝子を容易に導入することができる。
【００４３】
また、本発明の組換えタンパク質発現用ベクターには、転写の終結部位に転写終結領域を設けていてもよい。転写終結領域では、転写終結因子（ρ因子）が転写終了シグナルを認識して、ＲＮＡポリメラーゼ・ＲＮＡ・ＤＮＡ複合体からＲＮＡが乖離して転写が終了する。このような転写終結領域としては、リン酸結合タンパク質をコードする領域の下流の遺伝子配列、ポリアデニル化部位、他のベクターに用いられている転写終結領域などを転用することができる。例えば、リボソーム結合領域に、ｐＴ７ベクター由来のリボソーム結合領域を用いる場合は、ｐＴ７ベクター由来の転写終結領域を使用することができる。
【００４４】
［組換えタンパク質発現用ベクターの作成］
本発明の組換えタンパク質発現ベクターの作製は、定法の遺伝子組換え技術を利用して行う。例えば、リン酸結合タンパク遺伝子の上流域の遺伝子、ＳＤ配列、マルチクローニングサイト、転写終結領域を含む遺伝子とベクターＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、フェノール抽出を行い、各遺伝子を調製する。これらの遺伝子を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行う。遺伝子が導入されたベクターを、大腸菌に形質転換する。この形質転換体をスクリーニングすることにより組換えタンパク質発現用ベクターの構築が可能になる。目的タンパク質遺伝子の導入は、このベクターに対して行う。
【００４５】
上記ベクターは、具体的には、以下のようにして作成する。まず、リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域配列、ＳＤ配列、マルチクローニングサイト、転写終結領域の順序で、ベクターに挿入する。すなわち、リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域のＤＮＡ配列に、ＳＤ配列・マルチクローニングサイト・転写終結領域のＤＮＡ配列をＰＣＲにより挿入する。この遺伝子を用いてさらに、ベクターに組込みが可能なように適切な制限酵素サイトを付与するためにＰＣＲを行う。次に、本遺伝子とベクターＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、フェノール抽出を行い、各遺伝子を調製する。次に、調整された各遺伝子を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする。その後、このようにして得られたベクターを大腸菌に形質転換する。この形質転換体をスクリーニングして、リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域配列が導入されたベクターを選択する。
【００４６】
次に、上記リン酸結合タンパク質遺伝子の上流域配列が導入されたベクターと目的とするタンパク質遺伝子とを制限酵素で処理する。次に、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行いマルチクローニングサイトに、目的タンパク質遺伝子を導入する。これにより、本発明の組換えタンパク質発現用ベクターが得られる。
【００４７】
［組換え微生物］
本発明の組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物は、上記組換えタンパク質発現用ベクターを微生物に導入して得る。導入方法としては、通常のベクター導入方法を用いればよい。例えば、塩化カルシウム法で調製したコンピテントセル（前処理によりＤＮＡを取り込む能力が上昇した細菌）と組換えタンパク質発現用ベクターを混合し、４２度で３０−６０秒処理する。この後、この混合液を選択薬剤（アンピシリンなど）を含むプレートに広げ、培養後プレート培地上に形成されるコロニーを回収する方法を用いることができる。その他、エレクトロポレーションによる電気穿孔法などを用いてもよい。
【００４８】
組換え微生物としては、特に制限はないが、大腸菌を用いるのが好ましい。使用できる大腸菌の菌株には特に制限はない。例えば、大腸菌Ｋ１２株、Ｃ２株が適応される。
【００４９】
［組換え微生物の培養方法］
本発明の組換え微生物は、宿主となる微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類からなる培地あるいはそれを改変した培地を用いて公知の培養方法あるいはそれを改変した方法により培養することができる。組換え微生物が大腸菌である場合の培養方法としては、液体培養が好適に使用される。培養温度は、大腸菌が生育可能な温度範囲で培養可能であり、通常は２０℃から４０℃の範囲が好適に用いられる。培養時間は目的とする有用タンパク質の生産にとって最も適切な時間を選ぶことが可能である。
【００５０】
［組換えタンパク質の製造方法］
組換えタンパク質を製造する場合には、上述したようにこれらの菌体が資化可能な炭素源、窒素源に加え、適当な濃度になるようにリン酸を添加して、数時間培養する。その後、リン酸のみを除去する。リン酸濃度の低下により、ｐｈｏＢｏｘを含むプロモーター領域が活性化され、目的タンパク質遺伝子の発現が促進される。この結果、目的タンパク質を製造することができる。
【００５１】
リン酸の除去方法としては、培養液を回収・遠心操作により培地成分を一度除去した後、生理食塩水を用いてスタベーションを行い、リン酸を含まない培地を再度加え、数時間培養する。または膜型バイオリアクターを使用してもよい。すなわち、濾過培養により、リン酸を含む培地を除去しながら、リン酸を含まない培地を添加し、さらに数時間培養する。培養温度は本発明の大腸菌が生育可能な温度範囲で培養可能であり、通常は２０度から４０度の範囲が好適に用いられる。培養時間は目的とする有用タンパク質の生産にとって最も適切な時間を選ぶことが可能である。
【００５２】
例えば、プロモーター領域にｐｈｏ ＳのｐｈｏＢｏｘを含む配列を用いると、培地中のリン酸濃度を１ｍＭ以下にすることで、目的タンパク質を有意に製造することができる。
【００５３】
本発明の組換えタンパク質の製造方法では、組換えタンパク質の製造を制御するのは、リン酸に限られない。例えば、ヘキサメタリン酸などのメタリン酸を用いることもできる。プロモーター領域にｐｈｏ ＳのｐｈｏＢｏｘを含む配列を用いると、培地中のメタリン酸濃度を１ｇ／Ｌ以下にすることで、目的タンパク質を有意に製造することができる。
【実施例】
【００５４】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（実施例１） リン酸結合タンパク遺伝子（ｐｈｏＳ）の上流域遺伝子を含む新規ベクターの構築
（１） 大腸菌Ｋ−１２株のゲノムＤＮＡの調製
大腸菌Ｋ−１２株であるＫＬＦ４８／ＫＬ１５９株（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｃｏｌｉ． ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ ＣＧＳＣ Ｓｔｒａｉｎ＃４３０２）をＴ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で終日培養後、遠心操作により沈殿とし、Ｓｅｐａｇｅｎｅ（三光純薬社製）を用いてゲノムＤＮＡを回収した。
【００５６】
ゲノムＤＮＡの回収は、具体的には、以下のように行った。まず、トリス緩衝液で構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬１を沈殿に添加し、撹拌後室温で１０分間静置した。次にチオシアン酸グアニジンで構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬２を添加してゆるやかに混和した後、吸着剤とクロロホルムで構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬３を添加し激しく混和した。その後、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心操作した。その後、上清を回収し酢酸緩衝液で構成されるＳｅｐａｇｅｎｅの試薬５を加え、さらにイソプロパノール加え転倒混和した。１２０００ｒｐｍ，１５分遠心後、上清を除去し沈殿物を滅菌蒸留水に溶解した。
【００５７】
（２） リン酸結合タンパク質ｐｈｏＳ上流配列遺伝子の取得
大腸菌Ｋ１２株ゲノム配列情報（ＭＥＤＬＩＮＥ）を元に、以下の配列番号３と４の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号３）
５’−ＴＧＣＧＣＧＧＣＴＧ ＧＴＣＡＡＣＧＴＣＧ−３’
（配列番号４）
５’−ＧＡＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣ−３’
【００５８】
上記（１）より得られたゲノムＤＮＡを０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、１分、プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、下記配列番号１の約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【表２】
【００５９】
次に、下記配列番号５と６の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号５）
５’−ＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧ−３’
（配列番号６）
５’−ＡＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＡＴ−３’
上記アガロースゲルより調製したＤＮＡ断片を０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、１分、プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００６０】
得られたＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られたＤＮＡ断片が大腸菌Ｋ１２株由来の遺伝子をコードする配列であることを確認した。
【００６１】
（３） リン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＳ）上流配列およびＳＤ配列を含む配列を付加したベクターの構築
上記（２）で調製したリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターを用いて、リン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子の３’末にＳＤ配列を付加した。
【００６２】
まず、配列番号５、７に示すセンス側プライマーとアンチセンス側プライマー（ＳＤ配列を有する）を作成した。
（配列番号５）
センス側のプライマー：５’−ＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧ−３’
（配列番号７）
アンチセンス側のプライマー：５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＡＴ−３’
【００６３】
次に、配列番号５と配列番号７のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを実施した。すなわち、上記ベクターＤＮＡを０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、１分、プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００６４】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。ＤＮＡ断片が導入されたベクターを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られたＤＮＡ断片が、配列番号２に示す大腸菌Ｋ１２株由来の遺伝子をコードする配列であることを確認した。
【表３】
【００６５】
上記（２）で調製したリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターおよびタカラバイオ社のｐＢＲ３２２をそれぞれＥｃｏＲＩによる制限酵素処理を行った。ぞれぞれを、アガロースゲル電気泳動を行い、常法に従い遺伝子を切り出した。ｐＢＲ３２２についてはＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ Ｓｈｒｉｍｐ（日本ロシュ社製）による脱リン酸化処理後、リン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子と宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子および新たに付加したＳＤ配列を含む配列をコードする配列であることを確認した。以下では、配列番号２の配列を有するベクターをｐＰｈｏ２と呼ぶ。
【００６６】
（実施例２） イヌＩＦＮ−γ遺伝子の取得
（１） イヌｃＤＮＡの調製
イヌ末梢血よりイヌリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍＬの終濃度で４８時間刺激した。その後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち滅菌した０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μＬにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ ＭｇＣｌ２を２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μＬおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μＬそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを１μＬ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間おいた。この反応液に１μＬのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００６７】
（２） イヌＩＦＮ−γ遺伝子の取得
イヌＩＦＮ−γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ２０００ Ｎｏｖ ２０，１０１５−１０２２）をもとに、配列番号９、１０に示す、２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号９）
５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ−３’
（配列番号１０）
５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＣＧＡＡＡ−３’
【００６８】
上記（１）のイヌリンパ球より得られたｃＤＮＡを０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００６９】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られたＤＮＡ断片が、配列番号８に示すイヌＩＦＮ−γをコードする配列であることを確認した。
【表４】
【００７０】
（３） イヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子の取得
イヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子は、イヌＩＦＮ−γタンパク質のＣ末端を１６残基欠損させたものである。まず、イヌＩＦＮ−γ遺伝子のＮ末端及びＣ末端の塩基配列を基に、配列番号１１、１２に示す、２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号１１）
５’−ＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡ３’−
（配列番号１２）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＴＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＧＡ−３’
【００７１】
上記（１）のイヌリンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（２）と同様にして約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌＩＦＮ−γをコードする配列であることを確認した。
【００７２】
（実施例３） イヌＩＦＮ−γを含む発現ベクターを用いたＳＤ配列を含む配列の最適化検討
実施例２で調製したｐＢＲ３２２中のリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターと、実施例３で調整したイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子とを、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩによる制限酵素処理を行った。次に、これらを宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに、次に、このプラスミドＤＮＡを用いて常法に従い大腸菌ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ社より購入）に形質転換した。宿主/ベクターを、ｐＰｈｏ２−γ／ＪＭ１０９、 ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１とする。
【００７３】
得られた２種類の形質転換体を表５に示す培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地（リン酸カリウムなし）で２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、電気泳動し、抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。結果を図１に示す。図１において、一番左側のレーンは、分子量の大きさを示すマーカーを泳動したレーンであり、（１）、（２）のレーンは、ｐＰｈｏ２−γ／ＪＭ１０９、 ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１により生産されたタンパク質を電気泳動させたレーンを示し、ＳＴＤは、標準となるイヌＩＦＮ−γを電気泳動させたレーンを示す。矢印は、イヌＩＦＮ−γの位置を意味する。図１から、ｐＰｈｏ２−γ／ＪＭ１０９及びｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１のいずれを用いても、イヌＩＦＮ−γ変異体が発現することが確認できた。
【表５】
【表６】
【００７４】
（参考例） イヌＩＦＮ−γ変異体を含む他のベクターの構築および発現
実施例２で調製したイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子を含むＴ ｖｅｃｔｏｒ プラスミドＤＮＡを常法に従い調製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、イヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子を調製した。同様に、発現ベクターであるｐＣＷｏｒｉベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、開裂したベクターＤＮＡを調製した。ｐＣＷｏｒｉベクターとイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子を宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに次にこのプラスミドＤＮＡを用いて常法に従い大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社製）に形質転換した。各宿主/ベクターを、ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＪＭ１０９、 ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＢＬ２１とした。
【００７５】
得られた２種類の形質転換体をＬＢ培地下で培養し、ＯＤ６００（波長６００ｎｍにおける吸光度）＝０．６で０．２ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、８時間培養した。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、上記実施例３と同様に、電気泳動し抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。その結果、ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＪＭ１０９、 ｐＣＷｏｒｉ−γ／ＢＬ２１ともに発現を確認できた。これにより、実施例２で調製したイヌＩＦＮ−γ変異体遺伝子は、非特許文献１に記載の方法によっても、発現されることがわかった。
【００７６】
（実施例４） イヌＩＦＮ−γ変異体の発現制御
（１）リン酸濃度の最適化
実施例３で得られたｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、表５の培地条件下リン酸濃度の最適化を行った。すなわち、表５の培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地およびリン酸カリウムを１０ｍＭ，５ｍＭ，１ｍＭ，０．１ｍＭおよび０ｍＭ添加しで２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、実施例３と同様に、電気泳動し抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。結果を図２に示す。図２において、一番左側のレーンは、分子量の大きさを示すマーカーを電気泳動したレーンを示し、レーン（１）、（２）、（３）、（４）、（５）は、それぞれリン酸カリウムの添加量が、０ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭのものを電気泳動したレーンを示す。矢印は、イヌＩＦＮ−γの矢印は、イヌＩＦＮ−γの位置を意味する。図２では、レーン（１）、（２）、（３）、（４）、（５）のいずれにおいても、イヌＩＦＮ−γされたことが確認できた。レーン（４）、（５）は、レーン（１）、（２）、（３）に比べ、イヌＩＦＮ−γの誘導量が少なかった。すなわち、レーン（４）、（５）におけるイヌＩＦＮ−γのイムノブロッティングによる発色が薄かった。このことから、リン酸カリウム濃度が１ｍＭ以下の時有意にイヌＩＦＮ−γが誘導されていることがわかる。
【００７７】
（２） メタリン酸による発現制御
実施例３で得られたｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、表５の培地条件下メタリン酸濃度の最適化を行った。すなわち、表５の培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地およびヘキサメタリン酸ナトリウムを１０ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ，１ｇ／Ｌ，０．１ｇ／Ｌ及び０ｍＭ添加しで２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、ソニケーション処理し、その上清を実施例３と同様にＩＦＮ−γ活性を測定した。結果を図３に示す。図３において、一番左側のレーンは、分子量の大きさを示すマーカーを電気泳動したレーンであり、レーン（１）、（２）は、リン酸カリウムの添加量が、０ｍＭ、１０ｍＭのものを電気泳動したレーンであり、レーン（３）、（４）、（５）、（６）は、ヘキサメタリン酸ナトリウムの添加量が、０．１ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌのものを電気泳動したレーンであり、レーン（７）は、ＳＴＤすなわち、標準となるイヌＩＦＮ−γを電気泳動させたレーンである。矢印は、イヌＩＦＮ−γの位置を意味する。なお、図３の例では、各レーンとも、イヌＩＦＮ−γのイムノブロッティングによる発色が薄かった。その位置を、図中の楕円で囲った部分に示す。各レーンにおける図３では、図３から、ヘキサメタリン酸ナトリウム濃度が１ｇ／Ｌ以下の時有意にイヌＩＦＮ−γが誘導されていることが明らかになった。
【００７８】
（比較例） リン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＡ）上流配列およびＳＤ配列を含む配列を付加したベクターによるイヌＩＦＮ−γ変異体の発現について
実施例１の（１）により得られた大腸菌Ｋ−１２株のゲノムＤＮＡおよび下記に示す配列番号１３および配列番号１４に示すプライマーを用いて、配列番号１５に示すリン酸結合タンパク質ｐｈｏＡ上流配列遺伝子の取得を行った。
（配列番号１３）
５’−ＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧ−３’
（配列番号１４）
５’−ＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＡ−３’
【表７】
【００７９】
得られたｐｈｏＡ遺伝子、下記に示す配列番号１６および配列番号１７を用いて、実施例１の（３）に示すＳＤ配列を含む配列とリン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＡ）上流配列を含むベクターを構築した。
（配列番号１６）
５’−ＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＧ−３’
（配列番号１７）
５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣ−３’
【００８０】
さらに、実施例３に示すように、イヌＩＦＮ−γ変異体を含むベクターおよび組換え体を作出した。これらの宿主/ベクターを、ｐＰｈｏＡ−γ／ＪＭ１０９，ｐＰｈｏＡ−γ／ＭＣ１０６１とする。得られた２種類の形質転換体を表５に示す培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加し、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地（リン酸カリウムなし）で２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、電気泳動し抗イヌＩＦＮ−γ抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。その結果、両組換え体とも、イヌＩＦＮ−γ変異体の発現はほとんどみられなかった。このことから、ｐｈｏＢｏｘを含まないリン酸結合タンパク質遺伝子（ｐｈｏＡ）上流配列では、リン酸濃度の制御により、組換えタンパク質の製造ができないことがわかった。
【００８１】
（実施例５） ヒトＩＦＮ−β遺伝子の取得
（１） ヒトＩＦＮ−β遺伝子の取得
ヒトＩＦＮ−βのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、下記配列番号１９、２０に示す２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。
（配列番号１９）
５’−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＧＧＡＴ−３’
（配列番号２０）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧＴＡＡＧＡ−３’
【００８２】
ヒトリンパ節ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を０．５ｍＬのミクロ遠心チューブに２μＬ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍＬゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μＬとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００８３】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い、その添付プロトコルに従ってパーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて得られた、配列番号１８のＤＮＡ断片がヒトＩＦＮ−βをコードする配列であることを確認した。
【表８】
【００８４】
（実施例６） ヒトＩＦＮ−βを含む発現ベクターの作製および発現
実施例２および実施例３で調製したｐＢＲ３２２中のリン酸結合タンパク質ｐｈｏＳの上流配列遺伝子を含むベクターｐＰｈｏ２ベクターおよび実施例５で調整した配列番号１９で示す、ヒトＩＦＮ−β遺伝子を、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩによる制限酵素処理を行った。その後、ｐＰｈｏ２ベクター遺伝子とヒトＩＦＮ−β遺伝子を宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。さらに次にこのプラスミドＤＮＡを用いて常法に従い大腸菌ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ社より購入）に形質転換した。宿主/ベクターを、ｐＰｈｏ２−β／ＪＭ１０９，ｐＰｈｏ２−β／ＭＣ１０６１とする。
【００８５】
得られた２種類の形質転換体を、表５に示す培地に１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ＝７）を添加したもので、数時間培養した。次に生理食塩水を用いて菌体を洗浄し、表５に示す培地（リン酸カリウムなし）で２０時間培養を行った。得られた菌体を表６に示すバッファーで可溶化後、電気泳動し抗ヒトＩＦＮ−β抗体を用いたイムノブロッティングを実施した。その結果、ｐＰｈｏ２−β／ＪＭ１０９、ｐＰｈｏ２−β／ＭＣ１０６９のいずれにおいても、ヒトＩＦＮ−βの発現を確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、培地中のリン酸濃度の制御により組換えタンパク質の発現が可能になり、従来までに知られている発現系における高価な各種誘導剤（ＩＰＴＧ、インドールアクリル酸）を使用することなく低コストに組換えタンパク質の提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、実施例３でリン酸結合遺伝子ｐｈｏＳの上流域遺伝子とＳＤ配列を有するベクターを用いて、イヌＩＦＮ−γの発現を検討した結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例３で得られたイヌＩＦＮ−γ形質転換体ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、種々のリン酸濃度を変えた場合の、イヌＩＦＮ−γの発現を検討した結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例３で得られたイヌＩＦＮ−γ形質転換体ｐＰｈｏ２−γ／ＭＣ１０６１を用いて、種々のメタリン酸濃度を変えた場合の、イヌＩＦＮ−γの発現を検討した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域と、目的タンパク質遺伝子領域とを含む、組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項２】
前記プロモーター領域は、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む、請求項1に記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項３】
前記プロモーター領域は、前記コンセンサス配列が２つ結合している、請求項2に記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項４】
前記プロモーター領域は、配列番号1に記載の配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項５】
前記リボソーム結合領域は、シャイン・ダルガノ配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項６】
前記目的タンパク質遺伝子は、酵素、生理活性タンパク質、またはワクチンタンパク質の遺伝子である、請求項１〜５のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項８】
前記組換え微生物が、大腸菌である、請求項7に記載の組換え微生物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物を用いて、培地中のリン酸濃度を制御してタンパク質を製造する、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１】
リン酸濃度感受性を有するプロモーター領域と、リボソーム結合領域と、目的タンパク質遺伝子領域とを含む、組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項２】
前記プロモーター領域は、大腸菌のリン酸結合タンパク質遺伝子上流域に存在するコンセンサス配列を含む、請求項1に記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項３】
前記プロモーター領域は、前記コンセンサス配列が２つ結合している、請求項2に記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項４】
前記プロモーター領域は、配列番号1に記載の配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項５】
前記リボソーム結合領域は、シャイン・ダルガノ配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項６】
前記目的タンパク質遺伝子は、酵素、生理活性タンパク質、またはワクチンタンパク質の遺伝子である、請求項１〜５のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項８】
前記組換え微生物が、大腸菌である、請求項7に記載の組換え微生物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の組換えタンパク質発現用ベクターで形質転換された組換え微生物を用いて、培地中のリン酸濃度を制御してタンパク質を製造する、組換えタンパク質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−４５０４３（Ｐ２００９−４５０４３Ａ）
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１６７０７（Ｐ２００７−２１６７０７）
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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