組換えヒトＧ−ＣＳＦの改善されたプロセシング
シグナルペプチドとＧ−ＣＳＦペプチドとを含むＧ−ＣＳＦ前駆体であって、シグナルペプチドが、以下の変異の少なくとも１つを有するヒトＧ−ＣＳＦ／ｂ分子のヒト野生型シグナルペプチドの配列を有する、Ｇ−ＣＳＦ前駆体：Ｇｌｕ２９の欠失、Ｇｌｕ２６の挿入、Ｌｙｓ１１Ｌｅｕの置換、Ｈｉｓ２１Ｐｈｅの置換、及びＧｌｕ２８Ｌｅｕの置換。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒトＧ−ＣＳＦの改善されたプロセシングに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦは、２個の鎖間ジスルフィド結合によって安定化されており、１個のＯ結合型糖質部分を含む、２０ｋＤａの糖タンパク質である。完全Ｇ−ＣＳＦは１７４アミノ酸を有する。Ｇ−ＣＳＦは、骨髄細胞、マクロファージ、及び線維芽細胞によって合成される。その主な機能は、好中性顆粒球及びその前駆細胞の成長分化因子となることである。また、Ｇ−ＣＳＦが成熟好中球を活性化することも当該技術分野で公知である。更に、Ｇ−ＣＳＦは、（他の造血系成長因子と一緒に）その他の種々の造血系前駆細胞の成長／分化を刺激し、内皮細胞の増殖及び移動を促進する。臨床的には、Ｇ−ＣＳＦは、好中性顆粒球レベルの欠乏（例えばがん／化学療法、エイズ、又は骨髄移植により生じる好中球減少症）の処置に用いられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の概要
ヒト同一Ｇ−ＣＳＦを用いて好中球減少症患者を処置するために、ヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをコードするプラスミドをヒトの細胞にトランスフェクトした。選択したクローンの細胞培養上清からＧ−ＣＳＦを精製した後、かなりの量の分泌Ｇ−ＣＳＦでＮ末端が３アミノ酸切断されていることが観察された。この切断は、クローン特異的ではなく、細胞培養条件を変えても取り除くことはできなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この観察に基づき、細胞、特にＨＥＫ２９３Ｆ細胞中でのＧ−ＣＳＦ前駆体タンパク質のプロセシングが正確でないと結論づけた。具体的には、シグナルペプチダーゼ複合体が、シグナルペプチドを生理学的に除去するために予測される位置だけでなく、Ｎ末端切断を生じる更にもう１ヶ所で切断していると結論づけた。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】野生型シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをプログラムＴａｒｇｅｔＰを用いて解析した図である。
【図２】ＳＰ９シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをプログラムＴａｒｇｅｔＰを用いて解析した図である。
【図３】ＳＰ１０シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをプログラムＴａｒｇｅｔＰを用いて解析した図である。
【図４】それぞれ野生型シグナルペプチド、ＳＰ９シグナルペプチド、又はＳＰ１０シグナルペプチドを有する前駆体タンパク質をコードするコンストラクトを用いた、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中での完全Ｇ−ＣＳＦタンパク質の発現を示す図である（野生型の発現レベルを１００％とする）。
【図５】ＳＰ９シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図４ａ〜４ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図６】ＳＰ１０シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図５ａ〜５ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図７】グラノサイト（ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ）のアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図６ａ〜６ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図８】野生型シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図７ａ〜７ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図９】Ｇ−ＣＳＦ ＳＰ９安定トランスフェクションのクローン単離により得られた２つの典型的クローンに対する、全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１０】異なる培養ｐＨで撹拌タンク型反応器中にて培養したクローン１を例に全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン１はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。振盪フラスコ中でのクローン１の参照用培養（ｐＨ調整なし）の全長Ｇ−ＣＳＦの割合を最初の灰色のバーに示す。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１１】異なる培養ｐＨで撹拌タンク型反応器中にて培養したクローン２を例に全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン２はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。振盪フラスコ中でのクローン２の参照用培養（ｐＨ調整なし）の全長Ｇ−ＣＳＦの割合を最初の灰色バーに示す。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１２】培養培地中の種々のインスリン濃度についてクローン２を例に全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン２はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１３】クローン２を例に、培養培地に１５ｍｇ／Ｌのインスリンを添加し、ｐＨを調整せずに大規模高細胞密度モードにて培養して異なる日に回収し、全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン２はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、改変したシグナルペプチド及び対応するＧ−ＣＳＦ前駆体を用いることでＮ末端切断が減少することが見出された。
【０００７】
したがって、一実施形態では、本発明は、シグナルペプチドとＧ−ＣＳＦペプチドとを含むＧ−ＣＳＦ前駆体であって、上記シグナルペプチドが、以下の変異の少なくとも１つを有するヒトＧ−ＣＳＦ／ｂ分子（配列番号４）のヒト野生型シグナルペプチドの配列を有する、Ｇ−ＣＳＦ前駆体を提供する：
Ｇｌｕ２９の欠失、
Ｇｌｕ２６の挿入、
Ｌｙｓ１１Ｌｅｕの置換、
Ｈｉｓ２１Ｐｈｅの置換、及び
Ｇｌｕ２８Ｌｅｕの置換。
【０００８】
好ましい実施形態では、上記Ｇ−ＣＳＦ前駆体は、上記変異の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は５つ全てを有する。
【０００９】
本発明の別の実施形態では、上記Ｇ−ＣＳＦ前駆体は、挿入、欠失、及び置換から選択される更なる変異を３つ以下有する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、本発明のＧ−ＣＳＦ前駆体をコードするポリヌクレオチド及び上記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターのいずれかを含むトランスフェクト細胞である。
【００１２】
好ましい実施形態では、細胞は、真核細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｆ由来細胞である。
【００１３】
一実施形態ではトランスフェクションは一過性であり、別の実施形態ではトランスフェクションは安定である。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、
適切な培養培地中で本発明のトランスフェクト細胞を培養する工程；
上記培養培地からＧ−ＣＳＦを単離する工程
を含む、Ｇ−ＣＳＦを発現する方法である。
【００１５】
好ましい実施形態では、培養は、ｐＨが６．８〜７．５、好ましくは７．１〜７．３、より好ましくは約７．２、で行われる。培養中、ｐＨを調整することが好ましい。
【００１６】
別の実施形態では、培養は、５〜２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｍｌ、のインスリン存在下で行われる。
【００１７】
驚くべきことに、本発明の改変シグナルペプチドを用いると、産生されるＧ−ＣＳＦは切断の割合が非常に低く、好ましくは分子の５％未満、より好ましくは全Ｇ−ＣＳＦの１％未満である。１％が検出限界であると考えられる。
【００１８】
好ましくは、培養培地は無血清培地である。
【００１９】
大部分のＧ−ＣＳＦのグリコシル化パターンは変化しておらず、活性は野生型Ｇ−ＣＳＦと同じである。
【００２０】
したがって、本発明の方法により、医薬品用途に非常に適したＧ−ＣＳＦが製造される。
【実施例１】
【００２１】
実施例１
正確なタンパク質プロセシングのためのＧ−ＣＳＦ前駆体ペプチドの最適化
野生型ヒトＧ−ＣＳＦアイソフォームｂのｃＤＮＡがＧｅｎＢａｎｋデータベースに公開されていた（ＮＭ＿１７２２１９）。ＮＭ＿１７２２１９に由来する任意の配列を有するＧ−ＣＳＦ前駆体タンパク質の基本的に全てが、本発明のシグナルペプチド配列の改変に有用である。例示的な一実施形態では、前駆体タンパク質は、本明細書中に配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿７５７３７３）で示される配列を有する：
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＴＶＱＥＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ
【００２２】
プロセシングを受けていない野生型Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質（配列番号１）は、３０アミノ酸からなるシグナルペプチドを含む２０４アミノ酸を含む。プロセシングは、Ａｌａ３０及びＴｈｒ３１の残基間で起こることが報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿７５７３７３）。
【００２３】
最近の文献に、真核生物シグナルペプチドのコンセンサス配列及びシグナルペプチダーゼ複合体の機能が記載されている（Rapoport, 2007, Nature 450 (29), 663 - 669；Tuteja, 2005, Arch Biochem Biophys 441, 107-111；Dalbey et al., 1997, Protein Science 6, 1129-1138）。
【００２４】
Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドのアミノ酸配列を、上記コンセンサスシグナルペプチドの推定される特徴と比較した。複数のアミノ酸残基が推定されるモデルに適合しないことが見出された。具体的には、シグナルペプチドＣ末端の推定Ａｌａ−Ｘ−Ａｌａモチーフは、正確な切断に必須であると考えられているが、Ｇ−ＣＳＦ前駆体ペプチドでは荷電アミノ酸（Ｇｌｕ２９）によって隔てられていた。更に、荷電残基Ｌｙｓ１１及びＨｉｓ２１が、シグナルペプチドの疎水性領域に位置しているため、モデルの条件に合わない。
【００２５】
野生型Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドを、ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ及びＴａｒｇｅｔＰ（www.cbs.dtu.dk/services；Emanuelsson et al., 2007, Nature Protocols 2, 953-971）を用いてインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）解析した。このソフトウェアにより、プロセシングはＧ−ＣＳＦの正しいＮ末端（Ｔｈｒ３１）に予測されるが、更に他の複数の部位にも予測されることが示された（図１）。しかし、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）部位（Ｇｌｙ３４）におけるプロセシングはこのソフトウェアでは予測されなかった。
【実施例２】
【００２６】
実施例２
野生型Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドを、上記の仮説的シグナルペプチダーゼモデルに関してアミノ酸配列の変化を最小にしてインシリコでモデル化した。得られた切断位置を、ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ及びＴａｒｇｅｔＰを用いて再度解析した。インシリコ設計したモデル中のごく小数、例えばＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦと命名したものが、Ｇ−ＣＳＦプロセシングが正しい位置（Ｔｈｒ３１）でのみ予測され、これを最適化されたシグナルペプチドのヒントとした（ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦの切断部位のインシリコ解析についてはそれぞれ図２及び図３を参照されたい）。複数のそのようなコンストラクトを選んで遺伝子合成した（ドイツ、レーゲンスブルクのジーンアート社（ＧｅｎｅＡｒｔ））。ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦペプチド及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦペプチドをそれぞれコードする合成遺伝子を、真核生物用発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションに用いた。
【実施例３】
【００２７】
実施例３
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ前駆体タンパク質（配列番号１）のシグナルペプチド配列から得る。具体的には、野生型シグナルペプチドの２９位のグルタミン酸（Ｇｌｕ２９）を除去し、２６位に挿入した（Ｇｌｕ２６）。例示的な実施形態では、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質は本明細書中に配列番号２で示す配列を有する：
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＥＴＶＱＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ
【実施例４】
【００２８】
実施例４
ＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質
ＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号１）のシグナルペプチド配列から得る。具体的には、１１位のリジンをロイシンに置換し（Ｌｙｓ１１Ｌｅｕ）、ヒスチジン２１をフェニルアラニンに置換し（Ｈｉｓ２１Ｐｈｅ）、グルタミン２８をロイシンに置換した（Ｇｌｕ２８Ｌｅｕ）。例示的な実施形態では、ＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦペプチドは本明細書中に配列番号３で示す配列を有する：
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＬＬＭＡＬＱＬＬＬＷＦＳＡＬＷＴＶＬＥＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ
【００２９】
シグナルペプチド中には変化があるものの、完全Ｇ−ＣＳＦペプチドは野生型のままであることに留意することが重要である（配列番号１、配列番号２、配列番号３の残基３１〜２０４）。
【実施例５】
【００３０】
実施例５
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＣＦをコードする発現ベクターを用いた一過性トランスフェクション
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ又はＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦをそれぞれコードする発現ベクターでＨＥＫ２９３Ｆ細胞を一過性にトランスフェクトした。３日後に上清を回収した。Ｇ−ＣＳＦの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データから、野生型シグナルペプチドを有するＧ−ＣＳＦに匹敵するか、それよりも高い発現レベルが示された（図４）。
【００３１】
Ｇ−ＣＳＦを高純度に精製した。２種類の産物、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのそれぞれの精製は、プロトコールを改変せずに野生型Ｇ−ＣＳＦと同様に行った。
【実施例６】
【００３２】
実施例６
野生型Ｇ−ＣＳＦ、市販品であるグラノサイト（中外製薬のカナダ特許第１３４１３８９号、ＣＨＯ細胞中で産生されたＧ−ＣＳＦ）、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ、及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端配列をエドマン分解により決定した（ドイツ、マーティンスリート（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）のトップラボ社（ＴｏｐＬａｂ））。驚くべきことに、２種類の発現産物ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのデータは、切断のない正しいＮ末端のみを示していた（図５及び図６）。同じことがグラノサイトでも観察された（図７）。一方、野生型シグナルペプチドを有するＧ−ＣＳＦでは切断が見られ（図８）、また、他の複数の設計コンストラクトでも、インシリコでＳｉｇｎａｌＰ又はＴａｒｇｅｔＰにより１ヶ所のみの切断部位が予測されていたにも関わらず、切断が見られた（不図示）。
【実施例７】
【００３３】
実施例７
細胞増殖アッセイにおいてＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦの活性を測定し、グラノサイトと比較した。ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦの細胞増殖活性はグラノサイトよりも優れていた。
【実施例８】
【００３４】
実施例８
ＧｌｕＣ消化後にＭＡＬＤＩ ＴＯＦペプチドマスフィンガープリント解析を行い、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのグリコシル化を決定した。反射スペクトル（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞によって産生されたＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ又はＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦと野生型Ｇ−ＣＳＦとの間に何ら差を示さなかった。
【実施例９】
【００３５】
実施例９
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦをコードする発現ベクターを用いた安定トランスフェクションにより得られたクローンの評価
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦをコードする発現ベクターで安定にトランスフェクトした。トランスフェクション安定後に均質なクローンを単離した。選択したクローンの上清を異なる発酵規模で解析した。そのために、回収した上清からＧ−ＣＳＦを高純度に精製し、そのアミノ末端配列、グリコシル化パターン、及び活性について評価した。
【００３６】
一過性トランスフェクションのプールから得られたＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦの上清の解析ではＮ末端の３アミノ酸切断は観察されなかったが、いくつかのクローンでは３アミノ酸の切断を完全に抑制できないことが観察された。この影響はクローン依存的であり、更に、培養規模及び培養条件に依存していた。
【００３７】
このクローン依存性（図９）は、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦベクターを得るためのＧ−ＣＳＦシグナルペプチド配列の改変がシグナルペプチドの正確な切断を強く支持していることを示唆している。しかし、１００％正確な切断は依然としてクローン特異的代謝の影響を受ける。
【００３８】
クローン特異的代謝に影響を与えるための主なアプローチは、培養条件の最適化である。
【００３９】
Ｇ−ＣＳＦのシグナルペプチド配列の正確な切断に対する培養ｐＨの影響を、２つの典型的なクローンで評価した。両方のクローンを、実験室規模の撹拌タンク型反応器中でそれぞれｐＨ６．６、６．８、７．０、及び７．２で培養した。Ｇ−ＣＳＦ含有上清を高純度に精製し、そのアミノ末端配列について評価した（図１０及び図１１）。両方の典型的クローンについて、Ｇ−ＣＳＦクローンの細胞培養のｐＨを７．２に調整することで、全長Ｇ−ＣＳＦの割合が９９％を超える、シグナルペプチド配列の正確なプロセシングを達成できることが観察された。９９％を超える値は、シークエンス方法の検出下限である１％に相当する。
【実施例１０】
【００４０】
実施例１０
ｐＨを調整せずに培養培地中のインスリン濃度を変えた振盪フラスコ培養を１つのクローンを例に行った。インスリン濃度は５ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌで変化させた。Ｇ−ＣＳＦ含有上清を高純度に精製し、そのアミノ末端配列について評価した（図１２）。評価したクローンの例において、ｐＨ調整のない培養条件の場合、培養培地中のインスリン濃度を１５〜２０ｍｇ／Ｌに最適化することでシグナルペプチド配列の正確なプロセシングが得られることが観察された。
【００４１】
培地供給に灌流モードを用いた大規模高細胞密度培養を１つのクローンを例について行った。培養のｐＨは調整せず、培養中、６．８〜７．２で変化する。培養培地のインスリン濃度は最適濃度である１５ｍｇ／Ｌに調整した。４つの選択された培養時点、培養６日目、７日目、１７日目、及び２１日目に由来するＧ−ＣＳＦ含有上清を高純度に精製し、そのアミノ末端配列について評価した（図１３）。細胞密度及びＧ−ＣＳＦの生産性に依存せず、解析した全ての上清で、全長Ｇ−ＣＳＦが９９％を超えるシグナルペプチド配列の正確なプロセシングが達成された。したがって、最適化されたインスリン濃度１５ｍｇ／Ｌの添加は、大規模高細胞密度培養においてＮ末端の切断を回避するのに有効である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒトＧ−ＣＳＦの改善されたプロセシングに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦは、２個の鎖間ジスルフィド結合によって安定化されており、１個のＯ結合型糖質部分を含む、２０ｋＤａの糖タンパク質である。完全Ｇ−ＣＳＦは１７４アミノ酸を有する。Ｇ−ＣＳＦは、骨髄細胞、マクロファージ、及び線維芽細胞によって合成される。その主な機能は、好中性顆粒球及びその前駆細胞の成長分化因子となることである。また、Ｇ−ＣＳＦが成熟好中球を活性化することも当該技術分野で公知である。更に、Ｇ−ＣＳＦは、（他の造血系成長因子と一緒に）その他の種々の造血系前駆細胞の成長／分化を刺激し、内皮細胞の増殖及び移動を促進する。臨床的には、Ｇ−ＣＳＦは、好中性顆粒球レベルの欠乏（例えばがん／化学療法、エイズ、又は骨髄移植により生じる好中球減少症）の処置に用いられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の概要
ヒト同一Ｇ−ＣＳＦを用いて好中球減少症患者を処置するために、ヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをコードするプラスミドをヒトの細胞にトランスフェクトした。選択したクローンの細胞培養上清からＧ−ＣＳＦを精製した後、かなりの量の分泌Ｇ−ＣＳＦでＮ末端が３アミノ酸切断されていることが観察された。この切断は、クローン特異的ではなく、細胞培養条件を変えても取り除くことはできなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この観察に基づき、細胞、特にＨＥＫ２９３Ｆ細胞中でのＧ−ＣＳＦ前駆体タンパク質のプロセシングが正確でないと結論づけた。具体的には、シグナルペプチダーゼ複合体が、シグナルペプチドを生理学的に除去するために予測される位置だけでなく、Ｎ末端切断を生じる更にもう１ヶ所で切断していると結論づけた。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】野生型シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをプログラムＴａｒｇｅｔＰを用いて解析した図である。
【図２】ＳＰ９シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをプログラムＴａｒｇｅｔＰを用いて解析した図である。
【図３】ＳＰ１０シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦをプログラムＴａｒｇｅｔＰを用いて解析した図である。
【図４】それぞれ野生型シグナルペプチド、ＳＰ９シグナルペプチド、又はＳＰ１０シグナルペプチドを有する前駆体タンパク質をコードするコンストラクトを用いた、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中での完全Ｇ−ＣＳＦタンパク質の発現を示す図である（野生型の発現レベルを１００％とする）。
【図５】ＳＰ９シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図４ａ〜４ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図６】ＳＰ１０シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図５ａ〜５ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図７】グラノサイト（ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ）のアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図６ａ〜６ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図８】野生型シグナルペプチドを有するヒト野生型Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のアミノ酸シークエンシング（エドマン分解）のクロマトグラムを示す図である。図７ａ〜７ｅは残基１〜５に対応する。アミノ酸配列解析の概要を下の表に示す。
【図９】Ｇ−ＣＳＦ ＳＰ９安定トランスフェクションのクローン単離により得られた２つの典型的クローンに対する、全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１０】異なる培養ｐＨで撹拌タンク型反応器中にて培養したクローン１を例に全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン１はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。振盪フラスコ中でのクローン１の参照用培養（ｐＨ調整なし）の全長Ｇ−ＣＳＦの割合を最初の灰色のバーに示す。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１１】異なる培養ｐＨで撹拌タンク型反応器中にて培養したクローン２を例に全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン２はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。振盪フラスコ中でのクローン２の参照用培養（ｐＨ調整なし）の全長Ｇ−ＣＳＦの割合を最初の灰色バーに示す。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１２】培養培地中の種々のインスリン濃度についてクローン２を例に全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン２はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【図１３】クローン２を例に、培養培地に１５ｍｇ／Ｌのインスリンを添加し、ｐＨを調整せずに大規模高細胞密度モードにて培養して異なる日に回収し、全長Ｇ−ＣＳＦの割合を比較した図である。クローン２はＧ−ＣＳＦ ＳＰ９ベクター安定トランスフェクションのクローン単離により得られた。残った非全長画分にはＮ末端が３アミノ酸切断されたＧ−ＣＳＦが主に含まれる。全長Ｇ−ＣＳＦの割合９９％のラインが、Ｎ末端切断が１％以下であることに関連し、これが解析の検出下限である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、改変したシグナルペプチド及び対応するＧ−ＣＳＦ前駆体を用いることでＮ末端切断が減少することが見出された。
【０００７】
したがって、一実施形態では、本発明は、シグナルペプチドとＧ−ＣＳＦペプチドとを含むＧ−ＣＳＦ前駆体であって、上記シグナルペプチドが、以下の変異の少なくとも１つを有するヒトＧ−ＣＳＦ／ｂ分子（配列番号４）のヒト野生型シグナルペプチドの配列を有する、Ｇ−ＣＳＦ前駆体を提供する：
Ｇｌｕ２９の欠失、
Ｇｌｕ２６の挿入、
Ｌｙｓ１１Ｌｅｕの置換、
Ｈｉｓ２１Ｐｈｅの置換、及び
Ｇｌｕ２８Ｌｅｕの置換。
【０００８】
好ましい実施形態では、上記Ｇ−ＣＳＦ前駆体は、上記変異の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は５つ全てを有する。
【０００９】
本発明の別の実施形態では、上記Ｇ−ＣＳＦ前駆体は、挿入、欠失、及び置換から選択される更なる変異を３つ以下有する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、本発明のＧ−ＣＳＦ前駆体をコードするポリヌクレオチド及び上記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターのいずれかを含むトランスフェクト細胞である。
【００１２】
好ましい実施形態では、細胞は、真核細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｆ由来細胞である。
【００１３】
一実施形態ではトランスフェクションは一過性であり、別の実施形態ではトランスフェクションは安定である。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、
適切な培養培地中で本発明のトランスフェクト細胞を培養する工程；
上記培養培地からＧ−ＣＳＦを単離する工程
を含む、Ｇ−ＣＳＦを発現する方法である。
【００１５】
好ましい実施形態では、培養は、ｐＨが６．８〜７．５、好ましくは７．１〜７．３、より好ましくは約７．２、で行われる。培養中、ｐＨを調整することが好ましい。
【００１６】
別の実施形態では、培養は、５〜２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｍｌ、のインスリン存在下で行われる。
【００１７】
驚くべきことに、本発明の改変シグナルペプチドを用いると、産生されるＧ−ＣＳＦは切断の割合が非常に低く、好ましくは分子の５％未満、より好ましくは全Ｇ−ＣＳＦの１％未満である。１％が検出限界であると考えられる。
【００１８】
好ましくは、培養培地は無血清培地である。
【００１９】
大部分のＧ−ＣＳＦのグリコシル化パターンは変化しておらず、活性は野生型Ｇ−ＣＳＦと同じである。
【００２０】
したがって、本発明の方法により、医薬品用途に非常に適したＧ−ＣＳＦが製造される。
【実施例１】
【００２１】
実施例１
正確なタンパク質プロセシングのためのＧ−ＣＳＦ前駆体ペプチドの最適化
野生型ヒトＧ−ＣＳＦアイソフォームｂのｃＤＮＡがＧｅｎＢａｎｋデータベースに公開されていた（ＮＭ＿１７２２１９）。ＮＭ＿１７２２１９に由来する任意の配列を有するＧ−ＣＳＦ前駆体タンパク質の基本的に全てが、本発明のシグナルペプチド配列の改変に有用である。例示的な一実施形態では、前駆体タンパク質は、本明細書中に配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿７５７３７３）で示される配列を有する：
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＴＶＱＥＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ
【００２２】
プロセシングを受けていない野生型Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質（配列番号１）は、３０アミノ酸からなるシグナルペプチドを含む２０４アミノ酸を含む。プロセシングは、Ａｌａ３０及びＴｈｒ３１の残基間で起こることが報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿７５７３７３）。
【００２３】
最近の文献に、真核生物シグナルペプチドのコンセンサス配列及びシグナルペプチダーゼ複合体の機能が記載されている（Rapoport, 2007, Nature 450 (29), 663 - 669；Tuteja, 2005, Arch Biochem Biophys 441, 107-111；Dalbey et al., 1997, Protein Science 6, 1129-1138）。
【００２４】
Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドのアミノ酸配列を、上記コンセンサスシグナルペプチドの推定される特徴と比較した。複数のアミノ酸残基が推定されるモデルに適合しないことが見出された。具体的には、シグナルペプチドＣ末端の推定Ａｌａ−Ｘ−Ａｌａモチーフは、正確な切断に必須であると考えられているが、Ｇ−ＣＳＦ前駆体ペプチドでは荷電アミノ酸（Ｇｌｕ２９）によって隔てられていた。更に、荷電残基Ｌｙｓ１１及びＨｉｓ２１が、シグナルペプチドの疎水性領域に位置しているため、モデルの条件に合わない。
【００２５】
野生型Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドを、ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ及びＴａｒｇｅｔＰ（www.cbs.dtu.dk/services；Emanuelsson et al., 2007, Nature Protocols 2, 953-971）を用いてインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）解析した。このソフトウェアにより、プロセシングはＧ−ＣＳＦの正しいＮ末端（Ｔｈｒ３１）に予測されるが、更に他の複数の部位にも予測されることが示された（図１）。しかし、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）部位（Ｇｌｙ３４）におけるプロセシングはこのソフトウェアでは予測されなかった。
【実施例２】
【００２６】
実施例２
野生型Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドを、上記の仮説的シグナルペプチダーゼモデルに関してアミノ酸配列の変化を最小にしてインシリコでモデル化した。得られた切断位置を、ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ及びＴａｒｇｅｔＰを用いて再度解析した。インシリコ設計したモデル中のごく小数、例えばＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦと命名したものが、Ｇ−ＣＳＦプロセシングが正しい位置（Ｔｈｒ３１）でのみ予測され、これを最適化されたシグナルペプチドのヒントとした（ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦの切断部位のインシリコ解析についてはそれぞれ図２及び図３を参照されたい）。複数のそのようなコンストラクトを選んで遺伝子合成した（ドイツ、レーゲンスブルクのジーンアート社（ＧｅｎｅＡｒｔ））。ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦペプチド及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦペプチドをそれぞれコードする合成遺伝子を、真核生物用発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションに用いた。
【実施例３】
【００２７】
実施例３
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ前駆体タンパク質（配列番号１）のシグナルペプチド配列から得る。具体的には、野生型シグナルペプチドの２９位のグルタミン酸（Ｇｌｕ２９）を除去し、２６位に挿入した（Ｇｌｕ２６）。例示的な実施形態では、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質は本明細書中に配列番号２で示す配列を有する：
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＫＬＭＡＬＱＬＬＬＷＨＳＡＬＷＥＴＶＱＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ
【実施例４】
【００２８】
実施例４
ＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質
ＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦ前駆体タンパク質は、野生型ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号１）のシグナルペプチド配列から得る。具体的には、１１位のリジンをロイシンに置換し（Ｌｙｓ１１Ｌｅｕ）、ヒスチジン２１をフェニルアラニンに置換し（Ｈｉｓ２１Ｐｈｅ）、グルタミン２８をロイシンに置換した（Ｇｌｕ２８Ｌｅｕ）。例示的な実施形態では、ＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦペプチドは本明細書中に配列番号３で示す配列を有する：
ＭＡＧＰＡＴＱＳＰＭＬＬＭＡＬＱＬＬＬＷＦＳＡＬＷＴＶＬＥＡＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ
【００２９】
シグナルペプチド中には変化があるものの、完全Ｇ−ＣＳＦペプチドは野生型のままであることに留意することが重要である（配列番号１、配列番号２、配列番号３の残基３１〜２０４）。
【実施例５】
【００３０】
実施例５
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＣＦをコードする発現ベクターを用いた一過性トランスフェクション
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ又はＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦをそれぞれコードする発現ベクターでＨＥＫ２９３Ｆ細胞を一過性にトランスフェクトした。３日後に上清を回収した。Ｇ−ＣＳＦの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。データから、野生型シグナルペプチドを有するＧ−ＣＳＦに匹敵するか、それよりも高い発現レベルが示された（図４）。
【００３１】
Ｇ−ＣＳＦを高純度に精製した。２種類の産物、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのそれぞれの精製は、プロトコールを改変せずに野生型Ｇ−ＣＳＦと同様に行った。
【実施例６】
【００３２】
実施例６
野生型Ｇ−ＣＳＦ、市販品であるグラノサイト（中外製薬のカナダ特許第１３４１３８９号、ＣＨＯ細胞中で産生されたＧ−ＣＳＦ）、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ、及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端配列をエドマン分解により決定した（ドイツ、マーティンスリート（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）のトップラボ社（ＴｏｐＬａｂ））。驚くべきことに、２種類の発現産物ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのデータは、切断のない正しいＮ末端のみを示していた（図５及び図６）。同じことがグラノサイトでも観察された（図７）。一方、野生型シグナルペプチドを有するＧ−ＣＳＦでは切断が見られ（図８）、また、他の複数の設計コンストラクトでも、インシリコでＳｉｇｎａｌＰ又はＴａｒｇｅｔＰにより１ヶ所のみの切断部位が予測されていたにも関わらず、切断が見られた（不図示）。
【実施例７】
【００３３】
実施例７
細胞増殖アッセイにおいてＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦの活性を測定し、グラノサイトと比較した。ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦの細胞増殖活性はグラノサイトよりも優れていた。
【実施例８】
【００３４】
実施例８
ＧｌｕＣ消化後にＭＡＬＤＩ ＴＯＦペプチドマスフィンガープリント解析を行い、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ及びＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦのグリコシル化を決定した。反射スペクトル（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞によって産生されたＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦ又はＳＰ１０ Ｇ−ＣＳＦと野生型Ｇ−ＣＳＦとの間に何ら差を示さなかった。
【実施例９】
【００３５】
実施例９
ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦをコードする発現ベクターを用いた安定トランスフェクションにより得られたクローンの評価
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦをコードする発現ベクターで安定にトランスフェクトした。トランスフェクション安定後に均質なクローンを単離した。選択したクローンの上清を異なる発酵規模で解析した。そのために、回収した上清からＧ−ＣＳＦを高純度に精製し、そのアミノ末端配列、グリコシル化パターン、及び活性について評価した。
【００３６】
一過性トランスフェクションのプールから得られたＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦの上清の解析ではＮ末端の３アミノ酸切断は観察されなかったが、いくつかのクローンでは３アミノ酸の切断を完全に抑制できないことが観察された。この影響はクローン依存的であり、更に、培養規模及び培養条件に依存していた。
【００３７】
このクローン依存性（図９）は、ＳＰ９ Ｇ−ＣＳＦベクターを得るためのＧ−ＣＳＦシグナルペプチド配列の改変がシグナルペプチドの正確な切断を強く支持していることを示唆している。しかし、１００％正確な切断は依然としてクローン特異的代謝の影響を受ける。
【００３８】
クローン特異的代謝に影響を与えるための主なアプローチは、培養条件の最適化である。
【００３９】
Ｇ−ＣＳＦのシグナルペプチド配列の正確な切断に対する培養ｐＨの影響を、２つの典型的なクローンで評価した。両方のクローンを、実験室規模の撹拌タンク型反応器中でそれぞれｐＨ６．６、６．８、７．０、及び７．２で培養した。Ｇ−ＣＳＦ含有上清を高純度に精製し、そのアミノ末端配列について評価した（図１０及び図１１）。両方の典型的クローンについて、Ｇ−ＣＳＦクローンの細胞培養のｐＨを７．２に調整することで、全長Ｇ−ＣＳＦの割合が９９％を超える、シグナルペプチド配列の正確なプロセシングを達成できることが観察された。９９％を超える値は、シークエンス方法の検出下限である１％に相当する。
【実施例１０】
【００４０】
実施例１０
ｐＨを調整せずに培養培地中のインスリン濃度を変えた振盪フラスコ培養を１つのクローンを例に行った。インスリン濃度は５ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌで変化させた。Ｇ−ＣＳＦ含有上清を高純度に精製し、そのアミノ末端配列について評価した（図１２）。評価したクローンの例において、ｐＨ調整のない培養条件の場合、培養培地中のインスリン濃度を１５〜２０ｍｇ／Ｌに最適化することでシグナルペプチド配列の正確なプロセシングが得られることが観察された。
【００４１】
培地供給に灌流モードを用いた大規模高細胞密度培養を１つのクローンを例について行った。培養のｐＨは調整せず、培養中、６．８〜７．２で変化する。培養培地のインスリン濃度は最適濃度である１５ｍｇ／Ｌに調整した。４つの選択された培養時点、培養６日目、７日目、１７日目、及び２１日目に由来するＧ−ＣＳＦ含有上清を高純度に精製し、そのアミノ末端配列について評価した（図１３）。細胞密度及びＧ−ＣＳＦの生産性に依存せず、解析した全ての上清で、全長Ｇ−ＣＳＦが９９％を超えるシグナルペプチド配列の正確なプロセシングが達成された。したがって、最適化されたインスリン濃度１５ｍｇ／Ｌの添加は、大規模高細胞密度培養においてＮ末端の切断を回避するのに有効である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルペプチドとＧ−ＣＳＦペプチドとを含むＧ−ＣＳＦ前駆体であって、前記シグナルペプチドが、以下の変異の少なくとも１つを有するヒトＧ−ＣＳＦ／ｂ分子のヒト野生型シグナルペプチドの配列を有する、Ｇ−ＣＳＦ前駆体：
Ｇｌｕ２９の欠失、
Ｇｌｕ２６の挿入、
Ｌｙｓ１１Ｌｅｕの置換、
Ｈｉｓ２１Ｐｈｅの置換、及び
Ｇｌｕ２８Ｌｅｕの置換。
【請求項２】
請求項１に記載の変異の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は５つを有する、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦ前駆体。
【請求項３】
前記シグナルペプチド中に、挿入、欠失、及び置換から選択される更なる変異を３つ以下有する、請求項１又は請求項２に記載のＧ−ＣＳＦ前駆体。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のＧ−ＣＳＦ前駆体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項４若しくは請求項５に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６に記載のベクターを含むトランスフェクト細胞。
【請求項８】
前記細胞が真核細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３Ｆ細胞である、請求項７に記載のトランスフェクト細胞。
【請求項９】
トランスフェクションが一過性である、請求項７又は請求項８に記載のトランスフェクト細胞。
【請求項１０】
トランスフェクションが安定である、請求項７又は請求項８に記載のトランスフェクト細胞。
【請求項１１】
請求項７〜請求項１０のいずれか一項に記載のトランスフェクト細胞を適切な培養培地中で培養する工程；
前記培養培地からＧ−ＣＳＦを単離する工程
を含む、Ｇ−ＣＳＦを発現させる方法。
【請求項１２】
培養が、ｐＨ６．８〜７．５、好ましくはｐＨ７．１〜７．３、で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
培養が、５〜２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｍｌ、のインスリン存在下で行われる、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養培地が無血清である、請求項１１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
シグナルペプチドとＧ−ＣＳＦペプチドとを含むＧ−ＣＳＦ前駆体であって、前記シグナルペプチドが、以下の変異の少なくとも１つを有するヒトＧ−ＣＳＦ／ｂ分子のヒト野生型シグナルペプチドの配列を有する、Ｇ−ＣＳＦ前駆体：
Ｇｌｕ２９の欠失、
Ｇｌｕ２６の挿入、
Ｌｙｓ１１Ｌｅｕの置換、
Ｈｉｓ２１Ｐｈｅの置換、及び
Ｇｌｕ２８Ｌｅｕの置換。
【請求項２】
請求項１に記載の変異の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は５つを有する、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦ前駆体。
【請求項３】
前記シグナルペプチド中に、挿入、欠失、及び置換から選択される更なる変異を３つ以下有する、請求項１又は請求項２に記載のＧ−ＣＳＦ前駆体。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のＧ−ＣＳＦ前駆体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項４若しくは請求項５に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６に記載のベクターを含むトランスフェクト細胞。
【請求項８】
前記細胞が真核細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３Ｆ細胞である、請求項７に記載のトランスフェクト細胞。
【請求項９】
トランスフェクションが一過性である、請求項７又は請求項８に記載のトランスフェクト細胞。
【請求項１０】
トランスフェクションが安定である、請求項７又は請求項８に記載のトランスフェクト細胞。
【請求項１１】
請求項７〜請求項１０のいずれか一項に記載のトランスフェクト細胞を適切な培養培地中で培養する工程；
前記培養培地からＧ−ＣＳＦを単離する工程
を含む、Ｇ−ＣＳＦを発現させる方法。
【請求項１２】
培養が、ｐＨ６．８〜７．５、好ましくはｐＨ７．１〜７．３、で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
培養が、５〜２５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｍｌ、のインスリン存在下で行われる、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養培地が無血清である、請求項１１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５０４４０５（Ｐ２０１２−５０４４０５Ａ）
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２９５７１（Ｐ２０１１−５２９５７１）
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６２８４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３７８５５
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５１１０８５１８３）オクタファルマ バイオファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２日（２００９．１０．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６２８４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３７８５５
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５１１０８５１８３）オクタファルマ バイオファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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