組換え微生物
【課題】タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させた組換え微生物及び当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供する。
【解決手段】枯草菌のptsG、sucC、sucD、proJ、asnO、asnH、argH、rocG、rocA若しくはrocF遺伝子のいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【解決手段】枯草菌のptsG、sucC、sucD、proJ、asnO、asnH、argH、rocG、rocA若しくはrocF遺伝子のいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis） Marburg No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
また、微生物には、自然界での厳しい生存競争を生き残っていくために、生育環境中に存在する種々の栄養素を効率的に取り込み、炭素源、窒素源あるいはエネルギー源として利用するための多様な代謝系が存在することが知られている。枯草菌においては、ゲノム解読の結果、約900もの代謝に関わる遺伝子が存在することが明らかにされている（非特許文献1参照）。
【０００５】
一方で、微生物を工業的な物資生産に用いる場合、限定した培地成分が豊富に供給され
、安定に生存が可能であるため、枯草菌の例のような多くの代謝関連遺伝子を必ずしも必要としないものと考えられる。
【非特許文献１】Kunst,F.,et al.,Nature,390,249-256,1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能にする宿主微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に当該組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に不要或いは有害な働きをする遺伝子群を鋭意探索したところ、意外にも、枯草菌等が栄養源を取り込み、代謝する際に用いる遺伝子群の中の特定の遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、枯草菌の遺伝子ptsG、sucC、sucD、proJ、asnO、asnH、argH、rocG、rocA若しくはrocFのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物に関する。
【０００９】
また本発明は、当該組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の組換え微生物を用いることにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, 1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１２】
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、各種栄養源を利用するための代謝関連遺伝子、具体的には表１に示す枯草菌の遺伝子又は当該遺伝子に相当する糖の取り込み、糖代謝、アミノ酸代謝などに関与する遺伝子を有するものであればよい。これらは、野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもBacillus属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１３】
枯草菌ゲノム上に散在する、糖、有機酸、アミノ酸代謝及びそれら遺伝子の発現制御にに関わる遺伝子としては、例えば、解糖系に関わる遺伝子群gapA(BG10827)、gapB(BG12592)、glcK(BG11685)、glvA(BG11839)、pgi(BG12366)、pps(BG12657)、ptsG(BG10198)、ptsH(BG10200)、ptsI(BG10201)、pykA(BG12661)、有機酸代謝に関わる遺伝子群ackA(BG10813)、acsA(BG10370)、alsD(BG10472)、alsR(BG10470)、alsS(BG10471)、dhaS(BG12582)、lctP(BG12001)、ldh(BG19003)、malS(BG12614)、pckA(BG11841)、pta(BG10634)、ydaP(BG12063)、アミノ酸代謝に関わる遺伝子群ansA(BG10300)、ansZ(BG12755)、argC(BG10191)、argD(BG10194)、argE(BG12569)、argF(BG10197)、argG(BG12570)、argH(BG12571)、argJ(BG10192)、asnH(BG11116)、asnO(BG12240)、aspB (BG11513)、carA(BG10195)、carB(BG10196)、glnA(BG10425)、gltA(BG10811)、gltB(BG12594)、gltC(BG10810)、nadB(BG10867)、proA(BG10964)、proB(BG10963)、proJ(BG12658)、rocA(BG10622)、rocD(BG10722)、rocF(BG10932)、rocG(BG10621)、さらに、トリカルボン酸回路に関わる遺伝子群acoA(BG12558）、acoB(BG12559）、acoC(BG12560）、acoL(BG12561）、acoR(BG11790）、citA(BG10854）、citB(BG10478）、citC(BG10856）、citG(BG10384）、citZ(BG10855）、mdh(BG11386）、mmgD(BG11322）、pdhB(BG10208）、pdhC(BG10209）、pdhD(BG10210）、sdhA(BG10352）、sdhB(BG10353）、sdhC(BG10351）、sucC(BG12680）、sucD(BG12681）等が知られているが、本発明において欠失、又は不活性の対象となる遺伝子は、このうち、以下の表１に示す枯草菌遺伝子のいずれか又は当該遺伝子に相当する遺伝子から選択されるものである。斯かる遺伝子群は、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産には直接関与しておらず、また、通常の工業的生産培地における微生物の生育にも不要であることが本発明者らによって見出された。
【００１４】
尚、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997）、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。
【００１５】
【表１】
【００１６】
また、表１に示される枯草菌の各遺伝子と同じ機能を有する、または、表１の各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子は、表１に記載の遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。
【００１７】
本発明の遺伝子のうち、ptsG遺伝子産物は膜に存在し、ヒスチジン残基がリン酸化したHPrタンパク（ptsH遺伝子産物）からリン酸基を受け取り、グルコースをリン酸化しながら細胞内に取り込むグルコース-PTS（Phosphotransferase system）系として知られている（特許文献２；Sonenshein, A.L.,et al. Bacillus subtilis and its closest relatives from genes to cells, ASM press,2002）。また、sucC、sucD遺伝子産物はトリカルボン酸サイクル（TCA回路）において、スクシニルCoAのスクシネートへの変換を触媒することが知られている（同特許文献２）。次いで、proJ、rocG、rocA遺伝子は、細胞内においてグルタミン酸の代謝、そして、argH遺伝子産物は尿素回路においてアルギノスクシネートからアルギニンとフマル酸の生成、rocF遺伝子産物は同じく尿素回路においてアルギニンからオルニチンと尿素の生成、さらに、asnO及びasnH遺伝子産物はアスパラギン酸からアスパラギンの生成、にそれぞれに関わることが知られている（同特許文献２）。
【００１８】
上記遺伝子を欠失又は不活性化することにより、培地成分中の栄養源の資化速度及び資化経路が変化した宿主細胞を構築することが可能となると考えられる。
【００１９】
ここで、欠失又は不活性化する遺伝子は１以上であればよく、上記以外の遺伝子群の欠失又は不活性化を組み合わせることも可能である。更には上記遺伝子群の欠失の他に、それ以外の遺伝子群の発現強化及び機能強化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。また、本発明は目的遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、あるいは、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によっても目的遺伝子を不活性化することができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方がより望ましい。
【００２０】
斯かる遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、表１に示す標的遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００２１】
標的とする遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００２２】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２３】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２４】
以下に、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
【００２５】
本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約1.0kb断片と、同じく下流に隣接する約1.0kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２６】
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。
【００２７】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。
【００２８】
かくして得られた欠失用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞、或いは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が薬剤耐性マーカーによる選択によって分離できる（図１）。即ち、表２に示したプライマーセットを用いて調製した欠失（不活性化）用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換、或いは目的遺伝子内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることを確認すれば良い。
【００２９】
上記の宿主微生物変異株を用いて生産させるタンパク質やポリペプチドは特に限定されず、洗浄剤用、食品加工用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、プロテアーゼ、α-アミラーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ、または、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３０】
また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるバチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００３１】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。
【００３２】
また、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がBacillus属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。
【００３３】
上記の目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３４】
本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【００３５】
以下に、枯草菌のptsG遺伝子（BG10198）を不活性化させた組換え枯草菌株構築の実施例を中心に、当該発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼ及びプロテアーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３６】
実施例１
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したptsG-AFとptsG-A/CmR、及びptsG-B/CmFとptsG-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のptsG遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）、及び下流に隣接する1.0kb断片（B）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194（J.Bacteriol.,158,543,1984）を鋳型とし、表２に示したCmFWとCmRVのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.9kb断片（C）を調製した。次に、得られた（A）（B）（C）3断片を混合して鋳型とし、ptsG-AFとptsG-BRのプライマーを用いてSOE−PCRを行ない、3断片を（A）-（C）-（B）の順になる様に結合させ、2.9kbのDNA断片を得た（図１参照）。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってptsG遺伝子の構造遺伝子（ORF）内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された、目的とする遺伝子不活性化株であることを確認した。
【００３７】
【表２】
【００３８】
実施例２
一方、実施例１と同様にして表２に示したプライマーセット（遺伝子名-AFと遺伝子名-A/CmR、遺伝子名-B/CmFと遺伝子名-BR、CmFWとCmRV）を用いて欠失用DNA断片を調製し、ゲノム上のargH遺伝子(BG12571)、asnO遺伝子(BG12240)、asnH遺伝子（BG11116）、proJ遺伝子(BG12658)、rocA遺伝子(BG10622)、rocF遺伝子(BG10932)、rocG遺伝子(BG10621)、sucC遺伝子(BG12680)、sucD遺伝子(BG12681)の一部がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換した、或いは構造遺伝子（ORF）内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された、目的とする遺伝子欠失株（不活性化株）を作製した。さらに、得られた変異株が目的とする遺伝子欠失株（不活性化株）であることを実施例1と同様の方法にて確認した。
【００３９】
実施例３（セルラーゼ生産性評価）
実施例１〜２にて得られた各遺伝子欠失株、遺伝子不活性化株及び対照として枯草菌168株に、Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）をコードするDNA断片（3.1kb）が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた形質転換株を5mLのLB培地で30℃にて15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6mLを30mLの2xL−マルトース培地（2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を、上記特許文献に記載の方法、またはp-nitrophenyl-β-cellotrioside（生化学工業）を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度（420nm）の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表３に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株、不活性化株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
【００４０】
【表３】
実施例４（プロテアーゼ生産性評価）
実施例１〜２にて得られた各遺伝子欠失株、遺伝子不活性化株及び対照として枯草菌168株に、Bacillus clausii KSM-K16株（FERM BP-3376）由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子（Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,473,1995）をコードするDNA断片（1.3kb）が、Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域をコードするDNA断片（0.6kb）の下流に連結したDNA断片を、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI−BglII制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHYKAP（S237p）をプロトプラスト形質転換法にて導入した。これによって得られた形質転換株を実施例３で示した条件にて培養を行ない、培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を上記文献記載の方法、またはSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide（ペプチド研究所）を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度（420nm）の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。この結果、表４に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株、不活性化株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリプロテアーゼの分泌生産が認められた。
【００４１】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis） Marburg No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
また、微生物には、自然界での厳しい生存競争を生き残っていくために、生育環境中に存在する種々の栄養素を効率的に取り込み、炭素源、窒素源あるいはエネルギー源として利用するための多様な代謝系が存在することが知られている。枯草菌においては、ゲノム解読の結果、約900もの代謝に関わる遺伝子が存在することが明らかにされている（非特許文献1参照）。
【０００５】
一方で、微生物を工業的な物資生産に用いる場合、限定した培地成分が豊富に供給され
、安定に生存が可能であるため、枯草菌の例のような多くの代謝関連遺伝子を必ずしも必要としないものと考えられる。
【非特許文献１】Kunst,F.,et al.,Nature,390,249-256,1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能にする宿主微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に当該組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に不要或いは有害な働きをする遺伝子群を鋭意探索したところ、意外にも、枯草菌等が栄養源を取り込み、代謝する際に用いる遺伝子群の中の特定の遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、枯草菌の遺伝子ptsG、sucC、sucD、proJ、asnO、asnH、argH、rocG、rocA若しくはrocFのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物に関する。
【０００９】
また本発明は、当該組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の組換え微生物を用いることにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, 1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１２】
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、各種栄養源を利用するための代謝関連遺伝子、具体的には表１に示す枯草菌の遺伝子又は当該遺伝子に相当する糖の取り込み、糖代謝、アミノ酸代謝などに関与する遺伝子を有するものであればよい。これらは、野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもBacillus属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１３】
枯草菌ゲノム上に散在する、糖、有機酸、アミノ酸代謝及びそれら遺伝子の発現制御にに関わる遺伝子としては、例えば、解糖系に関わる遺伝子群gapA(BG10827)、gapB(BG12592)、glcK(BG11685)、glvA(BG11839)、pgi(BG12366)、pps(BG12657)、ptsG(BG10198)、ptsH(BG10200)、ptsI(BG10201)、pykA(BG12661)、有機酸代謝に関わる遺伝子群ackA(BG10813)、acsA(BG10370)、alsD(BG10472)、alsR(BG10470)、alsS(BG10471)、dhaS(BG12582)、lctP(BG12001)、ldh(BG19003)、malS(BG12614)、pckA(BG11841)、pta(BG10634)、ydaP(BG12063)、アミノ酸代謝に関わる遺伝子群ansA(BG10300)、ansZ(BG12755)、argC(BG10191)、argD(BG10194)、argE(BG12569)、argF(BG10197)、argG(BG12570)、argH(BG12571)、argJ(BG10192)、asnH(BG11116)、asnO(BG12240)、aspB (BG11513)、carA(BG10195)、carB(BG10196)、glnA(BG10425)、gltA(BG10811)、gltB(BG12594)、gltC(BG10810)、nadB(BG10867)、proA(BG10964)、proB(BG10963)、proJ(BG12658)、rocA(BG10622)、rocD(BG10722)、rocF(BG10932)、rocG(BG10621)、さらに、トリカルボン酸回路に関わる遺伝子群acoA(BG12558）、acoB(BG12559）、acoC(BG12560）、acoL(BG12561）、acoR(BG11790）、citA(BG10854）、citB(BG10478）、citC(BG10856）、citG(BG10384）、citZ(BG10855）、mdh(BG11386）、mmgD(BG11322）、pdhB(BG10208）、pdhC(BG10209）、pdhD(BG10210）、sdhA(BG10352）、sdhB(BG10353）、sdhC(BG10351）、sucC(BG12680）、sucD(BG12681）等が知られているが、本発明において欠失、又は不活性の対象となる遺伝子は、このうち、以下の表１に示す枯草菌遺伝子のいずれか又は当該遺伝子に相当する遺伝子から選択されるものである。斯かる遺伝子群は、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産には直接関与しておらず、また、通常の工業的生産培地における微生物の生育にも不要であることが本発明者らによって見出された。
【００１４】
尚、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997）、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。
【００１５】
【表１】
【００１６】
また、表１に示される枯草菌の各遺伝子と同じ機能を有する、または、表１の各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子は、表１に記載の遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。
【００１７】
本発明の遺伝子のうち、ptsG遺伝子産物は膜に存在し、ヒスチジン残基がリン酸化したHPrタンパク（ptsH遺伝子産物）からリン酸基を受け取り、グルコースをリン酸化しながら細胞内に取り込むグルコース-PTS（Phosphotransferase system）系として知られている（特許文献２；Sonenshein, A.L.,et al. Bacillus subtilis and its closest relatives from genes to cells, ASM press,2002）。また、sucC、sucD遺伝子産物はトリカルボン酸サイクル（TCA回路）において、スクシニルCoAのスクシネートへの変換を触媒することが知られている（同特許文献２）。次いで、proJ、rocG、rocA遺伝子は、細胞内においてグルタミン酸の代謝、そして、argH遺伝子産物は尿素回路においてアルギノスクシネートからアルギニンとフマル酸の生成、rocF遺伝子産物は同じく尿素回路においてアルギニンからオルニチンと尿素の生成、さらに、asnO及びasnH遺伝子産物はアスパラギン酸からアスパラギンの生成、にそれぞれに関わることが知られている（同特許文献２）。
【００１８】
上記遺伝子を欠失又は不活性化することにより、培地成分中の栄養源の資化速度及び資化経路が変化した宿主細胞を構築することが可能となると考えられる。
【００１９】
ここで、欠失又は不活性化する遺伝子は１以上であればよく、上記以外の遺伝子群の欠失又は不活性化を組み合わせることも可能である。更には上記遺伝子群の欠失の他に、それ以外の遺伝子群の発現強化及び機能強化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。また、本発明は目的遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、あるいは、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によっても目的遺伝子を不活性化することができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方がより望ましい。
【００２０】
斯かる遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、表１に示す標的遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００２１】
標的とする遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００２２】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２３】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２４】
以下に、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。
【００２５】
本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約1.0kb断片と、同じく下流に隣接する約1.0kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００２６】
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。
【００２７】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。
【００２８】
かくして得られた欠失用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞、或いは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が薬剤耐性マーカーによる選択によって分離できる（図１）。即ち、表２に示したプライマーセットを用いて調製した欠失（不活性化）用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換、或いは目的遺伝子内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることを確認すれば良い。
【００２９】
上記の宿主微生物変異株を用いて生産させるタンパク質やポリペプチドは特に限定されず、洗浄剤用、食品加工用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、プロテアーゼ、α-アミラーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ、または、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３０】
また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるバチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００３１】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。
【００３２】
また、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がBacillus属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているBacillus属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。
【００３３】
上記の目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３４】
本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【００３５】
以下に、枯草菌のptsG遺伝子（BG10198）を不活性化させた組換え枯草菌株構築の実施例を中心に、当該発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼ及びプロテアーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３６】
実施例１
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したptsG-AFとptsG-A/CmR、及びptsG-B/CmFとptsG-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のptsG遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）、及び下流に隣接する1.0kb断片（B）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194（J.Bacteriol.,158,543,1984）を鋳型とし、表２に示したCmFWとCmRVのプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.9kb断片（C）を調製した。次に、得られた（A）（B）（C）3断片を混合して鋳型とし、ptsG-AFとptsG-BRのプライマーを用いてSOE−PCRを行ない、3断片を（A）-（C）-（B）の順になる様に結合させ、2.9kbのDNA断片を得た（図１参照）。このDNA断片を用いてコンピテント法により枯草菌168株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってptsG遺伝子の構造遺伝子（ORF）内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された、目的とする遺伝子不活性化株であることを確認した。
【００３７】
【表２】
【００３８】
実施例２
一方、実施例１と同様にして表２に示したプライマーセット（遺伝子名-AFと遺伝子名-A/CmR、遺伝子名-B/CmFと遺伝子名-BR、CmFWとCmRV）を用いて欠失用DNA断片を調製し、ゲノム上のargH遺伝子(BG12571)、asnO遺伝子(BG12240)、asnH遺伝子（BG11116）、proJ遺伝子(BG12658)、rocA遺伝子(BG10622)、rocF遺伝子(BG10932)、rocG遺伝子(BG10621)、sucC遺伝子(BG12680)、sucD遺伝子(BG12681)の一部がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換した、或いは構造遺伝子（ORF）内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入された、目的とする遺伝子欠失株（不活性化株）を作製した。さらに、得られた変異株が目的とする遺伝子欠失株（不活性化株）であることを実施例1と同様の方法にて確認した。
【００３９】
実施例３（セルラーゼ生産性評価）
実施例１〜２にて得られた各遺伝子欠失株、遺伝子不活性化株及び対照として枯草菌168株に、Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）をコードするDNA断片（3.1kb）が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた形質転換株を5mLのLB培地で30℃にて15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6mLを30mLの2xL−マルトース培地（2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を、上記特許文献に記載の方法、またはp-nitrophenyl-β-cellotrioside（生化学工業）を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度（420nm）の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表３に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株、不活性化株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
【００４０】
【表３】
実施例４（プロテアーゼ生産性評価）
実施例１〜２にて得られた各遺伝子欠失株、遺伝子不活性化株及び対照として枯草菌168株に、Bacillus clausii KSM-K16株（FERM BP-3376）由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子（Appl.Microbiol.Biotechnol.,43,473,1995）をコードするDNA断片（1.3kb）が、Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域をコードするDNA断片（0.6kb）の下流に連結したDNA断片を、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI−BglII制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドpHYKAP（S237p）をプロトプラスト形質転換法にて導入した。これによって得られた形質転換株を実施例３で示した条件にて培養を行ない、培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を上記文献記載の方法、またはSuccinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Alanine p-Nitroanilide（ペプチド研究所）を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度（420nm）の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。この結果、表４に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株、不活性化株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリプロテアーゼの分泌生産が認められた。
【００４１】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌遺伝子ptsG、sucC、sucD、proJ、asnO、asnH、argH、rocG、rocA若しくはrocFのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項２】
微生物がバチルス属（Bacillus）細菌である請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項２記載の組換え微生物。
【請求項４】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル領域のいずれか１以上の領域を結合した請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項５】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである請求項４又は５記載の組換え微生物。
【請求項７】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと７０%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である請求項４〜６のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項１】
枯草菌遺伝子ptsG、sucC、sucD、proJ、asnO、asnH、argH、rocG、rocA若しくはrocFのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項２】
微生物がバチルス属（Bacillus）細菌である請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項２記載の組換え微生物。
【請求項４】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル領域のいずれか１以上の領域を結合した請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項５】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである請求項４又は５記載の組換え微生物。
【請求項７】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと７０%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片である請求項４〜６のいずれか１項記載の組換え微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の組換え微生物を用いる目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−３３０２５５（Ｐ２００７−３３０２５５Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２５９０５（Ｐ２００７−１２５９０５）
【出願日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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