組換え微生物
【課題】ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール資化能を付与し、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを資化できる微生物を提供する。
【解決手段】ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを資化可能な組換え微生物。宿主微生物としては、サッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属からなる群より選ばれる酵母が用いられ、サッカマイセス(Saccharomyces)属及びクリベロマイセス(Kluyveromyces)属のものが好ましい。
【解決手段】ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを資化可能な組換え微生物。宿主微生物としては、サッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属からなる群より選ばれる酵母が用いられ、サッカマイセス(Saccharomyces)属及びクリベロマイセス(Kluyveromyces)属のものが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソルビトール資化能を有する組換え微生物に関する。さらに詳しくいえば、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を宿主微生物に組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを消費して生育（資化）できる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界的に化石燃料を大量に消費することによる地球温暖化及び資源枯渇が問題になっている。このような状況の下で、安定で且つ持続可能なエネルギーの開発が求められており、バイオマスからエネルギーを生産する技術が注目されている。
【０００３】
可食バイオマスを用いたバイオエタノールの急激な需要増加により、食料価格の上昇をもたらした。従って、食料とならないバイオマス、特に資源的に豊富なセルロースの利用が重要である。
【０００４】
植物の細胞壁の構成成分であるセルロースを燃料に変換する方法として、高分子であるセルロースを糖に分解し、発酵させてバイオエタノールを得る方法がある。セルロースを糖に分解するには、硫酸または酵素を用いる方法が知られているが、硫酸は腐食性・危険性が高く大量の中和廃棄物を発生させる。また酵素には基質依存性があるという難点がある。
【０００５】
特許文献１（国際公開第２００７／１０００５２号パンフレット）には、触媒によりセルロースをソルビトールに分解する方法が開示されている。しかしながら、エタノールを生産するサッカロマイセス属酵母においては、ソルビトールを炭素源として生育するものは知られておらず、ソルビトールを利用してエタノール等の有用物質を生産することは考えられていなかった。
【０００６】
ソルビトールを消費して生育（資化）できる微生物としては、グルコノバクター属等が知られており（特許文献２：特開２００３−１５９０９３号公報参照）ソルビトール脱水素酵素が公知である。また、サッカロマイセス属酵母のソルビトール脱水素酵素遺伝子も知られている（特許文献３：特表平８−５０５５２７号公報参照）。しかしながら、このサッカロマイセス属酵母におけるソルビトール脱水素酵素遺伝子は発現（機能）しておらず、ソルビトールを炭素源として生育することができない。
【０００７】
また、リンゴ、サクラ等のバラ属由来ソルビトールトランスポーター遺伝子が知られており、リンゴ由来ソルビトールトランスポーター遺伝子でサッカロマイセス属酵母を形質転換すると、ソルビトールの菌体内取込み能が向上することが開示されている（非特許文献１：Aatari et al., (2004) Plant Cell. Physiol. 45: p.1032-1041）。しかしながら、ソルビトールを炭素源として生育するかについては開示されていない。
【０００８】
従って、ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込むと、炭素源としてソルビトールのみを含む培地においてソルビトールを資化可能になることはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０００５２号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−１５９０９３号公報
【特許文献３】特表平８−５０５５２７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Aatari et al., (2004) Plant Cell. Physiol. 45: p.1032-1041
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール資化能を付与し、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを資化可能な微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込むことにより、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを資化可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［１２］を含む。
［１］ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを資化可能な組換え微生物。
［２］前記宿主微生物が酵母である前記［１］記載の組換え微生物。
［３］前記酵母がサッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属からなる群より選ばれるいずれかに属する前記［２］記載の組換え微生物。
［４］前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する前記［３］記載の組換え微生物。
［５］前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である前記［４］記載の組換え微生物。
［６］前記酵母がクリベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する前記［３］記載の組換え微生物。
［７］前記酵母がクリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クリベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotrelans)のいずれかである前記［６］記載の組換え微生物。
［８］前記ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属からなる群より選ばれる微生物に由来する前記［１］〜［７］のいずれかに記載の組換え微生物。
［９］前記ソルビトールトランスポーター遺伝子が、植物または酵母に由来する前記［１］〜［７］のいずれかに記載の組換え微生物。
［１０］前記植物がバラ科植物である前記［９］記載の組換え微生物。
［１１］前記バラ科植物がリンゴまたはサクラである前記［１０］記載の組換え微生物。
［１２］前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属のいずれかに属する前記［９］記載の組換え微生物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により得られる組換え微生物は、セルロースを分解して得られるソルビトールを利用して有用化学物質等を生産するための生産菌を作製するのに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを資化できる組換え微生物は、宿主微生物に、ソルビトール脱水素酵素遺伝子（以下、ＳＤＨ遺伝子またはＳＤＨということもある）、及びソルビトールトランスポーター遺伝子（以下、ＳＯＴ遺伝子またはＳＯＴということもある）を組み込むことにより得ることができる。
【００１６】
本発明に用いられる宿主微生物は特に制限されるものではなく、例えば、酵母、バクテリア、古細菌等が挙げられる。酵母の具体例としては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等が挙げられ、中でもサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属のものが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クリベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotrelans)由来のものが特に好ましい。
【００１７】
本発明に用いられるＳＤＨ遺伝子は、ソルビトール脱水素酵素活性を持つタンパク質をコードするものであればいずれのものも使用することができる。動物肝由来の遺伝子としては、例えば羊肝由来、また、微生物由来の遺伝子としては、例えばシュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、アセトバクター（Acetobacter）属由来の遺伝子を用いることができる。このうち宿主微生物として酵母を用いる場合は宿主微生物と似ている点で酵母由来のものを使用することが好ましい。酵母由来のものとしては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属のものが挙げられ、中でもサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属のものが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）由来のものが特に好ましい。
【００１８】
本発明に用いられるＳＯＴ遺伝子は、ソルビトールトランスポーター活性を持つタンパク質をコードするものであればいずれのものも使用することができる。中でも植物由来、酵母由来のものが好ましい。このうち、植物由来ではバラ科植物のものが好ましく、特にリンゴ、サクラが好ましい。酵母由来ではサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属由来のものを好ましく用いることができる。
【００１９】
本発明に用いられる遺伝子の単離は、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の公知の方法によって行うことができる。あるいは、常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、あるいは市販のｃＤＮＡライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明に用いられる遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプライマーを用いたＰＣＲ法によって取得することができる。また、染色体ＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション等の公知の方法によって行うこともできる。
【００２０】
ＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子の機能発現に用いられるプロモーターは、その発現ベクターを導入すべき宿主細胞中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できる任意のものであってよい。酵母中で発現させるためには、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター等の公知のプロモーターが使用できる。このうち、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターがソルビトール培地中でも常に働く能力を有している点で好ましい。
【００２１】
ＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子の発現に用いられるターミネーターは、ＥＮＯ１ターミネーター、ＧＡＬ１０ターミネーター、ＧＡＰＤＨターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーター等の公知のターミネーターが使用できる。
【００２２】
形質転換に用いるベクターは、宿主微生物で複製されるものを用いることができる。例えば、宿主微生物として酵母を用いる場合はＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０、ｐＰＩＣＺαＡ、ｐ４ＸＸシリーズ（Dominik et al., (1995)Gene. 156: p.119-122）等が挙げられる。ベクター中に本発明で用いられるＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。本発明で使用する発現ベクターには、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーが必要に応じて含まれていてもよい。
【００２３】
本発明で用いられるＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子またはそれを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換するには、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用して行うことができる。
【００２４】
本発明で用いられるＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子が宿主細胞（微生物）に確実に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。例えば、宿主細胞（微生物）からプラスミドを抽出し、本発明のＳＯＴ遺伝子、ＳＤＨ遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行えばよい。その増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、サイバーグリーン（SYBR Green）液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、本発明の遺伝子の導入を確認することができる。
【００２５】
培地は、炭素源としてソルビトール、及び本発明の組換え微生物が資化し得る窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養のいずれで行ってもよいが、振とう培養が好ましく用いられる。培養温度は通常、１５〜４０℃である。
【実施例】
【００２６】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１、比較例１〜２：
（１）ＳＤＨ遺伝子の単離及びＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）NBRC1090株（（独）製品評価技術基盤機構より入手）の染色体ＤＮＡを、QIA amp DNA Mini kit（キアゲン（QIAGEN）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って調製した。得られた染色体を鋳型とし、配列番号１及び２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約１．１ｋｂｐの断片を取得した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って単離、精製した。このＤＮＡとp426GPDベクターをEcoRI及びSalIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００２８】
（２）ＳＯＴ遺伝子の単離及びＳＯＴ遺伝子を有するプラスミドの調製
りんごの葉からRNeasy（キアゲン（QIAGEN）社製）を用いて、添付された説明書の記載に従って全ＲＮＡの抽出及び精製を行うことにより、全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡを鋳型として、PrimeScript High Fidelity RT-PCR Kit（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、配列番号４〜７のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１．６ｋｂｐの断片を取得した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い単離、精製した。このＤＮＡ断片とp413GPDベクターをSpeI及びEcoRIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００２９】
（３）酵母の形質転換
前記（１）及び（２）で調製したプラスミドを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
形質転換体選択培地には、以下に示す組成のＳＤ寒天培地に対応するアミノ酸を添加した寒天培地を用いた。実施例１及び比較例１〜２に使用したプラスミド及び寒天培地を表１に示す。
すなわち、実施例１はＳＤＨ遺伝子（配列番号３）をp426GPDベクターに連結したプラスミド及びＳＯＴ遺伝子（配列番号８）をp413GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体１を取得するために、ＳＤ寒天培地にトリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、ロイシン６０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Trp，Leu）寒天培地を用い、比較例１はＳＤＨ遺伝子（配列番号３）をp426GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体２を取得するために、ＳＤ寒天培地にトリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、ロイシン６０ｍｇ／Ｌ、ヒスチジン塩酸塩２０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Trp，Leu，His）寒天培地を用い、比較例２はＳＯＴ遺伝子（配列番号８）をp413GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体３を取得するために、ＳＤ寒天培地にトリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、ロイシン６０ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Trp，Leu，Ura）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養して、表１に記載した３種の形質転換体を取得した。
ＳＤ寒天培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base，ディフコ（Difco）社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
寒天 20g/L
【００３０】
（４）培養結果（ＯＤ、糖濃度）
得られた形質転換体を、以下に示す組成のＳＣ液体培地作製時に、対応するアミノ酸を除いて作製した液体培地を用いてフラスコ培養試験を行った。実施例１及び比較例１〜２に使用した液体培地を表１に示す。
すなわち、実施例１の形質転換体１にはウラシル及びヒスチジンを添加せずに作製したＳＣ（-Ura，-His）液体培地を用い、比較例１の形質転換体２にはウラシルを添加せずに作製したＳＣ（-Ura）液体培地を用い、比較例２の形質転換体３にはヒスチジンを添加せずに作製したＳＣ（-His）液体培地を用いた。各培地５ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、これを前培養溶液とした。
得られた前培養溶液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の１００ｍＬのＳＣ液体培地、及びＳＣ液体培地中のグルコースをソルビトールに代えて作製したＳＣＳ液体培地にぞれぞれ加え、３０℃で培養した。１３２時間後の培養液の濁度（OD660）を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表１に示す。
【００３１】
ＳＣ液体培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base，ディフコ（Difco）社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
硫酸アデニン 20mg/L
ウラシル 20mg/L
トリプトファン 20mg/L
ヒスチジン塩酸塩 20mg/L
アルギニン塩酸塩 20mg/L
メチオニン 20mg/L
チロシン 30mg/L
ロイシン 60mg/L
イソロイシン 30mg/L
リシン塩酸塩 30mg/L
フェニルアラニン 40mg/L
グルタミン酸 100mg/L
アスパラギン酸 100mg/L
バリン 150mg/L
トレオニン 200mg/L
セリン 400mg/L
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入した実施例１のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のみが、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを消費することが確認された。
【００３４】
実施例２〜３、比較例３〜４：
（１）ＳＤＨ遺伝子の単離及びＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）NBRC1090株の染色体ＤＮＡを、QIA amp DNA Mini kit（キアゲン（QIAGEN）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って調製した。得られた染色体を鋳型とし、配列番号９及び１０で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約２．１ｋｂｐの断片を取得した。プライマーは、構造遺伝子部分の上流、下流それぞれ５００ｂｐを含む断片を得るために設計した。すなわち、プロモーターを含む断片を得るために設計した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って単離、精製した。このＤＮＡとp426GPDベクターをSalI及びSacIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００３５】
（２）酵母の形質転換
前記（１）で調製したプラスミド、実施例１で作製した配列番号８のＤＮＡとp413GPDベクターを連結したプラスミド、実施例１で作製した配列番号３のＤＮＡとp426GPDベクターを連結したプラスミド、そしてp413GPDベクターを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
【００３６】
形質転換体選択培地には、実施例１に示したＳＤ（Trp，Leu）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養して、表２に記載した形質転換体を取得した。比較例３と４で用いた形質転換体は、ＳＯＴ遺伝子を導入せず、p413GPDベクターのみを導入した。これは培地成分による差をなくしたデータをとるためである。実施例２〜３及び比較例３〜４に使用したプラスミド及び寒天培地を表２に示す。
【００３７】
培養結果（ＯＤ、糖濃度）得られた形質転換体を用い試験管培養試験を行った。実施例１で使用したＳＣ（-Ura，-His）液体培地、及びＳＣＳ（-Ura，-His）培地（ＳＣ（-Ura，-His）培地のグルコースをソルビトールに代えた培地）６ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で培養した。１３９時間後の培養液のOD660を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表２に示す。
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のみが、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを消費することが確認された。ＳＤＨ遺伝子のプロモーターは、ＧＰＤプロモーターと同様に働くことが明らかになった。また、グルコース培地でのOD660はいずれも約２．０だった。
【００４０】
実施例４〜５：
（１）ＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
実施例１で単離、精製したＤＮＡ（配列番号３）とp413GPDベクターをEcoRI及びSalIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。また、実施例１で単離、精製したＤＮＡ（配列番号８）とp426GPDベクターをSpeI及びEcoRIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。
【００４１】
（２）酵母の形質転換
前記（１）で調製したプラスミドを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
【００４２】
実施例１に記載のＳＤ（Trp，Leu）寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して、表３に記載した形質転換体７を取得した。
【００４３】
（３）培養結果（ＯＤ、糖濃度）
得られた形質転換体７（実施例５）及び実施例１で取得した形質転換体１（実施例４）を、実施例１と同様のＳＣ液体培地（ＳＣ（-Ura，-His)；Yeast Nitrogen Base 6.7g/L、グルコース 20g/L、硫酸アデニン20mg/L、トリプトファン 20mg/L、アルギニン塩酸塩 20mg/L、メチオニン 20mg/L、チロシン 30mg/L、ロイシン 60mg/L、イソロイシン 30mg/L、リシン塩酸塩 30mg/L、フェニルアラニン 40mg/L、グルタミン酸 100mg/L、アスパラギン酸 100mg/l、バリン 150mg/L、トレオニン 200mg/L、セリン 400mg/Lを含有する培地）及びＳＣＳ液体培地（ＳＣＳ（-Ura，-His)；ＳＣ培地のグルコースをソルビトールに代えた培地）で培養した。試験管中のＳＣ培地５ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、これを前培養溶液とした。得られた前培養溶液６０ｕＬを、試験管中のＳＣ培地、ＳＣＳ培地６ｍＬに植菌し、３０℃で培養した。ＳＣ培地は１１１時間後、ＳＣＳ培地は１４２時間後の培養液のOD660を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表３に示す。
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、いずれもソルビトールを消費することが確認された。なお、ＳＯＴ遺伝子をコピー数の少ないp413GPDと連結したプラスミドを有する形質転換体１は、ＳＯＴ遺伝子をコピー数の多いp426GPDと連結したプラスミドを有する形質転換体７よりも、ソルビトール培地での生育が良く、ソルビトール消費量も多かった。
【００４６】
実施例６、比較例５〜６：
（１）ＳＤＨ遺伝子の単離及びＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン社より入手）の染色体ＤＮＡを、QIAamp DNA Mini kit（キアゲン（QIAGEN）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って調製した。得られた染色体を鋳型とし、配列番号１２及び１３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約１．１ｋｂｐの断片を取得した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応性生物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って単離、精製した。このＤＮＡとp426GPDベクターをSpeI及びEcoRIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００４７】
（２）酵母の形質転換
前記（１）で調整したプラスミド、及び実施例１で調製した配列番号８のＤＮＡとp413GPDベクターを連結したプラスミドを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
【００４８】
形質転換体選択培地には、実施例１に記載のＳＤ寒天培地に対応するアミノ酸を添加した寒天培地を用いた。実施例６及び比較例５〜６に使用したプラスミド及び寒天培地を表１に示す。
すなわち、実施例６はＳＤＨ遺伝子（配列番号１４）をp426GPDベクターに連結したプラスミド及びＳＯＴ遺伝子（配列番号８）をp413GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体８を取得するために、ＳＤ（Trp，Leu）寒天培地を用い、比較例５はＳＤＨ遺伝子（配列番号１４）をp426GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体９を取得するために、ＳＤ（Trp，Leu，His）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養して、表４に記載した形質転換体を取得した。
【００４９】
（３）培養結果（ＯＤ、糖濃度）
得られた形質転換体８〜９及び形質転換体３（比較例６）を、ＳＣ液体培地作製時に、対応するアミノ酸を除いて作製した液体培地を用いて試験管培養試験を行った。実施例６及び比較例５〜６に使用した液体培地を表４に示す。
すなわち、実施例６の形質転換体８はＳＣ（-Ura，-His）液体培地を用い、比較例５の形質転換体９はＳＣ（-Ura）液体培地を用い、比較例６の形質転換体３はＳＣ（-His）液体培地を用いた。また、それぞれに対応するＳＣＳ（-Ura，-His）液体培地、ＳＣＳ（-Ura）液体培地、ＳＣＳ（-His）液体培地も用いた。各培地６ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で培養した。１３９時間後の培養液のOD660を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表４に示す。
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のみが、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを消費することが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソルビトール資化能を有する組換え微生物に関する。さらに詳しくいえば、ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を宿主微生物に組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを消費して生育（資化）できる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界的に化石燃料を大量に消費することによる地球温暖化及び資源枯渇が問題になっている。このような状況の下で、安定で且つ持続可能なエネルギーの開発が求められており、バイオマスからエネルギーを生産する技術が注目されている。
【０００３】
可食バイオマスを用いたバイオエタノールの急激な需要増加により、食料価格の上昇をもたらした。従って、食料とならないバイオマス、特に資源的に豊富なセルロースの利用が重要である。
【０００４】
植物の細胞壁の構成成分であるセルロースを燃料に変換する方法として、高分子であるセルロースを糖に分解し、発酵させてバイオエタノールを得る方法がある。セルロースを糖に分解するには、硫酸または酵素を用いる方法が知られているが、硫酸は腐食性・危険性が高く大量の中和廃棄物を発生させる。また酵素には基質依存性があるという難点がある。
【０００５】
特許文献１（国際公開第２００７／１０００５２号パンフレット）には、触媒によりセルロースをソルビトールに分解する方法が開示されている。しかしながら、エタノールを生産するサッカロマイセス属酵母においては、ソルビトールを炭素源として生育するものは知られておらず、ソルビトールを利用してエタノール等の有用物質を生産することは考えられていなかった。
【０００６】
ソルビトールを消費して生育（資化）できる微生物としては、グルコノバクター属等が知られており（特許文献２：特開２００３−１５９０９３号公報参照）ソルビトール脱水素酵素が公知である。また、サッカロマイセス属酵母のソルビトール脱水素酵素遺伝子も知られている（特許文献３：特表平８−５０５５２７号公報参照）。しかしながら、このサッカロマイセス属酵母におけるソルビトール脱水素酵素遺伝子は発現（機能）しておらず、ソルビトールを炭素源として生育することができない。
【０００７】
また、リンゴ、サクラ等のバラ属由来ソルビトールトランスポーター遺伝子が知られており、リンゴ由来ソルビトールトランスポーター遺伝子でサッカロマイセス属酵母を形質転換すると、ソルビトールの菌体内取込み能が向上することが開示されている（非特許文献１：Aatari et al., (2004) Plant Cell. Physiol. 45: p.1032-1041）。しかしながら、ソルビトールを炭素源として生育するかについては開示されていない。
【０００８】
従って、ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込むと、炭素源としてソルビトールのみを含む培地においてソルビトールを資化可能になることはこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０００５２号パンフレット
【特許文献２】特開２００３−１５９０９３号公報
【特許文献３】特表平８−５０５５２７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Aatari et al., (2004) Plant Cell. Physiol. 45: p.1032-1041
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール資化能を付与し、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを資化可能な微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込むことにより、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを資化可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［１２］を含む。
［１］ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを資化可能な組換え微生物。
［２］前記宿主微生物が酵母である前記［１］記載の組換え微生物。
［３］前記酵母がサッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属からなる群より選ばれるいずれかに属する前記［２］記載の組換え微生物。
［４］前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する前記［３］記載の組換え微生物。
［５］前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である前記［４］記載の組換え微生物。
［６］前記酵母がクリベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する前記［３］記載の組換え微生物。
［７］前記酵母がクリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クリベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotrelans)のいずれかである前記［６］記載の組換え微生物。
［８］前記ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属からなる群より選ばれる微生物に由来する前記［１］〜［７］のいずれかに記載の組換え微生物。
［９］前記ソルビトールトランスポーター遺伝子が、植物または酵母に由来する前記［１］〜［７］のいずれかに記載の組換え微生物。
［１０］前記植物がバラ科植物である前記［９］記載の組換え微生物。
［１１］前記バラ科植物がリンゴまたはサクラである前記［１０］記載の組換え微生物。
［１２］前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属のいずれかに属する前記［９］記載の組換え微生物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により得られる組換え微生物は、セルロースを分解して得られるソルビトールを利用して有用化学物質等を生産するための生産菌を作製するのに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のソルビトールを唯一の炭素源とする培地においてソルビトールを資化できる組換え微生物は、宿主微生物に、ソルビトール脱水素酵素遺伝子（以下、ＳＤＨ遺伝子またはＳＤＨということもある）、及びソルビトールトランスポーター遺伝子（以下、ＳＯＴ遺伝子またはＳＯＴということもある）を組み込むことにより得ることができる。
【００１６】
本発明に用いられる宿主微生物は特に制限されるものではなく、例えば、酵母、バクテリア、古細菌等が挙げられる。酵母の具体例としては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等が挙げられ、中でもサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属のものが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クリベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotrelans)由来のものが特に好ましい。
【００１７】
本発明に用いられるＳＤＨ遺伝子は、ソルビトール脱水素酵素活性を持つタンパク質をコードするものであればいずれのものも使用することができる。動物肝由来の遺伝子としては、例えば羊肝由来、また、微生物由来の遺伝子としては、例えばシュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、アセトバクター（Acetobacter）属由来の遺伝子を用いることができる。このうち宿主微生物として酵母を用いる場合は宿主微生物と似ている点で酵母由来のものを使用することが好ましい。酵母由来のものとしては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属のものが挙げられ、中でもサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属のものが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）由来のものが特に好ましい。
【００１８】
本発明に用いられるＳＯＴ遺伝子は、ソルビトールトランスポーター活性を持つタンパク質をコードするものであればいずれのものも使用することができる。中でも植物由来、酵母由来のものが好ましい。このうち、植物由来ではバラ科植物のものが好ましく、特にリンゴ、サクラが好ましい。酵母由来ではサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属由来のものを好ましく用いることができる。
【００１９】
本発明に用いられる遺伝子の単離は、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の公知の方法によって行うことができる。あるいは、常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、あるいは市販のｃＤＮＡライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明に用いられる遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプライマーを用いたＰＣＲ法によって取得することができる。また、染色体ＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション等の公知の方法によって行うこともできる。
【００２０】
ＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子の機能発現に用いられるプロモーターは、その発現ベクターを導入すべき宿主細胞中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できる任意のものであってよい。酵母中で発現させるためには、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター等の公知のプロモーターが使用できる。このうち、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターがソルビトール培地中でも常に働く能力を有している点で好ましい。
【００２１】
ＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子の発現に用いられるターミネーターは、ＥＮＯ１ターミネーター、ＧＡＬ１０ターミネーター、ＧＡＰＤＨターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーター等の公知のターミネーターが使用できる。
【００２２】
形質転換に用いるベクターは、宿主微生物で複製されるものを用いることができる。例えば、宿主微生物として酵母を用いる場合はＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０、ｐＰＩＣＺαＡ、ｐ４ＸＸシリーズ（Dominik et al., (1995)Gene. 156: p.119-122）等が挙げられる。ベクター中に本発明で用いられるＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。本発明で使用する発現ベクターには、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーが必要に応じて含まれていてもよい。
【００２３】
本発明で用いられるＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子またはそれを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換するには、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用して行うことができる。
【００２４】
本発明で用いられるＳＤＨ遺伝子及びＳＯＴ遺伝子が宿主細胞（微生物）に確実に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。例えば、宿主細胞（微生物）からプラスミドを抽出し、本発明のＳＯＴ遺伝子、ＳＤＨ遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行えばよい。その増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、サイバーグリーン（SYBR Green）液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、本発明の遺伝子の導入を確認することができる。
【００２５】
培地は、炭素源としてソルビトール、及び本発明の組換え微生物が資化し得る窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養のいずれで行ってもよいが、振とう培養が好ましく用いられる。培養温度は通常、１５〜４０℃である。
【実施例】
【００２６】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１、比較例１〜２：
（１）ＳＤＨ遺伝子の単離及びＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）NBRC1090株（（独）製品評価技術基盤機構より入手）の染色体ＤＮＡを、QIA amp DNA Mini kit（キアゲン（QIAGEN）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って調製した。得られた染色体を鋳型とし、配列番号１及び２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約１．１ｋｂｐの断片を取得した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って単離、精製した。このＤＮＡとp426GPDベクターをEcoRI及びSalIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００２８】
（２）ＳＯＴ遺伝子の単離及びＳＯＴ遺伝子を有するプラスミドの調製
りんごの葉からRNeasy（キアゲン（QIAGEN）社製）を用いて、添付された説明書の記載に従って全ＲＮＡの抽出及び精製を行うことにより、全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡを鋳型として、PrimeScript High Fidelity RT-PCR Kit（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、配列番号４〜７のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１．６ｋｂｐの断片を取得した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い単離、精製した。このＤＮＡ断片とp413GPDベクターをSpeI及びEcoRIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００２９】
（３）酵母の形質転換
前記（１）及び（２）で調製したプラスミドを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
形質転換体選択培地には、以下に示す組成のＳＤ寒天培地に対応するアミノ酸を添加した寒天培地を用いた。実施例１及び比較例１〜２に使用したプラスミド及び寒天培地を表１に示す。
すなわち、実施例１はＳＤＨ遺伝子（配列番号３）をp426GPDベクターに連結したプラスミド及びＳＯＴ遺伝子（配列番号８）をp413GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体１を取得するために、ＳＤ寒天培地にトリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、ロイシン６０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Trp，Leu）寒天培地を用い、比較例１はＳＤＨ遺伝子（配列番号３）をp426GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体２を取得するために、ＳＤ寒天培地にトリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、ロイシン６０ｍｇ／Ｌ、ヒスチジン塩酸塩２０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Trp，Leu，His）寒天培地を用い、比較例２はＳＯＴ遺伝子（配列番号８）をp413GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体３を取得するために、ＳＤ寒天培地にトリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、ロイシン６０ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Trp，Leu，Ura）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養して、表１に記載した３種の形質転換体を取得した。
ＳＤ寒天培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base，ディフコ（Difco）社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
寒天 20g/L
【００３０】
（４）培養結果（ＯＤ、糖濃度）
得られた形質転換体を、以下に示す組成のＳＣ液体培地作製時に、対応するアミノ酸を除いて作製した液体培地を用いてフラスコ培養試験を行った。実施例１及び比較例１〜２に使用した液体培地を表１に示す。
すなわち、実施例１の形質転換体１にはウラシル及びヒスチジンを添加せずに作製したＳＣ（-Ura，-His）液体培地を用い、比較例１の形質転換体２にはウラシルを添加せずに作製したＳＣ（-Ura）液体培地を用い、比較例２の形質転換体３にはヒスチジンを添加せずに作製したＳＣ（-His）液体培地を用いた。各培地５ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、これを前培養溶液とした。
得られた前培養溶液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の１００ｍＬのＳＣ液体培地、及びＳＣ液体培地中のグルコースをソルビトールに代えて作製したＳＣＳ液体培地にぞれぞれ加え、３０℃で培養した。１３２時間後の培養液の濁度（OD660）を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表１に示す。
【００３１】
ＳＣ液体培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base，ディフコ（Difco）社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
硫酸アデニン 20mg/L
ウラシル 20mg/L
トリプトファン 20mg/L
ヒスチジン塩酸塩 20mg/L
アルギニン塩酸塩 20mg/L
メチオニン 20mg/L
チロシン 30mg/L
ロイシン 60mg/L
イソロイシン 30mg/L
リシン塩酸塩 30mg/L
フェニルアラニン 40mg/L
グルタミン酸 100mg/L
アスパラギン酸 100mg/L
バリン 150mg/L
トレオニン 200mg/L
セリン 400mg/L
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入した実施例１のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のみが、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを消費することが確認された。
【００３４】
実施例２〜３、比較例３〜４：
（１）ＳＤＨ遺伝子の単離及びＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）NBRC1090株の染色体ＤＮＡを、QIA amp DNA Mini kit（キアゲン（QIAGEN）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って調製した。得られた染色体を鋳型とし、配列番号９及び１０で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約２．１ｋｂｐの断片を取得した。プライマーは、構造遺伝子部分の上流、下流それぞれ５００ｂｐを含む断片を得るために設計した。すなわち、プロモーターを含む断片を得るために設計した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って単離、精製した。このＤＮＡとp426GPDベクターをSalI及びSacIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００３５】
（２）酵母の形質転換
前記（１）で調製したプラスミド、実施例１で作製した配列番号８のＤＮＡとp413GPDベクターを連結したプラスミド、実施例１で作製した配列番号３のＤＮＡとp426GPDベクターを連結したプラスミド、そしてp413GPDベクターを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
【００３６】
形質転換体選択培地には、実施例１に示したＳＤ（Trp，Leu）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養して、表２に記載した形質転換体を取得した。比較例３と４で用いた形質転換体は、ＳＯＴ遺伝子を導入せず、p413GPDベクターのみを導入した。これは培地成分による差をなくしたデータをとるためである。実施例２〜３及び比較例３〜４に使用したプラスミド及び寒天培地を表２に示す。
【００３７】
培養結果（ＯＤ、糖濃度）得られた形質転換体を用い試験管培養試験を行った。実施例１で使用したＳＣ（-Ura，-His）液体培地、及びＳＣＳ（-Ura，-His）培地（ＳＣ（-Ura，-His）培地のグルコースをソルビトールに代えた培地）６ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で培養した。１３９時間後の培養液のOD660を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表２に示す。
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のみが、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを消費することが確認された。ＳＤＨ遺伝子のプロモーターは、ＧＰＤプロモーターと同様に働くことが明らかになった。また、グルコース培地でのOD660はいずれも約２．０だった。
【００４０】
実施例４〜５：
（１）ＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
実施例１で単離、精製したＤＮＡ（配列番号３）とp413GPDベクターをEcoRI及びSalIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。また、実施例１で単離、精製したＤＮＡ（配列番号８）とp426GPDベクターをSpeI及びEcoRIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。
【００４１】
（２）酵母の形質転換
前記（１）で調製したプラスミドを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
【００４２】
実施例１に記載のＳＤ（Trp，Leu）寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して、表３に記載した形質転換体７を取得した。
【００４３】
（３）培養結果（ＯＤ、糖濃度）
得られた形質転換体７（実施例５）及び実施例１で取得した形質転換体１（実施例４）を、実施例１と同様のＳＣ液体培地（ＳＣ（-Ura，-His)；Yeast Nitrogen Base 6.7g/L、グルコース 20g/L、硫酸アデニン20mg/L、トリプトファン 20mg/L、アルギニン塩酸塩 20mg/L、メチオニン 20mg/L、チロシン 30mg/L、ロイシン 60mg/L、イソロイシン 30mg/L、リシン塩酸塩 30mg/L、フェニルアラニン 40mg/L、グルタミン酸 100mg/L、アスパラギン酸 100mg/l、バリン 150mg/L、トレオニン 200mg/L、セリン 400mg/Lを含有する培地）及びＳＣＳ液体培地（ＳＣＳ（-Ura，-His)；ＳＣ培地のグルコースをソルビトールに代えた培地）で培養した。試験管中のＳＣ培地５ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、これを前培養溶液とした。得られた前培養溶液６０ｕＬを、試験管中のＳＣ培地、ＳＣＳ培地６ｍＬに植菌し、３０℃で培養した。ＳＣ培地は１１１時間後、ＳＣＳ培地は１４２時間後の培養液のOD660を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表３に示す。
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、いずれもソルビトールを消費することが確認された。なお、ＳＯＴ遺伝子をコピー数の少ないp413GPDと連結したプラスミドを有する形質転換体１は、ＳＯＴ遺伝子をコピー数の多いp426GPDと連結したプラスミドを有する形質転換体７よりも、ソルビトール培地での生育が良く、ソルビトール消費量も多かった。
【００４６】
実施例６、比較例５〜６：
（１）ＳＤＨ遺伝子の単離及びＳＤＨ遺伝子を有するプラスミドの調製
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン社より入手）の染色体ＤＮＡを、QIAamp DNA Mini kit（キアゲン（QIAGEN）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って調製した。得られた染色体を鋳型とし、配列番号１２及び１３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約１．１ｋｂｐの断片を取得した。ＰＣＲ反応はPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付された説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て該説明書の記載に従った。断片は、反応性生物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、確認した。このＤＮＡ断片をゲルから切り出し、GENECLEAN kit（エムピーバイオメディカルズ（MP-Biomedicals）社製）を用い、添付された説明書の記載に従って単離、精製した。このＤＮＡとp426GPDベクターをSpeI及びEcoRIで制限酵素処理し、連結してプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００４７】
（２）酵母の形質転換
前記（１）で調整したプラスミド、及び実施例１で調製した配列番号８のＤＮＡとp413GPDベクターを連結したプラスミドを用いて、以下の方法でサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ScINV1株（インビトロジェン（Invitrogen）社）を形質転換した。すなわち、Chen D, Yang B, Kuo T. (1992).Curr Genet 21: 83-84.に記載の形質転換法を用いた。
【００４８】
形質転換体選択培地には、実施例１に記載のＳＤ寒天培地に対応するアミノ酸を添加した寒天培地を用いた。実施例６及び比較例５〜６に使用したプラスミド及び寒天培地を表１に示す。
すなわち、実施例６はＳＤＨ遺伝子（配列番号１４）をp426GPDベクターに連結したプラスミド及びＳＯＴ遺伝子（配列番号８）をp413GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体８を取得するために、ＳＤ（Trp，Leu）寒天培地を用い、比較例５はＳＤＨ遺伝子（配列番号１４）をp426GPDベクターに連結したプラスミドを導入した形質転換体９を取得するために、ＳＤ（Trp，Leu，His）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養して、表４に記載した形質転換体を取得した。
【００４９】
（３）培養結果（ＯＤ、糖濃度）
得られた形質転換体８〜９及び形質転換体３（比較例６）を、ＳＣ液体培地作製時に、対応するアミノ酸を除いて作製した液体培地を用いて試験管培養試験を行った。実施例６及び比較例５〜６に使用した液体培地を表４に示す。
すなわち、実施例６の形質転換体８はＳＣ（-Ura，-His）液体培地を用い、比較例５の形質転換体９はＳＣ（-Ura）液体培地を用い、比較例６の形質転換体３はＳＣ（-His）液体培地を用いた。また、それぞれに対応するＳＣＳ（-Ura，-His）液体培地、ＳＣＳ（-Ura）液体培地、ＳＣＳ（-His）液体培地も用いた。各培地６ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で培養した。１３９時間後の培養液のOD660を測定した。また培養上清中のグルコースとソルビトールの含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィーを用いて定量し、ソルビトールの消費量を算出した。結果を表４に示す。
サンプル：培養上清、
カラム：Shodex Sugar SC1011（昭和電工（株）製）、
移動相：水、
流速 ：0.8 ml/分、
カラム温度：80℃、
検出 ：RI。
【００５０】
【表４】
【００５１】
表４に示す通り、ＳＤＨとＳＯＴを含むプラスミドを導入したサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のみが、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを消費することが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを資化可能な組換え微生物。
【請求項２】
前記宿主微生物が酵母である請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記酵母がサッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属からなる群より選ばれるいずれかに属する請求項２記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する請求項３記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記酵母がクリベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する請求項３記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記酵母がクリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クリベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotrelans)のいずれかである請求項６記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属からなる群より選ばれる微生物に由来する請求項１〜７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ソルビトールトランスポーター遺伝子が、植物または酵母に由来する請求項１〜７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記植物がバラ科植物である請求項９記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記バラ科植物がリンゴまたはサクラである請求項１０記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属のいずれかに属する請求項９記載の組換え微生物。
【請求項１】
ソルビトールを資化できない宿主微生物にソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子及びソルビトールトランスポーターをコードする遺伝子を組み込んで得られる、ソルビトールを唯一の炭素源とする培地のソルビトールを資化可能な組換え微生物。
【請求項２】
前記宿主微生物が酵母である請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記酵母がサッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属からなる群より選ばれるいずれかに属する請求項２記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する請求項３記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記酵母がクリベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する請求項３記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記酵母がクリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クリベロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クリベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotrelans)のいずれかである請求項６記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記ソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属からなる群より選ばれる微生物に由来する請求項１〜７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ソルビトールトランスポーター遺伝子が、植物または酵母に由来する請求項１〜７のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記植物がバラ科植物である請求項９記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記バラ科植物がリンゴまたはサクラである請求項１０記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記酵母がサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属のいずれかに属する請求項９記載の組換え微生物。
【公開番号】特開２０１２−３４６０５（Ｐ２０１２−３４６０５Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７６１９５（Ｐ２０１０−１７６１９５）
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
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