結晶ＥＧＦＲ−マツズマブ複合体、及び、得られたそれらのマツズマブ模倣物
本発明は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、及び、抗−ＥＧＦＲ抗体のマツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）のＦａｂ断片によって形成された結晶複合体に関する。特に、本発明は、抗体マツズマブが抗原として認識し、かつ、特異的に結合する前記ＥＧＦＲにおけるエピトープ領域の同定に関する。本発明は、更に、ＥＧＦＲにおけるそのエピトープ領域へのマツズマブの結合を模倣するタンパク質、ペプチド、及び、抗体構造に関し、従って、マツズマブと比較して同様の、又は改良された性質を有するＥＧＦＲアンタゴニストとして用いられうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、及び、抗−ＥＧＦＲ抗体のマツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）のＦａｂ断片によって形成された結晶複合体に関する。特に、本発明は、抗体マツズマブが抗原として認識し、かつ、特異的に結合する前記ＥＧＦＲにおけるエピトープ領域の同定に関する。本発明は、更に、ＥＧＦＲにおけるそのエピトープ領域へのマツズマブの結合を模倣するタンパク質、ペプチド、及び、抗体構造に関し、従って、マツズマブと比較して同様の、又は改良された性質を有するＥＧＦＲアンタゴニストとして用いられうる。
【背景技術】
【０００２】
シグナル変換経路中の関連性ある構成要素の医薬的標的を介したこれらのシグナル変換経路の破壊は、様々なタイプの癌の治療のために効果的な治療上の選択肢になっている。癌細胞における膜チロシンキナーゼ受容体は、特に、興味深い標的であり、膜受容体の表皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーは、最も有望な標的の一つである。
ＥＧＦファミリーは、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）からなる。ＥＧＦＲは、１７０ｋＤの膜貫通糖タンパク質であって、（１）６２１アミノ酸残基からなるアミノ末端細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインを含む）；（２）安定化に寄与しうるシグナル２３アミノ酸膜貫通固定領域；及び（３）細胞質標的を活性化するチロシンキナーゼ活性を有する５４２アミノ酸Ｃ末端細胞内ドメインを含む。ＥＧＦＲを刺激するリガンドの例は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−ｃｃ（ＴＧＦ−ａ）、ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）、３−セルリン（ｃｅｌｌｕｌｉｎ）、及び、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）−１を含む。特異的リガンドの結合は、ＥＧＦＲ自己リン酸化、レセプターの細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、及び、腫瘍成長及び腫瘍生存を制御する多様なシグナル変換経路の開始を引き起こす。
【０００３】
ＥＧＦファミリー由来の受容体の機能の変化、特にＥＧＦＲの制御解除は、自己制御細胞成長、侵入、血管形成能、及び、転移の進行に関連することが分かっている。
ＥＧＦ様成長因子のようなリガンドは、多様な成長制御シグナル伝達経路を開始する細胞外ドメインへの結合を介してＥＧＦＲを活性化する。２つの最も関連する経路は、ＭＡＰＫ（細胞外シグナル伝達制御キナーゼ［ＥＲＫ］としても知られるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）マイトジェン経路、及び、ホスファチジルイノシトール３-キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ［ＰＫＢ］としても知られる）経路である。
ＭＡＰＫ経路は、細胞質基質、核、及び、細胞膜における多くの基質分子の活性化を介して、遺伝子転写及び増殖を制御する。細胞膜へのＡｋｔの漸増が、抗アポトーシスのシグナルの発現増加、プロアポトーシスのシグナルの発現減少、及びｍＲＮＡ転写の活性化に起因して、生存促進性のシグナル伝達を引き起こす点で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路は、細胞生存を仲介する。
【０００４】
異常型のＥＧＦＲシグナリングによる原癌遺伝子形質転換は、様々な異なるメカニズムの結果であり、受容体過発現；活性化変異；細胞内チロシンキナーゼ部分及び受容体自己リン酸化を活性化するＥＧＦＲの立体配座の改変を誘導するために必要な二量化プロセスの変化；自己分泌成長因子のループの活性化；及び特異的ホスファターゼの欠陥を含む。細胞外ドメインの変異を有する様々なＥＧＦＲ形態は、同定されており、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、様々なタイプの癌に関連する。
受容体タンパク質チロシンキナーゼ、例えばＥＧＦＲキナーゼは、ホモ二量化及びヘテロ二量化の双方を受けることができ、ホモ二量化受容体の組合せは、対応するヘテロ二量化受容体の組合せよりも分裂促進と形質転換とが起こりにくい（シグナル伝達が開始しないか、あまり起こらない）ことに注目するべきである（Ｙａｒｄｅｎ及びＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２，１２７ -１３７；Ｔｚａｈａｒ及び Ｙａｒｄｅｎ，１９９８，ＢＢＡ １３７７，Ｍ２５-Ｍ３７）。
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、様々な表皮性癌中で異常に活性化され、抗癌治療の治療標的として多くの関心が向けられている。ＥＧＦＲは、増殖、分化、及び、アポトーシスのような重要な細胞プロセスに関与する４つの受容体チロシンキナーゼのファミリー（まとめてＥｒｂＢ受容体として知られている）のひとつである（Ｈｕｂｂａｒｄ及びＭｉｌｌｅｒ，２００７）。過発現又は変異を介したＥＧＦＲの誤制御は、常時活動又は受容体ダウンレギュレーション障害をもたらし、そして、細胞の悪性転換を引き起こしうる（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＢａｓｅｌｇａ，２００６）。
【０００５】
ＥＧＦＲの細胞外領域のこれまでの５年間の構造研究に基づいて、あるモデルが、ＥＧＦＲのリガンド依存的二量化及び活性化のために提案された。ＥＧＦＲの細胞外領域の二量化は、ＥＧＦＲのドメインＩＩによってもたらされる主要な相互作用による完全な受容体媒介性である。ＥＧＦ−ＥＧＦＲの細胞外ドメイン複合体の結晶構造（受容体ドメインが二量体型で存在する）は、Ｏｇｉｓｏ，Ｈ．等，２００２，Ｃｅｌｌ １１０，７７５-７８７によって提供されている。低い、非生理的ｐＨで結晶化して得られたＥＧＦ−ＥＧＦＲ細胞外ドメイン複合体の構造（該受容体は、単量体型で存在する）も、提供されている（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．等，２００３，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，５０７-５１７）。二量形態の形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）−ＥＧＦＲ細胞外ドメイン複合体の構造も決定されている（Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｐ．等，２００２，Ｃｅｌｌ １１０，７６３−７７３）。リガンドが存在しない状況において、受容体は、ドメインＩＶとの分子内相互作用、又は、結合におけるほとんどの二量化接触部分をふさぐ非常に様々な配座を選択できる。リガンド結合により、ＥＧＦＲの細胞外ドメインは、劇的なドメイン再構成を受ける。さらなるリガンド誘導配座の変化は、二量化に必要なドメインＩＩの正確な配座を安定化させる。受容体二量化は、細胞内のチロシンキナーゼドメインを、それらのアロステリックな活性を促進する、閉じた近傍に至らしめる。このメカニズムは、受容体Ｘ線構造の細胞外領域との相互作用を介してＥＧＦＲ活性を阻害する多くの方法を提案し、そして、受容体−抗体複合体の生化学的分析は、ＥｒｂＢ受容体シグナル伝達の効果的な阻害をもたらす結合の様々な様式を示す。
【０００６】
薬理学的標的ＥＧＦＲへの様々な可能なストラテジーには、例えば、細胞外ドメインに結合するための活性化ＥＧＦＲリガンドと競合するためのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）；受容体の細胞内のチロシンキナーゼドメインの小分子阻害剤；腫瘍細胞に毒素を送達するためのＥＧＦＲリガンド共役毒素；ＥＧＦＲレベルを低減するためのアンチセンスのヌクレオチド；及び、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の下流エフェクターの阻害剤がある。
悪性細胞における異常なＥＧＦＲシグナル伝達を標的にするために臨床上用いられる第一のストラテジーは、ＭＡｂの使用である。抗ＥＧＦＲ抗体は、受容体／リガンド相互作用、異常なシグナル伝達並びに腫瘍細胞増殖及び腫瘍細胞増大のブロックを破壊するだけでなく、該抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を介して抗腫瘍エフェクターを調整することもできる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＩｇＧへの低親和性受容体ＦｃｙＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６を介して、抗体分子の炭素末端側終端を認識することによって、ＡＤＣＣを仲介する。ＮＫ細胞は、従って、抗体-被覆腫瘍細胞と密接に相互作用でき、ネクローシス及びアポトーシスを介して細胞を破壊することができる。
【０００７】
開発された第一のマウス抗ＥＧＦＲ ＭＡｂは、動物モデルにおいて優れた抗-腫瘍活性を示した。しかしながら、それらの臨床使用は、患者におけるヒトの抗マウス抗体の高発生率に起因して制限され、薬効が弱まった。この欠点に応じて、研究者は、抗-ＥＧＦＲ ＭＡｂのキメラのヒト化形態を開発した。
セツキシマブ（ＩＭＣ-Ｃ２２５，Ｅｒｂｉｔｕｘ）キラル抗ＥＧＦＲ抗体は、好結果で臨床試験を終えて、様々な癌の治療として２００３年に用いられ始めたこのタイプの第一のＭａｂだった。癌の治療の活発な臨床開発下において、多くの他の抗ＥＧＦＲ抗体が存在する。それらの一つがマツズマブである。
【０００８】
マツズマブ（ＥＭＤ-７２０００）は、ＥＧＦＲに高い特異性及び親和性で結合するヒト化ｌｇＧ1 ＭＡｂである。動物腫瘍異種移植モデルにおいて、ヒトの癌、例えば頭頸癌、胃癌、膵臓癌、及び肺癌に対する強力な阻害活性を有することが分かっている。マツズマブは、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合をブロックすることが分かっており、それによって、下流シグナル伝達経路を阻害し、そしてそれは免疫細胞においてＦｃＲ結合を介したＡＤＣＣを経て作用することもできる。マツズマブは、癌の治療としての更に開発を進めるために選択された。マツズマブは、ＥＧＦＲ発現ヒト肺腺癌（ＬＸＦＡ６２９）及び胃腺癌（ＧＸＦ２５１）及び膵臓腺扁平上皮癌（ＰＡＸＦ５４６）の外科標本に対して抗腫瘍活性を示し、該外科標本は、化学療法薬（ブレオマイシン、シスプラチン、ビンデシン、パクリタキセル、イホスファミド）に反応しにくく、ヌードマウスに皮下注射されたものである。マツズマブでの治療（腫瘍が７０−１２０ｍｍ3に達したときに開始し、２週間の間、週に一回、腹腔内で０．５又は０．５ｍｇ／マウスで投与）は、全ての３つの腫瘍タイプに対して良好な許容性及び効果があった。高い投与量で治療された胃癌及び肺癌を患った動物で、それぞれ８３％及び８７％で完全寛解が観察された。膵臓腫瘍において著しい減少が観察され、コントロールと比較して３１％の平均腫瘍容積として観察された（２７）。同所性のヒトＬ３．６ｐｌ膵臓腫瘍を有するマウスにおけるマツズマブ（週に２回（biweekly）１００ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍の効能は、同時にゲムシタビン（週に２回１００ｍｇ／ｋｇ）で治療することによって、促進されることが分かった。いずれかの薬剤の単独の治療は、腫瘍の大きさ、並びに、リンパ節及び肝臓の転移を減少させた。これらの効果は、併用治療によって著しく促進された。マツズマブ単独の治療、又はゲムシタビンとの併用の治療は、微小血管密度及び増殖指数も著しく減少させた。治療は、腫瘍細胞注入の後に早く投与された場合に、最も有効であった（２８）。インビトロ及びインビボでの研究からの結果は更に、マツズマブの抗腫瘍効果はＡＤＣＣを関与させることが提案されている。
【０００９】
マツズマブ（ＩＭＣ−ｈ４２５としても知られるＥＭＤ ７２０００）の様々な領域のアミノ酸シークエンス及びその抗腫瘍効能は、ＵＳ ５，５５８，８６４及びＥＰ ０５３１ ４７２ Ｂ１にも記載されており、これら文献は参照により組み込まれる。
マツズマブの完全な軽鎖のペプチドシークエンスは、以下の通りである：（ＶＬは下線部であり、ＣＤＲはボールド体の二重下線部である。）：
【００１０】
【化１】
マツズマブの完全な重鎖のペプチドシークエンスは、以下の通りである：（ＶＨは下線部であり、ＣＤＲはボールド体の二重下線部である。）:
【００１１】
【化２】
【００１２】
ＷＯ ２００６／００９６９４では、このようにセツキシマブによって認識されるＥＧＦＲ上のエピトープドメインを同定するセツキシマブのＦａｂ断片と一緒にＥＧＦＲの可溶性細胞外ドメインによって形成される結晶複合体を開示している。
セツキシマブとマツズマブの併用が、インビトロモデルにおいて相乗効果を生み出すことを証明できたので（ＷＯ ２００４／０３２９６０参照）、これら２つの抗体がＥＧＦＲ上で異なるエピトープに結合することを推定することができた。
従って、マツズマブの模倣物であるペプチド、タンパク質、及び、抗体分子であって、マツズマブの同じエピトープに結合でき、ＥＧＦＲの天然リガンドのアンタゴニストとして作用できるものを同定し、開発するためにマツズマブのエピトープを同定することは、特別に興味深い。
【００１３】
したがって、本発明は、マツズマブの可能性のある模倣物を同定する方法であって、それぞれの結晶複合体から得られる座標の少なくともサブセットに対してスクリーニングすることで同定する方法を提供する。マツズマブに対する模倣物について、ＥＧＦＲ依存の病状又は疾病の治療に有用なＥＧＦＲアンタゴニストを得るために、生物学的活性のアッセイを行うことができる。ＥＧＦＲアンタゴニストは、制限されないが、リガンド結合のブロック、受容体二量化の阻害、受容体基質リン酸化、遺伝子活性、及び、細胞増殖の最終的な阻害によって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害するための受容体と相互作用する。好ましくは、アンタゴニストは、マツズマブと比較して、実質的に同様の又は改良された効果を有する。アンタゴニストは、ＥＧＦＲ発現と関連する病状の治療のために用いられる。このような疾病は、好ましくは、ＥＧＦＲを発現、又は、過剰発現する腫瘍を含み、それは、ＥＧＦＲのリガンドによって刺激されうる。また、ＥＧＦＲのリガンドによって刺激される過剰増殖性の疾病も含まれる。
【００１４】
本発明の更なる目的は、セツキシマブ、又はセツキシマブの公知のエピトープ（本発明の結果に従うとマツズマブのエピトープと異なる）に結合するセツキシマブ以外のペプチド、タンパク質、若しくは抗体分子と、上記マツズマブ模倣物を併用することである。これらの抗体（マツズマブ及びセツキシマブ）、又は、これらのエピトープに対する同様の若しくは改善された結合特性を有するように特異的に設計されたこれらの抗体の模倣物を用いて、これらの２つの抗体（マツズマブ及びセツキシマブ）によって認識されるＥＧＦＲにおけるエピトープを特異的にブロックすることによって、ＥＧＦＲ関連疾患及び疾病の治療の改善がなされるべきである。なぜならマツズマブ又はセツキシマブのような天然の抗体が好適な結合親和性を有することは、本来、推定することができないためである。従って、重要なエピトープ（リガンド結合をブロックし、チロシンキナーゼシグナル伝達をなくすか、減らす）を認識することは、マツズマブ（及び、場合によってはセツキシマブ）と比較して、同様か、又は好ましくは改善された特性を有する新規のエピトープ結合剤を設計し、開発することを可能にするために、特別重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、初めて、ＥＧＦＲの細胞外領域の切断型に結合したマツズマブ（Ｆａｂ７２０００）のＦａｂ断片の結晶構造を示す。この構造によって、マツズマブが、リガンド及びそのドメインにおけるセツキシマブ結合領域の双方と異なるＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおける新規のエピトープに結合することが分かった。この構造に基づいて、発明者は、二量化に必要な配座を取るためのＥＧＦの立体障害によって決定されるＥＧＦＲ活性の阻害の新規メカニズムを提案する。この新規のメカニズムは、現在の薬剤の応用及び新しい抗-ＥＧＦＲ治療の開発の双方に対して影響を及ぼす。
一つの局面において、本発明は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン及びセツキシマブのＦａｂの受容体-抗体複合体を含む受容体−抗体複合体の結晶を提供し、該複合体において、結晶は、Ｘ線結晶学によって決定される約５．０オングストローム（Å）より良い分解能を有する。好ましくは、結晶は、Ｘ線結晶学によって決定される約４．０オングストロームより良い、更に好ましくは、約３．０オングストロームより良い分解能を有する。
【００１６】
結晶は、空間群Ｃ２に属し、ユニットセル次元が、a＝141Å（± 3Å）、b＝205Å（±3Å）、c＝81Å（±3Å）、及び、β＝117°（±1°）である。好ましくは、結晶複合体は、以下のユニットセル次元を有する：a＝141.1Å（±0.3Å）、b＝205.0Å（±0.3Å、c＝81.6Å（±0.3Å）、及びβ＝117.5°(±0.5°)。
別の局面において、本発明は、マツズマブ、好ましくはマツズマブのＦａｂ断片が、特異的に結合するＥＧＦ受容体ドメインＩＩＩにおけるエピトープ領域を提供する。このエピトープは、ＥＧＦ受容体における位置４３３〜４６６の範囲中の位置、特に詳細にはSer433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464、又は、Ile466に位置する１つ以上のアミノ酸残基を含む。好ましくは、位置Trp452からThr464の間の完全なシークエンストラックが、マツズマブの抗原領域として認識されるようであることを発見できた。このシークエンストラックは、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩベータへリックスのループに対応する。それと対照的に、セツキシマブは、このシークエンストラックの外のアミノ酸Gln384、Gln408、Ser418、Ser440、Lys465、Ser468、及び、Asn469と相互作用する（ＷＯ２００６／００９６９４）。
【００１７】
少なくとも、マツズマブのドメインのＣＤＲ領域又はＣＤＲ近接領域における以下のアミノ酸は、上記規定された受容体アミノ酸残基との相互作用／結合に関与する：
CDR1、軽鎖：Tyr31
CDR2、軽鎖：Asp49
CDR3、軽鎖：Trp90、His93
CDR1、重鎖：(Thr30)、Ser31、Trp33、His35
CDR2、重鎖：Asn52、Ser54、Glu50、Asn55、Asn59
CDR3、重鎖：Tyr103、Tyr101、Asp100
受容体の位置Lys454は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Ser54、Ser31、Asp100、Tyr101、Asn52、Ser54、Asn55 (全て重鎖)。
受容体の位置Lys455は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Ser54、Asn55 (全て重鎖)。
受容体の位置Leu456 は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Asn55 (重鎖)。
受容体の位置Phe457は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、Asn52、Asn55 (全て重鎖)。
受容体の位置Gly458は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、Asn59 (全て重鎖)。
受容体の位置Thr459は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、Glu50 (全て重鎖)、Trp90、His93 (全て軽鎖)。
受容体の位置Ser460は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、His35、Glu50、Tyr101 (全て重鎖)。
受容体の位置Gly461は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp90、Tyr31 (全て軽鎖)。
受容体の位置Lys463は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Tyr31、Asp49 (全て軽鎖)、Tyr101 (重鎖)。
受容体の位置Thr464は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Tyr103 (重鎖)。
【００１８】
他の局面において、本発明は、前記模倣物／類似体の３次元構造を、上記で規定された結晶複合体の決定された３次元構造と、比較することを含むマツズマブのペプチドの模倣物又は類似体を同定する方法を提供する。好ましくは、模倣物の３次元構造は、少なくともマツズマブの結晶座標のサブセットと比較される。
更なる局面において、本発明は、ドメインＩＩＩを含む可容性細胞外ＥＧＦＲ、及び、マツズマブのＦａｂ断片又はマツズマブ模倣物によって形成される結晶複合体を提供し、ここで、受容体原子及びマツズマブ／マツズマブ-模倣物の間の結合-関連の原子-原子距離は、４Å未満であり、好ましくは３Å未満である。好適な態様において、マツズマブ／ＥＧＦＲ複合体の前記距離は、表２に規定されるようなそれぞれの値である。
一つの態様において、マツズマブのＦａｂと結合するか、又は本質的に相互作用する、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のＥＧＦＲアミノ酸の座標に対して、模倣物／類似体の３次元構造を比較することで、模倣物／類似体が同定される。このようなＥＧＦＲアミノ酸は、Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464、及び、Ile466からなる群から、好ましくは、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、及び、Thr464からなる群から選択される。
また、他の態様において、アミノ酸残基約４４８からアミノ酸残基約４６４からなる群から、好ましくはアミノ酸残基４５３又は４５４からアミノ酸残基約４６４からなる群から選択されるＥＧＦＲの領域の原子座標と、模倣物の３次元構造を比較することによって、スクリーニングが行われる。また、別の態様において、ＥＧＦＲの更なるアミノ酸残基、例えばSer433〜Asn452が含まれる。
【００１９】
ＥＧＦ受容体における以下の位置と結合するか、又は相互作用するマツズマブの模倣物、又は、ＥＧＦ受容体における少なくとも以下の位置で結合するか、又は相互作用するマツズマブの模倣物は、特に重要であり、価値がある：
(1) Lys454
(2) Lys454及びLys455
(3) Lys454及びLys455及びPhe457
(4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460
(7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461
(8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461及びLys463
(9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461及びLys463及びThr464
(10) Phe457
(11) Phe457及びLys454
(12) Phe457及びLys454及びGly458
(13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461
(16) Thr459
(17) Thr459及びLys454
(18) Thr459及びLys454及びPhe457
(19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及びGly461
(22) Ser460及びLys454
(23) Ser460及びLys454及びPhe457
(24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(26) Lys454及びPhe457
(27) Lys454及びPhe457及びSer460
(28) Lys454及びPhe457及びGly461
(29) Lys454及びPhe457及びThr459
(30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(32) Phe457及びSer460
(33) Phe457及びThr459及びSer460
(34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(35) Ala448
(36) Ala448及びAsn449
(37) Ala448及びLys454
(38) Ala448及びLys454及びPhe457
(39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(44) Asn449
(45) Asn449及びLys454
(46) Asn449及びLys454及びPhe457
(47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(51) Ser433及び/又はAsp433を含むこれらの選択肢(1)-(50)のいずれか。
【００２０】
本発明における模倣物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は、免疫グロブリン、又は、それらの断片でありうる。該模倣物は、場合によっては、小さな、非ペプチドの分子、又は、部分的なペプチドの分子であってもよい。どのような場合であっても、模倣物は、ＥＧＦＲの天然リガンドに対するＥＧＦ受容体を阻害し、ブロックすること、及び、チロシンキナーゼ活性をなくすか、又は低減することについて、マツズマブの重要な生物学的特性を有する。
本発明の別の局面において、抗体又はその断片である模倣物は、少なくともマツズマブの単鎖ＣＤＲ領域において、及び／又は、ＣＤＲと相互作用し、その配座に影響する抗体の非ＣＤＲアミノ酸で、１個以上の置換の導入によって同定される。ある態様において、多くても、単一置換が、各ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、又は、ＣＤＲの一つのみで起こる。他の態様において、置換は、単に、ＣＤＲ３中で、又は、ＣＤＲ３の配座に影響するアミノ酸で起こる。別の好適な態様において、置換は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３中で行われ、抗体配座に影響する各ＣＤＲの環境の中で行われても良い。好ましくは、置換は重鎖ＣＤＲ中で起こる。
改良された模倣物を得るために修飾されたマツズマブのＣＤＲ中の好適な位置は、Trp90及びHis93（それぞれ軽鎖のＣＤＲ３）、Asp100、Tyr101、及び、Tyr103（それぞれ重鎖のＣＤＲ３）、Glu50、Asn52、Ser54、及びAsn55（それぞれ重鎖のＣＤＲ２）、Ser31及びTrp33（それぞれ重鎖のＣＤＲ１）である。
【００２１】
本発明の更なる局面において、ＷＯ ２００６／００９６９４（ここに、参照により組み込まれる）によって提供されるようなセツキシマブ、又は、セツキシマブの模倣物と治療学的に併用されうるマツズマブの模倣物を同定することを提供する。一つの態様において、薬学的併用は、本発明において同定されたマツズマブ模倣物、及び、セツキシマブ模倣物で行われる。マツズマブ模倣物は、リスト(1)〜(51)に示されるようなＥＧＦＲエピトープ残基とのその結合／相互作用活性によって特徴付けられ、そして、セツキシマブ模倣物は、ＥＧＦＲエピトープ残基Gln384、Gln408、Ser418、Ser440、Lys465、Ser468、及びAsn469からの一つ以上とのその結合／相互作用活性によって特徴付けられる。従って、本発明の他の局面は、マツズマブの模倣化合物、好ましくは抗体、及び
（ｉ）ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ）ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ）ＥＧＦＲの以下のアミノ酸残基、又は、少なくとも４個のアミノ酸のサブセットと結合するか、又は相互作用する第２の化合物を含む化合物の組成物である：
Gln 384、Gln 408、Ser 418、Ser 440、Lys 465、Ser 468、及び、Asn 469。
【００２２】
本発明は、さらに、記載されたような模倣物を合成し、その結合又は生理学的活性をアッセイすることで、ＥＧＦＲ機能を阻害し、かつ、ＥＧＦＲ関連疾病又は病状を治療するために有用なＥＧＦＲアンタゴニストを選択する方法を提供する。本発明のある局面において、受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害する模倣物が提供される。本発明の別の局面において、模倣物は、細胞で発現するＥＧＦＲの二量化を阻害する。好ましくは、模倣物は、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合をブロックする。本発明の模倣物は、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲの機能活性を阻害し（好ましくは、マツズマブと同様か、より高い程度で）、セツキシマブと併用することもできる。
詳しくは、本発明は、更にマツズマブの模倣物候補、好ましくは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は免疫グロブリン、更に好ましくは、標的抗体若しくは抗体断片であって、マツズマブと類似の、又は同様の生物学的活性を有するものを同定し、選択する方法を提供する；前記方法は、（ａ）模倣物-ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中のＥＧＦＲに結合した模倣化合物、又は、その断片の結合座標を、
（ｂ）請求項１又は請求項４に規定されたマツズマブ−ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中でＥＧＦＲに結合するマツズマブのＦａｂ断片の結合座標と、
比較することを含み、
前記結合座標が、以下の（i）〜（ｉｉｉ）によって定義される。
【００２３】
（ｉ）マツズマブのＦａｂ断片と結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基の位置；該位置は、以下のアミノ酸又は少なくとも３個、４個、５個、及び６個のアミノ酸残基の群から選択される：
Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466、より具体的に言うと：
(a1) Lys454
(a2) Lys454及びLys455
(a3) Lys454及びLys455及びPhe457
(a4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(a5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(a6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460
(a7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461
(a8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463
(a9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463及びThr464
(a10) Phe457
(a11) Phe457及びLys454
(a12) Phe457及びLys454及びGly458
(a13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(a14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(a15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a16) Thr459
(a17) Thr459及びLys454
(a18) Thr459及びLys454及びPhe457
(a19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(a20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(a21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及び
Gly461
(a22) Ser460及びLys454
(a23) Ser460及びLys454及びPhe457
(a24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(a25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(a26) Lys454及びPhe457
(a27) Lys454及びPhe457及びSer460
(a28) Lys454及びPhe457及びGly461
(a29) Lys454及びPhe457及びThr459
(a30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a32) Phe457及びSer460
(a33) Phe457及びThr459及びSer460
(a34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a35) Ala448
(a36) Ala448及びAsn449
(a37) Ala448及びLys454
(a38) Ala448及びLys454及びPhe457
(a39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(a40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(a41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(a42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a44) Asn449
(a45) Asn449及びLys454
(a46) Asn449及びLys454及びPhe457
(a47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(a48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(a51) Ser433及び／又はAsp433を含む選択肢(a1)−(a50)のいずれか、
【００２４】
（ｉｉ）これらの位置のＥＧＦＲアミノ酸の中の特定の原子と、これらの位置のＥＧＦＲの前記アミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する模倣化合物の中での特定の原子との間の距離、及び、
（ｉｉｉ）参照として、これらの位置のＥＧＦＲアミノ酸の中の特定の原子と、マツズマブのＦａｂ断片の中の特定の原子との間の距離（ここで、前記位置のＥＧＦＲのアミノ酸残基の原子と、前記結晶複合体中でそれらと結合するか、又は相互作用する模倣化合物の原子との間の距離が、４Å未満であり、好ましくは３Å未満であり、場合によって２Å未満である）。
【００２５】
他の局面において、本発明は、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）ではない化合物、又はマツズマブの模倣化合物を提供し、該化合物は、
（ｉ）ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ）ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ）ＥＧＦＲの位置４４８と４６４との間の、好ましくは、ＥＧＦＲの位置４５４と４５９との間のシークエンストラックの少なくとも３個のアミノ酸残基と、結合するか又は相互作用する。より好ましくは、化合物は全てのＥＧＦＲのアミノ酸：Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464と結合するか、又は相互作用し、特に：Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458及びThr459と結合するか、又は相互作用する。
【００２６】
本発明の別の局面において、
・ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
・ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
・ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
・マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する、
抗ＥＧＦＲ抗体を設計する方法であって、
（ｉ） マツズマブの重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ領域中の、又は、ＣＤＲに隣接したフレームワーク領域（ＦＲ）中の、少なくとも１個のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換し、
（ｉｉ） 前記修飾されたマツズマブのＦａｂ断片及びＥＧＦＲの可溶細胞外ドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）によって形成される結晶複合体を調製し、
（ｉｉｉ） 上記で規定されたＥＧＦＲドメイン（例えばシークエンスａ１−ａ５０）中の特定のアミノ酸残基の位置に対する上記のように形成される結晶複合体の原子座標を、ｓＥＧＦＲｄ３と一緒に非修飾のマツズマブによって形成される参照用の結晶複合体の対応する座標と比較し、
（ｉｖ） ＥＧＦＲドメインにおける前記特定のアミノ酸残基の位置に対してより密接な相互作用をとらせる原子座標を有する修飾されたマツズマブを選択し、
（ｖ） 標準方法でその結合親和性及び生物学的活性をアッセイし、そして、
（ｖｉ） 工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返しても良い、方法を提供する。
【００２７】
他の局面において、本発明は、この出願書類に記載された方法によって同定されたマツズマブ模倣物を提供する。
他の局面において、本発明は、同定された模倣分子を投与することを含むＥＧＦＲを阻害する医薬組成物及び方法を提供する。
他の局面において、本発明は、同定された模倣物を投与することを含むＥＧＦＲ発現に関連する疾病又は病状を治療する医薬組成物及び方法を提供する。
ある非限定的な態様において、本発明は、同定された模倣物を投与することを含むＥＧＦＲを発現した腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、マツズマブ模倣物でＥＧＦＲのリガンドによって刺激された過剰増殖性疾病を治療する医薬組成物及び方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】マツズマブは、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する。 Ａ．左側のパネルは、固定化Ｆａｂ７２０００に結合したｓＥＧＦＲ及びｓＥＧＦＲｄ３の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析結果を示す。バイオセンサー表面にＦａｂ断片を共有結合させ示された濃度で一連のサンプルをバイオセンサー表面に通過させた。ｓＥＧＦＲ（黒いしるし）及びｓＥＧＦＲｄ３(赤いしるし)で表示したデータを示す。それぞれの濃度での平衡ＳＰＲ反応値を、最大結合量の割合として表す。曲線は、これらのデータを示された単純な１サイトのラングミュア結合式に適合させたものである。ＫD値（少なくとも３回の独立した結合実験に基づく）は、ｓＥＧＦＲで１０３．２±４．０ｎＭであり、ｓＥＧＦＲｄ３で５０．１±１．３ｎＭである。 右側のパネルは、固定化ＥＧＦへのｓＥＧＦＲの結合に競合するＦａｂ７２０００の能力を示す。６００ｎＭのｓＥＧＦＲのサンプルへのＦａｂの示された過剰量の添加で得られた平衡ＳＰＲ反応を示し、Ｆａｂを添加しないで得られた反応と比較して規格化した。比較のために、Ｆａｂを添加しない場合のｓＥＧＦＲの結合、及び、セツキシマブ（ＦａｂＣ２２５）由来のＦａｂ断片の２倍モル過剰量添加による予め報告されている値を示した（Ｌｉ等、２００５）。各データの点は、少なくとも３回の独立した測定の平均値である。
【図１Ｂ】Ｂ．左側において、Ｆａｂ７２０００：ｓＥＧＦＲｄ３複合体の模型図を示す。参照のために、同じ配向でドメインＩＩＩと連結されたｓＥＧＦＲの模型図を、その左に示す。ドメインＩは赤色に着色され、ドメインＩＩは緑色に着色され、そして、ドメインＩＩＩ及びＩＶは、灰色の中にそれぞれ赤色及び緑色で強調された第２の構造要素を含む。Ｆａｂ７２０００は、ＶL鎖がシアンに着色され、ＶHが黄色に着色されている。図中のボックス（□）は、図１Ｃで示されるＦａｂ７２０００：ｓＥＧＦＲｄ３複合体の領域を示す。矢印は、図１Ｃ中で詳細に表す目的で行われる回転を示す。
【図１Ｃ】Ｃ．ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおけるＦａｂ７２０００結合サイトの拡大図である。ＶL及びＶH鎖は、灰色の中でそれぞれシアン及び黄色で強調されて表される。相互作用するＣＤＲは、ＶL鎖のＬ２及びＬ３がシアンで示され、Ｈ２及びＨ３が黄色で示される。主要な相互作用に関与するアミノ酸の側鎖を示す。アミノ酸は、Ｆａｂ７２０００のＶH由来のアミノ酸が黄色背景で、ＶL由来がシアン背景で、ｓＥＧＦＲｄ３由来が黒で標識されている。水素結合は、緑色の破線で示される。
【図２】ドメインＩＩＩにおけるマツズマブ結合サイトは、ＥＧＦ／ＴＧＦａ結合サイトをふさがない。 Ａ．ｓＥＧＦＲにおけるマツズマブエピトープの変異の分析結果である。固定化ＥＧＦへの変異ｓＥＧＦＲの結合が黒色で示され、Ｆａｂ７２０００表面への変異ｓＥＧＦＲの結合が赤色で示される。データは、図１Ａにおいて記載されたように表される。ＳＰＲ反応は、野生型ｓＥＧＦＲの反応の結合の％割合として表す。 Ｂ．図１Ｂと同じ配向におけるドメインＩＩＩの表面図を示す。左側において、表面はマツズマブの結合サイト（赤色）及びＥＧＦの結合サイト（緑色）で着色されて示される。Ａにおける結合の実験での変異残基は標識されている。右側に、ドメインＩＩＩの同じ配向で、セツキシマブの結合サイト（黄色）、ＥＧＦの結合サイト（緑色）、及び、それらの重複（青色）を示す。
【図３Ａ】マツズマブによるＥＧＦＲの阻害のメカニズムに対する影響 Ａ．右側にＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３の複合体、左側にＥＧＦ結合ｓＥＧＦＲ二量体の模型図を示す。Ｆａｂ７２００／ｓＥＧＦＲｄ３の複合体中のドメインＩＩは、二量体の右のプロモーター中のドメインＩＩＩと同じ配向である。ドメインＩＩＩは赤色／灰色で示され、Ｆａｂ軽鎖がシアン、及び重鎖が黄色で示される。二量体において、リガンドは、紫色に着色され、ドメインＩ及びＩＩＩは赤色に着色され、ドメインＩＩは緑色に着色されている。ドメインＩＩＩにおける第２の構造要素は灰色で陰影を付けられている。矢印は、図３Ｂ中の該配向への回転を示す。
【図３Ｂ】Ｂ．拡大された受容体配座のＦａｂ７２０００モデルの概略図である。Ｆａｂは、軽鎖がシアンに着色され、重鎖が黄色に着色された表面図で示される。受容体ドメインは、模型図のように示され、ドメインＩが赤色に着色され、ドメインＩＩが緑色に着色され、ドメインＩＩＩが赤色／灰色に着色されている。ドメインＩのＮ-末端は、ボックス１で示されたように軽鎖と衝突する。ボックス２は、図３Ｃでより詳細に示される領域を示す。
【図３Ｃ】Ｃ．二量化構成要素受容体配座でのドメインＩＩ／ＩＩＩ相互作用を安定化する二量体に近接したＦａｂ７２０００の拡大図である。ｓＥＧＦＲドメインＩＩは緑色に着色された球体で示され、ドメインＩＩＩは赤色／灰色に着色された模式図で示される。ドメインＩＩ及びＩＩＩにおける二量化安定性に関与する極めて重要なアミノ酸は、黒で着色されている。ドメインＩＩ／ＩＩＩ相互作用を介して二量体接触部分に曝されたドメインＩＩループ（残基Ｄ２７９及びＨ２８０）は、アスタリスクの印がつけられている。Ｆａｂ７２０００ ＶLは、表面図にて灰色で示される。結合は、破線の黒い線で示される。ドメインＩ、ＩＶ、及びＶHは、相互作用を明確に示すために記載されていない。
【図３Ｄ】マツズマブ及びセツキシマブによるＥＧＦＲ二量化の阻害の異なるメカニズム 模型図の中心は、リガンド誘導ＥＧＦＲ二量体を示し、ドメインＩが赤色、ドメインＩＩが緑色、ドメインＩＩＩが赤色の縁で囲まれた灰色、ドメインＩＶが緑色の縁で囲まれた灰色で示され、そして、リガンド（Ｅ）が紫色で示され、１つのプロモーターの色が対比的に強調される。Ｆａｂ７２０００がｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合し、受容体が立体的に二量化を必要とする配座を取れないようにする。重要なことは、Ｆａｂ７２０００は、高い親和性で引き起こされる二量体の構成で重要なドメインＩＩの局所的な配座変化をブロックすることである。阻害は、非競合的である；ドメインＩＩＩにおけるリガンド結合サイトは、ブロックされない。これとは対照的にＦａｂＣ２２５（セツキシマブ）は、ドメインＩＩＩにおけるリガンド結合サイトをブロックし、かくしてリガンド誘導受容体二量化及び活性化を抑制する競合阻害剤である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本発明は、ＥＧＦＲ細胞外ドメイン、特に、ドメインＩＩＩの共結晶を提供する。該結晶は、好ましくは、空間群Ｃ２及び以下のユニットのセル次元を有する：
a＝141.1Å(±0.3Å)、b＝205.0Å(±0.3Å)、c =81.6Å(±0.3Å)、及び、β＝117.5°(±0.5°)。
ＥＧＦＲ−マツズマブのＦａｂ複合体の結晶化は、マツズマブのＦａｂ及びＥＧＦＲの溶液から、様々な技術、例えば、マイクロバッチ、水滴法、シッティングドロップ（sitting drop）、サンドウィッチドロップ（sandwich drop）、播種、及び、透析を用いて行われうる。溶液は、好適なバッファー中で、ＥＧＦＲ細胞外ドメインをマツズマブのＦａｂと結合させることで調製される。標準的なバッファー剤は、例えば、ヘペス、トリス、ＭＥＳ、及び、酢酸が用いられうる。バッファー系は、特に、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム／カリウム、酢酸アンモニウムのような塩の添加によって処理されてもよい。イミダゾールは、バッファーとして用いてもよい。塩の濃度は、好ましくは約１０ｍＭ〜約５００ｍＭであり、より好ましくは、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭであり、最も好ましくは、約５０ｍＭである。バッファーのｐＨは、好ましくは約６〜約８であり、より好ましくは約６〜約７である。溶液中のタンパク質の濃度は、好ましくは、沈殿が生じるほどの過飽和濃度である。溶液は、タンパク質安定剤を含んでもよい。
【００３０】
一つの態様において、沈殿剤、すなわち沈殿を誘導する試薬の存在によってタンパク質の可溶性を減少させる貯蔵器と該溶液との接触で、結晶を沈殿させる。このような接触は、蒸気拡散で行われうる。沈殿剤の例は、硫酸アンモニウム、エタノール、３−エチル−２，４ペンタンジオール、及び、グリコールを含み、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。利用されるＰＥＧは、好ましくは、約４００〜約２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０００Ｄａの分子量を有し、であって、約１０％〜約２０％の濃度、より好ましくは、約１５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する。いくつかの沈殿剤は、タンパク質溶解性に好ましくないバッファーｐＨにすることによって作用しうる。
結晶化の間の温度は、好ましくは約０℃〜約３０℃であり、より好ましくは約２０℃〜約３０℃であり、最も好ましくは約２５℃である。構造の生成に加えて、本発明の結晶化技術は、タンパク質の純度を増加させることにも用いられうる。
【００３１】
ある態様において、ＥＧＦＲと接触するマツズマブの模倣化合物の少なくともいくつかの原子の位置は、ＥＧＦＲと接触するマツズマブの原子の位置と対応する。好ましくは、１〜４Å、好ましくは１〜３Åの距離範囲内で対応する。この原子は、通常、マツズマブのＦａｂの対応する原子と同様の様式（すなわち、極性、塩基性、酸性、疎水性）でＥＧＦＲと相互作用する。模倣物は、様々な数の上記の対応する原子を含むことができ、ＥＧＦＲへの模倣物の結合は、上記の対応する相互作用に、完全に又は部分的にのみ依存しうる。ある態様において、このようなＥＧＦＲとの原子相互作用は、ＥＧＦＲと相互作用する模倣物の他の原子の相互作用によっても補完されうる。模倣物の結合能は、本分野で公知の様々なコンピューター法及びプログラムによって評価されうる。
本発明における模倣物は、ＥＧＦＲに結合し、そして、インビボ及びインビトロの双方においてマツズマブの効果、好ましくは、ＥＧＦＲアンタゴニストとしての効能を模倣する。模倣化合物は、ＥＧＦＲとの親和性、好ましい効能及び／又は好ましい選択性のような基準に基づいて設計されうる。これらの模倣物は、少なくともマツズマブの独自の生物学的活性又は結合活性を有する。生物学的活性及び／又は結合活性を決定するための方法及びアッセイは、本分野において公知である。
【００３２】
ここで用いられる用語「模倣物」又は「模倣化合物」は、ＥＧＦＲへの特異性を模倣した化合物を含む。特に、模倣化合物は、マツズマブと同等にＥＧＦＲをブロックすることによってチロシンキナーゼ活性を阻害する。好ましくは、本発明における模倣化合物は、ペプチド又はポリペプチドであり、又は、より好ましくは、抗体又はその標的ＣＤＲ含有断片である。最も厳密な意味において「模倣物」は、マツズマブと異なる抗体（例えば修飾されたマツズマブ）であるが、マツズマブと比較したときに、ＥＧＦＲに関する生物活性が同様であるか又はまったく同じである抗体である。
好適な模倣化合物のスクリーニング及び選択の後に、選択された模倣物を合成でき、そして、模倣物の生物学的活性又は生理学的活性を測定するために行われる様々なアッセイでＥＧＦＲアンタゴニストが選択される。好適なＥＧＦＲアンタゴニストは、以下の特性の１つ以上を有する：ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害すること；ＥＧＦＲへのリガンド結合をブロックすること；ＥＧＦＲ二量化（ＥＧＦＲのホモ二量体又は他のＥＧＦＲファミリー受容体サブユニットとのヘテロ二量体）を阻害すること；ＥＧＦＲ基質リン酸化を阻害すること；ＥＧＦＲ仲介遺伝子活性化を阻害すること；ＥＧＦＲを発現する細胞の成長又は増殖を阻害すること。好ましくは、アンタゴニストは、マツズマブと比較してＥＧＦＲアンタゴニストとして実質的に同様の又は改良された有効性を有する。
【００３３】
チロシンキナーゼ阻害は、公知の方法を用いて決定されうる；例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、及び／又は、天然の若しくは合成の基質のリン酸化を測定することによって決定されうる。従って、リン酸化アッセイは、本発明のＥＧＦＲアンタゴニストを決定するのに有用である。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウエスタンブロットにおいてリン酸化チロシンに特異的な抗体を用いて検出されうる。チロシンキナーゼ活性のためのいくらかのアッセイは、Panek等, J. Pharmacol. Exp. Thera. (1997) 283: 1433-44及び Batley等, Life Sei. (1998) 62: 143-50に記載されている。
リガンド結合をブロックするための模倣物の能力は、例えば、インビトロ競合アッセイによって測定されうる。ここで、ＥＧＦのようなＥＧＦＲのリガンドを固定して、固定化リガンドへのＥＧＦＲの結合を競合的に阻害するための模倣物の有効性を決定するために結合アッセイを行う。
インビトロアッセイは、ＥＧＦＲアンタゴニストを決定するためにも利用されうる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤が存在するときと存在しないときにおいて受容体リガンドで刺激された細胞ラインを用いてマイトジェンのアッセイによって観測されうる。
【００３４】
別の局面において、本発明は、マツズマブの模倣物の治療的な有効量を投与することで、哺乳類、好ましくはヒトにおける、ＥＧＦＲ依存疾病、疾患、及び、病状を治療する方法を提供する。
本発明のマツズマブ模倣物は、ＥＧＦＲを発現、又は、過剰発現する腫瘍を治療するために特に有用である。ＥＧＦＲ（過剰）発現腫瘍は、この状態においてＥＧＦ存在に特に敏感であり、さらに、腫瘍生成ＥＧＦ又はＴＧＦ−ａによって刺激されうる。
ＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲのリガンドによって刺激される腫瘍の例は、癌腫、グリオーマ、肉腫、腺癌、腺肉腫、及び、腺腫を含む。このような腫瘍は、実際には、体の全ての部分、例えば胸部、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、頸部、又は、肝臓で生じうる。
【００３５】
本発明の他の形態において、マツズマブ模倣物、好ましくはマツズマブのペプチド模倣物又は抗体模倣物は、１つ以上の他の抗腫瘍薬又は細胞毒性薬、例えば化学療法剤（放射能を含んでもよい）と併用投与されうる。このような治療は、本分野では公知である。好適な抗腫瘍薬は、例えばアルカリ化剤又は抗代謝剤であり得る。アルカリ化剤の例は、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、及び、ダカルバジンを含む。抗代謝薬の例は、例えばドキソルビシン（doxorabicin）、ダウノルビシン（daunorabicin）、パクタキセル、及び、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）を含む。さらに、細胞毒性薬は、ＩＬ−２のような好適なサイトカインである。化学療法薬又は細胞毒性薬は、マツズマブの模倣化合物にも結合でき、又は、細胞毒性薬がペプチド又はポリペプチドである場合に、融合タンパク質を形成する抗体又はペプチド模倣物、好ましくは免疫サイトカインと融合できる。
【００３６】
＜マツズマブが、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する＞
ＥＧＦＲへのマツズマブの結合の様式を決定するために、そして、この治療抗体によるＥＧＦＥの阻害のメカニズムを解明するために、この抗体のＦａｂ断片及びＥＧＦＲの細胞外領域間の複合体のＸ線結晶構造を決定した。まず、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化されたＦａｂ７２０００へのｓＥＧＦＲの結合を実験した（実施例参照）。セツキシマブのエピトープは、ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩ上にのみ存在することが予め分かっている（Ｌｉ等、２００５）。
これがマツズマブでも変わらないのかどうか示すために、この同じ固定化Ｆａｂ７２０００への単離ドメインＩＩＩ(ｓＥＧＦＲｄ３；成熟ＥＧＦＲのアミノ酸310-514)の結合を分析した。図１Ａに示されるように、ｓＥＧＦＲ及びｓＥＧＦＲｄ３は、それぞれＫD-値が１０３．２±４．０ｎＭ及び５０．１±１．３ｎＭで固定化Ｆａｂに結合する。セツキシマブに似たマツズマブは、より強固にｓＥＧＦＲｄ３に結合し、これは、おそらくｓＥＧＦＲの他のドメインからの立体障害がないことに起因する。ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅを用いることで、我々は、次に、固定化ＥＧＦへのｓＥＧＦＲの結合と競合するマツズマブの能力を試験した（図１Ａ）。Ｆａｂ７２０００の２倍モル過剰の存在下で、ＥＧＦＢｉａｃｏｒｅ表面上を通ったｓＥＧＦＲの６００ｎＭのサンプルの平衡ＳＰＲ応答は、Ｆａｂを添加しないそれと比較して４５％減少した。さらに５０倍過剰まで添加しても、この結合はさらに減少することは無かった。このことは、Ｆａｂの２倍過剰の添加が、ベースラインに対するｓＥＧＦＲ結合を減少させる、セツキシマブ由来のＦａｂ断片における我々の予めの観察と対照的である（Ｌｉ等，２００５）。
ｓＥＧＦＲへのマツズマブの結合をさらに洞察するために、Ｆａｂ７２０００の構造を、単独及びｓＥＧＦＲ３との複合体において（実験手順及び表１参照のこと）、結晶化した。
【００３７】
＜Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３結合サイト＞
ドメインＩＩＩにおけるＦａｂ７２０００結合サイトは、ドメインＩＩＩベータへリックス（アミノ酸454-464；図１Ｂ）の最もＣ末端のストランドの前にあるループにおいて集中している。このループがＦａｂのＶL鎖及びＶH鎖の間の裂け目の中を貫く。このループの先端は、タイプＩのβターンを形成する。Ｔ４５９及びＳ４６０は裂け目の中に最も深くターンから突き出している。ＥＧＦＲへのセツキシマブの結合で観察されたように、エピトープが抗原上に大きな平面を構成することがより一般的である高分子のタンパク質抗原の認識においては、この様式の結合は珍しい。
Ｆａｂによって形成される全ての主要な相互作用は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来である。各ＣＤＲは、ドメインＩＩＩとの結合に寄与し、接触を決定する重要な特異性の多くは、ＣＤＲ Ｈ２、Ｈ３、及び、Ｌ３でもたらされる。全てのＣＤＲが抗原結合に寄与することは、比較的珍しい（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ及びＭａｒｉｕｚｚａ，2002）。
【００３８】
ｓＥＧＦＲの埋め込まれたループは、ＣＤＲの重鎖及び軽鎖の双方と相互作用をする（図１Ｃ）。エピトープの中心において、Ｔ４５９の副鎖は、Ｆａｂ軽鎖由来のＷ９０及びＨ９３の副鎖と相互作用する。この領域から重鎖への直接の相互作用は、それぞれＣＤＲ Ｈ２由来のＮ５９及びＥ５０の副鎖と相互作用するＴ４５９の骨格カルボニル及びＳ４６０の副鎖から生じる。このｓＥＧＦＲｄ３ループのいずれかの末端のリジン残基は、Ｆａｂにおけるアスパラギン酸との塩橋相互作用をする（重鎖におけるＤ１００とＫ４５４及び軽鎖におけるＤ４９とＫ４６３）。ＣＤＲ Ｈ２及びＨ３の双方からのｓＥＧＦＲｄ３のこのループの主鎖への更なる接触が、Ｆａｂ７２００／ｓＥＧＦＲｄ３接触部分の中心で、水素結合の大規模なネットワークを完成する。
２つの重大な相互作用が、アミノ酸４５４−４６３のループを越えた領域に生じる。ＣＤＲ Ｌ３（Ｈ９３）由来のヒスチジンは、ｓＥＧＦＲｄ３のＤ４３４と相互作用し、一方で、結合サイトの別の側において、ＣＤＲ Ｈ３の頂点由来のＹ１０３が下方に伸びて、Ｎ４９９と相互作用する。
【００３９】
合計２個の塩橋及び１５個の水素結合は、ドメインＩＩＩにおける７５８Å2の溶媒接触可能表面を埋め込んだ接触部分中でのＦａｂ７２０００及びｓＥＧＦＲｄ３の相互作用に関与する（計１５１６Å2の表面が複合体中の溶媒の接触をさえぎる）。多くのこの埋め込まれた表面は無極性であり（７４．１％）、結合接触部分から溶媒が除かれることによって高い結合自由エネルギーを示す（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ等、２０００）。
Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３複合体の接触部分の形状の相補性（ｓｃ）パラメーターは、０．６１である。これは、典型的に観察される抗原-抗体接触部分より低く（０．６４〜０．６８）（Ｌａｗｒｅｎｃｅ及びＣｏｌｍａｎ、１９９３）、そして、０．７０〜０．７５の範囲のパーツズマブ、セツキシマブ、及び、トラスズマブのｓｃ値よりも低い（Ｆｒａｎｋｌｉｎ等、２００４；Ｌｉ等、２００５；Ｃｈｏ等、２００３）。ここに追加すること：結合エネルギー又は親和性についてのコメント。
Ｆａｂ７２０００の配座は、受容体結合を著しくは変化させない。Ｃα位置のｒｍｓｄは、ＶLで０．５６Åであり、ＶHで０．９６Åである。また、Ｆａｂ７２０００の結合配座において、Ｌ字型の角度（elbow angle）は、４°のみ増加し、このことは、動的なＬ字型の柔軟性の範囲内である（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ等，２００６）。
【００４０】
＜受容体結合サイトにおける変異は、Ｆａｂ７２０００との結合を消失させるが、ＥＧＦ結合には影響しない＞
溶液中の結晶構造によって明らかにされたようなマツズマブのエピトープを確認するために、抗体-受容体の接触部分における主要な残基の受容体変異体が生成された。これらは、Ｆａｂ７２０００チップと同様にＥＧＦに結合する能力についてＳＰＲ/Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで試験された（図２Ａ）。受容体結合サイトにおける３つの組のアラニン変異体では、Ｆａｂ７２０００へのｓＥＧＦＲの結合が完全になくなったが、ＥＧＦへの結合はほんのわずかに影響を受けただけである。これは、抗体結合サイトの変異がリガンドへの結合も著しく減らしたセツキシマブに関する観察結果と対照的である（Ｌｉ等，２００５）。
【００４１】
＜マツズマブ、セツキシマブ及びＥＧＦ／ＴＧＦαのｓＥＧＦＲ結合サイトの比較＞
図２Ｂにおいて、ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおけるマツズマブ、ＥＧＦ、及び、セツキシマブのエピトープが示された。マツズマブのエピトープは、ＥＧＦのエピトープと重ならない。実際には、ｓＥＧＦＲ：ＥＧＦ複合体（ＰＤＢ ｉｄ １ＩＶＯ）由来のドメインＩＩＩにオーバーレイされたＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３複合体由来のドメインＩＩＩと、Ｆａｂ７２０００及びＥＧＦは、重ならず；Ｆａｂ及びＥＧＦの最接近距離は、９Åである。これは、セツキシマブ結合の場合と明らかに対照的である。ドメインＩＩＩにおけるセツキシマブ及びＥＧＦ結合サイトの間では高い度合いで重なる。リガンド結合の立体障害は、ＥＧＦＲのリガンド誘導二量化及び活性化のセツキシマブ仲介阻害の重要なメカニズムである（Ｌｉ等、２００５）。マツズマブによるＥＧＦＲ活性化の阻害のメカニズムは明確に相違しているに違いない。
【００４２】
＜マツズマブによるＥＧＦＲ活性化の阻害のメカニズムの関係性＞
マツズマブが、どのようにしてＥＧＦＲのリガンド誘導二量化及び活性化を阻害することができるかを理解するために、我々は、受容体のリガンド誘導-二量型の形態におけるＦａｂ７２０００の結合の効果を検討する。Ｆａｂ７２０００/ｓＥＧＦＲｄ３複合体由来のドメインＩＩＩが、その伸長(extended)二量化構成要素配座における受容体(PDB id 1MOX)由来のドメインＩＩＩとオーバーレイされたとき、Ｆａｂと伸長受容体のドメインＩ及びドメインＩＩの双方との間で不一致が生じる（Ｏｇｉｓｏ等，２００２；Ｇａｒｒｅｔｔ等，２００２）（図３Ａ）。ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合したマツズマブのために、受容体は、二量化に必要とされるドメイン再編成をうけることができない。更に、以下で詳述するように、Ｆａｂ７２０００の結合はまた、引き起こされる二量体の形成に重要なドメインＩＩの局所配座変化をブロックする。
伸長受容体配座におけるドメインＩのＮ末端領域は、ドメインＩが高い親和性のリガンド結合を要する位置に達するのを妨げるＦａｂ７２０００の軽鎖と衝突する（図３Ｂ）。これは、その抗体によるＥＧＦＲ二量化の阻害のメカニズムの一部として予め組み込まれたセツキシマブ及びドメインＩの間での衝突を、天然型及び伸長型(in nature and extent)において暗示している（Ｌｉ等，２００５）。その場合において、ドメインＩＩＩにおけるＦａｂの異なる配向は、受容体二量体におけるその必要とされる位置由来のドメインＩのＮ末端部分をふさぐように重鎖を配置する。
【００４３】
伸長受容体のドメインＩＩ及びＦａｂ７２０００の間の衝突は、新規の発見であり、意義深い。ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合したＦａｂ７２０００のために、ドメインＩＩのＣ末端部分が、受容体のリガンド結合二量体形態において観察される配座を選択することはできない。図３Ｃに示されるように、伸長配座中のｓＥＧＦＲ分子におけるそのドメインＩＩＩ結合サイトに、Ｆａｂがドッキングした場合に、ドメインＩＩのＣ半末端に沿って、支配的にＦａｂのＶL鎖との衝突がおこる。ドメインＩＩのこのＣ半末端は、受容体二量体中の他の分子からの二量化のアームのための結合ポケットを形成する。ドメインＩＩにおけるＣ末端ループからの二量体接触部分を通した更なる相互作用は、実質的にＥＧＦＲ二量化の安定性に寄与する。この領域中のドメインＩＩの配座は、ＥＧＦＲ二量化及び活性化に重要であることが示されているドメインＩＩＩとの相互作用によって安定化される（Ｄａｗｓｏｎ等，２００５）。ドメインＩＩＩへのＦａｂ７２０００の結合は、これら全ての相互作用を妨害する。
ＥＧＦＲのドメインＩＩＩへ結合するＦａｂ７２０００は、ドメインＩＩにおけるドメイン再編成及び局所的配座変化をブロックする。従って、引き起こされるＥＧＦＲ二量体の形成におけるこれらの主要な要素の双方をブロックすることは、マツズマブによるＥＧＦＲ活性化の効果的な阻害に重要であることが示された。
【００４４】
＜結論＞
ＥＧＦＲ二量化は、ドメインＩ及びＩＩＩに結合するリガンドによって促進される受容体細胞外領域の配座再編成を必要とする（図３Ｄ）。セツキシマブは、競合阻害剤として作用し、ドメインＩＩＩリガンド結合サイトに対するリガンドのアクセスを直接的にブロックしてリガンド誘導二量化を抑制する。それに反して、マツズマブは、ドメインＩＩＩにおけるリガンド結合サイトをふさがない。寧ろ、マツズマブは、ｓＥＧＦＲ二量化及び活性化を阻害する新規の非競合メカニズムを利用し、該メカニズムは、高い親和性リガンド結合及び二量化を必要とする配座を、受容体が選択するのを立体的にブロックすることに完全に依存している。
このことは、がん治療においてそれぞれの潜在力を利用し、相乗効果を与える様々な阻害メカニズムを有する治療的抗体の併用に照らして、興味深い。
【００４５】
[実施例]
＜実施例１＞タンパク質発現及び精製
ｓＥＧＦＲ及びｓＥＧＦＲｄ３を、バキュロウイルス-感染Ｓｆ９細胞中で発現させ、記載（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等，２０００；Ｌｉ等，２００５）されているように精製し、そして、それらのグリコシル化修飾をせずに用いた。
マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）は、Merck Serono KGaA(USA／ドイツ)によって提供された。Ｆａｂ断片（Ｆａｂ７２０００）を、ImmunoPure Fab Preparation Kit(Pierce)を用いてパパイン開裂によって生成し、更に精製することなく用いた。Ｆａｂ７２０００/ｓＥＧＦＲ複合体を記載されたように（Ｌｉ等，２００５）正確に生成した。ｓＥＧＦＲｄ３との複合体を生成するために、Ｆａｂを１．２倍のモル過剰のｓＥＧＦＲｄ３と混合して、Bio-Silect SEC250カラム（バイオラッド）を用いたサイズ排出クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、過剰なｓＥＧＦＲｄ３を複合体から分離し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ７．５）で平衡化した。
【００４６】
＜実施例２＞結晶化及びデータ収集
タンパク質を濃縮し、バッファーを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ７．５）に変えて、水滴蒸気拡散法を用いて結晶化した。Ｆａｂ７２０００の大きな単結晶は、等容量（１μｌ）のＦａｂ（１３ｍｇ／ｍｌ）を、１．８Ｍの硫酸アンモニウム、０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ ６．５）を含有する溶液と混合して、２０℃で、このバッファーを含む貯蔵器で平衡にして得られた。結晶は、９％スクロース、２％グルコース、８％グリセロール、８％エチレングリコールを含む貯蔵器の中で急速冷凍された。ＡＤＳＣQuantum−２１０ ＣＣＤ検出器を用いて、Cornell High Energy Synchrotron Source(CHESS) ビームライン F1でデータを収集した。１ＭのＮａＣｌ、１６％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ ６．０）と、当量部（１μｌ）の複合体（１４ｍｇ／ｍｌ）を混合して、２０℃で同じバッファーを含む貯蔵器で平衡化することによって、Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３を、結晶化した。ストリークシーディング法を用いて大きな単結晶(0.5 x 0.1 x 0.15mm)を製造し、高濃度のエチレングリコール（最終濃度１５％）を含む貯蔵器の中の溶液へシリアル転送して該単結晶を結晶安定化させ、液体窒素中で急速冷凍した。ｘｘｘ検出器を用いて、Swiss Light Source (SLS)ビームラインＸ０６ＳＡで、データを収集した。全てのデータは、ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ及びＭｉｎｏｒ、１９９７）にて処理された。データ収集統計は、表１の中に要約されている。
【００４７】
＜実施例３＞構造決定及び精密化
Ｆａｂ７２０００及びＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３の構造を、プログラムＰＨＡＳＥＲ（ＣＣＰ４、１９９４）を用いた分子置換（ＭＲ）法によって解き明かした。Ｆａｂ構造を解き明かすために、Ｆａｂ２Ｃ４（PDB id 1L7I）の座標（Ｖａｊｄｏｓ等、２００２）を、このＦａｂ及びＦａｂ７２０００の間のシークエンス同一性に基づいた初期探索モデルとして選択した。Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３構造を解き明かすために、探索モデルとして精密化されたＦａｂ７２０００座標を用いて、まずＦａｂの位置を決定した。非対称ユニットにおける２つのＦａｂコピーの一つの位置を決定した。この解決結果を利用して、ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩ(PDB id 1YY9由来のアミノ酸 310-500)の座標を用いた第２の探索によって、１つのｓＥＧＦＲｄ３分子の位置を決定した。その後に、非対称ユニットにおける第２のＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３複合体が、見つかった。座標を手動でＣＯＯＴにおいて再構築し（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ、２００４）、ＣＮＳ（ＢＲＵＮＧＥＲ等、１９９８）及びＲｅｆｍａｃ（ＣＣＰ４、１９９８）を用いて精密化した。新しいマップは、精密化のすべての繰り返しの後に計算され、ＣＣＰ４プログラムＤＭで計算された最小化されたモデルバイアスを有する溶媒平滑化マップ含む。
【００４８】
＜実施例４＞結合実験
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）／Ｂｉａｃｏｒｅ実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００計器を用いて２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０の中で行った。Ｆａｂ７２０００を、以下のようにしてＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した：ＣＭ-デキストランマトリクスを、Ｎ-エチル-Ｎ’-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ）、及び、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドで活性化した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）の中で、５００ｎｇのＦａｂ断片を５μｇ／ｍｌで活性化表面の上に流した。残留反応サイトは、１Ｍのエタノールアミン-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でブロックされた。固定化Ｆａｂ断片は、１４３６応答ユニット（ＲＵ）のシグナルを与えた。２つの５μｌのインジェクション（１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）、１ＭのＮａＣｌ）を用い、残留受容体を除くために、ｓＥＧＦＲ接触間で表面を再生した。ＥＧＦ固定化及びｓＥＧＦＲ結合分析を、上述のように正確に行った（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等，２０００）。データをプリズム４で分析した（GraphPad Software, Inc．）。
【００４９】
＜実施例５＞ｓＥＧＦＲエピトープ変異の生成
部位特異的突然変異誘発法を利用して、pFastBacベクターの中の適当なＤＮＡにアラニン又は欠失変異体を導入した。以下の変異体を作製した：K454A、K463A、△S460、T459A/S460A、K454A/T459A/S460A、T459A/S460A/K463A。組換えバキュロウイルスの生成、Ｓｆ９細胞における過剰発現及びタンパク質精製を、野生型ｓＥＧＦＲ用として前に記載されたように正確に行った(Ferguson等, 2000)。
Ｆａｂ７２０００及びＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３構造体の座標は、ＲＣＳＢタンパク質データバンクに蓄積されている（それぞれのpdb idコード xxxx及びxxxx）。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表２：残基-受容体／残基-マツズマブのＦａｂ結合／相互作用のリスト：
原子源 標的原子 距離 角度
Ser 433D O ... His 93L CE1 ... 3.35
... His 93L NE2 ... 3.91 *
Asp 434D CB ... His 93L NE2 ... 3.69
Asp 434D CG ... His 93L CE1 ... 3.72
... His 93L NE2 ... 3.02
Asp 434D OD1 ... His 93L CD2 ... 3.77
... His 93L CE1 ... 3.18
... His 93L NE2 ... 2.74 ***
Asp 434D OD2 ... His 93L NE2 ... 3.47 *
Asp 436D OD2 ... Tyr 31L OH ... 3.91 *
Asn 449D N ... Tyr 103H OH ... 3.86 *
Asn 449D CA ... Tyr 103H OH ... 3.49
Asn 449D CG ... Tyr 103H OH ... 3.82
Asn 449D ND2 ... Tyr 103H CZ ... 3.67
... Tyr 103H OH ... 2.76 ***
Asn 452D ND2 ... Ser 54H CB ... 3.92
... Thr 30H O ... 3.60 *
Trp 453D CD1 ... Tyr 103H CE1 ... 3.84
Lys 454D C ... Ser 54H OG ... 3.93
... Asn 52H ND2 ... 3.79
Lys 454D O ... Asn 52H ND2 ... 2.95 ***
... Asn 55H ND2 ... 3.70 *
Lys 454D CG ... Ser 31H O ... 3.47
Lys 454D CD ... Ser 31H O ... 3.53
... Asp 100H OD2 ... 3.76
Lys 454D CE ... Asp 100H CG ... 3.49
... Asp 100H OD1 ... 3.80
... Ser 31H O ... 3.20
... Asp 100H OD2 ... 2.64
... Tyr 101H O ... 3.50
Lys 454D NZ ... Asp 100H OD2 ... 3.48 *
... Tyr 101H C ... 3.68
... Tyr 101H O ... 2.46 ***
Lys 455D N ... Ser 54H OG ... 3.48 *
Lys 455D CA ... Ser 54H OG ... 3.24
... Asn 55H ND2 ... 3.92
Lys 455D C ... Asn 55H ND2 ... 3.44
Lys 455D O ... Asn 55H CB ... 3.55
... Asn 55H CG ... 3.77
... Asn 55H ND2 ... 3.01 ***
Lys 455D CB ... Ser 54H OG ... 3.64
Leu 456D C ... Arg 57H NH1 ... 3.90
Leu 456D O ... Arg 57H NH1 ... 3.97 *
Phe 457D N ... Arg 57H NH1 ... 3.95 *
... Asn 55H ND2 ... 3.89 *
Phe 457D C ... Arg 57H NH1 ... 3.93
Phe 457D O ... Arg 57H CD ... 3.59
... Arg 57H NH1 ... 3.52 *
... Asn 52H ND2 ... 3.50 *
... Asn 55H ND2 ... 3.28 ***
... Trp 33H CZ2 ... 3.63
Gly 458D C ... Trp 33H CH2 ... 3.49
... Trp 33H CZ2 ... 3.40
Gly 458D O ... Trp 33H CH2 ... 3.06
... Asn 59H CG ... 3.97
... Asn 59H ND2 ... 3.16 ***
... Trp 33H CZ2 ... 3.45
Thr 459D N ... Trp 33H CH2 ... 3.94
... Trp 33H CZ2 ... 3.49
Thr 459D CA ... Trp 33H CH2 ... 3.95
... Trp 33H CZ2 ... 3.57
Thr 459D C ... Trp 33H NE1 ... 3.51
... Trp 33H CE2 ... 3.46
... Trp 33H CZ2 ... 3.53
Thr 459D O ... Trp 33H NE1 ... 2.98 ***
... Trp 33H CD1 ... 3.86
... Trp 33H CE2 ... 3.33
... Trp 33H CZ2 ... 3.49
Thr 459D CB ... Trp 90L CZ2 ... 3.63
... His 93L ND1 ... 3.81
Thr 459D OG1 ... Trp 90L CZ2 ... 3.59
... His 93L ND1 ... 3.33 *
... His 93L CE1 ... 3.37
Thr 459D CG2 ... Glu 50H OE1 ... 3.19
... His 93L O ... 3.98
... Trp 90L CZ2 ... 3.61
... His 93L CA ... 3.57
... His 93L CB ... 3.80
... His 93L CG ... 3.75
... His 93L ND1 ... 3.12
... Trp 90L NE1 ... 3.76
Ser 460D N ... Trp 33H NE1 ... 3.88 *
... Glu 50H OE1 ... 3.97 *
... Glu 50H OE2 ... 3.35 *
... Trp 33H CE2 ... 3.86
Ser 460D CA ... Glu 50H OE2 ... 3.96
Ser 460D O ... Tyr 101H CD2 ... 3.31
Ser 460D CB ... Glu 50H OE2 ... 3.53
Ser 460D OG ... Glu 50H CD ... 3.58
... Glu 50H OE2 ... 2.39 ***
... His 35H CE1 ... 3.26
... His 35H NE2 ... 3.29 ***
... Arg 99H O ... 3.65 *
... Phe 95L CE1 ... 3.94
... Phe 95L CZ ... 3.98
Gly 461D N ... Trp 90L CZ2 ... 3.97
Gly 461D CA ... Trp 90L CZ2 ... 3.80
... Trp 90L CZ3 ... 3.80
... Trp 90L CH2 ... 3.62
Gly 461D O ... Tyr 31L CE2 ... 3.62
... Tyr 31L OH ... 3.69 *
Lys 463D CD ... Tyr 101H CG ... 3.80
... Tyr 101H CD1 ... 3.56
... Tyr 101H CE1 ... 3.73
Lys 463D CE ... Tyr 31L CZ ... 3.87
... Tyr 31L OH ... 3.15
Lys 463D NZ ... Tyr 101H CD1 ... 3.97
... Tyr 101H CE1 ... 3.34
... Tyr 101H CZ ... 3.74
... Asp 49L OD2 ... 3.42 *
... Tyr 101H OH ... 3.89 *
... Tyr 31L CZ ... 3.99
... Tyr 31L OH ... 3.75 *
Thr 464D O ... Tyr 103H O ... 3.74 *
Thr 464D OG1 ... Tyr 103H O ... 3.79 *
Ile 466D CB ... Tyr 103H OH ... 3.73
【００５２】
以下の文献引用は、上記記載に挙げられ、そして、参照により組み込まれる：
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、及び、抗−ＥＧＦＲ抗体のマツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）のＦａｂ断片によって形成された結晶複合体に関する。特に、本発明は、抗体マツズマブが抗原として認識し、かつ、特異的に結合する前記ＥＧＦＲにおけるエピトープ領域の同定に関する。本発明は、更に、ＥＧＦＲにおけるそのエピトープ領域へのマツズマブの結合を模倣するタンパク質、ペプチド、及び、抗体構造に関し、従って、マツズマブと比較して同様の、又は改良された性質を有するＥＧＦＲアンタゴニストとして用いられうる。
【背景技術】
【０００２】
シグナル変換経路中の関連性ある構成要素の医薬的標的を介したこれらのシグナル変換経路の破壊は、様々なタイプの癌の治療のために効果的な治療上の選択肢になっている。癌細胞における膜チロシンキナーゼ受容体は、特に、興味深い標的であり、膜受容体の表皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーは、最も有望な標的の一つである。
ＥＧＦファミリーは、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）からなる。ＥＧＦＲは、１７０ｋＤの膜貫通糖タンパク質であって、（１）６２１アミノ酸残基からなるアミノ末端細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインを含む）；（２）安定化に寄与しうるシグナル２３アミノ酸膜貫通固定領域；及び（３）細胞質標的を活性化するチロシンキナーゼ活性を有する５４２アミノ酸Ｃ末端細胞内ドメインを含む。ＥＧＦＲを刺激するリガンドの例は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−ｃｃ（ＴＧＦ−ａ）、ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）、３−セルリン（ｃｅｌｌｕｌｉｎ）、及び、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）−１を含む。特異的リガンドの結合は、ＥＧＦＲ自己リン酸化、レセプターの細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、及び、腫瘍成長及び腫瘍生存を制御する多様なシグナル変換経路の開始を引き起こす。
【０００３】
ＥＧＦファミリー由来の受容体の機能の変化、特にＥＧＦＲの制御解除は、自己制御細胞成長、侵入、血管形成能、及び、転移の進行に関連することが分かっている。
ＥＧＦ様成長因子のようなリガンドは、多様な成長制御シグナル伝達経路を開始する細胞外ドメインへの結合を介してＥＧＦＲを活性化する。２つの最も関連する経路は、ＭＡＰＫ（細胞外シグナル伝達制御キナーゼ［ＥＲＫ］としても知られるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）マイトジェン経路、及び、ホスファチジルイノシトール３-キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ［ＰＫＢ］としても知られる）経路である。
ＭＡＰＫ経路は、細胞質基質、核、及び、細胞膜における多くの基質分子の活性化を介して、遺伝子転写及び増殖を制御する。細胞膜へのＡｋｔの漸増が、抗アポトーシスのシグナルの発現増加、プロアポトーシスのシグナルの発現減少、及びｍＲＮＡ転写の活性化に起因して、生存促進性のシグナル伝達を引き起こす点で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路は、細胞生存を仲介する。
【０００４】
異常型のＥＧＦＲシグナリングによる原癌遺伝子形質転換は、様々な異なるメカニズムの結果であり、受容体過発現；活性化変異；細胞内チロシンキナーゼ部分及び受容体自己リン酸化を活性化するＥＧＦＲの立体配座の改変を誘導するために必要な二量化プロセスの変化；自己分泌成長因子のループの活性化；及び特異的ホスファターゼの欠陥を含む。細胞外ドメインの変異を有する様々なＥＧＦＲ形態は、同定されており、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、様々なタイプの癌に関連する。
受容体タンパク質チロシンキナーゼ、例えばＥＧＦＲキナーゼは、ホモ二量化及びヘテロ二量化の双方を受けることができ、ホモ二量化受容体の組合せは、対応するヘテロ二量化受容体の組合せよりも分裂促進と形質転換とが起こりにくい（シグナル伝達が開始しないか、あまり起こらない）ことに注目するべきである（Ｙａｒｄｅｎ及びＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２，１２７ -１３７；Ｔｚａｈａｒ及び Ｙａｒｄｅｎ，１９９８，ＢＢＡ １３７７，Ｍ２５-Ｍ３７）。
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、様々な表皮性癌中で異常に活性化され、抗癌治療の治療標的として多くの関心が向けられている。ＥＧＦＲは、増殖、分化、及び、アポトーシスのような重要な細胞プロセスに関与する４つの受容体チロシンキナーゼのファミリー（まとめてＥｒｂＢ受容体として知られている）のひとつである（Ｈｕｂｂａｒｄ及びＭｉｌｌｅｒ，２００７）。過発現又は変異を介したＥＧＦＲの誤制御は、常時活動又は受容体ダウンレギュレーション障害をもたらし、そして、細胞の悪性転換を引き起こしうる（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＢａｓｅｌｇａ，２００６）。
【０００５】
ＥＧＦＲの細胞外領域のこれまでの５年間の構造研究に基づいて、あるモデルが、ＥＧＦＲのリガンド依存的二量化及び活性化のために提案された。ＥＧＦＲの細胞外領域の二量化は、ＥＧＦＲのドメインＩＩによってもたらされる主要な相互作用による完全な受容体媒介性である。ＥＧＦ−ＥＧＦＲの細胞外ドメイン複合体の結晶構造（受容体ドメインが二量体型で存在する）は、Ｏｇｉｓｏ，Ｈ．等，２００２，Ｃｅｌｌ １１０，７７５-７８７によって提供されている。低い、非生理的ｐＨで結晶化して得られたＥＧＦ−ＥＧＦＲ細胞外ドメイン複合体の構造（該受容体は、単量体型で存在する）も、提供されている（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．等，２００３，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，５０７-５１７）。二量形態の形質転換成長因子α（ＴＧＦ−ａ）−ＥＧＦＲ細胞外ドメイン複合体の構造も決定されている（Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｐ．等，２００２，Ｃｅｌｌ １１０，７６３−７７３）。リガンドが存在しない状況において、受容体は、ドメインＩＶとの分子内相互作用、又は、結合におけるほとんどの二量化接触部分をふさぐ非常に様々な配座を選択できる。リガンド結合により、ＥＧＦＲの細胞外ドメインは、劇的なドメイン再構成を受ける。さらなるリガンド誘導配座の変化は、二量化に必要なドメインＩＩの正確な配座を安定化させる。受容体二量化は、細胞内のチロシンキナーゼドメインを、それらのアロステリックな活性を促進する、閉じた近傍に至らしめる。このメカニズムは、受容体Ｘ線構造の細胞外領域との相互作用を介してＥＧＦＲ活性を阻害する多くの方法を提案し、そして、受容体−抗体複合体の生化学的分析は、ＥｒｂＢ受容体シグナル伝達の効果的な阻害をもたらす結合の様々な様式を示す。
【０００６】
薬理学的標的ＥＧＦＲへの様々な可能なストラテジーには、例えば、細胞外ドメインに結合するための活性化ＥＧＦＲリガンドと競合するためのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）；受容体の細胞内のチロシンキナーゼドメインの小分子阻害剤；腫瘍細胞に毒素を送達するためのＥＧＦＲリガンド共役毒素；ＥＧＦＲレベルを低減するためのアンチセンスのヌクレオチド；及び、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の下流エフェクターの阻害剤がある。
悪性細胞における異常なＥＧＦＲシグナル伝達を標的にするために臨床上用いられる第一のストラテジーは、ＭＡｂの使用である。抗ＥＧＦＲ抗体は、受容体／リガンド相互作用、異常なシグナル伝達並びに腫瘍細胞増殖及び腫瘍細胞増大のブロックを破壊するだけでなく、該抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を介して抗腫瘍エフェクターを調整することもできる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＩｇＧへの低親和性受容体ＦｃｙＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６を介して、抗体分子の炭素末端側終端を認識することによって、ＡＤＣＣを仲介する。ＮＫ細胞は、従って、抗体-被覆腫瘍細胞と密接に相互作用でき、ネクローシス及びアポトーシスを介して細胞を破壊することができる。
【０００７】
開発された第一のマウス抗ＥＧＦＲ ＭＡｂは、動物モデルにおいて優れた抗-腫瘍活性を示した。しかしながら、それらの臨床使用は、患者におけるヒトの抗マウス抗体の高発生率に起因して制限され、薬効が弱まった。この欠点に応じて、研究者は、抗-ＥＧＦＲ ＭＡｂのキメラのヒト化形態を開発した。
セツキシマブ（ＩＭＣ-Ｃ２２５，Ｅｒｂｉｔｕｘ）キラル抗ＥＧＦＲ抗体は、好結果で臨床試験を終えて、様々な癌の治療として２００３年に用いられ始めたこのタイプの第一のＭａｂだった。癌の治療の活発な臨床開発下において、多くの他の抗ＥＧＦＲ抗体が存在する。それらの一つがマツズマブである。
【０００８】
マツズマブ（ＥＭＤ-７２０００）は、ＥＧＦＲに高い特異性及び親和性で結合するヒト化ｌｇＧ1 ＭＡｂである。動物腫瘍異種移植モデルにおいて、ヒトの癌、例えば頭頸癌、胃癌、膵臓癌、及び肺癌に対する強力な阻害活性を有することが分かっている。マツズマブは、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合をブロックすることが分かっており、それによって、下流シグナル伝達経路を阻害し、そしてそれは免疫細胞においてＦｃＲ結合を介したＡＤＣＣを経て作用することもできる。マツズマブは、癌の治療としての更に開発を進めるために選択された。マツズマブは、ＥＧＦＲ発現ヒト肺腺癌（ＬＸＦＡ６２９）及び胃腺癌（ＧＸＦ２５１）及び膵臓腺扁平上皮癌（ＰＡＸＦ５４６）の外科標本に対して抗腫瘍活性を示し、該外科標本は、化学療法薬（ブレオマイシン、シスプラチン、ビンデシン、パクリタキセル、イホスファミド）に反応しにくく、ヌードマウスに皮下注射されたものである。マツズマブでの治療（腫瘍が７０−１２０ｍｍ3に達したときに開始し、２週間の間、週に一回、腹腔内で０．５又は０．５ｍｇ／マウスで投与）は、全ての３つの腫瘍タイプに対して良好な許容性及び効果があった。高い投与量で治療された胃癌及び肺癌を患った動物で、それぞれ８３％及び８７％で完全寛解が観察された。膵臓腫瘍において著しい減少が観察され、コントロールと比較して３１％の平均腫瘍容積として観察された（２７）。同所性のヒトＬ３．６ｐｌ膵臓腫瘍を有するマウスにおけるマツズマブ（週に２回（biweekly）１００ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍の効能は、同時にゲムシタビン（週に２回１００ｍｇ／ｋｇ）で治療することによって、促進されることが分かった。いずれかの薬剤の単独の治療は、腫瘍の大きさ、並びに、リンパ節及び肝臓の転移を減少させた。これらの効果は、併用治療によって著しく促進された。マツズマブ単独の治療、又はゲムシタビンとの併用の治療は、微小血管密度及び増殖指数も著しく減少させた。治療は、腫瘍細胞注入の後に早く投与された場合に、最も有効であった（２８）。インビトロ及びインビボでの研究からの結果は更に、マツズマブの抗腫瘍効果はＡＤＣＣを関与させることが提案されている。
【０００９】
マツズマブ（ＩＭＣ−ｈ４２５としても知られるＥＭＤ ７２０００）の様々な領域のアミノ酸シークエンス及びその抗腫瘍効能は、ＵＳ ５，５５８，８６４及びＥＰ ０５３１ ４７２ Ｂ１にも記載されており、これら文献は参照により組み込まれる。
マツズマブの完全な軽鎖のペプチドシークエンスは、以下の通りである：（ＶＬは下線部であり、ＣＤＲはボールド体の二重下線部である。）：
【００１０】
【化１】
マツズマブの完全な重鎖のペプチドシークエンスは、以下の通りである：（ＶＨは下線部であり、ＣＤＲはボールド体の二重下線部である。）:
【００１１】
【化２】
【００１２】
ＷＯ ２００６／００９６９４では、このようにセツキシマブによって認識されるＥＧＦＲ上のエピトープドメインを同定するセツキシマブのＦａｂ断片と一緒にＥＧＦＲの可溶性細胞外ドメインによって形成される結晶複合体を開示している。
セツキシマブとマツズマブの併用が、インビトロモデルにおいて相乗効果を生み出すことを証明できたので（ＷＯ ２００４／０３２９６０参照）、これら２つの抗体がＥＧＦＲ上で異なるエピトープに結合することを推定することができた。
従って、マツズマブの模倣物であるペプチド、タンパク質、及び、抗体分子であって、マツズマブの同じエピトープに結合でき、ＥＧＦＲの天然リガンドのアンタゴニストとして作用できるものを同定し、開発するためにマツズマブのエピトープを同定することは、特別に興味深い。
【００１３】
したがって、本発明は、マツズマブの可能性のある模倣物を同定する方法であって、それぞれの結晶複合体から得られる座標の少なくともサブセットに対してスクリーニングすることで同定する方法を提供する。マツズマブに対する模倣物について、ＥＧＦＲ依存の病状又は疾病の治療に有用なＥＧＦＲアンタゴニストを得るために、生物学的活性のアッセイを行うことができる。ＥＧＦＲアンタゴニストは、制限されないが、リガンド結合のブロック、受容体二量化の阻害、受容体基質リン酸化、遺伝子活性、及び、細胞増殖の最終的な阻害によって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害するための受容体と相互作用する。好ましくは、アンタゴニストは、マツズマブと比較して、実質的に同様の又は改良された効果を有する。アンタゴニストは、ＥＧＦＲ発現と関連する病状の治療のために用いられる。このような疾病は、好ましくは、ＥＧＦＲを発現、又は、過剰発現する腫瘍を含み、それは、ＥＧＦＲのリガンドによって刺激されうる。また、ＥＧＦＲのリガンドによって刺激される過剰増殖性の疾病も含まれる。
【００１４】
本発明の更なる目的は、セツキシマブ、又はセツキシマブの公知のエピトープ（本発明の結果に従うとマツズマブのエピトープと異なる）に結合するセツキシマブ以外のペプチド、タンパク質、若しくは抗体分子と、上記マツズマブ模倣物を併用することである。これらの抗体（マツズマブ及びセツキシマブ）、又は、これらのエピトープに対する同様の若しくは改善された結合特性を有するように特異的に設計されたこれらの抗体の模倣物を用いて、これらの２つの抗体（マツズマブ及びセツキシマブ）によって認識されるＥＧＦＲにおけるエピトープを特異的にブロックすることによって、ＥＧＦＲ関連疾患及び疾病の治療の改善がなされるべきである。なぜならマツズマブ又はセツキシマブのような天然の抗体が好適な結合親和性を有することは、本来、推定することができないためである。従って、重要なエピトープ（リガンド結合をブロックし、チロシンキナーゼシグナル伝達をなくすか、減らす）を認識することは、マツズマブ（及び、場合によってはセツキシマブ）と比較して、同様か、又は好ましくは改善された特性を有する新規のエピトープ結合剤を設計し、開発することを可能にするために、特別重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明は、初めて、ＥＧＦＲの細胞外領域の切断型に結合したマツズマブ（Ｆａｂ７２０００）のＦａｂ断片の結晶構造を示す。この構造によって、マツズマブが、リガンド及びそのドメインにおけるセツキシマブ結合領域の双方と異なるＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおける新規のエピトープに結合することが分かった。この構造に基づいて、発明者は、二量化に必要な配座を取るためのＥＧＦの立体障害によって決定されるＥＧＦＲ活性の阻害の新規メカニズムを提案する。この新規のメカニズムは、現在の薬剤の応用及び新しい抗-ＥＧＦＲ治療の開発の双方に対して影響を及ぼす。
一つの局面において、本発明は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン及びセツキシマブのＦａｂの受容体-抗体複合体を含む受容体−抗体複合体の結晶を提供し、該複合体において、結晶は、Ｘ線結晶学によって決定される約５．０オングストローム（Å）より良い分解能を有する。好ましくは、結晶は、Ｘ線結晶学によって決定される約４．０オングストロームより良い、更に好ましくは、約３．０オングストロームより良い分解能を有する。
【００１６】
結晶は、空間群Ｃ２に属し、ユニットセル次元が、a＝141Å（± 3Å）、b＝205Å（±3Å）、c＝81Å（±3Å）、及び、β＝117°（±1°）である。好ましくは、結晶複合体は、以下のユニットセル次元を有する：a＝141.1Å（±0.3Å）、b＝205.0Å（±0.3Å、c＝81.6Å（±0.3Å）、及びβ＝117.5°(±0.5°)。
別の局面において、本発明は、マツズマブ、好ましくはマツズマブのＦａｂ断片が、特異的に結合するＥＧＦ受容体ドメインＩＩＩにおけるエピトープ領域を提供する。このエピトープは、ＥＧＦ受容体における位置４３３〜４６６の範囲中の位置、特に詳細にはSer433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464、又は、Ile466に位置する１つ以上のアミノ酸残基を含む。好ましくは、位置Trp452からThr464の間の完全なシークエンストラックが、マツズマブの抗原領域として認識されるようであることを発見できた。このシークエンストラックは、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩベータへリックスのループに対応する。それと対照的に、セツキシマブは、このシークエンストラックの外のアミノ酸Gln384、Gln408、Ser418、Ser440、Lys465、Ser468、及び、Asn469と相互作用する（ＷＯ２００６／００９６９４）。
【００１７】
少なくとも、マツズマブのドメインのＣＤＲ領域又はＣＤＲ近接領域における以下のアミノ酸は、上記規定された受容体アミノ酸残基との相互作用／結合に関与する：
CDR1、軽鎖：Tyr31
CDR2、軽鎖：Asp49
CDR3、軽鎖：Trp90、His93
CDR1、重鎖：(Thr30)、Ser31、Trp33、His35
CDR2、重鎖：Asn52、Ser54、Glu50、Asn55、Asn59
CDR3、重鎖：Tyr103、Tyr101、Asp100
受容体の位置Lys454は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Ser54、Ser31、Asp100、Tyr101、Asn52、Ser54、Asn55 (全て重鎖)。
受容体の位置Lys455は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Ser54、Asn55 (全て重鎖)。
受容体の位置Leu456 は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Asn55 (重鎖)。
受容体の位置Phe457は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、Asn52、Asn55 (全て重鎖)。
受容体の位置Gly458は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、Asn59 (全て重鎖)。
受容体の位置Thr459は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、Glu50 (全て重鎖)、Trp90、His93 (全て軽鎖)。
受容体の位置Ser460は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp33、His35、Glu50、Tyr101 (全て重鎖)。
受容体の位置Gly461は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Trp90、Tyr31 (全て軽鎖)。
受容体の位置Lys463は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Tyr31、Asp49 (全て軽鎖)、Tyr101 (重鎖)。
受容体の位置Thr464は、好ましくは、マツズマブの以下のアミノ酸と相互作用する: Tyr103 (重鎖)。
【００１８】
他の局面において、本発明は、前記模倣物／類似体の３次元構造を、上記で規定された結晶複合体の決定された３次元構造と、比較することを含むマツズマブのペプチドの模倣物又は類似体を同定する方法を提供する。好ましくは、模倣物の３次元構造は、少なくともマツズマブの結晶座標のサブセットと比較される。
更なる局面において、本発明は、ドメインＩＩＩを含む可容性細胞外ＥＧＦＲ、及び、マツズマブのＦａｂ断片又はマツズマブ模倣物によって形成される結晶複合体を提供し、ここで、受容体原子及びマツズマブ／マツズマブ-模倣物の間の結合-関連の原子-原子距離は、４Å未満であり、好ましくは３Å未満である。好適な態様において、マツズマブ／ＥＧＦＲ複合体の前記距離は、表２に規定されるようなそれぞれの値である。
一つの態様において、マツズマブのＦａｂと結合するか、又は本質的に相互作用する、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上のＥＧＦＲアミノ酸の座標に対して、模倣物／類似体の３次元構造を比較することで、模倣物／類似体が同定される。このようなＥＧＦＲアミノ酸は、Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464、及び、Ile466からなる群から、好ましくは、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、及び、Thr464からなる群から選択される。
また、他の態様において、アミノ酸残基約４４８からアミノ酸残基約４６４からなる群から、好ましくはアミノ酸残基４５３又は４５４からアミノ酸残基約４６４からなる群から選択されるＥＧＦＲの領域の原子座標と、模倣物の３次元構造を比較することによって、スクリーニングが行われる。また、別の態様において、ＥＧＦＲの更なるアミノ酸残基、例えばSer433〜Asn452が含まれる。
【００１９】
ＥＧＦ受容体における以下の位置と結合するか、又は相互作用するマツズマブの模倣物、又は、ＥＧＦ受容体における少なくとも以下の位置で結合するか、又は相互作用するマツズマブの模倣物は、特に重要であり、価値がある：
(1) Lys454
(2) Lys454及びLys455
(3) Lys454及びLys455及びPhe457
(4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460
(7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461
(8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461及びLys463
(9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461及びLys463及びThr464
(10) Phe457
(11) Phe457及びLys454
(12) Phe457及びLys454及びGly458
(13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及びGly461
(16) Thr459
(17) Thr459及びLys454
(18) Thr459及びLys454及びPhe457
(19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及びGly461
(22) Ser460及びLys454
(23) Ser460及びLys454及びPhe457
(24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(26) Lys454及びPhe457
(27) Lys454及びPhe457及びSer460
(28) Lys454及びPhe457及びGly461
(29) Lys454及びPhe457及びThr459
(30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(32) Phe457及びSer460
(33) Phe457及びThr459及びSer460
(34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(35) Ala448
(36) Ala448及びAsn449
(37) Ala448及びLys454
(38) Ala448及びLys454及びPhe457
(39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(44) Asn449
(45) Asn449及びLys454
(46) Asn449及びLys454及びPhe457
(47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(51) Ser433及び/又はAsp433を含むこれらの選択肢(1)-(50)のいずれか。
【００２０】
本発明における模倣物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は、免疫グロブリン、又は、それらの断片でありうる。該模倣物は、場合によっては、小さな、非ペプチドの分子、又は、部分的なペプチドの分子であってもよい。どのような場合であっても、模倣物は、ＥＧＦＲの天然リガンドに対するＥＧＦ受容体を阻害し、ブロックすること、及び、チロシンキナーゼ活性をなくすか、又は低減することについて、マツズマブの重要な生物学的特性を有する。
本発明の別の局面において、抗体又はその断片である模倣物は、少なくともマツズマブの単鎖ＣＤＲ領域において、及び／又は、ＣＤＲと相互作用し、その配座に影響する抗体の非ＣＤＲアミノ酸で、１個以上の置換の導入によって同定される。ある態様において、多くても、単一置換が、各ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、又は、ＣＤＲの一つのみで起こる。他の態様において、置換は、単に、ＣＤＲ３中で、又は、ＣＤＲ３の配座に影響するアミノ酸で起こる。別の好適な態様において、置換は、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３中で行われ、抗体配座に影響する各ＣＤＲの環境の中で行われても良い。好ましくは、置換は重鎖ＣＤＲ中で起こる。
改良された模倣物を得るために修飾されたマツズマブのＣＤＲ中の好適な位置は、Trp90及びHis93（それぞれ軽鎖のＣＤＲ３）、Asp100、Tyr101、及び、Tyr103（それぞれ重鎖のＣＤＲ３）、Glu50、Asn52、Ser54、及びAsn55（それぞれ重鎖のＣＤＲ２）、Ser31及びTrp33（それぞれ重鎖のＣＤＲ１）である。
【００２１】
本発明の更なる局面において、ＷＯ ２００６／００９６９４（ここに、参照により組み込まれる）によって提供されるようなセツキシマブ、又は、セツキシマブの模倣物と治療学的に併用されうるマツズマブの模倣物を同定することを提供する。一つの態様において、薬学的併用は、本発明において同定されたマツズマブ模倣物、及び、セツキシマブ模倣物で行われる。マツズマブ模倣物は、リスト(1)〜(51)に示されるようなＥＧＦＲエピトープ残基とのその結合／相互作用活性によって特徴付けられ、そして、セツキシマブ模倣物は、ＥＧＦＲエピトープ残基Gln384、Gln408、Ser418、Ser440、Lys465、Ser468、及びAsn469からの一つ以上とのその結合／相互作用活性によって特徴付けられる。従って、本発明の他の局面は、マツズマブの模倣化合物、好ましくは抗体、及び
（ｉ）ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ）ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ）ＥＧＦＲの以下のアミノ酸残基、又は、少なくとも４個のアミノ酸のサブセットと結合するか、又は相互作用する第２の化合物を含む化合物の組成物である：
Gln 384、Gln 408、Ser 418、Ser 440、Lys 465、Ser 468、及び、Asn 469。
【００２２】
本発明は、さらに、記載されたような模倣物を合成し、その結合又は生理学的活性をアッセイすることで、ＥＧＦＲ機能を阻害し、かつ、ＥＧＦＲ関連疾病又は病状を治療するために有用なＥＧＦＲアンタゴニストを選択する方法を提供する。本発明のある局面において、受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害する模倣物が提供される。本発明の別の局面において、模倣物は、細胞で発現するＥＧＦＲの二量化を阻害する。好ましくは、模倣物は、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合をブロックする。本発明の模倣物は、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲの機能活性を阻害し（好ましくは、マツズマブと同様か、より高い程度で）、セツキシマブと併用することもできる。
詳しくは、本発明は、更にマツズマブの模倣物候補、好ましくは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は免疫グロブリン、更に好ましくは、標的抗体若しくは抗体断片であって、マツズマブと類似の、又は同様の生物学的活性を有するものを同定し、選択する方法を提供する；前記方法は、（ａ）模倣物-ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中のＥＧＦＲに結合した模倣化合物、又は、その断片の結合座標を、
（ｂ）請求項１又は請求項４に規定されたマツズマブ−ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中でＥＧＦＲに結合するマツズマブのＦａｂ断片の結合座標と、
比較することを含み、
前記結合座標が、以下の（i）〜（ｉｉｉ）によって定義される。
【００２３】
（ｉ）マツズマブのＦａｂ断片と結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基の位置；該位置は、以下のアミノ酸又は少なくとも３個、４個、５個、及び６個のアミノ酸残基の群から選択される：
Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466、より具体的に言うと：
(a1) Lys454
(a2) Lys454及びLys455
(a3) Lys454及びLys455及びPhe457
(a4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(a5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(a6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460
(a7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461
(a8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463
(a9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463及びThr464
(a10) Phe457
(a11) Phe457及びLys454
(a12) Phe457及びLys454及びGly458
(a13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(a14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(a15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a16) Thr459
(a17) Thr459及びLys454
(a18) Thr459及びLys454及びPhe457
(a19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(a20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(a21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及び
Gly461
(a22) Ser460及びLys454
(a23) Ser460及びLys454及びPhe457
(a24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(a25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(a26) Lys454及びPhe457
(a27) Lys454及びPhe457及びSer460
(a28) Lys454及びPhe457及びGly461
(a29) Lys454及びPhe457及びThr459
(a30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a32) Phe457及びSer460
(a33) Phe457及びThr459及びSer460
(a34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a35) Ala448
(a36) Ala448及びAsn449
(a37) Ala448及びLys454
(a38) Ala448及びLys454及びPhe457
(a39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(a40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(a41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(a42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a44) Asn449
(a45) Asn449及びLys454
(a46) Asn449及びLys454及びPhe457
(a47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(a48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(a51) Ser433及び／又はAsp433を含む選択肢(a1)−(a50)のいずれか、
【００２４】
（ｉｉ）これらの位置のＥＧＦＲアミノ酸の中の特定の原子と、これらの位置のＥＧＦＲの前記アミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する模倣化合物の中での特定の原子との間の距離、及び、
（ｉｉｉ）参照として、これらの位置のＥＧＦＲアミノ酸の中の特定の原子と、マツズマブのＦａｂ断片の中の特定の原子との間の距離（ここで、前記位置のＥＧＦＲのアミノ酸残基の原子と、前記結晶複合体中でそれらと結合するか、又は相互作用する模倣化合物の原子との間の距離が、４Å未満であり、好ましくは３Å未満であり、場合によって２Å未満である）。
【００２５】
他の局面において、本発明は、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）ではない化合物、又はマツズマブの模倣化合物を提供し、該化合物は、
（ｉ）ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ）ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ）ＥＧＦＲの位置４４８と４６４との間の、好ましくは、ＥＧＦＲの位置４５４と４５９との間のシークエンストラックの少なくとも３個のアミノ酸残基と、結合するか又は相互作用する。より好ましくは、化合物は全てのＥＧＦＲのアミノ酸：Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464と結合するか、又は相互作用し、特に：Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458及びThr459と結合するか、又は相互作用する。
【００２６】
本発明の別の局面において、
・ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
・ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
・ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
・マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する、
抗ＥＧＦＲ抗体を設計する方法であって、
（ｉ） マツズマブの重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ領域中の、又は、ＣＤＲに隣接したフレームワーク領域（ＦＲ）中の、少なくとも１個のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換し、
（ｉｉ） 前記修飾されたマツズマブのＦａｂ断片及びＥＧＦＲの可溶細胞外ドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）によって形成される結晶複合体を調製し、
（ｉｉｉ） 上記で規定されたＥＧＦＲドメイン（例えばシークエンスａ１−ａ５０）中の特定のアミノ酸残基の位置に対する上記のように形成される結晶複合体の原子座標を、ｓＥＧＦＲｄ３と一緒に非修飾のマツズマブによって形成される参照用の結晶複合体の対応する座標と比較し、
（ｉｖ） ＥＧＦＲドメインにおける前記特定のアミノ酸残基の位置に対してより密接な相互作用をとらせる原子座標を有する修飾されたマツズマブを選択し、
（ｖ） 標準方法でその結合親和性及び生物学的活性をアッセイし、そして、
（ｖｉ） 工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返しても良い、方法を提供する。
【００２７】
他の局面において、本発明は、この出願書類に記載された方法によって同定されたマツズマブ模倣物を提供する。
他の局面において、本発明は、同定された模倣分子を投与することを含むＥＧＦＲを阻害する医薬組成物及び方法を提供する。
他の局面において、本発明は、同定された模倣物を投与することを含むＥＧＦＲ発現に関連する疾病又は病状を治療する医薬組成物及び方法を提供する。
ある非限定的な態様において、本発明は、同定された模倣物を投与することを含むＥＧＦＲを発現した腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、マツズマブ模倣物でＥＧＦＲのリガンドによって刺激された過剰増殖性疾病を治療する医薬組成物及び方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】マツズマブは、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する。 Ａ．左側のパネルは、固定化Ｆａｂ７２０００に結合したｓＥＧＦＲ及びｓＥＧＦＲｄ３の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析結果を示す。バイオセンサー表面にＦａｂ断片を共有結合させ示された濃度で一連のサンプルをバイオセンサー表面に通過させた。ｓＥＧＦＲ（黒いしるし）及びｓＥＧＦＲｄ３(赤いしるし)で表示したデータを示す。それぞれの濃度での平衡ＳＰＲ反応値を、最大結合量の割合として表す。曲線は、これらのデータを示された単純な１サイトのラングミュア結合式に適合させたものである。ＫD値（少なくとも３回の独立した結合実験に基づく）は、ｓＥＧＦＲで１０３．２±４．０ｎＭであり、ｓＥＧＦＲｄ３で５０．１±１．３ｎＭである。 右側のパネルは、固定化ＥＧＦへのｓＥＧＦＲの結合に競合するＦａｂ７２０００の能力を示す。６００ｎＭのｓＥＧＦＲのサンプルへのＦａｂの示された過剰量の添加で得られた平衡ＳＰＲ反応を示し、Ｆａｂを添加しないで得られた反応と比較して規格化した。比較のために、Ｆａｂを添加しない場合のｓＥＧＦＲの結合、及び、セツキシマブ（ＦａｂＣ２２５）由来のＦａｂ断片の２倍モル過剰量添加による予め報告されている値を示した（Ｌｉ等、２００５）。各データの点は、少なくとも３回の独立した測定の平均値である。
【図１Ｂ】Ｂ．左側において、Ｆａｂ７２０００：ｓＥＧＦＲｄ３複合体の模型図を示す。参照のために、同じ配向でドメインＩＩＩと連結されたｓＥＧＦＲの模型図を、その左に示す。ドメインＩは赤色に着色され、ドメインＩＩは緑色に着色され、そして、ドメインＩＩＩ及びＩＶは、灰色の中にそれぞれ赤色及び緑色で強調された第２の構造要素を含む。Ｆａｂ７２０００は、ＶL鎖がシアンに着色され、ＶHが黄色に着色されている。図中のボックス（□）は、図１Ｃで示されるＦａｂ７２０００：ｓＥＧＦＲｄ３複合体の領域を示す。矢印は、図１Ｃ中で詳細に表す目的で行われる回転を示す。
【図１Ｃ】Ｃ．ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおけるＦａｂ７２０００結合サイトの拡大図である。ＶL及びＶH鎖は、灰色の中でそれぞれシアン及び黄色で強調されて表される。相互作用するＣＤＲは、ＶL鎖のＬ２及びＬ３がシアンで示され、Ｈ２及びＨ３が黄色で示される。主要な相互作用に関与するアミノ酸の側鎖を示す。アミノ酸は、Ｆａｂ７２０００のＶH由来のアミノ酸が黄色背景で、ＶL由来がシアン背景で、ｓＥＧＦＲｄ３由来が黒で標識されている。水素結合は、緑色の破線で示される。
【図２】ドメインＩＩＩにおけるマツズマブ結合サイトは、ＥＧＦ／ＴＧＦａ結合サイトをふさがない。 Ａ．ｓＥＧＦＲにおけるマツズマブエピトープの変異の分析結果である。固定化ＥＧＦへの変異ｓＥＧＦＲの結合が黒色で示され、Ｆａｂ７２０００表面への変異ｓＥＧＦＲの結合が赤色で示される。データは、図１Ａにおいて記載されたように表される。ＳＰＲ反応は、野生型ｓＥＧＦＲの反応の結合の％割合として表す。 Ｂ．図１Ｂと同じ配向におけるドメインＩＩＩの表面図を示す。左側において、表面はマツズマブの結合サイト（赤色）及びＥＧＦの結合サイト（緑色）で着色されて示される。Ａにおける結合の実験での変異残基は標識されている。右側に、ドメインＩＩＩの同じ配向で、セツキシマブの結合サイト（黄色）、ＥＧＦの結合サイト（緑色）、及び、それらの重複（青色）を示す。
【図３Ａ】マツズマブによるＥＧＦＲの阻害のメカニズムに対する影響 Ａ．右側にＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３の複合体、左側にＥＧＦ結合ｓＥＧＦＲ二量体の模型図を示す。Ｆａｂ７２００／ｓＥＧＦＲｄ３の複合体中のドメインＩＩは、二量体の右のプロモーター中のドメインＩＩＩと同じ配向である。ドメインＩＩＩは赤色／灰色で示され、Ｆａｂ軽鎖がシアン、及び重鎖が黄色で示される。二量体において、リガンドは、紫色に着色され、ドメインＩ及びＩＩＩは赤色に着色され、ドメインＩＩは緑色に着色されている。ドメインＩＩＩにおける第２の構造要素は灰色で陰影を付けられている。矢印は、図３Ｂ中の該配向への回転を示す。
【図３Ｂ】Ｂ．拡大された受容体配座のＦａｂ７２０００モデルの概略図である。Ｆａｂは、軽鎖がシアンに着色され、重鎖が黄色に着色された表面図で示される。受容体ドメインは、模型図のように示され、ドメインＩが赤色に着色され、ドメインＩＩが緑色に着色され、ドメインＩＩＩが赤色／灰色に着色されている。ドメインＩのＮ-末端は、ボックス１で示されたように軽鎖と衝突する。ボックス２は、図３Ｃでより詳細に示される領域を示す。
【図３Ｃ】Ｃ．二量化構成要素受容体配座でのドメインＩＩ／ＩＩＩ相互作用を安定化する二量体に近接したＦａｂ７２０００の拡大図である。ｓＥＧＦＲドメインＩＩは緑色に着色された球体で示され、ドメインＩＩＩは赤色／灰色に着色された模式図で示される。ドメインＩＩ及びＩＩＩにおける二量化安定性に関与する極めて重要なアミノ酸は、黒で着色されている。ドメインＩＩ／ＩＩＩ相互作用を介して二量体接触部分に曝されたドメインＩＩループ（残基Ｄ２７９及びＨ２８０）は、アスタリスクの印がつけられている。Ｆａｂ７２０００ ＶLは、表面図にて灰色で示される。結合は、破線の黒い線で示される。ドメインＩ、ＩＶ、及びＶHは、相互作用を明確に示すために記載されていない。
【図３Ｄ】マツズマブ及びセツキシマブによるＥＧＦＲ二量化の阻害の異なるメカニズム 模型図の中心は、リガンド誘導ＥＧＦＲ二量体を示し、ドメインＩが赤色、ドメインＩＩが緑色、ドメインＩＩＩが赤色の縁で囲まれた灰色、ドメインＩＶが緑色の縁で囲まれた灰色で示され、そして、リガンド（Ｅ）が紫色で示され、１つのプロモーターの色が対比的に強調される。Ｆａｂ７２０００がｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合し、受容体が立体的に二量化を必要とする配座を取れないようにする。重要なことは、Ｆａｂ７２０００は、高い親和性で引き起こされる二量体の構成で重要なドメインＩＩの局所的な配座変化をブロックすることである。阻害は、非競合的である；ドメインＩＩＩにおけるリガンド結合サイトは、ブロックされない。これとは対照的にＦａｂＣ２２５（セツキシマブ）は、ドメインＩＩＩにおけるリガンド結合サイトをブロックし、かくしてリガンド誘導受容体二量化及び活性化を抑制する競合阻害剤である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本発明は、ＥＧＦＲ細胞外ドメイン、特に、ドメインＩＩＩの共結晶を提供する。該結晶は、好ましくは、空間群Ｃ２及び以下のユニットのセル次元を有する：
a＝141.1Å(±0.3Å)、b＝205.0Å(±0.3Å)、c =81.6Å(±0.3Å)、及び、β＝117.5°(±0.5°)。
ＥＧＦＲ−マツズマブのＦａｂ複合体の結晶化は、マツズマブのＦａｂ及びＥＧＦＲの溶液から、様々な技術、例えば、マイクロバッチ、水滴法、シッティングドロップ（sitting drop）、サンドウィッチドロップ（sandwich drop）、播種、及び、透析を用いて行われうる。溶液は、好適なバッファー中で、ＥＧＦＲ細胞外ドメインをマツズマブのＦａｂと結合させることで調製される。標準的なバッファー剤は、例えば、ヘペス、トリス、ＭＥＳ、及び、酢酸が用いられうる。バッファー系は、特に、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム／カリウム、酢酸アンモニウムのような塩の添加によって処理されてもよい。イミダゾールは、バッファーとして用いてもよい。塩の濃度は、好ましくは約１０ｍＭ〜約５００ｍＭであり、より好ましくは、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭであり、最も好ましくは、約５０ｍＭである。バッファーのｐＨは、好ましくは約６〜約８であり、より好ましくは約６〜約７である。溶液中のタンパク質の濃度は、好ましくは、沈殿が生じるほどの過飽和濃度である。溶液は、タンパク質安定剤を含んでもよい。
【００３０】
一つの態様において、沈殿剤、すなわち沈殿を誘導する試薬の存在によってタンパク質の可溶性を減少させる貯蔵器と該溶液との接触で、結晶を沈殿させる。このような接触は、蒸気拡散で行われうる。沈殿剤の例は、硫酸アンモニウム、エタノール、３−エチル−２，４ペンタンジオール、及び、グリコールを含み、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。利用されるＰＥＧは、好ましくは、約４００〜約２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０００Ｄａの分子量を有し、であって、約１０％〜約２０％の濃度、より好ましくは、約１５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する。いくつかの沈殿剤は、タンパク質溶解性に好ましくないバッファーｐＨにすることによって作用しうる。
結晶化の間の温度は、好ましくは約０℃〜約３０℃であり、より好ましくは約２０℃〜約３０℃であり、最も好ましくは約２５℃である。構造の生成に加えて、本発明の結晶化技術は、タンパク質の純度を増加させることにも用いられうる。
【００３１】
ある態様において、ＥＧＦＲと接触するマツズマブの模倣化合物の少なくともいくつかの原子の位置は、ＥＧＦＲと接触するマツズマブの原子の位置と対応する。好ましくは、１〜４Å、好ましくは１〜３Åの距離範囲内で対応する。この原子は、通常、マツズマブのＦａｂの対応する原子と同様の様式（すなわち、極性、塩基性、酸性、疎水性）でＥＧＦＲと相互作用する。模倣物は、様々な数の上記の対応する原子を含むことができ、ＥＧＦＲへの模倣物の結合は、上記の対応する相互作用に、完全に又は部分的にのみ依存しうる。ある態様において、このようなＥＧＦＲとの原子相互作用は、ＥＧＦＲと相互作用する模倣物の他の原子の相互作用によっても補完されうる。模倣物の結合能は、本分野で公知の様々なコンピューター法及びプログラムによって評価されうる。
本発明における模倣物は、ＥＧＦＲに結合し、そして、インビボ及びインビトロの双方においてマツズマブの効果、好ましくは、ＥＧＦＲアンタゴニストとしての効能を模倣する。模倣化合物は、ＥＧＦＲとの親和性、好ましい効能及び／又は好ましい選択性のような基準に基づいて設計されうる。これらの模倣物は、少なくともマツズマブの独自の生物学的活性又は結合活性を有する。生物学的活性及び／又は結合活性を決定するための方法及びアッセイは、本分野において公知である。
【００３２】
ここで用いられる用語「模倣物」又は「模倣化合物」は、ＥＧＦＲへの特異性を模倣した化合物を含む。特に、模倣化合物は、マツズマブと同等にＥＧＦＲをブロックすることによってチロシンキナーゼ活性を阻害する。好ましくは、本発明における模倣化合物は、ペプチド又はポリペプチドであり、又は、より好ましくは、抗体又はその標的ＣＤＲ含有断片である。最も厳密な意味において「模倣物」は、マツズマブと異なる抗体（例えば修飾されたマツズマブ）であるが、マツズマブと比較したときに、ＥＧＦＲに関する生物活性が同様であるか又はまったく同じである抗体である。
好適な模倣化合物のスクリーニング及び選択の後に、選択された模倣物を合成でき、そして、模倣物の生物学的活性又は生理学的活性を測定するために行われる様々なアッセイでＥＧＦＲアンタゴニストが選択される。好適なＥＧＦＲアンタゴニストは、以下の特性の１つ以上を有する：ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害すること；ＥＧＦＲへのリガンド結合をブロックすること；ＥＧＦＲ二量化（ＥＧＦＲのホモ二量体又は他のＥＧＦＲファミリー受容体サブユニットとのヘテロ二量体）を阻害すること；ＥＧＦＲ基質リン酸化を阻害すること；ＥＧＦＲ仲介遺伝子活性化を阻害すること；ＥＧＦＲを発現する細胞の成長又は増殖を阻害すること。好ましくは、アンタゴニストは、マツズマブと比較してＥＧＦＲアンタゴニストとして実質的に同様の又は改良された有効性を有する。
【００３３】
チロシンキナーゼ阻害は、公知の方法を用いて決定されうる；例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、及び／又は、天然の若しくは合成の基質のリン酸化を測定することによって決定されうる。従って、リン酸化アッセイは、本発明のＥＧＦＲアンタゴニストを決定するのに有用である。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウエスタンブロットにおいてリン酸化チロシンに特異的な抗体を用いて検出されうる。チロシンキナーゼ活性のためのいくらかのアッセイは、Panek等, J. Pharmacol. Exp. Thera. (1997) 283: 1433-44及び Batley等, Life Sei. (1998) 62: 143-50に記載されている。
リガンド結合をブロックするための模倣物の能力は、例えば、インビトロ競合アッセイによって測定されうる。ここで、ＥＧＦのようなＥＧＦＲのリガンドを固定して、固定化リガンドへのＥＧＦＲの結合を競合的に阻害するための模倣物の有効性を決定するために結合アッセイを行う。
インビトロアッセイは、ＥＧＦＲアンタゴニストを決定するためにも利用されうる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤が存在するときと存在しないときにおいて受容体リガンドで刺激された細胞ラインを用いてマイトジェンのアッセイによって観測されうる。
【００３４】
別の局面において、本発明は、マツズマブの模倣物の治療的な有効量を投与することで、哺乳類、好ましくはヒトにおける、ＥＧＦＲ依存疾病、疾患、及び、病状を治療する方法を提供する。
本発明のマツズマブ模倣物は、ＥＧＦＲを発現、又は、過剰発現する腫瘍を治療するために特に有用である。ＥＧＦＲ（過剰）発現腫瘍は、この状態においてＥＧＦ存在に特に敏感であり、さらに、腫瘍生成ＥＧＦ又はＴＧＦ−ａによって刺激されうる。
ＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲのリガンドによって刺激される腫瘍の例は、癌腫、グリオーマ、肉腫、腺癌、腺肉腫、及び、腺腫を含む。このような腫瘍は、実際には、体の全ての部分、例えば胸部、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、頸部、又は、肝臓で生じうる。
【００３５】
本発明の他の形態において、マツズマブ模倣物、好ましくはマツズマブのペプチド模倣物又は抗体模倣物は、１つ以上の他の抗腫瘍薬又は細胞毒性薬、例えば化学療法剤（放射能を含んでもよい）と併用投与されうる。このような治療は、本分野では公知である。好適な抗腫瘍薬は、例えばアルカリ化剤又は抗代謝剤であり得る。アルカリ化剤の例は、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、及び、ダカルバジンを含む。抗代謝薬の例は、例えばドキソルビシン（doxorabicin）、ダウノルビシン（daunorabicin）、パクタキセル、及び、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）を含む。さらに、細胞毒性薬は、ＩＬ−２のような好適なサイトカインである。化学療法薬又は細胞毒性薬は、マツズマブの模倣化合物にも結合でき、又は、細胞毒性薬がペプチド又はポリペプチドである場合に、融合タンパク質を形成する抗体又はペプチド模倣物、好ましくは免疫サイトカインと融合できる。
【００３６】
＜マツズマブが、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する＞
ＥＧＦＲへのマツズマブの結合の様式を決定するために、そして、この治療抗体によるＥＧＦＥの阻害のメカニズムを解明するために、この抗体のＦａｂ断片及びＥＧＦＲの細胞外領域間の複合体のＸ線結晶構造を決定した。まず、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化されたＦａｂ７２０００へのｓＥＧＦＲの結合を実験した（実施例参照）。セツキシマブのエピトープは、ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩ上にのみ存在することが予め分かっている（Ｌｉ等、２００５）。
これがマツズマブでも変わらないのかどうか示すために、この同じ固定化Ｆａｂ７２０００への単離ドメインＩＩＩ(ｓＥＧＦＲｄ３；成熟ＥＧＦＲのアミノ酸310-514)の結合を分析した。図１Ａに示されるように、ｓＥＧＦＲ及びｓＥＧＦＲｄ３は、それぞれＫD-値が１０３．２±４．０ｎＭ及び５０．１±１．３ｎＭで固定化Ｆａｂに結合する。セツキシマブに似たマツズマブは、より強固にｓＥＧＦＲｄ３に結合し、これは、おそらくｓＥＧＦＲの他のドメインからの立体障害がないことに起因する。ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅを用いることで、我々は、次に、固定化ＥＧＦへのｓＥＧＦＲの結合と競合するマツズマブの能力を試験した（図１Ａ）。Ｆａｂ７２０００の２倍モル過剰の存在下で、ＥＧＦＢｉａｃｏｒｅ表面上を通ったｓＥＧＦＲの６００ｎＭのサンプルの平衡ＳＰＲ応答は、Ｆａｂを添加しないそれと比較して４５％減少した。さらに５０倍過剰まで添加しても、この結合はさらに減少することは無かった。このことは、Ｆａｂの２倍過剰の添加が、ベースラインに対するｓＥＧＦＲ結合を減少させる、セツキシマブ由来のＦａｂ断片における我々の予めの観察と対照的である（Ｌｉ等，２００５）。
ｓＥＧＦＲへのマツズマブの結合をさらに洞察するために、Ｆａｂ７２０００の構造を、単独及びｓＥＧＦＲ３との複合体において（実験手順及び表１参照のこと）、結晶化した。
【００３７】
＜Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３結合サイト＞
ドメインＩＩＩにおけるＦａｂ７２０００結合サイトは、ドメインＩＩＩベータへリックス（アミノ酸454-464；図１Ｂ）の最もＣ末端のストランドの前にあるループにおいて集中している。このループがＦａｂのＶL鎖及びＶH鎖の間の裂け目の中を貫く。このループの先端は、タイプＩのβターンを形成する。Ｔ４５９及びＳ４６０は裂け目の中に最も深くターンから突き出している。ＥＧＦＲへのセツキシマブの結合で観察されたように、エピトープが抗原上に大きな平面を構成することがより一般的である高分子のタンパク質抗原の認識においては、この様式の結合は珍しい。
Ｆａｂによって形成される全ての主要な相互作用は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来である。各ＣＤＲは、ドメインＩＩＩとの結合に寄与し、接触を決定する重要な特異性の多くは、ＣＤＲ Ｈ２、Ｈ３、及び、Ｌ３でもたらされる。全てのＣＤＲが抗原結合に寄与することは、比較的珍しい（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ及びＭａｒｉｕｚｚａ，2002）。
【００３８】
ｓＥＧＦＲの埋め込まれたループは、ＣＤＲの重鎖及び軽鎖の双方と相互作用をする（図１Ｃ）。エピトープの中心において、Ｔ４５９の副鎖は、Ｆａｂ軽鎖由来のＷ９０及びＨ９３の副鎖と相互作用する。この領域から重鎖への直接の相互作用は、それぞれＣＤＲ Ｈ２由来のＮ５９及びＥ５０の副鎖と相互作用するＴ４５９の骨格カルボニル及びＳ４６０の副鎖から生じる。このｓＥＧＦＲｄ３ループのいずれかの末端のリジン残基は、Ｆａｂにおけるアスパラギン酸との塩橋相互作用をする（重鎖におけるＤ１００とＫ４５４及び軽鎖におけるＤ４９とＫ４６３）。ＣＤＲ Ｈ２及びＨ３の双方からのｓＥＧＦＲｄ３のこのループの主鎖への更なる接触が、Ｆａｂ７２００／ｓＥＧＦＲｄ３接触部分の中心で、水素結合の大規模なネットワークを完成する。
２つの重大な相互作用が、アミノ酸４５４−４６３のループを越えた領域に生じる。ＣＤＲ Ｌ３（Ｈ９３）由来のヒスチジンは、ｓＥＧＦＲｄ３のＤ４３４と相互作用し、一方で、結合サイトの別の側において、ＣＤＲ Ｈ３の頂点由来のＹ１０３が下方に伸びて、Ｎ４９９と相互作用する。
【００３９】
合計２個の塩橋及び１５個の水素結合は、ドメインＩＩＩにおける７５８Å2の溶媒接触可能表面を埋め込んだ接触部分中でのＦａｂ７２０００及びｓＥＧＦＲｄ３の相互作用に関与する（計１５１６Å2の表面が複合体中の溶媒の接触をさえぎる）。多くのこの埋め込まれた表面は無極性であり（７４．１％）、結合接触部分から溶媒が除かれることによって高い結合自由エネルギーを示す（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ等、２０００）。
Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３複合体の接触部分の形状の相補性（ｓｃ）パラメーターは、０．６１である。これは、典型的に観察される抗原-抗体接触部分より低く（０．６４〜０．６８）（Ｌａｗｒｅｎｃｅ及びＣｏｌｍａｎ、１９９３）、そして、０．７０〜０．７５の範囲のパーツズマブ、セツキシマブ、及び、トラスズマブのｓｃ値よりも低い（Ｆｒａｎｋｌｉｎ等、２００４；Ｌｉ等、２００５；Ｃｈｏ等、２００３）。ここに追加すること：結合エネルギー又は親和性についてのコメント。
Ｆａｂ７２０００の配座は、受容体結合を著しくは変化させない。Ｃα位置のｒｍｓｄは、ＶLで０．５６Åであり、ＶHで０．９６Åである。また、Ｆａｂ７２０００の結合配座において、Ｌ字型の角度（elbow angle）は、４°のみ増加し、このことは、動的なＬ字型の柔軟性の範囲内である（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ等，２００６）。
【００４０】
＜受容体結合サイトにおける変異は、Ｆａｂ７２０００との結合を消失させるが、ＥＧＦ結合には影響しない＞
溶液中の結晶構造によって明らかにされたようなマツズマブのエピトープを確認するために、抗体-受容体の接触部分における主要な残基の受容体変異体が生成された。これらは、Ｆａｂ７２０００チップと同様にＥＧＦに結合する能力についてＳＰＲ/Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで試験された（図２Ａ）。受容体結合サイトにおける３つの組のアラニン変異体では、Ｆａｂ７２０００へのｓＥＧＦＲの結合が完全になくなったが、ＥＧＦへの結合はほんのわずかに影響を受けただけである。これは、抗体結合サイトの変異がリガンドへの結合も著しく減らしたセツキシマブに関する観察結果と対照的である（Ｌｉ等，２００５）。
【００４１】
＜マツズマブ、セツキシマブ及びＥＧＦ／ＴＧＦαのｓＥＧＦＲ結合サイトの比較＞
図２Ｂにおいて、ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおけるマツズマブ、ＥＧＦ、及び、セツキシマブのエピトープが示された。マツズマブのエピトープは、ＥＧＦのエピトープと重ならない。実際には、ｓＥＧＦＲ：ＥＧＦ複合体（ＰＤＢ ｉｄ １ＩＶＯ）由来のドメインＩＩＩにオーバーレイされたＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３複合体由来のドメインＩＩＩと、Ｆａｂ７２０００及びＥＧＦは、重ならず；Ｆａｂ及びＥＧＦの最接近距離は、９Åである。これは、セツキシマブ結合の場合と明らかに対照的である。ドメインＩＩＩにおけるセツキシマブ及びＥＧＦ結合サイトの間では高い度合いで重なる。リガンド結合の立体障害は、ＥＧＦＲのリガンド誘導二量化及び活性化のセツキシマブ仲介阻害の重要なメカニズムである（Ｌｉ等、２００５）。マツズマブによるＥＧＦＲ活性化の阻害のメカニズムは明確に相違しているに違いない。
【００４２】
＜マツズマブによるＥＧＦＲ活性化の阻害のメカニズムの関係性＞
マツズマブが、どのようにしてＥＧＦＲのリガンド誘導二量化及び活性化を阻害することができるかを理解するために、我々は、受容体のリガンド誘導-二量型の形態におけるＦａｂ７２０００の結合の効果を検討する。Ｆａｂ７２０００/ｓＥＧＦＲｄ３複合体由来のドメインＩＩＩが、その伸長(extended)二量化構成要素配座における受容体(PDB id 1MOX)由来のドメインＩＩＩとオーバーレイされたとき、Ｆａｂと伸長受容体のドメインＩ及びドメインＩＩの双方との間で不一致が生じる（Ｏｇｉｓｏ等，２００２；Ｇａｒｒｅｔｔ等，２００２）（図３Ａ）。ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合したマツズマブのために、受容体は、二量化に必要とされるドメイン再編成をうけることができない。更に、以下で詳述するように、Ｆａｂ７２０００の結合はまた、引き起こされる二量体の形成に重要なドメインＩＩの局所配座変化をブロックする。
伸長受容体配座におけるドメインＩのＮ末端領域は、ドメインＩが高い親和性のリガンド結合を要する位置に達するのを妨げるＦａｂ７２０００の軽鎖と衝突する（図３Ｂ）。これは、その抗体によるＥＧＦＲ二量化の阻害のメカニズムの一部として予め組み込まれたセツキシマブ及びドメインＩの間での衝突を、天然型及び伸長型(in nature and extent)において暗示している（Ｌｉ等，２００５）。その場合において、ドメインＩＩＩにおけるＦａｂの異なる配向は、受容体二量体におけるその必要とされる位置由来のドメインＩのＮ末端部分をふさぐように重鎖を配置する。
【００４３】
伸長受容体のドメインＩＩ及びＦａｂ７２０００の間の衝突は、新規の発見であり、意義深い。ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合したＦａｂ７２０００のために、ドメインＩＩのＣ末端部分が、受容体のリガンド結合二量体形態において観察される配座を選択することはできない。図３Ｃに示されるように、伸長配座中のｓＥＧＦＲ分子におけるそのドメインＩＩＩ結合サイトに、Ｆａｂがドッキングした場合に、ドメインＩＩのＣ半末端に沿って、支配的にＦａｂのＶL鎖との衝突がおこる。ドメインＩＩのこのＣ半末端は、受容体二量体中の他の分子からの二量化のアームのための結合ポケットを形成する。ドメインＩＩにおけるＣ末端ループからの二量体接触部分を通した更なる相互作用は、実質的にＥＧＦＲ二量化の安定性に寄与する。この領域中のドメインＩＩの配座は、ＥＧＦＲ二量化及び活性化に重要であることが示されているドメインＩＩＩとの相互作用によって安定化される（Ｄａｗｓｏｎ等，２００５）。ドメインＩＩＩへのＦａｂ７２０００の結合は、これら全ての相互作用を妨害する。
ＥＧＦＲのドメインＩＩＩへ結合するＦａｂ７２０００は、ドメインＩＩにおけるドメイン再編成及び局所的配座変化をブロックする。従って、引き起こされるＥＧＦＲ二量体の形成におけるこれらの主要な要素の双方をブロックすることは、マツズマブによるＥＧＦＲ活性化の効果的な阻害に重要であることが示された。
【００４４】
＜結論＞
ＥＧＦＲ二量化は、ドメインＩ及びＩＩＩに結合するリガンドによって促進される受容体細胞外領域の配座再編成を必要とする（図３Ｄ）。セツキシマブは、競合阻害剤として作用し、ドメインＩＩＩリガンド結合サイトに対するリガンドのアクセスを直接的にブロックしてリガンド誘導二量化を抑制する。それに反して、マツズマブは、ドメインＩＩＩにおけるリガンド結合サイトをふさがない。寧ろ、マツズマブは、ｓＥＧＦＲ二量化及び活性化を阻害する新規の非競合メカニズムを利用し、該メカニズムは、高い親和性リガンド結合及び二量化を必要とする配座を、受容体が選択するのを立体的にブロックすることに完全に依存している。
このことは、がん治療においてそれぞれの潜在力を利用し、相乗効果を与える様々な阻害メカニズムを有する治療的抗体の併用に照らして、興味深い。
【００４５】
[実施例]
＜実施例１＞タンパク質発現及び精製
ｓＥＧＦＲ及びｓＥＧＦＲｄ３を、バキュロウイルス-感染Ｓｆ９細胞中で発現させ、記載（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等，２０００；Ｌｉ等，２００５）されているように精製し、そして、それらのグリコシル化修飾をせずに用いた。
マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）は、Merck Serono KGaA(USA／ドイツ)によって提供された。Ｆａｂ断片（Ｆａｂ７２０００）を、ImmunoPure Fab Preparation Kit(Pierce)を用いてパパイン開裂によって生成し、更に精製することなく用いた。Ｆａｂ７２０００/ｓＥＧＦＲ複合体を記載されたように（Ｌｉ等，２００５）正確に生成した。ｓＥＧＦＲｄ３との複合体を生成するために、Ｆａｂを１．２倍のモル過剰のｓＥＧＦＲｄ３と混合して、Bio-Silect SEC250カラム（バイオラッド）を用いたサイズ排出クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、過剰なｓＥＧＦＲｄ３を複合体から分離し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ７．５）で平衡化した。
【００４６】
＜実施例２＞結晶化及びデータ収集
タンパク質を濃縮し、バッファーを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ ７．５）に変えて、水滴蒸気拡散法を用いて結晶化した。Ｆａｂ７２０００の大きな単結晶は、等容量（１μｌ）のＦａｂ（１３ｍｇ／ｍｌ）を、１．８Ｍの硫酸アンモニウム、０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ ６．５）を含有する溶液と混合して、２０℃で、このバッファーを含む貯蔵器で平衡にして得られた。結晶は、９％スクロース、２％グルコース、８％グリセロール、８％エチレングリコールを含む貯蔵器の中で急速冷凍された。ＡＤＳＣQuantum−２１０ ＣＣＤ検出器を用いて、Cornell High Energy Synchrotron Source(CHESS) ビームライン F1でデータを収集した。１ＭのＮａＣｌ、１６％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ ６．０）と、当量部（１μｌ）の複合体（１４ｍｇ／ｍｌ）を混合して、２０℃で同じバッファーを含む貯蔵器で平衡化することによって、Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３を、結晶化した。ストリークシーディング法を用いて大きな単結晶(0.5 x 0.1 x 0.15mm)を製造し、高濃度のエチレングリコール（最終濃度１５％）を含む貯蔵器の中の溶液へシリアル転送して該単結晶を結晶安定化させ、液体窒素中で急速冷凍した。ｘｘｘ検出器を用いて、Swiss Light Source (SLS)ビームラインＸ０６ＳＡで、データを収集した。全てのデータは、ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ及びＭｉｎｏｒ、１９９７）にて処理された。データ収集統計は、表１の中に要約されている。
【００４７】
＜実施例３＞構造決定及び精密化
Ｆａｂ７２０００及びＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３の構造を、プログラムＰＨＡＳＥＲ（ＣＣＰ４、１９９４）を用いた分子置換（ＭＲ）法によって解き明かした。Ｆａｂ構造を解き明かすために、Ｆａｂ２Ｃ４（PDB id 1L7I）の座標（Ｖａｊｄｏｓ等、２００２）を、このＦａｂ及びＦａｂ７２０００の間のシークエンス同一性に基づいた初期探索モデルとして選択した。Ｆａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３構造を解き明かすために、探索モデルとして精密化されたＦａｂ７２０００座標を用いて、まずＦａｂの位置を決定した。非対称ユニットにおける２つのＦａｂコピーの一つの位置を決定した。この解決結果を利用して、ｓＥＧＦＲのドメインＩＩＩ(PDB id 1YY9由来のアミノ酸 310-500)の座標を用いた第２の探索によって、１つのｓＥＧＦＲｄ３分子の位置を決定した。その後に、非対称ユニットにおける第２のＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３複合体が、見つかった。座標を手動でＣＯＯＴにおいて再構築し（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ、２００４）、ＣＮＳ（ＢＲＵＮＧＥＲ等、１９９８）及びＲｅｆｍａｃ（ＣＣＰ４、１９９８）を用いて精密化した。新しいマップは、精密化のすべての繰り返しの後に計算され、ＣＣＰ４プログラムＤＭで計算された最小化されたモデルバイアスを有する溶媒平滑化マップ含む。
【００４８】
＜実施例４＞結合実験
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）／Ｂｉａｃｏｒｅ実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００計器を用いて２５℃で、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０の中で行った。Ｆａｂ７２０００を、以下のようにしてＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した：ＣＭ-デキストランマトリクスを、Ｎ-エチル-Ｎ’-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ）、及び、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドで活性化した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）の中で、５００ｎｇのＦａｂ断片を５μｇ／ｍｌで活性化表面の上に流した。残留反応サイトは、１Ｍのエタノールアミン-ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でブロックされた。固定化Ｆａｂ断片は、１４３６応答ユニット（ＲＵ）のシグナルを与えた。２つの５μｌのインジェクション（１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）、１ＭのＮａＣｌ）を用い、残留受容体を除くために、ｓＥＧＦＲ接触間で表面を再生した。ＥＧＦ固定化及びｓＥＧＦＲ結合分析を、上述のように正確に行った（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等，２０００）。データをプリズム４で分析した（GraphPad Software, Inc．）。
【００４９】
＜実施例５＞ｓＥＧＦＲエピトープ変異の生成
部位特異的突然変異誘発法を利用して、pFastBacベクターの中の適当なＤＮＡにアラニン又は欠失変異体を導入した。以下の変異体を作製した：K454A、K463A、△S460、T459A/S460A、K454A/T459A/S460A、T459A/S460A/K463A。組換えバキュロウイルスの生成、Ｓｆ９細胞における過剰発現及びタンパク質精製を、野生型ｓＥＧＦＲ用として前に記載されたように正確に行った(Ferguson等, 2000)。
Ｆａｂ７２０００及びＦａｂ７２０００／ｓＥＧＦＲｄ３構造体の座標は、ＲＣＳＢタンパク質データバンクに蓄積されている（それぞれのpdb idコード xxxx及びxxxx）。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表２：残基-受容体／残基-マツズマブのＦａｂ結合／相互作用のリスト：
原子源 標的原子 距離 角度
Ser 433D O ... His 93L CE1 ... 3.35
... His 93L NE2 ... 3.91 *
Asp 434D CB ... His 93L NE2 ... 3.69
Asp 434D CG ... His 93L CE1 ... 3.72
... His 93L NE2 ... 3.02
Asp 434D OD1 ... His 93L CD2 ... 3.77
... His 93L CE1 ... 3.18
... His 93L NE2 ... 2.74 ***
Asp 434D OD2 ... His 93L NE2 ... 3.47 *
Asp 436D OD2 ... Tyr 31L OH ... 3.91 *
Asn 449D N ... Tyr 103H OH ... 3.86 *
Asn 449D CA ... Tyr 103H OH ... 3.49
Asn 449D CG ... Tyr 103H OH ... 3.82
Asn 449D ND2 ... Tyr 103H CZ ... 3.67
... Tyr 103H OH ... 2.76 ***
Asn 452D ND2 ... Ser 54H CB ... 3.92
... Thr 30H O ... 3.60 *
Trp 453D CD1 ... Tyr 103H CE1 ... 3.84
Lys 454D C ... Ser 54H OG ... 3.93
... Asn 52H ND2 ... 3.79
Lys 454D O ... Asn 52H ND2 ... 2.95 ***
... Asn 55H ND2 ... 3.70 *
Lys 454D CG ... Ser 31H O ... 3.47
Lys 454D CD ... Ser 31H O ... 3.53
... Asp 100H OD2 ... 3.76
Lys 454D CE ... Asp 100H CG ... 3.49
... Asp 100H OD1 ... 3.80
... Ser 31H O ... 3.20
... Asp 100H OD2 ... 2.64
... Tyr 101H O ... 3.50
Lys 454D NZ ... Asp 100H OD2 ... 3.48 *
... Tyr 101H C ... 3.68
... Tyr 101H O ... 2.46 ***
Lys 455D N ... Ser 54H OG ... 3.48 *
Lys 455D CA ... Ser 54H OG ... 3.24
... Asn 55H ND2 ... 3.92
Lys 455D C ... Asn 55H ND2 ... 3.44
Lys 455D O ... Asn 55H CB ... 3.55
... Asn 55H CG ... 3.77
... Asn 55H ND2 ... 3.01 ***
Lys 455D CB ... Ser 54H OG ... 3.64
Leu 456D C ... Arg 57H NH1 ... 3.90
Leu 456D O ... Arg 57H NH1 ... 3.97 *
Phe 457D N ... Arg 57H NH1 ... 3.95 *
... Asn 55H ND2 ... 3.89 *
Phe 457D C ... Arg 57H NH1 ... 3.93
Phe 457D O ... Arg 57H CD ... 3.59
... Arg 57H NH1 ... 3.52 *
... Asn 52H ND2 ... 3.50 *
... Asn 55H ND2 ... 3.28 ***
... Trp 33H CZ2 ... 3.63
Gly 458D C ... Trp 33H CH2 ... 3.49
... Trp 33H CZ2 ... 3.40
Gly 458D O ... Trp 33H CH2 ... 3.06
... Asn 59H CG ... 3.97
... Asn 59H ND2 ... 3.16 ***
... Trp 33H CZ2 ... 3.45
Thr 459D N ... Trp 33H CH2 ... 3.94
... Trp 33H CZ2 ... 3.49
Thr 459D CA ... Trp 33H CH2 ... 3.95
... Trp 33H CZ2 ... 3.57
Thr 459D C ... Trp 33H NE1 ... 3.51
... Trp 33H CE2 ... 3.46
... Trp 33H CZ2 ... 3.53
Thr 459D O ... Trp 33H NE1 ... 2.98 ***
... Trp 33H CD1 ... 3.86
... Trp 33H CE2 ... 3.33
... Trp 33H CZ2 ... 3.49
Thr 459D CB ... Trp 90L CZ2 ... 3.63
... His 93L ND1 ... 3.81
Thr 459D OG1 ... Trp 90L CZ2 ... 3.59
... His 93L ND1 ... 3.33 *
... His 93L CE1 ... 3.37
Thr 459D CG2 ... Glu 50H OE1 ... 3.19
... His 93L O ... 3.98
... Trp 90L CZ2 ... 3.61
... His 93L CA ... 3.57
... His 93L CB ... 3.80
... His 93L CG ... 3.75
... His 93L ND1 ... 3.12
... Trp 90L NE1 ... 3.76
Ser 460D N ... Trp 33H NE1 ... 3.88 *
... Glu 50H OE1 ... 3.97 *
... Glu 50H OE2 ... 3.35 *
... Trp 33H CE2 ... 3.86
Ser 460D CA ... Glu 50H OE2 ... 3.96
Ser 460D O ... Tyr 101H CD2 ... 3.31
Ser 460D CB ... Glu 50H OE2 ... 3.53
Ser 460D OG ... Glu 50H CD ... 3.58
... Glu 50H OE2 ... 2.39 ***
... His 35H CE1 ... 3.26
... His 35H NE2 ... 3.29 ***
... Arg 99H O ... 3.65 *
... Phe 95L CE1 ... 3.94
... Phe 95L CZ ... 3.98
Gly 461D N ... Trp 90L CZ2 ... 3.97
Gly 461D CA ... Trp 90L CZ2 ... 3.80
... Trp 90L CZ3 ... 3.80
... Trp 90L CH2 ... 3.62
Gly 461D O ... Tyr 31L CE2 ... 3.62
... Tyr 31L OH ... 3.69 *
Lys 463D CD ... Tyr 101H CG ... 3.80
... Tyr 101H CD1 ... 3.56
... Tyr 101H CE1 ... 3.73
Lys 463D CE ... Tyr 31L CZ ... 3.87
... Tyr 31L OH ... 3.15
Lys 463D NZ ... Tyr 101H CD1 ... 3.97
... Tyr 101H CE1 ... 3.34
... Tyr 101H CZ ... 3.74
... Asp 49L OD2 ... 3.42 *
... Tyr 101H OH ... 3.89 *
... Tyr 31L CZ ... 3.99
... Tyr 31L OH ... 3.75 *
Thr 464D O ... Tyr 103H O ... 3.74 *
Thr 464D OG1 ... Tyr 103H O ... 3.79 *
Ile 466D CB ... Tyr 103H OH ... 3.73
【００５２】
以下の文献引用は、上記記載に挙げられ、そして、参照により組み込まれる：
(1) Baselga, J. (2002), Oncologist 7, 2-8.
(2) Bier, H.等, (2001), Cancer Chemother. Pharmacol. 47, 519-524.
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、及び、マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）のＦａｂの受容体−抗体複合体を含む、受容体−抗体複合体の結晶であって、
空間群Ｃ２に属し、以下のセル座標を有する結晶：
a＝141Å(±3Å)、b＝205Å(±3Å)、c＝81Å(±3Å)、及びβ＝117°(±1°)。
【請求項２】
以下のセル座標を有する、請求項１に記載の結晶：
a＝141.1Å(±0.3Å)、b＝205.0Å(±0.3Å)、c =81.6Å(±0.3Å)、及び、β＝117.5°(±0.5°)。
【請求項３】
抗体全体のパパイン開裂で生じたマツズマブのＦａｂ断片を、
１ＭのＮａＣｌ、１６％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭのＭＥＳを含み、ｐＨが６．０〜７．０である、ＥＧＦＲの可溶性細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ）の溶液と混合し、
約２０℃で、同じバッファーを含む貯蔵器で平衡にして得られうる、請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
可溶性細胞外ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）を使用することによって得られうる、請求項３に記載の結晶。
【請求項５】
ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及びマツズマブのＦａｂの複合体の結晶を調製する方法であって、
ＥＧＦＲのドメイン及びマツズマブのＦａｂ断片を含み、ｐＨが６．０〜７．０であるバッファー溶液を調製して、結晶を成長させることによって結晶を調製する方法。
【請求項６】
可溶性細胞外ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バッファー溶液が、沈降剤を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
バッファー溶液が、沈降剤としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
類似の、又は同様の生物活性を有するマツズマブの模倣物候補を同定して選択する方法であって、
（ａ）模倣物-ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中のＥＧＦＲに結合した模倣化合物の結合座標、又は、その断片の結合座標を、
（ｂ）請求項１又は請求項４に規定されたマツズマブ−ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中でＥＧＦＲに結合するマツズマブのＦａｂ断片の結合座標と、
比較することを含み、
前記結合座標が、
（ｉ） マツズマブのＦａｂ断片と結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基の位置、
（ｉｉ）これらの位置のＥＧＦＲのアミノ酸の中の特定の原子と、これらの位置のＥＧＦＲの前記アミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する模倣化合物の中での特定の原子との間の距離、及び、
（ｉｉｉ）参照として、これらの位置のＥＧＦＲのアミノ酸の中の特定の原子と、マツズマブのＦａｂ断片の中の特定の原子との間の距離、
によって定義される方法。
【請求項１０】
前記位置のＥＧＦＲのアミノ酸残基の原子と、
前記結晶複合体中でそれらと結合するか、又は相互作用する模倣化合物の原子との間の距離が、４Å未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記位置のＥＧＦＲのアミノ酸残基の原子と、
前記結晶複合体中でそれらと結合するか、又は相互作用する模倣化合物の原子との間の距離が、３Å未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
模倣物−ＥＧＦＲ複合体の結晶構造が、マツズマブ／ＥＧＦＲの結晶複合体で使用される同様の又は類似の方法に従って調製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
模倣物候補及びマツズマブのＦａｂそれぞれと結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基が、Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
模倣物候補及びマツズマブのＦａｂそれぞれと結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基が、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
模倣物候補及びマツズマブのＦａｂそれぞれと結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項９に記載の方法：
(a1) Lys454
(a2) Lys454及びLys455
(a3) Lys454及びLys455及びPhe457
(a4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(a5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(a6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460
(a7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461
(a8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463
(a9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463及びThr464
(a10) Phe457
(a11) Phe457及びLys454
(a12) Phe457及びLys454及びGly458
(a13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(a14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(a15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a16) Thr459
(a17) Thr459及びLys454
(a18) Thr459及びLys454及びPhe457
(a19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(a20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(a21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及び
Gly461
(a22) Ser460及びLys454
(a23) Ser460及びLys454及びPhe457
(a24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(a25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(a26) Lys454及びPhe457
(a27) Lys454及びPhe457及びSer460
(a28) Lys454及びPhe457及びGly461
(a29) Lys454及びPhe457及びThr459
(a30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a32) Phe457及びSer460
(a33) Phe457及びThr459及びSer460
(a34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a35) Ala448
(a36) Ala448及びAsn449
(a37) Ala448及びLys454
(a38) Ala448及びLys454及びPhe457
(a39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(a40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(a41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(a42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a44) Asn449
(a45) Asn449及びLys454
(a46) Asn449及びLys454及びPhe457
(a47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(a48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(a51) Ser433及び／又はAsp433を含む選択肢(a1)−(a50)のいずれか。
【請求項１６】
模倣化合物が、ペプチド、ポリペプチド、又は、タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
模倣化合物が、抗体、又は、それらのＣＤＲ含有断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
模倣化合物が、マツズマブのＦａｂ断片と類似の、又は改良された親和性でＥＧＦＲに結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
模倣化合物が、以下の性質の少なくとも１つを有する請求項９に記載の方法：
（ｉ） ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害すること、
（ｉｉ） ＥＧＦ受容体の二量化を阻害すること、
（ｉｉｉ） ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックすること。
【請求項２０】
模倣化合物が、抗体、又は、そのＣＤＲ含有断片である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＧＦＲとの結晶複合体を形成する前に模倣物候補を修飾し、結合座標を決定し、そして、結晶構造における前記位置の１つ以上のＥＧＦＲのアミノ酸残基との改良された結合特性を有する模倣物候補を選択する、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
模倣物候補が、請求項２０に規定されるようなＥＧＦＲのアンタゴニストの生物学的活性を維持しているか、又は獲得している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
模倣物候補が、抗体又はその断片であり、
修飾が、抗体又はその断片の少なくとも１つのＣＤＲ領域の中で少なくとも１つのアミノ酸の置換によって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）の模倣物であり、
（ｉ） ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ） ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ） ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ） ＥＧＦＲの位置４４８と４６４との間のシークエンストラックの少なくとも３個のアミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する、化合物。
【請求項２５】
ＥＧＦＲの位置４５４及び４５９の間のシークエンストラックの少なくとも３個のアミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
少なくともＥＧＦＲの以下の残基と結合するか、又は相互作用する、請求項２４に記載の化合物：
Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464。
【請求項２７】
少なくともＥＧＦＲの以下の残基と結合するか、又は相互作用する、請求項２４に記載の化合物：
Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458及びThr459。
【請求項２８】
少なくとも請求項２７の化合物、及び、
（ｉ） ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ） ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ） ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ） ＥＧＦＲの以下のアミノ酸残基、又は、少なくとも４個のアミノ酸のサブセットと結合するか、又は相互作用する、第２の化合物を含む、化合物の組成物：
Gln 384、Gln 408、Ser 418、Ser 440、Lys 465、Ser 468、及び、Asn 469。
【請求項２９】
第２の化合物が、少なくとも同じＥＧＦＲのアミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する、セツキシマブ又はセツキシマブ模倣化合物である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
・ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
・ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
・ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
・マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する、
抗ＥＧＦＲ抗体を設計する方法であって、
（ｉ） 少なくともマツズマブの重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ領域中の、又は、ＣＤＲに隣接したフレームワーク領域（ＦＲ）中の、１個のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換し、
（ｉｉ） 修飾されたマツズマブのＦａｂ断片及びＥＧＦＲの可溶細胞外ドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）によって形成される結晶複合体を調製し、
（ｉｉｉ） ＥＧＦＲドメイン中の特定のアミノ酸残基の位置に対する上記のように形成される結晶複合体の原子座標を、ｓＥＧＦＲｄ３と一緒に非修飾のマツズマブによって形成される参照用の結晶複合体の対応する座標と比較し、
（ｉｖ） ＥＧＦＲドメインにおける前記特定のアミノ酸残基の位置に対してより密接な相互作用をとらせる原子座標を有する修飾されたマツズマブを選択し、
（ｖ） 標準方法によってその結合親和性及び生物学的活性をアッセイし、そして、
（ｖｉ） 工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返しても良い、方法。
【請求項３１】
前記それぞれの結晶複合体を得るための方法であって、
前記それぞれの抗体全体のパパイン開裂によって生じた、修飾された又は非修飾のマツズマブのＦａｂ断片を、
１ＭのＮａＣｌ、１６％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭのＭＥＳを含み、ｐＨが６．０〜７．０である、ＥＧＦＲ可溶細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ）のバッファー溶液と混合し、
約２０℃で、同じバッファーを含む貯蔵器で平衡にして、
バッファー溶液が、沈降剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＥＧＦＲドメインに中の特異的アミノ酸残基の位置の少なくとも４個が、
Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＧＦＲドメインの中の特異的アミノ酸残基の位置の少なくとも４個が、
Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＥＧＦＲドメインの中の特異的アミノ酸残基の位置が、少なくとも以下からなる群から選択される請求項３０に記載の方法：
(a1) Lys454
(a2) Lys454 及びLys455
(a3) Lys454及びLys455及びPhe457
(a4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(a5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(a6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460
(a7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461
(a8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463
(a9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463及びThr464
(a10) Phe457
(a11) Phe457及びLys454
(a12) Phe457及びLys454及びGly458
(a13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(a14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(a15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a16) Thr459
(a17) Thr459及びLys454
(a18) Thr459及びLys454及びPhe457
(a19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(a20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(a21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及び
Gly461
(a22) Ser460及びLys454
(a23) Ser460及びLys454及びPhe457
(a24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(a25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(a26) Lys454及びPhe457
(a27) Lys454及びPhe457及びSer460
(a28) Lys454及びPhe457及びGly461
(a29) Lys454及びPhe457及びThr459
(a30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a32) Phe457及びSer460
(a33) Phe457及びThr459及びSer460
(a34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a35) Ala448
(a36) Ala448及びAsn449
(a37) Ala448及びLys454
(a38) Ala448及びLys454及びPhe457
(a39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(a40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(a41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(a42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a44) Asn449
(a45) Asn449及びLys454
(a46) Asn449及びLys454及びPhe457
(a47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(a48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(a51) Ser433及びAsp433を含む選択肢(a1)−(a50)のいずれか。
【請求項３５】
修飾されたマツズマブのＦａｂ及びｓＥＧＦＲｄ３によって形成される結晶複合体の原子座標において、
相互作用又は結合に関与するアミノ酸残基の間の原子距離が、
非修飾の、又は、修飾が少ないマツズマブによって形成される参照用の結晶複合体の原子座標によって与えられるそれぞれの距離より小さくなるようにした、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
原子座標によって与えられるそれぞれの距離が、４Å未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
原子座標によって与えられるそれぞれの距離が、３Å未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
原子座標によって与えられるそれぞれの距離が、２Å未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
置換が、マツズマブの重鎖のＣＤＲ又はＦＲで行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
置換が、マツズマブの重鎖又は軽鎖のＣＤＲ３で行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３０又は３４の方法によって得られる抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項４２】
患者に、請求項２４の化合物、又は、請求項２８の組成物、又は、請求項４１の抗体を投与することを含むＥＧＦＲの阻害によって、ＥＧＦＲ関連疾病又は疾患を治療する方法。
【請求項４３】
ＥＧＦＲ関連疾病又は疾患が癌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する抗ＥＧＦＲ抗体を設計及び製造するためのＥＧＦＲ抗体結晶複合体中のSer433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基の使用。
【請求項４５】
マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する抗ＥＧＦＲ抗体を設計及び製造するためのＥＧＦＲ抗体結晶複合体中のアミノ酸残基Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460及びGly461の使用。
【請求項１】
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン、及び、マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）のＦａｂの受容体−抗体複合体を含む、受容体−抗体複合体の結晶であって、
空間群Ｃ２に属し、以下のセル座標を有する結晶：
a＝141Å(±3Å)、b＝205Å(±3Å)、c＝81Å(±3Å)、及びβ＝117°(±1°)。
【請求項２】
以下のセル座標を有する、請求項１に記載の結晶：
a＝141.1Å(±0.3Å)、b＝205.0Å(±0.3Å)、c =81.6Å(±0.3Å)、及び、β＝117.5°(±0.5°)。
【請求項３】
抗体全体のパパイン開裂で生じたマツズマブのＦａｂ断片を、
１ＭのＮａＣｌ、１６％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭのＭＥＳを含み、ｐＨが６．０〜７．０である、ＥＧＦＲの可溶性細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ）の溶液と混合し、
約２０℃で、同じバッファーを含む貯蔵器で平衡にして得られうる、請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
可溶性細胞外ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）を使用することによって得られうる、請求項３に記載の結晶。
【請求項５】
ＥＧＦＲの細胞外ドメイン及びマツズマブのＦａｂの複合体の結晶を調製する方法であって、
ＥＧＦＲのドメイン及びマツズマブのＦａｂ断片を含み、ｐＨが６．０〜７．０であるバッファー溶液を調製して、結晶を成長させることによって結晶を調製する方法。
【請求項６】
可溶性細胞外ＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バッファー溶液が、沈降剤を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
バッファー溶液が、沈降剤としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
類似の、又は同様の生物活性を有するマツズマブの模倣物候補を同定して選択する方法であって、
（ａ）模倣物-ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中のＥＧＦＲに結合した模倣化合物の結合座標、又は、その断片の結合座標を、
（ｂ）請求項１又は請求項４に規定されたマツズマブ−ＥＧＦＲ複合体の結晶構造の中でＥＧＦＲに結合するマツズマブのＦａｂ断片の結合座標と、
比較することを含み、
前記結合座標が、
（ｉ） マツズマブのＦａｂ断片と結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基の位置、
（ｉｉ）これらの位置のＥＧＦＲのアミノ酸の中の特定の原子と、これらの位置のＥＧＦＲの前記アミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する模倣化合物の中での特定の原子との間の距離、及び、
（ｉｉｉ）参照として、これらの位置のＥＧＦＲのアミノ酸の中の特定の原子と、マツズマブのＦａｂ断片の中の特定の原子との間の距離、
によって定義される方法。
【請求項１０】
前記位置のＥＧＦＲのアミノ酸残基の原子と、
前記結晶複合体中でそれらと結合するか、又は相互作用する模倣化合物の原子との間の距離が、４Å未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記位置のＥＧＦＲのアミノ酸残基の原子と、
前記結晶複合体中でそれらと結合するか、又は相互作用する模倣化合物の原子との間の距離が、３Å未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
模倣物−ＥＧＦＲ複合体の結晶構造が、マツズマブ／ＥＧＦＲの結晶複合体で使用される同様の又は類似の方法に従って調製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
模倣物候補及びマツズマブのＦａｂそれぞれと結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基が、Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
模倣物候補及びマツズマブのＦａｂそれぞれと結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基が、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
模倣物候補及びマツズマブのＦａｂそれぞれと結合するか、又は相互作用するＥＧＦＲのアミノ酸残基が、以下からなる群から選択される、請求項９に記載の方法：
(a1) Lys454
(a2) Lys454及びLys455
(a3) Lys454及びLys455及びPhe457
(a4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(a5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(a6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460
(a7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461
(a8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463
(a9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463及びThr464
(a10) Phe457
(a11) Phe457及びLys454
(a12) Phe457及びLys454及びGly458
(a13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(a14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(a15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a16) Thr459
(a17) Thr459及びLys454
(a18) Thr459及びLys454及びPhe457
(a19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(a20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(a21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及び
Gly461
(a22) Ser460及びLys454
(a23) Ser460及びLys454及びPhe457
(a24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(a25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(a26) Lys454及びPhe457
(a27) Lys454及びPhe457及びSer460
(a28) Lys454及びPhe457及びGly461
(a29) Lys454及びPhe457及びThr459
(a30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a32) Phe457及びSer460
(a33) Phe457及びThr459及びSer460
(a34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a35) Ala448
(a36) Ala448及びAsn449
(a37) Ala448及びLys454
(a38) Ala448及びLys454及びPhe457
(a39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(a40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(a41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(a42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a44) Asn449
(a45) Asn449及びLys454
(a46) Asn449及びLys454及びPhe457
(a47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(a48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(a51) Ser433及び／又はAsp433を含む選択肢(a1)−(a50)のいずれか。
【請求項１６】
模倣化合物が、ペプチド、ポリペプチド、又は、タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
模倣化合物が、抗体、又は、それらのＣＤＲ含有断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
模倣化合物が、マツズマブのＦａｂ断片と類似の、又は改良された親和性でＥＧＦＲに結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
模倣化合物が、以下の性質の少なくとも１つを有する請求項９に記載の方法：
（ｉ） ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害すること、
（ｉｉ） ＥＧＦ受容体の二量化を阻害すること、
（ｉｉｉ） ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックすること。
【請求項２０】
模倣化合物が、抗体、又は、そのＣＤＲ含有断片である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＧＦＲとの結晶複合体を形成する前に模倣物候補を修飾し、結合座標を決定し、そして、結晶構造における前記位置の１つ以上のＥＧＦＲのアミノ酸残基との改良された結合特性を有する模倣物候補を選択する、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
模倣物候補が、請求項２０に規定されるようなＥＧＦＲのアンタゴニストの生物学的活性を維持しているか、又は獲得している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
模倣物候補が、抗体又はその断片であり、
修飾が、抗体又はその断片の少なくとも１つのＣＤＲ領域の中で少なくとも１つのアミノ酸の置換によって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）の模倣物であり、
（ｉ） ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ） ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ） ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ） ＥＧＦＲの位置４４８と４６４との間のシークエンストラックの少なくとも３個のアミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する、化合物。
【請求項２５】
ＥＧＦＲの位置４５４及び４５９の間のシークエンストラックの少なくとも３個のアミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
少なくともＥＧＦＲの以下の残基と結合するか、又は相互作用する、請求項２４に記載の化合物：
Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464。
【請求項２７】
少なくともＥＧＦＲの以下の残基と結合するか、又は相互作用する、請求項２４に記載の化合物：
Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458及びThr459。
【請求項２８】
少なくとも請求項２７の化合物、及び、
（ｉ） ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
（ｉｉ） ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
（ｉｉｉ） ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
（ｉｖ） ＥＧＦＲの以下のアミノ酸残基、又は、少なくとも４個のアミノ酸のサブセットと結合するか、又は相互作用する、第２の化合物を含む、化合物の組成物：
Gln 384、Gln 408、Ser 418、Ser 440、Lys 465、Ser 468、及び、Asn 469。
【請求項２９】
第２の化合物が、少なくとも同じＥＧＦＲのアミノ酸残基と結合するか、又は相互作用する、セツキシマブ又はセツキシマブ模倣化合物である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
・ＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、
・ＥＧＦ受容体の二量化を阻害し、
・ＥＧＦ受容体へのＥＧＦの結合をブロックし、そして、
・マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する、
抗ＥＧＦＲ抗体を設計する方法であって、
（ｉ） 少なくともマツズマブの重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ領域中の、又は、ＣＤＲに隣接したフレームワーク領域（ＦＲ）中の、１個のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換し、
（ｉｉ） 修飾されたマツズマブのＦａｂ断片及びＥＧＦＲの可溶細胞外ドメインＩＩＩ（ｓＥＧＦＲｄ３）によって形成される結晶複合体を調製し、
（ｉｉｉ） ＥＧＦＲドメイン中の特定のアミノ酸残基の位置に対する上記のように形成される結晶複合体の原子座標を、ｓＥＧＦＲｄ３と一緒に非修飾のマツズマブによって形成される参照用の結晶複合体の対応する座標と比較し、
（ｉｖ） ＥＧＦＲドメインにおける前記特定のアミノ酸残基の位置に対してより密接な相互作用をとらせる原子座標を有する修飾されたマツズマブを選択し、
（ｖ） 標準方法によってその結合親和性及び生物学的活性をアッセイし、そして、
（ｖｉ） 工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返しても良い、方法。
【請求項３１】
前記それぞれの結晶複合体を得るための方法であって、
前記それぞれの抗体全体のパパイン開裂によって生じた、修飾された又は非修飾のマツズマブのＦａｂ断片を、
１ＭのＮａＣｌ、１６％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭのＭＥＳを含み、ｐＨが６．０〜７．０である、ＥＧＦＲ可溶細胞外ドメイン（ｓＥＧＦＲ）のバッファー溶液と混合し、
約２０℃で、同じバッファーを含む貯蔵器で平衡にして、
バッファー溶液が、沈降剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＥＧＦＲドメインに中の特異的アミノ酸残基の位置の少なくとも４個が、
Ser433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＧＦＲドメインの中の特異的アミノ酸残基の位置の少なくとも４個が、
Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463及びThr464からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＥＧＦＲドメインの中の特異的アミノ酸残基の位置が、少なくとも以下からなる群から選択される請求項３０に記載の方法：
(a1) Lys454
(a2) Lys454 及びLys455
(a3) Lys454及びLys455及びPhe457
(a4) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458
(a5) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459
(a6) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460
(a7) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461
(a8) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463
(a9) Lys454及びLys455及びPhe457及びGly458及びThr459及び
Ser460及びGly461及びLys463及びThr464
(a10) Phe457
(a11) Phe457及びLys454
(a12) Phe457及びLys454及びGly458
(a13) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459
(a14) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460
(a15) Phe457及びLys454及びGly458及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a16) Thr459
(a17) Thr459及びLys454
(a18) Thr459及びLys454及びPhe457
(a19) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458
(a20) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460
(a21) Thr459及びLys454及びPhe457及びGly458及びSer460及び
Gly461
(a22) Ser460及びLys454
(a23) Ser460及びLys454及びPhe457
(a24) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459
(a25) Ser460及びLys454及びPhe457及びThr459及びGly461
(a26) Lys454及びPhe457
(a27) Lys454及びPhe457及びSer460
(a28) Lys454及びPhe457及びGly461
(a29) Lys454及びPhe457及びThr459
(a30) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a31) Lys454及びPhe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a32) Phe457及びSer460
(a33) Phe457及びThr459及びSer460
(a34) Phe457及びThr459及びSer460及びGly461
(a35) Ala448
(a36) Ala448及びAsn449
(a37) Ala448及びLys454
(a38) Ala448及びLys454及びPhe457
(a39) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459
(a40) Ala448及びLys454及びPhe457及びSer460
(a41) Ala448及びLys454及びPhe457及びGly461
(a42) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a43) Ala448及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a44) Asn449
(a45) Asn449及びLys454
(a46) Asn449及びLys454及びPhe457
(a47) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459
(a48) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460
(a49) Asn449及びLys454及びPhe457及びThr459及びSer460及び
Gly461
(a50) Asn449及びLys454及びPhe457及びSer460
(a51) Ser433及びAsp433を含む選択肢(a1)−(a50)のいずれか。
【請求項３５】
修飾されたマツズマブのＦａｂ及びｓＥＧＦＲｄ３によって形成される結晶複合体の原子座標において、
相互作用又は結合に関与するアミノ酸残基の間の原子距離が、
非修飾の、又は、修飾が少ないマツズマブによって形成される参照用の結晶複合体の原子座標によって与えられるそれぞれの距離より小さくなるようにした、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
原子座標によって与えられるそれぞれの距離が、４Å未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
原子座標によって与えられるそれぞれの距離が、３Å未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
原子座標によって与えられるそれぞれの距離が、２Å未満である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
置換が、マツズマブの重鎖のＣＤＲ又はＦＲで行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
置換が、マツズマブの重鎖又は軽鎖のＣＤＲ３で行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３０又は３４の方法によって得られる抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項４２】
患者に、請求項２４の化合物、又は、請求項２８の組成物、又は、請求項４１の抗体を投与することを含むＥＧＦＲの阻害によって、ＥＧＦＲ関連疾病又は疾患を治療する方法。
【請求項４３】
ＥＧＦＲ関連疾病又は疾患が癌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する抗ＥＧＦＲ抗体を設計及び製造するためのＥＧＦＲ抗体結晶複合体中のSer433、Asp434、Ala448、Asn449、Asn452、Trp453、Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460、Gly461、Lys463、Thr464及びIle466から選択される少なくとも３個のアミノ酸残基の使用。
【請求項４５】
マツズマブ（ＥＭＤ ７２０００）に由来する抗ＥＧＦＲ抗体を設計及び製造するためのＥＧＦＲ抗体結晶複合体中のアミノ酸残基Lys454、Lys455、Leu456、Phe457、Gly458、Thr459、Ser460及びGly461の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５４０５７８（Ｐ２０１０−５４０５７８Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２７３４８（Ｐ２０１０−５２７３４８）
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００７８８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４３４９０
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【出願人】（５１００９０６８９）ザ トラスティーズ オヴ ザ ユニヴァーシティー オヴ ペンシルバニア (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００７８８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４３４９０
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【出願人】（５１００９０６８９）ザ トラスティーズ オヴ ザ ユニヴァーシティー オヴ ペンシルバニア (1)
【Ｆターム（参考）】
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