総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【課題】テトラゾリウム塩を用いた液状のＢＣＡＡ測定試薬において、試薬の「高精度性」と「安定性」を両立すること。初回の測定のみキャリブレーションを行えば、その後の測定ではキャリブレーションを行わなくても、生体試料中の特定成分の測定値が長期に渡って安定化する方法を提供すること。
【解決手段】還元型色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなる総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。好ましくは、第一試液がｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上である。
【解決手段】還元型色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなる総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。好ましくは、第一試液がｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液などの生体に由来する試料中に存在する総分岐鎖アミノ酸（以下、ＢＣＡＡ）測定用の試薬に関する。さらに詳しくは、下記（１）〜（４）を達成することにより、液状で長期間安定であり、かつ高精度な測定が可能なＢＣＡＡ測定用試薬を提供するものである。
（１）液状試薬中での保存中の還元系色素の非特異的発色を抑制する。
（２）高精度測定が可能である。
（３）生体試料中のアスコルビン酸や乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨ）の影響を回避する。
（４）還元系色素と生体試料中の蛋白質の影響を回避する。
【背景技術】
【０００２】
病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化のため凍結乾燥品の形態で流通し、使用時に溶解液で溶解して使用するのが主流となっている。慢性肝炎から肝硬変への移行診断に用いられる、ＢＴＲ測定用試薬（総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定試薬）は、ＢＣＡＡ測定試薬とＴＹＲ（チロシン）測定試薬がセットになっており、ＢＴＲ測定用試薬も各々酵素、色素などが不安定であり凍結乾燥品の形態で流通している。なお、総分岐鎖アミノ酸とはＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンのことを指す。
一方、臨床検査施設では、多項目を測定し検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になることが多く、使用時に試薬の調製が不要な溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。ＢＴＲ測定用試薬に関しても同様であり溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。
【０００３】
酵素的分析法を用いた生体試料中に含まれる種々の特定成分を定量する方法の一つとして、例えば、酸化還元反応を用いる方法が知られている。すなわち、電子受容体の存在下で、該特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することにより、試料中の特定成分を間接的に定量する方法である。
【０００４】
特に、定量しようとする特定成分が微量成分であるような場合は、より高感度に測定するために、上記生成された電子受容体の還元体を、より発色感度の高い発色剤を用いて検出、定量することも行なわれている。例えば、電子受容体としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを用いた場合、その還元体であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに、ジアホラーゼ等の電子キャリアーと還元系色素であるテトラゾリウムまたは、その化合物を作用させてホルマザンを形成させることにより検出、定量することが行なわれている。
【０００５】
ＢＴＲ測定方法に用いられるＢＴＲ測定用試薬においては、慢性肝炎から肝硬変への移行期に血中ＢＣＡＡ濃度が低下することから、診断上低値での精度が必要であり、高感度・高精度測定が要求される。そのため、これまでに流通しているＢＴＲ測定試薬の、ＢＣＡＡ測定試薬は該酸化還元反応を用いて測定が行われている。
【０００６】
該ＢＣＡＡ試薬は、高感度発色剤として３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下、ＭＴＴ）が用いられている。ＭＴＴを用いる該ＢＣＡＡ試薬をはじめとして、これまでに販売されてきた還元系色素を用いた臨床検査試薬においては、生成するホルマザンが難溶性であり、分析機のセルに吸着し、測定に影響を与えることが問題となっていた。
【０００７】
そこで、最近では水溶性の高いホルマザンを生成するテトラゾリウム塩が開発され、それを臨床検査試薬に適応する商品が販売されるようになってきている。
【０００８】
還元系色素であるテトラゾリウムまたはその化合物を用いた測定法に関する先行技術としては、例えば以下の特許文献１〜９がある。
特許文献１には、本願請求項３の一般式（１）に含有される化合物について開示されている。
特許文献２には、本願請求項３の一般式（１）に含有される化合物を用いた活性酸素の測定法について開示されている。
特許文献３には、テトラゾリウム化合物を予め前処理液に添加しておくことで生体試料中の還元物質の影響を回避すること、テトラゾリウム化合物は生体試料中の還元物質の影響を回避する目的に利用することが開示されている。
特許文献４には、テトラゾリウムから生じるホルマザンを予め前処理液に添加しておくことで生体試料中の還元物質の影響を回避することが開示されている。
これら、特許文献３および４は、テトラゾリウム塩を生体試料の前処理目的で使用するものであり、生体試料中の特定成分の発色定量用途に用いる本発明とは明らかに異なっている。
特許文献５には、テトラゾリウム塩をｐＨ８．５〜１１．０（好ましくは９．５〜１０．５）の範囲で被検試料と接触させて使用することが開示されている。
特許文献６には、実施例にｐＨが記されており、実施例中にあるようにテトラゾリウム塩を含む試薬のｐＨをｐＨ１０．０とすることが開示されている。
特許文献５、６においては、テトラゾリウム塩を含有する試薬のｐＨがｐＨ８．５以上であり、該ｐＨ溶液中でテトラゾリウム塩を保存した場合、保存中にテトラゾリウム塩の経日的な非特異的発色が顕著になることを本発明者らは確認している。
特許文献７および８には、テトラゾリウム塩を用いた乾式試薬について開示されているが、液状試薬におけるテトラゾリウム塩の安定性についえては言及されていない。また、実施形態についても乾式試薬であり、本発明の液状試薬とは明らかに異なっている。
特許文献９には、テトラゾリウム塩を用いた測定系において、試薬にアルブミンを添加することでヘモグロビンを含有する生体試料の影響を回避する方法について開示されている。
これら何れの文献においても、テトラゾリウム塩の液状試薬中での保存中の非特異的発色については、記載されていない。
【特許文献１】特許第２５９２４３６号公報
【特許文献２】特許第３６０２９５６号公報
【特許文献３】特開２０００−２１０１００号公報
【特許文献４】再公表ＷＯ２００３／０３３７３０号公報
【特許文献５】特許第２７９６１５０号公報
【特許文献６】特開２０００−３００２９３号公報
【特許文献７】特開２０００−９３１９８号公報
【特許文献８】特開２０００−９３１９９号公報
【特許文献９】特開２００４−６１２６３号公報
【０００９】
また、総分岐鎖アミノ酸測定に関する先行技術としては、例えば以下の特許文献１０がある。特許文献１０には、ＢＣＡＡ測定試薬、ＴＹＲ試薬からなる、ＢＴＲ測定試薬を凍結乾燥品として提供することが開示されている。
【特許文献１０】特許第１９６４６７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、液状で長期間安定であり、かつ高精度な測定が可能なＢＣＡＡ測定用試薬を提供することにある。
【００１１】
還元系色素であるテトラゾリウム塩を用いる液状の臨床検査試薬においては、酵素の液状での安定性以外に、以下の２点が大きな問題となっている。
（１）保存中に経日的に試薬ブランクが上昇する。
（２）生体試料中の成分の影響を受け易い。
（１）においては、吸光度測定における、感度低下、測定レンジ上限の低下等の問題が生じるため、測定に際し、毎回標準物質を測定し検量線を引き（以下キャリブレーションと言う）、非特異的に発色した色素の吸光量を差し引いておく必要性が生じる。また、測定感度が低下することにより生体試料中に微量しか存在しない測定対象物については、測定が困難になる。
（２）においては、テトラゾリウム塩を用いる酸化還元反応測定系では、特に、アスコルビン酸やグルタチオン、蛋白などの還元物質や、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などの酸化還元酵素の影響を受けることが大きな問題となっている。
【００１２】
また、テトラゾリウム塩を高感度に使用するためには、ｐＨをアルカリ性側にしておくことが知られているが、高感度で使用するために保存溶液のｐＨをアルカリ性側に設定した場合、経日的なブランク上昇がより顕著になることを本発明者らは見出した。
【００１３】
さらに、高感度に測定するために反応ｐＨをアルカリ性側にした場合、測定する生体試料中に乳酸が多く含まれる場合は、ＬＤＨの乳酸からピルビン酸への反応活性が促進されるため、テトラゾリウム塩を用いた酸化還元反応に影響を与えることが問題となる。
【００１４】
すなわち、本発明が解決しようとする課題は、テトラゾリウム塩を用いた液状のＢＣＡＡ測定試薬において、試薬の「高精度性」と「安定性」を両立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
［項１］
還元型色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項２］
第一試液がｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上であることを特徴とする、項１記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項３］
還元系色素が、一般式（１）で表される還元系色素である、項１または２に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【化３】
［一般式（１）］
（式中、Ｒ１は水素、ニトロ基、または、メトキシ基、Ｒ２は水素またはニトロ基、Ｒ３はハロゲン、ニトロ基または、以下の式（２）で表されるアゾ化合物、Ｒ４は水素またはスルホ基、Ｒ５は水素または、スルホ基、Ｒ６は水素、ニトロ基、またはスルホ基、Ｒ７は水素または、スルホ基を示す。）
【化４】
［式（２）］
［項４］
還元系色素を含む第一試液に、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する項１〜３のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項５］
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体を含有する項１〜４のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項６］
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体およびアスコルビン酸オキシダーゼを含有する項１〜５のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【００１６】
本発明において「高精度性」とは、生体試料中に含まれる測定対象物の濃度が低濃度、例えば２ｍＭ以下の測定対象物の測定において、既知濃度の測定値の変動幅が、±２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の測定が可能であることを意味する。
【００１７】
本発明において「安定性」とは、測定の初回のみ、下記に記載の方法で検量線を引き値を校正（キャリブレーション）しておけば、その後の測定ではキャリブレーションを行わなくても、生体試料中の特定成分の測定値が長期に渡って安定化することを意味する。より厳密には１０℃以下の開封保存状態において、２週間中および２週間後の測定値が理論値の９０％、好ましくは９５％を下回らないことを意味する。
【００１８】
本発明において「反応時」とは、「還元系色素が酵素特異的に発色反応に導かれる際」を意味し、「第一試薬と第二試薬の混合時」と同義で用いている。
【００１９】
検量線での校正方法（キャリブレーション方法）
［１］精製水あるいは、生理食塩水と、
［２］１水準以上の濃度の標準物質または、標準溶液により行うのが好ましい。
【００２０】
キャリブレーション方法としては、直線法、スプライン法などいずにも限定されないが、特に直線法が好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の目的は、還元系色素であるテトラゾリウム塩を用いた液状のＢＣＡＡ測定試薬において、試薬の「高精度性」と「安定性」を両立することである。具体的には、テトラゾリウム塩を用いた液状の臨床検査試薬において、生体試料中に含まれる測定対象物の濃度が２ｍＭ以下の測定対象物の測定において、既知濃度の測定値の変動幅が、±２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の測定が可能である。さらに液状保存中の還元系色素の非特異的発色を抑制すること、及び非特異的発色が抑制された試薬による生体試料中のＢＣＡＡの測定において、生体試料中のタンパク質、アスコルビン酸、グルタチオンなどの還元物質の影響および、生体試料中のＬＤＨなどの酸化還元酵素の影響を回避することによって、生体試料中のＢＣＡＡの測定値が長期に渡って安定化する測定法、およびその試薬を提供することである。
【００２２】
さらに、本発明方法を用いれば、初回の測定のみキャリブレーションを行えば、その後の測定ではキャリブレーションを行わなくても、生体試料中のＢＣＡＡの測定値が長期に渡って安定化する。
【００２３】
還元系色素の非特異的発色を抑制し、かつ生体試料中の成分の影響を回避することにより、初回の測定のみキャリブレーションを行えば、その後キャリブレーションすることなく長期に渡って、生体試料中のＢＣＡＡの測定値を安定化させることが可能となる。
【００２４】
また、本発明においては、ノンキャリブレーション測定において測定値を安定化させるために、試薬ブランクの上昇度と感度の関係が重要になってくる。
本発明においては、保存による試薬ブランクの吸光度上昇による誤差を許容できる感度を有することが好ましい。より具体的には、保存によるブランク上昇度が、感度に対して１０％以内であることが好ましい。
【００２５】
本特許中に記載の「試薬」と「試液」は同義で用いている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、２ないし４のパーツで構成される液状試薬を用いて生体試料中のＢＣＡＡを定量する方法であって、電子受容体の存在下で該ＢＣＡＡに対して脱水素による酸化能を有するロイシンデヒドロゲナーゼを生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を、さらに電子キャリアーと還元系色素であるテトラゾリウム塩を作用させてホルマザンを形成させることにより検出・定量する方法であって、２試薬で構成される場合、還元系色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなることを特徴とする。
【００２７】
さらに、本発明は、還元系色素の保存中の非特異的発色を抑制するために、還元系色素を含有する第一試液のｐＨをｐＨ６．０〜８．０にし、かつ還元系色素を高感度に使用するため、およびロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるために、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上であることが好ましい。
【００２８】
本発明の実施の形態としては、ＢＣＡＡ測定用試薬については測定方法として、［１］ＢＣＡＡに酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型ＮＡＤにより還元系発色試薬を還元し発色に導く方法、［２］ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法がある。
【００２９】
特に式（３）で表される反応を用いる方法が好ましい。
【数１】
［式（３）］
【００３０】
式（３）では、ＢＣＡＡ測定試薬の測定方法として、ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法を例示されている（ジアホラーゼの代わりに電子キャリアーを用いても良い）。
【００３１】
なお、ジアホラーゼは、本発明においては電子キャリアーに包含される。
【００３２】
なお、本明細書においては、「電子伝達体」と「電子キャリアー」は同義である。
【００３３】
本発明の生体試料中のＢＣＡＡを定量する方法に用いられる液状試薬は、汎用自動分析装置で取り扱える試薬構成であれば、特に限定されないが、２ないし４のパーツで構成されることが望ましい。好ましくは２つのパーツで構成される２試薬系がよい。
また、試薬の状態としては、凍結乾燥試薬（液状で不安定な酵素などを凍結乾燥しておき、使用時に溶解液と混合して用いる試薬）、ドライケミストリー試薬（分析に必要な全ての試薬が乾燥状態で用意されている試薬）、液状試薬が好適に用いられるが、特に液状試薬であることが好ましい。
すなわち、２ないし４のパーツで構成される液状試薬であることが好ましい。好ましくは２つのパーツで構成される液状試薬がよい。
【００３４】
測定対象物である生体試料としては、特に限定されないが、血清あるいは血漿もしくは、全血あるいは、尿であることが好ましい。
【００３５】
本発明で用いられる酵素は、測定対象となるＢＣＡＡ又は該ＢＣＡＡから別の反応により派生した物質に対して、電子受容体の存在下で、脱水素による酸化能を有する酵素（以下、脱水素酵素という。）であればよい。すなわち、ＢＣＡＡに直接作用する酵素に限定されず、酵素共役系等によりＢＣＡＡから定量的に派生した物質に対する脱水素酵素も用いることができる。例えば、ＢＣＡＡに直接作用するロイシンデヒドロゲナーゼが用いられる。ロイシンデヒドロゲナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＳＰ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが、東洋紡社、ユニチカ社より入手できる。本発明試薬における、ロイシンデヒドロゲナーゼの添加配置は、第二試液である。
本発明で用いられる酵素濃度としては、好ましくは、反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、さらには０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられることがより好ましい。
【００３６】
また、電子受容体としては、生成された電子受容体の還元体を直接定量できるもの、あるいは該還元体を、発色剤を用いて比色定量できるものであれば、特に制限なく用いることができる。電子受容体であるＮＡＤ、ＮＡＤＰ等の補酵素にテトラゾリウムおよびその化合物や、フェナジンメトサルフェート類、ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等の電子キャリアーを作用させて生じるホルマザンを比色定量することが好ましい。
具体的には、ニコチンアミド補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ：還元型、ＮＡＤ：酸化型、以下同様）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェイト、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、あるいはニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイト等が具体的に挙げられる。また、チオニコチンアミド補酵素としては、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（チオＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、あるいはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイト、ニコチンアミド１，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミド１，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチドホスフェイト、ピロロキノリンキノンおよび、フラビン化合物であるＦＡＤ、ＦＭＮ等が挙げられる。
本発明試薬における、電子受容体の添加配置は、特に限定されないが、第一試液であることがより好ましい。
本発明で用いられる電子受容体としては、好ましくは、反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらには０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることがより好ましい。
【００３７】
本発明で使用する、還元系色素は、還元されることにより発色する色素である。本発明においては、還元系色素としてテトラゾリウムおよびその化合物を使用する。
テトラゾリウムおよびその化合物は、その主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の結合が開裂することにより、ホルマザンへと導かれ、その際に生じる励起波長により発色する。
【００３８】
非特異的発色における発色機構も同様であるが、本発明により、還元系色素を含有する試薬のｐＨをｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．５にすることにより、テトラゾリウムおよびその化合物の主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の非特異的開裂を抑制し、それにより経時的な非特異的発色の抑制の程度を強めることが可能となる。
【００３９】
本発明で使用するテトラゾリウムおよびその化合物としては、例えば、２−（２’ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）テトラゾリウム（ＢＳＰＴ）、２−ベンゾチアゾリル−（２）−３，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＢＴＤＰ）、２，３−ジ（４−ニトロフェニル）テトラゾリウム（ＤＮＰ）、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム（ＤＰＳＰ）、ジスチリルニトロブルーテトラゾリウム（ＤＳＮＢＴ）、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル（−２Ｈテトラゾリウム（ＮＢＴ）、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム（ＭＴＴ）、２−フェニル−３−（４−カルボキシフェニル）−５−メチルテトラゾリウム（ＰＣＰＭ）、テトラゾリウムブルー（ＴＢ）、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウム（ＴＣＮＢＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、テトラゾリウムバイオレット（ＴＶ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、３，３‘−［３，３’−ジメトキシ−（１，１‘−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３，３‘−［３，３’−ジメトキシ−（１，１‘−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム クロライド］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム クロライド、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、２，２‘−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］ −３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４‘−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム ブロマイド、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム クロライド、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム オダイド、２，３，５−トリス（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−クロロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−フルオロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−メチルフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−クロロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−エチルフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−フルオロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−メトキシフェニル）−５−（４−シアノフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−メトキシフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−メチルフェニル）−５−（４−シアノフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジ（ｐ−トリル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−メチルフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−アミノテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−カーボキシテトラゾリウム クロライド、２，５−ジ（ｐ−トリル）−３−フェニルテトラゾリウム クロライド、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム ブロマイド、２−（４−アイドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２−フェニル−３−（４−ビフェニリル）−５−メチルテトラゾリウム クロライド、３，３’−（３，３‘−ジメトキシ−４，４−ジフェニレン）ビス（２−フェニル−５−ベラトリテトラゾリウム クロライド）、３−（３−ニトロフェニル）−５−メチル−２−フェニルテトラゾリウム クロライド、３−（４−ニトロフェニル）−５−メチル−２−フェニルテトラゾリウム クロライド、ｍ−トリテトラゾリウムレッド、ネオ−テトリテトラゾリウム クロライド、ニトロブルーテトラゾリウム、Ｏ−トリテトラゾリウムレッド、ｐ−トリテトラゾリウムレッド等が挙げられるが、特に水溶性ホルマザンを生成する以下のテトラゾリウムおよび、その化合物の適応が好ましい。
すなわち、本発明に用いられるテトラゾリウムおよびその化合物は、２−ベンゾチアゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルフォエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、ジナトリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロ、２−メトキシフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩であることが好ましい。
これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
【００４０】
本発明における、還元系色素の使用用途は発色定量用途であり、生体試料中の還元物質の影響回避のために前処理液等に添加して用いるものではない。
【００４１】
本発明における還元系色素の添加配置は、第一試液である。
【００４２】
本発明に用いられるジアホラーゼは起源として、例えばバチルス・メガテリウム、クロストリジウム・ＳＰが挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
【００４３】
本発明に用いられる還元型ＮＡＤオキシダーゼは反応液中に、０．５〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍＬの濃度で用いられることが好ましい。
【００４４】
本発明に用いられる緩衝剤としては、非特異発色の要因となりうるアミン類などが不純物として含まないものであれば特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。中でもＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤は還元系色素の非特異発色をより低減することから好適である。
該緩衝剤のｐＨは５〜１０の範囲で調整されるが、還元系色素を含有する試薬のｐＨをｐＨ５．５〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜８．０にすることが、還元系色素の非特異的発色抑制において好ましい。
還元系色素の発色の原理は、テトラゾリウムおよびその化合物の主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の結合が開裂することにより、ホルマザンへと導かれ、その際に生じる励起波長により発色するという原理である。
非特異的発色における発色機構も同様であるが、本発明により、還元系色素を含有する試薬のｐＨをｐＨ８．０未満、好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．５にすることにより、テトラゾリウムおよびその化合物の主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の非特異的開裂を抑制し、それにより経時的な非特異的発色を抑制することが可能となる。
【００４５】
本発明で用いられる界面活性剤としては、脂肪酸塩、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸トリエタノールアミン、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルベタインであることが好適である。
【００４６】
ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン（登録商標）１０４Ｐ、エマルゲン（登録商標）１０５、エマルゲン（登録商標）１０６、エマルゲン（登録商標）１０８、エマルゲン（登録商標）１０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）１２０、エマルゲン（登録商標）１２３Ｐ、エマルゲン（登録商標）１４７、エマルゲン（登録商標）１３０Ｋ、ノニオン（登録商標）Ｋ−２０４、ノニオン（登録商標）Ｋ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｋ−２２０、ノニオン（登録商標）Ｋ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）２１０、エマルゲン（登録商標）２２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオン（登録商標）Ｐ−２０８、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１０、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）３０６Ｐ、エマルゲン（登録商標）３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２０、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０７、ノニオン（登録商標）Ｓ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｓ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）４０４、エマルゲン（登録商標）４０８、エマルゲン（登録商標）４０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）４２０、エマルゲン（登録商標）４３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−５０、ノニオン（登録商標）Ｅ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｅ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｅ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００４７】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）７０７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−９、アデカトール（登録商標）ＳＯ−８０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１０５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１２０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１３５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１４５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１６０、エマルゲン（登録商標）７０５、エマルゲン（登録商標）７０７、エマルゲン（登録商標）７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）８１０、エマルゲン（登録商標）８４０Ｓ、エマルゲン（登録商標）９０９、エマルゲン（登録商標）９１０、エマルゲン（登録商標）９３０、エマルゲン（登録商標）９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲン（登録商標）Ａ６０、エマルゲン（登録商標）Ａ９０、エマルゲン（登録商標）Ｂ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−１５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２３０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２０７、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１２、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１５、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドール（登録商標）（登録商標）ＴＷ−Ｌ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｌ１０６、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｐ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｓ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｏ１２０、レオドール（登録商標）４６０、エマノーン（登録商標）１１１２、エマノーン（登録商標）３１１５、エマノーン（登録商標）３１７０、エマノーン（登録商標）３２９９、エマノーン（登録商標）３１３０
【００４８】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００４９】
さらにアルキルベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール（登録商標）（登録商標）２０ＢＳ、アンヒトール（登録商標）２４Ｂ、アンヒトール（登録商標）８６Ｂ、アンヒトール（登録商標）２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００５０】
界面活性剤の濃度としては、特に規定はしないが、特異的あるいは非特異的に生じたホルマザンと試料中の蛋白質との作用による吸光度の低下を抑制するために、還元系色素を含有する試薬において界面活性剤を０．０１重量％以上、好ましくは０．０５重量％以上さらに好ましくは、０．１重量％以上添加することが好ましい。
【００５１】
また、界面活性剤のうち特にＨＬＢ値が８．８〜１９．１さらに好ましくは、１１．０〜１９．１の範囲であり、かつ分子量が１６７〜１２００であり、さらにその構造中に炭素分子を１２個以上、水素原子を２３個以上含有するものが好ましい。
【００５２】
本発明に用いられる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００５３】
本発明に用いられる安定化剤としては、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼなどがある。中でもエチレンジアミン四酢酸塩が好適であり、反応液中で０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。
また、色素の安定化剤として、硫酸カリクスアレン（６）、硫酸カリクスアレン（８）等のカリクスアレン誘導体、およびＧ１αＣＤ、Ｇ２αＣＤ、Ｇ１βＣＤ、Ｇ２βＣＤ等のデキストリン類を使用する場合、非特異的発色抑制のために、還元系色素を含有する試薬とは別配置に添加することが好ましい。
【００５４】
生体試料中のアスコルビン酸の影響回避のために、本発明で使用するアスコルビン酸オキシダーゼの起源としては、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐ．やＣｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐ．およびＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．が挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む試薬のｐＨとしては、酵素の安定性、活性を考慮し、ｐＨ６．０〜８．０であることが好ましい。すなわち本発明においては、テトラゾリウム塩を含む第一試薬に含有させることが好ましい。
【００５５】
生体試料中のＬＤＨの影響低減および回避剤としては、シュウ酸、オキサミド酸および、各々の塩や、ヨウ素、銀、水銀および各々のイオン、ｐ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨより生成する物質などが挙げられる。反応液中、０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上の濃度で用いられることが好ましい。
【００５６】
本発明における試薬キットの様態としては、例えば以下が考えられるが、これらに限定されるものではない。
キット１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素を含有する試薬
キット２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアーを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子キャリアーを含有する試薬
キット４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子受容体を含有する試薬
キット５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含有する試薬
キット９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
キット１０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、生体試料の特定成分のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット１１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子キャリアーを含有する試薬
キット１２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子受容体を含有する試薬
キット１３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット１４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含含有する試薬
キット１５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット１６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含有する試薬
キット１７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
キット１８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット１９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアーを含有する試薬
キット２０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体を含有する試薬
キット２１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬を含有する試薬
キット２２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット２３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット２４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含む試薬を含有する試薬
キット２５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上となるように調整された緩衝剤を含む試薬
キット２６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試液
第二試薬
ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット２７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水酵素を含有する試薬
第二試液
電子キャリアーを含有する試薬
キット２８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
電子受容体を含有する試薬
キット２９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬を含有する試薬
キット３０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット３２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含む試薬を含有する試薬
キット３３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
キット３４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアーを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、キャリアーを含有する試薬
キット３６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体を含有する試薬
キット３７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬を含有する試薬
キット３８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット４０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含む試薬を含有する試薬
【００５７】
本発明の還元系色素を含む溶液は、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の形態で提供することができるが、これらの容器を遮光することがより望ましい。
【００５８】
本発明における検量線での校正方法（キャリブレーション方法）は特に限定されないが、［１］精製水あるいは、生理食塩水と、
［２］１水準以上の濃度の標準物質または、標準溶液により行うのが好ましい。
【００５９】
キャリブレーション方法としては、直線法、スプライン法などいずにも限定されないが、特に直線法が好ましい。
【００６０】
また、分析方法としては、以下の方法に限定されるものではないが、以下の［１］、［２］、［３］、のいずれかであることが好ましい。
［１］１ポイント法；試薬を添加し、一定時間後の吸光度を測定するエンドポイント法
［２］２ポイント法；測光ポイントを変えて２回測定し、差の吸光度を求めるエンドポイント法
［３］レート法；指定された測光ポイント間の単位時間あたりの吸光度変化を求める方法
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
本実施例で用いる酵素としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ロイシンデヒドロゲナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＳＰ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが、東洋紡社、ユニチカ社より入手できる。ジアホラーゼとしては、起源として、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＳＰ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓがあげられ、東洋紡社、ユニチカ社より入手できる。また、本発明では生体試料中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼを含有してよく、Ｃｕｃｕｍｉｓ ＳＰやＣｕｃｕｒｉｂｉｔａ ＳＰ由来のものが、東洋紡社、ロシュ社、旭化成社より入手できる。
【００６２】
［実施例１〜６、および、比較例１〜６］還元系色素の配置と非特異的発色による試薬ブランクの上昇度の関係（表１、図１）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した（比較例６のみ１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）測定試薬）。
【００６３】
（実施例１）反応ｐＨ７．５
第一試薬（ｐＨ６．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） ２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６４】
（実施例２）反応ｐＨ７．７５
第一試薬（ｐＨ６．５）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６５】
（実施例３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６６】
（実施例４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） ２５ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６７】
（実施例５）反応ｐＨ８．３
第一試薬（ｐＨ７．５）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６８】
（実施例６）反応ｐＨ８．５
第一試薬（ｐＨ８．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６９】
（比較例１）反応ｐＨ８．２
第一試薬（ｐＨ８．２）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．２）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
【００７０】
（比較例２）反応ｐＨ７．６
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．２）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７１】
（比較例３）反応ｐＨ７．８
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．５）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７２】
（比較例４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ（同仁化学株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ（同仁化学株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７３】
（比較例５）反応ｐＨ８．３
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ（同仁化学株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．５）
ＣＨＥＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ（同仁化学株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７４】
（比較例６）反応ｐＨ８．１
第一試薬（ｐＨ６．８）
緩衝液
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ ３Ｕ／ｍＬ
ジアホラーゼ ９Ｕ／ｍＬ
アデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ） ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
酸化型ＮＡＤＰ＋ ９．２ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．７）
緩衝液
ＡＧ−６−リン酸デヒドロゲナーゼ ８０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７５】
実施例１〜６、比較例１〜５のＢＣＡＡ測定用試薬および、比較例６の１，５ＡＧ測定試薬を３５℃、７日間保存し、調製直後の各試薬との試薬ブランクの差を検討した。
【００７６】
実施例１〜６、比較例１〜５のＢＣＡＡ測定試薬、比較例６の１，５ＡＧ試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について、下記の測定法にて試料として精製水を繰返しｎ＝３で測定し、その平均値より試薬ブランクを求めた。
【００７７】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬ（比較例６のみ２．０μＬ）に第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、実施例１〜６および比較例１〜６試薬全て主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
還元系色素の配置と非特異的発色による試薬ブランクの上昇度の関係を、表１および図１に示す。
還元系色素が第一試液に含まれる実施例１〜６では試薬ブランクの上昇が１８ｍＡＢＳ以下であったのに対し、還元系色素が第二試液に含まれる比較例１〜６では４０ｍＡＢＳ以上であった。（特に、実施例３と比較例４では、第一試液、第二試液のｐＨが同じ条件で比較している。）
【００８０】
［実施例７〜１４、および、比較例７、８］第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨと感度の関係（表２、図２）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
【００８１】
（実施例７）反応ｐＨ７．５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） ２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８２】
（実施例８）反応ｐＨ７．６
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．５）
ＴＡＰＳ緩衝液 １６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８３】
（実施例９）反応ｐＨ７．７５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８４】
（実施例１０）反応ｐＨ７．９
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） ２５ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５４ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８５】
（実施例１１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８６】
（実施例１２）反応ｐＨ８．５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．５）
ＣＨＥＳ緩衝液 １４１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８７】
（実施例１３）反応ｐＨ９．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ１０．０）
ＣＡＰＳＯ緩衝液 １３３ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８８】
（実施例１４）反応ｐＨ９．５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ１０．０）
ＣＡＰＳＯ緩衝液 １１８ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８９】
（比較例７）反応ｐＨ７．２５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ７．５）
ＴＥＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００９０】
（比較例８）反応ｐＨ７．４
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５４ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００９１】
実施例７〜１４、比較例７、８のＢＣＡＡ測定用試薬について、試料として標準液と精製水を下記の測定法にて各々繰返しｎ＝２で測定し、その平均値より各試薬の標準液の感度を以下の式より算出した。なお、標準液には、Ｌ−イソロイシン溶液（５００μｍｏｌ／Ｌ）を用いた。
標準液の感度（ｍＡＢＳ）＝標準液の吸光度（ｍＡＢＳ）−試薬ブランクの吸光度（ｍＡＢＳ）
【００９２】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、実施例７〜１４および、比較例６、７試薬全て主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９３】
【表２】
【００９４】
第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨと感度の関係を表２および図２に示す。
第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨが７．５以上である実施例７〜１４では、感度が１５０ｍＡＢＳ以上であったのに対し、第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨが７．５未満である比較例７、８では感度が１４０ｍＡＢＳ程度以下であった。
また、第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨが７．５を越えて高くなるにつれて、感度がより高くなった。
【００９５】
【表３】
【００９６】
次に、「還元系色素の配置」と「第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨ」の組合せに対し、非特異的発色による試薬ブランクの上昇度、感度がどのような値を示すかについて、表３にまとめた。
表３における実施例１〜６および比較例１〜６は、表１のそれと同じである。
表３にはさらに、上記結果から求められる、感度に対する試薬ブランク上昇度の数値を記載した。
【００９７】
［還元系色素の配置について］
本発明において、ノンキャリブレーション測定での高精度かつ安定な測定を実現するためには、保存によるブランク上昇度が、感度に対して１０％以内であることが好ましい。
表３からわかるように、還元系色素が第一試液に配置されている実施例１〜６では、保存によるブランク上昇度が感度に対して１０％以内であるのに対し、還元系色素が第二試液に配置されている比較例１〜６では、感度に対する保存ブランクの上昇度が１８〜７２％と高い。比較例１〜６に代表される様に、３５℃・７日間の保存において、保存ブランクの上昇度が感度に対して１０％を上回る試薬組成においては、ノンキャリブレーション測定においても３５℃・７日保存と同様に経日的にブランク上昇が起こり、保存ブランクの上昇度が許容できなくなる。
【００９８】
［第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨについて］
第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨについては、表２および図２のところで述べたように、ｐＨが７．５を越えて高くなるにつれて、感度がより高くなった。
一方、データの記載はしていないが、反応ｐＨがｐＨ７．５以下、特にｐＨ７．０以下である場合には、還元系色素の感度が下がり、かつ本発明で用いられるロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性が低下し、本発明における（式（３））で表される反応が遅くなる。そのため、測定の安定性、高精度性が損なわれる。
【００９９】
他方、生体試料中には、乳酸またはピルビン酸が含まれているが、さらに乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる場合は、式（４）で表される反応が起こる。特に、ｐＨ８．５〜９．０では乳酸からピルビン酸への反応（以下、Ｌ→Ｐ反応）、ｐＨ７〜８ではピルビン酸から乳酸への反応（以下、Ｐ→Ｌ反応）が促進される。特に、Ｌ→Ｐ反応が、本発明の（式（３））で表される酸化還元反応と競合する。そのため、ロイシンデヒドロゲナーゼの反応性を高め、乳酸デヒドロゲナーゼの反応性を抑制することが重要になる。本発明においては、反応ｐＨがｐＨ７．５以上、好ましくはｐＨ８．０以上で乳酸デヒドロゲナーゼの競合反応を抑制し、本発明の酸化還元反応を高めることができることを確認している。
【０１００】
【数２】
［式（４）］
【０１０１】
さらに、本発明で電子キャリアーとして好適に用いられるジアホラーゼの活性を考慮した場合、反応ｐＨがｐＨ１０以上では著しくジアホラーゼの活性が低下する。
よって、第一試液と第二試液の混合時のｐＨ、つまり反応時のｐＨとしては、ｐＨ７．５以上、より好ましくは、ｐＨ７．５〜ｐＨ１０．０、さらに好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ９．５、さらに好ましくは、ｐＨ８．０〜９．５であることが好ましい。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
さらに、「還元系色素が配置される第一試液のｐＨ」と「第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨ」の組合せに対し、非特異的発色による試薬ブランクの上昇の程度、測定感度、および、ノンキャリブレーション測定での高精度かつ安定な測定が可能かどうかについて、表４にまとめた。
【０１０４】
表４より、還元系色素を含有する第一試液のｐＨがｐＨ６．０〜８．０であり、さらに第一試液とロイシンデヒドロゲナーゼを含有する第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上にすることにより、液状での長期安定性、および高精度測定を両立することが可能となることがわかる。
【０１０５】
この高精度かつ安定な測定を実現するためには、感度を上げる目的で反応時のｐＨをｐＨ７．５以上に設定する必要があるが、還元系色素を含む第一試液のｐＨがｐＨ６．０未満の場合、保存によるブランク上昇は良好であるものの、反応時の感度をｐＨ７．５以上とするために、還元系色素を含有しない試液のｐＨをｐＨ１０〜１１のように高く設定するか、もしくは、ｐＨ８〜１０に設定した場合、緩衝剤濃度を高める必要がある。前者については、含有する酵素の液状での長期保存安定性を下げる可能性があり、また、後者については、イオン強度が増すため、同様に酵素の安定性、反応性を下げる可能性がある。
また、ｐＨ５．５未満では、緩衝能のすぐれたグッドバッファーが存在しないため、長期保存における酵素、色素の安定性が問題となる。
また、本発明で好適に用いられる電子キャリアーとしてジアホラーゼがあるが、該酵素を還元系色素を含有する試液中に保存する場合、ｐＨ６．０未満では、著しく保存安定性が低下する。また、本発明において、生体試料中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で好適に用いられるアスコルビン酸オキシダーゼは、還元系色素を含有する第一試液に添加することが好適であるが、ｐＨ６．０未満においては、液状での保存安定性が著しく低下する。
よって、本発明において、還元系色素の非特異的発色による試薬ブランクの上昇を抑制するためには、還元系色素を含有する第一試薬のｐＨがｐＨ５．５〜８．０、好ましくは、ｐＨ６．０〜８．０であることが好ましい。
【０１０６】
また、還元系色素の添加位置について、第二試液に配置した場合も第一試液に添加した場合と同様に、第二試液のｐＨをｐＨ８．０以下にすれば、還元系色素の非特異的発色によるブランク上昇は抑制されるものの、反応ｐＨをｐＨ７．５以上とするために、第一試液のｐＨを中性以上に設定する必要がある。この場合、第一試液中に含まれるアスコルビン酸オキシダーゼやジアホラーゼの長期保存安定性が低下する。また、第二試液のｐＨをｐＨ８．０以下とすることで、第二試液中のロイシンデヒドロゲナーゼの長期保存安定性の低下や、活性低下が見られるため、還元系色素を第二試液に含有させることは好ましくない。
【０１０７】
以上より、本発明を達成するためには、還元系色素を第一試液に含有し、かつ第一試液のｐＨがｐＨがｐＨ５．５〜８．０、好ましくは、ｐＨ６．０〜８．０であることが必須である。
【０１０８】
［実施例１５、および、比較例９、１０］試薬を長期保存した際の試薬ブランクの上昇について（表５、図３）（後述の実施例１６、および、比較例１１、１２と、それぞれ同じ組成の試薬を使用して検討）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
（実施例１５）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１０９】
（比較例９）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１１０】
（比較例１０）ダイヤカラー・ＢＴＲ 総分岐鎖アミノ酸測定試薬（凍結乾燥品）
［１］酵素試薬ＢＲ１
１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
［２］酵素溶解液ＢＲ１
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
［３］酵素試薬ＢＲ２
ロイシンデヒドロゲナーゼ
［４］酵素溶解液ＢＲ２
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロミド
第一試薬：［１］を［２］で溶解した試液（ｐＨ７．５）
第二試薬：［３］を［４］で溶解した試薬
【０１１１】
実施例１５、比較例９、１０のＢＣＡＡ測定用試薬をＨ７１８０型自動分析機の試薬テーブル（１０℃以下）にて、１０週間（７１日間）開封保存し、保存１日目、１週間目、２週間目、３週間目、４週間目、６週間目、８週間目、１０週間目に、下記の測定法にて試料として精製水を繰返しｎ＝３測定し、ｎ＝３測定の平均値より試薬ブランクを求めた。
【０１１２】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬ（比較例１０は１．７μＬ）に第一試薬を１２０μＬ添加し、３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ（比較例１０は３０μＬ）添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法を用い、測定波長は、実施例１５および比較例９の両試薬については、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を、比較例１０は主波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
試薬を長期保存した際の試薬ブランクの上昇について、結果を表５および図３に示す。
比較例９、１０は経時的に非特異的発色による試薬ブランクの上昇が見られ、１０週間目の段階で、非特異的発色による試薬ブランク上昇度は、スタート時と比較し比較例９では９８．９ｍＡＢＳ、比較例１０では２０．１ｍＡＢＳであるのに対し、実施例１５は経時的な非特定的発色は見られず、１０週間目の段階での非特異的発色による試薬ブランク上昇度もスタート時と比較し３．６ｍＡＢＳ程度と良好であり、本法の有用性が示された。
【０１１５】
［実施例１６、および、比較例１１、１２］試薬を長期保存した際のノンキャリブレーション測定における測定値の精密性と安定性について（表６、図４〜６）（前述の実施例１５、および、比較例９、１０と、それぞれ同じ組成の試薬を使用して検討）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
なお、実施例１５と１６、比較例９と１１、比較例１０と１２は同じ試薬である。
（実施例１６）
第一試薬（ｐＨ７．０）反応ｐＨ８．０
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１１６】
（比較例１１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１１７】
（比較例１２）ダイヤカラー・ＢＴＲ 総分岐鎖アミノ酸測定試薬（凍結乾燥品）
［１］酵素試薬ＢＲ１
１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
［２］酵素溶解液ＢＲ１
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
［３］酵素試薬ＢＲ２
ロイシンデヒドロゲナーゼ
［４］酵素溶解液ＢＲ２
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロミド
第一試薬：［１］を［２］で溶解した試液（ｐＨ７．５）
第二試薬：［３］を［４］で溶解した試薬
【０１１８】
実施例１６、比較例１１および１２のＢＣＡＡ測定用試薬をＨ７１８０型自動分析機の試薬テーブル（１０℃以下）にて、１０週間（７１日間）開封保存し、保存１日目、１週間目、２週間目、３週間目、４週間目、６週間目、８週間目、１０週間目に、下記の測定法にて試料として液状ネスコールＮ、液状ネスコールＡ（アルフレッサファーマ社）、ＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）を繰返しｎ＝５で測定した。
【０１１９】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬ（比較例１２は１．７μＬ）に第一試薬を１２０μＬ添加し、３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ（比較例１２は３０μＬ）添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法を用い、測定波長は、実施例１６および比較例１１の両試薬については、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を、比較例１２は主波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２０】
また測定は、一日目測定のみ下記方法にてキャリブレーションを行い、その後の測定はキャリブレーションなしのいわゆるノンキャリブレーション測定法にて、上記方法で液状ネスコールＮ、液状ネスコールＡ（アルフレッサファーマ社）、ＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）を各々繰返しｎ＝５で測定した。結果はｎ＝５測定の平均値を示したものである。
【０１２１】
（キャリブレーション法）
精製水、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液を２重測定し、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
試薬を長期保存した際の測定値の精密性について、結果を表６および図４、５、６に示す。
比較例１１は還元系色素の経日的な非特異的発色の影響により、血清測定値が上昇していく。一方、凍結乾燥品である比較例１２については、４週目までは、還元系色素の経日的な非特異的発色の影響により血清測定値が上昇し、その後、酵素の保存安定性が低下するため、血清測定値が低下する。
実施例１６については経時的な血清値の変動は見られず、ノンキャリブレーションでの高精度かつ長期安定な測定が可能であることを示している。
【０１２４】
その他、実施例および比較例としてデータの記載はしないが、還元系色素を含有する第一試液のｐＨがｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上である条件においては、実施例１６同様の結果が得られ、本発明におけるノンキャリブレーションでの高精度かつ安定な測定が可能であった。
【０１２５】
［実施例１７〜３４、および、比較例１３］界面活性剤添加による、還元系色素に及ぼす生体試料中のタンパク質の影響回避について（表７〜９、図７〜９ ）
（実施例１７）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２６】
（実施例１８）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） ５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２７】
（実施例１９）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２８】
（実施例２０）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２９】
（実施例２１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３０】
（実施例２２）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）３０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３１】
（実施例２３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３２】
（実施例２４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） ５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３３】
（実施例２５）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３４】
（実施例２６）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３５】
（実施例２７）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３６】
（実施例２８）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）３０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３７】
（実施例２９）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３８】
（実施例３０）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） ５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３９】
（実施例３１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４０】
（実施例３２）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）１５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４１】
（実施例３３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４２】
（実施例３４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）３０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
【０１４３】
（比較例１３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４４】
実施例１７〜３４、比較例１３のＢＣＡＡ測定用試薬を、下記の測定法にて試料としてＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）を繰返しｎ＝５で測定した。
【０１４５】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、実施例１７〜３４および比較例１３の何れの試薬とも主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１４６】
【表７】
【０１４７】
【表８】
【０１４８】
【表９】
【０１４９】
結果を表７〜９および図７〜９に示す。同様の試料を市販のダイヤカラーＢＴＲのＢＣＡＡ測定試薬（総分岐鎖アミノ酸測定試薬）にて測定した値を真値とした。なお、ダイヤカラーＢＴＲ試薬は製造承認を受けており、測定に関しては、ＨＰＬＣ法との相関性についても良好である。
結果より、テトラゾリウム塩を含有する試薬に界面活性剤を添加しない場合（比較例１３）においては、真値に対して測定値が低値化するのに対して、テトラゾリウム塩を含有する試薬に界面活性剤を含有する試薬（実施例１７〜３４）では、真値に対し、良好な測定値であった。測定値の低下は、還元系色素と試料中のアルブミン等のタンパク質との作用により還元系色素の発色吸光度が低下することに起因している。実施例１７〜３４に示したように、ホルマザン色素と試料中のアルブミン等の蛋白質の作用による吸光度の低下を抑制するために、本発明においては、還元系色素を含む試薬に界面活性剤を０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上含有させることが好ましい。
【０１５０】
また、界面活性剤の種類としては、特に限定されないが、濃度としては、同配置中の酵素の安定性を考慮し、上限５．０重量％さらに好ましくは、３．０％であることがより好ましい。
したがって、還元系色素への生体試料中の蛋白質の作用による吸光度低下を抑制するために、還元系色素を含有する試液への界面活性剤の添加濃度としては、０．１〜５．０重量％、好ましくは、０．１〜３．０重量％、さらに好ましくは０．５〜３．０重量％、さらに好ましくは１．０〜３．０重量％であることが好ましい。
【０１５１】
［実施例３５］ アスコルビン酸の影響回避（表１０、図１０）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
（実施例３５）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１５２】
実施例３５のＢＣＡＡ測定用試薬を、下記の測定法にて以下の試料を繰返しｎ＝２で測定した。
【０１５３】
（試料）
ＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）：Ｌ−イソロイシン溶液（５０００μｍｏｌ／Ｌ）＝９：１の混合溶液に、アスコルビン酸を試料中に終濃度０ｍｇ／ｄＬ、２０ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、８０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬとなるように添加した試料。
【０１５４】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１５５】
（濃度換算）
試料中のＬ−イソロイシン濃度を以下のキャリブレーション法の結果より算出した。
試料中のイソロイシン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）＝（試料の測定吸光度）／（５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液の測定吸光度）×（５００μｍｏｌ／Ｌ）
【０１５６】
（キャリブレーション法）
精製水、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液を２重測定し、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
【０１５７】
【表１０】
【０１５８】
結果を表１０および図１０に示す。実施例３５において、試料中のアスコルビン酸の影響を回避することが可能であることを示している。データには示していないが、アスコルビン酸オキシダーゼおよび還元系色素を含有する第一試液のｐＨをｐＨ６．０〜８．０かつ、反応時のｐＨがｐＨ７．５以上である試薬においては、同様の結果が得られた。
【０１５９】
本発明においては、アスコルビン酸オキシダーゼは、還元系色素と同様に第一試液に配置して用いる。さらに、第一試液のｐＨをｐＨ５．５〜８．０、好ましくは、ｐＨ６．０〜８．０にすることで、還元系試薬の非特異的発色を抑制するのみならず、アスコルビン酸の試液中での保存安定性も保つことが可能である。
【０１６０】
［実施例３６］ 乳酸デヒドロゲナーゼの影響回避（表１１、図１１）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
（実施例３６）
反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
オキサミド酸ナトリウム １０ｍＭ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１６１】
実施例３６のＢＣＡＡ測定用試薬を、下記の測定法にて以下の試料を繰返しｎ＝２で測定した。
【０１６２】
（試料）
Ｌ−イソロイシン（５００μｍｏｌ／Ｌ）と乳酸（２０ｍＭ）を含む混合溶液に、乳酸デヒドロゲナーゼを試料中に終濃度０ｕ／Ｌ、２０００ｕ／Ｌ、４０００ｕ／Ｌ、６０００ｕ／Ｌ、８０００ｕ／Ｌ、１００００ｕ／Ｌとなるように添加した試料。
【０１６３】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１６４】
（濃度換算）
試料中のＬ−イソロイシン濃度を以下のキャリブレーション法の結果より算出した。
試料中のイソロイシン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）＝（試料の測定吸光度）／（５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液の測定吸光度）×（５００μｍｏｌ／Ｌ）
【０１６５】
（キャリブレーション法）
精製水、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液を２重測定し、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
【０１６６】
【表１１】
【０１６７】
結果を表１１および図１１に示す。酸化還元反応を用いる測定系では、特に試料中の乳酸デヒドロゲナーゼの乳酸からピルビン酸への触媒反応、または、ピルビン酸から乳酸への触媒反応が測定に影響を与えることが問題となっている。実施例３６において、乳酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるオキサミド酸ナトリウムを添加することにより、試料中の乳酸デヒドロゲナーゼの影響を回避することが可能であることを示している。
【０１６８】
また、データには示していないが、還元系色素を含有する第一試液のｐＨをｐＨ６．０〜８．０かつ、反応時のｐＨがｐＨ７．５以上である試薬においては、同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明の、総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】還元系色素を含有する試薬ｐＨと試薬ブランクの関係を示す（実施例１〜６、比較例１〜５）。縦軸は３５℃、７日間保存後の調製直後試薬と比較した試薬ブランク上昇度（ｍＡＢＳ；ミリ吸光度）を示す。横軸は各実施例、比較例における還元系色素を含有する試薬のｐＨを示す。
【図２】試薬の反応ｐＨと感度の関係を示す（実施例７〜１４、比較例６、７）。縦軸に標準液の測定感度（ｍＡＢＳ；ミリ吸光度）を示す。
【図３】実施例１５と比較例９、１０の経時的な試薬ブランク上昇度を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。縦軸は試薬ブランクを示し、ｍＡＢＳは、ミリ吸光度を示す。
【図４】実施例１６のノンキャリブレーション測定での各血清測定値の経時的な変動を示す。縦軸は血清中の総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。
【図５】比較例１１のノンキャリブレーション測定での各血清測定値の経時的な変動を示す。縦軸は血清中の総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。
【図６】比較例１２のノンキャリブレーション測定での各血清測定値の経時的な変動を示す。縦軸は血清中の総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。
【図７】界面活性剤添加濃度と真値に対する測定値の関係を示す（実施例１７〜２２、比較例１３）。縦軸は生体試料中のＢＣＡＡ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する測定値（μｍｏｌ／Ｌ）を示す（％）。横軸は界面活性剤添加濃度を示す。
【図８】界面活性剤添加濃度と真値に対する測定値の関係を示す（実施例２３〜２８、比較例１３）。縦軸は生体試料中のＢＣＡＡ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する測定値（μｍｏｌ／Ｌ）を示す（％）。横軸は界面活性剤添加濃度を示す。
【図９】界面活性剤添加濃度と真値に対する測定値の関係を示す（実施例２９〜３４、比較例１３）。縦軸は生体試料中のＢＣＡＡ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する測定値（μｍｏｌ／Ｌ）を示す（％）。横軸は界面活性剤添加濃度を示す。
【図１０】実施例３５の試料中のアスコルビン酸の影響を示す。縦軸はＬ−イソロイシンの試料中の濃度を、横軸はアスコルビン酸の試料への添加濃度を示す。
【図１１】実施例３６の試料中の乳酸デヒドロゲナーゼの影響を示す。縦軸はＬ−イソロイシンの試料中の濃度を、横軸は乳酸デヒドロゲナーゼの試料への添加濃度を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液などの生体に由来する試料中に存在する総分岐鎖アミノ酸（以下、ＢＣＡＡ）測定用の試薬に関する。さらに詳しくは、下記（１）〜（４）を達成することにより、液状で長期間安定であり、かつ高精度な測定が可能なＢＣＡＡ測定用試薬を提供するものである。
（１）液状試薬中での保存中の還元系色素の非特異的発色を抑制する。
（２）高精度測定が可能である。
（３）生体試料中のアスコルビン酸や乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨ）の影響を回避する。
（４）還元系色素と生体試料中の蛋白質の影響を回避する。
【背景技術】
【０００２】
病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化のため凍結乾燥品の形態で流通し、使用時に溶解液で溶解して使用するのが主流となっている。慢性肝炎から肝硬変への移行診断に用いられる、ＢＴＲ測定用試薬（総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定試薬）は、ＢＣＡＡ測定試薬とＴＹＲ（チロシン）測定試薬がセットになっており、ＢＴＲ測定用試薬も各々酵素、色素などが不安定であり凍結乾燥品の形態で流通している。なお、総分岐鎖アミノ酸とはＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンのことを指す。
一方、臨床検査施設では、多項目を測定し検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になることが多く、使用時に試薬の調製が不要な溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。ＢＴＲ測定用試薬に関しても同様であり溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。
【０００３】
酵素的分析法を用いた生体試料中に含まれる種々の特定成分を定量する方法の一つとして、例えば、酸化還元反応を用いる方法が知られている。すなわち、電子受容体の存在下で、該特定成分又は該特定成分より派生した物質に対して脱水素による酸化能を有する酵素を生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を測定することにより、試料中の特定成分を間接的に定量する方法である。
【０００４】
特に、定量しようとする特定成分が微量成分であるような場合は、より高感度に測定するために、上記生成された電子受容体の還元体を、より発色感度の高い発色剤を用いて検出、定量することも行なわれている。例えば、電子受容体としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを用いた場合、その還元体であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに、ジアホラーゼ等の電子キャリアーと還元系色素であるテトラゾリウムまたは、その化合物を作用させてホルマザンを形成させることにより検出、定量することが行なわれている。
【０００５】
ＢＴＲ測定方法に用いられるＢＴＲ測定用試薬においては、慢性肝炎から肝硬変への移行期に血中ＢＣＡＡ濃度が低下することから、診断上低値での精度が必要であり、高感度・高精度測定が要求される。そのため、これまでに流通しているＢＴＲ測定試薬の、ＢＣＡＡ測定試薬は該酸化還元反応を用いて測定が行われている。
【０００６】
該ＢＣＡＡ試薬は、高感度発色剤として３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下、ＭＴＴ）が用いられている。ＭＴＴを用いる該ＢＣＡＡ試薬をはじめとして、これまでに販売されてきた還元系色素を用いた臨床検査試薬においては、生成するホルマザンが難溶性であり、分析機のセルに吸着し、測定に影響を与えることが問題となっていた。
【０００７】
そこで、最近では水溶性の高いホルマザンを生成するテトラゾリウム塩が開発され、それを臨床検査試薬に適応する商品が販売されるようになってきている。
【０００８】
還元系色素であるテトラゾリウムまたはその化合物を用いた測定法に関する先行技術としては、例えば以下の特許文献１〜９がある。
特許文献１には、本願請求項３の一般式（１）に含有される化合物について開示されている。
特許文献２には、本願請求項３の一般式（１）に含有される化合物を用いた活性酸素の測定法について開示されている。
特許文献３には、テトラゾリウム化合物を予め前処理液に添加しておくことで生体試料中の還元物質の影響を回避すること、テトラゾリウム化合物は生体試料中の還元物質の影響を回避する目的に利用することが開示されている。
特許文献４には、テトラゾリウムから生じるホルマザンを予め前処理液に添加しておくことで生体試料中の還元物質の影響を回避することが開示されている。
これら、特許文献３および４は、テトラゾリウム塩を生体試料の前処理目的で使用するものであり、生体試料中の特定成分の発色定量用途に用いる本発明とは明らかに異なっている。
特許文献５には、テトラゾリウム塩をｐＨ８．５〜１１．０（好ましくは９．５〜１０．５）の範囲で被検試料と接触させて使用することが開示されている。
特許文献６には、実施例にｐＨが記されており、実施例中にあるようにテトラゾリウム塩を含む試薬のｐＨをｐＨ１０．０とすることが開示されている。
特許文献５、６においては、テトラゾリウム塩を含有する試薬のｐＨがｐＨ８．５以上であり、該ｐＨ溶液中でテトラゾリウム塩を保存した場合、保存中にテトラゾリウム塩の経日的な非特異的発色が顕著になることを本発明者らは確認している。
特許文献７および８には、テトラゾリウム塩を用いた乾式試薬について開示されているが、液状試薬におけるテトラゾリウム塩の安定性についえては言及されていない。また、実施形態についても乾式試薬であり、本発明の液状試薬とは明らかに異なっている。
特許文献９には、テトラゾリウム塩を用いた測定系において、試薬にアルブミンを添加することでヘモグロビンを含有する生体試料の影響を回避する方法について開示されている。
これら何れの文献においても、テトラゾリウム塩の液状試薬中での保存中の非特異的発色については、記載されていない。
【特許文献１】特許第２５９２４３６号公報
【特許文献２】特許第３６０２９５６号公報
【特許文献３】特開２０００−２１０１００号公報
【特許文献４】再公表ＷＯ２００３／０３３７３０号公報
【特許文献５】特許第２７９６１５０号公報
【特許文献６】特開２０００−３００２９３号公報
【特許文献７】特開２０００−９３１９８号公報
【特許文献８】特開２０００−９３１９９号公報
【特許文献９】特開２００４−６１２６３号公報
【０００９】
また、総分岐鎖アミノ酸測定に関する先行技術としては、例えば以下の特許文献１０がある。特許文献１０には、ＢＣＡＡ測定試薬、ＴＹＲ試薬からなる、ＢＴＲ測定試薬を凍結乾燥品として提供することが開示されている。
【特許文献１０】特許第１９６４６７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、液状で長期間安定であり、かつ高精度な測定が可能なＢＣＡＡ測定用試薬を提供することにある。
【００１１】
還元系色素であるテトラゾリウム塩を用いる液状の臨床検査試薬においては、酵素の液状での安定性以外に、以下の２点が大きな問題となっている。
（１）保存中に経日的に試薬ブランクが上昇する。
（２）生体試料中の成分の影響を受け易い。
（１）においては、吸光度測定における、感度低下、測定レンジ上限の低下等の問題が生じるため、測定に際し、毎回標準物質を測定し検量線を引き（以下キャリブレーションと言う）、非特異的に発色した色素の吸光量を差し引いておく必要性が生じる。また、測定感度が低下することにより生体試料中に微量しか存在しない測定対象物については、測定が困難になる。
（２）においては、テトラゾリウム塩を用いる酸化還元反応測定系では、特に、アスコルビン酸やグルタチオン、蛋白などの還元物質や、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などの酸化還元酵素の影響を受けることが大きな問題となっている。
【００１２】
また、テトラゾリウム塩を高感度に使用するためには、ｐＨをアルカリ性側にしておくことが知られているが、高感度で使用するために保存溶液のｐＨをアルカリ性側に設定した場合、経日的なブランク上昇がより顕著になることを本発明者らは見出した。
【００１３】
さらに、高感度に測定するために反応ｐＨをアルカリ性側にした場合、測定する生体試料中に乳酸が多く含まれる場合は、ＬＤＨの乳酸からピルビン酸への反応活性が促進されるため、テトラゾリウム塩を用いた酸化還元反応に影響を与えることが問題となる。
【００１４】
すなわち、本発明が解決しようとする課題は、テトラゾリウム塩を用いた液状のＢＣＡＡ測定試薬において、試薬の「高精度性」と「安定性」を両立することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
［項１］
還元型色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項２］
第一試液がｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上であることを特徴とする、項１記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項３］
還元系色素が、一般式（１）で表される還元系色素である、項１または２に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【化３】
［一般式（１）］
（式中、Ｒ１は水素、ニトロ基、または、メトキシ基、Ｒ２は水素またはニトロ基、Ｒ３はハロゲン、ニトロ基または、以下の式（２）で表されるアゾ化合物、Ｒ４は水素またはスルホ基、Ｒ５は水素または、スルホ基、Ｒ６は水素、ニトロ基、またはスルホ基、Ｒ７は水素または、スルホ基を示す。）
【化４】
［式（２）］
［項４］
還元系色素を含む第一試液に、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する項１〜３のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項５］
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体を含有する項１〜４のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
［項６］
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体およびアスコルビン酸オキシダーゼを含有する項１〜５のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【００１６】
本発明において「高精度性」とは、生体試料中に含まれる測定対象物の濃度が低濃度、例えば２ｍＭ以下の測定対象物の測定において、既知濃度の測定値の変動幅が、±２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の測定が可能であることを意味する。
【００１７】
本発明において「安定性」とは、測定の初回のみ、下記に記載の方法で検量線を引き値を校正（キャリブレーション）しておけば、その後の測定ではキャリブレーションを行わなくても、生体試料中の特定成分の測定値が長期に渡って安定化することを意味する。より厳密には１０℃以下の開封保存状態において、２週間中および２週間後の測定値が理論値の９０％、好ましくは９５％を下回らないことを意味する。
【００１８】
本発明において「反応時」とは、「還元系色素が酵素特異的に発色反応に導かれる際」を意味し、「第一試薬と第二試薬の混合時」と同義で用いている。
【００１９】
検量線での校正方法（キャリブレーション方法）
［１］精製水あるいは、生理食塩水と、
［２］１水準以上の濃度の標準物質または、標準溶液により行うのが好ましい。
【００２０】
キャリブレーション方法としては、直線法、スプライン法などいずにも限定されないが、特に直線法が好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の目的は、還元系色素であるテトラゾリウム塩を用いた液状のＢＣＡＡ測定試薬において、試薬の「高精度性」と「安定性」を両立することである。具体的には、テトラゾリウム塩を用いた液状の臨床検査試薬において、生体試料中に含まれる測定対象物の濃度が２ｍＭ以下の測定対象物の測定において、既知濃度の測定値の変動幅が、±２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の測定が可能である。さらに液状保存中の還元系色素の非特異的発色を抑制すること、及び非特異的発色が抑制された試薬による生体試料中のＢＣＡＡの測定において、生体試料中のタンパク質、アスコルビン酸、グルタチオンなどの還元物質の影響および、生体試料中のＬＤＨなどの酸化還元酵素の影響を回避することによって、生体試料中のＢＣＡＡの測定値が長期に渡って安定化する測定法、およびその試薬を提供することである。
【００２２】
さらに、本発明方法を用いれば、初回の測定のみキャリブレーションを行えば、その後の測定ではキャリブレーションを行わなくても、生体試料中のＢＣＡＡの測定値が長期に渡って安定化する。
【００２３】
還元系色素の非特異的発色を抑制し、かつ生体試料中の成分の影響を回避することにより、初回の測定のみキャリブレーションを行えば、その後キャリブレーションすることなく長期に渡って、生体試料中のＢＣＡＡの測定値を安定化させることが可能となる。
【００２４】
また、本発明においては、ノンキャリブレーション測定において測定値を安定化させるために、試薬ブランクの上昇度と感度の関係が重要になってくる。
本発明においては、保存による試薬ブランクの吸光度上昇による誤差を許容できる感度を有することが好ましい。より具体的には、保存によるブランク上昇度が、感度に対して１０％以内であることが好ましい。
【００２５】
本特許中に記載の「試薬」と「試液」は同義で用いている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、２ないし４のパーツで構成される液状試薬を用いて生体試料中のＢＣＡＡを定量する方法であって、電子受容体の存在下で該ＢＣＡＡに対して脱水素による酸化能を有するロイシンデヒドロゲナーゼを生体試料に作用させ、生成された電子受容体の還元体を、さらに電子キャリアーと還元系色素であるテトラゾリウム塩を作用させてホルマザンを形成させることにより検出・定量する方法であって、２試薬で構成される場合、還元系色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなることを特徴とする。
【００２７】
さらに、本発明は、還元系色素の保存中の非特異的発色を抑制するために、還元系色素を含有する第一試液のｐＨをｐＨ６．０〜８．０にし、かつ還元系色素を高感度に使用するため、およびロイシンデヒドロゲナーゼの活性を高めるために、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上であることが好ましい。
【００２８】
本発明の実施の形態としては、ＢＣＡＡ測定用試薬については測定方法として、［１］ＢＣＡＡに酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型ＮＡＤにより還元系発色試薬を還元し発色に導く方法、［２］ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法がある。
【００２９】
特に式（３）で表される反応を用いる方法が好ましい。
【数１】
［式（３）］
【００３０】
式（３）では、ＢＣＡＡ測定試薬の測定方法として、ＢＣＡＡにＮＡＤ存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型ＮＡＤによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法を例示されている（ジアホラーゼの代わりに電子キャリアーを用いても良い）。
【００３１】
なお、ジアホラーゼは、本発明においては電子キャリアーに包含される。
【００３２】
なお、本明細書においては、「電子伝達体」と「電子キャリアー」は同義である。
【００３３】
本発明の生体試料中のＢＣＡＡを定量する方法に用いられる液状試薬は、汎用自動分析装置で取り扱える試薬構成であれば、特に限定されないが、２ないし４のパーツで構成されることが望ましい。好ましくは２つのパーツで構成される２試薬系がよい。
また、試薬の状態としては、凍結乾燥試薬（液状で不安定な酵素などを凍結乾燥しておき、使用時に溶解液と混合して用いる試薬）、ドライケミストリー試薬（分析に必要な全ての試薬が乾燥状態で用意されている試薬）、液状試薬が好適に用いられるが、特に液状試薬であることが好ましい。
すなわち、２ないし４のパーツで構成される液状試薬であることが好ましい。好ましくは２つのパーツで構成される液状試薬がよい。
【００３４】
測定対象物である生体試料としては、特に限定されないが、血清あるいは血漿もしくは、全血あるいは、尿であることが好ましい。
【００３５】
本発明で用いられる酵素は、測定対象となるＢＣＡＡ又は該ＢＣＡＡから別の反応により派生した物質に対して、電子受容体の存在下で、脱水素による酸化能を有する酵素（以下、脱水素酵素という。）であればよい。すなわち、ＢＣＡＡに直接作用する酵素に限定されず、酵素共役系等によりＢＣＡＡから定量的に派生した物質に対する脱水素酵素も用いることができる。例えば、ＢＣＡＡに直接作用するロイシンデヒドロゲナーゼが用いられる。ロイシンデヒドロゲナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＳＰ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが、東洋紡社、ユニチカ社より入手できる。本発明試薬における、ロイシンデヒドロゲナーゼの添加配置は、第二試液である。
本発明で用いられる酵素濃度としては、好ましくは、反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、さらには０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられることがより好ましい。
【００３６】
また、電子受容体としては、生成された電子受容体の還元体を直接定量できるもの、あるいは該還元体を、発色剤を用いて比色定量できるものであれば、特に制限なく用いることができる。電子受容体であるＮＡＤ、ＮＡＤＰ等の補酵素にテトラゾリウムおよびその化合物や、フェナジンメトサルフェート類、ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物等の電子キャリアーを作用させて生じるホルマザンを比色定量することが好ましい。
具体的には、ニコチンアミド補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ：還元型、ＮＡＤ：酸化型、以下同様）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェイト、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、あるいはニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイト等が具体的に挙げられる。また、チオニコチンアミド補酵素としては、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェイト（チオＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド、あるいはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェイト、ニコチンアミド１，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミド１，Ｎ６−エテノアデニンジヌクレオチドホスフェイト、ピロロキノリンキノンおよび、フラビン化合物であるＦＡＤ、ＦＭＮ等が挙げられる。
本発明試薬における、電子受容体の添加配置は、特に限定されないが、第一試液であることがより好ましい。
本発明で用いられる電子受容体としては、好ましくは、反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、さらには０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることがより好ましい。
【００３７】
本発明で使用する、還元系色素は、還元されることにより発色する色素である。本発明においては、還元系色素としてテトラゾリウムおよびその化合物を使用する。
テトラゾリウムおよびその化合物は、その主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の結合が開裂することにより、ホルマザンへと導かれ、その際に生じる励起波長により発色する。
【００３８】
非特異的発色における発色機構も同様であるが、本発明により、還元系色素を含有する試薬のｐＨをｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．５にすることにより、テトラゾリウムおよびその化合物の主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の非特異的開裂を抑制し、それにより経時的な非特異的発色の抑制の程度を強めることが可能となる。
【００３９】
本発明で使用するテトラゾリウムおよびその化合物としては、例えば、２−（２’ベンゾチアゾリル）−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）テトラゾリウム（ＢＳＰＴ）、２−ベンゾチアゾリル−（２）−３，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＢＴＤＰ）、２，３−ジ（４−ニトロフェニル）テトラゾリウム（ＤＮＰ）、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム（ＤＰＳＰ）、ジスチリルニトロブルーテトラゾリウム（ＤＳＮＢＴ）、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル（−２Ｈテトラゾリウム（ＮＢＴ）、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム（ＭＴＴ）、２−フェニル−３−（４−カルボキシフェニル）−５−メチルテトラゾリウム（ＰＣＰＭ）、テトラゾリウムブルー（ＴＢ）、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウム（ＴＣＮＢＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、テトラゾリウムバイオレット（ＴＶ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、３，３‘−［３，３’−ジメトキシ−（１，１‘−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３，３‘−［３，３’−ジメトキシ−（１，１‘−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム クロライド］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム クロライド、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、２，２‘−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］ −３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４‘−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム ブロマイド、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム クロライド、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム オダイド、２，３，５−トリス（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−クロロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−フルオロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−メチルフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−クロロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−エチルフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−フルオロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−メトキシフェニル）−５−（４−シアノフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−メトキシフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−メチルフェニル）−５−（４−シアノフェニル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジ（ｐ−トリル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ビス（３−メチルフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−トリル）テトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−アミノテトラゾリウム クロライド、２，３−ジフェニル−５−カーボキシテトラゾリウム クロライド、２，５−ジ（ｐ−トリル）−３−フェニルテトラゾリウム クロライド、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム ブロマイド、２−（４−アイドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム クロライド、２−フェニル−３−（４−ビフェニリル）−５−メチルテトラゾリウム クロライド、３，３’−（３，３‘−ジメトキシ−４，４−ジフェニレン）ビス（２−フェニル−５−ベラトリテトラゾリウム クロライド）、３−（３−ニトロフェニル）−５−メチル−２−フェニルテトラゾリウム クロライド、３−（４−ニトロフェニル）−５−メチル−２−フェニルテトラゾリウム クロライド、ｍ−トリテトラゾリウムレッド、ネオ−テトリテトラゾリウム クロライド、ニトロブルーテトラゾリウム、Ｏ−トリテトラゾリウムレッド、ｐ−トリテトラゾリウムレッド等が挙げられるが、特に水溶性ホルマザンを生成する以下のテトラゾリウムおよび、その化合物の適応が好ましい。
すなわち、本発明に用いられるテトラゾリウムおよびその化合物は、２−ベンゾチアゾチアゾリル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルフォエチルカルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、２，２’−ジベンゾチアゾリル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム、ジナトリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロ、２−メトキシフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩であることが好ましい。
これらは反応液中、０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
【００４０】
本発明における、還元系色素の使用用途は発色定量用途であり、生体試料中の還元物質の影響回避のために前処理液等に添加して用いるものではない。
【００４１】
本発明における還元系色素の添加配置は、第一試液である。
【００４２】
本発明に用いられるジアホラーゼは起源として、例えばバチルス・メガテリウム、クロストリジウム・ＳＰが挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。
【００４３】
本発明に用いられる還元型ＮＡＤオキシダーゼは反応液中に、０．５〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍＬの濃度で用いられることが好ましい。
【００４４】
本発明に用いられる緩衝剤としては、非特異発色の要因となりうるアミン類などが不純物として含まないものであれば特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。中でもＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤は還元系色素の非特異発色をより低減することから好適である。
該緩衝剤のｐＨは５〜１０の範囲で調整されるが、還元系色素を含有する試薬のｐＨをｐＨ５．５〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜８．０にすることが、還元系色素の非特異的発色抑制において好ましい。
還元系色素の発色の原理は、テトラゾリウムおよびその化合物の主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の結合が開裂することにより、ホルマザンへと導かれ、その際に生じる励起波長により発色するという原理である。
非特異的発色における発色機構も同様であるが、本発明により、還元系色素を含有する試薬のｐＨをｐＨ８．０未満、好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．５にすることにより、テトラゾリウムおよびその化合物の主骨格である五環状中の窒素間の二重結合を形成するπ電子同士の非特異的開裂を抑制し、それにより経時的な非特異的発色を抑制することが可能となる。
【００４５】
本発明で用いられる界面活性剤としては、脂肪酸塩、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸トリエタノールアミン、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルベタインであることが好適である。
【００４６】
ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン（登録商標）１０４Ｐ、エマルゲン（登録商標）１０５、エマルゲン（登録商標）１０６、エマルゲン（登録商標）１０８、エマルゲン（登録商標）１０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）１２０、エマルゲン（登録商標）１２３Ｐ、エマルゲン（登録商標）１４７、エマルゲン（登録商標）１３０Ｋ、ノニオン（登録商標）Ｋ−２０４、ノニオン（登録商標）Ｋ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｋ−２２０、ノニオン（登録商標）Ｋ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）２１０、エマルゲン（登録商標）２２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオン（登録商標）Ｐ−２０８、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１０、ノニオン（登録商標）Ｐ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン（登録商標）３０６Ｐ、エマルゲン（登録商標）３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＳ−２０、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｓ−２０７、ノニオン（登録商標）Ｓ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｓ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）４０４、エマルゲン（登録商標）４０８、エマルゲン（登録商標）４０９Ｐ、エマルゲン（登録商標）４２０、エマルゲン（登録商標）４３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＯ−５０、ノニオン（登録商標）Ｅ−２０６、ノニオン（登録商標）Ｅ−２１５、ノニオン（登録商標）Ｅ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００４７】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）７０７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＴ−９、アデカトール（登録商標）ＳＯ−８０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１０５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１２０、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１３５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１４５、アデカトール（登録商標）ＳＯ−１６０、エマルゲン（登録商標）７０５、エマルゲン（登録商標）７０７、エマルゲン（登録商標）７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン（登録商標）８１０、エマルゲン（登録商標）８４０Ｓ、エマルゲン（登録商標）９０９、エマルゲン（登録商標）９１０、エマルゲン（登録商標）９３０、エマルゲン（登録商標）９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲン（登録商標）Ａ６０、エマルゲン（登録商標）Ａ９０、エマルゲン（登録商標）Ｂ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−１５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２３０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２５０、エマルゲン（登録商標）ＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２０７、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１２、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２１５、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０、エマレックス（登録商標）ＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドール（登録商標）（登録商標）ＴＷ−Ｌ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｌ１０６、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｐ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｓ１２０、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｏ１２０、レオドール（登録商標）４６０、エマノーン（登録商標）１１１２、エマノーン（登録商標）３１１５、エマノーン（登録商標）３１７０、エマノーン（登録商標）３２９９、エマノーン（登録商標）３１３０
【００４８】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ（登録商標） ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００４９】
さらにアルキルベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール（登録商標）（登録商標）２０ＢＳ、アンヒトール（登録商標）２４Ｂ、アンヒトール（登録商標）８６Ｂ、アンヒトール（登録商標）２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００５０】
界面活性剤の濃度としては、特に規定はしないが、特異的あるいは非特異的に生じたホルマザンと試料中の蛋白質との作用による吸光度の低下を抑制するために、還元系色素を含有する試薬において界面活性剤を０．０１重量％以上、好ましくは０．０５重量％以上さらに好ましくは、０．１重量％以上添加することが好ましい。
【００５１】
また、界面活性剤のうち特にＨＬＢ値が８．８〜１９．１さらに好ましくは、１１．０〜１９．１の範囲であり、かつ分子量が１６７〜１２００であり、さらにその構造中に炭素分子を１２個以上、水素原子を２３個以上含有するものが好ましい。
【００５２】
本発明に用いられる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００５３】
本発明に用いられる安定化剤としては、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼなどがある。中でもエチレンジアミン四酢酸塩が好適であり、反応液中で０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。
また、色素の安定化剤として、硫酸カリクスアレン（６）、硫酸カリクスアレン（８）等のカリクスアレン誘導体、およびＧ１αＣＤ、Ｇ２αＣＤ、Ｇ１βＣＤ、Ｇ２βＣＤ等のデキストリン類を使用する場合、非特異的発色抑制のために、還元系色素を含有する試薬とは別配置に添加することが好ましい。
【００５４】
生体試料中のアスコルビン酸の影響回避のために、本発明で使用するアスコルビン酸オキシダーゼの起源としては、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓｐ．やＣｕｃｕｒｂｉｔａ ｓｐ．およびＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．が挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられることが好ましい。また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む試薬のｐＨとしては、酵素の安定性、活性を考慮し、ｐＨ６．０〜８．０であることが好ましい。すなわち本発明においては、テトラゾリウム塩を含む第一試薬に含有させることが好ましい。
【００５５】
生体試料中のＬＤＨの影響低減および回避剤としては、シュウ酸、オキサミド酸および、各々の塩や、ヨウ素、銀、水銀および各々のイオン、ｐ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨより生成する物質などが挙げられる。反応液中、０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上の濃度で用いられることが好ましい。
【００５６】
本発明における試薬キットの様態としては、例えば以下が考えられるが、これらに限定されるものではない。
キット１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素を含有する試薬
キット２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアーを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子キャリアーを含有する試薬
キット４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子受容体を含有する試薬
キット５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含有する試薬
キット９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
キット１０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、生体試料の特定成分のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット１１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子キャリアーを含有する試薬
キット１２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子受容体を含有する試薬
キット１３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット１４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含含有する試薬
キット１５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット１６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含有する試薬
キット１７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
キット１８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット１９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアーを含有する試薬
キット２０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体を含有する試薬
キット２１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬を含有する試薬
キット２２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット２３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット２４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含む試薬を含有する試薬
キット２５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上となるように調整された緩衝剤を含む試薬
キット２６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試液
第二試薬
ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット２７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水酵素を含有する試薬
第二試液
電子キャリアーを含有する試薬
キット２８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
電子受容体を含有する試薬
キット２９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬
第二試液
電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬を含有する試薬
キット３０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３１（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素を含有する試薬、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット３２（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
第二試液
電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含む試薬を含有する試薬
キット３３（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素を含有する試薬
キット３４（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアーを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３５（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、キャリアーを含有する試薬
キット３６（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体を含有する試薬
キット３７（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子受容体、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬を含有する試薬
キット３８（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、電子キャリアー、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
キット３９（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼ、ＬＤＨ阻害剤を含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子受容体、電子キャリアーを含有する試薬
キット４０（第一試液と第二試液混合時のｐＨ：ｐＨ７．５以上）
第一試液（ｐＨ６．０〜８．０）
テトラゾリウム塩、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する試薬
第二試液
生体試料中のＢＣＡＡに作用する脱水素酵素、生体試料のＢＣＡＡの派生物に作用する脱水素酵素、電子キャリアー、ＬＤＨ阻害剤、電子受容体を含む試薬を含有する試薬
【００５７】
本発明の還元系色素を含む溶液は、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の形態で提供することができるが、これらの容器を遮光することがより望ましい。
【００５８】
本発明における検量線での校正方法（キャリブレーション方法）は特に限定されないが、［１］精製水あるいは、生理食塩水と、
［２］１水準以上の濃度の標準物質または、標準溶液により行うのが好ましい。
【００５９】
キャリブレーション方法としては、直線法、スプライン法などいずにも限定されないが、特に直線法が好ましい。
【００６０】
また、分析方法としては、以下の方法に限定されるものではないが、以下の［１］、［２］、［３］、のいずれかであることが好ましい。
［１］１ポイント法；試薬を添加し、一定時間後の吸光度を測定するエンドポイント法
［２］２ポイント法；測光ポイントを変えて２回測定し、差の吸光度を求めるエンドポイント法
［３］レート法；指定された測光ポイント間の単位時間あたりの吸光度変化を求める方法
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
本実施例で用いる酵素としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ロイシンデヒドロゲナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＳＰ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のものが、東洋紡社、ユニチカ社より入手できる。ジアホラーゼとしては、起源として、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＳＰ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓがあげられ、東洋紡社、ユニチカ社より入手できる。また、本発明では生体試料中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼを含有してよく、Ｃｕｃｕｍｉｓ ＳＰやＣｕｃｕｒｉｂｉｔａ ＳＰ由来のものが、東洋紡社、ロシュ社、旭化成社より入手できる。
【００６２】
［実施例１〜６、および、比較例１〜６］還元系色素の配置と非特異的発色による試薬ブランクの上昇度の関係（表１、図１）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した（比較例６のみ１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）測定試薬）。
【００６３】
（実施例１）反応ｐＨ７．５
第一試薬（ｐＨ６．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） ２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６４】
（実施例２）反応ｐＨ７．７５
第一試薬（ｐＨ６．５）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６５】
（実施例３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６６】
（実施例４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） ２５ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６７】
（実施例５）反応ｐＨ８．３
第一試薬（ｐＨ７．５）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６８】
（実施例６）反応ｐＨ８．５
第一試薬（ｐＨ８．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００６９】
（比較例１）反応ｐＨ８．２
第一試薬（ｐＨ８．２）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．２）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
【００７０】
（比較例２）反応ｐＨ７．６
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．２）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ナカライテスク株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７１】
（比較例３）反応ｐＨ７．８
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．５）
Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７２】
（比較例４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ（同仁化学株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ（同仁化学株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７３】
（比較例５）反応ｐＨ８．３
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ（同仁化学株式会社） ２０ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．５）
ＣＨＥＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ（同仁化学株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７４】
（比較例６）反応ｐＨ８．１
第一試薬（ｐＨ６．８）
緩衝液
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ ３Ｕ／ｍＬ
ジアホラーゼ ９Ｕ／ｍＬ
アデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ） ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ
酸化型ＮＡＤＰ＋ ９．２ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．７）
緩衝液
ＡＧ−６−リン酸デヒドロゲナーゼ ８０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７５】
実施例１〜６、比較例１〜５のＢＣＡＡ測定用試薬および、比較例６の１，５ＡＧ測定試薬を３５℃、７日間保存し、調製直後の各試薬との試薬ブランクの差を検討した。
【００７６】
実施例１〜６、比較例１〜５のＢＣＡＡ測定試薬、比較例６の１，５ＡＧ試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について、下記の測定法にて試料として精製水を繰返しｎ＝３で測定し、その平均値より試薬ブランクを求めた。
【００７７】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬ（比較例６のみ２．０μＬ）に第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、実施例１〜６および比較例１〜６試薬全て主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
還元系色素の配置と非特異的発色による試薬ブランクの上昇度の関係を、表１および図１に示す。
還元系色素が第一試液に含まれる実施例１〜６では試薬ブランクの上昇が１８ｍＡＢＳ以下であったのに対し、還元系色素が第二試液に含まれる比較例１〜６では４０ｍＡＢＳ以上であった。（特に、実施例３と比較例４では、第一試液、第二試液のｐＨが同じ条件で比較している。）
【００８０】
［実施例７〜１４、および、比較例７、８］第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨと感度の関係（表２、図２）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
【００８１】
（実施例７）反応ｐＨ７．５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） ２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８２】
（実施例８）反応ｐＨ７．６
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．５）
ＴＡＰＳ緩衝液 １６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８３】
（実施例９）反応ｐＨ７．７５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８４】
（実施例１０）反応ｐＨ７．９
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） ２５ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（ユニチカ社製） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５４ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８５】
（実施例１１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８６】
（実施例１２）反応ｐＨ８．５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）５ｇ／Ｌ
１−Ｍ−ＰＭＳ ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．５）
ＣＨＥＳ緩衝液 １４１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ナカライテスク株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８７】
（実施例１３）反応ｐＨ９．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ１０．０）
ＣＡＰＳＯ緩衝液 １３３ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８８】
（実施例１４）反応ｐＨ９．５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ１０．０）
ＣＡＰＳＯ緩衝液 １１８ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００８９】
（比較例７）反応ｐＨ７．２５
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ７．５）
ＴＥＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００９０】
（比較例８）反応ｐＨ７．４
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスル
ホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ８．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５４ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【００９１】
実施例７〜１４、比較例７、８のＢＣＡＡ測定用試薬について、試料として標準液と精製水を下記の測定法にて各々繰返しｎ＝２で測定し、その平均値より各試薬の標準液の感度を以下の式より算出した。なお、標準液には、Ｌ−イソロイシン溶液（５００μｍｏｌ／Ｌ）を用いた。
標準液の感度（ｍＡＢＳ）＝標準液の吸光度（ｍＡＢＳ）−試薬ブランクの吸光度（ｍＡＢＳ）
【００９２】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、実施例７〜１４および、比較例６、７試薬全て主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９３】
【表２】
【００９４】
第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨと感度の関係を表２および図２に示す。
第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨが７．５以上である実施例７〜１４では、感度が１５０ｍＡＢＳ以上であったのに対し、第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨが７．５未満である比較例７、８では感度が１４０ｍＡＢＳ程度以下であった。
また、第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨが７．５を越えて高くなるにつれて、感度がより高くなった。
【００９５】
【表３】
【００９６】
次に、「還元系色素の配置」と「第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨ」の組合せに対し、非特異的発色による試薬ブランクの上昇度、感度がどのような値を示すかについて、表３にまとめた。
表３における実施例１〜６および比較例１〜６は、表１のそれと同じである。
表３にはさらに、上記結果から求められる、感度に対する試薬ブランク上昇度の数値を記載した。
【００９７】
［還元系色素の配置について］
本発明において、ノンキャリブレーション測定での高精度かつ安定な測定を実現するためには、保存によるブランク上昇度が、感度に対して１０％以内であることが好ましい。
表３からわかるように、還元系色素が第一試液に配置されている実施例１〜６では、保存によるブランク上昇度が感度に対して１０％以内であるのに対し、還元系色素が第二試液に配置されている比較例１〜６では、感度に対する保存ブランクの上昇度が１８〜７２％と高い。比較例１〜６に代表される様に、３５℃・７日間の保存において、保存ブランクの上昇度が感度に対して１０％を上回る試薬組成においては、ノンキャリブレーション測定においても３５℃・７日保存と同様に経日的にブランク上昇が起こり、保存ブランクの上昇度が許容できなくなる。
【００９８】
［第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨについて］
第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨについては、表２および図２のところで述べたように、ｐＨが７．５を越えて高くなるにつれて、感度がより高くなった。
一方、データの記載はしていないが、反応ｐＨがｐＨ７．５以下、特にｐＨ７．０以下である場合には、還元系色素の感度が下がり、かつ本発明で用いられるロイシンデヒドロゲナーゼの酵素活性が低下し、本発明における（式（３））で表される反応が遅くなる。そのため、測定の安定性、高精度性が損なわれる。
【００９９】
他方、生体試料中には、乳酸またはピルビン酸が含まれているが、さらに乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる場合は、式（４）で表される反応が起こる。特に、ｐＨ８．５〜９．０では乳酸からピルビン酸への反応（以下、Ｌ→Ｐ反応）、ｐＨ７〜８ではピルビン酸から乳酸への反応（以下、Ｐ→Ｌ反応）が促進される。特に、Ｌ→Ｐ反応が、本発明の（式（３））で表される酸化還元反応と競合する。そのため、ロイシンデヒドロゲナーゼの反応性を高め、乳酸デヒドロゲナーゼの反応性を抑制することが重要になる。本発明においては、反応ｐＨがｐＨ７．５以上、好ましくはｐＨ８．０以上で乳酸デヒドロゲナーゼの競合反応を抑制し、本発明の酸化還元反応を高めることができることを確認している。
【０１００】
【数２】
［式（４）］
【０１０１】
さらに、本発明で電子キャリアーとして好適に用いられるジアホラーゼの活性を考慮した場合、反応ｐＨがｐＨ１０以上では著しくジアホラーゼの活性が低下する。
よって、第一試液と第二試液の混合時のｐＨ、つまり反応時のｐＨとしては、ｐＨ７．５以上、より好ましくは、ｐＨ７．５〜ｐＨ１０．０、さらに好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ９．５、さらに好ましくは、ｐＨ８．０〜９．５であることが好ましい。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
さらに、「還元系色素が配置される第一試液のｐＨ」と「第一試薬と第二試薬の混合時のｐＨ」の組合せに対し、非特異的発色による試薬ブランクの上昇の程度、測定感度、および、ノンキャリブレーション測定での高精度かつ安定な測定が可能かどうかについて、表４にまとめた。
【０１０４】
表４より、還元系色素を含有する第一試液のｐＨがｐＨ６．０〜８．０であり、さらに第一試液とロイシンデヒドロゲナーゼを含有する第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上にすることにより、液状での長期安定性、および高精度測定を両立することが可能となることがわかる。
【０１０５】
この高精度かつ安定な測定を実現するためには、感度を上げる目的で反応時のｐＨをｐＨ７．５以上に設定する必要があるが、還元系色素を含む第一試液のｐＨがｐＨ６．０未満の場合、保存によるブランク上昇は良好であるものの、反応時の感度をｐＨ７．５以上とするために、還元系色素を含有しない試液のｐＨをｐＨ１０〜１１のように高く設定するか、もしくは、ｐＨ８〜１０に設定した場合、緩衝剤濃度を高める必要がある。前者については、含有する酵素の液状での長期保存安定性を下げる可能性があり、また、後者については、イオン強度が増すため、同様に酵素の安定性、反応性を下げる可能性がある。
また、ｐＨ５．５未満では、緩衝能のすぐれたグッドバッファーが存在しないため、長期保存における酵素、色素の安定性が問題となる。
また、本発明で好適に用いられる電子キャリアーとしてジアホラーゼがあるが、該酵素を還元系色素を含有する試液中に保存する場合、ｐＨ６．０未満では、著しく保存安定性が低下する。また、本発明において、生体試料中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で好適に用いられるアスコルビン酸オキシダーゼは、還元系色素を含有する第一試液に添加することが好適であるが、ｐＨ６．０未満においては、液状での保存安定性が著しく低下する。
よって、本発明において、還元系色素の非特異的発色による試薬ブランクの上昇を抑制するためには、還元系色素を含有する第一試薬のｐＨがｐＨ５．５〜８．０、好ましくは、ｐＨ６．０〜８．０であることが好ましい。
【０１０６】
また、還元系色素の添加位置について、第二試液に配置した場合も第一試液に添加した場合と同様に、第二試液のｐＨをｐＨ８．０以下にすれば、還元系色素の非特異的発色によるブランク上昇は抑制されるものの、反応ｐＨをｐＨ７．５以上とするために、第一試液のｐＨを中性以上に設定する必要がある。この場合、第一試液中に含まれるアスコルビン酸オキシダーゼやジアホラーゼの長期保存安定性が低下する。また、第二試液のｐＨをｐＨ８．０以下とすることで、第二試液中のロイシンデヒドロゲナーゼの長期保存安定性の低下や、活性低下が見られるため、還元系色素を第二試液に含有させることは好ましくない。
【０１０７】
以上より、本発明を達成するためには、還元系色素を第一試液に含有し、かつ第一試液のｐＨがｐＨがｐＨ５．５〜８．０、好ましくは、ｐＨ６．０〜８．０であることが必須である。
【０１０８】
［実施例１５、および、比較例９、１０］試薬を長期保存した際の試薬ブランクの上昇について（表５、図３）（後述の実施例１６、および、比較例１１、１２と、それぞれ同じ組成の試薬を使用して検討）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
（実施例１５）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１０９】
（比較例９）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１１０】
（比較例１０）ダイヤカラー・ＢＴＲ 総分岐鎖アミノ酸測定試薬（凍結乾燥品）
［１］酵素試薬ＢＲ１
１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
［２］酵素溶解液ＢＲ１
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
［３］酵素試薬ＢＲ２
ロイシンデヒドロゲナーゼ
［４］酵素溶解液ＢＲ２
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロミド
第一試薬：［１］を［２］で溶解した試液（ｐＨ７．５）
第二試薬：［３］を［４］で溶解した試薬
【０１１１】
実施例１５、比較例９、１０のＢＣＡＡ測定用試薬をＨ７１８０型自動分析機の試薬テーブル（１０℃以下）にて、１０週間（７１日間）開封保存し、保存１日目、１週間目、２週間目、３週間目、４週間目、６週間目、８週間目、１０週間目に、下記の測定法にて試料として精製水を繰返しｎ＝３測定し、ｎ＝３測定の平均値より試薬ブランクを求めた。
【０１１２】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬ（比較例１０は１．７μＬ）に第一試薬を１２０μＬ添加し、３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ（比較例１０は３０μＬ）添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法を用い、測定波長は、実施例１５および比較例９の両試薬については、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を、比較例１０は主波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
試薬を長期保存した際の試薬ブランクの上昇について、結果を表５および図３に示す。
比較例９、１０は経時的に非特異的発色による試薬ブランクの上昇が見られ、１０週間目の段階で、非特異的発色による試薬ブランク上昇度は、スタート時と比較し比較例９では９８．９ｍＡＢＳ、比較例１０では２０．１ｍＡＢＳであるのに対し、実施例１５は経時的な非特定的発色は見られず、１０週間目の段階での非特異的発色による試薬ブランク上昇度もスタート時と比較し３．６ｍＡＢＳ程度と良好であり、本法の有用性が示された。
【０１１５】
［実施例１６、および、比較例１１、１２］試薬を長期保存した際のノンキャリブレーション測定における測定値の精密性と安定性について（表６、図４〜６）（前述の実施例１５、および、比較例９、１０と、それぞれ同じ組成の試薬を使用して検討）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
なお、実施例１５と１６、比較例９と１１、比較例１０と１２は同じ試薬である。
（実施例１６）
第一試薬（ｐＨ７．０）反応ｐＨ８．０
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１１６】
（比較例１１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【０１１７】
（比較例１２）ダイヤカラー・ＢＴＲ 総分岐鎖アミノ酸測定試薬（凍結乾燥品）
［１］酵素試薬ＢＲ１
１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
［２］酵素溶解液ＢＲ１
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
［３］酵素試薬ＢＲ２
ロイシンデヒドロゲナーゼ
［４］酵素溶解液ＢＲ２
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロミド
第一試薬：［１］を［２］で溶解した試液（ｐＨ７．５）
第二試薬：［３］を［４］で溶解した試薬
【０１１８】
実施例１６、比較例１１および１２のＢＣＡＡ測定用試薬をＨ７１８０型自動分析機の試薬テーブル（１０℃以下）にて、１０週間（７１日間）開封保存し、保存１日目、１週間目、２週間目、３週間目、４週間目、６週間目、８週間目、１０週間目に、下記の測定法にて試料として液状ネスコールＮ、液状ネスコールＡ（アルフレッサファーマ社）、ＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）を繰返しｎ＝５で測定した。
【０１１９】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬ（比較例１２は１．７μＬ）に第一試薬を１２０μＬ添加し、３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ（比較例１２は３０μＬ）添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法を用い、測定波長は、実施例１６および比較例１１の両試薬については、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を、比較例１２は主波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２０】
また測定は、一日目測定のみ下記方法にてキャリブレーションを行い、その後の測定はキャリブレーションなしのいわゆるノンキャリブレーション測定法にて、上記方法で液状ネスコールＮ、液状ネスコールＡ（アルフレッサファーマ社）、ＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）を各々繰返しｎ＝５で測定した。結果はｎ＝５測定の平均値を示したものである。
【０１２１】
（キャリブレーション法）
精製水、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液を２重測定し、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
試薬を長期保存した際の測定値の精密性について、結果を表６および図４、５、６に示す。
比較例１１は還元系色素の経日的な非特異的発色の影響により、血清測定値が上昇していく。一方、凍結乾燥品である比較例１２については、４週目までは、還元系色素の経日的な非特異的発色の影響により血清測定値が上昇し、その後、酵素の保存安定性が低下するため、血清測定値が低下する。
実施例１６については経時的な血清値の変動は見られず、ノンキャリブレーションでの高精度かつ長期安定な測定が可能であることを示している。
【０１２４】
その他、実施例および比較例としてデータの記載はしないが、還元系色素を含有する第一試液のｐＨがｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上である条件においては、実施例１６同様の結果が得られ、本発明におけるノンキャリブレーションでの高精度かつ安定な測定が可能であった。
【０１２５】
［実施例１７〜３４、および、比較例１３］界面活性剤添加による、還元系色素に及ぼす生体試料中のタンパク質の影響回避について（表７〜９、図７〜９ ）
（実施例１７）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２６】
（実施例１８）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） ５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２７】
（実施例１９）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２８】
（実施例２０）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１２９】
（実施例２１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３０】
（実施例２２）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）３０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３１】
（実施例２３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３２】
（実施例２４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） ５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３３】
（実施例２５）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３４】
（実施例２６）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３５】
（実施例２７）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３６】
（実施例２８）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）３０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（日本油脂株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３７】
（実施例２９）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３８】
（実施例３０）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） ５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１３９】
（実施例３１）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４０】
（実施例３２）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）１５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４１】
（実施例３３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４２】
（実施例３４）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社）３０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
【０１４３】
（比較例１３）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ）０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社） １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１４４】
実施例１７〜３４、比較例１３のＢＣＡＡ測定用試薬を、下記の測定法にて試料としてＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）を繰返しｎ＝５で測定した。
【０１４５】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、実施例１７〜３４および比較例１３の何れの試薬とも主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１４６】
【表７】
【０１４７】
【表８】
【０１４８】
【表９】
【０１４９】
結果を表７〜９および図７〜９に示す。同様の試料を市販のダイヤカラーＢＴＲのＢＣＡＡ測定試薬（総分岐鎖アミノ酸測定試薬）にて測定した値を真値とした。なお、ダイヤカラーＢＴＲ試薬は製造承認を受けており、測定に関しては、ＨＰＬＣ法との相関性についても良好である。
結果より、テトラゾリウム塩を含有する試薬に界面活性剤を添加しない場合（比較例１３）においては、真値に対して測定値が低値化するのに対して、テトラゾリウム塩を含有する試薬に界面活性剤を含有する試薬（実施例１７〜３４）では、真値に対し、良好な測定値であった。測定値の低下は、還元系色素と試料中のアルブミン等のタンパク質との作用により還元系色素の発色吸光度が低下することに起因している。実施例１７〜３４に示したように、ホルマザン色素と試料中のアルブミン等の蛋白質の作用による吸光度の低下を抑制するために、本発明においては、還元系色素を含む試薬に界面活性剤を０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上含有させることが好ましい。
【０１５０】
また、界面活性剤の種類としては、特に限定されないが、濃度としては、同配置中の酵素の安定性を考慮し、上限５．０重量％さらに好ましくは、３．０％であることがより好ましい。
したがって、還元系色素への生体試料中の蛋白質の作用による吸光度低下を抑制するために、還元系色素を含有する試液への界面活性剤の添加濃度としては、０．１〜５．０重量％、好ましくは、０．１〜３．０重量％、さらに好ましくは０．５〜３．０重量％、さらに好ましくは１．０〜３．０重量％であることが好ましい。
【０１５１】
［実施例３５］ アスコルビン酸の影響回避（表１０、図１０）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
（実施例３５）反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１５２】
実施例３５のＢＣＡＡ測定用試薬を、下記の測定法にて以下の試料を繰返しｎ＝２で測定した。
【０１５３】
（試料）
ＱＡＰトロールＩＩＸ（シスメックス社）：Ｌ−イソロイシン溶液（５０００μｍｏｌ／Ｌ）＝９：１の混合溶液に、アスコルビン酸を試料中に終濃度０ｍｇ／ｄＬ、２０ｍｇ／ｄＬ、４０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、８０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬとなるように添加した試料。
【０１５４】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１５５】
（濃度換算）
試料中のＬ−イソロイシン濃度を以下のキャリブレーション法の結果より算出した。
試料中のイソロイシン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）＝（試料の測定吸光度）／（５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液の測定吸光度）×（５００μｍｏｌ／Ｌ）
【０１５６】
（キャリブレーション法）
精製水、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液を２重測定し、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
【０１５７】
【表１０】
【０１５８】
結果を表１０および図１０に示す。実施例３５において、試料中のアスコルビン酸の影響を回避することが可能であることを示している。データには示していないが、アスコルビン酸オキシダーゼおよび還元系色素を含有する第一試液のｐＨをｐＨ６．０〜８．０かつ、反応時のｐＨがｐＨ７．５以上である試薬においては、同様の結果が得られた。
【０１５９】
本発明においては、アスコルビン酸オキシダーゼは、還元系色素と同様に第一試液に配置して用いる。さらに、第一試液のｐＨをｐＨ５．５〜８．０、好ましくは、ｐＨ６．０〜８．０にすることで、還元系試薬の非特異的発色を抑制するのみならず、アスコルビン酸の試液中での保存安定性も保つことが可能である。
【０１６０】
［実施例３６］ 乳酸デヒドロゲナーゼの影響回避（表１１、図１１）
下記組成からなる総分岐鎖アミノ酸（以下ＢＣＡＡ）測定試薬を調製した。
（実施例３６）
反応ｐＨ８．０
第一試薬（ｐＨ７．０）
ＰＩＰＥＳ緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）２０ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
酸化型ＮＡＤ １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社性ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
オキサミド酸ナトリウム １０ｍＭ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λｍａｘ＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬（ｐＨ９．０）
ＴＡＰＳ緩衝液 １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（花王株式会社）１ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製ＬＥＤ−２０１） ７０Ｕ／ｍＬ
【０１６１】
実施例３６のＢＣＡＡ測定用試薬を、下記の測定法にて以下の試料を繰返しｎ＝２で測定した。
【０１６２】
（試料）
Ｌ−イソロイシン（５００μｍｏｌ／Ｌ）と乳酸（２０ｍＭ）を含む混合溶液に、乳酸デヒドロゲナーゼを試料中に終濃度０ｕ／Ｌ、２０００ｕ／Ｌ、４０００ｕ／Ｌ、６０００ｕ／Ｌ、８０００ｕ／Ｌ、１００００ｕ／Ｌとなるように添加した試料。
【０１６３】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．８μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を４０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は、主波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１６４】
（濃度換算）
試料中のＬ−イソロイシン濃度を以下のキャリブレーション法の結果より算出した。
試料中のイソロイシン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）＝（試料の測定吸光度）／（５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液の測定吸光度）×（５００μｍｏｌ／Ｌ）
【０１６５】
（キャリブレーション法）
精製水、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液を２重測定し、５００μｍｏｌ／Ｌ Ｌ−イソロイシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し、補正を行った。
【０１６６】
【表１１】
【０１６７】
結果を表１１および図１１に示す。酸化還元反応を用いる測定系では、特に試料中の乳酸デヒドロゲナーゼの乳酸からピルビン酸への触媒反応、または、ピルビン酸から乳酸への触媒反応が測定に影響を与えることが問題となっている。実施例３６において、乳酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるオキサミド酸ナトリウムを添加することにより、試料中の乳酸デヒドロゲナーゼの影響を回避することが可能であることを示している。
【０１６８】
また、データには示していないが、還元系色素を含有する第一試液のｐＨをｐＨ６．０〜８．０かつ、反応時のｐＨがｐＨ７．５以上である試薬においては、同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明の、総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】還元系色素を含有する試薬ｐＨと試薬ブランクの関係を示す（実施例１〜６、比較例１〜５）。縦軸は３５℃、７日間保存後の調製直後試薬と比較した試薬ブランク上昇度（ｍＡＢＳ；ミリ吸光度）を示す。横軸は各実施例、比較例における還元系色素を含有する試薬のｐＨを示す。
【図２】試薬の反応ｐＨと感度の関係を示す（実施例７〜１４、比較例６、７）。縦軸に標準液の測定感度（ｍＡＢＳ；ミリ吸光度）を示す。
【図３】実施例１５と比較例９、１０の経時的な試薬ブランク上昇度を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。縦軸は試薬ブランクを示し、ｍＡＢＳは、ミリ吸光度を示す。
【図４】実施例１６のノンキャリブレーション測定での各血清測定値の経時的な変動を示す。縦軸は血清中の総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。
【図５】比較例１１のノンキャリブレーション測定での各血清測定値の経時的な変動を示す。縦軸は血清中の総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。
【図６】比較例１２のノンキャリブレーション測定での各血清測定値の経時的な変動を示す。縦軸は血清中の総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。横軸は経過日数であり、図中Ｗはｗｅｅｋ（週）を示す。
【図７】界面活性剤添加濃度と真値に対する測定値の関係を示す（実施例１７〜２２、比較例１３）。縦軸は生体試料中のＢＣＡＡ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する測定値（μｍｏｌ／Ｌ）を示す（％）。横軸は界面活性剤添加濃度を示す。
【図８】界面活性剤添加濃度と真値に対する測定値の関係を示す（実施例２３〜２８、比較例１３）。縦軸は生体試料中のＢＣＡＡ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する測定値（μｍｏｌ／Ｌ）を示す（％）。横軸は界面活性剤添加濃度を示す。
【図９】界面活性剤添加濃度と真値に対する測定値の関係を示す（実施例２９〜３４、比較例１３）。縦軸は生体試料中のＢＣＡＡ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）に対する測定値（μｍｏｌ／Ｌ）を示す（％）。横軸は界面活性剤添加濃度を示す。
【図１０】実施例３５の試料中のアスコルビン酸の影響を示す。縦軸はＬ−イソロイシンの試料中の濃度を、横軸はアスコルビン酸の試料への添加濃度を示す。
【図１１】実施例３６の試料中の乳酸デヒドロゲナーゼの影響を示す。縦軸はＬ−イソロイシンの試料中の濃度を、横軸は乳酸デヒドロゲナーゼの試料への添加濃度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元型色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項２】
第一試液がｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上であることを特徴とする、請求項１記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項３】
還元系色素が、一般式（１）で表される還元系色素である、請求項１または２に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【化１】
［一般式（１）］
（式中、Ｒ１は水素、ニトロ基、または、メトキシ基、Ｒ２は水素またはニトロ基、Ｒ３はハロゲン、ニトロ基または、以下の式（２）で表されるアゾ化合物、Ｒ４は水素またはスルホ基、Ｒ５は水素または、スルホ基、Ｒ６は水素、ニトロ基、またはスルホ基、Ｒ７は水素または、スルホ基を示す。）
【化２】
［式（２）］
【請求項４】
還元系色素を含む第一試液に、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項５】
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体を含有する請求項１〜４のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項６】
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体およびアスコルビン酸オキシダーゼを含有する請求項１〜５のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項１】
還元型色素を主成分とする第一試液と、ロイシンデヒドロゲナーゼを主成分とする第二試液とからなることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項２】
第一試液がｐＨ６．０〜８．０かつ、第一試液と第二試液の混合時のｐＨがｐＨ７．５以上であることを特徴とする、請求項１記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項３】
還元系色素が、一般式（１）で表される還元系色素である、請求項１または２に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【化１】
［一般式（１）］
（式中、Ｒ１は水素、ニトロ基、または、メトキシ基、Ｒ２は水素またはニトロ基、Ｒ３はハロゲン、ニトロ基または、以下の式（２）で表されるアゾ化合物、Ｒ４は水素またはスルホ基、Ｒ５は水素または、スルホ基、Ｒ６は水素、ニトロ基、またはスルホ基、Ｒ７は水素または、スルホ基を示す。）
【化２】
［式（２）］
【請求項４】
還元系色素を含む第一試液に、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項５】
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体を含有する請求項１〜４のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【請求項６】
還元系色素を含む第一試液に、電子受容体およびアスコルビン酸オキシダーゼを含有する請求項１〜５のいずれかに記載の総分岐鎖アミノ酸測定用試薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−７２１３７（Ｐ２００９−７２１３７Ａ）
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４５０４７（Ｐ２００７−２４５０４７）
【出願日】平成１９年９月２１日（２００７．９．２１）
【特許番号】特許第４２００４６７号（Ｐ４２００４６７）
【特許公報発行日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２１日（２００７．９．２１）
【特許番号】特許第４２００４６７号（Ｐ４２００４６７）
【特許公報発行日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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