総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬
【課題】本発明は、溶液状態で長期間安定なBCAA測定用試薬、TYR測定用試薬またはBTR測定用試薬を提供することを目的とする。
【解決手段】総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、または、BCAA分解酵素と色源体を別処方とすることによるBCAA測定用液状試薬である。また、チロシンを酵素を用いて測定する試薬において、チロシン分解酵素と金属塩を共存させることを特徴とするチロシン測定用液状試薬である。これら、総分岐鎖アミノ酸測定液状試薬および／またはチロシン測定液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬である。
【解決手段】総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、または、BCAA分解酵素と色源体を別処方とすることによるBCAA測定用液状試薬である。また、チロシンを酵素を用いて測定する試薬において、チロシン分解酵素と金属塩を共存させることを特徴とするチロシン測定用液状試薬である。これら、総分岐鎖アミノ酸測定液状試薬および／またはチロシン測定液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、総分岐鎖アミノ酸（BCAAと略す）またはチロシン（TYRと略す）または総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比（BTRと略す）測定用試薬組成物に関する。更に詳しくは溶液状態で長期間安定なBCAA、TYRまたはBTR測定用液状試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化のため凍結乾燥品の形態で流通し、使用時に溶解液で溶解して使用するのが主流となっている。BTR測定用試薬も各々酵素、色素などが不安定であり凍結乾燥品の形態で流通している。一方、臨床検査施設では、多項目を測定し検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になることが多く、使用時に試薬の調製が不要な溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。BTR測定用試薬に関しても同様であり溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。
【０００３】
現在、臨床検査室で用いられるBTR測定用試薬はBCAA測定用試薬、TYR測定用試薬の2項目の測定試薬がセットとなっており、各々下記反応式で測定され、得られたBCAA値、TYR値の比をとりBTR値を得るものである。たとえば図１、２のような方法が例示される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記BTR測定方法に用いられるBTR測定用試薬は、BCAA測定用試薬では慢性肝炎から肝硬変への移行期に血中BCAA濃度が低下することから、診断上低値での精度が必要であることから、高感度測定が必要である。このことから、高感度発色に導く系が必要であり、高感度発色剤としてMTTが用いられる。しかし、MTTは保存中に自然非特異発色があり試薬ブランクが上昇するという問題がある。また、ロイシンデヒドロゲナーゼの活性低下の問題がある。また、TYR測定用試薬ではチロシンデカルボキシラーゼが不安定であり低温下においても長期保存後の感度低下がみられ安定性が十分ではなかった。従って、本発明の目的は、溶液状態で長期間安定なBCAA測定用試薬、TYR測定用試薬またはBTR測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、BCAA測定用試薬を安定化させる方法として、BCAA分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることによるBCAA測定用液状試薬であり、または、BCAA分解酵素と色源体を別処方とすることによるBCAA測定用液状試薬である。また、TYR測定用試薬を安定化させる方法として、TYR分解酵素と金属化合物とを共存させることによるTYR測定用液状試薬である。また、これらBCAA測定用液状試薬またはTYR測定用液状試薬を用いたBTR測定用液状試薬に関する。
【０００６】
すなわち本発明は、以下のような構成よりなる。
［項１］総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項２］総分岐鎖アミノ酸分解酵素がロイシンデヒドロゲナーゼである項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項３］非特異発色が低減された色源体が35℃1週間保存前後の色素の極大吸収における吸光度差が0.2Abs以下である項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項４］非特異発色が低減された色源体がテトラゾリウム塩である項１、３に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項５］テトラゾリウム塩が２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩である項４に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項６］さらにＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤から選ばれた緩衝剤を含有する項１〜５に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項７］さらにシクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼから選ばれた安定化剤を含有する項１〜６に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項８］総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と色源体を別処方とすることを特徴とする項１〜７に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項９］項１〜８に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、および、チロシン測定用液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬
【０００７】
さらに本発明は、総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定方法であり、また、該総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、および、チロシン測定用液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定方法である。
【０００８】
あるいは本発明は、総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを含む、総分岐鎖アミノ酸測定試薬の安定化方法であり、また、安定な総分岐鎖アミノ酸測定試薬の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、BCAA測定用試薬においてBCAA分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることでBCAA分解酵素の安定性が良好化しBCAA測定用試薬の試薬ブランクが改善することから、安定性、精密性を向上させることができる。また、TYR測定用試薬においてTYR分解酵素と金属化合物とを共存させることによりTYR分解酵素の安定性が良好化しTYR測定用試薬の安定性、精密性を向上させることができる。このことから、BCAA測定用試薬またはTYR測定用試薬の液状試薬化により安定性、精密性の良好なBTR測定液状試薬を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の実施の形態としては、BCAA測定用試薬については測定方法として、（１）BCAAに酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型NADにより還元系発色試薬を還元し発色に導く方法、（２）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型NADによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法、（３）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型NADをピルビン酸存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成せしめ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（４）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型NADをスーパーオキシドジスムターゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（５）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型NADを還元型NADオキシダーゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（６）BCAAにバリンデカルボキシラーゼを作用させモノアミンとし、生成したミノアミンをモノアミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（７）BCAAに酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオNADと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型チオNADに導く方法、がある。
【００１１】
これらの測定系において溶液状態における長期保存安定性を損なう要因としてBCAA分解酵素の安定性と色源体の非特異発色が挙げられるが、BCAA分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させるかまたは色源体の非特異発色を低減させる組成においてBCAA分解酵素を共存させることにより、BCAA分解酵素の安定性を改善しかつ測定用試薬の試薬ブランクを低減させることがわかった。
【００１２】
BCAA分解酵素としては、特に限定されないが、ロイシンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼが挙げられる。ロイシンデヒドロゲナーゼはバチルス・スフアエリカスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、バリンデカルボキシラーゼはプロテウス・ブルガリスより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１３】
本発明の非特異発色が低減された色源体とは、長期保存後の試薬ブランクの上昇が少ない色源体であれば特に限定されないが、具体的には、35℃、1週間保存前後の色素の極大吸収における吸光度差が0.2Abs以下、好ましくは0.1Abs以下、より好ましくは0.05Abs以下である。
【００１４】
このような色源体としては、例えば水素供与体として、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）アニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４-アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１５】
また、ロイコ色素として、４，４’-ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアニリン）、４，４’-ビス[Ｎ-エチル-Ｎ-（３-スルホプロピルアミノ）-２，６-ジメチルフェニル]メタン、１-（エチルアミノチオカルボニル）-２-（３，５-ジメトキシ-４-ヒドロキシフェニル）-４，５-ビス（４-ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ-カルボキシメチルアミノカルボニル）-４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-３，７-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３,７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１６】
また、テトラゾリウム塩として、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロライド、3,3'-(1,1'-ビフェニル-4,4'-ジル)-ビス(2,5-ジフェニル)-2H-テトラゾリウムクロライド、3,3'-[3,3'-ジメトキシ-(1,1'-ビフェニル)-4,4'-ジル]-ビス[2-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウム クロライド]、2,3-ジフェニル-5-(4-クロロフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(p-ジフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-(p-ジフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(4-スチリルフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(m-トリル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(p-トリル)テトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-(2-チエニル)テトラゾリウム クロライド、2-ベンゾチアゾイル-3-(4-カルボキシ-2-メトキシフェニル)-5-[4-(2-スルホエチル カルバモイル)フェニル]-2H-テトラゾリウム、2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-シアノテトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-カルボキシテトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-メチルテトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-エチルテトラゾリウム クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩などが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１７】
また、可視部測定可能な補酵素としてチオNAD、チオNADPなどが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１８】
本発明に用いられる電子伝達体としては、フェナジンメトサルフェート、1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルサルフェート、メルドラブルーが挙げられる。電子伝達体の反応液中の初期濃度としては、０．００１〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
本発明に用いられるジアホラーゼは起源として、例えばバチルス・メガテリウム、クロストリジウム・SPが挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００２０】
本発明に用いられる還元型NADオキシダーゼは反応液中に、０．５〜１００U/mL、好ましくは１〜５０U/mLの濃度で用いられる。
【００２１】
また、色源体の非特異発色は溶液組成にも影響される。色源体の非特異発色に影響を与える要因としては、緩衝剤、pH、界面活性剤、防腐剤、安定化剤などがある。前述の色源体を適用するにあたりこれら溶液組成の組み合わせにより非特異発色を低減することができる。
【００２２】
本発明に用いられる緩衝剤としては、非特異発色の要因となりうるアミン類などが不純物として含まないものであれば特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、N-（２-アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。中でもＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤は色源体の非特異発色をより低減することから好適である。該緩衝剤のｐＨは５〜１０の範囲で調整されるが、好ましくは酸化型NADまたは酸化型チオNADを含有する試薬のｐＨを５〜７．５とし、酸化型チオNADを除く色源体を含有する試薬はｐＨ７．５〜１０とするのが好ましい。
【００２３】
本発明で用いられる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００２４】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２５】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００２６】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２７】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００２８】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２９】
本発明に用いられる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００３０】
本発明に用いられる安定化剤としては、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼなどがある。中でもエチレンジアミン四酢酸塩が好適であり、反応液中で０．０１〜１０mmol/L、好ましくは０．０５〜２mmol/Lである。
【００３１】
本発明では検体中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼを含有してよく、反応液中で０．１〜２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１０Ｕ／ｍＬである。
【００３２】
TYR測定用試薬については測定方法として、（１）TYRにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンをチラミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（２）TYRにβ-チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成せしめ、ピルビン酸をチアミンピロホスフェート、フラビンアデニンジヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼの作用により過酸化水素を生成せしめ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（３）TYRにβ-チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成させ、還元型NAD存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成させ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、がある。この中で好ましい態様としては、（１）が挙げられ、TYR分解酵素として、チロシンデカルボキシラーゼが挙げられる。
【００３３】
これらの測定系において溶液状態における長期保存安定性を損なう要因としてTYR分解酵素の安定性が挙げられるが、TYR分解酵素と金属化合物を含有することにより、TYR分解酵素の安定性を改善しかつ測定用試薬の長期保存安定性が改善することがわかった。
【００３４】
TYR分解酵素としては、特に限定されないが、チロシンデカルボキシラーゼ、β-チロシナーゼが挙げられる。チロシンデカルボキシラーゼはストレプトコッカス・フアエカリスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、β-チロシナーゼはエシェリシア・インターメディアより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３５】
本発明の金属化合物とは、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオンと硫酸、硝酸、炭酸などの無機酸との塩、ヨウ素、臭素、塩素等のハロゲン原子との塩、または酢酸、グルコン酸、プロピオン酸、パンテント酸、エチレンジアミン四酢酸などの有機酸との塩、が挙げられる。中でも、鉄イオンが好ましく、エチレンジアミン四酢酸鉄（ＩＩＩ）、塩化第一鉄（ＩＩＩ）、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等が挙げられる。金属化合物の濃度としては、反応液中で０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。またこれらの金属化合物は複数組み合わせて用いることができる。
【００３６】
本発明のアミンを含む緩衝剤としては、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。好ましくは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、である。
【００３７】
緩衝剤の濃度としては、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。緩衝剤のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには５．５〜８が好ましい。中でも６〜７が好ましい。また、その他、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのアミンを含まない緩衝剤と組み合わせて用いることができる。
【００３８】
TYR測定試薬に用いられる色源体としては、例えば水素供与体として、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）アニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４-アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００３９】
また、ロイコ色素として、４，４’-ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアニリン）、４，４’-ビス[Ｎ-エチル-Ｎ-（３-スルホプロピルアミノ）-２，６-ジメチルフェニル]メタン、１-（エチルアミノチオカルボニル）-２-（３，５-ジメトキシ-４-ヒドロキシフェニル）-４，５-ビス（４-ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ-カルボキシメチルアミノカルボニル）-４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-３，７-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３,７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００４０】
本発明で用いられる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００４１】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００４２】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００４３】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００４４】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００４５】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００４６】
本発明に用いられる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００４７】
本発明ではその他に、安定化剤、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼなどを含有してよい。安定化剤としては、ピリドキサール５’-リン酸、アルブミンなどが挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００４９】
（試薬の調製）
下記組成からなるBCAA測定試薬を調製した。
【００５０】
（実施例１）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
1-M-PMS ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５１】
（実施例２）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５２】
（実施例３）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５３】
（実施例４）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
エチレンジアミン四酢酸２水素２カリウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５４】
（実施例５）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩（λmax＝５８０ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５５】
（実施例６）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩（λmax＝４３３ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５６】
（実施例７）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩（λmax＝４６０ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５７】
（実施例８）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型チオNAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
【００５８】
（実施例９）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５９】
（実施例１０）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６０】
（実施例１１）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
TAPS緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６１】
（実施例１２）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ホウ酸緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６２】
（実施例１３）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ジメチルグリシン緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６３】
（比較例１）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
1-M-PMS ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝５６５ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６４】
実施例１〜１３、比較例１のBCAA測定用試薬を３５℃、７日間保存し、ロイシンデヒドロゲナーゼの残存活性（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
結果 表１に示す。比較例１のロイシンデヒドロゲナーゼの残存率が５６％に対し実施例１〜１３の残存率は７２〜９８％と良好であった。
【００６７】
次に実施例１〜１３、比較例１のBCAA測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について、下記の測定法にて試料として精製水、５００μmol/Lイソロイシン水溶液を測定し５００μmol/Lイソロイシン測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し調製直後のその吸光度と比較し相対パーセントを求めた。
【００６８】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は各々、実施例８は４０５ｎｍ、実施例１〜４、６、７は４５０ｎｍ、実施例９〜１３は５０５ｎｍ、実施例５、比較例１は５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および５００μmol/Lイソロイシン水溶液の測定吸光度より算出しBCAA濃度として求めた。
【００６９】
【表２】
【００７０】
結果 表２に示す。比較例１の精製水測定吸光度は３５℃、１週間後、０．２Abs以上の吸光度上昇がみられ、標準液測定感度は３５℃、１週間後、調製直後に対し２８．９％の低下がみられるのに対し、実施例１〜１３の精製水測定吸光度は３５℃、１週間後の吸光度上昇は０．００１９〜０．１５５３Absで０．２Abs以下であり、３５℃、１週間後の標準液測定感度は調製直後に対し７７．５〜１０２．２％と良好であった。
【００７１】
次に実施例１〜１３、比較例１のBCAA測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールIＸ、IIＸ（シスメックス社）を試料とし繰返しn=5で測定し変動係数ＣＶ（％）を算出した。
【００７２】
【表３】
【００７３】
結果 表３に示す。比較例１の製造直後のCVはQAPトロールIXで１．９％、QAPトロールIIXで１．２％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで４．７％、QAPトロールIIXで２．１％に対し、実施例１〜１３では製造直後のCVがQAPトロールIXで０．７〜１．８％、QAPトロールIIXで０．３〜１．１％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで２．０〜３．２％、QAPトロールIIXで０．５〜１．８％であり良好であった。また、製造直後試薬に対する３５℃、７日間保存後試薬測定値の相対％は比較例１がQAPトロールIXで１４４．０％、QAPトロールIIXで１１０．３％に対し、実施例１〜１３ではQAPトロールIXで９６．７〜１０５．３％、QAPトロールIIXで９８．６〜１０４．５％と良好であった。
【００７４】
（試薬の調製）
下記組成からなるTYR測定試薬を調製した。
【００７５】
（実施例１４）
第一試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７６】
（実施例１５）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００７７】
（実施例１６）
第一試薬
PIPES緩衝液 １００ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 １００ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００７８】
（実施例１７）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００７９】
（実施例１８）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００８０】
（実施例１９）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００８１】
（比較例２）
第一試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００８２】
上記、実施例１４〜１９、比較例２のTYR測定試薬を３５℃、７日間保存し、チロシンデカルボキシラーゼの残存活性（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００８３】
【表４】
【００８４】
結果 表４に示す。比較例２のｈシロシンデカルボキシラーゼの残存率が２８％に対し実施例１４〜１９の残存率は４６〜９１％と良好であった。
【００８５】
次に実施例１４〜１９、比較例２のTYR測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について、下記の測定法にて試料として精製水、２００μmol/Lチロシン水溶液を測定し２００μmol/Lチロシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し調製直後のその吸光度と比較し相対パーセントを求めた。
【００８６】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料３．５μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００μmol/LＬ-チロシン水溶液の測定吸光度より算出しチロシン濃度として求めた。
【００８７】
【表５】
【００８８】
結果 表５に示す。比較例２の標準液測定感度は３５℃、１週間後、調製直後に対し３８．３％の低下がみられるのに対し、実施例１４〜１９の３５℃、１週間後の標準液測定感度は調製直後に対し８３．７〜１００．５％と良好であった。
【００８９】
次に実施例１４〜１９、比較例２のTYR測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールIＸ、IIＸ（シスメックス社）を試料とし繰返しn=5で測定し変動係数ＣＶ（％）を算出した。
【００９０】
【表６】
【００９１】
結果 表６に示す。比較例２の製造直後のCVはQAPトロールIXで５．９％、QAPトロールIIXで１．５％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで６．７％、QAPトロールIIXで２．１％に対し、実施例１４〜１９では製造直後のCVがQAPトロールIXで３．８〜５．６％、QAPトロールIIXで０．８〜１．２％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで５．２〜６．６％、QAPトロールIIXで１．２〜１．８％であり良好であった。また、製造直後試薬に対する３５℃、７日間保存後試薬測定値の相対％は比較例２がQAPトロールIXで８６．７％に対し、実施例１４〜１９ではQAPトロールIXで９３．３〜１００．０％と良好であった。
【００９２】
次に実施例１〜１３のBCAA測定試薬および実施例１７のTYR測定試薬の市販管理血清ＱＡＰトロールIIＸ（シスメックス社）測定値より組み合わせを変えてBTR値（BCAA測定値÷TYR測定値）を算出し、製造直後のBTR値に対する３５℃、７日間保存後試薬のBTR値の相対％を算出した。また、同じく比較例１のBCAA測定試薬および比較例２のTYR測定試薬の測定値よりBTR値（BCAA測定値÷TYR測定値）を算出し、製造直後のBTR値に対する３５℃、７日間保存後試薬のBTR値の相対％を算出した。
【００９３】
【表７】
【００９４】
結果 表７に示す。製造直後試薬に対する３５℃、７日間保存後試薬測定値の相対％は比較例１が１０６．８％に対し、実施例１〜１３のBCAA値と実施例１７のTYR値より算出したBTR値では９８．５〜１０４．３％と良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＢＣＡＡ測定法の例示。
【図２】チロシン測定法の例示。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、総分岐鎖アミノ酸（BCAAと略す）またはチロシン（TYRと略す）または総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比（BTRと略す）測定用試薬組成物に関する。更に詳しくは溶液状態で長期間安定なBCAA、TYRまたはBTR測定用液状試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化のため凍結乾燥品の形態で流通し、使用時に溶解液で溶解して使用するのが主流となっている。BTR測定用試薬も各々酵素、色素などが不安定であり凍結乾燥品の形態で流通している。一方、臨床検査施設では、多項目を測定し検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になることが多く、使用時に試薬の調製が不要な溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。BTR測定用試薬に関しても同様であり溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。
【０００３】
現在、臨床検査室で用いられるBTR測定用試薬はBCAA測定用試薬、TYR測定用試薬の2項目の測定試薬がセットとなっており、各々下記反応式で測定され、得られたBCAA値、TYR値の比をとりBTR値を得るものである。たとえば図１、２のような方法が例示される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記BTR測定方法に用いられるBTR測定用試薬は、BCAA測定用試薬では慢性肝炎から肝硬変への移行期に血中BCAA濃度が低下することから、診断上低値での精度が必要であることから、高感度測定が必要である。このことから、高感度発色に導く系が必要であり、高感度発色剤としてMTTが用いられる。しかし、MTTは保存中に自然非特異発色があり試薬ブランクが上昇するという問題がある。また、ロイシンデヒドロゲナーゼの活性低下の問題がある。また、TYR測定用試薬ではチロシンデカルボキシラーゼが不安定であり低温下においても長期保存後の感度低下がみられ安定性が十分ではなかった。従って、本発明の目的は、溶液状態で長期間安定なBCAA測定用試薬、TYR測定用試薬またはBTR測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明は、BCAA測定用試薬を安定化させる方法として、BCAA分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることによるBCAA測定用液状試薬であり、または、BCAA分解酵素と色源体を別処方とすることによるBCAA測定用液状試薬である。また、TYR測定用試薬を安定化させる方法として、TYR分解酵素と金属化合物とを共存させることによるTYR測定用液状試薬である。また、これらBCAA測定用液状試薬またはTYR測定用液状試薬を用いたBTR測定用液状試薬に関する。
【０００６】
すなわち本発明は、以下のような構成よりなる。
［項１］総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項２］総分岐鎖アミノ酸分解酵素がロイシンデヒドロゲナーゼである項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項３］非特異発色が低減された色源体が35℃1週間保存前後の色素の極大吸収における吸光度差が0.2Abs以下である項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項４］非特異発色が低減された色源体がテトラゾリウム塩である項１、３に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項５］テトラゾリウム塩が２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩である項４に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項６］さらにＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤から選ばれた緩衝剤を含有する項１〜５に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項７］さらにシクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼから選ばれた安定化剤を含有する項１〜６に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項８］総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と色源体を別処方とすることを特徴とする項１〜７に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
［項９］項１〜８に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、および、チロシン測定用液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬
【０００７】
さらに本発明は、総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定方法であり、また、該総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、および、チロシン測定用液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定方法である。
【０００８】
あるいは本発明は、総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを含む、総分岐鎖アミノ酸測定試薬の安定化方法であり、また、安定な総分岐鎖アミノ酸測定試薬の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、BCAA測定用試薬においてBCAA分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることでBCAA分解酵素の安定性が良好化しBCAA測定用試薬の試薬ブランクが改善することから、安定性、精密性を向上させることができる。また、TYR測定用試薬においてTYR分解酵素と金属化合物とを共存させることによりTYR分解酵素の安定性が良好化しTYR測定用試薬の安定性、精密性を向上させることができる。このことから、BCAA測定用試薬またはTYR測定用試薬の液状試薬化により安定性、精密性の良好なBTR測定液状試薬を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の実施の形態としては、BCAA測定用試薬については測定方法として、（１）BCAAに酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型NADにより還元系発色試薬を還元し発色に導く方法、（２）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型NADによりジアホラーゼ存在下、還元系発色試薬を還元し発色に導く方法、（３）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型NADをピルビン酸存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成せしめ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（４）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、電子伝達体存在下、生成した還元型NADをスーパーオキシドジスムターゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（５）BCAAにNAD存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成した還元型NADを還元型NADオキシダーゼの作用により過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（６）BCAAにバリンデカルボキシラーゼを作用させモノアミンとし、生成したミノアミンをモノアミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（７）BCAAに酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオNADと略す）存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型チオNADに導く方法、がある。
【００１１】
これらの測定系において溶液状態における長期保存安定性を損なう要因としてBCAA分解酵素の安定性と色源体の非特異発色が挙げられるが、BCAA分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させるかまたは色源体の非特異発色を低減させる組成においてBCAA分解酵素を共存させることにより、BCAA分解酵素の安定性を改善しかつ測定用試薬の試薬ブランクを低減させることがわかった。
【００１２】
BCAA分解酵素としては、特に限定されないが、ロイシンデヒドロゲナーゼ、バリンデカルボキシラーゼが挙げられる。ロイシンデヒドロゲナーゼはバチルス・スフアエリカスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、バリンデカルボキシラーゼはプロテウス・ブルガリスより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００１３】
本発明の非特異発色が低減された色源体とは、長期保存後の試薬ブランクの上昇が少ない色源体であれば特に限定されないが、具体的には、35℃、1週間保存前後の色素の極大吸収における吸光度差が0.2Abs以下、好ましくは0.1Abs以下、より好ましくは0.05Abs以下である。
【００１４】
このような色源体としては、例えば水素供与体として、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）アニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４-アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１５】
また、ロイコ色素として、４，４’-ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアニリン）、４，４’-ビス[Ｎ-エチル-Ｎ-（３-スルホプロピルアミノ）-２，６-ジメチルフェニル]メタン、１-（エチルアミノチオカルボニル）-２-（３，５-ジメトキシ-４-ヒドロキシフェニル）-４，５-ビス（４-ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ-カルボキシメチルアミノカルボニル）-４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-３，７-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３,７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１６】
また、テトラゾリウム塩として、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロライド、3,3'-(1,1'-ビフェニル-4,4'-ジル)-ビス(2,5-ジフェニル)-2H-テトラゾリウムクロライド、3,3'-[3,3'-ジメトキシ-(1,1'-ビフェニル)-4,4'-ジル]-ビス[2-(4-ニトロフェニル)-5-フェニル-2H-テトラゾリウム クロライド]、2,3-ジフェニル-5-(4-クロロフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(p-ジフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-(p-ジフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(4-スチリルフェニル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(m-トリル)テトラゾリウム クロライド、2,5-ジフェニル-3-(p-トリル)テトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-(2-チエニル)テトラゾリウム クロライド、2-ベンゾチアゾイル-3-(4-カルボキシ-2-メトキシフェニル)-5-[4-(2-スルホエチル カルバモイル)フェニル]-2H-テトラゾリウム、2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩、2,3-ジフェニル-5-シアノテトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-カルボキシテトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-メチルテトラゾリウム クロライド、2,3-ジフェニル-5-エチルテトラゾリウム クロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩などが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１７】
また、可視部測定可能な補酵素としてチオNAD、チオNADPなどが挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００１８】
本発明に用いられる電子伝達体としては、フェナジンメトサルフェート、1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルサルフェート、メルドラブルーが挙げられる。電子伝達体の反応液中の初期濃度としては、０．００１〜５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
本発明に用いられるジアホラーゼは起源として、例えばバチルス・メガテリウム、クロストリジウム・SPが挙げられる。反応液中、０．０１〜１００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００２０】
本発明に用いられる還元型NADオキシダーゼは反応液中に、０．５〜１００U/mL、好ましくは１〜５０U/mLの濃度で用いられる。
【００２１】
また、色源体の非特異発色は溶液組成にも影響される。色源体の非特異発色に影響を与える要因としては、緩衝剤、pH、界面活性剤、防腐剤、安定化剤などがある。前述の色源体を適用するにあたりこれら溶液組成の組み合わせにより非特異発色を低減することができる。
【００２２】
本発明に用いられる緩衝剤としては、非特異発色の要因となりうるアミン類などが不純物として含まないものであれば特に限定はなく、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としてはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、N-（２-アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。中でもＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤は色源体の非特異発色をより低減することから好適である。該緩衝剤のｐＨは５〜１０の範囲で調整されるが、好ましくは酸化型NADまたは酸化型チオNADを含有する試薬のｐＨを５〜７．５とし、酸化型チオNADを除く色源体を含有する試薬はｐＨ７．５〜１０とするのが好ましい。
【００２３】
本発明で用いられる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００２４】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２５】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００２６】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２７】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００２８】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２９】
本発明に用いられる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００３０】
本発明に用いられる安定化剤としては、シクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、スメクタイトなどの膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼなどがある。中でもエチレンジアミン四酢酸塩が好適であり、反応液中で０．０１〜１０mmol/L、好ましくは０．０５〜２mmol/Lである。
【００３１】
本発明では検体中のアスコルビン酸の影響を回避する目的で、アスコルビン酸オキシダーゼを含有してよく、反応液中で０．１〜２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１０Ｕ／ｍＬである。
【００３２】
TYR測定用試薬については測定方法として、（１）TYRにチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、生成したチラミンをチラミンオキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（２）TYRにβ-チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成せしめ、ピルビン酸をチアミンピロホスフェート、フラビンアデニンジヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼの作用により過酸化水素を生成せしめ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、（３）TYRにβ-チロシナーゼを作用させピルビン酸を生成させ、還元型NAD存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させ乳酸を生成させ、生成した乳酸を乳酸オキシダーゼにより過酸化水素とし、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、酸化系発色試薬を酸化し発色に導く方法、がある。この中で好ましい態様としては、（１）が挙げられ、TYR分解酵素として、チロシンデカルボキシラーゼが挙げられる。
【００３３】
これらの測定系において溶液状態における長期保存安定性を損なう要因としてTYR分解酵素の安定性が挙げられるが、TYR分解酵素と金属化合物を含有することにより、TYR分解酵素の安定性を改善しかつ測定用試薬の長期保存安定性が改善することがわかった。
【００３４】
TYR分解酵素としては、特に限定されないが、チロシンデカルボキシラーゼ、β-チロシナーゼが挙げられる。チロシンデカルボキシラーゼはストレプトコッカス・フアエカリスなどから得られるが起源は特に限定されない。また、β-チロシナーゼはエシェリシア・インターメディアより得られるが起源は特に限定されない。反応液中、０．０１〜２００Ｕ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１００Ｕ／Ｌの濃度で用いられる。
【００３５】
本発明の金属化合物とは、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオンと硫酸、硝酸、炭酸などの無機酸との塩、ヨウ素、臭素、塩素等のハロゲン原子との塩、または酢酸、グルコン酸、プロピオン酸、パンテント酸、エチレンジアミン四酢酸などの有機酸との塩、が挙げられる。中でも、鉄イオンが好ましく、エチレンジアミン四酢酸鉄（ＩＩＩ）、塩化第一鉄（ＩＩＩ）、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等が挙げられる。金属化合物の濃度としては、反応液中で０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。またこれらの金属化合物は複数組み合わせて用いることができる。
【００３６】
本発明のアミンを含む緩衝剤としては、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤などが挙げられる。グッド緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。好ましくは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、である。
【００３７】
緩衝剤の濃度としては、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。緩衝剤のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには５．５〜８が好ましい。中でも６〜７が好ましい。また、その他、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのアミンを含まない緩衝剤と組み合わせて用いることができる。
【００３８】
TYR測定試薬に用いられる色源体としては、例えば水素供与体として、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-スルホプロピル-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）アニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメトキシアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３，５-ジメチルアニリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メトキシアニリン、Ｎ-スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、これらのカップラーとして４-アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。水素供与体、カップラーは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００３９】
また、ロイコ色素として、４，４’-ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ-ジメチルアニリン）、４，４’-ビス[Ｎ-エチル-Ｎ-（３-スルホプロピルアミノ）-２，６-ジメチルフェニル]メタン、１-（エチルアミノチオカルボニル）-２-（３，５-ジメトキシ-４-ヒドロキシフェニル）-４，５-ビス（４-ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン、４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ-カルボキシメチルアミノカルボニル）-４，４’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-３，７-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、１０−Ｎ−カルボキシメチルカバモイル−３,７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン塩等が挙げられる。これらは反応液中、０．０１〜５０mmol/L、好ましくは０．０５〜１０mmol/Lの濃度で用いられる。
【００４０】
本発明で用いられる界面活性剤としては特に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が好適である。
【００４１】
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００４２】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
【００４３】
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００４４】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００４５】
界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００４６】
本発明に用いられる防腐剤として、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。中でもアジ化ナトリウムは好適であり、反応液中で０．００１〜１重量％、好ましくは０．０１〜０．１重量％である。
【００４７】
本発明ではその他に、安定化剤、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼなどを含有してよい。安定化剤としては、ピリドキサール５’-リン酸、アルブミンなどが挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【００４９】
（試薬の調製）
下記組成からなるBCAA測定試薬を調製した。
【００５０】
（実施例１）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
1-M-PMS ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５１】
（実施例２）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５２】
（実施例３）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５３】
（実施例４）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
エチレンジアミン四酢酸２水素２カリウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５４】
（実施例５）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩（λmax＝５８０ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５５】
（実施例６）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩（λmax＝４３３ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５６】
（実施例７）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩（λmax＝４６０ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５７】
（実施例８）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型チオNAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
【００５８】
（実施例９）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００５９】
（実施例１０）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
Bicine緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６０】
（実施例１１）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
TAPS緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６１】
（実施例１２）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ホウ酸緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６２】
（実施例１３）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ジアホラーゼ（東洋紡社製ＤＡＤ−３０１） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
ジメチルグリシン緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝４３８ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６３】
（比較例１）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
1-M-PMS ０．１μｍｏｌ／Ｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
酸化型NAD １０ｍｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５
トリトンX−１００ １ｇ／Ｌ
ロイシンデヒドロゲナーゼ １００Ｕ／ｍＬ
３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（λmax＝５６５ｎｍ） ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００６４】
実施例１〜１３、比較例１のBCAA測定用試薬を３５℃、７日間保存し、ロイシンデヒドロゲナーゼの残存活性（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
結果 表１に示す。比較例１のロイシンデヒドロゲナーゼの残存率が５６％に対し実施例１〜１３の残存率は７２〜９８％と良好であった。
【００６７】
次に実施例１〜１３、比較例１のBCAA測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について、下記の測定法にて試料として精製水、５００μmol/Lイソロイシン水溶液を測定し５００μmol/Lイソロイシン測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し調製直後のその吸光度と比較し相対パーセントを求めた。
【００６８】
（測定法）
日立７１８０形自動分析機を用いた。試料１．７μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で測定波長は各々、実施例８は４０５ｎｍ、実施例１〜４、６、７は４５０ｎｍ、実施例９〜１３は５０５ｎｍ、実施例５、比較例１は５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および５００μmol/Lイソロイシン水溶液の測定吸光度より算出しBCAA濃度として求めた。
【００６９】
【表２】
【００７０】
結果 表２に示す。比較例１の精製水測定吸光度は３５℃、１週間後、０．２Abs以上の吸光度上昇がみられ、標準液測定感度は３５℃、１週間後、調製直後に対し２８．９％の低下がみられるのに対し、実施例１〜１３の精製水測定吸光度は３５℃、１週間後の吸光度上昇は０．００１９〜０．１５５３Absで０．２Abs以下であり、３５℃、１週間後の標準液測定感度は調製直後に対し７７．５〜１０２．２％と良好であった。
【００７１】
次に実施例１〜１３、比較例１のBCAA測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールIＸ、IIＸ（シスメックス社）を試料とし繰返しn=5で測定し変動係数ＣＶ（％）を算出した。
【００７２】
【表３】
【００７３】
結果 表３に示す。比較例１の製造直後のCVはQAPトロールIXで１．９％、QAPトロールIIXで１．２％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで４．７％、QAPトロールIIXで２．１％に対し、実施例１〜１３では製造直後のCVがQAPトロールIXで０．７〜１．８％、QAPトロールIIXで０．３〜１．１％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで２．０〜３．２％、QAPトロールIIXで０．５〜１．８％であり良好であった。また、製造直後試薬に対する３５℃、７日間保存後試薬測定値の相対％は比較例１がQAPトロールIXで１４４．０％、QAPトロールIIXで１１０．３％に対し、実施例１〜１３ではQAPトロールIXで９６．７〜１０５．３％、QAPトロールIIXで９８．６〜１０４．５％と良好であった。
【００７４】
（試薬の調製）
下記組成からなるTYR測定試薬を調製した。
【００７５】
（実施例１４）
第一試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７６】
（実施例１５）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００７７】
（実施例１６）
第一試薬
PIPES緩衝液 １００ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 １００ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００７８】
（実施例１７）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００７９】
（実施例１８）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ７．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００８０】
（実施例１９）
第一試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
PIPES緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．５
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００８１】
（比較例２）
第一試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-３-メチルアニリン １ｇ／Ｌ
フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ３Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
チラミンオキシダーゼ（東洋紡社製ＴＹＯ−３０１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ピリドキサール５-リン酸エステル １０μｍｏｌ／Ｌ
第ニ試薬
マックィルバイン緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ６．０
トリトンＸ−１００ １ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
チロシンデカルボキシラーゼ １．２Ｕ／ｍＬ
【００８２】
上記、実施例１４〜１９、比較例２のTYR測定試薬を３５℃、７日間保存し、チロシンデカルボキシラーゼの残存活性（調製直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
【００８３】
【表４】
【００８４】
結果 表４に示す。比較例２のｈシロシンデカルボキシラーゼの残存率が２８％に対し実施例１４〜１９の残存率は４６〜９１％と良好であった。
【００８５】
次に実施例１４〜１９、比較例２のTYR測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について、下記の測定法にて試料として精製水、２００μmol/Lチロシン水溶液を測定し２００μmol/Lチロシン水溶液測定吸光度から精製水測定吸光度を差引いた吸光度（感度）を算出し調製直後のその吸光度と比較し相対パーセントを求めた。
【００８６】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料３．５μＬに第一試薬 １２０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を３０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果は、精製水および２００μmol/LＬ-チロシン水溶液の測定吸光度より算出しチロシン濃度として求めた。
【００８７】
【表５】
【００８８】
結果 表５に示す。比較例２の標準液測定感度は３５℃、１週間後、調製直後に対し３８．３％の低下がみられるのに対し、実施例１４〜１９の３５℃、１週間後の標準液測定感度は調製直後に対し８３．７〜１００．５％と良好であった。
【００８９】
次に実施例１４〜１９、比較例２のTYR測定試薬の調製直後および３５℃、７日間保存した試薬、各々について同時再現性を検討した。同時再現性は市販管理血清ＱＡＰトロールIＸ、IIＸ（シスメックス社）を試料とし繰返しn=5で測定し変動係数ＣＶ（％）を算出した。
【００９０】
【表６】
【００９１】
結果 表６に示す。比較例２の製造直後のCVはQAPトロールIXで５．９％、QAPトロールIIXで１．５％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで６．７％、QAPトロールIIXで２．１％に対し、実施例１４〜１９では製造直後のCVがQAPトロールIXで３．８〜５．６％、QAPトロールIIXで０．８〜１．２％、３５℃、７日間保存後のCVはQAPトロールIXで５．２〜６．６％、QAPトロールIIXで１．２〜１．８％であり良好であった。また、製造直後試薬に対する３５℃、７日間保存後試薬測定値の相対％は比較例２がQAPトロールIXで８６．７％に対し、実施例１４〜１９ではQAPトロールIXで９３．３〜１００．０％と良好であった。
【００９２】
次に実施例１〜１３のBCAA測定試薬および実施例１７のTYR測定試薬の市販管理血清ＱＡＰトロールIIＸ（シスメックス社）測定値より組み合わせを変えてBTR値（BCAA測定値÷TYR測定値）を算出し、製造直後のBTR値に対する３５℃、７日間保存後試薬のBTR値の相対％を算出した。また、同じく比較例１のBCAA測定試薬および比較例２のTYR測定試薬の測定値よりBTR値（BCAA測定値÷TYR測定値）を算出し、製造直後のBTR値に対する３５℃、７日間保存後試薬のBTR値の相対％を算出した。
【００９３】
【表７】
【００９４】
結果 表７に示す。製造直後試薬に対する３５℃、７日間保存後試薬測定値の相対％は比較例１が１０６．８％に対し、実施例１〜１３のBCAA値と実施例１７のTYR値より算出したBTR値では９８．５〜１０４．３％と良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬は、体外診断用医薬品などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＢＣＡＡ測定法の例示。
【図２】チロシン測定法の例示。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項２】
総分岐鎖アミノ酸分解酵素がロイシンデヒドロゲナーゼである請求項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項３】
非特異発色が低減された色源体が35℃1週間保存前後の色素の極大吸収における吸光度差が0.2Abs以下である請求項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項４】
非特異発色が低減された色源体がテトラゾリウム塩である請求項１、３に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項５】
テトラゾリウム塩が２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求項４に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項６】
さらにＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤から選ばれた緩衝剤を含有する請求項１〜５に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項７】
さらにシクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼから選ばれた安定化剤を含有する請求項１〜６に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項８】
総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と色源体を別処方とすることを特徴とする請求項１〜７に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項９】
請求項１〜８に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、および、チロシン測定用液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬
【請求項１】
総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と非特異発色が低減された色源体を共存させることを特徴とする総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項２】
総分岐鎖アミノ酸分解酵素がロイシンデヒドロゲナーゼである請求項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項３】
非特異発色が低減された色源体が35℃1週間保存前後の色素の極大吸収における吸光度差が0.2Abs以下である請求項１に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項４】
非特異発色が低減された色源体がテトラゾリウム塩である請求項１、３に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項５】
テトラゾリウム塩が２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、2,2'-ジベンゾチアゾイル-5,5'-ビス[4-ジ(2-スルホエチル)カルバモイルフェニル] -3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)ジテトラゾリウム塩、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−[４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル]−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求項４に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項６】
さらにＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス緩衝剤、炭酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ジメチルグリシン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤から選ばれた緩衝剤を含有する請求項１〜５に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項７】
さらにシクロデキストリンおよびその修飾体、クラスターデキストリン、カリックスアレン誘導体、エチレンジアミン四酢酸塩、アミノスルホン酸化合物、膨潤性層状粘土鉱物、ホウ酸塩、カタラーゼから選ばれた安定化剤を含有する請求項１〜６に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項８】
総分岐鎖アミノ酸を酵素を用いて測定する試薬において、総分岐鎖アミノ酸分解酵素と色源体を別処方とすることを特徴とする請求項１〜７に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬
【請求項９】
請求項１〜８に記載の総分岐鎖アミノ酸測定用液状試薬、および、チロシン測定用液状試薬を用いて総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比を算出する総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２８９０９６（Ｐ２００７−２８９０９６Ａ）
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２２０４５（Ｐ２００６−１２２０４５）
【出願日】平成１８年４月２６日（２００６．４．２６）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２６日（２００６．４．２６）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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