緑茶飲料
【課題】ＥＣｇおよびＣｇを高含有しながら渋味や苦味を極力抑えた緑茶飲料およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】（Ａ）エピカテキンガレート、（Ｂ）エピガロカテキンガレート、（Ｃ）カテキンガレートおよび（Ｄ）ガロカテキンガレートを含有し、前記４成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであることを特徴とする緑茶飲料。
【解決手段】（Ａ）エピカテキンガレート、（Ｂ）エピガロカテキンガレート、（Ｃ）カテキンガレートおよび（Ｄ）ガロカテキンガレートを含有し、前記４成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであることを特徴とする緑茶飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カメリア属である茶由来のＬＯＸ−１（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニストであるエピカテキンガレート（ＥＣｇ）およびカテキンガレート（Ｃｇ）の含有率を高めた、風味の良好な緑茶飲料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
緑茶は、日本では抹茶、煎茶などの飲料として、また、中国などでもジャスミン茶などの飲料としてよく飲まれてきたが、近年では、健康志向の高まりから、日本や中国だけでなく、欧米や他のアジア諸国でも緑茶ブームが起きている。
【０００３】
前記緑茶が人の健康に好適な影響を与える点については、例えば、心血管病リスクを低減させる可能性があることが従来から広く言われている。これは欧米諸国と比較して、日本人は喫煙率が高いにも関わらず、冠動脈疾患が少ないといった疫学データや、緑茶の抗動脈硬化を検証するヒト試験（例えば、非特許文献１）、あるいは多岐に渡る生体外（in vitro）の試験などから示唆されている。
【０００４】
緑茶飲料中には様々な成分が含まれるが、緑茶に特有の有効成分としてはカテキン類が知られている。これは、緑茶の原料であるカメリア属（Ｃａｍｅｌｌｉａ属）の葉には、他の植物に比べカテキン類が比較的大量に含有されることによる。前記カメリア属の茶葉由来のカテキン類として、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、カテキン（Ｃ）などのフラバン−３−オール類を始め、実に７０種類程度のカテキン類が単離され、構造が明らかにされている。
【０００５】
また、これらのカテキン類については、コレステロール上昇抑制作用（特許文献１）やアミラーゼ活性阻害作用（特許文献２）などを始め多くの薬理活性が知られている。カテキン類の血管系機能改善についても多く報告されており、ＣやＥＣによる血管系機能改善効果（特許文献３）、血清コレステロール値を低下させる効果（特許文献４〜７）が例示される。
しかしながら、上記の多く作用についてはその作用機序が明らかでないことから、多くのカテキン類の中で有用性を比較することは困難であり、所望の作用を発現するのに必要なカテキン類の最適な配合比を設計できないという根本的な課題が潜在している。
【０００６】
例えば、上記のように緑茶に抗動脈硬化作用があることは知られているが、その機序は、今なお十分には解明されてはいない。カテキンを用いた多くの試験から、その効能は緑茶中に多く含有されるカテキン類の効果であることが明らかにされており、ＥＧＣｇなどの一部のカテキン類については若干検討されている例があるものの、その他多くの個々のカテキン成分の効果の差異については、詳細に検討されていないのが現状である。
【０００７】
また、ガレート型カテキン類が特に腸管でのコレステロール吸収阻害活性が高いという報告があり、この理論からの商品設計がなされている例があるが、そもそも、人を含む動物は自身にコレステロール合成経路を持ち合わせる中、腸管でのコレステロールの吸収を阻害することでの動脈硬化抑制効果は非常に限定的であると推測される。加えて、近年、血中コレステロール値と動脈硬化の因果関係について、日本脂質栄養学会が従来の見解と異なった新たなガイドラインを発表するなど(非特許文献２)、必ずしも血中コレステロール値の抑制だけで動脈硬化や心血管病を根源的に予防できるとは言えないのが現状である。
【０００８】
緑茶に含まれるカテキン類については、その含有量が報告されている。具体的には、緑茶としての玉露、煎茶、釜炒り茶、番茶、ほうじ茶についての分析値の報告があり、報告によっては多少のバラつきがあるが、主要なカテキン類は、ＥＧＣｇ、ＥＧＣ、ＥＣｇおよびＥＣの４種である。中でも最も含有されるのはＥＧＣｇでありカテキン類全体の５０〜６０％を占める。一方、その他のカテキン類の含有量は微量である。例えば、ＥＣｇは主要カテキン成分の一つとされているものの、ＥＧＣｇの含量には及ばず、ＥＧＣｇ含量に対して、茶の種類の間で差はあるものの約１／４〜１／５前後である。ましてや、Ｃｇに至っては、前述したように微量成分でありＥＧＣｇ含量にははるかに及ばない（例えば、非特許文献３を参照）。
飲用に用いる緑茶飲料は、茶葉を湯や水で抽出したものであるから、緑茶飲料中のカテキン類の構成も茶葉と類似した比率になる。
【０００９】
ところで、前記カテキン類はポリフェノールに属し、苦味や渋味が強いことが知られている。このカテキン類の苦味や渋味の呈味性や、苦味や渋味の閾値についての研究もされており、個々のカテキン類によって、それぞれ苦味や渋味の強度が異なることが知られている。一般にガレート基が結合したガレート型カテキン類は、非ガレート型カテキン類に比べると、苦味や渋味が強い。例えば、ガレート型カテキン類であるＥＧＣｇ、ＥＣｇ、ＣｇおよびＧＣｇは、これらの間での苦味や渋味に大差はないものの、ＥＧＣやＥＣなどの非ガレート型カテキン類よりも苦味や渋味が強いことが示されており、中でもＥＧＣｇ、ＥＣｇの苦味・渋味閾値濃度は３倍程度低いとされている（非特許文献４）。
したがって、緑茶飲料やカテキン含有食品を調整するに際し、苦味や渋味の制御は、当業者において大きな課題となっており、目的に応じた呈味性や風味制御についての先行技術をあげると枚挙に暇がない。
【００１０】
また、苦味や渋味以外にも、カテキン類の含有比や含有量を様々な目的から制御あるいは調整する試行はすでに多くなされ、開示されている。例えば、沈殿防止に関するもの（特許文献８、９）、変色防止に関するもの（特許文献１０、１１）、機能性に関するもの（特許文献１２、１３）、苦味や渋味の調整や茶本来の風味付与に関するもの（特許文献１４〜１６）など用途や目的は多岐に渡っている。
【００１１】
しかし、風味に配慮しつつＥＣｇおよびＣｇ含量を高めるという本願の目的と一致した先行技術は開示されていない。そればかりか、そもそもＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇ、ＧＣｇのようなガレート型カテキンは苦味や渋味が強い成分であることから、これらの含量が高い緑茶飲料は必然的に、苦味や渋味が一般の緑茶よりも高まることになる。ガレート型カテキンの含有量を従来品より高めた緑茶も市販され、市場に受け入れられているからある程度の苦味や渋味は許容されると思われるものの、やはりガレート型カテキンの含有量を高めすぎると苦味や渋味が強くなりすぎて摂取しづらい緑茶飲料となってしまう傾向にある。
したがって、上記のような４種類のガレート型カテキンの総含有量については苦味、渋味の程度を決める指標として着目されていたものの、４種類の含有量比をコントロールするアプローチは従来ではなされていない。
【００１２】
例えば、特許文献１７〜２０などは、非エピ体カテキン類とエピ体カテキン類の含有比率を特定した飲料に関するものであるが、これらは飲料の長期保存時の沈殿発生防止や色調の安定性や風味改善に関する技術であり、また非エピ体カテキン類とエピ体カテキン類の含有比率について特徴があるものの、ともにエピ体であるＥＣｇとＥＧＣｇとの間の比率については言及しておらず、示唆すらもない。より詳細に述べると、例えば、特許文献１８においては、（Ａ）非エピ体カテキン類、（Ｂ）エピ体カテキン類として、（Ａ）／（Ｂ）＝０．５４〜９．０になるように調整する容器詰飲料が示されているが、ＥＣｇとＥＧＣｇは共に（Ｂ）エピ体カテキン類に属する成分であり、双方の比率について何ら規定されるべき数式になっていない。
【００１３】
同様に、特許文献２１では、エステル型カテキンと遊離型カテキンの比率を特定した飲料に関するもので、機能性が優れたエステル型カテキン量を高めながら苦味や渋味を抑えるための技術である。しかしながら、ともにエステル型であるＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇ、ＧＣｇ間の比率については言及しておらず、示唆すらもない。
同様に、特許文献２２、２３では、機能性が優れたエステル型カテキン含有比率を高めた飲食物に関するものであるが、ＥＣｇは血清コレステロール低下効果がエステル型カテキンの中で最も小さいとされており、ＥＣｇ含量を低めている点で、本願とは方針が異なっている。
特許文献２４、２５については、非重合型カテキン類中の非重合体カテキンガレート体類の割合を特定しているが、歯への色素沈着防止や色相変化抑制に関する技術であり、また、ともにガレート体であるＥＣｇとＥＧＣｇとの間の割合については言及しておらず、示唆すらもない。
【００１４】
また、仮に何らかの理由で、ＥＣｇとＥＧＣｇとの間の比率を調整しようにも、現在の技術ではＥＣｇ／ＥＧＣｇ比（重量比）を０．５以上にすることは容易ではない。なぜならば、各種のカメリア属の茶抽出エキスは、おのずとその構成カテキン成分も茶葉と類似した比率になるため、カテキン類のなかで最も主成分であるＥＧＣｇがＥＣｇよりもはるかに高い比率になる。精製されたカテキン成分が業務用に販売されてはいるが、このカテキン成分はもっぱらＥＧＣｇである（例えば、太陽化学社製「ＥＧＣｇ」、ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社「Ｔｅａｖｉｇｏ」）。これは、従来からＥＧＣｇが、一定の健康機能効果を有する成分として知られていること、およびカメリア属の茶葉中の主要カテキン成分であることから産業上の利用価値が高いことが主な理由である。よって、他の個々のカテキン成分や、より具体的にはＥＣｇを産業用に精製した工業製品は知られていない。
したがって、現在の産業界の状況下においては、ＥＣｇ／ＥＧＣｇ比（重量比）を小さくすることは容易であるが、０．５以上にまで高めることは困難であり、またそのための目的も存在していないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第１６２０９４３号公報
【特許文献２】特許第３０１８０１３号公報
【特許文献３】特表２００９−５０１１６１号公報
【特許文献４】特開昭６０−１５６６１４号公報
【特許文献５】特開昭６２−３０７１１号公報
【特許文献６】特許第２８１２６８２号公報
【特許文献７】特開２００４−２６２９２７号公報
【特許文献８】特許第３５９７８３６号公報
【特許文献９】特許第３５９７８５９号公報
【特許文献１０】特許第３７９５５０６号公報
【特許文献１１】特許第４３８３３３２号公報
【特許文献１２】特開平６−５６６８６号公報
【特許文献１３】特許第３７５６４３８号公報
【特許文献１４】特許第３５９００２７号公報
【特許文献１５】特許第３５９７８５６号公報
【特許文献１６】特許第３５９７８５７号公報
【特許文献１７】特許第３３２９７９９号公報
【特許文献１８】特許第３３３８７０５号公報
【特許文献１９】特許第３３４２６９８号公報
【特許文献２０】特許第３３６００７３号公報
【特許文献２１】特許第３９８１１０８号公報
【特許文献２２】特許第４４９４３７３号公報
【特許文献２３】特許第４３１７７８１号公報
【特許文献２４】特許第３５９７８５４号公報
【特許文献２５】特許第３５９７８５５号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ．２００５ Ｏｃｔ；２４（５）：３４２−３４６）
【非特許文献２】長寿のためのコレステロールガイドライン２０１０年度版 中日出版社
【非特許文献３】「茶の科学」ｐ８８−８９（朝倉書店）
【非特許文献４】「食品の変色の化学」、ｐ１２４−ｐ１２５（光琳）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者らは、より根本的に心血管病予防効果の期待できる化合物を同定すべく、酸化ＬＤＬによる血管内皮細胞への作用を媒介する受容体であるレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体(ＬＯＸ−１)に着目し、強力なＬＯＸ−１アンタゴニストを同定するに至り、その作用・効果について詳細に報告している（特願２０１１‐２３６４４８号）。同時に、これらの化合物のうち、実用性の高い化合物が茶に存在することも明らかにしており、これらがＥＣｇとＣｇの２種のカテキンであることを初めて明らかにした。ただし、緑茶カテキン類の主要成分であるＥＧＣｇは、アンタゴニスト活性を有するものの、ＥＣｇと比較して１／５、Ｃｇと比較しても１／２程度の低い活性であった。
【００１８】
そこで、本発明者らは、より健康機能性が期待される緑茶飲料の開発を目的として、すでに本発明者らが発見した強力なＬＯＸ−１アントゴニスト剤であるＥＣｇおよびＣｇに着目し、新規な観点から緑茶を設計した結果、従来の緑茶製品においてカテキン類として微量成分であったＥＣｇおよびＣｇの含有量を選択的に高めて、カテキン類の主成分であるＥＧＣｇに対するＥＣｇの含有量の比率を顕著に高めることで、従来の緑茶飲料に比べて、ＥＣｇおよびＣｇに由来する生理活性を付与しながら、苦味や渋味を極力抑えた緑茶飲料を完成するに至った。また、同時に、鋭意検討した結果、カメリア属の茶葉から得た茶葉抽出物を緑茶に配合すること、或いは、カメリア属の茶葉由来の抽出物を合成吸着剤により精製した茶葉由来精製物を緑茶に配合することで前記緑茶飲料を効率よく得る製造方法を確立するに至った。
【００１９】
したがって、本発明は、ＥＣｇ、Ｃｇなどの非重合型カテキン類を高含有しながら渋味や苦味を極力抑えた緑茶飲料およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕（Ａ）エピカテキンガレート、（Ｂ）エピガロカテキンガレート、（Ｃ）カテキンガレートおよび（Ｄ）ガロカテキンガレートを含有し、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分を含む非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであることを特徴とする緑茶飲料、
〔２〕非重合型カテキン類総量中の（Ａ）成分および（Ｃ）成分の合計の含有比率が２０重量％以上である前記〔１〕記載の緑茶飲料、
〔３〕（Ａ）成分、（Ｂ）成分および（Ｃ）成分の含有量が、以下の式：
（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）≧１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）
を満たす前記〔１〕または〔２〕記載の緑茶飲料、
〔４〕カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物と緑茶抽出液とを混合してなり、
前記カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物中の（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の緑茶飲料、
〔５〕カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
前記茶葉由来抽出物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の緑茶飲料の製造方法、
〔６〕カメリア属の茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の緑茶飲料の製造方法、並びに
〔７〕カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記カメリア属の茶葉由来抽出物と、前記カメリア属の茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程
を含むことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の緑茶飲料の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、優れた健康機能性が期待されるエピカテキンガレート（ＥＣｇ）、カテキンガレート（Ｃｇ）などの非重合型カテキン類を高含有しながら渋味や苦味を極力抑えるというように、従来の緑茶飲料に比べてより健康を維持しやすく、しかも飲み易い緑茶飲料およびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例1における、各化合物のｈＬＯＸ−１タンパク質（ヒト由来組換え型ＬＯＸ−１タンパク質）に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の結果を示すグラフである。縦軸は、化合物未添加の場合の酸化ＬＤＬ結合阻害能を１００とした場合の、各化合物が有する酸化ＬＤＬ結合阻害能の相対値を示す。相対値が低いほど、酸化ＬＤＬ結合阻害能が高いことを示す。
【図２】図２は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中総コレステロール濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図３】図３は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中ＨＤＬコレステロール濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図４】図４は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中トリグリセライド濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図５】図５は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中リン脂質濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図６】図６は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの各腸間膜動脈における脂質沈着をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏにより染色し、腸間膜動脈総面積に占める脂質沈着部位の面積の割合を、１群をｎ＝８で試験し測定した平均値の結果をグラフ化したものである。この場合、５％未満の危険率で有意差のあることを示している。
【図７】図７は、実施例５の実験の、精製物含有食またはコントロール食を摂取したラットの各腸間膜動脈における脂質沈着をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏにより染色した全体図を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本発明で使用するカテキン類は全て「非重合型カテキン類」のことを指し、さらに「非重合型カテキン類」とは、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）のエピ体カテキン類、および、カテキンガレート（Ｃｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）の非エピ体カテキン類をあわせての総称である。
【００２４】
本発明でいう緑茶飲料とは、茶葉から製茶された「緑茶茶葉」から水や熱水、抽出助剤を添加した水溶液で抽出して得られた緑茶抽出液（「緑茶飲料ベース」という）と、カメリア属の茶葉由来抽出物やその精製物とからなる、緑茶風味が保持された飲料のことを指す。
【００２５】
ここでいう「緑茶茶葉」は、製茶製造過程の第一段階で加熱によって茶葉の酵素活性を失わせ、成分の酸化を防ぎ、緑色を保たせた不発酵茶のことであり、加熱に蒸気を使う煎茶、玉露、天茶、番茶、茎茶、玉緑茶などを指す。ただし、更に焙煎処理が施される茶、例えば、ほうじ茶は成分や風味が大きく「緑茶茶葉」と異なるために、本発明でいうところの「緑茶茶葉」には含まれない。また、半発酵茶である烏龍茶、強発酵茶である紅茶、後発酵茶である黒茶などは、不発酵茶と分類上分けられるため、ここでいう「緑茶茶葉」に含有されない。当該製茶された「緑茶茶葉」としては、日本で最も一般的な「煎茶」、「玉露」が特に好ましい。「緑茶茶葉」は、カメリア属の茶葉であるが、カメリア属のなかで、例えばＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ａｓｓａｍｉｃａ、やぶきた種、べにふうき種、またはそれらの雑種があげられる。
【００２６】
本発明の緑茶飲料において、ベースとなる緑茶抽出液は、前記緑茶茶葉から、一般的な、あるいは従来法で得られる。抽出に用いる水の量は、緑茶茶葉に対して５〜１００重量倍量、特に５〜８０倍量が好ましい。抽出温度は、０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９５℃、さらに好ましくは４０〜９０℃である。温度によって得られる緑茶抽出液の風味や成分が異なるため、目的に応じて温度を選択すればよい。抽出時間は、抽出方法、装置の種類、装置の大きさ、処理量といったスケールの大きさによって様々であり、目的の風味や成分組成になるように、状況に適した抽出時間を設定すればよい。ただし、製造時の時間的なコストを考えると１〜１００分、好ましくは１〜８０分がよい。抽出時の溶媒は水であり、工業用水、上水、蒸留水、脱イオン水など制限はないが、雑味が少ないこと、沈殿が発生しにくいこと、変色が抑えられることおよびコストから考えると脱イオン水が好適である。
【００２７】
前記緑茶抽出液の抽出方法は、緑茶茶葉を水に浸漬し抽出する方法（浸漬法）、緑茶茶葉を水と混合攪拌し抽出する方法（攪拌法）、緑茶茶葉をカラムに充填し水を通水させ抽出する方法（カラム法）があり、それらのいずれでもよい。繰り返しの抽出を行う場合は、カラム法が効率的である。また、抽出時やその後の酸化による劣化を防ぐ目的で、アスコルビン酸やアスコルビン酸ナトリウムなどの抗酸化剤を水に添加してもよい。あるいは窒素ガスなどを使用して脱酸素条件下で抽出しても良い。ｐＨを調整や抽出効率から炭酸水素ナトリウムなどの助剤をあらかじめ水に添加してもよい。
【００２８】
緑茶抽出液は、沈殿の存在や、その後の沈殿発生のリスクを考え、状況に応じて濾過処理する。例えば、濾紙、ナイロンメッシュ、珪藻土などで適宜ろ過すればよい。緑茶抽出液は、そのままベースにしてもよいし、風味や成分量を考えて、水を添加し希釈してベースにしてもよい。ただし、希釈は緑茶の風味が十分に保たれる程度にする。ベースにする緑茶抽出液中のカテキン成分については、その含量やガレート型カテキン類の種類の構成は特に制限はない。ただし、本発明の緑茶飲料のガレート型カテキン類の含量や構成は、緑茶飲料ベースと添加する茶葉由来抽出物・精製物の２要素に依存する。したがって、後述のカメリア属の茶葉由来の抽出物やその精製物中のカテキン成分含量や構成次第では、目的とする緑茶飲料の条件を満たすために、所望のガレート型カテキン類の含量や構成を有する緑茶飲料ベースを適宜に選択する場合も生じることがある。
【００２９】
一方、本発明でいうカメリア属の茶葉由来の抽出物とは、カメリア属に分類される植物の茶葉由来の抽出物であれば制限はない。原料としては、例えば、チャ（カメリア シネンシス）があげられる。なかでも、日常的に飲用されている、不発酵茶である各種緑茶、半発酵茶である烏龍茶、強発酵茶である紅茶、後発酵茶である黒茶、プーアル茶などが、安全性が高く、安心感もあり、また原材料が入手しやすい観点から好ましい。また、一般に、ＥＣｇ含有率が比較的高いほうじ茶や紅茶は、更に好ましい。また、不発酵茶である緑茶においては、ＥＣｇ含量が比較的高い「釜炒り茶」や紅ふうき種が、緑茶風味を有することからもさらに好ましい。
【００３０】
カメリア属の茶葉由来の抽出物の抽出方法について述べる。原料茶葉を水や有機溶媒、あるいはこれらを組み合わせ、公知の方法により実施できる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムなどが挙げられる。好ましくは、親水性のメタノール、エタノール、アセトンが挙げられ、より好ましくはエタノールが食品用途としては適している。抽出方法としては、浸漬し静置抽出、浸漬し攪拌抽出、加温抽出、加温加圧抽出、還流抽出、あるいはカラムに原料を充填し、繰り返し抽出してもよい。超臨界抽出方法などを適用することもできる。短時間で効率的に抽出する観点からは、加温抽出や加温加圧抽出が望ましい。抽出温度や抽出時間は、茶葉や溶媒の量、茶葉や溶媒の種類、抽出装置や抽出スケールにより適宜選択すればよい。抽出された溶液は、そのまま用いてもよく、濃縮してもよく、溶媒を除去し固形状にしてもよい。すなわち該茶葉由来抽出物は、固体でも液体でもスラリー状でも構わなく、用途やコストに応じて調製すればよい。
【００３１】
カメリア属の茶葉由来の抽出物は、最終的に前記の緑茶飲料ベースに添加されるものであるから、原料として使用する茶葉が緑茶と異なる場合には、緑茶風味を害さないように留意する必要がある。この観点では、複数回の前段階抽出を実施し、使用する茶葉固有の好ましくない風味を除去して得られた茶殻から再度抽出し、目的に応じたガレート型カテキン類を多く含有する抽出物を得ることが望ましい。例えば、前段階の抽出時に得られる抽出液は用いず、ここで回収した茶殻に対し更に抽出を実施して得られた抽出液を回収すれば、好ましくない茶葉固有の風味は低減しつつ、ある程度の目的の成分は回収できる。一般に雑味成分は水で抽出されやすく、目的成分であるガレート型カテキン類は雑味成分に比べると水で抽出されにくい傾向があるために、この手法が有効である。前段階の抽出は水やエタノールなどの有機溶媒や、これらを組み合わせた抽出が有効である。抽出回数については、回収率やコストなどを総合的に考えると２〜３段階の抽出が望ましい。茶飲料製造などで廃棄物として問題になっている大量の茶殻を有効活用できることも本法の利点である。
【００３２】
こうして得られたカメリア属の茶葉由来の抽出物は、その固形分中に非重合型カテキン類を２〜９０重量％含有するのが好ましく、より好ましくは３〜１００重量％、特に好ましくは３．５〜９０重量％がよい。
また、（Ａ）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、（Ｂ）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、（Ｃ）カテキンガレート（Ｃｇ）、（Ｄ）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）とした時に、緑茶ベースに添加するカメリア属の茶葉由来の抽出物の量を少なくできる観点から、カメリア属の茶葉由来の抽出物としては、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上であることが好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．８０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．７０以上であることがより好ましい。
【００３３】
また、本発明でいうカメリア属の茶葉由来の精製物とは、カメリア属に分類される植物の茶葉由来のＥＣｇとＣｇ含量を高めた精製物のことを指す。前述のように１回あるいは複数回の抽出で得られたカメリア属の茶葉由来の抽出物の濃縮物や、市販のカテキン高含有原料から公知の精製方法に準じてＥＣｇとＣｇ含量を高めた精製物を得ることができる。市販のカテキン高含有原料としては、例えば三井農林（株）製「ポリフェノン」、太陽化学（株）製「サンフェノン」などがあり、これらを使用することもできる。公知の精製方法としては、合成吸着剤を使用した方法がある。合成吸着剤をカラムに充填し、カメリア属の茶葉由来の抽出物の濃縮物や、市販のカテキン高含有原料をカラムに負荷し、水や有機溶媒を通液し、目的成分が溶出する画分を回収する精製方法である。カラムを使用しないバッチ法も適用はできるが、効率面からはカラム法が望ましい。本発明に用いる合成吸着剤としては、その母体がスチレン系、例えばダイヤイオンＨＰ２０ 、セパビーズＳＰ７０、ＳＰ８５０ 、ＳＰ８２５、ＳＰ７００（三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ４、ＸＡＤ１６ＨＰ、ＸＡＤ２０００、（オルガノ社）、修飾スチレン系、例えばセパビーズＳＰ２０５（三菱化学（株）製）、メタクリル系、例えばダイヤイオンＨＰ１ ＭＧ（三菱化学（株）製）、アクリル系、例えばアンバーライトＸＡＤ７ＨＰ（オルガノ社）、フェノール系、例えばアンバーライトＸＡＤ７６１（オルガノ社）などが挙げられる。なかでも、スチレン系の合成吸着剤が非重合型カテキン類の分離に実績が多く、コストの点や製造スケールアップしやすい点から好ましい。特に汎用されているダイヤイオンＨＰ２０が望ましい。
【００３４】
前記合成吸着剤を用いてカメリア属の茶葉由来の抽出物をカラム法により分離する手法は、一般的な手法に準じればよい。非重合型カテキン類の分離・溶出に用いる溶離液としては、水や有機溶媒が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムなどが挙げられる。好ましくは、親水性のメタノール、エタノール、アセトンが挙げられ、より好ましくはエタノールが食品用途として好適である。溶離液のｐＨ調整や温度調整は特に必要ないが、目的成分の回収効率が高まるようなら適宜調整可能である。分画手法の一例を以下に示す。はじめに合成吸着剤が充填されたカラムを、例えば９９％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）によりＳＶ（空間速度）＝１〜１０で、合成吸着剤の２〜５倍量（ｖ／ｖ）通液し、洗浄を行う。次に分画スタート時の溶媒によりＳＶ＝１〜１０で、合成吸着剤の２〜５倍量（ｖ／ｖ）通液し、平衡化を行う。その後、カメリア属の各種茶葉抽出物をスタート時の溶媒で溶解させカラムに負荷する。目的のカテキン類が合成吸着剤にできる限り吸着するように、ＳＶは１０以下が望ましい。以降は、溶離液をＳＶ＝１〜１０、好ましくは１〜５で通液し、フラクションを得ればよい。溶離液は、アイソクラティックでも、ステップワイズに極性を変化させても、リニアグラジエントに極性を変化させてもよく、適した条件で実施すればよい。一般的には、スチレン系の合成吸着剤では溶離液の極性を低下させることにより、カテキン類の合成吸着剤への吸着能の差異により、順次溶出される。食用目的であるから水−エタノールの溶離液が好適であり、この場合、エタノール濃度を徐々に上げることが好適である。目的成分の溶出の確認は、各種分析機器、例えばＨＰＬＣなどで検出することで判別可能であり、また分画の条件が一定であれば本法の再現性の高さから、回収する画分は毎回一致する。
【００３５】
前記溶出工程において、目的成分が含有される画分を回収・合一することで、目的成分の精製度は顕著に上昇する。精製度を上げるためには、溶媒の極性を厳密にコントロールすることや、分画を細かくすること、回収画分の選定基準を引き上げることで調整可能である。求める精製度に応じて、カラム分画条件や回収条件を適用すればよい。合成吸着剤は、エタノールのような有機溶媒を通液し残存成分を脱離させることにより、再生できる。さらに水酸化ナトリウムなどのアルカリ水溶液を通液し洗浄してもよい。
【００３６】
目的成分、具体的にはＥＣｇ、Ｃｇが溶出された画分を合一した後、濃縮してエタノールなどの溶媒を除去する。緑茶飲料ベースに添加されるものであるため、エタノールなどの溶媒は除去されることが望ましい。濃縮方法は公知の方法に準じて行えばよい。例えば、常圧加熱乾燥法、減圧加熱乾燥法、凍結乾燥法、スプレードライ法などが挙げられる。加熱による成分変化を最小限に抑えるためとコスト面を考え、産業的には凍結乾燥法、スプレードライ法が好ましい。
【００３７】
本法によってカメリア属の茶葉由来の精製物が得られ、この固形分中には、非重合型カテキン類が５０〜１００質量％含有される。さらには、７０〜１００質量％含有されるのが好ましい。
また、緑茶ベースに添加するカメリア属の茶葉由来の精製物の量を少なくできる観点から、カメリア属の茶葉由来の精製物としては、（Ａ）ＥＣｇ、（Ｂ）ＥＧＣｇ、（Ｃ）Ｃｇ、（Ｄ）ＧＣｇとした時に、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上であることが好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が２．０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）は１．６以上であることがより好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が５．０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が４．０以上であることがさらに好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が１０．０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が８．０以上であることが最も好ましい。
【００３８】
また、本発明により得られる精製物中のＥＣｇおよびＣｇの総量は、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を期待する上から、全非重合型カテキン類中で、５０〜１００質量％であるのが好ましい。
【００３９】
なお、本発明により得られる精製物中の没食子酸濃度は、苦味、酸味などの呈味の点から低い方がよく、非重合型カテキン類に対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０〜０．１が好ましいが、没食子酸は、ＥＣｇやＣｇと合成吸着剤に対する吸着能が全く異なるために、回収画分に含有されることはないといえる。
【００４０】
本発明の緑茶飲料は、これまでに述べた「緑茶飲料ベース」に、カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物を添加し、緑茶風味を有しながら一般的な緑茶飲料とはカテキン組成が大きく異なる緑茶飲料を製造する。
【００４１】
緑茶飲料ベースとカメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物との組み合わせとしては、（１）緑茶飲料ベースおよびカメリア属の茶葉由来抽出物、
（２）緑茶飲料ベースおよびカメリア属の茶葉由来精製物、
（３）緑茶飲料ベースおよびカメリア属の茶葉由来抽出物およびカメリア属の茶葉由来精製物
の３通りがある。
これらの３通りの組み合わせのうち、どの組み合わせを選択するかには制限はないが、風味上の観点、求める機能性のグレードからのカテキン類組成設計、製造コスト、原料とするカメリア属植物の市場でのイメージを考えたマーケティング上の観点など様々あり、目的に最もあう組み合わせを選択することができる。
緑茶飲料の製造方法としては、具体的には、以下の３つの態様が挙げられる。
（１）カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
前記茶葉由来抽出物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含む緑茶飲料の製造方法。
（２）カメリア属の茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含む緑茶飲料の製造方法。
（３）前記（１）に記載のカメリア属の茶葉由来抽出物と、前記（２）に記載のカメリア属の茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程
を含む緑茶飲料の製造方法。
【００４２】
前記のように組み合わせる場合の各成分の配合量については、緑茶風味が保持されるように配合すべきであり、さらに最終的な緑茶飲料中のカテキン類の含有量が以下の関係が満たされるように配合する必要がある。
即ち、本発明の緑茶飲料では、（Ａ）ＥＣｇ、（Ｂ）ＥＧＣｇ、（Ｃ）Ｃｇ、（Ｄ）ＧＣｇとした時に、前記４成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであるように調整されている点に大きな特徴がある。
【００４３】
動脈硬化などの心血管病予防や治療を目的とした場合には、一般的な茶葉抽出液や、一般的な抽出方法により得た茶葉抽出液といった緑茶飲料では、十分量のＥＣｇやＣｇが含有されておらず、すなわち従来技術により得られる緑茶飲料では満足いく効果が得られない。例えば、特許文献６には、ＥＣｇを有効成分とするコレステロール排泄促進剤、排泄促進飲食品が示されているが、Ｃｇの有用性についての示唆はなく、また摂取しやすい緑茶飲料を提供するために、渋味・苦味を考慮したカテキン成分の構成に関する示唆もない。
【００４４】
そこで、心血管病リスクを低下させることを期待した緑茶飲料を設計するに当たり、本発明では、カメリア属の茶に含有されるカテキン類の中で極めてＬＯＸ−１アンタゴニスト活性の高いカテキン成分であるＥＣｇおよびＣｇを従来の緑茶飲料に添加することで、合理的に機能性を向上させた緑茶飲料となると予想した。このような根拠に基づきＥＣｇおよびＣｇの含量を共に高めた緑茶飲料は、これまでに報告された例がない。
【００４５】
しかしながら、ＥＣｇおよびＣｇや、緑茶にもともと含まれるカテキンの主成分であるＥＧＣｇはいずれも苦味・渋味のつよいガレート型カテキン類であり、単にＥＣｇやＣｇの含量を高めるだけでは、ＥＧＣｇなどの含量も高まるため緑茶飲料自体が極めて飲み難いものとなってしまうという問題がある。
【００４６】
そこで、本発明者らは、さらに創意工夫を加え、いずれも苦味・渋味のつよいガレート型カテキン、すなわち４種のＥＣｇとＣｇとＥＧＣｇとＧＣｇ間の含有量比をコントロールすることで、従来の緑茶飲料に比べてＬＯＸ−１アンタゴニスト活性が有意に強く、かつ遜色ない程度に苦なく飲用できる緑茶飲料となることを見出した。
具体的には、本発明の緑茶飲料では、緑茶に含まれるカテキン類で最も含量の高いＥＧＣｇに対し、続いて含量の高いカテキン類の一つであるＥＣｇをＥＣｇ／ＥＧＣｇ（重量比）が０．７以上になるように調整し、且ついずれも苦味・渋味の強いガレート型カテキン全体間で、具体的には（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）の重量比が０．６以上になるように調整する。
このような関係を満たすことで、一般の緑茶飲料に比べてＥＣｇとＣｇの含有比率が有意に高くなるから、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性に優れ、しかもＥＧＣｇの含有比率が抑えられることから苦味・渋味を抑えた緑茶飲料とすることができる。
【００４７】
さらに、本発明の緑茶飲料では、非重合型カテキン類の総量を３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬに調整することで、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を向上させながら、苦味や渋味の発現を極力に抑制するという、従来の緑茶飲料にはない好ましい効果を奏する緑茶飲料としている。
【００４８】
以上のように、本発明は、緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を高めるという動機のもとで、苦味や渋味を抑えて飲用の許容性を風味面からも担保するといった新しい手法を打ち立てることに初めて成功したものである。
【００４９】
本発明の緑茶飲料では、前記（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００（ｍｇ／５００ｍＬ）を満たすように配合量を考慮しながら組み合わせることが好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜８００（ｍｇ／５００ｍＬ）を満たすように配合量を考慮しながら組み合わせることがより好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜７００（ｍｇ／５００ｍＬ）を満たすように配合量を考慮しながら組み合わせることがさらに好ましい。
【００５０】
本発明の緑茶飲料では、一般的な緑茶飲料に比べて前記のように（Ａ）および（Ｃ）成分の含有量が強化されているが、これらの成分が有するＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を発現させ易くする観点から、緑茶飲料に含有される非重合型カテキン類総量中の（Ａ）成分および（Ｃ）成分の合計の含有比率は２０重量％以上に調整されていることが好ましく、２５重量％以上がより好ましい。また、含有比率の上限値については、特に限定はない。
【００５１】
また、本発明の設計思想であるＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を高める観点から（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）≧１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）以上となるように、緑茶飲料ベースにカメリア属の茶葉由来の抽出物や精製物を添加することが好ましい。より生理効果を期待するために（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）が２００（ｍｇ／５００ｍＬ）以上であることが好ましく、（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）が２４０（ｍｇ／５００ｍＬ）以上であることが更に好ましい。
【００５２】
前記（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）という式は、後述の実施例に記載のように緑茶飲料開発のための一つの指標として本発明者らが初めて見出したものであり、緑茶飲料５００ｍＬ中のＥＣｇ量＋Ｃｇ量＋（ＥＧＣｇの２／３量）の総量のことであり、緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を相対的に評価できる指標である。
これは、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性の強さを、後述実施例に記載のように、モデルラットを用いた動物試験にて比較した結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系ではＥＣｇのアンタゴニスト活性がＥＧＣｇに対し５倍強かった（特願２０１１‐２３６４４８号）のに対し、より生体内での有効性を反映すると考えられるｉｎ ｖｉｖｏの試験系ではＥＣｇがＥＧＣｇと比較して約１．５倍強い効果を示したことから導き出された指標である。すなわち、強いＥＣｇ量と、Ｃｇ量と、ＥＣｇなどよりもＬＯＸ−１アンタゴニスト活性が２／３程度のＥＧＣｇ量との総量が、緑茶飲料そのもののＬＯＸ−１アンタゴニスト活性の強さに比例することから導き出された指標である。そして、前記総量の数値が高いほどＬＯＸ−１アンタゴニスト活性は高くなり、特に総量が１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）以上である緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性は顕著に高いものとなる。
なお、一般の緑茶飲料では、ＥＧＣｇの量が最も多く、ＥＣｇやＣｇは微量成分であるため、一概に限定できないが、（Ａ）＋（Ｂ）２／３＋（Ｃ）は、１３０（ｍｇ／５００ｍＬ）未満となる傾向にある。
【００５３】
前記緑茶飲料ベースに、カメリア属の茶葉由来の抽出物や精製物を添加する際は、緑茶飲料ベースに直接添加しその後十分に混合し溶解させても良いし、カメリア属の茶葉由来の抽出物や精製物を溶媒に十分に溶解させた後に緑茶飲料ベースに添加しても良い。この場合の溶媒は、飲用に適するものなら何でも良いが、一般的に水が好ましい。
【００５４】
また、ｐＨ調整剤、安定剤、加工助剤、分散剤、シクロデキストリンなど物性改良、品質安定のために食品に一般に使用される添加物は、前記緑茶飲料の製造工程において必要に応じて使用可能である。
【００５５】
なお、長期保存が必要な商品、例えば容器詰め緑茶飲料にする場合には、殺菌工程時の熱によりカテキン類が変化する（例えばＥＧＣｇ→ＧＣｇ、ＥＣｇ→Ｃｇなど）ことが知られているから、殺菌後に前記のようなカテキン類の含量の条件が満たされるように、配合量と組み合わせを考慮する必要がある。また、長期保存でもカテキン類が変化する場合があるから、この点にも注意が必要である。
【００５６】
本発明の緑茶飲料は、長期保存を目的としない緑茶飲料として提供してもよい。この場合、非密閉容器、密閉容器など形態は制限されない。長期保存を目的とした場合には、スチール缶やアルミ缶などの金属製容器、紙や樹脂性パック、ＰＥＴなどの合成樹脂容器などの密閉容器に充填して提供することができる。この場合は、充填前の殺菌あるいは充填後の殺菌を公知の方法に準じて行えばよい。
【００５７】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
（実施例１：非重合型カテキン類のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性比較）
緑茶中に含まれる主要なガレート型カテキンである、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、および、カテキンガレート（Ｃｇ）を試料とし、「非重合型カテキン類」であるこれらのカテキン成分について、特願２０１１‐２３６４４８号の実施例より高濃度条件におけるＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を検討した。
組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は、ヒト由来ＬＯＸ−１の細胞外ドメインである。ｈｕｍａｎ ＬＯＸ−１ ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＭ００２５４３）のうち、細胞外ドメイン（ｅｘ−ｈＬＯＸ−１）をコードする領域（６１〜２７３番目の塩基配列）を、定法に従い発現、精製したものを使用した。組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は酸化ＬＤＬに対する結合能力を有していることを確認し、以下のＥＬＩＳＡによる試験用ＬＯＸ−１標品として用いることにした。
なお、前記酸化ＬＤＬは、Sawamura T, et al., Nature, 386:73-77,(1997)に記載の方法に準じて作製した。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）は、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ製）を用いて行った。上記のように精製した組換えｈＬＯＸ−１タンパク質を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）バッファーで調整し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、２０％イムノブロックを含むＰＢＳ（−）バッファー３００μＬを各ウェルにアプライした。２５℃で２時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／３μＭ 硫酸鉄（ＦｅＳＯ4）バッファーで１０μＭとなるように調整した各精製サンプルを５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、１μｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）バッファーで調整した酸化ＬＤＬを各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ａｎｔｉ−ＡｐｏＢ ＨＵＣ２０抗体（株式会社広島バイオメディカル社製）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体（ミリポア社製）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×５回で洗浄し、 ３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を５０μＬずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、０．５Ｍ Ｈ2ＳＯ4を５０μＬずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、ＬＯＸ‐１アンタゴニスト活性（ＬＯＸ‐１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害率）を定量した。図１に結果を示す。
【００６０】
図１は、実施例１で行ったｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬの結合率の結果を示している。ｈＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合時の吸光度を結合率１００％とし、各化合物存在時の吸光度を測定し、ｈＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合率で示した。抗ＬＯＸ−１抗体はｈＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を９５％以上阻害しており、酸化ＬＤＬの結合がほぼｈＬＯＸ−１を介したものであることが示唆される。
図１の結果より、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験ではＥＧＣｇにも高濃度存在時に酸化ＬＤＬ結合阻害活性が認められたことから、緑茶中に含まれる代表的な没食子酸エステルであるＥＣｇとＥＧＣｇのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性の差については、後述の実施例５で動物試験を行い比較した。
【００６１】
（実施例２：緑茶飲料ベースの製造）
＜煎茶を９０℃で抽出＞
煎茶茶葉（株式会社森徳）１５ｇを、水２，０００ｍＬ添加し、８０℃にて３分加熱した。抽出液をナイロンメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１（アドバンテック社）にて濾過し、緑茶飲料ベース１（試作品１）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６２】
＜玉露を水出し抽出＞
玉露茶葉（株式会社森徳）２１ｇを、水１，０００ｍＬ添加し、４℃に一夜静置した。抽出液をナイロンメッシュにて濾過し、緑茶飲料ベース２（試作品２）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６３】
（実施例３：カメリア属の茶葉由来抽出物の製造）
＜ほうじ茶を抽出＞
ほうじ茶茶葉「ほうじ茶Ｂ」（京都グレインシステム（株））１５ｇに対し、水５００ｍＬを添加し、１２０℃、１分間、オートクレーブ（三洋バイオメディカル社）によりにて抽出した。これを、メッシュろ過し、回収された茶殻に水７５０ｍＬを添加し、沸騰状態で２０分間抽出し、抽出液をナイロンメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１にて濾過し、カメリア属の茶葉由来抽出物４５０ｍＬを得た。得られた茶葉由来抽出物を凍結乾燥し、ほうじ茶葉由来抽出物を３７９．０ｍｇ得た（試作品３）。ＨＰＬＣによる定量（以降の実施例７の条件による）により、試作品３ ３７９．０ｍｇ中にＥＧＣｇ:８．４ｍｇ、ＥＣｇ：１７．４ｍｇ、Ｃｇ：５．７ｍｇ、ＧＣｇ：１．１ｍｇが検出され、ＥＣ、Ｃ、ＥＧＣ、ＧＣの４種の非重合型カテキンは、検出されなかった。また、(Ａ)ＥＣｇ／（Ｂ）ＥＧＣｇは、２．０、（（Ａ）ＥＣｇ＋（Ｃ）Ｃｇ）／（（Ｂ）ＥＧＣｇ＋（Ｄ）ＧＣｇ）は、２．４となった。必要に応じてこの作業を繰り返した。
また、得られた試作品３中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６４】
＜紅茶１を抽出＞
紅茶茶葉「セイロン オレンジペコー」（片岡物産（株））３０ｇに対し、１０００ｍＬの水を添加し、１２０℃、１分間、オートクレーブにより抽出した。エタノール４００ｍＬを添加し、５０℃にて１時間振とうした。これをメッシュ濾過し回収された茶殻に水を８００ｍＬ添加し、４℃にて一夜静置した。これをメッシュ濾過し得られた茶殻に対し水５００ｍＬを添加し、８０℃にて３時間加温抽出し、抽出液をナイロンメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１にて濾過し、カメリア属の茶葉由来の抽出物４６０ｍＬを得た。得られた茶葉由来の抽出物を凍結乾燥し、紅茶茶葉由来抽出物を４２５．０ｍｇ得た（試作品４）。ＨＰＬＣによる定量（以降の実施例７の条件による）により、試作品４ ４２５．０ｍｇ中にＥＧＣｇ:１．８ｍｇ、ＥＣｇ：１８．１ｍｇ、Ｃｇ：３．８ｍｇが検出され、ＧＣｇ、ＥＣ、Ｃ、ＥＧＣ、ＧＣの５種の非重合型カテキンは検出されなかった。(Ａ)／(Ｂ)は、９．８、（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））は、１１．９となった。必要に応じてこの作業を繰り返した。
なお、得られた試作品４中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６５】
＜紅茶２を抽出＞
紅茶茶葉「紅茶＃２９６９」（スリランカ産；ディンブラ）（京都グレインシステム（株））３ｇに対し、水２００ｍＬを添加し、８０℃にて２時間振とうした。これをメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１にて濾過し、カメリア属の茶葉由来の抽出物１９０ｍＬ（試作品５）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
なお、得られた試作品５中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６６】
（実施例４：カメリア属の茶葉由来の精製物の製造）
茶ポリフェノール抽出物「ポリフェノン７０Ｓ」（三井農林（株））５００ｇを１０００ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に溶解させ、茶ポリフェノール溶液を調製した。
次に、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学（株））を８．０Ｌ充填したカラムを作製し、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液にて平衡化した。このカラムに上記茶ポリフェノール溶液を通液し、各種茶ポリフェノール類を吸着させた。次いで、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液３０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、さらに２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液７．５Ｌを同様にＳＶ＝２〜３で通液し、これらは非回収画分とした。
その後、２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液２０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、目的のＥＣｇおよびＣｇを高濃度に含む溶出画分として、この溶出画分を全て回収した。回収した溶出液を常法により乾固し、固形物４４．７ｇを得た。ＨＰＬＣによる定量（以降の実施例７の条件による）により、本固形物中のＥＧＣｇ:１．７ｇ、ＥＣｇ：２４．８ｇ、Ｃｇ：３．１ｇ、ＧＣ：３．０ｇが検出され、Ｃ、ＥＣ、ＥＧＣ、ＧＣの４種の非重合型カテキンは検出されなかった。また、(Ａ)／(Ｂ)は、１４．６、（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））は、１６．４となった。
本法によりカメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
なお、得られた試作品６中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６７】
（実施例５：ＥＣｇの有効性試験）
図１の結果より、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験ではＥＧＣｇにも高濃度存在時に酸化ＬＤＬ結合阻害活性が認められたことから、緑茶中に含まれる代表的な没食子酸エステルであるＥＣｇとＥＧＣｇの有効性の差を、動物試験を行い比較した。
茶ポリフェノール抽出物「サンフェノン９０Ｓ」（太陽化学（株））５００ｇを１０００ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に溶解させ、茶ポリフェノール溶液を調製した。
次に、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学（株））を８．０Ｌ充填したカラムを作製し、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液にて平衡化した。このカラムに上記茶ポリフェノール溶液を通液し、各種茶ポリフェノール類を吸着させた。次いで、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液３０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、さらに２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液７．５Ｌを同様にＳＶ＝２〜３で通液し、これらは非回収画分とした。
その後、２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液２０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、目的のＥＣｇおよびＣｇを高濃度に含む溶出画分として、この溶出画分を全て回収した。回収した溶出液を濃縮し、クロロホルム５００ｍＬと水５００ｍＬで液液分配を３回行い、溶出画分中のカフェインの除去を行った後乾固し、ＨＰＬＣによりＥＣｇ画分を分取した。得られた画分を濃縮、乾固した精製物はＥＣｇのみを乾燥重量中７１．７％含有し、ＥＧＣｇ、カフェインなどを含まない精製物であることを確認し、以後の試験に使用した。
得られたＥＣｇの精製物を用いて、自然発症脳卒中モデルラット（ＳＨＲＳＰ／Ｉｚｍ系、雄、８週齢、日本クレア社製）の腸間膜動脈における脂質沈着に対する抑制能を評価した。
【００６８】
上記モデルラット１０匹を１群として、日本クレア社製の「Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ」（α―トコフェロール抜き、以下、コントロール食）および０．６％重量ＥＣｇ含有「Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ」（以下、ＥＣｇ含有食）、０．６％重量ＥＧＣｇ含有「Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ」(以下ＥＧＣｇ含有食)の３群で試験を行った。これらの固形飼料および生理食塩水（大塚製薬社製）については自由摂取の形態で行い、１週間を飼育期間とした。なお、１日おき、若しくは最終的な摂餌量および摂水量で両群に違いは見られなかった。また、自然発症脳卒中モデルラットを用いた腸間膜動脈の脂質沈着に関する実験は、既報（Japanese Circulation Journal, Vol.39, p601-609, 1975）を参考に、下記のように変法して行った。
【００６９】
コントロール食あるいはＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食による、１週間の経口投与をモデルラットに行った後に、イソフルランで吸入麻酔を行い、開腹・開胸を行った。開腹・開胸したラットから血清を採取し、さらに、腸間膜動脈を周囲脂肪組織とともに摘出し、摘出後にＰＢＳバッファー中でピンセットを用いながら腸間膜動脈の周囲脂肪組織を除去した。得られた腸間膜動脈を６０％イソプロパノールで洗浄・平衡化した後に、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液（和光純薬工業（株）製）による腸間膜動脈に沈着した脂質の染色を行い、６０％イソプロパノール／３０％イソプロパノール／ＰＢＳバッファーへと段階的にイソプロパノール濃度を下げながら脱色操作を行った。最終的に、顕微鏡下でＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色により染色された脂質沈着部の面積を計測した。
【００７０】
採取した血清より、コレステロールＥテストワコー、ＨＤＬコレステロールＥテストワコー、トリグリセライドＥテストワコー、リン脂質Ｃテストワコー（和光純薬工業（株）製）を用いて血中総コレステロール濃度（図２）、ＨＤＬコレステロール濃度（図３）、トリグリセライド濃度（図４）、リン脂質濃度（図５）をそれぞれ測定した。
図２〜５の結果より、コントロール食、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食を摂取したラット間で血中総コレステロール濃度、ＨＤＬコレステロール濃度、トリグリセライド濃度、リン脂質濃度に有意な差はみられなかった。
【００７１】
また、実施例５により得られた、腸間膜動脈における脂質沈着面積の測定結果（図６）および解析された実際の腸間膜動脈の写真（図７）を示す。この結果より、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液により染色された血管での脂質沈着面積は、ＥＣｇ含有食処理群、ＥＧＣｇ含有食群でともにコントロール食処理群に比べて有意に低下しており、特にその低下率はＥＧＣｇ含有食群の１．５倍（１．６／１．１）であった。この結果から、ＥＧＣｇの生理活性はＥＣｇの生理活性に対して約２／３の活性であるという詳細なデータが確認できた。
【００７２】
したがって、実施例１、５の結果から、ＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇを摂取することで、血中総コレステロール値などには大きな変動は及ぼさないものの、動脈硬化などの心血管病予防の予防に対しては顕著な効果を有することが明らかとなった。特に、高脂肪食により誘発される動脈硬化症などの心血管病は、ＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇを積極的に摂取することで効率よく抑制できると考えられる。
【００７３】
そこで、実施例１、５の結果から、緑茶飲料を評価するための一つの指標として、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性指標なるＬＡＶを定めた。ＬＡＶ（ＬＯＸ−１ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｖａｌｕｅを簡略化した造語）とは、緑茶飲料５００ｍＬ中のＥＣｇ量＋Ｃｇ量＋（ＥＧＣｇの２／３量）の総量のことであり、緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を相対的に評価できる指標である。なお、前記ＬＡＶにおいて緑茶５００ｍＬを基準としたのは、日本では緑茶の市販品は５００ｍＬの容量で販売されているのが一般的であり、一日の摂取量として換算されることからである。また、前記ＬＡＶが１３５ｍｇ／５００ｍＬ以上としたのは、実施例５で食事として与えたＥＣｇやＥＧＣｇの量を１日あたりに換算したところ、約１３５ｍｇになったためである。すなわち、緑茶飲料のＬＡＶが１３５ｍｇ／５００ｍＬ以上であることで、図６、７に示すような結果が期待できる。
【００７４】
なお、上記実施例５においてＥＣｇ含有食やＥＧＣｇ含有食を投与したラットは、投与していないラットと比べても体重増加率は変わらなかった。また、ＥＣｇ含有食やＥＧＣｇ含有食を投与したラットを開腹したところ、顕著な臓器異常も見られなかった。以上のことから、カメリア属の茶葉由来のＥＣｇ精製物やＥＧＣｇ精製物の安全性が高いことも明らかとなった。
【００７５】
（実施例６：緑茶飲料の製造と分析）
実施例２〜４で得た試作品を用いて、緑茶飲料を製造した。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）３００ｍｇを添加し、緑茶飲料（試作品７）を得た。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）６００ｍｇを添加し、緑茶飲料（試作品８）を得た。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）９００ｇを添加し、緑茶飲料（試作品９）を得た。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）１．２５ｇを添加し、緑茶飲料（試作品１０）を得た。
試作品７、８、１０を同様に作製し、それぞれに１２０℃、１０分の加熱殺菌をオートクレーブにより施し、試作品１１，１２、１３を得た。参考のために、試作品１も同様に加熱殺菌を施し、試作品１４とした。
緑茶飲料ベース２（試作品２）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の抽出物（試作品３）を４ｇ添加し、緑茶飲料（試作品１５）を得た。
緑茶飲料ベース２（試作品２）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の抽出物（試作品４）を６ｇ添加し、緑茶飲料（試作品１６）を得た。
緑茶飲料ベース２（試作品２）４００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の抽出物（試作品５）を１００ｍＬ、およびカメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）１００ｍｇを添加し、添加し、緑茶飲料（試作品１７）を得た。
なお、日本のメーカーＡ〜Ｇの７社から市販されている緑茶飲料１４品についても比較品１〜１４として使用した。
【００７６】
（実施例７：緑茶飲料および各社緑茶飲料のカテキン類分析）
次に、緑茶飲料（試作品１、２、５、７〜１７）および各社緑茶飲料（比較品１〜１４）のカテキン類分析を行った。その結果を表１、２に示す。
【００７７】
なお、ＨＰＬＣ分析条件を下記に示す。
カラム：逆相用カラム「ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ」（ナカライテスク、４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ；Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ；アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２８０ｎｍ
勾配（容量％）：９５％Ａ／５％Ｂから７０％Ａ／３０％Ｂまで２５分間、７０％Ａ／３０％Ｂから１００％Ｂまで２分間、１００％Ｂで８分間（全て直線）
【００７８】
検量線は、各種標準品、ＥＣ、Ｃ、ＧＣ、ＥＣｇ、Ｃｇ、ＧＣｇ、ＥＧＣｇ（全て和光純薬社製）を用いて作成した。また、各カテキン類のリテンションタイムと、没食子酸、カフェインのリテンションタイムには重なりがないことを確認した。
【００７９】
ＥＧＣについての定量は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより実施した。分析条件は以下の通りである。
カラム：逆相用カラム「ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ」（ＹＭＣ社製、２．０ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ）
移動相：Ａ；Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）， Ｂ；アセトニトリル（０．１％ギ酸）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出（質量分析）：ＥＳＩ、Ｎｅｇａｔｉｖｅモード（３２００ＱＴＲＡＰ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム、エービーサイエックス社製）
勾配（容量％）：９５％Ａ／５％Ｂから５０％Ａ／５０％Ｂまで１５分間、５０％Ａ／５０％Ｂから１００％Ｂまで２分間、１００％Ｂで８分間（全て直線）
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
【００８２】
表１、２の結果より、通常の緑茶飲料である試作品１、２、１４において、ＥＣｇ／ＥＧＣｇは０．７、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）は０．６よりそれぞれ低値であった。
カメリア属の茶葉由来抽出物、カメリア属の茶葉由来精製物、あるいはカメリア属の茶葉由来抽出物と精製物を添加して得られた試作品７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７においては、いずれもＥＣｇ／ＥＧＣｇは０．７以上、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）は０．６以上を示した。
また、試作品７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７の非重合型カテキン類の総量は、いずれも３００以上であった。
また、ＬＡＶ（ＥＣｇ＋Ｃｇ＋ＥＧＣｇ２／３（５００ｍｌ中））の値も、試作品１、２、１４は、１３５より低い値になっているが、試作品７〜１３、１５〜１７においてはいずれも１３５以上の値を示していた。
試作品５については非重合型カテキン類の総量が３００未満であり、ＬＡＶの値も１３５より低い値であった。
一方、比較品１〜１４はいずれもＥＣｇ／ＥＧＣｇは０．７、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）は０．６よりそれぞれ低値となっていた。
【００８３】
（実施例８：緑茶飲料の官能検査）
試作品７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、比較品３および苦渋い（苦味と渋味とを感じる）といわれる比較品１２、１３についてパネラー５人で試飲し、官能評価を行った。官能評価は、５人それぞれ、味良好：１、少し苦渋い：２、苦渋い：３、かなり苦渋い：４、飲み難い：５で評価し、５人の平均値を取り、
１以上１．５未満：味良好：◎、
１．５以上２．５未満：少し苦渋い：○、
２．５以上３．５未満：苦渋い：△、
３．５以上５以下：かなり苦渋い：×
とし、表３に示している。
【００８４】
【表３】
【００８５】
その結果、試作品７および１１は、苦渋みが顕著に低く非常に飲み易く、試作品８、１２、１５、１７は少し苦渋いものの市販品である比較品１２、１３よりは苦渋くなく飲めた。試作例９、１６は、市販品である比較品１２、１３と同程度の苦渋さがある飲料であった。
これに対して、比較品３は官能評価が少し苦い程度であったが、ＥＣｇ／ＥＧＣｇや、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）の比がそれぞれ０．７、０．６以下であり、且つＬＡＶ値も低いことからＬＯＸ−１アンタゴニストとしての効果が期待できない。
一方、非重合型カテキン類の総量が１１００ｍｇ／５００ｍＬを超える試作品１０、１３は、カテキンの量が多いため、苦味、渋味も強く飲料としては不向きであった。
したがって、苦味、渋味を抑えた飲料とするためには、非重合型カテキン類の総量が１１００ｍｇ／５００ｍＬ以下であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の緑茶飲料を継続的に摂取することで、血管内皮細胞やマクロファージなどで発現しているＬＯＸ-1への酸化ＬＤＬの結合を、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）やカテキンガレート（Ｃｇ）が効率的に阻害して、心血管病の予防効果や治療効果が期待される。カテキン類とＬＯＸ−１との関連性について詳細な検討はこれまで実施されておらず、本発明によって、これまでにない見地に立ち心血管病予防を目的とする緑茶飲料の設計が可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カメリア属である茶由来のＬＯＸ−１（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニストであるエピカテキンガレート（ＥＣｇ）およびカテキンガレート（Ｃｇ）の含有率を高めた、風味の良好な緑茶飲料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
緑茶は、日本では抹茶、煎茶などの飲料として、また、中国などでもジャスミン茶などの飲料としてよく飲まれてきたが、近年では、健康志向の高まりから、日本や中国だけでなく、欧米や他のアジア諸国でも緑茶ブームが起きている。
【０００３】
前記緑茶が人の健康に好適な影響を与える点については、例えば、心血管病リスクを低減させる可能性があることが従来から広く言われている。これは欧米諸国と比較して、日本人は喫煙率が高いにも関わらず、冠動脈疾患が少ないといった疫学データや、緑茶の抗動脈硬化を検証するヒト試験（例えば、非特許文献１）、あるいは多岐に渡る生体外（in vitro）の試験などから示唆されている。
【０００４】
緑茶飲料中には様々な成分が含まれるが、緑茶に特有の有効成分としてはカテキン類が知られている。これは、緑茶の原料であるカメリア属（Ｃａｍｅｌｌｉａ属）の葉には、他の植物に比べカテキン類が比較的大量に含有されることによる。前記カメリア属の茶葉由来のカテキン類として、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、カテキン（Ｃ）などのフラバン−３−オール類を始め、実に７０種類程度のカテキン類が単離され、構造が明らかにされている。
【０００５】
また、これらのカテキン類については、コレステロール上昇抑制作用（特許文献１）やアミラーゼ活性阻害作用（特許文献２）などを始め多くの薬理活性が知られている。カテキン類の血管系機能改善についても多く報告されており、ＣやＥＣによる血管系機能改善効果（特許文献３）、血清コレステロール値を低下させる効果（特許文献４〜７）が例示される。
しかしながら、上記の多く作用についてはその作用機序が明らかでないことから、多くのカテキン類の中で有用性を比較することは困難であり、所望の作用を発現するのに必要なカテキン類の最適な配合比を設計できないという根本的な課題が潜在している。
【０００６】
例えば、上記のように緑茶に抗動脈硬化作用があることは知られているが、その機序は、今なお十分には解明されてはいない。カテキンを用いた多くの試験から、その効能は緑茶中に多く含有されるカテキン類の効果であることが明らかにされており、ＥＧＣｇなどの一部のカテキン類については若干検討されている例があるものの、その他多くの個々のカテキン成分の効果の差異については、詳細に検討されていないのが現状である。
【０００７】
また、ガレート型カテキン類が特に腸管でのコレステロール吸収阻害活性が高いという報告があり、この理論からの商品設計がなされている例があるが、そもそも、人を含む動物は自身にコレステロール合成経路を持ち合わせる中、腸管でのコレステロールの吸収を阻害することでの動脈硬化抑制効果は非常に限定的であると推測される。加えて、近年、血中コレステロール値と動脈硬化の因果関係について、日本脂質栄養学会が従来の見解と異なった新たなガイドラインを発表するなど(非特許文献２)、必ずしも血中コレステロール値の抑制だけで動脈硬化や心血管病を根源的に予防できるとは言えないのが現状である。
【０００８】
緑茶に含まれるカテキン類については、その含有量が報告されている。具体的には、緑茶としての玉露、煎茶、釜炒り茶、番茶、ほうじ茶についての分析値の報告があり、報告によっては多少のバラつきがあるが、主要なカテキン類は、ＥＧＣｇ、ＥＧＣ、ＥＣｇおよびＥＣの４種である。中でも最も含有されるのはＥＧＣｇでありカテキン類全体の５０〜６０％を占める。一方、その他のカテキン類の含有量は微量である。例えば、ＥＣｇは主要カテキン成分の一つとされているものの、ＥＧＣｇの含量には及ばず、ＥＧＣｇ含量に対して、茶の種類の間で差はあるものの約１／４〜１／５前後である。ましてや、Ｃｇに至っては、前述したように微量成分でありＥＧＣｇ含量にははるかに及ばない（例えば、非特許文献３を参照）。
飲用に用いる緑茶飲料は、茶葉を湯や水で抽出したものであるから、緑茶飲料中のカテキン類の構成も茶葉と類似した比率になる。
【０００９】
ところで、前記カテキン類はポリフェノールに属し、苦味や渋味が強いことが知られている。このカテキン類の苦味や渋味の呈味性や、苦味や渋味の閾値についての研究もされており、個々のカテキン類によって、それぞれ苦味や渋味の強度が異なることが知られている。一般にガレート基が結合したガレート型カテキン類は、非ガレート型カテキン類に比べると、苦味や渋味が強い。例えば、ガレート型カテキン類であるＥＧＣｇ、ＥＣｇ、ＣｇおよびＧＣｇは、これらの間での苦味や渋味に大差はないものの、ＥＧＣやＥＣなどの非ガレート型カテキン類よりも苦味や渋味が強いことが示されており、中でもＥＧＣｇ、ＥＣｇの苦味・渋味閾値濃度は３倍程度低いとされている（非特許文献４）。
したがって、緑茶飲料やカテキン含有食品を調整するに際し、苦味や渋味の制御は、当業者において大きな課題となっており、目的に応じた呈味性や風味制御についての先行技術をあげると枚挙に暇がない。
【００１０】
また、苦味や渋味以外にも、カテキン類の含有比や含有量を様々な目的から制御あるいは調整する試行はすでに多くなされ、開示されている。例えば、沈殿防止に関するもの（特許文献８、９）、変色防止に関するもの（特許文献１０、１１）、機能性に関するもの（特許文献１２、１３）、苦味や渋味の調整や茶本来の風味付与に関するもの（特許文献１４〜１６）など用途や目的は多岐に渡っている。
【００１１】
しかし、風味に配慮しつつＥＣｇおよびＣｇ含量を高めるという本願の目的と一致した先行技術は開示されていない。そればかりか、そもそもＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇ、ＧＣｇのようなガレート型カテキンは苦味や渋味が強い成分であることから、これらの含量が高い緑茶飲料は必然的に、苦味や渋味が一般の緑茶よりも高まることになる。ガレート型カテキンの含有量を従来品より高めた緑茶も市販され、市場に受け入れられているからある程度の苦味や渋味は許容されると思われるものの、やはりガレート型カテキンの含有量を高めすぎると苦味や渋味が強くなりすぎて摂取しづらい緑茶飲料となってしまう傾向にある。
したがって、上記のような４種類のガレート型カテキンの総含有量については苦味、渋味の程度を決める指標として着目されていたものの、４種類の含有量比をコントロールするアプローチは従来ではなされていない。
【００１２】
例えば、特許文献１７〜２０などは、非エピ体カテキン類とエピ体カテキン類の含有比率を特定した飲料に関するものであるが、これらは飲料の長期保存時の沈殿発生防止や色調の安定性や風味改善に関する技術であり、また非エピ体カテキン類とエピ体カテキン類の含有比率について特徴があるものの、ともにエピ体であるＥＣｇとＥＧＣｇとの間の比率については言及しておらず、示唆すらもない。より詳細に述べると、例えば、特許文献１８においては、（Ａ）非エピ体カテキン類、（Ｂ）エピ体カテキン類として、（Ａ）／（Ｂ）＝０．５４〜９．０になるように調整する容器詰飲料が示されているが、ＥＣｇとＥＧＣｇは共に（Ｂ）エピ体カテキン類に属する成分であり、双方の比率について何ら規定されるべき数式になっていない。
【００１３】
同様に、特許文献２１では、エステル型カテキンと遊離型カテキンの比率を特定した飲料に関するもので、機能性が優れたエステル型カテキン量を高めながら苦味や渋味を抑えるための技術である。しかしながら、ともにエステル型であるＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇ、ＧＣｇ間の比率については言及しておらず、示唆すらもない。
同様に、特許文献２２、２３では、機能性が優れたエステル型カテキン含有比率を高めた飲食物に関するものであるが、ＥＣｇは血清コレステロール低下効果がエステル型カテキンの中で最も小さいとされており、ＥＣｇ含量を低めている点で、本願とは方針が異なっている。
特許文献２４、２５については、非重合型カテキン類中の非重合体カテキンガレート体類の割合を特定しているが、歯への色素沈着防止や色相変化抑制に関する技術であり、また、ともにガレート体であるＥＣｇとＥＧＣｇとの間の割合については言及しておらず、示唆すらもない。
【００１４】
また、仮に何らかの理由で、ＥＣｇとＥＧＣｇとの間の比率を調整しようにも、現在の技術ではＥＣｇ／ＥＧＣｇ比（重量比）を０．５以上にすることは容易ではない。なぜならば、各種のカメリア属の茶抽出エキスは、おのずとその構成カテキン成分も茶葉と類似した比率になるため、カテキン類のなかで最も主成分であるＥＧＣｇがＥＣｇよりもはるかに高い比率になる。精製されたカテキン成分が業務用に販売されてはいるが、このカテキン成分はもっぱらＥＧＣｇである（例えば、太陽化学社製「ＥＧＣｇ」、ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社「Ｔｅａｖｉｇｏ」）。これは、従来からＥＧＣｇが、一定の健康機能効果を有する成分として知られていること、およびカメリア属の茶葉中の主要カテキン成分であることから産業上の利用価値が高いことが主な理由である。よって、他の個々のカテキン成分や、より具体的にはＥＣｇを産業用に精製した工業製品は知られていない。
したがって、現在の産業界の状況下においては、ＥＣｇ／ＥＧＣｇ比（重量比）を小さくすることは容易であるが、０．５以上にまで高めることは困難であり、またそのための目的も存在していないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第１６２０９４３号公報
【特許文献２】特許第３０１８０１３号公報
【特許文献３】特表２００９−５０１１６１号公報
【特許文献４】特開昭６０−１５６６１４号公報
【特許文献５】特開昭６２−３０７１１号公報
【特許文献６】特許第２８１２６８２号公報
【特許文献７】特開２００４−２６２９２７号公報
【特許文献８】特許第３５９７８３６号公報
【特許文献９】特許第３５９７８５９号公報
【特許文献１０】特許第３７９５５０６号公報
【特許文献１１】特許第４３８３３３２号公報
【特許文献１２】特開平６−５６６８６号公報
【特許文献１３】特許第３７５６４３８号公報
【特許文献１４】特許第３５９００２７号公報
【特許文献１５】特許第３５９７８５６号公報
【特許文献１６】特許第３５９７８５７号公報
【特許文献１７】特許第３３２９７９９号公報
【特許文献１８】特許第３３３８７０５号公報
【特許文献１９】特許第３３４２６９８号公報
【特許文献２０】特許第３３６００７３号公報
【特許文献２１】特許第３９８１１０８号公報
【特許文献２２】特許第４４９４３７３号公報
【特許文献２３】特許第４３１７７８１号公報
【特許文献２４】特許第３５９７８５４号公報
【特許文献２５】特許第３５９７８５５号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｎｕｔｒ．２００５ Ｏｃｔ；２４（５）：３４２−３４６）
【非特許文献２】長寿のためのコレステロールガイドライン２０１０年度版 中日出版社
【非特許文献３】「茶の科学」ｐ８８−８９（朝倉書店）
【非特許文献４】「食品の変色の化学」、ｐ１２４−ｐ１２５（光琳）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者らは、より根本的に心血管病予防効果の期待できる化合物を同定すべく、酸化ＬＤＬによる血管内皮細胞への作用を媒介する受容体であるレクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体(ＬＯＸ−１)に着目し、強力なＬＯＸ−１アンタゴニストを同定するに至り、その作用・効果について詳細に報告している（特願２０１１‐２３６４４８号）。同時に、これらの化合物のうち、実用性の高い化合物が茶に存在することも明らかにしており、これらがＥＣｇとＣｇの２種のカテキンであることを初めて明らかにした。ただし、緑茶カテキン類の主要成分であるＥＧＣｇは、アンタゴニスト活性を有するものの、ＥＣｇと比較して１／５、Ｃｇと比較しても１／２程度の低い活性であった。
【００１８】
そこで、本発明者らは、より健康機能性が期待される緑茶飲料の開発を目的として、すでに本発明者らが発見した強力なＬＯＸ−１アントゴニスト剤であるＥＣｇおよびＣｇに着目し、新規な観点から緑茶を設計した結果、従来の緑茶製品においてカテキン類として微量成分であったＥＣｇおよびＣｇの含有量を選択的に高めて、カテキン類の主成分であるＥＧＣｇに対するＥＣｇの含有量の比率を顕著に高めることで、従来の緑茶飲料に比べて、ＥＣｇおよびＣｇに由来する生理活性を付与しながら、苦味や渋味を極力抑えた緑茶飲料を完成するに至った。また、同時に、鋭意検討した結果、カメリア属の茶葉から得た茶葉抽出物を緑茶に配合すること、或いは、カメリア属の茶葉由来の抽出物を合成吸着剤により精製した茶葉由来精製物を緑茶に配合することで前記緑茶飲料を効率よく得る製造方法を確立するに至った。
【００１９】
したがって、本発明は、ＥＣｇ、Ｃｇなどの非重合型カテキン類を高含有しながら渋味や苦味を極力抑えた緑茶飲料およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕（Ａ）エピカテキンガレート、（Ｂ）エピガロカテキンガレート、（Ｃ）カテキンガレートおよび（Ｄ）ガロカテキンガレートを含有し、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分を含む非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであることを特徴とする緑茶飲料、
〔２〕非重合型カテキン類総量中の（Ａ）成分および（Ｃ）成分の合計の含有比率が２０重量％以上である前記〔１〕記載の緑茶飲料、
〔３〕（Ａ）成分、（Ｂ）成分および（Ｃ）成分の含有量が、以下の式：
（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）≧１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）
を満たす前記〔１〕または〔２〕記載の緑茶飲料、
〔４〕カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物と緑茶抽出液とを混合してなり、
前記カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物中の（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の緑茶飲料、
〔５〕カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
前記茶葉由来抽出物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の緑茶飲料の製造方法、
〔６〕カメリア属の茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の緑茶飲料の製造方法、並びに
〔７〕カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記カメリア属の茶葉由来抽出物と、前記カメリア属の茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程
を含むことを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の緑茶飲料の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、優れた健康機能性が期待されるエピカテキンガレート（ＥＣｇ）、カテキンガレート（Ｃｇ）などの非重合型カテキン類を高含有しながら渋味や苦味を極力抑えるというように、従来の緑茶飲料に比べてより健康を維持しやすく、しかも飲み易い緑茶飲料およびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例1における、各化合物のｈＬＯＸ−１タンパク質（ヒト由来組換え型ＬＯＸ−１タンパク質）に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の結果を示すグラフである。縦軸は、化合物未添加の場合の酸化ＬＤＬ結合阻害能を１００とした場合の、各化合物が有する酸化ＬＤＬ結合阻害能の相対値を示す。相対値が低いほど、酸化ＬＤＬ結合阻害能が高いことを示す。
【図２】図２は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中総コレステロール濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図３】図３は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中ＨＤＬコレステロール濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図４】図４は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中トリグリセライド濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図５】図５は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの血中リン脂質濃度を、１群ｎ＝８で試験し測定した結果の平均値をグラフ化したものである。
【図６】図６は、実施例５の実験の、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食またはコントロール食を摂取したラットの各腸間膜動脈における脂質沈着をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏにより染色し、腸間膜動脈総面積に占める脂質沈着部位の面積の割合を、１群をｎ＝８で試験し測定した平均値の結果をグラフ化したものである。この場合、５％未満の危険率で有意差のあることを示している。
【図７】図７は、実施例５の実験の、精製物含有食またはコントロール食を摂取したラットの各腸間膜動脈における脂質沈着をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏにより染色した全体図を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本発明で使用するカテキン類は全て「非重合型カテキン類」のことを指し、さらに「非重合型カテキン類」とは、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）のエピ体カテキン類、および、カテキンガレート（Ｃｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）の非エピ体カテキン類をあわせての総称である。
【００２４】
本発明でいう緑茶飲料とは、茶葉から製茶された「緑茶茶葉」から水や熱水、抽出助剤を添加した水溶液で抽出して得られた緑茶抽出液（「緑茶飲料ベース」という）と、カメリア属の茶葉由来抽出物やその精製物とからなる、緑茶風味が保持された飲料のことを指す。
【００２５】
ここでいう「緑茶茶葉」は、製茶製造過程の第一段階で加熱によって茶葉の酵素活性を失わせ、成分の酸化を防ぎ、緑色を保たせた不発酵茶のことであり、加熱に蒸気を使う煎茶、玉露、天茶、番茶、茎茶、玉緑茶などを指す。ただし、更に焙煎処理が施される茶、例えば、ほうじ茶は成分や風味が大きく「緑茶茶葉」と異なるために、本発明でいうところの「緑茶茶葉」には含まれない。また、半発酵茶である烏龍茶、強発酵茶である紅茶、後発酵茶である黒茶などは、不発酵茶と分類上分けられるため、ここでいう「緑茶茶葉」に含有されない。当該製茶された「緑茶茶葉」としては、日本で最も一般的な「煎茶」、「玉露」が特に好ましい。「緑茶茶葉」は、カメリア属の茶葉であるが、カメリア属のなかで、例えばＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ａｓｓａｍｉｃａ、やぶきた種、べにふうき種、またはそれらの雑種があげられる。
【００２６】
本発明の緑茶飲料において、ベースとなる緑茶抽出液は、前記緑茶茶葉から、一般的な、あるいは従来法で得られる。抽出に用いる水の量は、緑茶茶葉に対して５〜１００重量倍量、特に５〜８０倍量が好ましい。抽出温度は、０℃〜１００℃、好ましくは２０℃〜９５℃、さらに好ましくは４０〜９０℃である。温度によって得られる緑茶抽出液の風味や成分が異なるため、目的に応じて温度を選択すればよい。抽出時間は、抽出方法、装置の種類、装置の大きさ、処理量といったスケールの大きさによって様々であり、目的の風味や成分組成になるように、状況に適した抽出時間を設定すればよい。ただし、製造時の時間的なコストを考えると１〜１００分、好ましくは１〜８０分がよい。抽出時の溶媒は水であり、工業用水、上水、蒸留水、脱イオン水など制限はないが、雑味が少ないこと、沈殿が発生しにくいこと、変色が抑えられることおよびコストから考えると脱イオン水が好適である。
【００２７】
前記緑茶抽出液の抽出方法は、緑茶茶葉を水に浸漬し抽出する方法（浸漬法）、緑茶茶葉を水と混合攪拌し抽出する方法（攪拌法）、緑茶茶葉をカラムに充填し水を通水させ抽出する方法（カラム法）があり、それらのいずれでもよい。繰り返しの抽出を行う場合は、カラム法が効率的である。また、抽出時やその後の酸化による劣化を防ぐ目的で、アスコルビン酸やアスコルビン酸ナトリウムなどの抗酸化剤を水に添加してもよい。あるいは窒素ガスなどを使用して脱酸素条件下で抽出しても良い。ｐＨを調整や抽出効率から炭酸水素ナトリウムなどの助剤をあらかじめ水に添加してもよい。
【００２８】
緑茶抽出液は、沈殿の存在や、その後の沈殿発生のリスクを考え、状況に応じて濾過処理する。例えば、濾紙、ナイロンメッシュ、珪藻土などで適宜ろ過すればよい。緑茶抽出液は、そのままベースにしてもよいし、風味や成分量を考えて、水を添加し希釈してベースにしてもよい。ただし、希釈は緑茶の風味が十分に保たれる程度にする。ベースにする緑茶抽出液中のカテキン成分については、その含量やガレート型カテキン類の種類の構成は特に制限はない。ただし、本発明の緑茶飲料のガレート型カテキン類の含量や構成は、緑茶飲料ベースと添加する茶葉由来抽出物・精製物の２要素に依存する。したがって、後述のカメリア属の茶葉由来の抽出物やその精製物中のカテキン成分含量や構成次第では、目的とする緑茶飲料の条件を満たすために、所望のガレート型カテキン類の含量や構成を有する緑茶飲料ベースを適宜に選択する場合も生じることがある。
【００２９】
一方、本発明でいうカメリア属の茶葉由来の抽出物とは、カメリア属に分類される植物の茶葉由来の抽出物であれば制限はない。原料としては、例えば、チャ（カメリア シネンシス）があげられる。なかでも、日常的に飲用されている、不発酵茶である各種緑茶、半発酵茶である烏龍茶、強発酵茶である紅茶、後発酵茶である黒茶、プーアル茶などが、安全性が高く、安心感もあり、また原材料が入手しやすい観点から好ましい。また、一般に、ＥＣｇ含有率が比較的高いほうじ茶や紅茶は、更に好ましい。また、不発酵茶である緑茶においては、ＥＣｇ含量が比較的高い「釜炒り茶」や紅ふうき種が、緑茶風味を有することからもさらに好ましい。
【００３０】
カメリア属の茶葉由来の抽出物の抽出方法について述べる。原料茶葉を水や有機溶媒、あるいはこれらを組み合わせ、公知の方法により実施できる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムなどが挙げられる。好ましくは、親水性のメタノール、エタノール、アセトンが挙げられ、より好ましくはエタノールが食品用途としては適している。抽出方法としては、浸漬し静置抽出、浸漬し攪拌抽出、加温抽出、加温加圧抽出、還流抽出、あるいはカラムに原料を充填し、繰り返し抽出してもよい。超臨界抽出方法などを適用することもできる。短時間で効率的に抽出する観点からは、加温抽出や加温加圧抽出が望ましい。抽出温度や抽出時間は、茶葉や溶媒の量、茶葉や溶媒の種類、抽出装置や抽出スケールにより適宜選択すればよい。抽出された溶液は、そのまま用いてもよく、濃縮してもよく、溶媒を除去し固形状にしてもよい。すなわち該茶葉由来抽出物は、固体でも液体でもスラリー状でも構わなく、用途やコストに応じて調製すればよい。
【００３１】
カメリア属の茶葉由来の抽出物は、最終的に前記の緑茶飲料ベースに添加されるものであるから、原料として使用する茶葉が緑茶と異なる場合には、緑茶風味を害さないように留意する必要がある。この観点では、複数回の前段階抽出を実施し、使用する茶葉固有の好ましくない風味を除去して得られた茶殻から再度抽出し、目的に応じたガレート型カテキン類を多く含有する抽出物を得ることが望ましい。例えば、前段階の抽出時に得られる抽出液は用いず、ここで回収した茶殻に対し更に抽出を実施して得られた抽出液を回収すれば、好ましくない茶葉固有の風味は低減しつつ、ある程度の目的の成分は回収できる。一般に雑味成分は水で抽出されやすく、目的成分であるガレート型カテキン類は雑味成分に比べると水で抽出されにくい傾向があるために、この手法が有効である。前段階の抽出は水やエタノールなどの有機溶媒や、これらを組み合わせた抽出が有効である。抽出回数については、回収率やコストなどを総合的に考えると２〜３段階の抽出が望ましい。茶飲料製造などで廃棄物として問題になっている大量の茶殻を有効活用できることも本法の利点である。
【００３２】
こうして得られたカメリア属の茶葉由来の抽出物は、その固形分中に非重合型カテキン類を２〜９０重量％含有するのが好ましく、より好ましくは３〜１００重量％、特に好ましくは３．５〜９０重量％がよい。
また、（Ａ）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、（Ｂ）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、（Ｃ）カテキンガレート（Ｃｇ）、（Ｄ）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）とした時に、緑茶ベースに添加するカメリア属の茶葉由来の抽出物の量を少なくできる観点から、カメリア属の茶葉由来の抽出物としては、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上であることが好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．８０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．７０以上であることがより好ましい。
【００３３】
また、本発明でいうカメリア属の茶葉由来の精製物とは、カメリア属に分類される植物の茶葉由来のＥＣｇとＣｇ含量を高めた精製物のことを指す。前述のように１回あるいは複数回の抽出で得られたカメリア属の茶葉由来の抽出物の濃縮物や、市販のカテキン高含有原料から公知の精製方法に準じてＥＣｇとＣｇ含量を高めた精製物を得ることができる。市販のカテキン高含有原料としては、例えば三井農林（株）製「ポリフェノン」、太陽化学（株）製「サンフェノン」などがあり、これらを使用することもできる。公知の精製方法としては、合成吸着剤を使用した方法がある。合成吸着剤をカラムに充填し、カメリア属の茶葉由来の抽出物の濃縮物や、市販のカテキン高含有原料をカラムに負荷し、水や有機溶媒を通液し、目的成分が溶出する画分を回収する精製方法である。カラムを使用しないバッチ法も適用はできるが、効率面からはカラム法が望ましい。本発明に用いる合成吸着剤としては、その母体がスチレン系、例えばダイヤイオンＨＰ２０ 、セパビーズＳＰ７０、ＳＰ８５０ 、ＳＰ８２５、ＳＰ７００（三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ４、ＸＡＤ１６ＨＰ、ＸＡＤ２０００、（オルガノ社）、修飾スチレン系、例えばセパビーズＳＰ２０５（三菱化学（株）製）、メタクリル系、例えばダイヤイオンＨＰ１ ＭＧ（三菱化学（株）製）、アクリル系、例えばアンバーライトＸＡＤ７ＨＰ（オルガノ社）、フェノール系、例えばアンバーライトＸＡＤ７６１（オルガノ社）などが挙げられる。なかでも、スチレン系の合成吸着剤が非重合型カテキン類の分離に実績が多く、コストの点や製造スケールアップしやすい点から好ましい。特に汎用されているダイヤイオンＨＰ２０が望ましい。
【００３４】
前記合成吸着剤を用いてカメリア属の茶葉由来の抽出物をカラム法により分離する手法は、一般的な手法に準じればよい。非重合型カテキン類の分離・溶出に用いる溶離液としては、水や有機溶媒が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムなどが挙げられる。好ましくは、親水性のメタノール、エタノール、アセトンが挙げられ、より好ましくはエタノールが食品用途として好適である。溶離液のｐＨ調整や温度調整は特に必要ないが、目的成分の回収効率が高まるようなら適宜調整可能である。分画手法の一例を以下に示す。はじめに合成吸着剤が充填されたカラムを、例えば９９％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）によりＳＶ（空間速度）＝１〜１０で、合成吸着剤の２〜５倍量（ｖ／ｖ）通液し、洗浄を行う。次に分画スタート時の溶媒によりＳＶ＝１〜１０で、合成吸着剤の２〜５倍量（ｖ／ｖ）通液し、平衡化を行う。その後、カメリア属の各種茶葉抽出物をスタート時の溶媒で溶解させカラムに負荷する。目的のカテキン類が合成吸着剤にできる限り吸着するように、ＳＶは１０以下が望ましい。以降は、溶離液をＳＶ＝１〜１０、好ましくは１〜５で通液し、フラクションを得ればよい。溶離液は、アイソクラティックでも、ステップワイズに極性を変化させても、リニアグラジエントに極性を変化させてもよく、適した条件で実施すればよい。一般的には、スチレン系の合成吸着剤では溶離液の極性を低下させることにより、カテキン類の合成吸着剤への吸着能の差異により、順次溶出される。食用目的であるから水−エタノールの溶離液が好適であり、この場合、エタノール濃度を徐々に上げることが好適である。目的成分の溶出の確認は、各種分析機器、例えばＨＰＬＣなどで検出することで判別可能であり、また分画の条件が一定であれば本法の再現性の高さから、回収する画分は毎回一致する。
【００３５】
前記溶出工程において、目的成分が含有される画分を回収・合一することで、目的成分の精製度は顕著に上昇する。精製度を上げるためには、溶媒の極性を厳密にコントロールすることや、分画を細かくすること、回収画分の選定基準を引き上げることで調整可能である。求める精製度に応じて、カラム分画条件や回収条件を適用すればよい。合成吸着剤は、エタノールのような有機溶媒を通液し残存成分を脱離させることにより、再生できる。さらに水酸化ナトリウムなどのアルカリ水溶液を通液し洗浄してもよい。
【００３６】
目的成分、具体的にはＥＣｇ、Ｃｇが溶出された画分を合一した後、濃縮してエタノールなどの溶媒を除去する。緑茶飲料ベースに添加されるものであるため、エタノールなどの溶媒は除去されることが望ましい。濃縮方法は公知の方法に準じて行えばよい。例えば、常圧加熱乾燥法、減圧加熱乾燥法、凍結乾燥法、スプレードライ法などが挙げられる。加熱による成分変化を最小限に抑えるためとコスト面を考え、産業的には凍結乾燥法、スプレードライ法が好ましい。
【００３７】
本法によってカメリア属の茶葉由来の精製物が得られ、この固形分中には、非重合型カテキン類が５０〜１００質量％含有される。さらには、７０〜１００質量％含有されるのが好ましい。
また、緑茶ベースに添加するカメリア属の茶葉由来の精製物の量を少なくできる観点から、カメリア属の茶葉由来の精製物としては、（Ａ）ＥＣｇ、（Ｂ）ＥＧＣｇ、（Ｃ）Ｃｇ、（Ｄ）ＧＣｇとした時に、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上であることが好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が２．０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）は１．６以上であることがより好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が５．０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が４．０以上であることがさらに好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が１０．０以上且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が８．０以上であることが最も好ましい。
【００３８】
また、本発明により得られる精製物中のＥＣｇおよびＣｇの総量は、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を期待する上から、全非重合型カテキン類中で、５０〜１００質量％であるのが好ましい。
【００３９】
なお、本発明により得られる精製物中の没食子酸濃度は、苦味、酸味などの呈味の点から低い方がよく、非重合型カテキン類に対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０〜０．１が好ましいが、没食子酸は、ＥＣｇやＣｇと合成吸着剤に対する吸着能が全く異なるために、回収画分に含有されることはないといえる。
【００４０】
本発明の緑茶飲料は、これまでに述べた「緑茶飲料ベース」に、カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物を添加し、緑茶風味を有しながら一般的な緑茶飲料とはカテキン組成が大きく異なる緑茶飲料を製造する。
【００４１】
緑茶飲料ベースとカメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物との組み合わせとしては、（１）緑茶飲料ベースおよびカメリア属の茶葉由来抽出物、
（２）緑茶飲料ベースおよびカメリア属の茶葉由来精製物、
（３）緑茶飲料ベースおよびカメリア属の茶葉由来抽出物およびカメリア属の茶葉由来精製物
の３通りがある。
これらの３通りの組み合わせのうち、どの組み合わせを選択するかには制限はないが、風味上の観点、求める機能性のグレードからのカテキン類組成設計、製造コスト、原料とするカメリア属植物の市場でのイメージを考えたマーケティング上の観点など様々あり、目的に最もあう組み合わせを選択することができる。
緑茶飲料の製造方法としては、具体的には、以下の３つの態様が挙げられる。
（１）カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
前記茶葉由来抽出物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含む緑茶飲料の製造方法。
（２）カメリア属の茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含む緑茶飲料の製造方法。
（３）前記（１）に記載のカメリア属の茶葉由来抽出物と、前記（２）に記載のカメリア属の茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程
を含む緑茶飲料の製造方法。
【００４２】
前記のように組み合わせる場合の各成分の配合量については、緑茶風味が保持されるように配合すべきであり、さらに最終的な緑茶飲料中のカテキン類の含有量が以下の関係が満たされるように配合する必要がある。
即ち、本発明の緑茶飲料では、（Ａ）ＥＣｇ、（Ｂ）ＥＧＣｇ、（Ｃ）Ｃｇ、（Ｄ）ＧＣｇとした時に、前記４成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであるように調整されている点に大きな特徴がある。
【００４３】
動脈硬化などの心血管病予防や治療を目的とした場合には、一般的な茶葉抽出液や、一般的な抽出方法により得た茶葉抽出液といった緑茶飲料では、十分量のＥＣｇやＣｇが含有されておらず、すなわち従来技術により得られる緑茶飲料では満足いく効果が得られない。例えば、特許文献６には、ＥＣｇを有効成分とするコレステロール排泄促進剤、排泄促進飲食品が示されているが、Ｃｇの有用性についての示唆はなく、また摂取しやすい緑茶飲料を提供するために、渋味・苦味を考慮したカテキン成分の構成に関する示唆もない。
【００４４】
そこで、心血管病リスクを低下させることを期待した緑茶飲料を設計するに当たり、本発明では、カメリア属の茶に含有されるカテキン類の中で極めてＬＯＸ−１アンタゴニスト活性の高いカテキン成分であるＥＣｇおよびＣｇを従来の緑茶飲料に添加することで、合理的に機能性を向上させた緑茶飲料となると予想した。このような根拠に基づきＥＣｇおよびＣｇの含量を共に高めた緑茶飲料は、これまでに報告された例がない。
【００４５】
しかしながら、ＥＣｇおよびＣｇや、緑茶にもともと含まれるカテキンの主成分であるＥＧＣｇはいずれも苦味・渋味のつよいガレート型カテキン類であり、単にＥＣｇやＣｇの含量を高めるだけでは、ＥＧＣｇなどの含量も高まるため緑茶飲料自体が極めて飲み難いものとなってしまうという問題がある。
【００４６】
そこで、本発明者らは、さらに創意工夫を加え、いずれも苦味・渋味のつよいガレート型カテキン、すなわち４種のＥＣｇとＣｇとＥＧＣｇとＧＣｇ間の含有量比をコントロールすることで、従来の緑茶飲料に比べてＬＯＸ−１アンタゴニスト活性が有意に強く、かつ遜色ない程度に苦なく飲用できる緑茶飲料となることを見出した。
具体的には、本発明の緑茶飲料では、緑茶に含まれるカテキン類で最も含量の高いＥＧＣｇに対し、続いて含量の高いカテキン類の一つであるＥＣｇをＥＣｇ／ＥＧＣｇ（重量比）が０．７以上になるように調整し、且ついずれも苦味・渋味の強いガレート型カテキン全体間で、具体的には（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）の重量比が０．６以上になるように調整する。
このような関係を満たすことで、一般の緑茶飲料に比べてＥＣｇとＣｇの含有比率が有意に高くなるから、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性に優れ、しかもＥＧＣｇの含有比率が抑えられることから苦味・渋味を抑えた緑茶飲料とすることができる。
【００４７】
さらに、本発明の緑茶飲料では、非重合型カテキン類の総量を３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬに調整することで、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を向上させながら、苦味や渋味の発現を極力に抑制するという、従来の緑茶飲料にはない好ましい効果を奏する緑茶飲料としている。
【００４８】
以上のように、本発明は、緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を高めるという動機のもとで、苦味や渋味を抑えて飲用の許容性を風味面からも担保するといった新しい手法を打ち立てることに初めて成功したものである。
【００４９】
本発明の緑茶飲料では、前記（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００（ｍｇ／５００ｍＬ）を満たすように配合量を考慮しながら組み合わせることが好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜８００（ｍｇ／５００ｍＬ）を満たすように配合量を考慮しながら組み合わせることがより好ましく、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上であり、非重合型カテキン類の総量が３００〜７００（ｍｇ／５００ｍＬ）を満たすように配合量を考慮しながら組み合わせることがさらに好ましい。
【００５０】
本発明の緑茶飲料では、一般的な緑茶飲料に比べて前記のように（Ａ）および（Ｃ）成分の含有量が強化されているが、これらの成分が有するＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を発現させ易くする観点から、緑茶飲料に含有される非重合型カテキン類総量中の（Ａ）成分および（Ｃ）成分の合計の含有比率は２０重量％以上に調整されていることが好ましく、２５重量％以上がより好ましい。また、含有比率の上限値については、特に限定はない。
【００５１】
また、本発明の設計思想であるＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を高める観点から（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）≧１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）以上となるように、緑茶飲料ベースにカメリア属の茶葉由来の抽出物や精製物を添加することが好ましい。より生理効果を期待するために（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）が２００（ｍｇ／５００ｍＬ）以上であることが好ましく、（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）が２４０（ｍｇ／５００ｍＬ）以上であることが更に好ましい。
【００５２】
前記（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）という式は、後述の実施例に記載のように緑茶飲料開発のための一つの指標として本発明者らが初めて見出したものであり、緑茶飲料５００ｍＬ中のＥＣｇ量＋Ｃｇ量＋（ＥＧＣｇの２／３量）の総量のことであり、緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を相対的に評価できる指標である。
これは、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性の強さを、後述実施例に記載のように、モデルラットを用いた動物試験にて比較した結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系ではＥＣｇのアンタゴニスト活性がＥＧＣｇに対し５倍強かった（特願２０１１‐２３６４４８号）のに対し、より生体内での有効性を反映すると考えられるｉｎ ｖｉｖｏの試験系ではＥＣｇがＥＧＣｇと比較して約１．５倍強い効果を示したことから導き出された指標である。すなわち、強いＥＣｇ量と、Ｃｇ量と、ＥＣｇなどよりもＬＯＸ−１アンタゴニスト活性が２／３程度のＥＧＣｇ量との総量が、緑茶飲料そのもののＬＯＸ−１アンタゴニスト活性の強さに比例することから導き出された指標である。そして、前記総量の数値が高いほどＬＯＸ−１アンタゴニスト活性は高くなり、特に総量が１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）以上である緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性は顕著に高いものとなる。
なお、一般の緑茶飲料では、ＥＧＣｇの量が最も多く、ＥＣｇやＣｇは微量成分であるため、一概に限定できないが、（Ａ）＋（Ｂ）２／３＋（Ｃ）は、１３０（ｍｇ／５００ｍＬ）未満となる傾向にある。
【００５３】
前記緑茶飲料ベースに、カメリア属の茶葉由来の抽出物や精製物を添加する際は、緑茶飲料ベースに直接添加しその後十分に混合し溶解させても良いし、カメリア属の茶葉由来の抽出物や精製物を溶媒に十分に溶解させた後に緑茶飲料ベースに添加しても良い。この場合の溶媒は、飲用に適するものなら何でも良いが、一般的に水が好ましい。
【００５４】
また、ｐＨ調整剤、安定剤、加工助剤、分散剤、シクロデキストリンなど物性改良、品質安定のために食品に一般に使用される添加物は、前記緑茶飲料の製造工程において必要に応じて使用可能である。
【００５５】
なお、長期保存が必要な商品、例えば容器詰め緑茶飲料にする場合には、殺菌工程時の熱によりカテキン類が変化する（例えばＥＧＣｇ→ＧＣｇ、ＥＣｇ→Ｃｇなど）ことが知られているから、殺菌後に前記のようなカテキン類の含量の条件が満たされるように、配合量と組み合わせを考慮する必要がある。また、長期保存でもカテキン類が変化する場合があるから、この点にも注意が必要である。
【００５６】
本発明の緑茶飲料は、長期保存を目的としない緑茶飲料として提供してもよい。この場合、非密閉容器、密閉容器など形態は制限されない。長期保存を目的とした場合には、スチール缶やアルミ缶などの金属製容器、紙や樹脂性パック、ＰＥＴなどの合成樹脂容器などの密閉容器に充填して提供することができる。この場合は、充填前の殺菌あるいは充填後の殺菌を公知の方法に準じて行えばよい。
【００５７】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
（実施例１：非重合型カテキン類のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性比較）
緑茶中に含まれる主要なガレート型カテキンである、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、および、カテキンガレート（Ｃｇ）を試料とし、「非重合型カテキン類」であるこれらのカテキン成分について、特願２０１１‐２３６４４８号の実施例より高濃度条件におけるＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を検討した。
組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は、ヒト由来ＬＯＸ−１の細胞外ドメインである。ｈｕｍａｎ ＬＯＸ−１ ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＭ００２５４３）のうち、細胞外ドメイン（ｅｘ−ｈＬＯＸ−１）をコードする領域（６１〜２７３番目の塩基配列）を、定法に従い発現、精製したものを使用した。組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は酸化ＬＤＬに対する結合能力を有していることを確認し、以下のＥＬＩＳＡによる試験用ＬＯＸ−１標品として用いることにした。
なお、前記酸化ＬＤＬは、Sawamura T, et al., Nature, 386:73-77,(1997)に記載の方法に準じて作製した。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）は、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ製）を用いて行った。上記のように精製した組換えｈＬＯＸ−１タンパク質を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）バッファーで調整し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、２０％イムノブロックを含むＰＢＳ（−）バッファー３００μＬを各ウェルにアプライした。２５℃で２時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）／３μＭ 硫酸鉄（ＦｅＳＯ4）バッファーで１０μＭとなるように調整した各精製サンプルを５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、１μｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）バッファーで調整した酸化ＬＤＬを各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ａｎｔｉ−ＡｐｏＢ ＨＵＣ２０抗体（株式会社広島バイオメディカル社製）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体（ミリポア社製）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×５回で洗浄し、 ３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を５０μＬずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、０．５Ｍ Ｈ2ＳＯ4を５０μＬずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、ＬＯＸ‐１アンタゴニスト活性（ＬＯＸ‐１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害率）を定量した。図１に結果を示す。
【００６０】
図１は、実施例１で行ったｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬの結合率の結果を示している。ｈＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合時の吸光度を結合率１００％とし、各化合物存在時の吸光度を測定し、ｈＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合率で示した。抗ＬＯＸ−１抗体はｈＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を９５％以上阻害しており、酸化ＬＤＬの結合がほぼｈＬＯＸ−１を介したものであることが示唆される。
図１の結果より、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験ではＥＧＣｇにも高濃度存在時に酸化ＬＤＬ結合阻害活性が認められたことから、緑茶中に含まれる代表的な没食子酸エステルであるＥＣｇとＥＧＣｇのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性の差については、後述の実施例５で動物試験を行い比較した。
【００６１】
（実施例２：緑茶飲料ベースの製造）
＜煎茶を９０℃で抽出＞
煎茶茶葉（株式会社森徳）１５ｇを、水２，０００ｍＬ添加し、８０℃にて３分加熱した。抽出液をナイロンメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１（アドバンテック社）にて濾過し、緑茶飲料ベース１（試作品１）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６２】
＜玉露を水出し抽出＞
玉露茶葉（株式会社森徳）２１ｇを、水１，０００ｍＬ添加し、４℃に一夜静置した。抽出液をナイロンメッシュにて濾過し、緑茶飲料ベース２（試作品２）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００６３】
（実施例３：カメリア属の茶葉由来抽出物の製造）
＜ほうじ茶を抽出＞
ほうじ茶茶葉「ほうじ茶Ｂ」（京都グレインシステム（株））１５ｇに対し、水５００ｍＬを添加し、１２０℃、１分間、オートクレーブ（三洋バイオメディカル社）によりにて抽出した。これを、メッシュろ過し、回収された茶殻に水７５０ｍＬを添加し、沸騰状態で２０分間抽出し、抽出液をナイロンメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１にて濾過し、カメリア属の茶葉由来抽出物４５０ｍＬを得た。得られた茶葉由来抽出物を凍結乾燥し、ほうじ茶葉由来抽出物を３７９．０ｍｇ得た（試作品３）。ＨＰＬＣによる定量（以降の実施例７の条件による）により、試作品３ ３７９．０ｍｇ中にＥＧＣｇ:８．４ｍｇ、ＥＣｇ：１７．４ｍｇ、Ｃｇ：５．７ｍｇ、ＧＣｇ：１．１ｍｇが検出され、ＥＣ、Ｃ、ＥＧＣ、ＧＣの４種の非重合型カテキンは、検出されなかった。また、(Ａ)ＥＣｇ／（Ｂ）ＥＧＣｇは、２．０、（（Ａ）ＥＣｇ＋（Ｃ）Ｃｇ）／（（Ｂ）ＥＧＣｇ＋（Ｄ）ＧＣｇ）は、２．４となった。必要に応じてこの作業を繰り返した。
また、得られた試作品３中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６４】
＜紅茶１を抽出＞
紅茶茶葉「セイロン オレンジペコー」（片岡物産（株））３０ｇに対し、１０００ｍＬの水を添加し、１２０℃、１分間、オートクレーブにより抽出した。エタノール４００ｍＬを添加し、５０℃にて１時間振とうした。これをメッシュ濾過し回収された茶殻に水を８００ｍＬ添加し、４℃にて一夜静置した。これをメッシュ濾過し得られた茶殻に対し水５００ｍＬを添加し、８０℃にて３時間加温抽出し、抽出液をナイロンメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１にて濾過し、カメリア属の茶葉由来の抽出物４６０ｍＬを得た。得られた茶葉由来の抽出物を凍結乾燥し、紅茶茶葉由来抽出物を４２５．０ｍｇ得た（試作品４）。ＨＰＬＣによる定量（以降の実施例７の条件による）により、試作品４ ４２５．０ｍｇ中にＥＧＣｇ:１．８ｍｇ、ＥＣｇ：１８．１ｍｇ、Ｃｇ：３．８ｍｇが検出され、ＧＣｇ、ＥＣ、Ｃ、ＥＧＣ、ＧＣの５種の非重合型カテキンは検出されなかった。(Ａ)／(Ｂ)は、９．８、（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））は、１１．９となった。必要に応じてこの作業を繰り返した。
なお、得られた試作品４中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６５】
＜紅茶２を抽出＞
紅茶茶葉「紅茶＃２９６９」（スリランカ産；ディンブラ）（京都グレインシステム（株））３ｇに対し、水２００ｍＬを添加し、８０℃にて２時間振とうした。これをメッシュおよび濾紙Ｎｏ．１０１にて濾過し、カメリア属の茶葉由来の抽出物１９０ｍＬ（試作品５）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
なお、得られた試作品５中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６６】
（実施例４：カメリア属の茶葉由来の精製物の製造）
茶ポリフェノール抽出物「ポリフェノン７０Ｓ」（三井農林（株））５００ｇを１０００ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に溶解させ、茶ポリフェノール溶液を調製した。
次に、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学（株））を８．０Ｌ充填したカラムを作製し、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液にて平衡化した。このカラムに上記茶ポリフェノール溶液を通液し、各種茶ポリフェノール類を吸着させた。次いで、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液３０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、さらに２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液７．５Ｌを同様にＳＶ＝２〜３で通液し、これらは非回収画分とした。
その後、２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液２０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、目的のＥＣｇおよびＣｇを高濃度に含む溶出画分として、この溶出画分を全て回収した。回収した溶出液を常法により乾固し、固形物４４．７ｇを得た。ＨＰＬＣによる定量（以降の実施例７の条件による）により、本固形物中のＥＧＣｇ:１．７ｇ、ＥＣｇ：２４．８ｇ、Ｃｇ：３．１ｇ、ＧＣ：３．０ｇが検出され、Ｃ、ＥＣ、ＥＧＣ、ＧＣの４種の非重合型カテキンは検出されなかった。また、(Ａ)／(Ｂ)は、１４．６、（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））は、１６．４となった。
本法によりカメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）を得た。必要に応じてこの作業を繰り返した。
なお、得られた試作品６中の没食子酸濃度も前記ＨＰＬＣによる定量で測定したところ、非重合型カテキンに対して、没食子酸／非重合型カテキン類（質量比）＝０．１以下であった。
【００６７】
（実施例５：ＥＣｇの有効性試験）
図１の結果より、ｉｎ ｖｉｔｒｏの試験ではＥＧＣｇにも高濃度存在時に酸化ＬＤＬ結合阻害活性が認められたことから、緑茶中に含まれる代表的な没食子酸エステルであるＥＣｇとＥＧＣｇの有効性の差を、動物試験を行い比較した。
茶ポリフェノール抽出物「サンフェノン９０Ｓ」（太陽化学（株））５００ｇを１０００ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液に溶解させ、茶ポリフェノール溶液を調製した。
次に、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学（株））を８．０Ｌ充填したカラムを作製し、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液にて平衡化した。このカラムに上記茶ポリフェノール溶液を通液し、各種茶ポリフェノール類を吸着させた。次いで、２０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液３０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、さらに２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液７．５Ｌを同様にＳＶ＝２〜３で通液し、これらは非回収画分とした。
その後、２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液２０ＬをＳＶ＝２〜３で通液し、目的のＥＣｇおよびＣｇを高濃度に含む溶出画分として、この溶出画分を全て回収した。回収した溶出液を濃縮し、クロロホルム５００ｍＬと水５００ｍＬで液液分配を３回行い、溶出画分中のカフェインの除去を行った後乾固し、ＨＰＬＣによりＥＣｇ画分を分取した。得られた画分を濃縮、乾固した精製物はＥＣｇのみを乾燥重量中７１．７％含有し、ＥＧＣｇ、カフェインなどを含まない精製物であることを確認し、以後の試験に使用した。
得られたＥＣｇの精製物を用いて、自然発症脳卒中モデルラット（ＳＨＲＳＰ／Ｉｚｍ系、雄、８週齢、日本クレア社製）の腸間膜動脈における脂質沈着に対する抑制能を評価した。
【００６８】
上記モデルラット１０匹を１群として、日本クレア社製の「Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ」（α―トコフェロール抜き、以下、コントロール食）および０．６％重量ＥＣｇ含有「Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ」（以下、ＥＣｇ含有食）、０．６％重量ＥＧＣｇ含有「Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ」(以下ＥＧＣｇ含有食)の３群で試験を行った。これらの固形飼料および生理食塩水（大塚製薬社製）については自由摂取の形態で行い、１週間を飼育期間とした。なお、１日おき、若しくは最終的な摂餌量および摂水量で両群に違いは見られなかった。また、自然発症脳卒中モデルラットを用いた腸間膜動脈の脂質沈着に関する実験は、既報（Japanese Circulation Journal, Vol.39, p601-609, 1975）を参考に、下記のように変法して行った。
【００６９】
コントロール食あるいはＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食による、１週間の経口投与をモデルラットに行った後に、イソフルランで吸入麻酔を行い、開腹・開胸を行った。開腹・開胸したラットから血清を採取し、さらに、腸間膜動脈を周囲脂肪組織とともに摘出し、摘出後にＰＢＳバッファー中でピンセットを用いながら腸間膜動脈の周囲脂肪組織を除去した。得られた腸間膜動脈を６０％イソプロパノールで洗浄・平衡化した後に、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液（和光純薬工業（株）製）による腸間膜動脈に沈着した脂質の染色を行い、６０％イソプロパノール／３０％イソプロパノール／ＰＢＳバッファーへと段階的にイソプロパノール濃度を下げながら脱色操作を行った。最終的に、顕微鏡下でＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色により染色された脂質沈着部の面積を計測した。
【００７０】
採取した血清より、コレステロールＥテストワコー、ＨＤＬコレステロールＥテストワコー、トリグリセライドＥテストワコー、リン脂質Ｃテストワコー（和光純薬工業（株）製）を用いて血中総コレステロール濃度（図２）、ＨＤＬコレステロール濃度（図３）、トリグリセライド濃度（図４）、リン脂質濃度（図５）をそれぞれ測定した。
図２〜５の結果より、コントロール食、ＥＣｇ含有食、ＥＧＣｇ含有食を摂取したラット間で血中総コレステロール濃度、ＨＤＬコレステロール濃度、トリグリセライド濃度、リン脂質濃度に有意な差はみられなかった。
【００７１】
また、実施例５により得られた、腸間膜動脈における脂質沈着面積の測定結果（図６）および解析された実際の腸間膜動脈の写真（図７）を示す。この結果より、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液により染色された血管での脂質沈着面積は、ＥＣｇ含有食処理群、ＥＧＣｇ含有食群でともにコントロール食処理群に比べて有意に低下しており、特にその低下率はＥＧＣｇ含有食群の１．５倍（１．６／１．１）であった。この結果から、ＥＧＣｇの生理活性はＥＣｇの生理活性に対して約２／３の活性であるという詳細なデータが確認できた。
【００７２】
したがって、実施例１、５の結果から、ＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇを摂取することで、血中総コレステロール値などには大きな変動は及ぼさないものの、動脈硬化などの心血管病予防の予防に対しては顕著な効果を有することが明らかとなった。特に、高脂肪食により誘発される動脈硬化症などの心血管病は、ＥＣｇ、Ｃｇ、ＥＧＣｇを積極的に摂取することで効率よく抑制できると考えられる。
【００７３】
そこで、実施例１、５の結果から、緑茶飲料を評価するための一つの指標として、ＬＯＸ−１アンタゴニスト活性指標なるＬＡＶを定めた。ＬＡＶ（ＬＯＸ−１ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｖａｌｕｅを簡略化した造語）とは、緑茶飲料５００ｍＬ中のＥＣｇ量＋Ｃｇ量＋（ＥＧＣｇの２／３量）の総量のことであり、緑茶飲料のＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を相対的に評価できる指標である。なお、前記ＬＡＶにおいて緑茶５００ｍＬを基準としたのは、日本では緑茶の市販品は５００ｍＬの容量で販売されているのが一般的であり、一日の摂取量として換算されることからである。また、前記ＬＡＶが１３５ｍｇ／５００ｍＬ以上としたのは、実施例５で食事として与えたＥＣｇやＥＧＣｇの量を１日あたりに換算したところ、約１３５ｍｇになったためである。すなわち、緑茶飲料のＬＡＶが１３５ｍｇ／５００ｍＬ以上であることで、図６、７に示すような結果が期待できる。
【００７４】
なお、上記実施例５においてＥＣｇ含有食やＥＧＣｇ含有食を投与したラットは、投与していないラットと比べても体重増加率は変わらなかった。また、ＥＣｇ含有食やＥＧＣｇ含有食を投与したラットを開腹したところ、顕著な臓器異常も見られなかった。以上のことから、カメリア属の茶葉由来のＥＣｇ精製物やＥＧＣｇ精製物の安全性が高いことも明らかとなった。
【００７５】
（実施例６：緑茶飲料の製造と分析）
実施例２〜４で得た試作品を用いて、緑茶飲料を製造した。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）３００ｍｇを添加し、緑茶飲料（試作品７）を得た。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）６００ｍｇを添加し、緑茶飲料（試作品８）を得た。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）９００ｇを添加し、緑茶飲料（試作品９）を得た。
緑茶飲料ベース１（試作品１）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）１．２５ｇを添加し、緑茶飲料（試作品１０）を得た。
試作品７、８、１０を同様に作製し、それぞれに１２０℃、１０分の加熱殺菌をオートクレーブにより施し、試作品１１，１２、１３を得た。参考のために、試作品１も同様に加熱殺菌を施し、試作品１４とした。
緑茶飲料ベース２（試作品２）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の抽出物（試作品３）を４ｇ添加し、緑茶飲料（試作品１５）を得た。
緑茶飲料ベース２（試作品２）５００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の抽出物（試作品４）を６ｇ添加し、緑茶飲料（試作品１６）を得た。
緑茶飲料ベース２（試作品２）４００ｍＬに対し、カメリア属の茶葉由来の抽出物（試作品５）を１００ｍＬ、およびカメリア属の茶葉由来の精製物（試作品６）１００ｍｇを添加し、添加し、緑茶飲料（試作品１７）を得た。
なお、日本のメーカーＡ〜Ｇの７社から市販されている緑茶飲料１４品についても比較品１〜１４として使用した。
【００７６】
（実施例７：緑茶飲料および各社緑茶飲料のカテキン類分析）
次に、緑茶飲料（試作品１、２、５、７〜１７）および各社緑茶飲料（比較品１〜１４）のカテキン類分析を行った。その結果を表１、２に示す。
【００７７】
なお、ＨＰＬＣ分析条件を下記に示す。
カラム：逆相用カラム「ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ」（ナカライテスク、４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ；Ｈ2Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ；アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２８０ｎｍ
勾配（容量％）：９５％Ａ／５％Ｂから７０％Ａ／３０％Ｂまで２５分間、７０％Ａ／３０％Ｂから１００％Ｂまで２分間、１００％Ｂで８分間（全て直線）
【００７８】
検量線は、各種標準品、ＥＣ、Ｃ、ＧＣ、ＥＣｇ、Ｃｇ、ＧＣｇ、ＥＧＣｇ（全て和光純薬社製）を用いて作成した。また、各カテキン類のリテンションタイムと、没食子酸、カフェインのリテンションタイムには重なりがないことを確認した。
【００７９】
ＥＧＣについての定量は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより実施した。分析条件は以下の通りである。
カラム：逆相用カラム「ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ」（ＹＭＣ社製、２．０ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ）
移動相：Ａ；Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）， Ｂ；アセトニトリル（０．１％ギ酸）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出（質量分析）：ＥＳＩ、Ｎｅｇａｔｉｖｅモード（３２００ＱＴＲＡＰ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム、エービーサイエックス社製）
勾配（容量％）：９５％Ａ／５％Ｂから５０％Ａ／５０％Ｂまで１５分間、５０％Ａ／５０％Ｂから１００％Ｂまで２分間、１００％Ｂで８分間（全て直線）
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
【００８２】
表１、２の結果より、通常の緑茶飲料である試作品１、２、１４において、ＥＣｇ／ＥＧＣｇは０．７、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）は０．６よりそれぞれ低値であった。
カメリア属の茶葉由来抽出物、カメリア属の茶葉由来精製物、あるいはカメリア属の茶葉由来抽出物と精製物を添加して得られた試作品７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７においては、いずれもＥＣｇ／ＥＧＣｇは０．７以上、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）は０．６以上を示した。
また、試作品７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７の非重合型カテキン類の総量は、いずれも３００以上であった。
また、ＬＡＶ（ＥＣｇ＋Ｃｇ＋ＥＧＣｇ２／３（５００ｍｌ中））の値も、試作品１、２、１４は、１３５より低い値になっているが、試作品７〜１３、１５〜１７においてはいずれも１３５以上の値を示していた。
試作品５については非重合型カテキン類の総量が３００未満であり、ＬＡＶの値も１３５より低い値であった。
一方、比較品１〜１４はいずれもＥＣｇ／ＥＧＣｇは０．７、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）は０．６よりそれぞれ低値となっていた。
【００８３】
（実施例８：緑茶飲料の官能検査）
試作品７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、比較品３および苦渋い（苦味と渋味とを感じる）といわれる比較品１２、１３についてパネラー５人で試飲し、官能評価を行った。官能評価は、５人それぞれ、味良好：１、少し苦渋い：２、苦渋い：３、かなり苦渋い：４、飲み難い：５で評価し、５人の平均値を取り、
１以上１．５未満：味良好：◎、
１．５以上２．５未満：少し苦渋い：○、
２．５以上３．５未満：苦渋い：△、
３．５以上５以下：かなり苦渋い：×
とし、表３に示している。
【００８４】
【表３】
【００８５】
その結果、試作品７および１１は、苦渋みが顕著に低く非常に飲み易く、試作品８、１２、１５、１７は少し苦渋いものの市販品である比較品１２、１３よりは苦渋くなく飲めた。試作例９、１６は、市販品である比較品１２、１３と同程度の苦渋さがある飲料であった。
これに対して、比較品３は官能評価が少し苦い程度であったが、ＥＣｇ／ＥＧＣｇや、（ＥＣｇ＋Ｃｇ）／（ＥＧＣｇ＋ＧＣｇ）の比がそれぞれ０．７、０．６以下であり、且つＬＡＶ値も低いことからＬＯＸ−１アンタゴニストとしての効果が期待できない。
一方、非重合型カテキン類の総量が１１００ｍｇ／５００ｍＬを超える試作品１０、１３は、カテキンの量が多いため、苦味、渋味も強く飲料としては不向きであった。
したがって、苦味、渋味を抑えた飲料とするためには、非重合型カテキン類の総量が１１００ｍｇ／５００ｍＬ以下であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の緑茶飲料を継続的に摂取することで、血管内皮細胞やマクロファージなどで発現しているＬＯＸ-1への酸化ＬＤＬの結合を、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）やカテキンガレート（Ｃｇ）が効率的に阻害して、心血管病の予防効果や治療効果が期待される。カテキン類とＬＯＸ−１との関連性について詳細な検討はこれまで実施されておらず、本発明によって、これまでにない見地に立ち心血管病予防を目的とする緑茶飲料の設計が可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）エピカテキンガレート、（Ｂ）エピガロカテキンガレート、（Ｃ）カテキンガレートおよび（Ｄ）ガロカテキンガレートを含有し、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分を含む非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであることを特徴とする緑茶飲料。
【請求項２】
非重合型カテキン類総量中の（Ａ）成分および（Ｃ）成分の合計の含有比率が２０重量％以上である請求項１記載の緑茶飲料。
【請求項３】
（Ａ）成分、（Ｂ）成分、（Ｃ）成分の含有量が、以下の式：
（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）≧１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）
を満たす請求項１または２記載の緑茶飲料。
【請求項４】
カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物と緑茶抽出液とを混合してなり、
前記カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物中の（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である請求項１〜３いずれか記載の緑茶飲料。
【請求項５】
カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
前記茶葉由来抽出物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項６】
カメリア属の茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項７】
カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記カメリア属の茶葉由来抽出物と、前記カメリア属の茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程
を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項１】
（Ａ）エピカテキンガレート、（Ｂ）エピガロカテキンガレート、（Ｃ）カテキンガレートおよび（Ｄ）ガロカテキンガレートを含有し、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分の含有量について、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６以上であり、
前記（Ａ）成分〜（Ｄ）成分を含む非重合型カテキン類の総量が３００〜１１００ｍｇ／５００ｍＬであることを特徴とする緑茶飲料。
【請求項２】
非重合型カテキン類総量中の（Ａ）成分および（Ｃ）成分の合計の含有比率が２０重量％以上である請求項１記載の緑茶飲料。
【請求項３】
（Ａ）成分、（Ｂ）成分、（Ｃ）成分の含有量が、以下の式：
（Ａ）＋（Ｂ）×２／３＋（Ｃ）≧１３５（ｍｇ／５００ｍＬ）
を満たす請求項１または２記載の緑茶飲料。
【請求項４】
カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物と緑茶抽出液とを混合してなり、
前記カメリア属の茶葉由来の抽出物および／または精製物中の（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である請求項１〜３いずれか記載の緑茶飲料。
【請求項５】
カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
前記茶葉由来抽出物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項６】
カメリア属の茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程と
を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の緑茶飲料の製造方法。
【請求項７】
カメリア属の茶葉から、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来抽出物を得る工程と、
合成吸着剤を用いて前記茶葉由来抽出物を精製し、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７５以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））（重量比）が０．６５以上である茶葉由来精製物を得る工程と、
前記カメリア属の茶葉由来抽出物と、前記カメリア属の茶葉由来精製物を緑茶抽出液に配合して、（Ａ）／（Ｂ）（重量比）が０．７以上であり、且つ（（Ａ）＋（Ｃ））／（（Ｂ）＋（Ｄ））が０．６以上となるように調整された緑茶飲料を得る工程
を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の緑茶飲料の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１３−９６７０（Ｐ２０１３−９６７０Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２４４３２（Ｐ２０１２−１２４４３２）
【出願日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【Ｆターム（参考）】
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