線溶亢進を伴う凝固障害の処置
本発明は、血友病障害などの線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用に関する。このトロンボモジュリン類似体は、治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示す。新規なタンパク質改変も、その同定方法とともに開示する。この課題は、治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示すトロンボモジュリン類似体を含む、哺乳動物、特にヒトの線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬を提供することにより解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害の分野に関する。より詳しくは、本発明は、血友病Ａまたは血友病Ｂなどの血友病（ｈａｅｍｏｐｈｉｌａ）疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、血管が破れたときの出血を止めるために使用される血液の凝固（“ｃｌｏｔｔｉｎｇ”または“ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ”）を制御する身体の能力が障害された遺伝性の遺伝障害群である。血友病Ａは、最も一般的な形態であり、第ＶＩＩＩ因子の遺伝子における変異に起因しており；血友病Ｂは、クリスマス病としても知られており、第ＩＸ因子の遺伝子における変異に起因している。血友病Ｂは、血友病Ａと同様、Ｘ連鎖型であり、血友病症例のおよそ１２％を占める。その症状は、血友病Ａのものと同一：損傷時の過剰な出血；および特発性出血（特に、体重負荷関節、軟部組織および粘膜への出血）である。関節への反復出血により関節血症になり、有痛性の肢体不自由な（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）関節症（これは、多くの場合、関節置換を必要とする）が引き起こされる。軟部組織における血腫は、壊死性の凝固血液で構成された偽腫瘍をもたらし得；これは、隣接器官を閉塞、圧迫または破裂させることがあり得、感染をひきおこし得る。血腫は、いったん形成されると、手術を伴っても処置が困難である。圧迫後の神経の回復は不充分であり、麻痺が生じる。胃腸管、中枢神経系または気道／腹膜後隙が関与する出血エピソードは、検出されなければ死に至ることがあり得る。頭蓋内出血は血友病患者の主な死亡原因である。
【０００３】
米国では先天性血友病は１００，０００例と推定されている。このうち、およそ２０，０００例は血友病Ｂであり、かかる患者の血液は、第ＩＸ因子が完全にないか、または血漿中に第ＩＸ因子成分が重度に欠損しているかのいずれかである。したがって、該疾患は、種々の度合の重症度で存在し、毎週から年に１回または２回までの任意の場合での治療が必要とされる。完全欠損型症例では、毎週１回の補充療法が必要とされ；一部欠損型症例では、出血エピソードが起こったときだけ（これは、年に１回程度のめったにないものであり得る）治療が必要とされる。先天性の一部欠損型症例での出血エピソードは、一般的に、損傷単独によってではなく、一時的な後天的易罹患性によって引き起こされる。充分に大量の新鮮血漿または等価量の新鮮血液を静脈内注射すると、一時的に欠損型被験体の欠陥が修正される。この有益な効果は、多くの場合、２週間ないし３週間持続するが、患者の血液のインビトロ試験によって測定される凝固欠陥の改善は、２日ないし３日間しかみられない。
【０００４】
新鮮血漿または新鮮血液を用いたかかる治療は有効であるが、いくつかの深刻な欠点を有する：（１）大量の新鮮血漿がすぐに利用可能なことが必要とされる；（２）該血漿の投与のために入院が必要とされる；（３）非常に多くの人数の患者が、血液または血漿の反復注入に対して感作された状態になり、最終的に致死性の輸血反応がみられる；（４）せいぜい、血漿で該欠損症が一部軽減され得るにすぎない；および（５）必要とされる大量の血液または血漿によって急性で致死性の浮腫が引き起こされるため、長期間の処置または手術が可能でない。
【０００５】
改善された治療としては、第ＶＩＩＩ因子濃縮物または第ＩＸ因子濃縮物での静脈内補充療法が挙げられる。しかしながら、この治療はまた、いくつかの不都合点があるという欠点をもつ：（１）大きな出血エピソードの処置の場合、迅速な検出および処置の後であっても組織の損傷が残る；（２）非常に多くの人数の患者が、凝固因子に対して抗療性となり、該凝固因子に対する阻害性抗体が発生する（いわゆるインヒビターを有する血友病）；（３）ウイルス不活化法の改善にもかかわらず、依然として、致死性ウイルス（ＨＩＶおよびＣ型肝炎など）での汚染のリスクが高い（ＵＳＡでは、血友病集団の５０％より多く（１０，０００人超）が汚染血液の供給によってＨＩＶに感染したと推定されている）；（４）単離された凝固因子、特に組換え凝固因子は非常に高価であり、一般的に、発展途上諸国では入手できない。
【０００６】
血友病における出血は、三重欠陥：（１）低組織因子濃度での外因性経路によるトロンビン生成の低減、（２）内因性経路によるトロンビン生成の二次バーストの低減、および（３）内因性経路によるフィブリン溶解系の欠陥性下方調節が原因であり得る複雑な病態生理学的プロセスであるため、補充療法を超える出血の処置または予防は難題である。
【０００７】
トロンビン生成の低減によって凝固傾向の低減がもたらされ、したがって、出血リスクの増大がもたらされることは、一般的に、認知されている。しかしながら、過去１０年間の研究により、フィブリン溶解の欠陥性下方調節が血友病において役割を果し得ることも示されている。その結果、血友病は、線溶亢進を伴う凝固障害にも分類され得る。
【０００８】
この仮定は、最近の刊行物により、クロットを第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中で形成させ、組織プラスミノゲン活性化因子ｔＰＡを補給した場合、フィブリン溶解が充分に下方調節されず、その結果、クロットの溶解が早期に起こることをインビトロで示すことによって裏づけられている（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、この「早期の溶解（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｌｙｓｉｓ）」が、トロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）の活性化の低減または非存在のためであること（非特許文献１）ならびにＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では、活性化型ＴＡＦＩを含有する混合物によってクロット溶解時間が増大することを示すことができた。安定化させたＴＡＦＩが血友病の処置に使用され得ると結論付けられた（特許文献１）。
【０００９】
ＴＡＦＩは、安定なクロットの形成に必要とされるフィブリン溶解の下方調節において重要な役割を果している。ＴＡＦＩは、血漿プロカルボキシペプチダーゼＢ２またはプロカルボキシペプチダーゼＵとしても知られており、トロンビン−トロンボモジュリン複合体に曝露されると、Ａｒｇ９２でのタンパク質分解により、フィブリン溶解を阻害する塩基性カルボキシペプチダーゼ（ＴＡＦＩａまたは活性化型ＴＡＦＩ）に変換される血漿チモーゲンである。これは、プラスミノゲンの結合と活性化に重要なＣ末端のリシンおよびアルギニン残基をフィブリンから除去することにより、フィブリン溶解を強く弱める。
【００１０】
上記のように、トロンビンとの複合体の状態のトロンボモジュリン（ＴＭ）は、ＴＡＦＩの活性化を担う。トロンボモジュリンは、血管の内側を覆う内皮細胞上のトロンビン受容体として作用する膜タンパク質である。トロンビンは、フィブリノゲンをフィブリン（クロットマトリックスを構成する）に変換させる凝固カスケードにおける中心的な酵素である。初期では、局所損傷により、少量のトロンビンが、その不活性な前駆体プロトロンビンから生成される。このトロンビンが、さらに、血小板ならびに第２の特定の凝固因子（例えば、第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子）を活性化させる。後者の作用によって、さらなるプロトロンビン分子の大量活性化（いわゆるトロンビンバースト）が起こり、これにより、最終的に安定なクロットの形成がもたらされる。
【００１１】
しかしながら、トロンボモジュリンと結合した場合、トロンビンの活性の方向が変化する：トロンビン−トロンボモジュリン複合体の主要な特徴は、プロテインＣを活性化させ、それにより、次いで必須の補因子である第Ｖａ因子と第ＶＩＩＩａ因子をタンパク質分解的に不活化することによって凝固カスケードを下方調節し（非特許文献３）、したがって、抗凝固活性をもたらす能力である。また、トロンビン−トロンボモジュリン複合体は、トロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）を活性化することもでき、その場合は、フィブリン溶解が拮抗される（上記参照）。
【００１２】
成熟ヒトＴＭは、５５９残基の単一ポリペプチド鎖で構成されており、５つのドメイン：アミノ末端の「レクチン様」ドメイン、６つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様反復配列（ｒｅｐｅａｔ）を含む「６ ＥＧＦ様反復ドメイン」、Ｏ−グリコシル化ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなり、位置の特定は以下のとおりである（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
【００１３】
【化１】
ウサギＴＭのタンパク質分解断片または組換えヒトＴＭの欠失変異体を用いた種々の構造−機能試験により、その活性が、最後の３つのＥＧＦ様反復配列に位置することが特定された。ＴＡＦＩ活性化を効率的に促進し得る最小の変異体には、上皮増殖因子３（ＥＧＦ３）〜ＥＧＦ６のｃループを含む残基が含まれていた。この変異体は、Ｃを活性化させる最小の変異体よりも１３残基長い；該最小の変異体は、ＥＧＦ３とＥＧＦ４〜ＥＧＦ６を連結するドメイン間ループ由来の残基からなるものであった。
【００１４】
上記のように、血友病などの凝固障害を処置するための補充療法では、医療上の必要性が満たされていない。重要なことは、補充療法に使用されている凝固因子以外に、血友病患者を予防または処置することができる利用可能な薬物がないことである。
【００１５】
したがって、線溶亢進を伴う凝固障害、特に血友病を予防または処置するための治療薬の開発に対する長年にわたる必要性にもかかわらず、進歩は遅く、安全で有効な治療薬はまだない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第０２／０９９０９８号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ＢｒｏｚｅおよびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８８：３８１５−３８２３
【非特許文献２】Ｍｏｓｎｉｅｒら；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００１，８６：１０３５−１０３９
【非特許文献３】Ｅｓｍｏｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９１），６１４：３０−４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の課題は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための新規な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この課題は、治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示すトロンボモジュリン類似体を含む、哺乳動物、特にヒトの線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬を提供することにより解決される。
【００２０】
この新規なアプローチは、トロンボモジュリンを、高い血漿濃度、特に１５ｎＭより高い、特に２０、３０、４０または５０ｎＭより高い（少なくとも１００ｎＭまで）の濃度であってもフィブリン溶解促進活性が広くみられる抗フィブリン溶解活性を示すような様式で改変することができるというめざましい所見に基づく。したがって、このようなＴＭ類似体は抗フィブリン溶解効果を示し、そのため本発明による使用に適している。
【００２１】
この抗フィブリン溶解効果は、血友病患者由来の血漿（これは第ＶＩＩＩ因子が枯渇している；ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中で示された。それと共に、かかるトロンボモジュリン類似体が治療薬として使用され得ることを実証した。
【００２２】
これまで、血友病の処置に対するトロンボモジュリンの治療的使用は現実的な選択肢とはみなされていなかった。これは、ウサギ肺トロンボモジュリン（ｒｌＴＭ）により、かなり低い濃度であっても、常に、抗フィブリン溶解活性とフィブリン溶解促進活性の両方を有することがわかっていたためである（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００６；２６：２４４５−２４５３；特に図５参照）。１５ｎＭより低いｒｌＴＭ血漿濃度では、ｒｌＴＭによってクロット溶解時間が増大するが、１５ｎＭより高い血漿濃度では、溶解時間の著しい減少が示され（Ｍｏｓｎｉｅｒら，２００１，ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ，２００６）、最終的な結果としてフィブリン溶解促進効果がみられた。より高濃度でのこのフィブリン溶解促進効果により、血友病におけるなんらかの治療的使用は禁止されている。なぜなら、過剰投与の可能性または個体の易罹患性のばらつきによって出血事象が致死的に悪化したり、長期化したり、または引き起こされることすらあり得るためである。
【００２３】
本発明によれば、抗フィブリン溶解効果を示し、したがって本発明による処置に適したＴＭ類似体がもたらされる種々の選択肢が存在する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）、正常血漿（ＮＰ）およびＮＰと混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰのクロット溶解プロフィールおよび溶解時間を示す。クロット溶解プロフィールは、０（―――）、１（・・・・）、６（−−−）、１０（―・・―・・―）、５０（― ― ―）および１００％（―・―・―）ＮＰで示す。クロット溶解プロフィールから、最大光学密度の２分の１になるまでクロットが分解された時点を採用することにより、溶解時間を決定した。差し込み図に溶解時間をまとめており、一般的な傾向は、ＮＰの割合（したがって、ＦＶＩＩＩの量）が増大するにつれて、溶解時間も増大する。溶解時間に対するＮＰの添加の効果は、１０％ＮＰで平坦域に達する。
【図２】図２は、種々の割合のＦＶＩＩＩを含有する血漿中におけるトロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）の活性化を示す。（Ａ）ＦＶＩＩＩ欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）を正常血漿（ＮＰ）と混合すると、ＴＡＦＩ活性化は増強される。ＦＶＩＩＩ−ＤＰでは、そのピーク（●）においてわずか３０ｐＭのＴＡＦＩａが測定されたのに対し、５０％ＮＰ（□）および１００％ＮＰ（△）では約６００ｐＭのＴＡＦＩａが測定された。この実験は三連で行なった。データは平均値±ＳＥで示す。ＴＡＦＩａ産生能（Ｂ）（本明細書において、クロット開始時点から最後の時点までの活性化の時間的推移プロット（Ａ）下面積と定義）は、ＮＰの割合が増大するにつれて増大し、５０％ＮＰで平坦域となる。５０％ＮＰおよび１００％ＮＰのＴＡＦＩａ産生能は、それぞれのＴＡＦＩ活性化プロットの形状がかなり異なるにもかかわらず類似している（それぞれ、１４，１００ｐＭ分および１６，８００ｐＭ分）。溶解時間（図１，差し込み図）とＴＡＦＩａ産生能の間の関係を（ＦＶＩＩＩレベルに関係しているため）、ｌｏｇ溶解時間に対するｌｏｇ ＴＡＦＩａ産生能のプロットを用いて示す（図２Ｂ，差し込み図）。予測どおり、データは、０〜１００％のＦＶＩＩＩを含有する血漿中において溶解時間とＴＡＦＩａ産生能間の強い正の相関を示す。
【図３】図３は、種々の割合のＦＶＩＩＩを含有する血漿中におけるプロトロンビンの活性化を示す。プロトロンビン活性化の時間的推移を、０（●）、１（■）、６（▲）、１０（○）、５０（□）および１００％ＮＰ（△）と混合したＦＶＩＩＩＤＰについて示す。一般的に、プロトロンビンの活性化速度は、ＮＰの割合が増大するにつれて増大する。５０％ＮＰでは、プロトロンビン活性化は高速で起こり（各プロットの傾きを調べることによって判定する通り）、１５以内に終わるようであるが、１００％ＮＰでは、プロトロンビン活性化の速度は遅く、長期間にわたる。
【図４】図４は、ｓＴＭ（０〜１００ｎＭ）およびｔＰＡ（０．２５〜３ｎＭ）がともに種々の濃度で存在する正常血漿（ＮＰ）および第ＶＩＩＩ因子欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中における、トロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）の活性化に対するｓＴＭの効果を示す。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中における溶解延長のＴＡＦＩａ依存性欠陥は、０．２５ｎＭ ｔＰＡを含有する血漿に１００ｎＭのｓＴＭを添加することによって修正される。ｔＰＡ濃度が増大するにつれて、溶解の欠陥のわずかな一部修正が、１００ｎＭ ｓＴＭ存在下のＦＶＩＩＩ−ＤＰにおいて観察される。この実験では、イモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＴＣＩ）を用いて、機能性ＴＡＦＩａなしの状態を作出した。したがって、溶解の増大（あれば）（溶解時間／溶解時間＋ＰＴＣＩの比率で示される）はＴＡＦＩａ依存性である。
【図５】図５は、１０ｎＭトロンボモジュリンの存在下（●）またはトロンボモジュリンなし（○）での、正常血漿（ＮＰ）（Ａ）およびＦＶＩＩＩ欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）（Ｂ）におけるＴＡＦＩ活性化およびクロット溶解プロフィールを示す。ｓＴＭを伴うクロット溶解プロフィールを示し（―）、ｓＴＭなしでのクロット溶解プロフィールを参照として示す（−−−）。この実験は三連で行なった。データは平均値±ＳＥで示す。
【図６】図６は、トロンボモジュリンに対するトロンビン結合を示す。トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５．０ｍＭ Ｃａ２＋，０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液中のトロンビン（２０ｎＭ）およびＤＡＰＡ（２０ｎＭ）で構成された１．５ｍｌを、同一の溶液中の１．５４μＭのトロンボモジュリンで滴定することによって測定した。蛍光強度を測定した（λｅｘ＝２８０ｎｍ，λｅｍ＝５４５ｎｍ）。
【図７】図７は、ＴＡＦＩおよびプロテインＣの活性化における点変異体の相対補因子活性を示す。可溶性トロンボモジュリンにおける点変異の作製には、アラニンスキャニング変異誘発を使用した。プロテインＣおよびＴＡＦＩの活性化の速度（変異体ＴＭＥＭ３８８Ｌでの活性化の速度と比較して）を、ＴＡＦＩ（黒バー）およびプロテインＣ（斜線バー）について示す。
【図８】図８は、ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの変異を示す。３種類の独立したプラスミドを、各変異体について大腸菌において構築した。ショッケートを調製し、ＡＰＣアッセイによって補因子活性についてアッセイし、試料をウエスタンブロットにおいて解析した（図示せず）。活性の値は３つの別々のクローンの平均である。パネルＡ，Ｇｌｎ３８７における置換変異体；パネルＢ，Ｍｅｔ３８６における置換；パネルＣ，Ｐｈｅ３８９における置換変異体；パネルＤ，ドメイン間ループにおける欠失およびアラニン挿入。対照プラスミドｐＳｅｌｅｃｔ（ＴＭ挿入配列なし）でトランスフェクトした大腸菌からのショッケートについて測定した活性を示す。さらなる詳細については、Ｃｌａｒｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：６３０９−６３１５）を参照のこと。
【図９−１】図９は、トロンボモジュリン（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００６；２６：２４４５−２４５３後の改変型）のフィブリン溶解促進効果および抗フィブリン溶解効果の概略図を示す。低いＴＭ濃度でのクロット溶解時間の増大は、ＴＡＦＩ活性化の刺激に起因し、ＴＭの抗フィブリン溶解活性を示す。ウサギ肺ＴＭがより高い濃度では、プロテインＣの活性化とＴＡＦＩ活性化の阻害のためクロット溶解時間が減少し、これは、ウサギ肺ＴＭのフィブリン溶解促進活性を示す（実線）。１５ｎＭより上では、ウサギ肺ＴＭのフィブリン溶解促進活性は抗フィブリン溶解活性を上回り、全体的にフィブリン溶解促進効果がもたらされることに注目のこと。対照的に、可溶性ＴＭ類似体は抗フィブリン溶解効果のみを示す（破線）。
【図９−２】表１は、図４を作成するのに使用したデータ（各条件下での溶解時間の測定を可能にするためのＰＴＣＩの存在下での絶対溶解時間など）のまとめを示す。すべての場合において、溶解時間は、ＴＡＦＩａ阻害剤ＰＴＣＩの存在下で得られた溶解時間に相対的に示している。ＴＡＦＩはトロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター；ＰＴＣＩはイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害剤。
【図９−３】表２は、ＴＭＥ（Ｓｆ９）の部位特異的変異体類似体のクロラミンＴによる酸化を示す。クロラミンＴ処理後の結果を、対照での処理後の活性に対する割合で示した。＊二連の測定値の平均および平均値からの偏差。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
一実施形態において、トロンボモジュリン類似体は、トロンビンに対する結合親和性が低減された状態で使用され得る。そのため、該類似体により正常血漿およびＦＶＩＩＩ−ＤＰ中におけるクロット溶解が延長され得る（例えば１００ｎＭまで）（図４）。
【００２６】
この所見の重要性は、このようなトロンボモジュリン類似体が高濃度であっても、有害なフィブリン溶解促進効果なしで抗フィブリン溶解効果を示すことである。この濃度は、治療有効投薬量をはるかに超えている。したがって、ＴＭ類似体により線溶亢進を伴う凝固障害の処置が可能になる。
【００２７】
この理論に拘束されないが、本発明者らは、ＴＭ類似体のこの治療潜在力は、該類似体がトロンビンに対して著しく低減された親和性を示すことによって説明され得ることを示した。これは、トロンビンとウサギ肺トロンボモジュリンとの結合で観察された０．２ｎＭのＫＤ値（Ｅｓｍｏｎら，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８６，４８５：２１５−２２０）とは対照的に２３ｎＭのＫＤ値を見い出したＢａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ １９９６；２７１：１６６０３−１６６０８）によって示された。
【００２８】
したがって、本発明の一実施形態によれば、ウサギ肺トロンボモジュリンと比べてトロンビンに対する結合親和性が低減されたトロンボモジュリン類似体が、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のために使用され得る。
【００２９】
特に、０．２ｎＭより大きい、好ましくは、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、７．５ｎＭ、１０ｎＭ、１２．５ｎＭ、１５ｎＭ、１７．５ｎＭ、２０ｎＭ、２２．５ｎＭまたは２５ｎＭより大きいトロンビン結合に関するＫＤ、より好ましくは、１０〜３０ｎＭの範囲またはそれより大きいＫＤ値を示すトロンボモジュリン類似体が使用され得る。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体の低減されたフィブリン溶解促進活性は、プロテインＣを活性化させる能力（いわゆる「補因子活性」）の低減によるものであり得る。プロテインＣの活性化によってフィブリン溶解の上方調節がもたらされるため（Ｍｏｓｎｉｅｒら，２００１）、補因子活性の低下によりクロット溶解時間が延長される。当業者であれば、トロンボモジュリンの補因子活性を低下させるためのいくつかのストラテジーを知っている（例えば、グリコシル化の変更、タンパク質の二次もしくは三次構造の変更または好ましくは、一次構造の変更（例えば、１つ以上のアミノ酸の変異によって）など）。
【００３１】
また別の実施形態では、トロンボモジュリン類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌ（ここで、ＴＭＥは、６つのＥＧＦドメインのみからなる類似体を表す）と比べて補因子活性が低下したＴＭ類似体が使用され得る。
【００３２】
また、ＴＡＦＩの活性化によってフィブリン溶解の下方調節がもたらされるため（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ，２００６）、本発明によれば、ＴＡＦＩを活性化する能力（いわゆる「ＴＡＦＩ活性化活性」）が増大したトロンボモジュリン類似体も使用され得る。当業者にとって、トロンボモジュリンによるＴＡＦＩ活性化活性を増大させるためのいくつかのストラテジーがある（グリコシル化の変更、タンパク質の二次もしくは三次構造の変更または好ましくは、一次構造の変更（例えば、１つ以上のアミノ酸の変異によって）など）。
【００３３】
特に、本発明はまた、トロンボモジュリン類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率を有意に増大したトロンボモジュリン類似体を提供する。
【００３４】
注目すべきことに、本発明によれば、凝固障害の処置のために使用されるＴＭ類似体は、上記の特徴、すなわち：
（ｉ）ウサギ肺トロンボモジュリンと比べて低減されたトロンビンに対する結合親和性、および／またはｋＤ値が０．２ｎＭより大きいトロンビンに対する結合親和性；
（ｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌの補因子活性と比べて低下した補因子活性、あるいは
（ｉｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて増大した補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率
の１つ以上を有する。
【００３５】
本発明の一実施形態では、トロンボモジュリンは、正常被験体と比べて顕著に低減されたフィブリン溶解を伴って（または低減がわずかであっても）生じる任意の凝固障害を有するヒト患者を処置するために使用され得る。特に、以下の疾患：血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、後天性フォン・ヴィレブランド病、第Ｘ因子欠損症、パラ血友病、凝固第Ｉ、ＩＩ、ＶもしくはＶＩＩ因子の遺伝性障害、循環抗凝血素（例えば、第ＶＩＩＩ因子などの凝固因子に対する自己抗体）による出血性障害または後天性凝固欠損症は、該トロンボモジュリンの類似体によって処置され得る。
【００３６】
本発明の処置によって維持または達成され得る治療の好成績は、任意の具体的な患者の疾患の性質および程度に依存することは理解される。
【００３７】
本発明の特定の実施形態は、出血を予防するための凝固障害の予防的処置、または出血が起こったとき（「オンデマンド」）の急性処置に関するものである。トロンボモジュリン類似体での処置対象の出血事象は、生物体のどの器官または組織で起こるものであってもよく、最も重要ものは、中枢神経系（例えば、頭蓋内出血として）、関節、筋肉、胃腸管、呼吸路、腹膜後隙または軟部組織内で起こるものであり得る。
【００３８】
予防的処置では、ＴＭ類似体は患者に、一定間隔で長期間にわたって施与され得る。しかしながら、かなり限定された期間での複数回投与（「半長期的処置（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）も可能である。
【００３９】
本発明の一実施形態において、トロンボモジュリン類似体は、出血リスクがより高くなる前、例えば、手術または抜歯の前に施与される。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体は、血液もしくは血漿の輸血または凝固因子を用いた補充療法などの標準的な治療に対して抗療性の患者に投与される。
【００４１】
本発明によれば、ＴＭ類似体は、１週間未満から４週間までの合計期間にわたって、複数回用量で、好ましくは１日１回投与され得るが、２日に１回、または３日、４日、５日、６日もしくは７日おきに１回、より好ましくは長期投与として投与してもよい。したがって、本発明によれば、トロンボモジュリン類似体の複数回投与を可能にするのに適した医薬組成物が提供される。
【００４２】
ＴＭ類似体は、好ましくは、非経口適用として、例えば、静脈内または皮下適用によって非経口で施与される。静脈内または皮下でのボーラス適用が可能である。したがって、本発明によれば、トロンボモジュリンの非経口投与に適した医薬組成物が提供される。
【００４３】
本発明の一実施形態において、トロンボモジュリン類似体は、可溶性ＴＭ類似体、特に、細胞質ドメインが欠失しており、膜貫通ドメインが完全または部分的に欠失しているＴＭ類似体である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、トロンボモジュリン類似体は、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、またはＥＧＦ６を含む群、好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６を含む群、より好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含む群、最も好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ４〜ＥＧＦ６を含む群、から選択される少なくとも１つの構造ドメインを含み、特に、上皮増殖因子３（ＥＧＦ３）〜ＥＧＦ６のｃループを含む断片を含むものである。
【００４５】
可溶性トロンボモジュリンの種々の形態、例えば、いわゆるＡＲＴ−１２３（Ａｓａｈｉ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（東京，日本）によって開発されたもの）または組換え可溶性ヒトトロンボモジュリンであるＳｏｌｕｌｉｎ（現在、ＰＡＩＯＮ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，アーヘン（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって開発中）が当業者に知られている。組換え可溶性トロンボモジュリン、すなわち、アミノ酸配列の改変なしの可溶性トロンボモジュリンは、Ａｓａｈｉ社の特許ＥＰ０３１２５９８の主題である。
【００４６】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、可溶性であるとともにプロテアーゼと酸化に抵抗性であるヒトトロンボモジュリン類似体であり、したがってインビボで長寿命を示す。Ｓｏｌｕｌｉｎは、トロンビンを排他的に阻害するものでないため、その主な特徴は広い作用機序にある。また、これは、ＴＡＦＩおよび天然プロテインＣ／プロテインＳ経路も活性化する。トロンビン結合が低減される結果、Ｓｏｌｕｌｉｎは、さらに高濃度までフィブリン溶解を阻害する。
【００４７】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、とりわけ、欧州特許０６４１２１５ Ｂ１、ＥＰ０５４４８２６ Ｂ１ ならびにＥＰ０５２７８２１ Ｂ１の主題である。Ｓｏｌｕｌｉｎは、天然ヒトトロンボモジュリンの配列（配列番号１）と比較すると、以下の位置での改変を含む：Ｇ−３Ｖ、アミノ酸１〜３の除去、Ｍ３８８Ｌ、Ｒ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、Ｓ４７４ＡおよびＰ４９０での終結。この番号付けシステムは、配列番号１と配列番号３の天然トロンボモジュリンに従っている。本発明の好ましい一実施形態としてのＳｏｌｕｌｉｎの配列を配列番号２に示す。
【００４８】
しかしながら、注意すべきことに、本発明によれば、上記の特性または上記の欧州特許文献ＥＰ０５４４８２６ Ｂ１、ＥＰ０６４１２１５ Ｂ１およびＥＰ０５２７８２１ Ｂ１に概要が示された特性の１つだけ、または１超を含むトロンボモジュリン類似体もまた使用され得る。
【００４９】
本発明により適用可能な特に好ましいトロンボモジュリン類似体は、
以下の特性：
（ｉ） 酸化抵抗性を示す
（ｉｉ） プロテアーゼ抵抗性を示す
（ｉｉｉ） 均一なＮ−末端またはＣ−末端を有する
（ｉｖ） 例えば、天然トロンボモジュリン（配列番号１）のグリコシル化部位の少なくとも一部のグリコシル化によって翻訳後修飾されている
（ｖ） 線形の二重逆数トロンビン結合特性を有する
（ｖｉ） デタージェントの量が比較的少ない水溶液中で可溶性であり、典型的には膜貫通配列がない
（ｖｉｉ） グリコサミノグリカン鎖がない
の１つ以上を有するものである。
【００５０】
本発明に使用されるこのような類似体の製造は、上記の欧州特許文献に開示されている。
【００５１】
本発明の一実施形態では、Ｓｏｌｕｌｉｎの６つのＥＧＦドメインのみ、特に、ＥＧＦ４〜ＥＧＦ６ドメインからなるＳｏｌｕｌｉｎ断片が使用され得る。
【００５２】
一実施形態では、ＷＯ９３／２５６７５で知られているような補因子活性が低減されたトロンボモジュリン類似体が使用され得る。対照ヒト可溶性トロンボモジュリン（ＴＭＥＭ３８８Ｌ）の約５０％以下の補因子活性を有する一連のトロンボモジュリン類似体を本明細書において記載する。
【００５３】
より詳しくは、前記トロンボモジュリン類似体は、トロンビンに結合すると、ＴＭＥＭ３８８Ｌとの結合と比べて５０％以下の改変補因子活性を示す。前記類似体は、配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｆ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｉ） ３６８Ｔｙｒ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；
ａｎ） ３８５Ａｒｇ；
ｂａ） ３８７Ｇｌｎ；
ｂｂ） ３８９Ｐｈｅ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
を有する。
【００５４】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。便宜上、左側の表記、例えば、ａａ）は、各改変部位に対して同一である。最初の文字はＥＧＦドメインを表し、ここで、ａはＥＧＦ４であり；ｂはＥＧＦ５であり、ｃはＥＧＦ６である。２番目の文字は、配列表（ｔｈｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）内の他の残基に対する改変の相対位置を表す。また、本明細書において、上記のＴＭ類似体をコードする核酸も示す。
【００５５】
以下の類似体は、上記に示した類似体の好ましいサブセットを構成し、これらの類似体は、対照ＴＭＥＭ３８８Ｌの２５％以下の補因子活性を有する。このような類似体は、１つ以上のアミノ酸置換（好ましくは１つだけ）（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｏ） ４２３Ａｓｐ；
ｂｐ） ４２４Ｉｌｅ；
ｂｑ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
を有する。
【００５６】
プロテアーゼ活性、脂肪族置換、酸化抵抗性および均一な末端に関する上記に示した改変は、対照の５０％未満の補因子活性を有する上記の類似体にも適用可能である。
【００５７】
好ましいのは、対照の３０％未満の活性を有する上に列挙したものである。このような類似体は、ドメイン４における変異によって表される。このような類似体は、１つ以上のアミノ酸置換（好ましくは１つだけ）（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；または
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ
を有する。
【００５８】
また、本明細書では、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないＫＤ値を有する類似体を記載する。ＥＧＦ５およびＥＧＦ６はトロンビンに対する高親和性結合に重要な役割を果すことがわかっているが、結合におけるＥＧＦ４の役割の重要性が低いことが、ＴＭ／トロンビン複合体に対する補因子活性の付与に重要である。この理由のため、ＥＧＦ反復配列５および６に改変を有する類似体は、ほぼ同じ補因子活性を有し得るが、ＴＭＥＭ３８８Ｌ、例えば（Ｓ４０６Ａ）と比べてＫＤは小さい。ＥＧＦ反復配列５および６に改変を有する類似体（補因子活性の低下がもたらされたもの）を以下に示す。このような類似体は、１つ以上のアミノ酸置換（好ましくは１つだけ）（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
を有する。
【００５９】
上記の類似体は、それぞれのドメイン（すなわち、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５またはＥＦＧ６）ならびにそれぞれの相対活性によっても分類され得る。例えば、対照のおよそ５０％の補因子活性を有するＥＧＦ４の類似体は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｆ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｉ） ３６８Ｔｙｒ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；または
ａｎ） ３８５Ａｒｇ
である。
【００６０】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００６１】
ＥＧＦ４に対照の２５％未満の補因子活性を有するものは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；または
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ
である。
【００６２】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００６３】
ＥＧＦ５において、以下の改変（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；または
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ
により、補因子活性が少なくとも５０％の低下した類似体がもたらされた。
【００６４】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。とりわけ、このような類似体は、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体である。
【００６５】
ＥＧＦ５において、該類似体は、補因子活性が少なくとも７５％低下した類似体をもたらした改変（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；または
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ
に従ってさらに小群に分けられ得る。
【００６６】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。とりわけ、このような類似体は、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体である。また、上記の類似体をコードする核酸も示す。
【００６７】
ＥＧＦ６に関して、その群を以下に示す。対照の５０％未満の補因子活性を有するものは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
である。
【００６８】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００６９】
対照の２５％未満の補因子活性を有するものは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
である。
【００７０】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。好ましい類似体は、可溶性、プロテアーゼ抵抗性、酸化抵抗性ならびに均一な末端に関するさらなる改変を有する上記に示したものである。このような類似体をコードする核酸もまた、特許請求の範囲に記載の発明の一部である。その他の群と同様、このような類似体は、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有するものを包含する。
【００７１】
該類似体は、特定の位置に改変アミノ酸を有するものに従ってさらに小群に分けられ得、前記類似体は、前記の位置に天然残基を有する類似体と比べて本質的に同等のトロンビンに対するＫＤを有し、前記の位置は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；または
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ
に対応する。
【００７２】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。このような類似体は、対照の３０％未満の改変されたｋＣａｔ／Ｋｍを有するものであり得る。
【００７３】
以下の部位は、前記の位置に天然残基を有する類似体と比べて改変されたＫＤまたはｋＣａｔ／Ｋｍを有する記載の類似体を包含し、前記の位置は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａｆ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；
ａｎ） ３８５Ａｒｇ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；または
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ
に対応する。
【００７４】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。これらは、さらに、ともに改変されたＫＤとｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体、特に、少なくとも２０％改変されたものを包含する。
【００７５】
以下の部位は、低い補因子活性を有し、前記の位置に天然残基を有する類似体と比較した場合、本質的に同等のＫＤまたはｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体を示し、前記の位置は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
に対応する。
【００７６】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００７７】
以下の位置は、補因子活性の少なくとも７５％の低下がもたらされたが、ｋｃａｔ／Ｋｍは本質的にほとんど変化しなかった改変について小群分けしたものを示す（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ。
【００７８】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。トロンビンに対するＫＤが少なくとも３０％改変された上記の改変のさらなる小群分けを行なってもよい。
【００７９】
さらに、本発明は方法を提供する。より詳しくは、本明細書において、改変されたトロンビン結合のＫｄを示すトロンボモジュリン類似体のスクリーニングに有用な方法であって、
ａ） 位置（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ；
にアミノ酸置換を作製する工程、および
ｂ） トロンビンに対するＫＤを対照分子と比較する工程
を含む方法を記載する。
【００８０】
この方法において用いる場合、アミノ酸置換を１つだけ有するＴＭ類似体が好ましい。本発明の種々の実施形態は、前記ＫＤが少なくとも３３％改変されたもの、または前記改変がアミノ酸置換であるもの、または前記対照分子がＴＭＥＭ３８８Ｌであるものを包含する。該方法における使用のための改変の好ましい群分けは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
である。
【００８１】
この方法において用いる場合、アミノ酸置換を１つだけ有するＴＭ類似体が好ましい。
【００８２】
本明細書において、トロンビンへの結合に関して改変された補因子活性を有するトロンボモジュリン類似体のスクリーニングに有用な別の方法であって、
ａ） 位置（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
にアミノ酸置換を作製する工程、および
ｂ） トロンビンへの結合に関する補因子活性の割合を対照分子の割合と比較する工程
を含む方法を記載する。
【００８３】
この方法において用いる場合、アミノ酸置換を１つだけ有するＴＭ類似体が好ましい。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３７６位（配列番号１または配列番号３）のフェニルアラニン残基の改変を有する。この残基は、当業者によく知られた方法によって化学的または生化学的に改変され得るか、または欠失され得る。該フェニルアラニン残基は、好ましくは脂肪族アミノ酸で、より好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンで置換され、最も好ましくはアラニンで置換される。アラニンでのＰｈｅ３７６の置換（「Ｆ３７６Ａ」）により、ＴＡＦＩ活性化活性を保持したまま、トロンボモジュリン類似体の補因子活性がかなり減少することが実証された（図７参照）。その結果、Ｆ３７６Ａ−ＴＭ類似体では、補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率が増大している。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３８７位（配列番号１または配列番号３）のグルタミン残基の改変を有する。該グルタミン残基は、好ましくは、以下のアミノ酸（得られる変異体Ｇｌｎ３８７Ｘ−ＴＭ類似体（図８Ａ参照）の補因子活性の降順に）：Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換される。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３８８位（配列番号１または配列番号３）のメチオニン残基の改変を有する。該メチオニン残基は、好ましくは、以下のアミノ酸（得られる変異体Ｍｅｔ３８８Ｘ−ＴＭ類似体（図８Ｂ参照）の補因子活性の降順に）：Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換される。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３８９位（配列番号１または配列番号３）のフェニルアラニン残基の改変を有する。該フェニルアラニン残基は、好ましくは、以下のアミノ酸（得られる変異体Ｐｈｅ３８９Ｘ−ＴＭ類似体（図８Ｃ参照）の補因子活性の降順に）：Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏで置換される。
【００８８】
本発明の別の実施形態では、３つのアミノ酸Ｇｌｎ３８７、Ｍｅｔ３８８およびＰｈｅ３８９からなるＴＭのドメイン間ループが部分的もしくは完全に欠失しているか、または該ループに１つ以上のアミノ酸、好ましくはアラニン残基（図８Ｄ参照）が挿入されている。
【００８９】
位置Ｐｈｅ３７６、Ｇｌｎ３８７、Ｍｅｔ３８８またはＰｈｅ３８９に改変を有するこのような好ましいＴＭ類似体について、該ＴＭ類似体は完全長または可溶性のＴＭ類似体であり得、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６を含む、好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含むものであり得る。好ましい実施形態では、このような類似体は、ＴＭ類似体Ｓｏｌｕｌｉｎに示される置換を含むものである。より好ましい実施形態では、このようなＳｏｌｕｌｉｎ由来ＴＭ類似体は、ＥＧＦ１〜ＥＧＦ６のみ、特にＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６のみからなるものである。
【００９０】
本発明の実施形態では、トロンボモジュリン類似体は酸化型形態で使用される。タンパク質の制御酸化のためのいくつかの手法が当業者に知られている。ＴＭ類似体は、好ましくは、クロラミンＴ、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化される。
【００９１】
さらに、本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のために使用されるＴＭ類似体のスクリーニングに有用な方法に関する。この方法は、好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６内、より好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６内、最も好ましくはアミノ酸位置Ａｓｐ３４９とＡｓｐ４６１の間における１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって、トロンボモジュリンのアミノ酸配列を改変する第１の工程を含む。当業者には、タンパク質の配列を、例えば、部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発によって改変した後、選択するためのいくつかの手法が知られている。
【００９２】
第２の工程では、該改変ＴＭ類似体は、以下の特性：トロンビンに対する結合親和性（ＫＤ値）、補因子活性、ＴＡＦＩ活性化活性もしくはＴＡＦＩａ産生能（ＴＡＦＩａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、ＴＡＦＩ活性化活性と補因子活性の比率、タンパク質酸化の効果、インビトロアッセイでのクロット溶解時間に対する効果、または凝固関連動物モデルにおける効果からなる群より選択される１つ以上について対照タンパク質と比較される。
【００９３】
対照タンパク質としては、トロンボモジュリンタンパク質または類似体、好ましくは、ウサギ肺トロンボモジュリンまたは６つのＥＧＦドメインを含むヒトＴＭ類似体が使用される。ＴＭ類似体は、天然アミノ酸配列を有するものであってもよく、あるいはまた、１つ以上の改変（Ｍ３８８Ｌ置換など）を有するものであってもよい。
【００９４】
さらに、本発明は、抗フィブリン溶解効果を示すトロンボモジュリン類似体の治療有効量を投与する工程を含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法に関する。
【００９５】
特に、この処置方法は、対照タンパク質と比べて以下の特徴：低減されたトロンビンに対する結合親和性、ｋＤ値が０．２ｎＭより大きいトロンビンに対する結合親和性、有意に低下した補因子活性、または補因子活性に対する増大したＴＡＦＩ活性化活性の比率の１つ以上を示すＴＭ類似体を含む。対照タンパク質としては、トロンボモジュリンタンパク質または類似体、好ましくは、ウサギ肺トロンボモジュリンまたは６つのＥＧＦドメインを含むヒトＴＭ類似体が使用される。ＴＭ類似体は、天然アミノ酸配列を有するものであってもよく、あるいはまた、１つ以上の改変（Ｍ３８８Ｌ置換など）を有するものであってもよい。
【００９６】
定義
本発明との関連において用いる場合、用語「抗フィブリン溶解効果」は、トロンボモジュリン類似体が、該トロンボモジュリン類似体の添加なしでの同一アッセイ条件と比べてクロット溶解時間（実施例Ｉに記載）を延長する能力をいうものとする。この抗フィブリン溶解効果は、ＴＭ類似体の抗フィブリン溶解活性が、そのフィブリン溶解促進活性と比べて優勢なためである。
【００９７】
本明細書で用いる場合、用語「フィブリン溶解促進効果」は、トロンボモジュリン類似体が、該トロンボモジュリン類似体の添加なしでの同一アッセイ条件と比べて、インビトロアッセイ（実施例Ｉに記載する通り）においてクロット溶解時間を有意に低減する能力をいうものとする。
【００９８】
用語「有意に低減する」および「有意に延長する」は、本明細書で用いる場合、ｐ＝０．１レベルで基底値と有意に異なるクロット溶解時間の延長もしくは低減をいう、および／または１０％を上回る、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、最も好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％ １００％、１５０％または２００％を上回る延長もしくは低減をいう。
【００９９】
本発明との関連において用いる場合、文言「処置する」、「処置すること」または「処置」は、出血事象を予防的に抑制するか、または出血事象を緩和、改善もしくは停止させるかのいずれかのために、本発明のＴＭ類似体または該類似体を含む任意の組成物を使用することをいう。該文言は、特に明示していない限り、治癒（ｃｕｒｉｎｇ）もしくは治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）ならびに緩和、軽快または予防のいずれかを包含する。また、本明細書で用いる場合、文言「患者」は、ヒトを含む哺乳動物をいう。
【０１００】
本明細書で用いる場合、用語「線溶亢進を伴う凝固障害」は、血液の凝固性が障害され、それにより、フィブリン溶解の顕著な増大によって出血事象が引き起こされるか、悪化するか、または長期化する疾患としての凝固障害をいうものとする。
【０１０１】
本発明との関連において用いる場合、用語「トロンボモジュリン類似体」は、膜結合型または可溶性のトロンボモジュリンと同じ特徴的な生物学的活性を有するタンパク質およびペプチドの両方をいう。生物学的活性は、トロンビンの受容体として作用し、ＴＡＦＩの活性化を増大させる、または天然トロンボモジュリンと関連している他の生物学的活性を増大させる能力である。
【０１０２】
用語「結合親和性」は、本明細書で用いる場合、トロンボモジュリン類似体とトロンビンとの親和性の強度をいい、解離定数ＫＤで示される。トロンビンとトロンボモジュリンとの結合親和性のＫＤ値は、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ解析）によって決定し得る。結合親和性は、好ましくは、本発明の実施例ＩＩに記載の速度論アッセイを用いて解析される。
【０１０３】
「ＫＤ」は、ＴＭ類似体とトロンビンとの相対結合親和性をいう。高いＫＤ値は低い結合親和性を表す。ＫＤを決定するための厳密なアッセイおよび手段を実施例ＩＩに示す。
【０１０４】
用語「補因子活性」は、本明細書で用いる場合、トロンボモジュリン類似体が、トロンビンと複合体を形成してトロンビンのプロテインＣの活性化能力を増強する能力をいう。補因子活性を測定するために使用されるアッセイ手順を本発明の実施例ＩＩＩに示す。
【０１０５】
用語「ＴＡＦＩ活性化活性」は、本明細書で用いる場合、トロンボモジュリン類似体が、トロンビンと複合体を形成してトロンビンのＴＡＦＩの活性化能力を増強する能力をいう。ＴＡＦＩ活性を測定するために使用されるアッセイ手順を本発明の実施例ＩＶに示す。
【０１０６】
「Ｋｍ」は、ミカエリス定数をいい、種々の基質濃度で測定される触媒反応速度を測定することにより標準的な様式で誘導される。これは、反応速度がその最大値の半分になる基質濃度に等しい。本発明のＴＭ類似体の「Ｋｍ」は、トロンビン濃度を一定レベル（例えば、１ｎＭ）に維持し、ＫＤに応じたＴＭの飽和レベル（例えば、１００ｎＭ以上）を使用することにより決定する。反応は、漸増濃度のプロテインＣ（例えば、１〜６０μＭ）を用いて行なう。次いで、ラインウィーバー−バークプロットまたは非線形回帰解析を用いてＫｍおよびｋｃａｔを決定する。
【０１０７】
「ＴＭＥ」は、６つのＥＦＧ反復配列（配列番号１または配列番号３によるアミノ酸２２７〜４６２）からなるＴＭの類似体をいう。
【０１０８】
「ＴＭＥＭ３８８Ｌ」は、天然メチオニンの３８８位（配列番号３に基づく）にロイシン残基による置換を有する６つのＥＦＧ反復配列（ａａ２２７〜４６２）からなるＴＭの類似体をいう。
【０１０９】
用語「治療有効量」は、線溶亢進を伴う凝固障害と関連している症状（出血事象など）を低減する活性成分の量と定義する。また、「治療上有効」とは、無処置と比べて、障害の重症度、発生の頻度または持続期間における任意の改善をいう。
【実施例】
【０１１０】
Ｉ．実施例
ヒト血漿でのクロット溶解アッセイ
インビトロクロット溶解モデルを使用し、可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）が正常血漿と第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の混合物において、クロット溶解時間を減少または増大させる能力を試験した。
【０１１１】
１．試験系
この血漿組成物中で、トロンビン（第ＩＩａ因子）、塩化カルシウムおよびホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン（ＰＣＰＳ）小胞を混合することにより、インビトロで凝固を起こした。凝固およびフィブリン溶解の時間的推移を濁度アッセイにより調べ、「ＴＡＦＩａ産生能」を、機能アッセイを用いて調べた。
【０１１２】
２．実験手順
材料．トロンビンおよびフィブリノゲンは、１点を除き（フィブリノゲンの調製では、β−アラニン沈殿処理後、水中４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００を添加することによって、溶液を２％ＰＥＧ−８０００ではなく１．２％ＰＥＧ−８０００にしたこと）、Ｗａｌｋｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：５２０１−５２１２）に記載のようにして調製した。このプロトコルの変更によって、より多くのフィブリノゲンを得ることが可能になった。ＴＡＦＩａアッセイで使用したＱＳＹ−ＦＤＰ（クエンチャーであるＱＳＹ９ Ｃ５−マレイミドに共有結合させたフィブリン分解生成物）およびＴＡＦＩａ標準品は、既報のとおりに調製し（Ｋｉｍら，２００８；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７２：３２−４０；Ｎｅｉｌｌら，２００４；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３０：３３２−３４１）、組換えヒトＰｇ（Ｓ７４１Ｃ）およびフルオレセイン誘導体（５ＩＡＦ−Ｐｇ）は、Ｈｏｒｒｅｖｏｅｔｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ １９９７；２７２：２１７６−２１８２）に記載のとおりに調製した。Ｓ５２５Ｃ−プロトロンビンを、Ｂｒｕｆａｔｔｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：１７６６３−１７６７１）に既報のようにして精製し、５−ヨードアミドフルオレセイン（５ＩＡＦ）で蛍光標識した。ＱＳＹ９ Ｃ５−マレイミドおよび５−ヨードアミドフルオレセインは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（バーリントン，ＯＮ，カナダ）から購入した。プラスミンはＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＶＴ，ＵＳＡ）から購入し、組換えヒト可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ；ｓＴＭ）は、Ｐａｉｏｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（アーヘン，ドイツ）から提供された。正常ヒトプール血漿（ＮＰ）は、カナダのオンタリオ州キングストンのキングストン総合病院（ＫＧＨ）の血液バンクの健常ドナーから取得し、ＦＶＩＩＩ欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（ハミルトン，ＯＮ，カナダ）から購入した。ＴＡＦＩ欠損血漿（ＴＤＰ）は、固定化した抗ヒトＴＡＦＩモノクローナル抗体のカラムでの正常血漿のアフィニティクロマトグラフィーによって、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：１０２１−１０３０）に記載のとおりに調製した。プラスミン阻害剤Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓクロロメチルケトン（ＶＦＫｃｋ）、トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＰＰＡｃｋ）およびイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＴＣＩ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。組織型プラスミノゲン活性化因子（Ａｃｔｉｖａｓｅ；ｔＰＡ）は、ＫＧＨ（キングストン，ＯＮ，カナダ）の薬局から購入し、他の試薬はすべて分析用品質のものであった。
【０１１３】
３．方法
ＴＡＦＩ活性化の程度を調べるためのクロット溶解アッセイおよび試料の調製
ＦＶＩＩＩ−ＤＰをＮＰと、ＮＰの最終割合が０、１、６、１０、５０または１００％（０〜１００％ＮＰ）となるように混合した。混合前に、各血漿を光学密度が３２になるまで希釈し、１．５ｎＭ ｔＰＡ、４０μＭ ＰＣＰＳおよび２０ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する等容量の溶液に、２０ｎＭのトロンビンの存在下または非存在下で添加し（終濃度：０．７５ｎＭ ｔＰＡ，２０μＭ ＰＣＰＳ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２、±１０ｎＭトロンビン）、試料を複数のエッペンドルフチューブに分け、３７℃の水浴中に入れた。これらのチューブにおいて、種々の時点で、トロンビンとプラスミンをそれぞれ選択的に阻害するための、１０μＭ ＰＰＡｃｋおよび１０μＭ ＶＦＫｃｋを添加することによって凝固および溶解を停止させた。試料を激しく混合し、次いで、１６０００ｇで３０秒間遠心分離し（室温）、ＴＡＦＩａの熱不活化を防ぐために直ちに氷上に置いた。各試料の上清をＴＡＦＩ欠損血漿で５倍ずつ連続希釈し、Ｋｉｍら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００８；３７２：３２−４０）により記載された機能アッセイを用いてＴＡＦＩａを測定した。同一の実験を、覆いをした９６ウェルプレートで行ない、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ分光測光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，サニーベール，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて経時的に４００ｎｍで濁度をモニタリングし、凝固およびフィブリン溶解のタイミングを調べた。４つのｔＰＡ濃度（０．２５、０．７５、１．５および３ｎＭ）において可溶性トロンボモジュリン（０〜１００ｎＭ）の存在下または非存在下で同様の実験を行ない、ＴＡＦＩ活性化と溶解時間に対するｓＴＭの効果を調べた。また、これらの実験を、５μＭのＰＴＣＩの存在下でも行なうと、正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿においてＴＡＦＩａ依存性溶解延長が示された。
【０１１４】
正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿中でのプロトロンビン活性化の時間的推移の測定
正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿（０〜１００％ＮＰ）に、プロトロンビン誘導体（５ＩＡＦ−ＩＩ；３００ｎＭ最終）ならびに２０μＭ ＰＣＰＳおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２を、１０ｎＭトロンビンの存在下で補給して凝固を開始させた。この実験は、不透明なプラスチックカバー付きの９６ウェルプレート内で行なった。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＧｅｍｉｎｉＸＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，サニーベール，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、経時的に３７℃にて、それぞれ４９５ｎｍおよび５３５ｎｍの励起波長および発光波長で、５３０ｎｍ発光カットオフフィルターを用いて蛍光強度をモニタリングした。蛍光のベースラインと完全なプロトロンビン活性化と相関する最大蛍光を反映させるために蛍光を標準化した（０〜１）。
【０１１５】
ＴＡＦＩａ産生能の測定
ＴＡＦＩａプロット下面積を、実験過程にわたるＴＡＦＩａの効果を定量するためのパラメータとして選択した。このパラメータを、Ｈｅｍｋｅｒら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９３；８５：５−１１）によって定義された「トロンビン産生能」と同様に「ＴＡＦＩａ産生能」と命名した。ＴＡＦＩａ産生能は、トロンビン産生能と同様、切断された基質の量に比例し、数学的には以下のとおりに説明される：
【０１１６】
【数１】
（式中、ｄＳ／ｄｔは基質の消費速度であり、Ｓは基質である）。
【０１１７】
Ｓが一定（すなわち、Ｓの消費が限定的）の場合
【０１１８】
【数２】
ある区間０〜ｔでは、
【０１１９】
【数３】
等式（４）の右側の積分がＴＡＦＩａプロット下面積であることを認識すると、
【０１２０】
【数４】
４．結果
クロット溶解時間は、正常血漿をＦＶＩＩＩ欠損血漿に添加することによって増大する
１０ｎＭの第ＩＩａ因子、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および２０μＭ ＰＣＰＳの小胞を用いて凝固を開始し、クロット構造物がＦＶＩＩＩ濃度に対して非感受性であるモデルを作出した。ＦＶＩＩＩ濃度に関係なくクロット構造物が類似しているため、ｔＰＡ依存性（０．７５ｎＭ）のクロット溶解に対するＦＶＩＩＩの効果を調べることができる。この溶解モデルを使用すると、正常血漿の割合が増加するにつれて溶解時間が増大した。図１は、正常血漿を０〜１００％で添加したＦＶＩＩＩ−ＤＰのクロット溶解プロフィールを示し、溶解時間を図１にまとめている（差し込み図）。ＦＶＩＩＩ−ＤＰでは、溶解時間は３７分であり、正常血漿の添加によっておよそ５０％増大され得る。
【０１２１】
１０％正常血漿は、ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でのクロット溶解を回復させるのに充分である
１０％正常血漿で、ＦＶＩＩＩ−ＤＰと関連している溶解時間の短縮は、正常血漿で観察される時間まで修正された（図１，差し込み図参照）。
【０１２２】
５０％ＴＡＦＩａ産生能はＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でのクロット溶解を回復させるのに充分である
ＴＡＦＩ活性化を正常血漿、ＦＶＩＩＩ欠損血漿および混合血漿において測定し、活性化の時間的推移に対するＦＶＩＩＩの効果を定量した。機能アッセイを使用し、凝固および溶解の時間的推移にわたるＴＡＦＩａを測定し、その結果を図２に示している。トロンビン、カルシウムイオンおよびＰＣＰＳを用いてＦＶＩＩＩ−ＤＰ中で凝固を開始した場合、５分後、およそ３０ｐＭのＴＡＦＩａが測定された。正常血漿の割合が増加するにつれて、ＴＡＦＩａのピーク濃度も増大した。ＦＶＩＩＩ−ＤＰに１０％正常血漿を補給することによって溶解時間は修正されたが、これは、ＴＡＦＩ活性化を完全に修正するには充分ではなかった。ＴＡＦＩａ時間推移プロット下面積（図２Ａ）を計算することにより、最初の５０分間では、正常血漿中と５０％正常血漿中で、ほぼ同じＴＡＦＩａ産生能（図２Ｂ）が得られる（それぞれ、１６８００ｐＭ分および１４１００ｐＭ分）が、１０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰ血漿が有したＴＡＦＩａ産生能は、正常血漿におけるＴＡＦＩａ産生能のわずか５０％であることが測定された。
【０１２３】
溶解時間とＴＡＦＩａ産生能間には強い相関がある
０〜１００％のＦＶＩＩＩの範囲にわたる溶解時間とＴＡＦＩ活性化間の関係を定量するため、ｌｏｇ溶解時間に対してｌｏｇ ＴＡＦＩａ産生能をプロットした（図２Ｂ，差し込み図）。予測どおり、データは、０〜１００％のＦＶＩＩＩを含有する血漿中において溶解時間とＴＡＦＩａ産生能間の強い正の相関を示す。トロンビンはＴＡＦＩの活性化因子であるため、図２ＡのＴＡＦＩ活性化プロフィールは、血漿中でのプロトロンビン活性化を解析することにより合理的に説明され得る（図３）。一般的な傾向は、正常血漿の割合が増加するにつれて、プロトロンビンの活性化速度も増大する（これは、図３の曲線の傾きを調べることによって決定され得る）というものである。正常血漿では例外が生じる。正常血漿では、プロトロンビンの活性化速度は、５０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰよりも低い。この速度は正常血漿中では遅いが、プロトロンビン活性化は、５０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰ中よりも約２倍長く持続する。どの実験でも、プロトロンビン活性化のタイミングは、ＴＡＦＩ活性化に充分対応している。また、正常血漿を、トロンビンを添加せずにカルシウムイオンとＰＣＰＳを用いて凝固させた。カルシウム誘導性の凝固はすぐには起こらない；正常血漿中でクロットが形成されるのにおよそ１５分かかる。この時点で、プロトロンビン活性化は伝播期に入り、その結果、ＴＡＦＩが活性化される。クロットの形成に関するＴＡＦＩ活性化の程度とタイミングは、凝固が添加トロンビンの存在下で開始しようと非存在下で開始しようと同じであり、これは、ＴＡＦＩ活性化が、インサイチュで生成されたトロンビンの結果であって、凝固を誘導するために添加されたトロンビンの結果ではないことを示唆する。トロンビンの存在下では、ＴＡＦＩａ産生能が１６，８００ｐＭ分であったのに対して、トロンビンの非存在下では１４，１５０ｐＭ分であった。
【０１２４】
可溶性トロンボモジュリンは正常血漿とＦＶＩＩＩ欠損血漿においてクロット溶解を延長する
正常血漿では、ピークＴＡＦＩａレベルおよびＴＡＦＩａ産生能は、それぞれ、ｓＴＭの非存在下での６００ｐＭおよび１６８００ｐＭ分から、それぞれ、１０ｎＭのｓＴＭの存在下で、およそ６０００ｐＭおよび１５０，０００ｐＭ分に増大した。このＴＡＦＩ活性化の増大により、溶解時間の７０％の増大がもたらされた。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での溶解の相対的延長に対する１０ｎＭのｓＴＭの効果は、ＦＶＩＩＩ−ＤＰをｓＴＭの存在下で凝固および溶解させると溶解が６５％延長したという点で、正常血漿と類似していた。１０ｎＭのｓＴＭの存在下では、ピークＴＡＦＩａ濃度で７５０ｐＭのＴＡＦＩａが存在したのに対して、ｓＴＭの非存在下では３０ｐＭであった。クロットの開始からクロット溶解時間までの時間中、ＴＡＦＩａ産生能は、１０ｎＭのｓＴＭの存在下で１２８００ｐＭ分であると測定されたのに対して、ｓＴＭの非存在下では６００ｐＭ分であった。
【０１２５】
正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿におけるクロット溶解時間の増大はｔＰＡとｓＴＭの濃度に依存する
溶解時間に対するＴＡＦＩ活性化の効果をｔＰＡ濃度およびｓＴＭ濃度の範囲にわたって解析し、ＦＶＩＩＩ−ＤＰにおける溶解の欠陥がＴＡＦＩ活性化の刺激によって修正され得るかどうかを調べた。図４にまとめた溶解時間は、ＴＡＦＩａの阻害剤であるＰＴＣＩを含めた同様の実験での溶解時間との対比である。ＰＴＣＩの存在下では、機能性ＴＡＦＩａは存在せず、そのため図４に示した相対溶解時間は、ＴＡＦＩａ依存性溶解延長に典型的なものである。最も低いｔＰＡ濃度（０．２５ｎＭ）では、１ｎＭのｓＴＭを正常血漿に添加した場合、最大のＴＡＦＩａ依存性溶解延長（２倍）が観察された。ＦＶＩＩＩ−ＤＰにｓＴＭを補給すると、溶解時間の用量依存性の延長が引き起こされた（図４）。１００ｎＭのｓＴＭをＦＶＩＩＩ−ＤＰに添加した場合、溶解時間は、正常血漿でみられる時間まで完全に修正された。ｔＰＡ濃度を増大させるにつれて、最大のＴＡＦＩａ依存性溶解延長を得るために、より高濃度のｓＴＭが必要とされた。例えば、１．５ｎＭのｔＰＡ（図４）を存在させた場合、ＴＡＦＩａ依存性溶解延長を最大にするために、正常血漿中では２５ｎＭのｓＴＭが必要とされ、ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では１００ｎＭのｓＴＭが必要とされる。また、このクロット溶解実験でｔＰＡが増加するにつれて、ＴＡＦＩａは、溶解時間に対してずっと大きな効果を有するようである（１．５ｎＭ ｔＰＡでは５．２倍までに対して０．２５ｎＭ ｔＰＡでは２．３倍）。ｔＰＡ濃度が増加するにつれて、任意のＴＡＦＩａ依存性溶解延長を得るために必要とされるｓＴＭの濃度も増大するようである。０．２５ｎＭ ｔＰＡでは、正常血漿において溶解延長を得るためにｓＴＭは必要とされなかったが、３ｎＭのｔＰＡ（図４）を正常血漿に添加すると、溶解延長を得るために２５ｎＭのｓＴＭが必要とされた。実際の溶解時間がｔＰＡおよびｓＴＭによってどのように影響されるのかを示すため、ＴＡＦＩａ阻害正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿での溶解時間を表１に示す。
【０１２６】
トロンボモジュリンは、正常血漿とＦＶＩＩＩ欠損血漿の両方において、十分に実質的にＴＡＦＩ活性化を促進し、溶解を延長する
正常血漿では、ｓＴＭの非存在下（○；６００ｐＭのＴＡＦＩａ；図５Ａ参照）と比べて、１０ｎＭのｓＴＭの存在下で（●；ピークレベルで６０００ｐＭのＴＡＦＩａ）、ＴＡＦＩ活性化が有意に増大していることが示されている。ｓＴＭを伴うクロット溶解プロフィールは、１０ｎＭのｓＴＭの添加により、溶解時間の７０％の増大がもたらされたことを示す。１０ｎＭのｓＴＭを補給したＦＶＩＩＩ−ＤＰでは、ＴＡＦＩａは、ｓＴＭの非存在下で３０ｐＭであるのに比べて、ピークでは７５０ｐＭであると測定された（図５Ｂ参照）。ＴＡＦＩ活性化の増大により、ｓＴＭなしのＦＶＩＩＩ−ＤＰと比べて溶解の６０％延長がもたらされた。
【０１２７】
ＩＩ．実施例
トロンビンとトロンボモジュリンの結合親和性の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、ＫＤ値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合について測定した。
【０１２８】
１．試験系
トロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合の親和性は、蛍光速度論アッセイを用いて測定し、ＫＤ値で表示した。
【０１２９】
２．実験手順
材料
ヒトトロンビンは血漿から、Ｂａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１４４７７−１４４８４）に記載のようにして単離した。組換え可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）は、ＰＡＩＯＮ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（アーヘン，ドイツ）から取得した。他の試薬はすべて、Ｓｉｇｍａ社から分析用品質で取得した。
【０１３０】
方法
トロンボモジュリンおよびＴＡＦＩに対するトロンビンの結合の測定
トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合は、平衡結合アッセイとして測定した。トロンビン（２０ｎＭ）、トロンボモジュリン（１．５４μＭ）およびＤＡＰＡ（２０ｎＭ，ダンシルアルギニンＮ−３−（エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド，蛍光性の可逆性トロンビン阻害剤）を０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．４）中に含む溶液を、少量のアリコートに分けて連続的に、トロンボモジュリンを含まないこと以外は同一の溶液に添加した。添加は、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒモデルＬＳ５０Ｂ分光蛍光光度計の試料区画内で、磁気撹拌器を取り付けたキュベット内で行なった。強度の値を、それぞれ２８０ｎｍおよび５４５ｎｍの励起波長および発光波長で継続的に記録した。発光ビームにおいて４３０ｎｍカットオフフィルターを使用した。データを以下のようにして解析した。蛍光強度Ｉを、トロンビン−ＤＡＰＡ（Ｔ・Ｄ）とトロンビン−トロンボモジュリン−ＤＡＰＡ（Ｔ・ＴＭ・Ｄ）の強度の和と仮定した。すなわち、Ｉ＝ｉ１・［Ｔ・Ｄ］＋ｉ２・［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］であり、式中、ｉ１およびｉ２は、Ｔ・ＤおよびＴ・ＴＭ・Ｄの蛍光係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）である（励起は２８０ｎｍであったため、遊離ＤＡＰＡからの発光は無視できた）。ＴＭによってプロテインＣ活性化またはＴＡＦＩ活性化いずれかのＫｍは感知できるほどには変わらないため（Ｂａｊｚａｒら，１９９６；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６６０３−１６６０８参照）、トロンビン−ＤＡＰＡ相互作用の親和性は変わらないと仮定することが可能である。
【０１３１】
したがって ［Ｔ・Ｄ］＝（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）
および ［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］＝（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）
（式中、ＫＤＡＰＡはトロンビン−ＤＡＰＡ相互作用の解離定数である）。
したがって、
Ｉ＝ｉ１・（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）＋ｉ２（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）。
【０１３２】
ｆとｂを、それぞれ、遊離およびトロンボモジュリンに結合したトロンビンの分率と規定し、［Ｔ］０をトロンビンの総濃度とすると、ｆ＝（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／［Ｔ］０、ｂ＝（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／［Ｔ］０およびｆ＋ｂ＝１である。次いで、蛍光強度が、Ｉ＝ｉ１・ｆ［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）＋ｉ２・ｂ［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）によって得られる。Ｉ０を初期強度と規定すると、トロンボモジュリンを添加しなかった場合、ｆ＝１およびＩ０＝ｉ１［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）である。同様に、Ｉｍａｘを、トロンボモジュリンでトロンビンを飽和したときの強度と規定すると、ｂ＝１およびＩｍａｘ＝ｉ２［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）である。したがって、Ｉ＝Ｉ０・ｆ＋Ｉｍａｘ・ｂである。ｆを１−ｂで置き換えると、Ｉ＝Ｉ０＋（Ｉｍａｘ−Ｉ０）・ｂまたはΔＩ＝ΔＩｍａｘ・ｂが得られる。初期強度に対して標準化すると、（ΔＩ／Ｉ０）＝（ΔＩｍａｘ／Ｉ０）・ｂが得られる。ＤＡＰＡがＴとＴ・ＴＭに等しい親和性で結合する場合、ＴＭはＴとＴ・Ｄに等しい親和性で結合する。
【０１３３】
したがって、ＫＴＭをトロンビン−トロンボモジュリン相互作用の解離定数と規定すると、［Ｔ］［ＴＭ］＝ＫＴＭ［Ｔ・ＴＭ］；［Ｔ・Ｄ］［ＴＭ］＝ＫＴＭ［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］；および（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）・［ＴＭ］＝ＫＴＭ（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）である。最後の表現はｆ・［ＴＭ］＝ＫＴＭ・ｂと同一である。ｆ＝１−ｂおよび［ＴＭ］＝［ＴＭ］０−ｂ・［Ｔ］０（式中、［ＴＭ］０は総トロンボモジュリン濃度）であるため、以下の等式：（１−ｂ）（［ＴＭ］０−ｂ・［Ｔ］０）＝ＫＴＭ・ｂが得られる。これはｂの二次方程式であり、これは、解く場合に上記の表現を（ΔＩ／Ｉ０）で置き換えると、等式：（ΔＩ／Ｉ０）＝（ΔＩｍａｘ／Ｉ０）・０．５・（ＫＴＭ＋［Ｔ］０＋［ＴＭ］０−（（ＫＴＭ＋［Ｔ］０＋［ＴＭ］０）２−４・［Ｔ］０・［ＴＭ］０）１／２）が得られる。この後者の等式は、蛍光強度値、トロンボモジュリンとトロンビンの公称濃度、トロンビン−トロンボモジュリン相互作用の解離定数、およびトロンボモジュリンとトロンビン−ＤＡＰＡとの相互作用のシグナルを発する蛍光強度増分間の関係を示す。［ＴＭ］０を独立変数としてならびにＫＴＭおよびΔＩｍａｘをベストフィットパラメータとして用い、強度のデータを非線形回帰解析によって上記の等式にフィットさせた。
【０１３４】
３．結果
トロンビンは可溶性トロンボモジュリンにＫＤ＝２３±１４ｎＭの親和性で結合する
可溶性トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合を、ＤＡＰＡの蛍光の摂動によって測定した。図６に示したように、滴定曲線では、０〜７５ｎＭの可溶性トロンボモジュリン濃度範囲で相対蛍光の増大が示された。データ解析により、可溶性トロンボモジュリンに対するトロンビン結合はＫＤ＝２３±１４ｎＭで特性評価されることが示された。
【０１３５】
ＩＩＩ．実施例
変異トロンボモジュリン類似体の補因子活性の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、ＫＤ値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との間の結合について測定した。
【０１３６】
１．実験手順
材料および方法
ＴＭ変異体がプロテインＣのトロンビン媒介性活性化の補因子として作用する能力を、ショッケート（ｓｈｏｃｋａｔｅ）において直接アッセイした。組換えヒトプロテインＣは、Ｊｏｈｎ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ博士（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ．）からのものであり、既報（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０；８：６５５−６６１）のとおりに精製した。２５μｌの各ショッケートを等容量の組換えヒトプロテインＣ（終濃度０．３μＭ）およびヒトαトロンビン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，セントルイス，ＭＯ）と、マイクロタイタープレート内で１ｎＭの終濃度で混合した。使用した試薬はすべて、５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌ／３．７５ｍＭ ＣａＣｌ２／０．１％ＮａＮ３（ｗ／Ｖ）中で希釈した。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、８００単位／ｍｌの２５μｌのヒルジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，セントルイス，ＭＯ）の添加によって反応を終了させた。活性化プロテインＣの量を、１００μｌの色素形成性基質Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２６６）（１ｍＭ）の添加によって決定した。プレートリーダーを使用し、４０５ｎｍにおける吸光度によって変化を経時的に測定する。データはミリＯＤ単位／分で記録され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを用いて吸光度を１０秒ごとに１５分間測定することにより、各試料について決定する。すべてのアッセイに三連のショッケート試料（各ＤＨ５α細胞は、内部対照として、ｐＳＥＬＥＣＴ−１ベクター（ＴＭなし）、ｐＴＨＲ２１１（野生型）またはｐＭＪＭ５７（３８８位のメチオニンがロイシンに変えたｐＴＨＲ２１１）のいずれかでトランスフェクトした）を含めた。ＴＭ変異体の補因子活性は、ｐＭＪＭ５７で得られたものの平均値として示した。
【０１３７】
統計解析
各変異体を活性について少なくとも２回アッセイし（陽性クローンが２つしか単離されなかった変異体では３回）、すべてのデータを、スチューデントのｔ−検定を用いた有意差の判定に含めた。プレート間の変動係数は１６．７％であった（ｎ＝１８）。
【０１３８】
ウエスタンブロット解析
大腸菌ショッケートを、製造業者の使用説明書（Ｎｏｖｅｘ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，ＣＡ）に従い、還元条件下で１０％Ｔｒｉｓ−トリシンＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて実行した。１０ｍＭのジチオトレイトールを含有する試料バッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０．００２５％ブロモフェノールブルー）中でショッケートを１０分間煮沸することにより、還元アルキル化試料を調製した後、５０ｍＭのヨードアセトアミドとともにインキュベートした。
【０１３９】
タンパク質を、転写バッファー（１９２ｍＭグリシン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３，２０％メタノール）中、４℃でニトロセルロースフィルターに転写した。ニトロセルロースフィルターをブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，０．９％ＮａＣｌ，０．０５％ＮａＮ３）でブロックし、次いで、ブロッキングバッファー中で、マウスポリクローナル抗血清（ヒトトロンボモジュリンの還元アルキル化ＥＧＦドメインに対して生成させたもの）とともにインキュベートした。洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，０．９％ＮａＣｌ，０．０５％ＮａＮ３，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、フィルターをビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともに、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するブロッキングバッファー中でインキュベートした。タンパク質は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，アーリントンハイツ，ＩＬ）を、製造業者の使用説明書に従って用いて検出した。
【０１４０】
ＩＶ．実施例
ＴＡＦＩおよびプロテインＣの活性化に関するトロンボモジュリン類似体の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、ＫＤ値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との間の結合について決定した。
【０１４１】
１．実験手順
タンパク質および試薬
Ｓｏｌｕｌｉｎ（残基４〜４９０）、ＴＭＥ（残基２２７〜４６２）、ＴＭＥｃループ３〜６（残基３３３〜４６２）、およびＴＭＥｉ４〜６（残基３４５〜３６２）を含むトロンボモジュリンの切断型形態を、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２；１８５：５６７−５７６）に記載のとおりに調製した。Ｓｆ９細胞をＴＭ構築物でトランスフェクトし、タンパク質を培地から、クロマトグラフィー手順（アニオン交換、ゲル濾過およびトロンビン親和性の組合せを使用）によって単離した。純度（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によって評価）は９５％以上であった。ヒト血漿ＴＡＦＩを、Ｂａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１４４７７−１４４８４）に記載のようにして単離した。ヒトプロテインＣおよびトロンビンは、ＢａｊｚａｒおよびＮｅｓｈｅｉｍ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８６０８−８６１６）に記載のとおりに調製した。トロンビン阻害剤であるダンシルアルギニンＮ−（３−エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）は、Ｎｅｓｈｅｉｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７９；１８：９９６−１００３）に記載のとおり合成した。アラニンスキャニングによって得られる点変異体を、ＴＭＥＭ３８８Ｌ構築物から作製した。タンパク質は大腸菌において発現させた。ペリプラズム抽出物の手順および調製は、Ｎａｇａｓｈｉｍａら，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８６０８−８６１６）に記載されている。ＨＥＰＥＳ、塩基性カルボキシペプチダーゼ基質であるヒップリル−アルギニン、塩化シアヌル、および１，４−ジオキサンはＳｉｇｍａ社から入手した。他の試薬はすべて分析用品質のものであった。
【０１４２】
トロンボモジュリン類似体の点変異体でのプロテインＣおよびＴＡＦＩの活性化速度の測定
ＴＡＦＩの活性化のため、各ペリプラズム抽出物の２０μｌアリコートをトロンビン（１３ｎＭ最終）とともに、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２中、室温で５分間プレインキュベートした。次いで、混合物を、精製組換えＴＡＦＩ（１８ｎＭ最終）および基質ヒップリル−アルギニン（１．０ｍＭ最終）とともに、総容量６０μｌで６０分間インキュベートした。ヒップリル−アルギニンから馬尿酸への加水分解、続いて、馬尿酸の色原体への変換（８０μｌのリン酸バッファー（０．２Ｍ，ｐＨ８．３）および６０μｌの３％シアヌル酸含有ジオキサン（ｗ／ｖ）を使用）を測定することにより、活性化ＴＡＦＩの量を定量した。充分に混合した後、透明な上清の吸光度を３８２ｎｍにおいて測定した。各変異体について、ＴＡＦＩのトロンビン依存性活性化の量を、トロンビンの非存在下で生じたバックグラウンド吸光度を差し引くことにより計算した。ＴＭＥＭ３８８Ｌ−アラニン変異体によるプロテインＣの活性化を以下のようにしてアッセイした。
【０１４３】
試料および試薬はすべて、ＡＰＣアッセイ希釈剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．５％ＢＳＡ）中で希釈した。試料およびＴＭ標準品（０〜１ｎＭ）を、６０μｌの総容量で３７℃にて、９６ウェルプレート内で０．５μＭのプロテインＣおよび１ｎＭのトロンビンとともに６０分間インキュベートしてＡＰＣを生成させた後、２０μｌのヒルジン（０．１６Ｕ／μｌ，５７０ｎＭ）でクエンチした。Ｓ−２２６６（１ｍＭを１００μｌ）の加水分解をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて４０５ｎｍにて１分間隔でモニタリングすることにより、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性により、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分が生成される（３７℃）。
【０１４４】
すべてのアッセイに、内部対照として、ｐＳｅｌｅｃｔ−１ベクター（ＴＭＥなし）、野生型ＴＭＥ（Ｍ３８８）またはＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）のいずれかでトランスフェクトしたＤＨ５α細胞の抽出物を含めた。ＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）アラニン変異体の補因子活性は、ＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）の活性に対する割合で示した。各ＴＭ変異体を、プロテインＣとＴＡＦＩの両方の活性化について、３回の独立した抽出物の調製物を用いて二連でアッセイした。
【０１４５】
２．結果
ＴＭ変異体で得られた結果（図７）は、８つ（ｅｉｇｔｈ）の変異体のうち５つで、補因子活性化が実質的に低減していたことを示す。また、これらの５つの変異体のうち４つの変異体は、同時にＴＡＦＩの活性化活性の低下も示す。Ｆ３７６Ａにおける変異のみで、プロテインＣ活性化の顕著な減損がもたらされたが、ＴＡＦＩ活性化の低減は中程度にすぎなかった。興味深いことに、ＴＡＦＩおよびプロテインＣの活性化に対するＰｈｅ３７６の重要性に違いのあることから、プロテインＣがトロンビン−トロンボモジュリン複合体の基質である場合の方が、トロンボモジュリン構造についての要件に制限のあることが示唆される。
【０１４６】
Ｖ．実施例
酸化に関するプロテインＣ活性化についてのＭｅｔ特異的ＴＭ変異体の解析
トロンボモジュリン類似体の特定のメチオニン変異体を使用し、補因子活性化に対する、また、タンパク質の酸化に関するこの残基の役割を、プロテインＣ活性化アッセイを用いて解析した。
【０１４７】
１．実験手順
タンパク質および試薬
ヒト組換えプロテインＣはＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．（ボストン，ＭＡ）製のものであった。ウシトロンビンはＭｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ダラス，ＴＸ）製のものであった。Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドは、Ｇｌａｓｅｒら（Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９７５；５：３３３−３４８）に記載のとおりに調製した。ヒトα−トロンビン（４，０００ ＮＩＨ Ｕ／ｍｇ）、ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）およびクロラミンＴはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セントルイス，ＭＯ）製のものであった。
【０１４８】
ＴＭＥ（Ｓｆ９）の発現
全手順は４℃で行なった。ＴＭの６ ＥＧＦ様反復配列（アミノ酸２２７〜４６２）をコードするＤＮＡ配列を、昆虫プロテアーゼであるヒポデルミン（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｎ）Ａのシグナル配列に連結し、このハイブリッド遺伝子を、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）遺伝子プロモーターの制御下でバキュロウイルスシャトルベクターｐＴＭＨＹ１０１内に配置した。組換えウイルスは標準的な手法を用いて作製した。記載の変異体類似体は、ミューテーター部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ラ・ホーヤ，ＣＡ）の使用によって調製し、同じ方法によってバキュロウイルス系での発現のためのウイルスを調製した。
【０１４９】
精製およびクロラミンＴでの酸化
分泌されたＴＭＥ変異体（Ｓｆ９）を含有する増殖培地を遠心分離によって清澄にし、凍結乾燥させ、１：１０容量の０．２％ＮＥＭ−Ａｃ（ｐＨ７）／０．００８％Ｔｗｅｅｎ８０に再溶解させた。アリコートを５μｌのＨ２０または５μｌの１００ｍＭクロラミンＴのいずれかで処理し；室温で２０分間インキュベートし；希釈によって酸化剤を除去し；ＮＡＰ−５カラム（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，ｐＨ７．４；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）で脱塩し；プロテインＣの活性化について以下のようにしてアッセイした。
【０１５０】
ＴＭの補因子活性の測定（ＡＰＣアッセイ）
試料および試薬はすべて、ＡＰＣアッセイ希釈剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．５％ＢＳＡ）中で希釈した。試料およびＴＭ標準品（０〜１ｎＭ）を、６０μｌの総容量で３７℃にて、９６ウェルプレート内で０．５μＭのプロテインＣおよび１ｎＭのトロンビンとともに６０分間インキュベートしてＡＰＣを生成させた後、２０μｌのヒルジン（０．１６Ｕ／μｌ，５７０ｎＭ）でクエンチした。Ｓ−２２６６（１ｍＭを１００μｌ）の加水分解をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて４０５ｎｍにて１分間隔でモニタリングすることにより、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性により、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分が生成される（３７℃）。
【０１５１】
２．結果
Ｍｅｔ３８８の酸化によるＴＭの補因子活性の低下
変異体および野生型のＴＭＥ（Ｓｆ９）を昆虫細胞において発現させ、クロラミンＴで処理し、補因子活性についてアッセイし、結果を比較した（表２）。ＴＭＥは、クロラミンＴなどの酸化剤で処理すると、その補因子活性をおよそ８５％失う（表２参照）。Ｍｅｔ２９１およびＭｅｔ３８８の部位特異的変異により、ＴＭＥ（Ｓｆ９）の不活化が単一のメチオニンの酸化によるものであることが実証される。Ｍｅｔ３８８を保持した誘導体はクロラミンＴによって同程度（＞８０％）まで不活化されたが、Ｍｅｔ３８８Ｌｅｕ変異体は抵抗性であった。Ｍｅｔ２９１を置き換えた変異体は、活性であったが、酸化的不活化に対して抵抗性でなかった。
【０１５２】
ＶＩ．実施例
ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間にドメイン間ループの変異を有するＴＭ類似体の解析（Ｇｌｎ３８７，Ｍｅｔ３８８，Ｐｈｅ３８９）
トロンボモジュリン類似体の特定の変異体を使用し（ｓｉｎｇ）、これらの残基およびその酸化の役割を、プロテインＣ活性化アッセイを用いて解析した。
【０１５３】
１．実験手順
プラスミドの構築．ＥＧＦ様ドメインのみからなるトロンボモジュリン断片（ＴＭＥ）を大腸菌において以下のようにして発現させ、完全長ＴＭのＴＭＥ（残基２２７〜４６２）をコードするＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応によってヒトゲノムＤＮＡから、プライマー５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＣＧ−３’と５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣ−３’を用いて得た。この断片を、β−ラクタマーゼプロモーターおよびシグナル配列の制御下でｐＫＴ２７９内に配置した。次いで、得られたプラスミドのＥｃｏＲＶ−ＢｇＩＩＩ断片およびｆ１複製起点を含むｐＧＥＭ３ｚｆのＳｃａＩ−ＳａｃＩ断片を、それぞれ、ｐＳｅｌｅｃｔ−１ベクター内のＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩおよびＳｃａＩ−ＳａｃＩ部位に挿入し、大腸菌発現プラスミドｐＴＨＲ２１１を構築した。３８７位、３８８位または３８９位のＴＭ変異体をコードするプラスミドを、改変部位インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｏｒ）変異誘発キットに記載の部位特異的変異誘発手順を使用し、単鎖ｐＴＨＲ２１１ ＤＮＡ鋳型を用いて構築した。部位特異的変異の各プライマーは制限解析によって確認した。
【０１５４】
変異体の補因子活性を測定するため、変異体タンパク質を発現している個々の大腸菌培養物を遠心分離し、洗浄し、細胞ペレットを、２０％スクロース，３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２中でインキュベートした（１０分間，４℃）。ショッケートを細胞ペレットの遠心分離によって調製し、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２で処理し（１０分間，４℃）、ＡＰＣアッセイにおいてアッセイした。データは、３つの独立した各クローンの結果の平均である。
【０１５５】
ＴＭの補因子活性の測定（ＡＰＣアッセイ）
試料および試薬はすべて、ＡＰＣアッセイ希釈剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．５％ＢＳＡ）中で希釈した。試料およびＴＭ標準品（０〜１ｎＭ）を、６０μｌの総容量で３７℃にて、９６ウェルプレート内で０．５μＭのプロテインＣおよび１ｎＭのトロンビンとともに６０分間インキュベートしてＡＰＣを生成させた後、２０μｌのヒルジン（０．１６Ｕ／μｌ，５７０ｎＭ）でクエンチした。Ｓ−２２６６（１ｍＭを１００μｌ）の加水分解をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて４０５ｎｍにて１分間隔でモニタリングすることにより、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性により、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分が生成される（３７℃）。
【０１５６】
２．結果
ループ間ドメインの変異によるＴＭの補因子活性の低下
部位特異的変異誘発を使用し、３８７位、３８８位または３８９位に改変アミノ酸、欠失または挿入のいずれかを有するＴＭ変異体を発現させた（図８）。ＴＭ変異体の補因子活性は、３つの独立したクローンから得た平均であり、ＴＭＥ（Ｓｆ９）ＷＴで見られた活性に対する割合で示す。ウエスタンブロットのゲルスキャンは、新しいすべての３８８位の変異体および選択した３８７位の変異体について、ＴＭに対するポリクローナル抗体を用いて行なった。このスキャンによりほぼ同等量のＴＭが得られ、これは、発現の差が、観察された活性の差をもたらし得ないことを示す。また、３８７位（図８Ａ）、３８８位（図８Ｂ）、３８９位（図８Ｃ）の独立した置換またはドメイン間ループ内の任意の箇所における挿入および欠失（図８Ｄ）により、ＡＰＣアッセイでおおむね野生型ＴＭＥよりも（ｔｈｅｎ）不充分な補因子である類似体がもたらされる。Ｇｌｎ３８７がＴｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａで置き換えられた類似体は、７０％超の補因子活性を保持しているが、Ｇｌｕでの置換により、これは対照の５８％まで低下し、他のすべてのアミノ酸では５０％超の低下がもたらされる。ＬｅｕでのＭｅｔ３８８の置換のみ、野生型より実質的に高い補因子活性（１．８倍）がもたらされる。ＧｌｎとＴｙｒを除くＭｅｔ３８８の他のすべての置換では、補因子活性の５０％超の低下がもたらされた。ＴＭ補因子活性はＰｈｅ３８９のアミノ酸置換に対して感受性が低く、この位置の点変異体のうち９つが、対照でみられる活性の７０％を超保持している。任意の位置でのＰｒｏまたはＣｙｓ置換により活性が１０％超まで低下したが、Ｍｅｔ３８８Ｐｒｏは例外であり、これは３０％の活性を保持していた。個々のアミノ酸の欠失または４つの可能な各位置へのＡｌａの挿入いずれかによってＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの長さを変えると、野生型ＴＭＥの活性の１０％未満の変異体がもたらされた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害の分野に関する。より詳しくは、本発明は、血友病Ａまたは血友病Ｂなどの血友病（ｈａｅｍｏｐｈｉｌａ）疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、血管が破れたときの出血を止めるために使用される血液の凝固（“ｃｌｏｔｔｉｎｇ”または“ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ”）を制御する身体の能力が障害された遺伝性の遺伝障害群である。血友病Ａは、最も一般的な形態であり、第ＶＩＩＩ因子の遺伝子における変異に起因しており；血友病Ｂは、クリスマス病としても知られており、第ＩＸ因子の遺伝子における変異に起因している。血友病Ｂは、血友病Ａと同様、Ｘ連鎖型であり、血友病症例のおよそ１２％を占める。その症状は、血友病Ａのものと同一：損傷時の過剰な出血；および特発性出血（特に、体重負荷関節、軟部組織および粘膜への出血）である。関節への反復出血により関節血症になり、有痛性の肢体不自由な（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）関節症（これは、多くの場合、関節置換を必要とする）が引き起こされる。軟部組織における血腫は、壊死性の凝固血液で構成された偽腫瘍をもたらし得；これは、隣接器官を閉塞、圧迫または破裂させることがあり得、感染をひきおこし得る。血腫は、いったん形成されると、手術を伴っても処置が困難である。圧迫後の神経の回復は不充分であり、麻痺が生じる。胃腸管、中枢神経系または気道／腹膜後隙が関与する出血エピソードは、検出されなければ死に至ることがあり得る。頭蓋内出血は血友病患者の主な死亡原因である。
【０００３】
米国では先天性血友病は１００，０００例と推定されている。このうち、およそ２０，０００例は血友病Ｂであり、かかる患者の血液は、第ＩＸ因子が完全にないか、または血漿中に第ＩＸ因子成分が重度に欠損しているかのいずれかである。したがって、該疾患は、種々の度合の重症度で存在し、毎週から年に１回または２回までの任意の場合での治療が必要とされる。完全欠損型症例では、毎週１回の補充療法が必要とされ；一部欠損型症例では、出血エピソードが起こったときだけ（これは、年に１回程度のめったにないものであり得る）治療が必要とされる。先天性の一部欠損型症例での出血エピソードは、一般的に、損傷単独によってではなく、一時的な後天的易罹患性によって引き起こされる。充分に大量の新鮮血漿または等価量の新鮮血液を静脈内注射すると、一時的に欠損型被験体の欠陥が修正される。この有益な効果は、多くの場合、２週間ないし３週間持続するが、患者の血液のインビトロ試験によって測定される凝固欠陥の改善は、２日ないし３日間しかみられない。
【０００４】
新鮮血漿または新鮮血液を用いたかかる治療は有効であるが、いくつかの深刻な欠点を有する：（１）大量の新鮮血漿がすぐに利用可能なことが必要とされる；（２）該血漿の投与のために入院が必要とされる；（３）非常に多くの人数の患者が、血液または血漿の反復注入に対して感作された状態になり、最終的に致死性の輸血反応がみられる；（４）せいぜい、血漿で該欠損症が一部軽減され得るにすぎない；および（５）必要とされる大量の血液または血漿によって急性で致死性の浮腫が引き起こされるため、長期間の処置または手術が可能でない。
【０００５】
改善された治療としては、第ＶＩＩＩ因子濃縮物または第ＩＸ因子濃縮物での静脈内補充療法が挙げられる。しかしながら、この治療はまた、いくつかの不都合点があるという欠点をもつ：（１）大きな出血エピソードの処置の場合、迅速な検出および処置の後であっても組織の損傷が残る；（２）非常に多くの人数の患者が、凝固因子に対して抗療性となり、該凝固因子に対する阻害性抗体が発生する（いわゆるインヒビターを有する血友病）；（３）ウイルス不活化法の改善にもかかわらず、依然として、致死性ウイルス（ＨＩＶおよびＣ型肝炎など）での汚染のリスクが高い（ＵＳＡでは、血友病集団の５０％より多く（１０，０００人超）が汚染血液の供給によってＨＩＶに感染したと推定されている）；（４）単離された凝固因子、特に組換え凝固因子は非常に高価であり、一般的に、発展途上諸国では入手できない。
【０００６】
血友病における出血は、三重欠陥：（１）低組織因子濃度での外因性経路によるトロンビン生成の低減、（２）内因性経路によるトロンビン生成の二次バーストの低減、および（３）内因性経路によるフィブリン溶解系の欠陥性下方調節が原因であり得る複雑な病態生理学的プロセスであるため、補充療法を超える出血の処置または予防は難題である。
【０００７】
トロンビン生成の低減によって凝固傾向の低減がもたらされ、したがって、出血リスクの増大がもたらされることは、一般的に、認知されている。しかしながら、過去１０年間の研究により、フィブリン溶解の欠陥性下方調節が血友病において役割を果し得ることも示されている。その結果、血友病は、線溶亢進を伴う凝固障害にも分類され得る。
【０００８】
この仮定は、最近の刊行物により、クロットを第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中で形成させ、組織プラスミノゲン活性化因子ｔＰＡを補給した場合、フィブリン溶解が充分に下方調節されず、その結果、クロットの溶解が早期に起こることをインビトロで示すことによって裏づけられている（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、この「早期の溶解（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｌｙｓｉｓ）」が、トロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）の活性化の低減または非存在のためであること（非特許文献１）ならびにＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では、活性化型ＴＡＦＩを含有する混合物によってクロット溶解時間が増大することを示すことができた。安定化させたＴＡＦＩが血友病の処置に使用され得ると結論付けられた（特許文献１）。
【０００９】
ＴＡＦＩは、安定なクロットの形成に必要とされるフィブリン溶解の下方調節において重要な役割を果している。ＴＡＦＩは、血漿プロカルボキシペプチダーゼＢ２またはプロカルボキシペプチダーゼＵとしても知られており、トロンビン−トロンボモジュリン複合体に曝露されると、Ａｒｇ９２でのタンパク質分解により、フィブリン溶解を阻害する塩基性カルボキシペプチダーゼ（ＴＡＦＩａまたは活性化型ＴＡＦＩ）に変換される血漿チモーゲンである。これは、プラスミノゲンの結合と活性化に重要なＣ末端のリシンおよびアルギニン残基をフィブリンから除去することにより、フィブリン溶解を強く弱める。
【００１０】
上記のように、トロンビンとの複合体の状態のトロンボモジュリン（ＴＭ）は、ＴＡＦＩの活性化を担う。トロンボモジュリンは、血管の内側を覆う内皮細胞上のトロンビン受容体として作用する膜タンパク質である。トロンビンは、フィブリノゲンをフィブリン（クロットマトリックスを構成する）に変換させる凝固カスケードにおける中心的な酵素である。初期では、局所損傷により、少量のトロンビンが、その不活性な前駆体プロトロンビンから生成される。このトロンビンが、さらに、血小板ならびに第２の特定の凝固因子（例えば、第Ｖおよび第ＶＩＩＩ因子）を活性化させる。後者の作用によって、さらなるプロトロンビン分子の大量活性化（いわゆるトロンビンバースト）が起こり、これにより、最終的に安定なクロットの形成がもたらされる。
【００１１】
しかしながら、トロンボモジュリンと結合した場合、トロンビンの活性の方向が変化する：トロンビン−トロンボモジュリン複合体の主要な特徴は、プロテインＣを活性化させ、それにより、次いで必須の補因子である第Ｖａ因子と第ＶＩＩＩａ因子をタンパク質分解的に不活化することによって凝固カスケードを下方調節し（非特許文献３）、したがって、抗凝固活性をもたらす能力である。また、トロンビン−トロンボモジュリン複合体は、トロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）を活性化することもでき、その場合は、フィブリン溶解が拮抗される（上記参照）。
【００１２】
成熟ヒトＴＭは、５５９残基の単一ポリペプチド鎖で構成されており、５つのドメイン：アミノ末端の「レクチン様」ドメイン、６つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様反復配列（ｒｅｐｅａｔ）を含む「６ ＥＧＦ様反復ドメイン」、Ｏ−グリコシル化ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなり、位置の特定は以下のとおりである（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
【００１３】
【化１】
ウサギＴＭのタンパク質分解断片または組換えヒトＴＭの欠失変異体を用いた種々の構造−機能試験により、その活性が、最後の３つのＥＧＦ様反復配列に位置することが特定された。ＴＡＦＩ活性化を効率的に促進し得る最小の変異体には、上皮増殖因子３（ＥＧＦ３）〜ＥＧＦ６のｃループを含む残基が含まれていた。この変異体は、Ｃを活性化させる最小の変異体よりも１３残基長い；該最小の変異体は、ＥＧＦ３とＥＧＦ４〜ＥＧＦ６を連結するドメイン間ループ由来の残基からなるものであった。
【００１４】
上記のように、血友病などの凝固障害を処置するための補充療法では、医療上の必要性が満たされていない。重要なことは、補充療法に使用されている凝固因子以外に、血友病患者を予防または処置することができる利用可能な薬物がないことである。
【００１５】
したがって、線溶亢進を伴う凝固障害、特に血友病を予防または処置するための治療薬の開発に対する長年にわたる必要性にもかかわらず、進歩は遅く、安全で有効な治療薬はまだない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第０２／０９９０９８号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ＢｒｏｚｅおよびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８８：３８１５−３８２３
【非特許文献２】Ｍｏｓｎｉｅｒら；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００１，８６：１０３５−１０３９
【非特許文献３】Ｅｓｍｏｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９１），６１４：３０−４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の課題は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための新規な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この課題は、治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示すトロンボモジュリン類似体を含む、哺乳動物、特にヒトの線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬を提供することにより解決される。
【００２０】
この新規なアプローチは、トロンボモジュリンを、高い血漿濃度、特に１５ｎＭより高い、特に２０、３０、４０または５０ｎＭより高い（少なくとも１００ｎＭまで）の濃度であってもフィブリン溶解促進活性が広くみられる抗フィブリン溶解活性を示すような様式で改変することができるというめざましい所見に基づく。したがって、このようなＴＭ類似体は抗フィブリン溶解効果を示し、そのため本発明による使用に適している。
【００２１】
この抗フィブリン溶解効果は、血友病患者由来の血漿（これは第ＶＩＩＩ因子が枯渇している；ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中で示された。それと共に、かかるトロンボモジュリン類似体が治療薬として使用され得ることを実証した。
【００２２】
これまで、血友病の処置に対するトロンボモジュリンの治療的使用は現実的な選択肢とはみなされていなかった。これは、ウサギ肺トロンボモジュリン（ｒｌＴＭ）により、かなり低い濃度であっても、常に、抗フィブリン溶解活性とフィブリン溶解促進活性の両方を有することがわかっていたためである（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００６；２６：２４４５−２４５３；特に図５参照）。１５ｎＭより低いｒｌＴＭ血漿濃度では、ｒｌＴＭによってクロット溶解時間が増大するが、１５ｎＭより高い血漿濃度では、溶解時間の著しい減少が示され（Ｍｏｓｎｉｅｒら，２００１，ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ，２００６）、最終的な結果としてフィブリン溶解促進効果がみられた。より高濃度でのこのフィブリン溶解促進効果により、血友病におけるなんらかの治療的使用は禁止されている。なぜなら、過剰投与の可能性または個体の易罹患性のばらつきによって出血事象が致死的に悪化したり、長期化したり、または引き起こされることすらあり得るためである。
【００２３】
本発明によれば、抗フィブリン溶解効果を示し、したがって本発明による処置に適したＴＭ類似体がもたらされる種々の選択肢が存在する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）、正常血漿（ＮＰ）およびＮＰと混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰのクロット溶解プロフィールおよび溶解時間を示す。クロット溶解プロフィールは、０（―――）、１（・・・・）、６（−−−）、１０（―・・―・・―）、５０（― ― ―）および１００％（―・―・―）ＮＰで示す。クロット溶解プロフィールから、最大光学密度の２分の１になるまでクロットが分解された時点を採用することにより、溶解時間を決定した。差し込み図に溶解時間をまとめており、一般的な傾向は、ＮＰの割合（したがって、ＦＶＩＩＩの量）が増大するにつれて、溶解時間も増大する。溶解時間に対するＮＰの添加の効果は、１０％ＮＰで平坦域に達する。
【図２】図２は、種々の割合のＦＶＩＩＩを含有する血漿中におけるトロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）の活性化を示す。（Ａ）ＦＶＩＩＩ欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）を正常血漿（ＮＰ）と混合すると、ＴＡＦＩ活性化は増強される。ＦＶＩＩＩ−ＤＰでは、そのピーク（●）においてわずか３０ｐＭのＴＡＦＩａが測定されたのに対し、５０％ＮＰ（□）および１００％ＮＰ（△）では約６００ｐＭのＴＡＦＩａが測定された。この実験は三連で行なった。データは平均値±ＳＥで示す。ＴＡＦＩａ産生能（Ｂ）（本明細書において、クロット開始時点から最後の時点までの活性化の時間的推移プロット（Ａ）下面積と定義）は、ＮＰの割合が増大するにつれて増大し、５０％ＮＰで平坦域となる。５０％ＮＰおよび１００％ＮＰのＴＡＦＩａ産生能は、それぞれのＴＡＦＩ活性化プロットの形状がかなり異なるにもかかわらず類似している（それぞれ、１４，１００ｐＭ分および１６，８００ｐＭ分）。溶解時間（図１，差し込み図）とＴＡＦＩａ産生能の間の関係を（ＦＶＩＩＩレベルに関係しているため）、ｌｏｇ溶解時間に対するｌｏｇ ＴＡＦＩａ産生能のプロットを用いて示す（図２Ｂ，差し込み図）。予測どおり、データは、０〜１００％のＦＶＩＩＩを含有する血漿中において溶解時間とＴＡＦＩａ産生能間の強い正の相関を示す。
【図３】図３は、種々の割合のＦＶＩＩＩを含有する血漿中におけるプロトロンビンの活性化を示す。プロトロンビン活性化の時間的推移を、０（●）、１（■）、６（▲）、１０（○）、５０（□）および１００％ＮＰ（△）と混合したＦＶＩＩＩＤＰについて示す。一般的に、プロトロンビンの活性化速度は、ＮＰの割合が増大するにつれて増大する。５０％ＮＰでは、プロトロンビン活性化は高速で起こり（各プロットの傾きを調べることによって判定する通り）、１５以内に終わるようであるが、１００％ＮＰでは、プロトロンビン活性化の速度は遅く、長期間にわたる。
【図４】図４は、ｓＴＭ（０〜１００ｎＭ）およびｔＰＡ（０．２５〜３ｎＭ）がともに種々の濃度で存在する正常血漿（ＮＰ）および第ＶＩＩＩ因子欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）中における、トロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ）の活性化に対するｓＴＭの効果を示す。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中における溶解延長のＴＡＦＩａ依存性欠陥は、０．２５ｎＭ ｔＰＡを含有する血漿に１００ｎＭのｓＴＭを添加することによって修正される。ｔＰＡ濃度が増大するにつれて、溶解の欠陥のわずかな一部修正が、１００ｎＭ ｓＴＭ存在下のＦＶＩＩＩ−ＤＰにおいて観察される。この実験では、イモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＴＣＩ）を用いて、機能性ＴＡＦＩａなしの状態を作出した。したがって、溶解の増大（あれば）（溶解時間／溶解時間＋ＰＴＣＩの比率で示される）はＴＡＦＩａ依存性である。
【図５】図５は、１０ｎＭトロンボモジュリンの存在下（●）またはトロンボモジュリンなし（○）での、正常血漿（ＮＰ）（Ａ）およびＦＶＩＩＩ欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）（Ｂ）におけるＴＡＦＩ活性化およびクロット溶解プロフィールを示す。ｓＴＭを伴うクロット溶解プロフィールを示し（―）、ｓＴＭなしでのクロット溶解プロフィールを参照として示す（−−−）。この実験は三連で行なった。データは平均値±ＳＥで示す。
【図６】図６は、トロンボモジュリンに対するトロンビン結合を示す。トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５．０ｍＭ Ｃａ２＋，０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液中のトロンビン（２０ｎＭ）およびＤＡＰＡ（２０ｎＭ）で構成された１．５ｍｌを、同一の溶液中の１．５４μＭのトロンボモジュリンで滴定することによって測定した。蛍光強度を測定した（λｅｘ＝２８０ｎｍ，λｅｍ＝５４５ｎｍ）。
【図７】図７は、ＴＡＦＩおよびプロテインＣの活性化における点変異体の相対補因子活性を示す。可溶性トロンボモジュリンにおける点変異の作製には、アラニンスキャニング変異誘発を使用した。プロテインＣおよびＴＡＦＩの活性化の速度（変異体ＴＭＥＭ３８８Ｌでの活性化の速度と比較して）を、ＴＡＦＩ（黒バー）およびプロテインＣ（斜線バー）について示す。
【図８】図８は、ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの変異を示す。３種類の独立したプラスミドを、各変異体について大腸菌において構築した。ショッケートを調製し、ＡＰＣアッセイによって補因子活性についてアッセイし、試料をウエスタンブロットにおいて解析した（図示せず）。活性の値は３つの別々のクローンの平均である。パネルＡ，Ｇｌｎ３８７における置換変異体；パネルＢ，Ｍｅｔ３８６における置換；パネルＣ，Ｐｈｅ３８９における置換変異体；パネルＤ，ドメイン間ループにおける欠失およびアラニン挿入。対照プラスミドｐＳｅｌｅｃｔ（ＴＭ挿入配列なし）でトランスフェクトした大腸菌からのショッケートについて測定した活性を示す。さらなる詳細については、Ｃｌａｒｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：６３０９−６３１５）を参照のこと。
【図９−１】図９は、トロンボモジュリン（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２００６；２６：２４４５−２４５３後の改変型）のフィブリン溶解促進効果および抗フィブリン溶解効果の概略図を示す。低いＴＭ濃度でのクロット溶解時間の増大は、ＴＡＦＩ活性化の刺激に起因し、ＴＭの抗フィブリン溶解活性を示す。ウサギ肺ＴＭがより高い濃度では、プロテインＣの活性化とＴＡＦＩ活性化の阻害のためクロット溶解時間が減少し、これは、ウサギ肺ＴＭのフィブリン溶解促進活性を示す（実線）。１５ｎＭより上では、ウサギ肺ＴＭのフィブリン溶解促進活性は抗フィブリン溶解活性を上回り、全体的にフィブリン溶解促進効果がもたらされることに注目のこと。対照的に、可溶性ＴＭ類似体は抗フィブリン溶解効果のみを示す（破線）。
【図９−２】表１は、図４を作成するのに使用したデータ（各条件下での溶解時間の測定を可能にするためのＰＴＣＩの存在下での絶対溶解時間など）のまとめを示す。すべての場合において、溶解時間は、ＴＡＦＩａ阻害剤ＰＴＣＩの存在下で得られた溶解時間に相対的に示している。ＴＡＦＩはトロンビン活性化性フィブリン溶解インヒビター；ＰＴＣＩはイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害剤。
【図９−３】表２は、ＴＭＥ（Ｓｆ９）の部位特異的変異体類似体のクロラミンＴによる酸化を示す。クロラミンＴ処理後の結果を、対照での処理後の活性に対する割合で示した。＊二連の測定値の平均および平均値からの偏差。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
一実施形態において、トロンボモジュリン類似体は、トロンビンに対する結合親和性が低減された状態で使用され得る。そのため、該類似体により正常血漿およびＦＶＩＩＩ−ＤＰ中におけるクロット溶解が延長され得る（例えば１００ｎＭまで）（図４）。
【００２６】
この所見の重要性は、このようなトロンボモジュリン類似体が高濃度であっても、有害なフィブリン溶解促進効果なしで抗フィブリン溶解効果を示すことである。この濃度は、治療有効投薬量をはるかに超えている。したがって、ＴＭ類似体により線溶亢進を伴う凝固障害の処置が可能になる。
【００２７】
この理論に拘束されないが、本発明者らは、ＴＭ類似体のこの治療潜在力は、該類似体がトロンビンに対して著しく低減された親和性を示すことによって説明され得ることを示した。これは、トロンビンとウサギ肺トロンボモジュリンとの結合で観察された０．２ｎＭのＫＤ値（Ｅｓｍｏｎら，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８６，４８５：２１５−２２０）とは対照的に２３ｎＭのＫＤ値を見い出したＢａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ １９９６；２７１：１６６０３−１６６０８）によって示された。
【００２８】
したがって、本発明の一実施形態によれば、ウサギ肺トロンボモジュリンと比べてトロンビンに対する結合親和性が低減されたトロンボモジュリン類似体が、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のために使用され得る。
【００２９】
特に、０．２ｎＭより大きい、好ましくは、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、７．５ｎＭ、１０ｎＭ、１２．５ｎＭ、１５ｎＭ、１７．５ｎＭ、２０ｎＭ、２２．５ｎＭまたは２５ｎＭより大きいトロンビン結合に関するＫＤ、より好ましくは、１０〜３０ｎＭの範囲またはそれより大きいＫＤ値を示すトロンボモジュリン類似体が使用され得る。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体の低減されたフィブリン溶解促進活性は、プロテインＣを活性化させる能力（いわゆる「補因子活性」）の低減によるものであり得る。プロテインＣの活性化によってフィブリン溶解の上方調節がもたらされるため（Ｍｏｓｎｉｅｒら，２００１）、補因子活性の低下によりクロット溶解時間が延長される。当業者であれば、トロンボモジュリンの補因子活性を低下させるためのいくつかのストラテジーを知っている（例えば、グリコシル化の変更、タンパク質の二次もしくは三次構造の変更または好ましくは、一次構造の変更（例えば、１つ以上のアミノ酸の変異によって）など）。
【００３１】
また別の実施形態では、トロンボモジュリン類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌ（ここで、ＴＭＥは、６つのＥＧＦドメインのみからなる類似体を表す）と比べて補因子活性が低下したＴＭ類似体が使用され得る。
【００３２】
また、ＴＡＦＩの活性化によってフィブリン溶解の下方調節がもたらされるため（ＭｏｓｎｉｅｒおよびＢｏｕｍａ，２００６）、本発明によれば、ＴＡＦＩを活性化する能力（いわゆる「ＴＡＦＩ活性化活性」）が増大したトロンボモジュリン類似体も使用され得る。当業者にとって、トロンボモジュリンによるＴＡＦＩ活性化活性を増大させるためのいくつかのストラテジーがある（グリコシル化の変更、タンパク質の二次もしくは三次構造の変更または好ましくは、一次構造の変更（例えば、１つ以上のアミノ酸の変異によって）など）。
【００３３】
特に、本発明はまた、トロンボモジュリン類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率を有意に増大したトロンボモジュリン類似体を提供する。
【００３４】
注目すべきことに、本発明によれば、凝固障害の処置のために使用されるＴＭ類似体は、上記の特徴、すなわち：
（ｉ）ウサギ肺トロンボモジュリンと比べて低減されたトロンビンに対する結合親和性、および／またはｋＤ値が０．２ｎＭより大きいトロンビンに対する結合親和性；
（ｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌの補因子活性と比べて低下した補因子活性、あるいは
（ｉｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて増大した補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率
の１つ以上を有する。
【００３５】
本発明の一実施形態では、トロンボモジュリンは、正常被験体と比べて顕著に低減されたフィブリン溶解を伴って（または低減がわずかであっても）生じる任意の凝固障害を有するヒト患者を処置するために使用され得る。特に、以下の疾患：血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、後天性フォン・ヴィレブランド病、第Ｘ因子欠損症、パラ血友病、凝固第Ｉ、ＩＩ、ＶもしくはＶＩＩ因子の遺伝性障害、循環抗凝血素（例えば、第ＶＩＩＩ因子などの凝固因子に対する自己抗体）による出血性障害または後天性凝固欠損症は、該トロンボモジュリンの類似体によって処置され得る。
【００３６】
本発明の処置によって維持または達成され得る治療の好成績は、任意の具体的な患者の疾患の性質および程度に依存することは理解される。
【００３７】
本発明の特定の実施形態は、出血を予防するための凝固障害の予防的処置、または出血が起こったとき（「オンデマンド」）の急性処置に関するものである。トロンボモジュリン類似体での処置対象の出血事象は、生物体のどの器官または組織で起こるものであってもよく、最も重要ものは、中枢神経系（例えば、頭蓋内出血として）、関節、筋肉、胃腸管、呼吸路、腹膜後隙または軟部組織内で起こるものであり得る。
【００３８】
予防的処置では、ＴＭ類似体は患者に、一定間隔で長期間にわたって施与され得る。しかしながら、かなり限定された期間での複数回投与（「半長期的処置（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）も可能である。
【００３９】
本発明の一実施形態において、トロンボモジュリン類似体は、出血リスクがより高くなる前、例えば、手術または抜歯の前に施与される。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体は、血液もしくは血漿の輸血または凝固因子を用いた補充療法などの標準的な治療に対して抗療性の患者に投与される。
【００４１】
本発明によれば、ＴＭ類似体は、１週間未満から４週間までの合計期間にわたって、複数回用量で、好ましくは１日１回投与され得るが、２日に１回、または３日、４日、５日、６日もしくは７日おきに１回、より好ましくは長期投与として投与してもよい。したがって、本発明によれば、トロンボモジュリン類似体の複数回投与を可能にするのに適した医薬組成物が提供される。
【００４２】
ＴＭ類似体は、好ましくは、非経口適用として、例えば、静脈内または皮下適用によって非経口で施与される。静脈内または皮下でのボーラス適用が可能である。したがって、本発明によれば、トロンボモジュリンの非経口投与に適した医薬組成物が提供される。
【００４３】
本発明の一実施形態において、トロンボモジュリン類似体は、可溶性ＴＭ類似体、特に、細胞質ドメインが欠失しており、膜貫通ドメインが完全または部分的に欠失しているＴＭ類似体である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、トロンボモジュリン類似体は、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、またはＥＧＦ６を含む群、好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６を含む群、より好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含む群、最も好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ４〜ＥＧＦ６を含む群、から選択される少なくとも１つの構造ドメインを含み、特に、上皮増殖因子３（ＥＧＦ３）〜ＥＧＦ６のｃループを含む断片を含むものである。
【００４５】
可溶性トロンボモジュリンの種々の形態、例えば、いわゆるＡＲＴ−１２３（Ａｓａｈｉ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（東京，日本）によって開発されたもの）または組換え可溶性ヒトトロンボモジュリンであるＳｏｌｕｌｉｎ（現在、ＰＡＩＯＮ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，アーヘン（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって開発中）が当業者に知られている。組換え可溶性トロンボモジュリン、すなわち、アミノ酸配列の改変なしの可溶性トロンボモジュリンは、Ａｓａｈｉ社の特許ＥＰ０３１２５９８の主題である。
【００４６】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、可溶性であるとともにプロテアーゼと酸化に抵抗性であるヒトトロンボモジュリン類似体であり、したがってインビボで長寿命を示す。Ｓｏｌｕｌｉｎは、トロンビンを排他的に阻害するものでないため、その主な特徴は広い作用機序にある。また、これは、ＴＡＦＩおよび天然プロテインＣ／プロテインＳ経路も活性化する。トロンビン結合が低減される結果、Ｓｏｌｕｌｉｎは、さらに高濃度までフィブリン溶解を阻害する。
【００４７】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、とりわけ、欧州特許０６４１２１５ Ｂ１、ＥＰ０５４４８２６ Ｂ１ ならびにＥＰ０５２７８２１ Ｂ１の主題である。Ｓｏｌｕｌｉｎは、天然ヒトトロンボモジュリンの配列（配列番号１）と比較すると、以下の位置での改変を含む：Ｇ−３Ｖ、アミノ酸１〜３の除去、Ｍ３８８Ｌ、Ｒ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、Ｓ４７４ＡおよびＰ４９０での終結。この番号付けシステムは、配列番号１と配列番号３の天然トロンボモジュリンに従っている。本発明の好ましい一実施形態としてのＳｏｌｕｌｉｎの配列を配列番号２に示す。
【００４８】
しかしながら、注意すべきことに、本発明によれば、上記の特性または上記の欧州特許文献ＥＰ０５４４８２６ Ｂ１、ＥＰ０６４１２１５ Ｂ１およびＥＰ０５２７８２１ Ｂ１に概要が示された特性の１つだけ、または１超を含むトロンボモジュリン類似体もまた使用され得る。
【００４９】
本発明により適用可能な特に好ましいトロンボモジュリン類似体は、
以下の特性：
（ｉ） 酸化抵抗性を示す
（ｉｉ） プロテアーゼ抵抗性を示す
（ｉｉｉ） 均一なＮ−末端またはＣ−末端を有する
（ｉｖ） 例えば、天然トロンボモジュリン（配列番号１）のグリコシル化部位の少なくとも一部のグリコシル化によって翻訳後修飾されている
（ｖ） 線形の二重逆数トロンビン結合特性を有する
（ｖｉ） デタージェントの量が比較的少ない水溶液中で可溶性であり、典型的には膜貫通配列がない
（ｖｉｉ） グリコサミノグリカン鎖がない
の１つ以上を有するものである。
【００５０】
本発明に使用されるこのような類似体の製造は、上記の欧州特許文献に開示されている。
【００５１】
本発明の一実施形態では、Ｓｏｌｕｌｉｎの６つのＥＧＦドメインのみ、特に、ＥＧＦ４〜ＥＧＦ６ドメインからなるＳｏｌｕｌｉｎ断片が使用され得る。
【００５２】
一実施形態では、ＷＯ９３／２５６７５で知られているような補因子活性が低減されたトロンボモジュリン類似体が使用され得る。対照ヒト可溶性トロンボモジュリン（ＴＭＥＭ３８８Ｌ）の約５０％以下の補因子活性を有する一連のトロンボモジュリン類似体を本明細書において記載する。
【００５３】
より詳しくは、前記トロンボモジュリン類似体は、トロンビンに結合すると、ＴＭＥＭ３８８Ｌとの結合と比べて５０％以下の改変補因子活性を示す。前記類似体は、配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置に対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｆ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｉ） ３６８Ｔｙｒ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；
ａｎ） ３８５Ａｒｇ；
ｂａ） ３８７Ｇｌｎ；
ｂｂ） ３８９Ｐｈｅ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
を有する。
【００５４】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。便宜上、左側の表記、例えば、ａａ）は、各改変部位に対して同一である。最初の文字はＥＧＦドメインを表し、ここで、ａはＥＧＦ４であり；ｂはＥＧＦ５であり、ｃはＥＧＦ６である。２番目の文字は、配列表（ｔｈｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）内の他の残基に対する改変の相対位置を表す。また、本明細書において、上記のＴＭ類似体をコードする核酸も示す。
【００５５】
以下の類似体は、上記に示した類似体の好ましいサブセットを構成し、これらの類似体は、対照ＴＭＥＭ３８８Ｌの２５％以下の補因子活性を有する。このような類似体は、１つ以上のアミノ酸置換（好ましくは１つだけ）（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｏ） ４２３Ａｓｐ；
ｂｐ） ４２４Ｉｌｅ；
ｂｑ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
を有する。
【００５６】
プロテアーゼ活性、脂肪族置換、酸化抵抗性および均一な末端に関する上記に示した改変は、対照の５０％未満の補因子活性を有する上記の類似体にも適用可能である。
【００５７】
好ましいのは、対照の３０％未満の活性を有する上に列挙したものである。このような類似体は、ドメイン４における変異によって表される。このような類似体は、１つ以上のアミノ酸置換（好ましくは１つだけ）（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；または
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ
を有する。
【００５８】
また、本明細書では、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないＫＤ値を有する類似体を記載する。ＥＧＦ５およびＥＧＦ６はトロンビンに対する高親和性結合に重要な役割を果すことがわかっているが、結合におけるＥＧＦ４の役割の重要性が低いことが、ＴＭ／トロンビン複合体に対する補因子活性の付与に重要である。この理由のため、ＥＧＦ反復配列５および６に改変を有する類似体は、ほぼ同じ補因子活性を有し得るが、ＴＭＥＭ３８８Ｌ、例えば（Ｓ４０６Ａ）と比べてＫＤは小さい。ＥＧＦ反復配列５および６に改変を有する類似体（補因子活性の低下がもたらされたもの）を以下に示す。このような類似体は、１つ以上のアミノ酸置換（好ましくは１つだけ）（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
を有する。
【００５９】
上記の類似体は、それぞれのドメイン（すなわち、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５またはＥＦＧ６）ならびにそれぞれの相対活性によっても分類され得る。例えば、対照のおよそ５０％の補因子活性を有するＥＧＦ４の類似体は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｆ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｉ） ３６８Ｔｙｒ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；または
ａｎ） ３８５Ａｒｇ
である。
【００６０】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００６１】
ＥＧＦ４に対照の２５％未満の補因子活性を有するものは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；または
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ
である。
【００６２】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００６３】
ＥＧＦ５において、以下の改変（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；または
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ
により、補因子活性が少なくとも５０％の低下した類似体がもたらされた。
【００６４】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。とりわけ、このような類似体は、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体である。
【００６５】
ＥＧＦ５において、該類似体は、補因子活性が少なくとも７５％低下した類似体をもたらした改変（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；または
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ
に従ってさらに小群に分けられ得る。
【００６６】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。とりわけ、このような類似体は、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体である。また、上記の類似体をコードする核酸も示す。
【００６７】
ＥＧＦ６に関して、その群を以下に示す。対照の５０％未満の補因子活性を有するものは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
である。
【００６８】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００６９】
対照の２５％未満の補因子活性を有するものは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
である。
【００７０】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。好ましい類似体は、可溶性、プロテアーゼ抵抗性、酸化抵抗性ならびに均一な末端に関するさらなる改変を有する上記に示したものである。このような類似体をコードする核酸もまた、特許請求の範囲に記載の発明の一部である。その他の群と同様、このような類似体は、ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて本質的に改変されていないｋＣａｔ／Ｋｍを有するものを包含する。
【００７１】
該類似体は、特定の位置に改変アミノ酸を有するものに従ってさらに小群に分けられ得、前記類似体は、前記の位置に天然残基を有する類似体と比べて本質的に同等のトロンビンに対するＫＤを有し、前記の位置は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；または
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ
に対応する。
【００７２】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。このような類似体は、対照の３０％未満の改変されたｋＣａｔ／Ｋｍを有するものであり得る。
【００７３】
以下の部位は、前記の位置に天然残基を有する類似体と比べて改変されたＫＤまたはｋＣａｔ／Ｋｍを有する記載の類似体を包含し、前記の位置は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａｆ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；
ａｎ） ３８５Ａｒｇ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；または
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ
に対応する。
【００７４】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。これらは、さらに、ともに改変されたＫＤとｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体、特に、少なくとも２０％改変されたものを包含する。
【００７５】
以下の部位は、低い補因子活性を有し、前記の位置に天然残基を有する類似体と比較した場合、本質的に同等のＫＤまたはｋＣａｔ／Ｋｍを有する類似体を示し、前記の位置は（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
に対応する。
【００７６】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。
【００７７】
以下の位置は、補因子活性の少なくとも７５％の低下がもたらされたが、ｋｃａｔ／Ｋｍは本質的にほとんど変化しなかった改変について小群分けしたものを示す（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ。
【００７８】
最も好ましいのは、上に列挙した置換のうちの１つだけを有するＴＭ類似体である。トロンビンに対するＫＤが少なくとも３０％改変された上記の改変のさらなる小群分けを行なってもよい。
【００７９】
さらに、本発明は方法を提供する。より詳しくは、本明細書において、改変されたトロンビン結合のＫｄを示すトロンボモジュリン類似体のスクリーニングに有用な方法であって、
ａ） 位置（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｅ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｇ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｈ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｉ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｊ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｌ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｍ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｏ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｐ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｑ） ４５８Ｉｌｅ；
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ；
にアミノ酸置換を作製する工程、および
ｂ） トロンビンに対するＫＤを対照分子と比較する工程
を含む方法を記載する。
【００８０】
この方法において用いる場合、アミノ酸置換を１つだけ有するＴＭ類似体が好ましい。本発明の種々の実施形態は、前記ＫＤが少なくとも３３％改変されたもの、または前記改変がアミノ酸置換であるもの、または前記対照分子がＴＭＥＭ３８８Ｌであるものを包含する。該方法における使用のための改変の好ましい群分けは（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｃａ） ４２３Ａｓｐ；
ｃｂ） ４２４Ｉｌｅ；
ｃｃ） ４２５Ａｓｐ；
ｃｄ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃｆ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｋ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｎ） ４４４Ｐｈｅ；または
ｃｒ） ４６１Ａｓｐ
である。
【００８１】
この方法において用いる場合、アミノ酸置換を１つだけ有するＴＭ類似体が好ましい。
【００８２】
本明細書において、トロンビンへの結合に関して改変された補因子活性を有するトロンボモジュリン類似体のスクリーニングに有用な別の方法であって、
ａ） 位置（配列番号１または配列番号３に示すアミノ酸位置）：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
にアミノ酸置換を作製する工程、および
ｂ） トロンビンへの結合に関する補因子活性の割合を対照分子の割合と比較する工程
を含む方法を記載する。
【００８３】
この方法において用いる場合、アミノ酸置換を１つだけ有するＴＭ類似体が好ましい。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３７６位（配列番号１または配列番号３）のフェニルアラニン残基の改変を有する。この残基は、当業者によく知られた方法によって化学的または生化学的に改変され得るか、または欠失され得る。該フェニルアラニン残基は、好ましくは脂肪族アミノ酸で、より好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンで置換され、最も好ましくはアラニンで置換される。アラニンでのＰｈｅ３７６の置換（「Ｆ３７６Ａ」）により、ＴＡＦＩ活性化活性を保持したまま、トロンボモジュリン類似体の補因子活性がかなり減少することが実証された（図７参照）。その結果、Ｆ３７６Ａ−ＴＭ類似体では、補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率が増大している。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３８７位（配列番号１または配列番号３）のグルタミン残基の改変を有する。該グルタミン残基は、好ましくは、以下のアミノ酸（得られる変異体Ｇｌｎ３８７Ｘ−ＴＭ類似体（図８Ａ参照）の補因子活性の降順に）：Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｔｒ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換される。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３８８位（配列番号１または配列番号３）のメチオニン残基の改変を有する。該メチオニン残基は、好ましくは、以下のアミノ酸（得られる変異体Ｍｅｔ３８８Ｘ−ＴＭ類似体（図８Ｂ参照）の補因子活性の降順に）：Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓで置換される。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態では、トロンボモジュリン類似体が、３８９位（配列番号１または配列番号３）のフェニルアラニン残基の改変を有する。該フェニルアラニン残基は、好ましくは、以下のアミノ酸（得られる変異体Ｐｈｅ３８９Ｘ−ＴＭ類似体（図８Ｃ参照）の補因子活性の降順に）：Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏで置換される。
【００８８】
本発明の別の実施形態では、３つのアミノ酸Ｇｌｎ３８７、Ｍｅｔ３８８およびＰｈｅ３８９からなるＴＭのドメイン間ループが部分的もしくは完全に欠失しているか、または該ループに１つ以上のアミノ酸、好ましくはアラニン残基（図８Ｄ参照）が挿入されている。
【００８９】
位置Ｐｈｅ３７６、Ｇｌｎ３８７、Ｍｅｔ３８８またはＰｈｅ３８９に改変を有するこのような好ましいＴＭ類似体について、該ＴＭ類似体は完全長または可溶性のＴＭ類似体であり得、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６を含む、好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含むものであり得る。好ましい実施形態では、このような類似体は、ＴＭ類似体Ｓｏｌｕｌｉｎに示される置換を含むものである。より好ましい実施形態では、このようなＳｏｌｕｌｉｎ由来ＴＭ類似体は、ＥＧＦ１〜ＥＧＦ６のみ、特にＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６のみからなるものである。
【００９０】
本発明の実施形態では、トロンボモジュリン類似体は酸化型形態で使用される。タンパク質の制御酸化のためのいくつかの手法が当業者に知られている。ＴＭ類似体は、好ましくは、クロラミンＴ、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化される。
【００９１】
さらに、本発明は、線溶亢進を伴う凝固障害の処置のために使用されるＴＭ類似体のスクリーニングに有用な方法に関する。この方法は、好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６内、より好ましくはＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６内、最も好ましくはアミノ酸位置Ａｓｐ３４９とＡｓｐ４６１の間における１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって、トロンボモジュリンのアミノ酸配列を改変する第１の工程を含む。当業者には、タンパク質の配列を、例えば、部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発によって改変した後、選択するためのいくつかの手法が知られている。
【００９２】
第２の工程では、該改変ＴＭ類似体は、以下の特性：トロンビンに対する結合親和性（ＫＤ値）、補因子活性、ＴＡＦＩ活性化活性もしくはＴＡＦＩａ産生能（ＴＡＦＩａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、ＴＡＦＩ活性化活性と補因子活性の比率、タンパク質酸化の効果、インビトロアッセイでのクロット溶解時間に対する効果、または凝固関連動物モデルにおける効果からなる群より選択される１つ以上について対照タンパク質と比較される。
【００９３】
対照タンパク質としては、トロンボモジュリンタンパク質または類似体、好ましくは、ウサギ肺トロンボモジュリンまたは６つのＥＧＦドメインを含むヒトＴＭ類似体が使用される。ＴＭ類似体は、天然アミノ酸配列を有するものであってもよく、あるいはまた、１つ以上の改変（Ｍ３８８Ｌ置換など）を有するものであってもよい。
【００９４】
さらに、本発明は、抗フィブリン溶解効果を示すトロンボモジュリン類似体の治療有効量を投与する工程を含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法に関する。
【００９５】
特に、この処置方法は、対照タンパク質と比べて以下の特徴：低減されたトロンビンに対する結合親和性、ｋＤ値が０．２ｎＭより大きいトロンビンに対する結合親和性、有意に低下した補因子活性、または補因子活性に対する増大したＴＡＦＩ活性化活性の比率の１つ以上を示すＴＭ類似体を含む。対照タンパク質としては、トロンボモジュリンタンパク質または類似体、好ましくは、ウサギ肺トロンボモジュリンまたは６つのＥＧＦドメインを含むヒトＴＭ類似体が使用される。ＴＭ類似体は、天然アミノ酸配列を有するものであってもよく、あるいはまた、１つ以上の改変（Ｍ３８８Ｌ置換など）を有するものであってもよい。
【００９６】
定義
本発明との関連において用いる場合、用語「抗フィブリン溶解効果」は、トロンボモジュリン類似体が、該トロンボモジュリン類似体の添加なしでの同一アッセイ条件と比べてクロット溶解時間（実施例Ｉに記載）を延長する能力をいうものとする。この抗フィブリン溶解効果は、ＴＭ類似体の抗フィブリン溶解活性が、そのフィブリン溶解促進活性と比べて優勢なためである。
【００９７】
本明細書で用いる場合、用語「フィブリン溶解促進効果」は、トロンボモジュリン類似体が、該トロンボモジュリン類似体の添加なしでの同一アッセイ条件と比べて、インビトロアッセイ（実施例Ｉに記載する通り）においてクロット溶解時間を有意に低減する能力をいうものとする。
【００９８】
用語「有意に低減する」および「有意に延長する」は、本明細書で用いる場合、ｐ＝０．１レベルで基底値と有意に異なるクロット溶解時間の延長もしくは低減をいう、および／または１０％を上回る、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、最も好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％ １００％、１５０％または２００％を上回る延長もしくは低減をいう。
【００９９】
本発明との関連において用いる場合、文言「処置する」、「処置すること」または「処置」は、出血事象を予防的に抑制するか、または出血事象を緩和、改善もしくは停止させるかのいずれかのために、本発明のＴＭ類似体または該類似体を含む任意の組成物を使用することをいう。該文言は、特に明示していない限り、治癒（ｃｕｒｉｎｇ）もしくは治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）ならびに緩和、軽快または予防のいずれかを包含する。また、本明細書で用いる場合、文言「患者」は、ヒトを含む哺乳動物をいう。
【０１００】
本明細書で用いる場合、用語「線溶亢進を伴う凝固障害」は、血液の凝固性が障害され、それにより、フィブリン溶解の顕著な増大によって出血事象が引き起こされるか、悪化するか、または長期化する疾患としての凝固障害をいうものとする。
【０１０１】
本発明との関連において用いる場合、用語「トロンボモジュリン類似体」は、膜結合型または可溶性のトロンボモジュリンと同じ特徴的な生物学的活性を有するタンパク質およびペプチドの両方をいう。生物学的活性は、トロンビンの受容体として作用し、ＴＡＦＩの活性化を増大させる、または天然トロンボモジュリンと関連している他の生物学的活性を増大させる能力である。
【０１０２】
用語「結合親和性」は、本明細書で用いる場合、トロンボモジュリン類似体とトロンビンとの親和性の強度をいい、解離定数ＫＤで示される。トロンビンとトロンボモジュリンとの結合親和性のＫＤ値は、例えば、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ解析）によって決定し得る。結合親和性は、好ましくは、本発明の実施例ＩＩに記載の速度論アッセイを用いて解析される。
【０１０３】
「ＫＤ」は、ＴＭ類似体とトロンビンとの相対結合親和性をいう。高いＫＤ値は低い結合親和性を表す。ＫＤを決定するための厳密なアッセイおよび手段を実施例ＩＩに示す。
【０１０４】
用語「補因子活性」は、本明細書で用いる場合、トロンボモジュリン類似体が、トロンビンと複合体を形成してトロンビンのプロテインＣの活性化能力を増強する能力をいう。補因子活性を測定するために使用されるアッセイ手順を本発明の実施例ＩＩＩに示す。
【０１０５】
用語「ＴＡＦＩ活性化活性」は、本明細書で用いる場合、トロンボモジュリン類似体が、トロンビンと複合体を形成してトロンビンのＴＡＦＩの活性化能力を増強する能力をいう。ＴＡＦＩ活性を測定するために使用されるアッセイ手順を本発明の実施例ＩＶに示す。
【０１０６】
「Ｋｍ」は、ミカエリス定数をいい、種々の基質濃度で測定される触媒反応速度を測定することにより標準的な様式で誘導される。これは、反応速度がその最大値の半分になる基質濃度に等しい。本発明のＴＭ類似体の「Ｋｍ」は、トロンビン濃度を一定レベル（例えば、１ｎＭ）に維持し、ＫＤに応じたＴＭの飽和レベル（例えば、１００ｎＭ以上）を使用することにより決定する。反応は、漸増濃度のプロテインＣ（例えば、１〜６０μＭ）を用いて行なう。次いで、ラインウィーバー−バークプロットまたは非線形回帰解析を用いてＫｍおよびｋｃａｔを決定する。
【０１０７】
「ＴＭＥ」は、６つのＥＦＧ反復配列（配列番号１または配列番号３によるアミノ酸２２７〜４６２）からなるＴＭの類似体をいう。
【０１０８】
「ＴＭＥＭ３８８Ｌ」は、天然メチオニンの３８８位（配列番号３に基づく）にロイシン残基による置換を有する６つのＥＦＧ反復配列（ａａ２２７〜４６２）からなるＴＭの類似体をいう。
【０１０９】
用語「治療有効量」は、線溶亢進を伴う凝固障害と関連している症状（出血事象など）を低減する活性成分の量と定義する。また、「治療上有効」とは、無処置と比べて、障害の重症度、発生の頻度または持続期間における任意の改善をいう。
【実施例】
【０１１０】
Ｉ．実施例
ヒト血漿でのクロット溶解アッセイ
インビトロクロット溶解モデルを使用し、可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）が正常血漿と第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の混合物において、クロット溶解時間を減少または増大させる能力を試験した。
【０１１１】
１．試験系
この血漿組成物中で、トロンビン（第ＩＩａ因子）、塩化カルシウムおよびホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン（ＰＣＰＳ）小胞を混合することにより、インビトロで凝固を起こした。凝固およびフィブリン溶解の時間的推移を濁度アッセイにより調べ、「ＴＡＦＩａ産生能」を、機能アッセイを用いて調べた。
【０１１２】
２．実験手順
材料．トロンビンおよびフィブリノゲンは、１点を除き（フィブリノゲンの調製では、β−アラニン沈殿処理後、水中４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００を添加することによって、溶液を２％ＰＥＧ−８０００ではなく１．２％ＰＥＧ−８０００にしたこと）、Ｗａｌｋｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：５２０１−５２１２）に記載のようにして調製した。このプロトコルの変更によって、より多くのフィブリノゲンを得ることが可能になった。ＴＡＦＩａアッセイで使用したＱＳＹ−ＦＤＰ（クエンチャーであるＱＳＹ９ Ｃ５−マレイミドに共有結合させたフィブリン分解生成物）およびＴＡＦＩａ標準品は、既報のとおりに調製し（Ｋｉｍら，２００８；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７２：３２−４０；Ｎｅｉｌｌら，２００４；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３０：３３２−３４１）、組換えヒトＰｇ（Ｓ７４１Ｃ）およびフルオレセイン誘導体（５ＩＡＦ−Ｐｇ）は、Ｈｏｒｒｅｖｏｅｔｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ １９９７；２７２：２１７６−２１８２）に記載のとおりに調製した。Ｓ５２５Ｃ−プロトロンビンを、Ｂｒｕｆａｔｔｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：１７６６３−１７６７１）に既報のようにして精製し、５−ヨードアミドフルオレセイン（５ＩＡＦ）で蛍光標識した。ＱＳＹ９ Ｃ５−マレイミドおよび５−ヨードアミドフルオレセインは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（バーリントン，ＯＮ，カナダ）から購入した。プラスミンはＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＶＴ，ＵＳＡ）から購入し、組換えヒト可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ；ｓＴＭ）は、Ｐａｉｏｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（アーヘン，ドイツ）から提供された。正常ヒトプール血漿（ＮＰ）は、カナダのオンタリオ州キングストンのキングストン総合病院（ＫＧＨ）の血液バンクの健常ドナーから取得し、ＦＶＩＩＩ欠損血漿（ＦＶＩＩＩ−ＤＰ）は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（ハミルトン，ＯＮ，カナダ）から購入した。ＴＡＦＩ欠損血漿（ＴＤＰ）は、固定化した抗ヒトＴＡＦＩモノクローナル抗体のカラムでの正常血漿のアフィニティクロマトグラフィーによって、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：１０２１−１０３０）に記載のとおりに調製した。プラスミン阻害剤Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓクロロメチルケトン（ＶＦＫｃｋ）、トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＰＰＡｃｋ）およびイモ塊茎カルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＴＣＩ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。組織型プラスミノゲン活性化因子（Ａｃｔｉｖａｓｅ；ｔＰＡ）は、ＫＧＨ（キングストン，ＯＮ，カナダ）の薬局から購入し、他の試薬はすべて分析用品質のものであった。
【０１１３】
３．方法
ＴＡＦＩ活性化の程度を調べるためのクロット溶解アッセイおよび試料の調製
ＦＶＩＩＩ−ＤＰをＮＰと、ＮＰの最終割合が０、１、６、１０、５０または１００％（０〜１００％ＮＰ）となるように混合した。混合前に、各血漿を光学密度が３２になるまで希釈し、１．５ｎＭ ｔＰＡ、４０μＭ ＰＣＰＳおよび２０ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する等容量の溶液に、２０ｎＭのトロンビンの存在下または非存在下で添加し（終濃度：０．７５ｎＭ ｔＰＡ，２０μＭ ＰＣＰＳ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２、±１０ｎＭトロンビン）、試料を複数のエッペンドルフチューブに分け、３７℃の水浴中に入れた。これらのチューブにおいて、種々の時点で、トロンビンとプラスミンをそれぞれ選択的に阻害するための、１０μＭ ＰＰＡｃｋおよび１０μＭ ＶＦＫｃｋを添加することによって凝固および溶解を停止させた。試料を激しく混合し、次いで、１６０００ｇで３０秒間遠心分離し（室温）、ＴＡＦＩａの熱不活化を防ぐために直ちに氷上に置いた。各試料の上清をＴＡＦＩ欠損血漿で５倍ずつ連続希釈し、Ｋｉｍら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００８；３７２：３２−４０）により記載された機能アッセイを用いてＴＡＦＩａを測定した。同一の実験を、覆いをした９６ウェルプレートで行ない、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ分光測光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，サニーベール，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて経時的に４００ｎｍで濁度をモニタリングし、凝固およびフィブリン溶解のタイミングを調べた。４つのｔＰＡ濃度（０．２５、０．７５、１．５および３ｎＭ）において可溶性トロンボモジュリン（０〜１００ｎＭ）の存在下または非存在下で同様の実験を行ない、ＴＡＦＩ活性化と溶解時間に対するｓＴＭの効果を調べた。また、これらの実験を、５μＭのＰＴＣＩの存在下でも行なうと、正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿においてＴＡＦＩａ依存性溶解延長が示された。
【０１１４】
正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿中でのプロトロンビン活性化の時間的推移の測定
正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿（０〜１００％ＮＰ）に、プロトロンビン誘導体（５ＩＡＦ−ＩＩ；３００ｎＭ最終）ならびに２０μＭ ＰＣＰＳおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２を、１０ｎＭトロンビンの存在下で補給して凝固を開始させた。この実験は、不透明なプラスチックカバー付きの９６ウェルプレート内で行なった。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＧｅｍｉｎｉＸＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，サニーベール，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、経時的に３７℃にて、それぞれ４９５ｎｍおよび５３５ｎｍの励起波長および発光波長で、５３０ｎｍ発光カットオフフィルターを用いて蛍光強度をモニタリングした。蛍光のベースラインと完全なプロトロンビン活性化と相関する最大蛍光を反映させるために蛍光を標準化した（０〜１）。
【０１１５】
ＴＡＦＩａ産生能の測定
ＴＡＦＩａプロット下面積を、実験過程にわたるＴＡＦＩａの効果を定量するためのパラメータとして選択した。このパラメータを、Ｈｅｍｋｅｒら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９３；８５：５−１１）によって定義された「トロンビン産生能」と同様に「ＴＡＦＩａ産生能」と命名した。ＴＡＦＩａ産生能は、トロンビン産生能と同様、切断された基質の量に比例し、数学的には以下のとおりに説明される：
【０１１６】
【数１】
（式中、ｄＳ／ｄｔは基質の消費速度であり、Ｓは基質である）。
【０１１７】
Ｓが一定（すなわち、Ｓの消費が限定的）の場合
【０１１８】
【数２】
ある区間０〜ｔでは、
【０１１９】
【数３】
等式（４）の右側の積分がＴＡＦＩａプロット下面積であることを認識すると、
【０１２０】
【数４】
４．結果
クロット溶解時間は、正常血漿をＦＶＩＩＩ欠損血漿に添加することによって増大する
１０ｎＭの第ＩＩａ因子、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および２０μＭ ＰＣＰＳの小胞を用いて凝固を開始し、クロット構造物がＦＶＩＩＩ濃度に対して非感受性であるモデルを作出した。ＦＶＩＩＩ濃度に関係なくクロット構造物が類似しているため、ｔＰＡ依存性（０．７５ｎＭ）のクロット溶解に対するＦＶＩＩＩの効果を調べることができる。この溶解モデルを使用すると、正常血漿の割合が増加するにつれて溶解時間が増大した。図１は、正常血漿を０〜１００％で添加したＦＶＩＩＩ−ＤＰのクロット溶解プロフィールを示し、溶解時間を図１にまとめている（差し込み図）。ＦＶＩＩＩ−ＤＰでは、溶解時間は３７分であり、正常血漿の添加によっておよそ５０％増大され得る。
【０１２１】
１０％正常血漿は、ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でのクロット溶解を回復させるのに充分である
１０％正常血漿で、ＦＶＩＩＩ−ＤＰと関連している溶解時間の短縮は、正常血漿で観察される時間まで修正された（図１，差し込み図参照）。
【０１２２】
５０％ＴＡＦＩａ産生能はＦＶＩＩＩ−ＤＰ中でのクロット溶解を回復させるのに充分である
ＴＡＦＩ活性化を正常血漿、ＦＶＩＩＩ欠損血漿および混合血漿において測定し、活性化の時間的推移に対するＦＶＩＩＩの効果を定量した。機能アッセイを使用し、凝固および溶解の時間的推移にわたるＴＡＦＩａを測定し、その結果を図２に示している。トロンビン、カルシウムイオンおよびＰＣＰＳを用いてＦＶＩＩＩ−ＤＰ中で凝固を開始した場合、５分後、およそ３０ｐＭのＴＡＦＩａが測定された。正常血漿の割合が増加するにつれて、ＴＡＦＩａのピーク濃度も増大した。ＦＶＩＩＩ−ＤＰに１０％正常血漿を補給することによって溶解時間は修正されたが、これは、ＴＡＦＩ活性化を完全に修正するには充分ではなかった。ＴＡＦＩａ時間推移プロット下面積（図２Ａ）を計算することにより、最初の５０分間では、正常血漿中と５０％正常血漿中で、ほぼ同じＴＡＦＩａ産生能（図２Ｂ）が得られる（それぞれ、１６８００ｐＭ分および１４１００ｐＭ分）が、１０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰ血漿が有したＴＡＦＩａ産生能は、正常血漿におけるＴＡＦＩａ産生能のわずか５０％であることが測定された。
【０１２３】
溶解時間とＴＡＦＩａ産生能間には強い相関がある
０〜１００％のＦＶＩＩＩの範囲にわたる溶解時間とＴＡＦＩ活性化間の関係を定量するため、ｌｏｇ溶解時間に対してｌｏｇ ＴＡＦＩａ産生能をプロットした（図２Ｂ，差し込み図）。予測どおり、データは、０〜１００％のＦＶＩＩＩを含有する血漿中において溶解時間とＴＡＦＩａ産生能間の強い正の相関を示す。トロンビンはＴＡＦＩの活性化因子であるため、図２ＡのＴＡＦＩ活性化プロフィールは、血漿中でのプロトロンビン活性化を解析することにより合理的に説明され得る（図３）。一般的な傾向は、正常血漿の割合が増加するにつれて、プロトロンビンの活性化速度も増大する（これは、図３の曲線の傾きを調べることによって決定され得る）というものである。正常血漿では例外が生じる。正常血漿では、プロトロンビンの活性化速度は、５０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰよりも低い。この速度は正常血漿中では遅いが、プロトロンビン活性化は、５０％正常血漿と混合したＦＶＩＩＩ−ＤＰ中よりも約２倍長く持続する。どの実験でも、プロトロンビン活性化のタイミングは、ＴＡＦＩ活性化に充分対応している。また、正常血漿を、トロンビンを添加せずにカルシウムイオンとＰＣＰＳを用いて凝固させた。カルシウム誘導性の凝固はすぐには起こらない；正常血漿中でクロットが形成されるのにおよそ１５分かかる。この時点で、プロトロンビン活性化は伝播期に入り、その結果、ＴＡＦＩが活性化される。クロットの形成に関するＴＡＦＩ活性化の程度とタイミングは、凝固が添加トロンビンの存在下で開始しようと非存在下で開始しようと同じであり、これは、ＴＡＦＩ活性化が、インサイチュで生成されたトロンビンの結果であって、凝固を誘導するために添加されたトロンビンの結果ではないことを示唆する。トロンビンの存在下では、ＴＡＦＩａ産生能が１６，８００ｐＭ分であったのに対して、トロンビンの非存在下では１４，１５０ｐＭ分であった。
【０１２４】
可溶性トロンボモジュリンは正常血漿とＦＶＩＩＩ欠損血漿においてクロット溶解を延長する
正常血漿では、ピークＴＡＦＩａレベルおよびＴＡＦＩａ産生能は、それぞれ、ｓＴＭの非存在下での６００ｐＭおよび１６８００ｐＭ分から、それぞれ、１０ｎＭのｓＴＭの存在下で、およそ６０００ｐＭおよび１５０，０００ｐＭ分に増大した。このＴＡＦＩ活性化の増大により、溶解時間の７０％の増大がもたらされた。ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中での溶解の相対的延長に対する１０ｎＭのｓＴＭの効果は、ＦＶＩＩＩ−ＤＰをｓＴＭの存在下で凝固および溶解させると溶解が６５％延長したという点で、正常血漿と類似していた。１０ｎＭのｓＴＭの存在下では、ピークＴＡＦＩａ濃度で７５０ｐＭのＴＡＦＩａが存在したのに対して、ｓＴＭの非存在下では３０ｐＭであった。クロットの開始からクロット溶解時間までの時間中、ＴＡＦＩａ産生能は、１０ｎＭのｓＴＭの存在下で１２８００ｐＭ分であると測定されたのに対して、ｓＴＭの非存在下では６００ｐＭ分であった。
【０１２５】
正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿におけるクロット溶解時間の増大はｔＰＡとｓＴＭの濃度に依存する
溶解時間に対するＴＡＦＩ活性化の効果をｔＰＡ濃度およびｓＴＭ濃度の範囲にわたって解析し、ＦＶＩＩＩ−ＤＰにおける溶解の欠陥がＴＡＦＩ活性化の刺激によって修正され得るかどうかを調べた。図４にまとめた溶解時間は、ＴＡＦＩａの阻害剤であるＰＴＣＩを含めた同様の実験での溶解時間との対比である。ＰＴＣＩの存在下では、機能性ＴＡＦＩａは存在せず、そのため図４に示した相対溶解時間は、ＴＡＦＩａ依存性溶解延長に典型的なものである。最も低いｔＰＡ濃度（０．２５ｎＭ）では、１ｎＭのｓＴＭを正常血漿に添加した場合、最大のＴＡＦＩａ依存性溶解延長（２倍）が観察された。ＦＶＩＩＩ−ＤＰにｓＴＭを補給すると、溶解時間の用量依存性の延長が引き起こされた（図４）。１００ｎＭのｓＴＭをＦＶＩＩＩ−ＤＰに添加した場合、溶解時間は、正常血漿でみられる時間まで完全に修正された。ｔＰＡ濃度を増大させるにつれて、最大のＴＡＦＩａ依存性溶解延長を得るために、より高濃度のｓＴＭが必要とされた。例えば、１．５ｎＭのｔＰＡ（図４）を存在させた場合、ＴＡＦＩａ依存性溶解延長を最大にするために、正常血漿中では２５ｎＭのｓＴＭが必要とされ、ＦＶＩＩＩ−ＤＰ中では１００ｎＭのｓＴＭが必要とされる。また、このクロット溶解実験でｔＰＡが増加するにつれて、ＴＡＦＩａは、溶解時間に対してずっと大きな効果を有するようである（１．５ｎＭ ｔＰＡでは５．２倍までに対して０．２５ｎＭ ｔＰＡでは２．３倍）。ｔＰＡ濃度が増加するにつれて、任意のＴＡＦＩａ依存性溶解延長を得るために必要とされるｓＴＭの濃度も増大するようである。０．２５ｎＭ ｔＰＡでは、正常血漿において溶解延長を得るためにｓＴＭは必要とされなかったが、３ｎＭのｔＰＡ（図４）を正常血漿に添加すると、溶解延長を得るために２５ｎＭのｓＴＭが必要とされた。実際の溶解時間がｔＰＡおよびｓＴＭによってどのように影響されるのかを示すため、ＴＡＦＩａ阻害正常血漿およびＦＶＩＩＩ欠損血漿での溶解時間を表１に示す。
【０１２６】
トロンボモジュリンは、正常血漿とＦＶＩＩＩ欠損血漿の両方において、十分に実質的にＴＡＦＩ活性化を促進し、溶解を延長する
正常血漿では、ｓＴＭの非存在下（○；６００ｐＭのＴＡＦＩａ；図５Ａ参照）と比べて、１０ｎＭのｓＴＭの存在下で（●；ピークレベルで６０００ｐＭのＴＡＦＩａ）、ＴＡＦＩ活性化が有意に増大していることが示されている。ｓＴＭを伴うクロット溶解プロフィールは、１０ｎＭのｓＴＭの添加により、溶解時間の７０％の増大がもたらされたことを示す。１０ｎＭのｓＴＭを補給したＦＶＩＩＩ−ＤＰでは、ＴＡＦＩａは、ｓＴＭの非存在下で３０ｐＭであるのに比べて、ピークでは７５０ｐＭであると測定された（図５Ｂ参照）。ＴＡＦＩ活性化の増大により、ｓＴＭなしのＦＶＩＩＩ−ＤＰと比べて溶解の６０％延長がもたらされた。
【０１２７】
ＩＩ．実施例
トロンビンとトロンボモジュリンの結合親和性の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、ＫＤ値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合について測定した。
【０１２８】
１．試験系
トロンビンとトロンボモジュリン類似体との結合の親和性は、蛍光速度論アッセイを用いて測定し、ＫＤ値で表示した。
【０１２９】
２．実験手順
材料
ヒトトロンビンは血漿から、Ｂａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１４４７７−１４４８４）に記載のようにして単離した。組換え可溶性トロンボモジュリン（Ｓｏｌｕｌｉｎ）は、ＰＡＩＯＮ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（アーヘン，ドイツ）から取得した。他の試薬はすべて、Ｓｉｇｍａ社から分析用品質で取得した。
【０１３０】
方法
トロンボモジュリンおよびＴＡＦＩに対するトロンビンの結合の測定
トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合は、平衡結合アッセイとして測定した。トロンビン（２０ｎＭ）、トロンボモジュリン（１．５４μＭ）およびＤＡＰＡ（２０ｎＭ，ダンシルアルギニンＮ−３−（エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド，蛍光性の可逆性トロンビン阻害剤）を０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．４）中に含む溶液を、少量のアリコートに分けて連続的に、トロンボモジュリンを含まないこと以外は同一の溶液に添加した。添加は、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒモデルＬＳ５０Ｂ分光蛍光光度計の試料区画内で、磁気撹拌器を取り付けたキュベット内で行なった。強度の値を、それぞれ２８０ｎｍおよび５４５ｎｍの励起波長および発光波長で継続的に記録した。発光ビームにおいて４３０ｎｍカットオフフィルターを使用した。データを以下のようにして解析した。蛍光強度Ｉを、トロンビン−ＤＡＰＡ（Ｔ・Ｄ）とトロンビン−トロンボモジュリン−ＤＡＰＡ（Ｔ・ＴＭ・Ｄ）の強度の和と仮定した。すなわち、Ｉ＝ｉ１・［Ｔ・Ｄ］＋ｉ２・［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］であり、式中、ｉ１およびｉ２は、Ｔ・ＤおよびＴ・ＴＭ・Ｄの蛍光係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）である（励起は２８０ｎｍであったため、遊離ＤＡＰＡからの発光は無視できた）。ＴＭによってプロテインＣ活性化またはＴＡＦＩ活性化いずれかのＫｍは感知できるほどには変わらないため（Ｂａｊｚａｒら，１９９６；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６６０３−１６６０８参照）、トロンビン−ＤＡＰＡ相互作用の親和性は変わらないと仮定することが可能である。
【０１３１】
したがって ［Ｔ・Ｄ］＝（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）
および ［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］＝（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）
（式中、ＫＤＡＰＡはトロンビン−ＤＡＰＡ相互作用の解離定数である）。
したがって、
Ｉ＝ｉ１・（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）＋ｉ２（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）。
【０１３２】
ｆとｂを、それぞれ、遊離およびトロンボモジュリンに結合したトロンビンの分率と規定し、［Ｔ］０をトロンビンの総濃度とすると、ｆ＝（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）／［Ｔ］０、ｂ＝（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）／［Ｔ］０およびｆ＋ｂ＝１である。次いで、蛍光強度が、Ｉ＝ｉ１・ｆ［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）＋ｉ２・ｂ［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）によって得られる。Ｉ０を初期強度と規定すると、トロンボモジュリンを添加しなかった場合、ｆ＝１およびＩ０＝ｉ１［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）である。同様に、Ｉｍａｘを、トロンボモジュリンでトロンビンを飽和したときの強度と規定すると、ｂ＝１およびＩｍａｘ＝ｉ２［Ｔ］０／（１＋ＫＤＡＰＡ／［ＤＡＰＡ］）である。したがって、Ｉ＝Ｉ０・ｆ＋Ｉｍａｘ・ｂである。ｆを１−ｂで置き換えると、Ｉ＝Ｉ０＋（Ｉｍａｘ−Ｉ０）・ｂまたはΔＩ＝ΔＩｍａｘ・ｂが得られる。初期強度に対して標準化すると、（ΔＩ／Ｉ０）＝（ΔＩｍａｘ／Ｉ０）・ｂが得られる。ＤＡＰＡがＴとＴ・ＴＭに等しい親和性で結合する場合、ＴＭはＴとＴ・Ｄに等しい親和性で結合する。
【０１３３】
したがって、ＫＴＭをトロンビン−トロンボモジュリン相互作用の解離定数と規定すると、［Ｔ］［ＴＭ］＝ＫＴＭ［Ｔ・ＴＭ］；［Ｔ・Ｄ］［ＴＭ］＝ＫＴＭ［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］；および（［Ｔ］＋［Ｔ・Ｄ］）・［ＴＭ］＝ＫＴＭ（［Ｔ・ＴＭ］＋［Ｔ・ＴＭ・Ｄ］）である。最後の表現はｆ・［ＴＭ］＝ＫＴＭ・ｂと同一である。ｆ＝１−ｂおよび［ＴＭ］＝［ＴＭ］０−ｂ・［Ｔ］０（式中、［ＴＭ］０は総トロンボモジュリン濃度）であるため、以下の等式：（１−ｂ）（［ＴＭ］０−ｂ・［Ｔ］０）＝ＫＴＭ・ｂが得られる。これはｂの二次方程式であり、これは、解く場合に上記の表現を（ΔＩ／Ｉ０）で置き換えると、等式：（ΔＩ／Ｉ０）＝（ΔＩｍａｘ／Ｉ０）・０．５・（ＫＴＭ＋［Ｔ］０＋［ＴＭ］０−（（ＫＴＭ＋［Ｔ］０＋［ＴＭ］０）２−４・［Ｔ］０・［ＴＭ］０）１／２）が得られる。この後者の等式は、蛍光強度値、トロンボモジュリンとトロンビンの公称濃度、トロンビン−トロンボモジュリン相互作用の解離定数、およびトロンボモジュリンとトロンビン−ＤＡＰＡとの相互作用のシグナルを発する蛍光強度増分間の関係を示す。［ＴＭ］０を独立変数としてならびにＫＴＭおよびΔＩｍａｘをベストフィットパラメータとして用い、強度のデータを非線形回帰解析によって上記の等式にフィットさせた。
【０１３４】
３．結果
トロンビンは可溶性トロンボモジュリンにＫＤ＝２３±１４ｎＭの親和性で結合する
可溶性トロンボモジュリンに対するトロンビンの結合を、ＤＡＰＡの蛍光の摂動によって測定した。図６に示したように、滴定曲線では、０〜７５ｎＭの可溶性トロンボモジュリン濃度範囲で相対蛍光の増大が示された。データ解析により、可溶性トロンボモジュリンに対するトロンビン結合はＫＤ＝２３±１４ｎＭで特性評価されることが示された。
【０１３５】
ＩＩＩ．実施例
変異トロンボモジュリン類似体の補因子活性の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、ＫＤ値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との間の結合について測定した。
【０１３６】
１．実験手順
材料および方法
ＴＭ変異体がプロテインＣのトロンビン媒介性活性化の補因子として作用する能力を、ショッケート（ｓｈｏｃｋａｔｅ）において直接アッセイした。組換えヒトプロテインＣは、Ｊｏｈｎ ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ博士（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ．）からのものであり、既報（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０；８：６５５−６６１）のとおりに精製した。２５μｌの各ショッケートを等容量の組換えヒトプロテインＣ（終濃度０．３μＭ）およびヒトαトロンビン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，セントルイス，ＭＯ）と、マイクロタイタープレート内で１ｎＭの終濃度で混合した。使用した試薬はすべて、５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌ／３．７５ｍＭ ＣａＣｌ２／０．１％ＮａＮ３（ｗ／Ｖ）中で希釈した。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、８００単位／ｍｌの２５μｌのヒルジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，セントルイス，ＭＯ）の添加によって反応を終了させた。活性化プロテインＣの量を、１００μｌの色素形成性基質Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２６６）（１ｍＭ）の添加によって決定した。プレートリーダーを使用し、４０５ｎｍにおける吸光度によって変化を経時的に測定する。データはミリＯＤ単位／分で記録され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーを用いて吸光度を１０秒ごとに１５分間測定することにより、各試料について決定する。すべてのアッセイに三連のショッケート試料（各ＤＨ５α細胞は、内部対照として、ｐＳＥＬＥＣＴ−１ベクター（ＴＭなし）、ｐＴＨＲ２１１（野生型）またはｐＭＪＭ５７（３８８位のメチオニンがロイシンに変えたｐＴＨＲ２１１）のいずれかでトランスフェクトした）を含めた。ＴＭ変異体の補因子活性は、ｐＭＪＭ５７で得られたものの平均値として示した。
【０１３７】
統計解析
各変異体を活性について少なくとも２回アッセイし（陽性クローンが２つしか単離されなかった変異体では３回）、すべてのデータを、スチューデントのｔ−検定を用いた有意差の判定に含めた。プレート間の変動係数は１６．７％であった（ｎ＝１８）。
【０１３８】
ウエスタンブロット解析
大腸菌ショッケートを、製造業者の使用説明書（Ｎｏｖｅｘ Ｉｎｃ．，サンディエゴ，ＣＡ）に従い、還元条件下で１０％Ｔｒｉｓ−トリシンＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて実行した。１０ｍＭのジチオトレイトールを含有する試料バッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０．００２５％ブロモフェノールブルー）中でショッケートを１０分間煮沸することにより、還元アルキル化試料を調製した後、５０ｍＭのヨードアセトアミドとともにインキュベートした。
【０１３９】
タンパク質を、転写バッファー（１９２ｍＭグリシン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３，２０％メタノール）中、４℃でニトロセルロースフィルターに転写した。ニトロセルロースフィルターをブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，０．９％ＮａＣｌ，０．０５％ＮａＮ３）でブロックし、次いで、ブロッキングバッファー中で、マウスポリクローナル抗血清（ヒトトロンボモジュリンの還元アルキル化ＥＧＦドメインに対して生成させたもの）とともにインキュベートした。洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，０．９％ＮａＣｌ，０．０５％ＮａＮ３，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、フィルターをビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともに、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するブロッキングバッファー中でインキュベートした。タンパク質は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，アーリントンハイツ，ＩＬ）を、製造業者の使用説明書に従って用いて検出した。
【０１４０】
ＩＶ．実施例
ＴＡＦＩおよびプロテインＣの活性化に関するトロンボモジュリン類似体の解析
蛍光速度論アッセイを使用し、ＫＤ値で表示される親和性を、トロンビンとトロンボモジュリン類似体との間の結合について決定した。
【０１４１】
１．実験手順
タンパク質および試薬
Ｓｏｌｕｌｉｎ（残基４〜４９０）、ＴＭＥ（残基２２７〜４６２）、ＴＭＥｃループ３〜６（残基３３３〜４６２）、およびＴＭＥｉ４〜６（残基３４５〜３６２）を含むトロンボモジュリンの切断型形態を、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２；１８５：５６７−５７６）に記載のとおりに調製した。Ｓｆ９細胞をＴＭ構築物でトランスフェクトし、タンパク質を培地から、クロマトグラフィー手順（アニオン交換、ゲル濾過およびトロンビン親和性の組合せを使用）によって単離した。純度（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によって評価）は９５％以上であった。ヒト血漿ＴＡＦＩを、Ｂａｊｚａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１４４７７−１４４８４）に記載のようにして単離した。ヒトプロテインＣおよびトロンビンは、ＢａｊｚａｒおよびＮｅｓｈｅｉｍ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８６０８−８６１６）に記載のとおりに調製した。トロンビン阻害剤であるダンシルアルギニンＮ−（３−エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）は、Ｎｅｓｈｅｉｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７９；１８：９９６−１００３）に記載のとおり合成した。アラニンスキャニングによって得られる点変異体を、ＴＭＥＭ３８８Ｌ構築物から作製した。タンパク質は大腸菌において発現させた。ペリプラズム抽出物の手順および調製は、Ｎａｇａｓｈｉｍａら，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８６０８−８６１６）に記載されている。ＨＥＰＥＳ、塩基性カルボキシペプチダーゼ基質であるヒップリル−アルギニン、塩化シアヌル、および１，４−ジオキサンはＳｉｇｍａ社から入手した。他の試薬はすべて分析用品質のものであった。
【０１４２】
トロンボモジュリン類似体の点変異体でのプロテインＣおよびＴＡＦＩの活性化速度の測定
ＴＡＦＩの活性化のため、各ペリプラズム抽出物の２０μｌアリコートをトロンビン（１３ｎＭ最終）とともに、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＣａＣｌ２中、室温で５分間プレインキュベートした。次いで、混合物を、精製組換えＴＡＦＩ（１８ｎＭ最終）および基質ヒップリル−アルギニン（１．０ｍＭ最終）とともに、総容量６０μｌで６０分間インキュベートした。ヒップリル−アルギニンから馬尿酸への加水分解、続いて、馬尿酸の色原体への変換（８０μｌのリン酸バッファー（０．２Ｍ，ｐＨ８．３）および６０μｌの３％シアヌル酸含有ジオキサン（ｗ／ｖ）を使用）を測定することにより、活性化ＴＡＦＩの量を定量した。充分に混合した後、透明な上清の吸光度を３８２ｎｍにおいて測定した。各変異体について、ＴＡＦＩのトロンビン依存性活性化の量を、トロンビンの非存在下で生じたバックグラウンド吸光度を差し引くことにより計算した。ＴＭＥＭ３８８Ｌ−アラニン変異体によるプロテインＣの活性化を以下のようにしてアッセイした。
【０１４３】
試料および試薬はすべて、ＡＰＣアッセイ希釈剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．５％ＢＳＡ）中で希釈した。試料およびＴＭ標準品（０〜１ｎＭ）を、６０μｌの総容量で３７℃にて、９６ウェルプレート内で０．５μＭのプロテインＣおよび１ｎＭのトロンビンとともに６０分間インキュベートしてＡＰＣを生成させた後、２０μｌのヒルジン（０．１６Ｕ／μｌ，５７０ｎＭ）でクエンチした。Ｓ−２２６６（１ｍＭを１００μｌ）の加水分解をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて４０５ｎｍにて１分間隔でモニタリングすることにより、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性により、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分が生成される（３７℃）。
【０１４４】
すべてのアッセイに、内部対照として、ｐＳｅｌｅｃｔ−１ベクター（ＴＭＥなし）、野生型ＴＭＥ（Ｍ３８８）またはＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）のいずれかでトランスフェクトしたＤＨ５α細胞の抽出物を含めた。ＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）アラニン変異体の補因子活性は、ＴＭＥ（Ｍ３８８Ｌ）の活性に対する割合で示した。各ＴＭ変異体を、プロテインＣとＴＡＦＩの両方の活性化について、３回の独立した抽出物の調製物を用いて二連でアッセイした。
【０１４５】
２．結果
ＴＭ変異体で得られた結果（図７）は、８つ（ｅｉｇｔｈ）の変異体のうち５つで、補因子活性化が実質的に低減していたことを示す。また、これらの５つの変異体のうち４つの変異体は、同時にＴＡＦＩの活性化活性の低下も示す。Ｆ３７６Ａにおける変異のみで、プロテインＣ活性化の顕著な減損がもたらされたが、ＴＡＦＩ活性化の低減は中程度にすぎなかった。興味深いことに、ＴＡＦＩおよびプロテインＣの活性化に対するＰｈｅ３７６の重要性に違いのあることから、プロテインＣがトロンビン−トロンボモジュリン複合体の基質である場合の方が、トロンボモジュリン構造についての要件に制限のあることが示唆される。
【０１４６】
Ｖ．実施例
酸化に関するプロテインＣ活性化についてのＭｅｔ特異的ＴＭ変異体の解析
トロンボモジュリン類似体の特定のメチオニン変異体を使用し、補因子活性化に対する、また、タンパク質の酸化に関するこの残基の役割を、プロテインＣ活性化アッセイを用いて解析した。
【０１４７】
１．実験手順
タンパク質および試薬
ヒト組換えプロテインＣはＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．（ボストン，ＭＡ）製のものであった。ウシトロンビンはＭｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ダラス，ＴＸ）製のものであった。Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドは、Ｇｌａｓｅｒら（Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９７５；５：３３３−３４８）に記載のとおりに調製した。ヒトα−トロンビン（４，０００ ＮＩＨ Ｕ／ｍｇ）、ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）およびクロラミンＴはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セントルイス，ＭＯ）製のものであった。
【０１４８】
ＴＭＥ（Ｓｆ９）の発現
全手順は４℃で行なった。ＴＭの６ ＥＧＦ様反復配列（アミノ酸２２７〜４６２）をコードするＤＮＡ配列を、昆虫プロテアーゼであるヒポデルミン（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｎ）Ａのシグナル配列に連結し、このハイブリッド遺伝子を、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）遺伝子プロモーターの制御下でバキュロウイルスシャトルベクターｐＴＭＨＹ１０１内に配置した。組換えウイルスは標準的な手法を用いて作製した。記載の変異体類似体は、ミューテーター部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ラ・ホーヤ，ＣＡ）の使用によって調製し、同じ方法によってバキュロウイルス系での発現のためのウイルスを調製した。
【０１４９】
精製およびクロラミンＴでの酸化
分泌されたＴＭＥ変異体（Ｓｆ９）を含有する増殖培地を遠心分離によって清澄にし、凍結乾燥させ、１：１０容量の０．２％ＮＥＭ−Ａｃ（ｐＨ７）／０．００８％Ｔｗｅｅｎ８０に再溶解させた。アリコートを５μｌのＨ２０または５μｌの１００ｍＭクロラミンＴのいずれかで処理し；室温で２０分間インキュベートし；希釈によって酸化剤を除去し；ＮＡＰ−５カラム（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，ｐＨ７．４；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）で脱塩し；プロテインＣの活性化について以下のようにしてアッセイした。
【０１５０】
ＴＭの補因子活性の測定（ＡＰＣアッセイ）
試料および試薬はすべて、ＡＰＣアッセイ希釈剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．５％ＢＳＡ）中で希釈した。試料およびＴＭ標準品（０〜１ｎＭ）を、６０μｌの総容量で３７℃にて、９６ウェルプレート内で０．５μＭのプロテインＣおよび１ｎＭのトロンビンとともに６０分間インキュベートしてＡＰＣを生成させた後、２０μｌのヒルジン（０．１６Ｕ／μｌ，５７０ｎＭ）でクエンチした。Ｓ−２２６６（１ｍＭを１００μｌ）の加水分解をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて４０５ｎｍにて１分間隔でモニタリングすることにより、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性により、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分が生成される（３７℃）。
【０１５１】
２．結果
Ｍｅｔ３８８の酸化によるＴＭの補因子活性の低下
変異体および野生型のＴＭＥ（Ｓｆ９）を昆虫細胞において発現させ、クロラミンＴで処理し、補因子活性についてアッセイし、結果を比較した（表２）。ＴＭＥは、クロラミンＴなどの酸化剤で処理すると、その補因子活性をおよそ８５％失う（表２参照）。Ｍｅｔ２９１およびＭｅｔ３８８の部位特異的変異により、ＴＭＥ（Ｓｆ９）の不活化が単一のメチオニンの酸化によるものであることが実証される。Ｍｅｔ３８８を保持した誘導体はクロラミンＴによって同程度（＞８０％）まで不活化されたが、Ｍｅｔ３８８Ｌｅｕ変異体は抵抗性であった。Ｍｅｔ２９１を置き換えた変異体は、活性であったが、酸化的不活化に対して抵抗性でなかった。
【０１５２】
ＶＩ．実施例
ＥＧＦ４とＥＧＦ５の間にドメイン間ループの変異を有するＴＭ類似体の解析（Ｇｌｎ３８７，Ｍｅｔ３８８，Ｐｈｅ３８９）
トロンボモジュリン類似体の特定の変異体を使用し（ｓｉｎｇ）、これらの残基およびその酸化の役割を、プロテインＣ活性化アッセイを用いて解析した。
【０１５３】
１．実験手順
プラスミドの構築．ＥＧＦ様ドメインのみからなるトロンボモジュリン断片（ＴＭＥ）を大腸菌において以下のようにして発現させ、完全長ＴＭのＴＭＥ（残基２２７〜４６２）をコードするＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応によってヒトゲノムＤＮＡから、プライマー５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＣＧ−３’と５’−ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣ−３’を用いて得た。この断片を、β−ラクタマーゼプロモーターおよびシグナル配列の制御下でｐＫＴ２７９内に配置した。次いで、得られたプラスミドのＥｃｏＲＶ−ＢｇＩＩＩ断片およびｆ１複製起点を含むｐＧＥＭ３ｚｆのＳｃａＩ−ＳａｃＩ断片を、それぞれ、ｐＳｅｌｅｃｔ−１ベクター内のＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩおよびＳｃａＩ−ＳａｃＩ部位に挿入し、大腸菌発現プラスミドｐＴＨＲ２１１を構築した。３８７位、３８８位または３８９位のＴＭ変異体をコードするプラスミドを、改変部位インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｏｒ）変異誘発キットに記載の部位特異的変異誘発手順を使用し、単鎖ｐＴＨＲ２１１ ＤＮＡ鋳型を用いて構築した。部位特異的変異の各プライマーは制限解析によって確認した。
【０１５４】
変異体の補因子活性を測定するため、変異体タンパク質を発現している個々の大腸菌培養物を遠心分離し、洗浄し、細胞ペレットを、２０％スクロース，３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２中でインキュベートした（１０分間，４℃）。ショッケートを細胞ペレットの遠心分離によって調製し、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２で処理し（１０分間，４℃）、ＡＰＣアッセイにおいてアッセイした。データは、３つの独立した各クローンの結果の平均である。
【０１５５】
ＴＭの補因子活性の測定（ＡＰＣアッセイ）
試料および試薬はすべて、ＡＰＣアッセイ希釈剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，０．５％ＢＳＡ）中で希釈した。試料およびＴＭ標準品（０〜１ｎＭ）を、６０μｌの総容量で３７℃にて、９６ウェルプレート内で０．５μＭのプロテインＣおよび１ｎＭのトロンビンとともに６０分間インキュベートしてＡＰＣを生成させた後、２０μｌのヒルジン（０．１６Ｕ／μｌ，５７０ｎＭ）でクエンチした。Ｓ−２２６６（１ｍＭを１００μｌ）の加水分解をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて４０５ｎｍにて１分間隔でモニタリングすることにより、形成されたＡＰＣの量を決定した。１Ｕの活性により、１ｐｍｏｌの活性化プロテインＣ／分が生成される（３７℃）。
【０１５６】
２．結果
ループ間ドメインの変異によるＴＭの補因子活性の低下
部位特異的変異誘発を使用し、３８７位、３８８位または３８９位に改変アミノ酸、欠失または挿入のいずれかを有するＴＭ変異体を発現させた（図８）。ＴＭ変異体の補因子活性は、３つの独立したクローンから得た平均であり、ＴＭＥ（Ｓｆ９）ＷＴで見られた活性に対する割合で示す。ウエスタンブロットのゲルスキャンは、新しいすべての３８８位の変異体および選択した３８７位の変異体について、ＴＭに対するポリクローナル抗体を用いて行なった。このスキャンによりほぼ同等量のＴＭが得られ、これは、発現の差が、観察された活性の差をもたらし得ないことを示す。また、３８７位（図８Ａ）、３８８位（図８Ｂ）、３８９位（図８Ｃ）の独立した置換またはドメイン間ループ内の任意の箇所における挿入および欠失（図８Ｄ）により、ＡＰＣアッセイでおおむね野生型ＴＭＥよりも（ｔｈｅｎ）不充分な補因子である類似体がもたらされる。Ｇｌｎ３８７がＴｈｒ、ＭｅｔまたはＡｌａで置き換えられた類似体は、７０％超の補因子活性を保持しているが、Ｇｌｕでの置換により、これは対照の５８％まで低下し、他のすべてのアミノ酸では５０％超の低下がもたらされる。ＬｅｕでのＭｅｔ３８８の置換のみ、野生型より実質的に高い補因子活性（１．８倍）がもたらされる。ＧｌｎとＴｙｒを除くＭｅｔ３８８の他のすべての置換では、補因子活性の５０％超の低下がもたらされた。ＴＭ補因子活性はＰｈｅ３８９のアミノ酸置換に対して感受性が低く、この位置の点変異体のうち９つが、対照でみられる活性の７０％を超保持している。任意の位置でのＰｒｏまたはＣｙｓ置換により活性が１０％超まで低下したが、Ｍｅｔ３８８Ｐｒｏは例外であり、これは３０％の活性を保持していた。個々のアミノ酸の欠失または４つの可能な各位置へのＡｌａの挿入いずれかによってＥＧＦ４とＥＧＦ５の間のドメイン間ループの長さを変えると、野生型ＴＭＥの活性の１０％未満の変異体がもたらされた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用であって、該ＴＭ類似体が治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示すことを特徴とする、使用。
【請求項２】
前記トロンボモジュリン類似体が以下の特徴：
（ｉ）ウサギ肺トロンボモジュリンと比べて低下した、トロンビンに対する結合親和性、および／またはｋＤ値が０．２ｎＭより大きい、トロンビンに対する結合親和性；
および／または
（ｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌの補因子活性と比べて低下した補因子活性、
（ｉｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて増大した補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率
の１つ以上を示す、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記線溶亢進を伴う凝固障害が、以下：血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、後天性フォン・ヴィレブランド病、第Ｘ因子欠損症、パラ血友病、凝固第Ｉ、ＩＩ、ＶもしくはＶＩＩ因子の遺伝性障害、循環抗凝血素による出血性障害または後天性凝固欠損症の疾患の群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記トロンボモジュリン類似体が、頭蓋内または他のＣＮＳの出血、関節、微小毛細血管、筋肉、胃腸管、呼吸路、腹膜後隙または軟部組織での出血からなる群より選択される出血事象の１つ以上を処置するために使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記トロンボモジュリン類似体が出血エピソードのときに投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記トロンボモジュリン類似体が、出血リスクが増大する前、例えば、手術または抜歯の前に投与される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記トロンボモジュリン類似体が、血液／血漿の輸血または凝固因子補充療法に対して抗療性の患者に投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記トロンボモジュリン類似体が、１週間未満から４週間までの合計期間にわたって、複数回用量で、好ましくは１日１回、２日に１回、または３日、４日、５日、６日もしくは７日おきに１回、より好ましくは長期投与として投与される、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記トロンボモジュリン類似体が非経口適用として、好ましくは静脈内または皮下適用として与えられる、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記 トロンボモジュリン類似体が可溶性ＴＭ類似体である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記トロンボモジュリン類似体がヒト可溶性ＴＭ類似体である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記トロンボモジュリン類似体が、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、ＥＧＦ６を含み、好ましくは断片ＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含み、より好ましくはＥＧＦドメイン１〜６を含む群から選択される、少なくとも１つの構造ドメインを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記トロンボモジュリン類似体が、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６からなる、より好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６からなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記トロンボモジュリン類似体が、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１または配列番号３に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、以下の改変：
ａ） アミノ酸１〜３の除去
ｂ） Ｍ３８８Ｌ
ｃ） Ｒ４５６Ｇ
ｄ） Ｈ４５７Ｑ
ｅ） Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
の１つ以上を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号２と少なくとも８５％、または少なくとも９０％もしくは９５％配列が同一の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記トロンボモジュリン類似体が、以下：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｆ） ３６１Ｇｌｎ；
ａｇ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｈ） ３６４Ａｓｎ；
ａｉ） ３６８Ｔｙｒ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；
ａｎ） ３８５Ａｒｇ；
ｂａ） ３８７Ｇｌｎ；
ｂｂ） ３８９Ｐｈｅ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｂｏ） ４２３Ａｓｐ；
ｂｐ） ４２４Ｉｌｅ；
ｂｑ） ４２５Ａｓｐ；
ｂｒ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃａ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｂ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｃ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｄ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｅ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｆ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｇ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｈ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｉ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｊ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｋ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｌ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｍ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｎ） ４６１Ａｓｐ
（配列番号１または配列番号３による）で、天然配列に対応する１つ以上の位置にアミノ酸改変を有する、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号１または配列番号３による３７６位のフェニルアラニンの改変を有し、好ましくは脂肪族アミノ酸で置換され、より好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換され、最も好ましくはアラニンでの置換でされる、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号１または配列番号３による以下のアミノ酸：
ａ）３８７Ｇｌｎ；
ｂ）３８８Ｍｅｔ；
ｂ）３８９Ｐｈｅ
の１つ以上の改変を有し、
それにより、該アミノ酸は欠失しているか、１つ以上のさらなるアミノ酸が挿入されているか、または好ましくは置換されている、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記トロンボモジュリン類似体が、その酸化型形態で使用され、好ましくは、クロラミンＴ、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された形態で使用される、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記ＴＭ類似体内の１つ以上のメチオニン残基、好ましくは、３８８位（配列番号１または配列番号３による）のメチオニン残基が酸化される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
線溶亢進を伴う凝固障害の処置に適したトロンボモジュリンの類似体をスクリーニングするための方法であって、該トロンボモジュリンが以下の特徴：
（ｉ）トロンビンに対する結合親和性の低下、
（ｉｉ）補因子活性の低下、
（ｉｉｉ）ＴＡＦＩ活性化活性の増大、
の１つ以上を示し、
ａ）該トロンボモジュリンの配列（配列番号１または配列番号３）に、好ましくは請求項１５に列挙したアミノ酸位置に、１つ以上のアミノ酸置換を作製する工程；
ｂ）該改変した類似体を対照分子と、好ましくは、ウサギ肺ＴＭまたは可溶性ヒトＴＭ類似体と、以下の特性：
ｂａ）トロンビンに対する結合親和性（ＫＤ値）；
ｂｂ）補因子活性；
ｂｃ）ＴＡＦＩ活性化活性もしくはＴＡＦＩａ産生能；
ｂｄ）ＴＡＦＩ活性化活性と補因子活性の比率；
ｂｅ）タンパク質酸化の効果；
ｂｆ）インビトロアッセイでのクロット溶解時間に対する効果；または
ｂｇ）凝固関連動物モデルにおける効果
の１つ以上に関して比較する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
治療有効量の請求項１〜２０のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を投与する工程を含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法。
【請求項１】
線溶亢進を伴う凝固障害の処置のための医薬の製造のためのトロンボモジュリン類似体の使用であって、該ＴＭ類似体が治療有効投薬量で抗フィブリン溶解効果を示すことを特徴とする、使用。
【請求項２】
前記トロンボモジュリン類似体が以下の特徴：
（ｉ）ウサギ肺トロンボモジュリンと比べて低下した、トロンビンに対する結合親和性、および／またはｋＤ値が０．２ｎＭより大きい、トロンビンに対する結合親和性；
および／または
（ｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌの補因子活性と比べて低下した補因子活性、
（ｉｉｉ）ＴＭ類似体ＴＭＥＭ３８８Ｌと比べて増大した補因子活性に対するＴＡＦＩ活性化活性の比率
の１つ以上を示す、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記線溶亢進を伴う凝固障害が、以下：血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、後天性フォン・ヴィレブランド病、第Ｘ因子欠損症、パラ血友病、凝固第Ｉ、ＩＩ、ＶもしくはＶＩＩ因子の遺伝性障害、循環抗凝血素による出血性障害または後天性凝固欠損症の疾患の群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記トロンボモジュリン類似体が、頭蓋内または他のＣＮＳの出血、関節、微小毛細血管、筋肉、胃腸管、呼吸路、腹膜後隙または軟部組織での出血からなる群より選択される出血事象の１つ以上を処置するために使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記トロンボモジュリン類似体が出血エピソードのときに投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記トロンボモジュリン類似体が、出血リスクが増大する前、例えば、手術または抜歯の前に投与される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記トロンボモジュリン類似体が、血液／血漿の輸血または凝固因子補充療法に対して抗療性の患者に投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記トロンボモジュリン類似体が、１週間未満から４週間までの合計期間にわたって、複数回用量で、好ましくは１日１回、２日に１回、または３日、４日、５日、６日もしくは７日おきに１回、より好ましくは長期投与として投与される、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記トロンボモジュリン類似体が非経口適用として、好ましくは静脈内または皮下適用として与えられる、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記 トロンボモジュリン類似体が可溶性ＴＭ類似体である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記トロンボモジュリン類似体がヒト可溶性ＴＭ類似体である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記トロンボモジュリン類似体が、ＥＧＦ３、ＥＧＦ４、ＥＧＦ５、ＥＧＦ６を含み、好ましくは断片ＥＧＦ３〜ＥＧＦ６を含み、より好ましくはＥＧＦドメイン１〜６を含む群から選択される、少なくとも１つの構造ドメインを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記トロンボモジュリン類似体が、ＥＧＦドメインＥＧＦ１〜ＥＧＦ６からなる、より好ましくは、ＥＧＦドメインＥＧＦ３〜ＥＧＦ６からなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記トロンボモジュリン類似体が、成熟トロンボモジュリンのアミノ酸配列（配列番号１または配列番号３に示す）に対応するアミノ酸配列を有し、以下の改変：
ａ） アミノ酸１〜３の除去
ｂ） Ｍ３８８Ｌ
ｃ） Ｒ４５６Ｇ
ｄ） Ｈ４５７Ｑ
ｅ） Ｓ４７４Ａ、およびＰ４９０での終結
の１つ以上を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号２と少なくとも８５％、または少なくとも９０％もしくは９５％配列が同一の配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記トロンボモジュリン類似体が、以下：
ａａ） ３４９Ａｓｐ；
ｂｂ） ３５５Ａｓｎ；
ａｃ） ３５７Ｇｌｕ；
ａｄ） ３５８Ｔｙｒ；
ａｅ） ３５９Ｇｌｎ；
ａｆ） ３６１Ｇｌｎ；
ａｇ） ３６３Ｌｅｕ；
ａｈ） ３６４Ａｓｎ；
ａｉ） ３６８Ｔｙｒ；
ａｊ） ３７１Ｖａｌ；
ａｋ） ３７４Ｇｌｕ；
ａｌ） ３７６Ｐｈｅ；
ａｍ） ３８４Ｈｉｓ；
ａｎ） ３８５Ａｒｇ；
ｂａ） ３８７Ｇｌｎ；
ｂｂ） ３８９Ｐｈｅ；
ｂｃ） ３９８Ａｓｐ；
ｂｄ） ４００Ａｓｐ；
ｂｅ） ４０２Ａｓｎ；
ｂｆ） ４０３Ｔｈｒ；
ｂｇ） ４０８Ｇｌｕ；
ｂｈ） ４１１Ｇｌｕ；
ｂｉ） ４１３Ｔｙｒ；
ｂｊ） ４１４Ｉｌｅ；
ｂｋ） ４１５Ｌｅｕ；
ｂｌ） ４１６Ａｓｐ；
ｂｍ） ４１７Ａｓｐ；
ｂｎ） ４２０Ｉｌｅ；
ｂｏ） ４２３Ａｓｐ；
ｂｐ） ４２４Ｉｌｅ；
ｂｑ） ４２５Ａｓｐ；
ｂｒ） ４２６Ｇｌｕ；
ｃａ） ４２８Ｇｌｕ；
ｃｂ） ４２９Ａｓｐ；
ｃｃ） ４３２Ｐｈｅ；
ｃｄ） ４３４Ｓｅｒ；
ｃｅ） ４３６Ｖａｌ；
ｃｆ） ４３８Ｈｉｓ；
ｃｇ） ４３９Ａｓｐ；
ｃｈ） ４４０Ｌｅｕ；
ｃｉ） ４４３Ｔｈｒ；
ｃｊ） ４４４Ｐｈｅ；
ｃｋ） ４４５Ｇｌｕ；
ｃｌ） ４５６Ａｒｇ；
ｃｍ） ４５８Ｉｌｅ；または
ｃｎ） ４６１Ａｓｐ
（配列番号１または配列番号３による）で、天然配列に対応する１つ以上の位置にアミノ酸改変を有する、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号１または配列番号３による３７６位のフェニルアラニンの改変を有し、好ましくは脂肪族アミノ酸で置換され、より好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換され、最も好ましくはアラニンでの置換でされる、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記トロンボモジュリン類似体が、配列番号１または配列番号３による以下のアミノ酸：
ａ）３８７Ｇｌｎ；
ｂ）３８８Ｍｅｔ；
ｂ）３８９Ｐｈｅ
の１つ以上の改変を有し、
それにより、該アミノ酸は欠失しているか、１つ以上のさらなるアミノ酸が挿入されているか、または好ましくは置換されている、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記トロンボモジュリン類似体が、その酸化型形態で使用され、好ましくは、クロラミンＴ、過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された形態で使用される、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記ＴＭ類似体内の１つ以上のメチオニン残基、好ましくは、３８８位（配列番号１または配列番号３による）のメチオニン残基が酸化される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
線溶亢進を伴う凝固障害の処置に適したトロンボモジュリンの類似体をスクリーニングするための方法であって、該トロンボモジュリンが以下の特徴：
（ｉ）トロンビンに対する結合親和性の低下、
（ｉｉ）補因子活性の低下、
（ｉｉｉ）ＴＡＦＩ活性化活性の増大、
の１つ以上を示し、
ａ）該トロンボモジュリンの配列（配列番号１または配列番号３）に、好ましくは請求項１５に列挙したアミノ酸位置に、１つ以上のアミノ酸置換を作製する工程；
ｂ）該改変した類似体を対照分子と、好ましくは、ウサギ肺ＴＭまたは可溶性ヒトＴＭ類似体と、以下の特性：
ｂａ）トロンビンに対する結合親和性（ＫＤ値）；
ｂｂ）補因子活性；
ｂｃ）ＴＡＦＩ活性化活性もしくはＴＡＦＩａ産生能；
ｂｄ）ＴＡＦＩ活性化活性と補因子活性の比率；
ｂｅ）タンパク質酸化の効果；
ｂｆ）インビトロアッセイでのクロット溶解時間に対する効果；または
ｂｇ）凝固関連動物モデルにおける効果
の１つ以上に関して比較する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
治療有効量の請求項１〜２０のいずれかに記載のトロンボモジュリン類似体を投与する工程を含む、線溶亢進を伴う凝固障害の処置方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【公表番号】特表２０１２−５２９４４５（Ｐ２０１２−５２９４４５Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１４３５４（Ｐ２０１２−５１４３５４）
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００４２１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４２３０９
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５０５０８１１９１）パイオン ドイチュラント ゲーエムベーハー (11)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＩＯＮ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｍａｒｔｉｎｓｔｒａｓｓｅ １０−１２， ５２０６２ Ａａｃｈｅｎ， Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００４２１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４２３０９
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５０５０８１１９１）パイオン ドイチュラント ゲーエムベーハー (11)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＩＯＮ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｍａｒｔｉｎｓｔｒａｓｓｅ １０−１２， ５２０６２ Ａａｃｈｅｎ， Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ
【Ｆターム（参考）】
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