美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤
【課題】安全性の高い天然抽出物を有効成分とする美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を提供する。
【解決手段】本発明の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤に、琥珀熱水抽出物を含有せしめる。
【解決手段】本発明の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤に、琥珀熱水抽出物を含有せしめる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚においてメラニンは、紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）、シミ、ソバカス等を予防、治療又は改善するためには、メラニンの産生を抑制することが考えられる。
【０００３】
このような観点から、従来、メラニン産生抑制作用を有するものとして、例えば、トウゴマ根部からの抽出物（特許文献１参照）、サウスウレア（Saussurea）属に属する植物からの抽出物（特許文献２参照）等が知られている。
【０００４】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。細胞内におけるグルタチオンは、ラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、各種酵素のＳＨ供与体としての機能を果たすものであり、抗酸化成分としても知られている。その作用発現は、システイン残基に由来すると考えられている。しかしながら、皮膚中のグルタチオン量は、加齢により低下することが報告されており、このことが皮膚における酸化防御能を低下させ、細胞のＤＮＡ及びタンパク質等の構成成分にダメージを与える一因であると考えられている。
【０００５】
すなわち、皮膚においてグルタチオンの産生を促進することは、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する障害を抑制することにつながり、皮膚の老化の予防・治療、又はシミ等の色素沈着に対する改善が期待できると考えられる。このような考えに基づき、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、ビルベリー抽出物及びウォルナット抽出物（特許文献３参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献４参照）等が知られている。
【０００６】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００７】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献２参照）。角質層におけるアミノ酸量が低下し、角質層の水分量が低下すると、角質層が硬くなってしまい、角質層に亀裂を生じさせ、皮膚のしわ等の原因となることが知られている。
【０００８】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンの産生促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができ、皮膚のしわ等を防止し得ると期待されている。
【０００９】
このようなプロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用を有するものとしては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献５参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献６参照）等が知られており、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進作用を有するものとしては、例えば、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献７参照）等が知られている。
【００１０】
毛髪の成長は、成長期、退行期、休止期からなる周期的なヘアサイクル（毛周期）に従って成長及び脱落を繰り返している。このヘアサイクルのうち、休止期から成長期へかけての新たな毛包が形成されるステージが、発毛に最も重要であると考えられており、このステージにおける毛包上皮系細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしているのが、毛乳頭細胞であると考えられている。毛乳頭細胞は、毛根近傍にある外毛根鞘細胞とマトリックス細胞とからなる毛包上皮系細胞の内側にあって、基底膜に包まれている毛根の根幹部分に位置する細胞であり、毛包上皮系細胞へ働きかけてその増殖を促す等、毛髪への分化に重要な役割を担っている（非特許文献３参照）。
【００１１】
このように、毛乳頭細胞は、毛包上皮系細胞の増殖・分化及び毛髪の形成において最も重要な役割を果たしており、従来、毛乳頭細胞に対象物質を接触させて、その細胞の増殖活性の有無及び／又は強弱を特定することで、その対象物質の育毛効果を検定する方法が提案されている（特許文献８参照）。また、従来、毛乳頭細胞増殖促進作用を有する生薬としては、例えば、ハトムギ抽出物、ワイルドタイム抽出物、スギナ抽出物、ショウブ抽出物、ローズマリー抽出物、ウコン抽出物、シラカバ抽出物及びコウチャ抽出物等が提案されている（特許文献９参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００１−２１３７５７号公報
【特許文献２】特開２００２−２０１１２２号公報
【特許文献３】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献４】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献５】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献６】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２６１５６８号公報
【特許文献８】特開平１０−２２９９７８号公報
【特許文献９】特開２００６−２１９４０７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献２】「Arch. Dermatol. Res.」，1996年，Vol.288，p.442-446
【非特許文献３】「Trends Genet」，1992年，第8巻，p.56-61
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、安全性の高い天然抽出物を有効成分とする美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の美白剤においては、前記琥珀熱水抽出物が、メラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を有するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、天然物である琥珀熱水抽出物を有効成分として含有し、安全性の高い美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】琥珀熱水抽出物について液体クロマトグラフィーを用いて分析した分析結果を示すクロマトグラムである。
【図２】コハク酸について液体クロマトグラフィーを用いて分析した分析結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、琥珀熱水抽出物を有効成分として含有する。
【００２０】
ここで、本実施形態において「抽出物」には、琥珀を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２１】
本実施形態において使用する抽出原料は、琥珀である。琥珀とは、木の樹脂（主にマツ、スギ、ヒノキ等の松柏科に属する植物の樹脂）が地中に埋没し、長い年月を経て固化したものである。上記樹脂には多量のジテルペン類が含有されていることが知られているが、当該ジテルペン類の大部分は難溶性の重合体である。琥珀は、通常、不規則な粒状、塊状、鍾乳状又は散粒状をなしており、内部に植物や昆虫の化石が混入されているものもある。色は、黄色、黄褐色又は赤黄色で、透明又は半透明であり、条痕は白色か淡黄色で松ヤニ状の光沢を有する。また、断面は、貝殻状をなしている。琥珀は、従来、その美しさから装飾品（宝石）として用いられる。硬度は２〜２．５、比重は１．０５〜１．０９である。琥珀は、粘土層、砂層、炭層又は堆積岩の中から産出され、バルト海沿岸、ドミニカ共和国、岩手県久慈地方等を産地とするものであり、これらの地域から容易に入手することができる。
【００２２】
琥珀熱水抽出物は、抽出原料としての琥珀をそのまま又は粉砕し、抽出溶媒としての熱水による抽出に供することにより得ることができる。また、琥珀は、ヘキサン等の非極性溶媒による洗浄等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが挙げられる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２４】
熱水抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を熱水に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜２５倍量（質量比）の抽出溶媒である水に抽出原料を浸漬させ、通常４０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃の温度条件下で加熱して可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２５】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでも美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２６】
琥珀熱水抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料、頭髪化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２７】
上記のようにして得られる琥珀熱水抽出物は、美白作用、抗老化作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用、育毛作用又は毛乳頭細胞増殖促進作用を有しているため、それぞれの作用を利用して美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の有効成分として用いることができる。なお、琥珀に含まれる主要成分として、コハク酸が知られており、当該コハク酸が美白作用を有することが知られているが、上記琥珀熱水抽出物は、下記の実施例に示すように、実質的にコハク酸を含有していないため、琥珀熱水抽出物の有する美白作用（メラニン産生抑制作用、グルタチオン産生促進作用）、抗老化作用（プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用）、育毛作用（毛乳頭細胞増殖促進作用）等は、コハク酸により発揮されるものではないと推察される。
【００２８】
琥珀熱水抽出物が有する美白作用は、例えば、メラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用に基づいて発揮される。ただし、琥珀熱水抽出物が有する美白作用は、これらの作用に基づいて発揮される美白作用に限定されるものではない。
【００２９】
琥珀熱水抽出物が有する抗老化作用は、例えば、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用に基づいて発揮される。ただし、琥珀熱水抽出物が有する抗老化作用は、この作用に基づいて発揮される抗老化作用に限定されるものではない。
【００３０】
琥珀熱水抽出物が有する育毛作用は、例えば、毛乳頭細胞増殖促進作用に基づいて発揮される。ただし、琥珀熱水抽出物が有する育毛作用は、これらの作用に基づいて発揮される育毛作用に限定されるものではない。
【００３１】
なお、琥珀熱水抽出物は、メラニン産生抑制作用又はグルタチオン産生促進作用を有するため、それらの作用を利用して、メラニン産生抑制剤又はグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用してもよい。
【００３２】
本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、琥珀熱水抽出物のみからなるものであってもよいし、琥珀熱水抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００３３】
琥珀熱水抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、琥珀熱水抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料、頭髪化粧料等）に配合して使用することができる。
【００３４】
なお、本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、必要に応じて、美白作用、抗老化作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用、育毛作用又は毛乳頭細胞増殖促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として用いることができる。
【００３５】
本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３６】
また、本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３７】
本実施形態の美白剤は、琥珀熱水抽出物が有するメラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を通じて、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等の色素沈着を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の美白剤は、これらの用途以外にもメラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３８】
本実施形態の抗老化剤又はプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤は、琥珀熱水抽出物が有するプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を通じて、皮膚の老化症状等を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の抗老化剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３９】
本実施形態の育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進作用は、琥珀熱水抽出物が有する毛乳頭細胞増殖促進作用を通じて、脱毛症を予防、治療又は改善することができる。ただし、本実施形態の育毛剤は、これらの用途以外にも毛乳頭細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４０】
なお、本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４１】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４２】
〔製造例１〕琥珀熱水抽出物の製造
琥珀の粉砕物５０ｇを９０℃の熱水１０００ｍＬ中に加え、２時間抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理をした。得られた抽出液を合わせて減圧下で濃縮し、さらに乾燥して琥珀熱水抽出物０．０００５ｇを得た（試料１）。
【００４３】
上記のようにして得られた琥珀熱水抽出物（試料１）及びコハク酸（和光純薬社製）について、下記の条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した。琥珀熱水抽出物についての分析結果を図１に、コハク酸についての分析結果を図２に示す。
【００４４】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：Agilent 1100（Agilent Technologies社製）
固定相：Wakosil-II 5C18 HG（和光純薬工業社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：１５０ｍｍ
移動相：８５％リン酸バッファー
移動相流速：１．０ｍＬ／分
検出器：ＵＶ
検出波長：２１０ｎｍ
【００４５】
図２に示すように、上記条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した場合、コハク酸のリテンションタイムは３．０４４ｍｉｎであったが、琥珀熱水抽出物（試料１）において当該リテンションタイムにピークが見られなかった。この結果から、琥珀熱水抽出物（試料１）には、コハク酸が実質的に含有されていないことが確認された。
【００４６】
〔試験例１〕Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を試験した。
【００４７】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで２５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。
【００４８】
培養終了後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭに試料を溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各ｗｅｌｌに３００μＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を取り除き、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕機により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定してメラニン産生量とした。
【００４９】
また、単位細胞あたりのメラニン産生抑制作用を評価するために、上記と同様にして培養した後、４００μＬのＰＢＳ（−）で洗浄して、培養液を除去し、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したニュートラルレッドを各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２．５時間培養した。培養後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９）を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５０】
さらに、空試験として、試料を添加せずに上記と同様にして培養した細胞について、波長４７５ｎｍにおける吸光度及び５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果から、下記式により単位細胞あたりのメラニン産生抑制率（％）を算出した。
【００５１】
メラニン産生抑制率(％)＝{１−(Ｂ／Ｄ)／(Ａ／Ｃ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料無添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）はメラニン産生抑制作用を有することが確認された。
【００５４】
〔試験例２〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにしてグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００５５】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００５６】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００５７】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式によりグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００５８】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表２に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）は優れたグルタチオン産生促進作用を有することが確認された。
【００６１】
〔試験例３〕プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を試験した。
【００６２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００６３】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度は下記表３を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００６４】
この総ＲＮＡを鋳型とし、プロフィラグリン及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。プロフィラグリンのｍＲＮＡの発現量は、試料無添加及び試料添加のそれぞれで培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに試料無添加の補正値を１００とした時の試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進率（％）を算出した。
【００６５】
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇抑制率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表３に示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
表３に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）は優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を有することが確認された。
【００６８】
〔試験例４〕毛乳頭細胞増殖促進作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにして毛乳頭細胞増殖促進作用を試験した。
【００６９】
正常ヒト頭髪毛乳頭細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び増殖添加剤を含有する毛乳頭細胞増殖培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり１００μＬずつ播種し、３日間培養した。培養後、培地を抜き、試料を無血清ＤＭＥＭに溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加し、さらに４日間培養した。
【００７０】
毛乳頭細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を除き、無血清ＤＭＥＭに溶解したＭＴＴ（終濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）を、各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。なお、コントロールとして、試料溶液の代わりに無血清ＤＭＥＭを添加した場合についても同様の測定を行った。得られた結果から、下記式により毛乳頭細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７１】
毛乳頭細胞増殖促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
なお、式中、Ａは「試料添加時の吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加時の吸光度」を表す。
結果を表４に示す。
【００７２】
【表４】
【００７３】
表４に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）は優れた毛乳頭細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の美白剤は、皮膚の色素沈着等の予防・改善に、本発明の抗老化剤及びプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤は、皮膚の老化の予防・改善に、本発明の育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤は、脱毛症の予防・改善に大きく貢献することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚においてメラニンは、紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）、シミ、ソバカス等を予防、治療又は改善するためには、メラニンの産生を抑制することが考えられる。
【０００３】
このような観点から、従来、メラニン産生抑制作用を有するものとして、例えば、トウゴマ根部からの抽出物（特許文献１参照）、サウスウレア（Saussurea）属に属する植物からの抽出物（特許文献２参照）等が知られている。
【０００４】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。細胞内におけるグルタチオンは、ラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、各種酵素のＳＨ供与体としての機能を果たすものであり、抗酸化成分としても知られている。その作用発現は、システイン残基に由来すると考えられている。しかしながら、皮膚中のグルタチオン量は、加齢により低下することが報告されており、このことが皮膚における酸化防御能を低下させ、細胞のＤＮＡ及びタンパク質等の構成成分にダメージを与える一因であると考えられている。
【０００５】
すなわち、皮膚においてグルタチオンの産生を促進することは、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する障害を抑制することにつながり、皮膚の老化の予防・治療、又はシミ等の色素沈着に対する改善が期待できると考えられる。このような考えに基づき、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、ビルベリー抽出物及びウォルナット抽出物（特許文献３参照）、クチナシ属植物の抽出物（特許文献４参照）等が知られている。
【０００６】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００７】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献２参照）。角質層におけるアミノ酸量が低下し、角質層の水分量が低下すると、角質層が硬くなってしまい、角質層に亀裂を生じさせ、皮膚のしわ等の原因となることが知られている。
【０００８】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンの産生促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができ、皮膚のしわ等を防止し得ると期待されている。
【０００９】
このようなプロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用を有するものとしては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献５参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献６参照）等が知られており、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進作用を有するものとしては、例えば、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献７参照）等が知られている。
【００１０】
毛髪の成長は、成長期、退行期、休止期からなる周期的なヘアサイクル（毛周期）に従って成長及び脱落を繰り返している。このヘアサイクルのうち、休止期から成長期へかけての新たな毛包が形成されるステージが、発毛に最も重要であると考えられており、このステージにおける毛包上皮系細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしているのが、毛乳頭細胞であると考えられている。毛乳頭細胞は、毛根近傍にある外毛根鞘細胞とマトリックス細胞とからなる毛包上皮系細胞の内側にあって、基底膜に包まれている毛根の根幹部分に位置する細胞であり、毛包上皮系細胞へ働きかけてその増殖を促す等、毛髪への分化に重要な役割を担っている（非特許文献３参照）。
【００１１】
このように、毛乳頭細胞は、毛包上皮系細胞の増殖・分化及び毛髪の形成において最も重要な役割を果たしており、従来、毛乳頭細胞に対象物質を接触させて、その細胞の増殖活性の有無及び／又は強弱を特定することで、その対象物質の育毛効果を検定する方法が提案されている（特許文献８参照）。また、従来、毛乳頭細胞増殖促進作用を有する生薬としては、例えば、ハトムギ抽出物、ワイルドタイム抽出物、スギナ抽出物、ショウブ抽出物、ローズマリー抽出物、ウコン抽出物、シラカバ抽出物及びコウチャ抽出物等が提案されている（特許文献９参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００１−２１３７５７号公報
【特許文献２】特開２００２−２０１１２２号公報
【特許文献３】特開２００６−２４１０６２号公報
【特許文献４】特開２００６−３４７９３４号公報
【特許文献５】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献６】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２６１５６８号公報
【特許文献８】特開平１０−２２９９７８号公報
【特許文献９】特開２００６−２１９４０７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献２】「Arch. Dermatol. Res.」，1996年，Vol.288，p.442-446
【非特許文献３】「Trends Genet」，1992年，第8巻，p.56-61
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、安全性の高い天然抽出物を有効成分とする美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の美白剤においては、前記琥珀熱水抽出物が、メラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を有するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、天然物である琥珀熱水抽出物を有効成分として含有し、安全性の高い美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】琥珀熱水抽出物について液体クロマトグラフィーを用いて分析した分析結果を示すクロマトグラムである。
【図２】コハク酸について液体クロマトグラフィーを用いて分析した分析結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、琥珀熱水抽出物を有効成分として含有する。
【００２０】
ここで、本実施形態において「抽出物」には、琥珀を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２１】
本実施形態において使用する抽出原料は、琥珀である。琥珀とは、木の樹脂（主にマツ、スギ、ヒノキ等の松柏科に属する植物の樹脂）が地中に埋没し、長い年月を経て固化したものである。上記樹脂には多量のジテルペン類が含有されていることが知られているが、当該ジテルペン類の大部分は難溶性の重合体である。琥珀は、通常、不規則な粒状、塊状、鍾乳状又は散粒状をなしており、内部に植物や昆虫の化石が混入されているものもある。色は、黄色、黄褐色又は赤黄色で、透明又は半透明であり、条痕は白色か淡黄色で松ヤニ状の光沢を有する。また、断面は、貝殻状をなしている。琥珀は、従来、その美しさから装飾品（宝石）として用いられる。硬度は２〜２．５、比重は１．０５〜１．０９である。琥珀は、粘土層、砂層、炭層又は堆積岩の中から産出され、バルト海沿岸、ドミニカ共和国、岩手県久慈地方等を産地とするものであり、これらの地域から容易に入手することができる。
【００２２】
琥珀熱水抽出物は、抽出原料としての琥珀をそのまま又は粉砕し、抽出溶媒としての熱水による抽出に供することにより得ることができる。また、琥珀は、ヘキサン等の非極性溶媒による洗浄等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが挙げられる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２４】
熱水抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を熱水に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜２５倍量（質量比）の抽出溶媒である水に抽出原料を浸漬させ、通常４０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃の温度条件下で加熱して可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２５】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでも美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２６】
琥珀熱水抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料、頭髪化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２７】
上記のようにして得られる琥珀熱水抽出物は、美白作用、抗老化作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用、育毛作用又は毛乳頭細胞増殖促進作用を有しているため、それぞれの作用を利用して美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の有効成分として用いることができる。なお、琥珀に含まれる主要成分として、コハク酸が知られており、当該コハク酸が美白作用を有することが知られているが、上記琥珀熱水抽出物は、下記の実施例に示すように、実質的にコハク酸を含有していないため、琥珀熱水抽出物の有する美白作用（メラニン産生抑制作用、グルタチオン産生促進作用）、抗老化作用（プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用）、育毛作用（毛乳頭細胞増殖促進作用）等は、コハク酸により発揮されるものではないと推察される。
【００２８】
琥珀熱水抽出物が有する美白作用は、例えば、メラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用に基づいて発揮される。ただし、琥珀熱水抽出物が有する美白作用は、これらの作用に基づいて発揮される美白作用に限定されるものではない。
【００２９】
琥珀熱水抽出物が有する抗老化作用は、例えば、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用に基づいて発揮される。ただし、琥珀熱水抽出物が有する抗老化作用は、この作用に基づいて発揮される抗老化作用に限定されるものではない。
【００３０】
琥珀熱水抽出物が有する育毛作用は、例えば、毛乳頭細胞増殖促進作用に基づいて発揮される。ただし、琥珀熱水抽出物が有する育毛作用は、これらの作用に基づいて発揮される育毛作用に限定されるものではない。
【００３１】
なお、琥珀熱水抽出物は、メラニン産生抑制作用又はグルタチオン産生促進作用を有するため、それらの作用を利用して、メラニン産生抑制剤又はグルタチオン産生促進剤の有効成分として使用してもよい。
【００３２】
本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、琥珀熱水抽出物のみからなるものであってもよいし、琥珀熱水抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００３３】
琥珀熱水抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、琥珀熱水抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料、頭髪化粧料等）に配合して使用することができる。
【００３４】
なお、本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、必要に応じて、美白作用、抗老化作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用、育毛作用又は毛乳頭細胞増殖促進作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として用いることができる。
【００３５】
本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３６】
また、本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３７】
本実施形態の美白剤は、琥珀熱水抽出物が有するメラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を通じて、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等の色素沈着を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の美白剤は、これらの用途以外にもメラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３８】
本実施形態の抗老化剤又はプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤は、琥珀熱水抽出物が有するプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を通じて、皮膚の老化症状等を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の抗老化剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３９】
本実施形態の育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進作用は、琥珀熱水抽出物が有する毛乳頭細胞増殖促進作用を通じて、脱毛症を予防、治療又は改善することができる。ただし、本実施形態の育毛剤は、これらの用途以外にも毛乳頭細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４０】
なお、本実施形態の美白剤、抗老化剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤、育毛剤又は毛乳頭細胞増殖促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４１】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４２】
〔製造例１〕琥珀熱水抽出物の製造
琥珀の粉砕物５０ｇを９０℃の熱水１０００ｍＬ中に加え、２時間抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理をした。得られた抽出液を合わせて減圧下で濃縮し、さらに乾燥して琥珀熱水抽出物０．０００５ｇを得た（試料１）。
【００４３】
上記のようにして得られた琥珀熱水抽出物（試料１）及びコハク酸（和光純薬社製）について、下記の条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した。琥珀熱水抽出物についての分析結果を図１に、コハク酸についての分析結果を図２に示す。
【００４４】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：Agilent 1100（Agilent Technologies社製）
固定相：Wakosil-II 5C18 HG（和光純薬工業社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：１５０ｍｍ
移動相：８５％リン酸バッファー
移動相流速：１．０ｍＬ／分
検出器：ＵＶ
検出波長：２１０ｎｍ
【００４５】
図２に示すように、上記条件にて液体クロマトグラフィーを用いて分析した場合、コハク酸のリテンションタイムは３．０４４ｍｉｎであったが、琥珀熱水抽出物（試料１）において当該リテンションタイムにピークが見られなかった。この結果から、琥珀熱水抽出物（試料１）には、コハク酸が実質的に含有されていないことが確認された。
【００４６】
〔試験例１〕Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を試験した。
【００４７】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで２５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。
【００４８】
培養終了後、１０％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭに試料を溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各ｗｅｌｌに３００μＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を取り除き、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕機により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定してメラニン産生量とした。
【００４９】
また、単位細胞あたりのメラニン産生抑制作用を評価するために、上記と同様にして培養した後、４００μＬのＰＢＳ（−）で洗浄して、培養液を除去し、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したニュートラルレッドを各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２．５時間培養した。培養後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９）を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５０】
さらに、空試験として、試料を添加せずに上記と同様にして培養した細胞について、波長４７５ｎｍにおける吸光度及び５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果から、下記式により単位細胞あたりのメラニン産生抑制率（％）を算出した。
【００５１】
メラニン産生抑制率(％)＝{１−(Ｂ／Ｄ)／(Ａ／Ｃ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料添加時の４７５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料無添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料添加時の５４０ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表１に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）はメラニン産生抑制作用を有することが確認された。
【００５４】
〔試験例２〕Ｂ１６メラノーマ細胞におけるグルタチオン産生促進作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにしてグルタチオン産生促進作用を試験した。
【００５５】
Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００５６】
培養後、１％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地で溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ(−)にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用して細胞を溶解した。
【００５７】
このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨ２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式によりグルタチオン産生促進率（％）を算出した。
【００５８】
グルタチオン産生促進率(％)＝Ｂ／Ａ×１００
式中、Ａは「試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）」を表し、Ｂは「試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量」を表す。
結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
表２に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）は優れたグルタチオン産生促進作用を有することが確認された。
【００６１】
〔試験例３〕プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を試験した。
【００６２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００６３】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えてＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ２）を行い、その後EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試験試料（試料１，試料濃度は下記表３を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００６４】
この総ＲＮＡを鋳型とし、プロフィラグリン及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。プロフィラグリンのｍＲＮＡの発現量は、試料無添加及び試料添加のそれぞれで培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに試料無添加の補正値を１００とした時の試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進率（％）を算出した。
【００６５】
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇抑制率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表３に示す。
【００６６】
【表３】
【００６７】
表３に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）は優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進作用を有することが確認された。
【００６８】
〔試験例４〕毛乳頭細胞増殖促進作用試験
製造例１により得られた琥珀熱水抽出物（試料１）について、以下のようにして毛乳頭細胞増殖促進作用を試験した。
【００６９】
正常ヒト頭髪毛乳頭細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び増殖添加剤を含有する毛乳頭細胞増殖培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に希釈した後、コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり１００μＬずつ播種し、３日間培養した。培養後、培地を抜き、試料を無血清ＤＭＥＭに溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加し、さらに４日間培養した。
【００７０】
毛乳頭細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を除き、無血清ＤＭＥＭに溶解したＭＴＴ（終濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）を、各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。なお、コントロールとして、試料溶液の代わりに無血清ＤＭＥＭを添加した場合についても同様の測定を行った。得られた結果から、下記式により毛乳頭細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７１】
毛乳頭細胞増殖促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
なお、式中、Ａは「試料添加時の吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加時の吸光度」を表す。
結果を表４に示す。
【００７２】
【表４】
【００７３】
表４に示すように、琥珀熱水抽出物（試料１）は優れた毛乳頭細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の美白剤は、皮膚の色素沈着等の予防・改善に、本発明の抗老化剤及びプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤は、皮膚の老化の予防・改善に、本発明の育毛剤及び毛乳頭細胞増殖促進剤は、脱毛症の予防・改善に大きく貢献することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
【請求項２】
前記琥珀熱水抽出物が、メラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を有することを特徴とする請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項４】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤。
【請求項５】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする育毛剤。
【請求項６】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする毛乳頭細胞増殖促進剤。
【請求項１】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
【請求項２】
前記琥珀熱水抽出物が、メラニン産生抑制作用及び／又はグルタチオン産生促進作用を有することを特徴とする請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項４】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進剤。
【請求項５】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする育毛剤。
【請求項６】
琥珀熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とする毛乳頭細胞増殖促進剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２３５５５１（Ｐ２０１０−２３５５５１Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８７６３４（Ｐ２００９−８７６３４）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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