耐酸性が増大した乳酸菌の方法及び使用
本発明は、より良好な耐酸性の能力を有するように改変された乳酸菌の特定のプラスミドキュアリング菌株、かかる菌株の改変法、及びかかる菌株を含有する製品を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
１９０８年、ロシアの生物学者Ｅｌｉ Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆは、特定のブルガリア及びロシア国民の長寿を、大量の発酵乳製品の消費に原因があると考えた。これらの食品中の鍵となる生物は、後に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）という乳酸産生菌であると確認された。乳酸産生菌は、その乳酸を産生する能力に対してそのように名付けられている。しかし、乳酸産生は、この細菌群から得られる多くの利点の１つにすぎない。
【０００２】
Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆらの研究に基づいて、科学者は、動物の健康と性能の向上のために生きた乳酸産生菌及び酵母を動物に直接与えるプロバイオティック微生物の構想を生み出した。観察される利点は、１）消化管中での付着部位についての競合、２）必須栄養素についての競合、３）抗菌物質の産生、４）有益な細菌の増殖の増大、及び、５）免疫系の刺激から生じ得る。
【０００３】
一部の病原菌は、小腸の内膜を破壊することによって動物の栄養吸収能を低下させる。乳酸産生菌は、小腸に付着し、病原菌の腸壁への結合を防止する物質を産生する、と複数の研究が指摘している。さらに、有益な細菌の付着は、小腸の吸収表面積を拡大し、動物による栄養吸収増加のために酵素活性を増強することができる。
【０００４】
細菌は、健康を増進するものも、疾患を引き起こすものも、増殖に特定の栄養素を必要とする。乳酸産生菌は、ビタミン、アミノ酸、又は、他で有害菌の増殖を支持する可能性のある他の栄養素を活用することができる。
【０００５】
多数の研究が、直接摂食される微生物培養物の、疾患を引き起こす生物を抑制する能力に焦点を当てている。乳酸及びギ酸は、腸内ｐＨを低下させ、有害な生物に適さない環境を創り出す。乳酸産生菌は、過酸化水素も分泌し、酸素を要求する微生物に好ましくない条件を生じる。
【０００６】
２種類の抗菌物質群が同定されている。即ち、低分子量抗菌物質、例えばラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）によって産生されるロイテリン、及びバクテリオシンである。バクテリオシンは、しばしば遺伝的に関連のある細菌の増殖を抑制する細菌産生物質である。バクテリオシンは、ポリペプチドで、その抑制作用は、プロテアーゼによって破壊されるが、一方広範囲抗菌物質であるロイテリンは、ポリペプチドではなく、その抗菌活性は、プロテアーゼの影響を受けない。
【０００７】
ラクトバチルス・ロイテリを含めた様々なラクトバチルス種の菌株が、プロバイオティック製剤に使用されている。ラクトバチルス・ロイテリは、動物の消化管の天然の常在菌の１種で、通例、ヒトを含めた健康な動物の腸内に認められる。当該細菌は、抗菌活性を有することが既知である。例えば、米国特許第５，４３９，６７８号、第５，４５８，８７５号、第５，５３４，２５３号、第５，８３７，２３８号及び第５，８４９，２８９号を参照されたい。ラクトバチルス・ロイテリ細胞がグリセロール存在、嫌気条件下で増殖する場合、当該細胞は、β−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）として既知の抗菌物質を産生する。
【０００８】
乳酸産生菌の、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及びウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を抑制する能力が、研究によって実証されている。下痢を引き起こす生物の減少は、新生及び幼若動物において特に重要である。
【０００９】
ラクトバチルス菌株への遺伝子改変は通常、一般的食物病原菌に拮抗する化合物の産生、コレステロール代謝能又は酸若しくは胆汁認容能、及び、免疫応答増強能など、特定の菌株の特性の改善又は増強を標的とする（Ｋｕｌｌｅｎ，Ｍ．ＪとＴ．Ｒ．Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，１９９９，腸内ラクトバチルス及びビフィドバクテリアの遺伝子改変（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ａｎｄ ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ），ｐ．６５〜８３，Ｉｎ Ｇ．Ｔａｎｎｏｃｋ（編），Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）。これらの改変菌株は、理想的条件下で、宿主に有利であると思われる。しかし、自然条件下では、改変ラクトバチルス菌株の性能は、特に、操作にプラスミドが介在する場合、固有プラスミドに影響されることが多い。固有プラスミドと導入プラスミドの間の不適合性は、宿主内部のプラスミド不安定性に寄与する主たる要因の１つである（Ｐｏｓｎｏ，Ｍ．，Ｒ．Ｊ．Ｌｅｅｒ，Ｎ．ｖａｎ Ｌｕｉｊｋ，Ｍ．Ｊ．ｆ．ｖａｎ Ｇｉｅｚｅｎ，Ｐ．Ｔ．Ｈ．Ｍ．Ｂ．Ｃ．ＬｏｋｍａｎとＰ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ．１９９１，ラクトバチルスベクターの、小型潜在ラクトバチルスプラスミド由来レプリコンとの不適合性及び導入ベクターの分離不安定性（Ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｍａｌｌ ｃｒｙｐｔｉｃ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７，１８２２〜１８２８）。
【００１０】
大半のラクトバチルス菌株は、その入手源（植物、肉、貯蔵牧草、サワードー又は消化管）にかかわらず、少なくとも１つの、しばしばそれ以上の固有プラスミドを保有する（Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｈ．とＲ．Ｊ．Ｌｅｅｒ，１９９３，ラクトバチルスの遺伝学：プラスミドと遺伝子発現（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ：Ｐｌａｓｍｉｄ，ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）．Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ６４，８５〜１０７）。これらのプラスミドは、組換えプラスミドの安定性を妨げるだけでなく、望ましくない形質、例えば抗生物質耐性も保有する可能性があり（Ｐｏｓｎｏら，１９９１）、当該抗生物質耐性は、いずれかのかかる固有プラスミドを除去することが有利になり、或いは必要にさえなる場合がある。
【００１１】
多くの抗生物質及び抗菌物質は、本来、数百万年もの間自然界に存在し、ヒトは、抗生物質や抗菌物質を使って、細菌又は他の微生物の増殖を抑制し、ヒト、他の動物、及び、組織培養で細菌又は微生物感染症を治療してきた。しかし、抗生物質又は抗菌剤の使用は、投与若しくは適用されるこれらの抗生物質又は抗菌剤に耐性を示す細菌又は他の微生物に対して選択上の望ましくない影響を有する。結果として、治療法は、有害な影響を受け、又はある場合には無効になる可能性がある。
【００１２】
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０は、最近、リンコマイシンに耐性があり、また、耐性遺伝子ｌｎｕＡも含有することが報告された（Ｋａｓｔｎｅｒ，Ｓ．，Ｐｅｒｒｅｔｅｎ，Ｖ．，Ｂｌｅｕｌｅｒ，Ｈ．，Ｈｕｇｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｇ．，Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｃ．＆ Ｍｅｉｌｅ，Ｌ．２００６．食品に使用される開始培養物とプロバイオティック細菌の抗生物質感受性パターン及び耐性遺伝子（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｏｏｄ），Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９（２）：１４５−１５５）。この遺伝子について当該菌株のゲノムが探索され、プラスミドｐＬＲ５８５上のオープンリーディングフレームＩｒ２１０５として同定された。当該プラスミドは、多剤耐性タンパク質（Ｉｒ２０８９）及びポリケチド抗生物質エクスポーター（Ｉｒ２０９６及びＩｒ２０９７）をコードする遺伝子も保有する。当該プラスミドの遺伝子はいずれも、当該菌株の既知のプロバイオティック特性又は耐酸性について明白な関係も有さず、重要な関連性も有さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
特にプロバイオティック産業では、酸に耐性を示すラクトバチルスを使用し、それによって、各種調合のかかる培養物が胃の酸環境を通過し、十分な数を保って残りの腸管に到達するだけでなく、胃で増殖し、コロニー形成し、消化管全体でそのプロバイオティック作用を発揮することもできることが求められている。耐酸性が低い菌株が使用される場合、さらに多くの細菌数を摂取することが必要であり、これは、コスト増加を招く。さらに、各種手段によって、酸ｐＨからの培養物の保護に多大の努力が向けられており、これもコストを増加させる。そのため、酸に十分な耐性を示す菌株を有すること、その結果、既存菌株の耐酸性を改善する方法に、産業界で関心が持たれている。乳酸菌の耐酸性を改善する方法の一例は、米国特許出願第２００５０１５８，４２３ Ａ１に示されており、この場合、小型熱ショックタンパク質をコードするプラスミドを保持する菌株が使用され、かかるプラスミドを乳酸菌中に移す方法も示されている。しかし、これは、プラスミドを除去して菌株の耐酸性を増大させる本発明とは対照的である。
【００１４】
本発明の他の目的及び特徴は、以下の開示内容及び添付の特許請求の範囲からより詳細に明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
２種類のプラスミドｐＬＲ５８１及びｐＬＲ５８５をキュアリングすることによってラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０から誘導された菌株が得られている。この菌株は、親株よりもテトラサイクリン及びリンコマイシンに対する感受性がはるかに高い。当該二重キュアリング菌株は、ＤＳＭＺに寄託され、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８と指定された。ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８は、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０と同一のｒｅｐ−ＰＣＲ（反復ＰＣＲ）プロファイル、発酵パターン、ロイテリン産生、形態、増殖速度、粘液付着及び胆汁耐性を有する。しかし、当該キュアリング菌株は、より高密度に増殖し、酸性条件でさらに良好に生存する。当該菌株を共培養すると、ＤＳＭ１７９３８は、一層競合的にもなる。
【００１６】
よって、本明細書の発明は、新規菌株の特徴を使用し、より良好な耐酸性を示すように改変された乳酸菌の特定のプラスミドキュアリング菌株、かかる菌株の改変法、及びかかる菌株を含有する製品を提供する。本発明の他の目的及び特徴は、以下の開示内容及び添付の特許請求の範囲からより詳細に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８株（ブダペスト条約に従って、２００６年２月６日にＤＳＭＺ−ドイツ微生物系統保存施設（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託）は、２種類のプラスミドｐＬＲ５８１及びｐＬＲ５８５をキュアリングすることによってラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０から誘導される。当該菌株は、ＡＴＣＣ５５７３０と同一のｒｅｐ−ＰＣＲプロファイル、発酵パターン、ロイテリン産生、形態、増殖速度、粘液付着及び胆汁耐性を有するが、テトラサイクリン及びリンコマイシンへの感受性が親株よりもはるかに高い。驚くべきことに、Ｌ．ロイテリ ＤＳＭ１７９３８及びＤＳＭ１７６８６は、キュアリングによるプラスミド除去によって耐酸性の増加を引き起こすことが認められている。共培養実験では、さらに競合的で、酸性ｐＨでの生存率の改善によって説明できる。
【００１８】
本発明の一目的は、乳酸菌からプラスミドを除去し、耐酸性をさらに増大させ、それによって、腸管での生存率をさらに増大させ、その結果、ヒトの健康にさらに有益にすることである。これは、Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７６８６株と新規Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８株において立証されている。これは、耐酸性に関連するものをコードしない除去プラスミドから、酸により安定な新規菌株が得られるという、ラクトバチルスにおいて一般的な、これまで知られていなかった現象であると思われる。本明細書の発明では、この作用を使用し、ラクトバチルスの耐酸性を増大させている。
【００１９】
本発明の他の目的及び特徴は、以下の開示内容及び添付の特許請求の範囲からより詳細に明らかになる。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）
ＤＳＭ１７６８６からのｐＬＲ５８５のキュアリング
プロトプラスト形成及び再生によるプラスミドキュアリングは、基本的に、Ｖｅｓｃｏｖｏらの記述のとおりに実施した（Ｖｅｓｃｏｖｏ，Ｍ．，Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｃｏｃｃｏｎｃｅｌｌｉ，Ｐ．Ｓ．とＢｏｔｔａｚｚｉ，Ｖ．１９８４．ラクトバチルス・ロイテリにおけるプロトプラスト形成、再生及びプラスミドキュアリング（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｕｒｉｎｇ ｉｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２３：３３３〜３３４）。ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７６８６の一昼夜培養物を、１０ｍＬ ＭＲＳ培養液（Ｏｘｏｉｄ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）でＯＤ６００＝０．１まで希釈し、ＯＤ６００＝０．７〜０．８になるまで３７°Ｃで増殖させた。３０００ｘｇ、１０分間の遠心分離によって細胞を収集し、１０ｍｌのＮａｎｏｐｕｒｅ水で洗浄した。細胞は、遠心分離によって再度収集し、２ｍｌのプロトプラスト緩衝液（０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．５Ｍ スクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２；ｐＨ７．０）に再浮遊させた。当該細胞は、プロトプラスト緩衝液中、等量の１０ｍｇ／ｍｌリゾチームと混合し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。プロトプラストを３０００ｘｇ、１５分間の遠心分離によって採取し、２０ｍｌのプロトプラスト緩衝液で洗浄した。プロトプラストは、遠心分離によって再度採取し、１ｍｌのプロトプラスト緩衝液に再浮遊させ、その後、顕微鏡観察を実施した。
【００２１】
プロトプラスト緩衝液希釈物を、再生のため、０．５Ｍスクロース入りＭＲＳ寒天培地上に播いた。Ｎａｎｏｐｕｒｅ水希釈物は、ＭＲＳ寒天培地上に播き、残りの全細胞数を評価した。３７°Ｃ下一昼夜の嫌気的インキュベーション後、及び、再度、次の一昼夜のインキュベーションの後に、ｃｆｕ数を決定した。再生コロニーを取って、８μｇ／ｍｌリンコマイシン含有及び非含有ＭＲＳ寒天培地に播いた。リンコマイシンＭＲＳプレート上での非増殖によってプラスミドキュアリング候補を同定した。
【００２２】
結果
ｐＬＲ５８５のキュアリングの確認
ＤＳＭ１７９３８のプラスミドを、ＰＣＲで分析した（図１）。ｐＬＲ５８５、ｐＬＲ５８１は、ともに存在しなかったが、その他の２種類のプラスミドは、依然として認められた。よって、ＤＳＭ１７９３８は、ｔｅｔＷ−プラスミドｐＬＲ５８１及びｌｎｕＡ−プラスミドｐＬＲ５８５の両方からキュアリングされる。ＤＳＭ１７９３８中ｌｎｕＡの不存在も、ＰＣＲによって検出された（図２）。
【００２３】
（実施例２）
リンコマイシンの最小阻止濃度の決定
前記細菌を、ＭＲＳブイヨン培地中、３７°Ｃで１６時間増殖させた。１０５ｃｆｕ／ｍｌまで希釈した後、１μＬの各菌株を、リンコマイシン又はクリンダマイシン（濃度０、０．１２５、０．２５、０．５，１，２，４，８及び１６μｇ／ｍｌ）含有ＭＲＳプレート上にスポットした。当該液滴の吸着後、当該プレートは、嫌気的雰囲気中、３７°Ｃで２４時間インキュベートした。前記ＭＩＣは、細菌増殖が視覚的に認められない最低抗生物質濃度として定義した。製造会社の説明書に従って、ＭＲＳ寒天（Ｏｘｏｉｄ）プレート上で増殖する細菌について、Ｅｔｅｓｔ（ＡＢ Ｂｉｏｄｉｓｋ）でテトラサイクリンに対するＭＩＣを検討した。
【００２４】
結果
ｐＬＲ５８５のキュアリングは、リンコマイシン＞１６μｇ／ｍＬから０．２５μｇ／ｍｌへのＭＩＣ減少を生じ、これは、陰性対照ＤＳＭ２００１６のレベルに近いものであった。すでに非常に低いクリンダマイシンのＭＩＣ値は、変化しなかった。テトラサイクリンに対するＭＩＣも、Ｅ−ｔｅｓｔで検討し、ＤＳＭ１７９３８及びＤＳＭ１７６８６が１２〜１６μｇ／ｍｌ、ＡＴＣＣ５５７３０が＞２５６μｇ／ｍｌであると判明した。
表１
【表１】
【００２５】
（実施例３）
発酵パターン及びロイテリン産生
製造会社の説明書に従って、ａｐｉ５０ ＣＨＬ（ｂｉｏ−Ｍｅｒｉｅｕｘ）を使って発酵パターンを決定した。ロイテリン産生を検出するために、最初にＭＲＳプレート上で前記細菌を４８時間増殖させた（画線接種）。次いで、当該プレートに５００ｍＭグリセロール寒天（１％寒天）を重層し、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。５ｍＬの２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２Ｍ ＨＣｌ中０．１％）を添加してロイテリンを検出した。３分間のインキュベーション後、当該溶液を注ぎ、５ｍＬの５Ｍ ＫＯＨを添加した。コロニー周囲の赤色ゾーンは、ロイテリンが産生されたことを示す。
【００２６】
結果
ＤＳＭ１７９３８の発酵パターンを、ＡＰＩ５０ ＣＨＬを使ってＤＳＭ１７６８６及びＡＴＣＣ５５７３０と比較し、差を検出できなかった。全菌株が、Ｌ−アラビノース、リボース、ガラクトース、グルコース、マルトース、ラクトース、メリビオース、サッカロース、ラフィノース及びグルコネートを発酵させ、残りの試験では陰性であった。ロイテリンの産生も、３菌株は同一の規模であった。
【００２７】
（実施例４）
増殖及び共培養
増殖は、３７°Ｃに前加温した試験管中ＭＲＳブイヨンにＯＤ０．１になるまで一昼夜培養物をインキュベートすることによって検出した。当該試験管は、３７°Ｃでインキュベートし、ＯＤ６００ｎｍ測定用試料を８時間の間に入手した。各細菌を３回繰返しで分析した。当該細菌の共培養は、前加温ＭＲＳブイヨン試験管中でＡＴＣＣ５７３０、ＤＳＭ１７６８６及びＤＳＭ１７９３８の等量の一昼夜培養物を混合することによって実施した。当該混合物は、３７°Ｃで一昼夜インキュベートし、次いで、新規のＭＲＳ試験管に再接種した。この手順を３回繰り返した。開始時と各培養後に、培養物の各種希釈物をＭＲＳプレート上に播き、次いで、コロニーを取って、１枚が抗生物質なし、１枚が８μｇ／ｍｌのリンコマイシン含有、１枚が６４μｇ／ｍｌのテトラサイクリン含有の３枚のＭＲＳプレートにコロニーに播くことによって、試料を分析した。ＭＲＳのみで増殖したコロニーはＤＳＭ１７９３８と考えられ、リンコマイシン含有ＭＲＳで増殖したコロニーはＤＳＭ１７６８６と考えられ、３枚のプレート全部で増殖したコロニーはＡＴＣＣ５５７３０と考えられた。
【００２８】
結果
ＤＳＭ１７９３８株とＤＳＭ１７６８６株の増殖をＡＴＣＣ５５７３０と比較した。世代時間の差は検出できなかったが、両キュアリング菌株は、ＡＴＣＣ５５７３０よりも有意に高い密度まで増殖した。最終ＯＤは、ＡＴＣＣ５５７３０が４．７８±０．１３；ＤＳＭ１７６８６が５．８９±０．２８；ＤＳＭ１７９３８が６．００±０．２６であった。当該３菌株は、約３０世代にわたってＭＲＳブイヨン中で共培養も行った（３回の再接種）。結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の場合、キュアリング菌株が有利であることを明らかに示している。等量の菌株を合わせて接種したが、実験終了時には、当該混合物は、５６％のＤＳＭ１７９３８、３８％のＤＳＭ１７６８６及びわずか６％のＡＴＣＣ５５７３０から成った。この理由は、キュアリングされた菌株がより高いＯＤまで増殖する、或いは、おそらく、定常期での生存がさらに良好になるということであろう。２種類のプラスミドの喪失から、負荷量の減少（複製ＤＮＡの減少）とそれによる競合能の増加も生じる可能性がある。
【００２９】
（実施例５）
粘液への結合
ブタの小腸粘液を使用した。粘液材料及びＢＳＡは、ＰＢＳで溶解、希釈し、低速回転下、室温で３時間１００μｌの溶液をインキュベートすることによって、マイクロタイターウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に固定した。最終濃度は、粘液材料がＯＤ２８０で０．１、ＢＳＡが１００μｇ／ｍｌであった。前記ウェルを、０．２ｍＬの１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで１時間ブロックした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した。細菌は、ＭＲＳブイヨン中３７°Ｃで１６時間増殖させ、ＰＢＳＴで１回洗浄し、同一緩衝液でＤＯ６００ ０．５まで希釈した。その後、前記ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、倒立顕微鏡で結合度を検討した。全細菌を３回繰返しで分析した。
【００３０】
結果
ＤＳＭ１７９３８株及びＤＳＭ１７６８６株の粘液結合能をＡＴＣＣ５５７３０と比較した。結合の差は検出できなかった。
【００３１】
（実施例６）
耐酸性
低ｐＨでの生存率を検討するため、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ５５７３０株、ＤＳＭ１７６８６株及びＤＳＭ１７９３８株を、ＭＲＳ中３７°Ｃで一昼夜増殖させた。当該細菌５μｌを前加温ＭＲＳ １０ｍＬに添加し、ＯＤ６００ １．０が達成されるまで、３７°Ｃでインキュベートした。ＯＤ １．０の培養物８００μｌを人工胃液８ｍｌ（８．３ｇ／ｌプロテオース ペプトン（Ｏｘｏｉｄ）、３．５ｇ／ｌ グルコース、２．０５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．６ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．１１ｇ／ｌ ＣａＣｌ２、０．３７ｇ／ｌ ＫＣｌ、ＨＣｌでｐＨ２．０に調整）に添加した後、酵素を欠くＣｏｔｔｅｒらの変法（Ｃｏｔｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｇａｈａｎ，Ｃ．Ｇ．，＆ Ｈｉｌｌ，Ｃ．２００１．胃液中でグルタメートデカルボキシラーゼシステムはリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を保護する（Ａ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｆｌｕｉｄ）．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４０：４６５〜４７５）。試験管を３７°Ｃでインキュベートし、１、２０、５０及び９０分後に試料を取り出した。当該試料は、ＰＢＳで希釈し、ＭＲＳプレート上に広げ、これを嫌気的に３７°Ｃで２４時間インキュベートした。本実験は２回繰り返し、各時点で２回繰り返し試料を分析した。前記菌株間の差を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定で統計的に試験した。
【００３２】
結果
ＯＤ６００ １．０まで増殖した（指数増殖中期〜後期）当該３種の菌株を、その後、酸性ｐＨに曝露した。ｐＨ２．０での５０分間のインキュベーション後、ＤＳＭ１７９３８及びＤＳＭ１７６８６は、ともに、ＡＴＣＣ５５７３０よりも良好に生存し、生存率は、それぞれ、４１、２８及び２０％であった（図３）。差は、ｐ−値０．０００６（ＤＳＭ１７９３８対ＡＴＣＣ５５７３０）、及び０．０４（ＤＳＭ１７６８６対ＡＴＣＣ５５７３０）で有意であった。これに対する理由は、不明である。酸性ｐＨでの生存率の改善が、共培養実験においてキュアリングされた菌株が、なぜより競合的であったのかの説明になると思われる。
【００３３】
（実施例７）
胆汁耐性
当該細菌を、ＭＲＳブイヨン中３７°Ｃで１６時間増殖させた。当該細菌浮遊液をＰＢＳで、約１０３〜１０６ｃｆｕ／ｍｌまで希釈した。各希釈物１０μＬを、各種濃度のウシ胆汁（０、０．５、１、２、４及び６％；Ｓｉｇｍａ Ｂ３８８３）を含むＭＲＳプレート上に滴下した。各細菌を２回繰り返し分析した。前記プレートは、嫌気的雰囲気中、３７°Ｃで７２時間インキュベートした。コロニーをカウントし、胆汁耐性を、胆汁プレートのコロニー数を胆汁無添加ＭＲＳプレートと比較して推定した。指数増殖期の細菌（ＯＤ ０．５）も、同じ方法で検討した。
【００３４】
結果
キュアリングされたＤＳＭ１７９３８株及びＤＳＭ１７６８６株のウシ胆汁に対する耐性をＡＴＣＣ５５７３０と比較した。細菌は、定常期及び指数増殖期（ＯＤ６００ ０．５）の両方において検討した。細菌は、定常期にあるときには胆汁に十分な耐性を示したが、指数期では生存及び増殖が、はるかに低かった。しかし、菌株間に耐性の差は検出できなかった。
【００３５】
本発明を、具体的な実施形態を参照して説明したが、多数の変形、変更及び実施形態が可能であり、従って、かかる変形、変更及び実施形態は、すべて、本発明の趣旨及び範囲に入ると見なすことができると理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＰＣＲによるプラスミドの検出を示す図である。数字は、１、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＤＳＭ１７９３８；２、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＤＳＭ１７６８６；３、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＡＴＣＣ５５７３０；及び４、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＤＳＭ ２００１６（陰性対照）を表す。分析対象プラスミドは、ａ、ｐＬＲ５８０；ｂ、ｐＬＲ５８１；ｃ、ｐＬＲ５８４；及びｄ、ｐＬＲ５８５である。
【図２】耐性遺伝子ｌｎｕＡの検出を示す図である。１、ＤＳＭ１７９３８；２、ＤＳＭ１７６８６；３、ＡＴＣＣ５５７３０；４、ＤＳＭ ２００１６
【図３】棒グラフによるＡＴＣＣ５５７３０（左）、ＤＳＭ１７６８６（中央）及びＤＳＭ１７９３８（右）の耐酸性を示す図である。カラムは、生菌の割合を示す（４回繰返しの平均値）。誤差バーは標準偏差、＊はｐ−値＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【背景技術】
【０００１】
１９０８年、ロシアの生物学者Ｅｌｉ Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆは、特定のブルガリア及びロシア国民の長寿を、大量の発酵乳製品の消費に原因があると考えた。これらの食品中の鍵となる生物は、後に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）という乳酸産生菌であると確認された。乳酸産生菌は、その乳酸を産生する能力に対してそのように名付けられている。しかし、乳酸産生は、この細菌群から得られる多くの利点の１つにすぎない。
【０００２】
Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆらの研究に基づいて、科学者は、動物の健康と性能の向上のために生きた乳酸産生菌及び酵母を動物に直接与えるプロバイオティック微生物の構想を生み出した。観察される利点は、１）消化管中での付着部位についての競合、２）必須栄養素についての競合、３）抗菌物質の産生、４）有益な細菌の増殖の増大、及び、５）免疫系の刺激から生じ得る。
【０００３】
一部の病原菌は、小腸の内膜を破壊することによって動物の栄養吸収能を低下させる。乳酸産生菌は、小腸に付着し、病原菌の腸壁への結合を防止する物質を産生する、と複数の研究が指摘している。さらに、有益な細菌の付着は、小腸の吸収表面積を拡大し、動物による栄養吸収増加のために酵素活性を増強することができる。
【０００４】
細菌は、健康を増進するものも、疾患を引き起こすものも、増殖に特定の栄養素を必要とする。乳酸産生菌は、ビタミン、アミノ酸、又は、他で有害菌の増殖を支持する可能性のある他の栄養素を活用することができる。
【０００５】
多数の研究が、直接摂食される微生物培養物の、疾患を引き起こす生物を抑制する能力に焦点を当てている。乳酸及びギ酸は、腸内ｐＨを低下させ、有害な生物に適さない環境を創り出す。乳酸産生菌は、過酸化水素も分泌し、酸素を要求する微生物に好ましくない条件を生じる。
【０００６】
２種類の抗菌物質群が同定されている。即ち、低分子量抗菌物質、例えばラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）によって産生されるロイテリン、及びバクテリオシンである。バクテリオシンは、しばしば遺伝的に関連のある細菌の増殖を抑制する細菌産生物質である。バクテリオシンは、ポリペプチドで、その抑制作用は、プロテアーゼによって破壊されるが、一方広範囲抗菌物質であるロイテリンは、ポリペプチドではなく、その抗菌活性は、プロテアーゼの影響を受けない。
【０００７】
ラクトバチルス・ロイテリを含めた様々なラクトバチルス種の菌株が、プロバイオティック製剤に使用されている。ラクトバチルス・ロイテリは、動物の消化管の天然の常在菌の１種で、通例、ヒトを含めた健康な動物の腸内に認められる。当該細菌は、抗菌活性を有することが既知である。例えば、米国特許第５，４３９，６７８号、第５，４５８，８７５号、第５，５３４，２５３号、第５，８３７，２３８号及び第５，８４９，２８９号を参照されたい。ラクトバチルス・ロイテリ細胞がグリセロール存在、嫌気条件下で増殖する場合、当該細胞は、β−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）として既知の抗菌物質を産生する。
【０００８】
乳酸産生菌の、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及びウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を抑制する能力が、研究によって実証されている。下痢を引き起こす生物の減少は、新生及び幼若動物において特に重要である。
【０００９】
ラクトバチルス菌株への遺伝子改変は通常、一般的食物病原菌に拮抗する化合物の産生、コレステロール代謝能又は酸若しくは胆汁認容能、及び、免疫応答増強能など、特定の菌株の特性の改善又は増強を標的とする（Ｋｕｌｌｅｎ，Ｍ．ＪとＴ．Ｒ．Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，１９９９，腸内ラクトバチルス及びビフィドバクテリアの遺伝子改変（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ａｎｄ ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ），ｐ．６５〜８３，Ｉｎ Ｇ．Ｔａｎｎｏｃｋ（編），Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）。これらの改変菌株は、理想的条件下で、宿主に有利であると思われる。しかし、自然条件下では、改変ラクトバチルス菌株の性能は、特に、操作にプラスミドが介在する場合、固有プラスミドに影響されることが多い。固有プラスミドと導入プラスミドの間の不適合性は、宿主内部のプラスミド不安定性に寄与する主たる要因の１つである（Ｐｏｓｎｏ，Ｍ．，Ｒ．Ｊ．Ｌｅｅｒ，Ｎ．ｖａｎ Ｌｕｉｊｋ，Ｍ．Ｊ．ｆ．ｖａｎ Ｇｉｅｚｅｎ，Ｐ．Ｔ．Ｈ．Ｍ．Ｂ．Ｃ．ＬｏｋｍａｎとＰ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ．１９９１，ラクトバチルスベクターの、小型潜在ラクトバチルスプラスミド由来レプリコンとの不適合性及び導入ベクターの分離不安定性（Ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｍａｌｌ ｃｒｙｐｔｉｃ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７，１８２２〜１８２８）。
【００１０】
大半のラクトバチルス菌株は、その入手源（植物、肉、貯蔵牧草、サワードー又は消化管）にかかわらず、少なくとも１つの、しばしばそれ以上の固有プラスミドを保有する（Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｈ．とＲ．Ｊ．Ｌｅｅｒ，１９９３，ラクトバチルスの遺伝学：プラスミドと遺伝子発現（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ：Ｐｌａｓｍｉｄ，ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）．Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ６４，８５〜１０７）。これらのプラスミドは、組換えプラスミドの安定性を妨げるだけでなく、望ましくない形質、例えば抗生物質耐性も保有する可能性があり（Ｐｏｓｎｏら，１９９１）、当該抗生物質耐性は、いずれかのかかる固有プラスミドを除去することが有利になり、或いは必要にさえなる場合がある。
【００１１】
多くの抗生物質及び抗菌物質は、本来、数百万年もの間自然界に存在し、ヒトは、抗生物質や抗菌物質を使って、細菌又は他の微生物の増殖を抑制し、ヒト、他の動物、及び、組織培養で細菌又は微生物感染症を治療してきた。しかし、抗生物質又は抗菌剤の使用は、投与若しくは適用されるこれらの抗生物質又は抗菌剤に耐性を示す細菌又は他の微生物に対して選択上の望ましくない影響を有する。結果として、治療法は、有害な影響を受け、又はある場合には無効になる可能性がある。
【００１２】
ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０は、最近、リンコマイシンに耐性があり、また、耐性遺伝子ｌｎｕＡも含有することが報告された（Ｋａｓｔｎｅｒ，Ｓ．，Ｐｅｒｒｅｔｅｎ，Ｖ．，Ｂｌｅｕｌｅｒ，Ｈ．，Ｈｕｇｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｇ．，Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｃ．＆ Ｍｅｉｌｅ，Ｌ．２００６．食品に使用される開始培養物とプロバイオティック細菌の抗生物質感受性パターン及び耐性遺伝子（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｏｏｄ），Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９（２）：１４５−１５５）。この遺伝子について当該菌株のゲノムが探索され、プラスミドｐＬＲ５８５上のオープンリーディングフレームＩｒ２１０５として同定された。当該プラスミドは、多剤耐性タンパク質（Ｉｒ２０８９）及びポリケチド抗生物質エクスポーター（Ｉｒ２０９６及びＩｒ２０９７）をコードする遺伝子も保有する。当該プラスミドの遺伝子はいずれも、当該菌株の既知のプロバイオティック特性又は耐酸性について明白な関係も有さず、重要な関連性も有さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
特にプロバイオティック産業では、酸に耐性を示すラクトバチルスを使用し、それによって、各種調合のかかる培養物が胃の酸環境を通過し、十分な数を保って残りの腸管に到達するだけでなく、胃で増殖し、コロニー形成し、消化管全体でそのプロバイオティック作用を発揮することもできることが求められている。耐酸性が低い菌株が使用される場合、さらに多くの細菌数を摂取することが必要であり、これは、コスト増加を招く。さらに、各種手段によって、酸ｐＨからの培養物の保護に多大の努力が向けられており、これもコストを増加させる。そのため、酸に十分な耐性を示す菌株を有すること、その結果、既存菌株の耐酸性を改善する方法に、産業界で関心が持たれている。乳酸菌の耐酸性を改善する方法の一例は、米国特許出願第２００５０１５８，４２３ Ａ１に示されており、この場合、小型熱ショックタンパク質をコードするプラスミドを保持する菌株が使用され、かかるプラスミドを乳酸菌中に移す方法も示されている。しかし、これは、プラスミドを除去して菌株の耐酸性を増大させる本発明とは対照的である。
【００１４】
本発明の他の目的及び特徴は、以下の開示内容及び添付の特許請求の範囲からより詳細に明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
２種類のプラスミドｐＬＲ５８１及びｐＬＲ５８５をキュアリングすることによってラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０から誘導された菌株が得られている。この菌株は、親株よりもテトラサイクリン及びリンコマイシンに対する感受性がはるかに高い。当該二重キュアリング菌株は、ＤＳＭＺに寄託され、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８と指定された。ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８は、ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０と同一のｒｅｐ−ＰＣＲ（反復ＰＣＲ）プロファイル、発酵パターン、ロイテリン産生、形態、増殖速度、粘液付着及び胆汁耐性を有する。しかし、当該キュアリング菌株は、より高密度に増殖し、酸性条件でさらに良好に生存する。当該菌株を共培養すると、ＤＳＭ１７９３８は、一層競合的にもなる。
【００１６】
よって、本明細書の発明は、新規菌株の特徴を使用し、より良好な耐酸性を示すように改変された乳酸菌の特定のプラスミドキュアリング菌株、かかる菌株の改変法、及びかかる菌株を含有する製品を提供する。本発明の他の目的及び特徴は、以下の開示内容及び添付の特許請求の範囲からより詳細に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８株（ブダペスト条約に従って、２００６年２月６日にＤＳＭＺ−ドイツ微生物系統保存施設（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託）は、２種類のプラスミドｐＬＲ５８１及びｐＬＲ５８５をキュアリングすることによってラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ５５７３０から誘導される。当該菌株は、ＡＴＣＣ５５７３０と同一のｒｅｐ−ＰＣＲプロファイル、発酵パターン、ロイテリン産生、形態、増殖速度、粘液付着及び胆汁耐性を有するが、テトラサイクリン及びリンコマイシンへの感受性が親株よりもはるかに高い。驚くべきことに、Ｌ．ロイテリ ＤＳＭ１７９３８及びＤＳＭ１７６８６は、キュアリングによるプラスミド除去によって耐酸性の増加を引き起こすことが認められている。共培養実験では、さらに競合的で、酸性ｐＨでの生存率の改善によって説明できる。
【００１８】
本発明の一目的は、乳酸菌からプラスミドを除去し、耐酸性をさらに増大させ、それによって、腸管での生存率をさらに増大させ、その結果、ヒトの健康にさらに有益にすることである。これは、Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７６８６株と新規Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８株において立証されている。これは、耐酸性に関連するものをコードしない除去プラスミドから、酸により安定な新規菌株が得られるという、ラクトバチルスにおいて一般的な、これまで知られていなかった現象であると思われる。本明細書の発明では、この作用を使用し、ラクトバチルスの耐酸性を増大させている。
【００１９】
本発明の他の目的及び特徴は、以下の開示内容及び添付の特許請求の範囲からより詳細に明らかになる。
【実施例】
【００２０】
（実施例１）
ＤＳＭ１７６８６からのｐＬＲ５８５のキュアリング
プロトプラスト形成及び再生によるプラスミドキュアリングは、基本的に、Ｖｅｓｃｏｖｏらの記述のとおりに実施した（Ｖｅｓｃｏｖｏ，Ｍ．，Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｃｏｃｃｏｎｃｅｌｌｉ，Ｐ．Ｓ．とＢｏｔｔａｚｚｉ，Ｖ．１９８４．ラクトバチルス・ロイテリにおけるプロトプラスト形成、再生及びプラスミドキュアリング（Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｕｒｉｎｇ ｉｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２３：３３３〜３３４）。ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７６８６の一昼夜培養物を、１０ｍＬ ＭＲＳ培養液（Ｏｘｏｉｄ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）でＯＤ６００＝０．１まで希釈し、ＯＤ６００＝０．７〜０．８になるまで３７°Ｃで増殖させた。３０００ｘｇ、１０分間の遠心分離によって細胞を収集し、１０ｍｌのＮａｎｏｐｕｒｅ水で洗浄した。細胞は、遠心分離によって再度収集し、２ｍｌのプロトプラスト緩衝液（０．２Ｍ リン酸緩衝液、０．５Ｍ スクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２；ｐＨ７．０）に再浮遊させた。当該細胞は、プロトプラスト緩衝液中、等量の１０ｍｇ／ｍｌリゾチームと混合し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。プロトプラストを３０００ｘｇ、１５分間の遠心分離によって採取し、２０ｍｌのプロトプラスト緩衝液で洗浄した。プロトプラストは、遠心分離によって再度採取し、１ｍｌのプロトプラスト緩衝液に再浮遊させ、その後、顕微鏡観察を実施した。
【００２１】
プロトプラスト緩衝液希釈物を、再生のため、０．５Ｍスクロース入りＭＲＳ寒天培地上に播いた。Ｎａｎｏｐｕｒｅ水希釈物は、ＭＲＳ寒天培地上に播き、残りの全細胞数を評価した。３７°Ｃ下一昼夜の嫌気的インキュベーション後、及び、再度、次の一昼夜のインキュベーションの後に、ｃｆｕ数を決定した。再生コロニーを取って、８μｇ／ｍｌリンコマイシン含有及び非含有ＭＲＳ寒天培地に播いた。リンコマイシンＭＲＳプレート上での非増殖によってプラスミドキュアリング候補を同定した。
【００２２】
結果
ｐＬＲ５８５のキュアリングの確認
ＤＳＭ１７９３８のプラスミドを、ＰＣＲで分析した（図１）。ｐＬＲ５８５、ｐＬＲ５８１は、ともに存在しなかったが、その他の２種類のプラスミドは、依然として認められた。よって、ＤＳＭ１７９３８は、ｔｅｔＷ−プラスミドｐＬＲ５８１及びｌｎｕＡ−プラスミドｐＬＲ５８５の両方からキュアリングされる。ＤＳＭ１７９３８中ｌｎｕＡの不存在も、ＰＣＲによって検出された（図２）。
【００２３】
（実施例２）
リンコマイシンの最小阻止濃度の決定
前記細菌を、ＭＲＳブイヨン培地中、３７°Ｃで１６時間増殖させた。１０５ｃｆｕ／ｍｌまで希釈した後、１μＬの各菌株を、リンコマイシン又はクリンダマイシン（濃度０、０．１２５、０．２５、０．５，１，２，４，８及び１６μｇ／ｍｌ）含有ＭＲＳプレート上にスポットした。当該液滴の吸着後、当該プレートは、嫌気的雰囲気中、３７°Ｃで２４時間インキュベートした。前記ＭＩＣは、細菌増殖が視覚的に認められない最低抗生物質濃度として定義した。製造会社の説明書に従って、ＭＲＳ寒天（Ｏｘｏｉｄ）プレート上で増殖する細菌について、Ｅｔｅｓｔ（ＡＢ Ｂｉｏｄｉｓｋ）でテトラサイクリンに対するＭＩＣを検討した。
【００２４】
結果
ｐＬＲ５８５のキュアリングは、リンコマイシン＞１６μｇ／ｍＬから０．２５μｇ／ｍｌへのＭＩＣ減少を生じ、これは、陰性対照ＤＳＭ２００１６のレベルに近いものであった。すでに非常に低いクリンダマイシンのＭＩＣ値は、変化しなかった。テトラサイクリンに対するＭＩＣも、Ｅ−ｔｅｓｔで検討し、ＤＳＭ１７９３８及びＤＳＭ１７６８６が１２〜１６μｇ／ｍｌ、ＡＴＣＣ５５７３０が＞２５６μｇ／ｍｌであると判明した。
表１
【表１】
【００２５】
（実施例３）
発酵パターン及びロイテリン産生
製造会社の説明書に従って、ａｐｉ５０ ＣＨＬ（ｂｉｏ−Ｍｅｒｉｅｕｘ）を使って発酵パターンを決定した。ロイテリン産生を検出するために、最初にＭＲＳプレート上で前記細菌を４８時間増殖させた（画線接種）。次いで、当該プレートに５００ｍＭグリセロール寒天（１％寒天）を重層し、３７°Ｃで３０分間インキュベートした。５ｍＬの２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２Ｍ ＨＣｌ中０．１％）を添加してロイテリンを検出した。３分間のインキュベーション後、当該溶液を注ぎ、５ｍＬの５Ｍ ＫＯＨを添加した。コロニー周囲の赤色ゾーンは、ロイテリンが産生されたことを示す。
【００２６】
結果
ＤＳＭ１７９３８の発酵パターンを、ＡＰＩ５０ ＣＨＬを使ってＤＳＭ１７６８６及びＡＴＣＣ５５７３０と比較し、差を検出できなかった。全菌株が、Ｌ−アラビノース、リボース、ガラクトース、グルコース、マルトース、ラクトース、メリビオース、サッカロース、ラフィノース及びグルコネートを発酵させ、残りの試験では陰性であった。ロイテリンの産生も、３菌株は同一の規模であった。
【００２７】
（実施例４）
増殖及び共培養
増殖は、３７°Ｃに前加温した試験管中ＭＲＳブイヨンにＯＤ０．１になるまで一昼夜培養物をインキュベートすることによって検出した。当該試験管は、３７°Ｃでインキュベートし、ＯＤ６００ｎｍ測定用試料を８時間の間に入手した。各細菌を３回繰返しで分析した。当該細菌の共培養は、前加温ＭＲＳブイヨン試験管中でＡＴＣＣ５７３０、ＤＳＭ１７６８６及びＤＳＭ１７９３８の等量の一昼夜培養物を混合することによって実施した。当該混合物は、３７°Ｃで一昼夜インキュベートし、次いで、新規のＭＲＳ試験管に再接種した。この手順を３回繰り返した。開始時と各培養後に、培養物の各種希釈物をＭＲＳプレート上に播き、次いで、コロニーを取って、１枚が抗生物質なし、１枚が８μｇ／ｍｌのリンコマイシン含有、１枚が６４μｇ／ｍｌのテトラサイクリン含有の３枚のＭＲＳプレートにコロニーに播くことによって、試料を分析した。ＭＲＳのみで増殖したコロニーはＤＳＭ１７９３８と考えられ、リンコマイシン含有ＭＲＳで増殖したコロニーはＤＳＭ１７６８６と考えられ、３枚のプレート全部で増殖したコロニーはＡＴＣＣ５５７３０と考えられた。
【００２８】
結果
ＤＳＭ１７９３８株とＤＳＭ１７６８６株の増殖をＡＴＣＣ５５７３０と比較した。世代時間の差は検出できなかったが、両キュアリング菌株は、ＡＴＣＣ５５７３０よりも有意に高い密度まで増殖した。最終ＯＤは、ＡＴＣＣ５５７３０が４．７８±０．１３；ＤＳＭ１７６８６が５．８９±０．２８；ＤＳＭ１７９３８が６．００±０．２６であった。当該３菌株は、約３０世代にわたってＭＲＳブイヨン中で共培養も行った（３回の再接種）。結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の場合、キュアリング菌株が有利であることを明らかに示している。等量の菌株を合わせて接種したが、実験終了時には、当該混合物は、５６％のＤＳＭ１７９３８、３８％のＤＳＭ１７６８６及びわずか６％のＡＴＣＣ５５７３０から成った。この理由は、キュアリングされた菌株がより高いＯＤまで増殖する、或いは、おそらく、定常期での生存がさらに良好になるということであろう。２種類のプラスミドの喪失から、負荷量の減少（複製ＤＮＡの減少）とそれによる競合能の増加も生じる可能性がある。
【００２９】
（実施例５）
粘液への結合
ブタの小腸粘液を使用した。粘液材料及びＢＳＡは、ＰＢＳで溶解、希釈し、低速回転下、室温で３時間１００μｌの溶液をインキュベートすることによって、マイクロタイターウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に固定した。最終濃度は、粘液材料がＯＤ２８０で０．１、ＢＳＡが１００μｇ／ｍｌであった。前記ウェルを、０．２ｍＬの１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳで１時間ブロックした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した。細菌は、ＭＲＳブイヨン中３７°Ｃで１６時間増殖させ、ＰＢＳＴで１回洗浄し、同一緩衝液でＤＯ６００ ０．５まで希釈した。その後、前記ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、倒立顕微鏡で結合度を検討した。全細菌を３回繰返しで分析した。
【００３０】
結果
ＤＳＭ１７９３８株及びＤＳＭ１７６８６株の粘液結合能をＡＴＣＣ５５７３０と比較した。結合の差は検出できなかった。
【００３１】
（実施例６）
耐酸性
低ｐＨでの生存率を検討するため、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ５５７３０株、ＤＳＭ１７６８６株及びＤＳＭ１７９３８株を、ＭＲＳ中３７°Ｃで一昼夜増殖させた。当該細菌５μｌを前加温ＭＲＳ １０ｍＬに添加し、ＯＤ６００ １．０が達成されるまで、３７°Ｃでインキュベートした。ＯＤ １．０の培養物８００μｌを人工胃液８ｍｌ（８．３ｇ／ｌプロテオース ペプトン（Ｏｘｏｉｄ）、３．５ｇ／ｌ グルコース、２．０５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．６ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．１１ｇ／ｌ ＣａＣｌ２、０．３７ｇ／ｌ ＫＣｌ、ＨＣｌでｐＨ２．０に調整）に添加した後、酵素を欠くＣｏｔｔｅｒらの変法（Ｃｏｔｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｇａｈａｎ，Ｃ．Ｇ．，＆ Ｈｉｌｌ，Ｃ．２００１．胃液中でグルタメートデカルボキシラーゼシステムはリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を保護する（Ａ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｆｌｕｉｄ）．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４０：４６５〜４７５）。試験管を３７°Ｃでインキュベートし、１、２０、５０及び９０分後に試料を取り出した。当該試料は、ＰＢＳで希釈し、ＭＲＳプレート上に広げ、これを嫌気的に３７°Ｃで２４時間インキュベートした。本実験は２回繰り返し、各時点で２回繰り返し試料を分析した。前記菌株間の差を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定で統計的に試験した。
【００３２】
結果
ＯＤ６００ １．０まで増殖した（指数増殖中期〜後期）当該３種の菌株を、その後、酸性ｐＨに曝露した。ｐＨ２．０での５０分間のインキュベーション後、ＤＳＭ１７９３８及びＤＳＭ１７６８６は、ともに、ＡＴＣＣ５５７３０よりも良好に生存し、生存率は、それぞれ、４１、２８及び２０％であった（図３）。差は、ｐ−値０．０００６（ＤＳＭ１７９３８対ＡＴＣＣ５５７３０）、及び０．０４（ＤＳＭ１７６８６対ＡＴＣＣ５５７３０）で有意であった。これに対する理由は、不明である。酸性ｐＨでの生存率の改善が、共培養実験においてキュアリングされた菌株が、なぜより競合的であったのかの説明になると思われる。
【００３３】
（実施例７）
胆汁耐性
当該細菌を、ＭＲＳブイヨン中３７°Ｃで１６時間増殖させた。当該細菌浮遊液をＰＢＳで、約１０３〜１０６ｃｆｕ／ｍｌまで希釈した。各希釈物１０μＬを、各種濃度のウシ胆汁（０、０．５、１、２、４及び６％；Ｓｉｇｍａ Ｂ３８８３）を含むＭＲＳプレート上に滴下した。各細菌を２回繰り返し分析した。前記プレートは、嫌気的雰囲気中、３７°Ｃで７２時間インキュベートした。コロニーをカウントし、胆汁耐性を、胆汁プレートのコロニー数を胆汁無添加ＭＲＳプレートと比較して推定した。指数増殖期の細菌（ＯＤ ０．５）も、同じ方法で検討した。
【００３４】
結果
キュアリングされたＤＳＭ１７９３８株及びＤＳＭ１７６８６株のウシ胆汁に対する耐性をＡＴＣＣ５５７３０と比較した。細菌は、定常期及び指数増殖期（ＯＤ６００ ０．５）の両方において検討した。細菌は、定常期にあるときには胆汁に十分な耐性を示したが、指数期では生存及び増殖が、はるかに低かった。しかし、菌株間に耐性の差は検出できなかった。
【００３５】
本発明を、具体的な実施形態を参照して説明したが、多数の変形、変更及び実施形態が可能であり、従って、かかる変形、変更及び実施形態は、すべて、本発明の趣旨及び範囲に入ると見なすことができると理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＰＣＲによるプラスミドの検出を示す図である。数字は、１、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＤＳＭ１７９３８；２、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＤＳＭ１７６８６；３、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＡＴＣＣ５５７３０；及び４、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＤＳＭ ２００１６（陰性対照）を表す。分析対象プラスミドは、ａ、ｐＬＲ５８０；ｂ、ｐＬＲ５８１；ｃ、ｐＬＲ５８４；及びｄ、ｐＬＲ５８５である。
【図２】耐性遺伝子ｌｎｕＡの検出を示す図である。１、ＤＳＭ１７９３８；２、ＤＳＭ１７６８６；３、ＡＴＣＣ５５７３０；４、ＤＳＭ ２００１６
【図３】棒グラフによるＡＴＣＣ５５７３０（左）、ＤＳＭ１７６８６（中央）及びＤＳＭ１７９３８（右）の耐酸性を示す図である。カラムは、生菌の割合を示す（４回繰返しの平均値）。誤差バーは標準偏差、＊はｐ−値＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８の生物学的に純粋な培養物を含む組成物。
【請求項３】
ラクトバチルス菌株からプラスミドを除去するステップを含む、ラクトバチルス菌株の耐酸性を増大させる方法。
【請求項４】
ラクトバチルス菌株がラクトバチルス・ロイテリの菌株である、請求項３に記載のラクトバチルス菌株の耐酸性を増大させる方法。
【請求項５】
ラクトバチルス菌株からプラスミドを除去するステップを含む、ヒトの胃でより良好にコロニー形成することができるラクトバチルス菌株を提供する方法。
【請求項６】
ラクトバチルス菌株がラクトバチルス・ロイテリの菌株である、請求項５に記載のラクトバチルス菌株の耐酸性を増大させる方法。
【請求項７】
プラスミドが除去されているラクトバチルス菌株を含むプロバイオティック製品。
【請求項８】
全プラスミドが除去されている、請求項７に記載のプロバイオティック製品。
【請求項９】
菌株がラクトバチルス・ロイテリの菌株である、請求項７に記載のプロバイオティック製品。
【請求項１０】
菌株がラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８である、請求項９に記載のプロバイオティック製品。
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８の生物学的に純粋な培養物を含む組成物。
【請求項３】
ラクトバチルス菌株からプラスミドを除去するステップを含む、ラクトバチルス菌株の耐酸性を増大させる方法。
【請求項４】
ラクトバチルス菌株がラクトバチルス・ロイテリの菌株である、請求項３に記載のラクトバチルス菌株の耐酸性を増大させる方法。
【請求項５】
ラクトバチルス菌株からプラスミドを除去するステップを含む、ヒトの胃でより良好にコロニー形成することができるラクトバチルス菌株を提供する方法。
【請求項６】
ラクトバチルス菌株がラクトバチルス・ロイテリの菌株である、請求項５に記載のラクトバチルス菌株の耐酸性を増大させる方法。
【請求項７】
プラスミドが除去されているラクトバチルス菌株を含むプロバイオティック製品。
【請求項８】
全プラスミドが除去されている、請求項７に記載のプロバイオティック製品。
【請求項９】
菌株がラクトバチルス・ロイテリの菌株である、請求項７に記載のプロバイオティック製品。
【請求項１０】
菌株がラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８である、請求項９に記載のプロバイオティック製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５３９３７２（Ｐ２００９−５３９３７２Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１４２４０（Ｐ２００９−５１４２４０）
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５０３８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４２５９７
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０７３４０１２０）バイオガイヤ エービー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３０日（２００７．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５０３８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４２５９７
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０７３４０１２０）バイオガイヤ エービー (5)
【Ｆターム（参考）】
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