胚中で母系ゲノムの完全二倍体補完物を有する種子を作出するための核酸及び方法
本発明はＤＹＡＤ遺伝子、その変異体、及び雌親植物のヘテロ接合性を保持する植物を作出するためのそれらの使用に関する。本発明はまた構成的でも又は条件付きでも、ｄｙａｄ表現型を有し、及びそのため雌親のヘテロ接合性を保持する植物、植物組織、及び植物の種子をも含む。本発明は無配偶生殖植物の様式で所望のハイブリッド表現型を繁殖させることのために及び増大されたバイオマスを有する植物をもたらしうる、植物遺伝子型の倍数性を増大させることのために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は胚中で母系ゲノムの完全二倍体補完物を有する種子を作出する目的のために配偶子形成及び種子発達を操作するためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｏｅｃｈｅｒａ、イネ及び他の植物のＤＹＡＤ遺伝子の対立遺伝子及び遺伝子産物の使用に関する。本発明はまた花粉発達に対して実質的な影響なしに減数されていない雌性配偶体を作出するための変えられたＤＹＡＤ遺伝子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
植物の生活環は二倍胞子体世代及び半数配偶体世代の間を交替する。減数分裂は植物生活環の二倍胞子体及び半数配偶体相の間の変遷を代表する。減数分裂は半数体胞子の形成を導く。動物とは違って、植物においては、減数分裂生成物は多細胞半数配偶体を形成するために追加の分裂を経験する。配偶子の分化は、減数分裂生成物の分裂後、配偶体発達の後期段階に向かって起こる。受精前の性プロセスはそれゆえ２の明確な段階：減数分裂及び半数体胞子の形成を含む胞子生殖；及び受精に及び胚の生長を支持するために必要とされる配偶子及び関連細胞を含む配偶体への胞子の発達をいう配偶子形成を含む。
【０００３】
ほとんどの植物種は性生殖を経験する；しかしながら、いくつかの植物種は無性生殖をすることができる。用語無配偶生殖は一般的に無性生殖のある形態のいずれかによる性生殖の置換として認められる（Ｋｏｌｔｕｎｏｗ Ａ． ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓｓ Ｕ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ５４： ５４７−７４， ２００３）。無配偶生殖は、胚が卵及び精子の合体なしに形成される種子形成を含む、植物における生殖の遺伝学的に制御された方法である。無配偶生殖の３の基本的な型：１）胚が珠心に由来する胚のう内で染色体として減数されていない卵から単為生殖的に発達する、無胞子生殖、２）胚が大胞子母細胞に由来する胚のう内で減数されていない卵から単為生殖的に発達する、複相胞子生殖、及び３）胚が体細胞から直接的に発達する、不定胚形成がある。はじめの２の型の無配偶生殖は、両方の場合において胚は雌性配偶体又は胚のうから発達するので、配偶体の無配偶生殖の下に共に分類されるが、一方、不定胚形成においては、胚は中間雌性配偶体段階なしに体細胞から直接的に発達する。それゆえ配偶体の無配偶生殖は２の成分：ｉ）アポマイオシス又は親の遺伝子型を保持する減数されていない雌性配偶体（胚のう）の生成、及びｉｉ）内胚乳に発達する中心細胞の受精を伴う又は伴わない、胚の単為生殖的発達を含む。
【０００４】
無配偶生殖はしたがって母親と遺伝的に同一の胚を作出するための雌性減数分裂及び配偶子合体（有性生殖）をバイパスする生殖プロセスである。３の型の無配偶生殖は、それらは純種を繁殖させるためにどんなヘテロ接合にもかかわらず、どんな遺伝子型でも起こしうるので、経済的な可能性を有する。無配偶生殖で、特に適応性のある又はハイブリッドの遺伝子型の子孫は繰り返される生活環をとおしてそれらの遺伝子型を維持するであろう。ハイブリッドの生長力を固定することに加えて、無配偶生殖は、ハイブリッドを作出するための効果的な雄性不稔性又は稔性回復システムが知られていない又は開発されていない作物における可能性のある商業的ハイブリッド生産を作出しうる。無配偶生殖はそれゆえハイブリッド開発をより効率的にしうる。無配偶生殖はまた優れた雄性不稔性システムを有する植物種におけるハイブリッド生産を単純化し、及び遺伝的多様性を増大させる。栽培種に絶対的な又は高いレベルの無配偶生殖を制御する遺伝子を導入すること及び純種繁殖Ｆ１ハイブリッドを作出するために交雑適合性の性及び無配偶生殖遺伝子型を容易にハイブリダイズすることができることは非常に好ましいであろう。重要な作物への無配偶生殖の移動は細胞質−核雄性不稔性及び高いコストの、労働の激しい生産プロセスの必要性なしに、純種繁殖ハイブリッドの可能性のある開発及びハイブリッドの商業的生産を作出しうる。絶対的無配偶生殖Ｆ１ハイブリッドは無期限にその種子をとおして純種を繁殖するであろう、及びその種子をとおして栄養器官の又はクローンの生殖方法を提供すると考えられうる。無配偶生殖的に生殖する栽培作物の開発はまた発展する世界諸国民における食物安全性に対して主要な貢献を提供しうる（Ｓｐｉｌｌａｎｅ Ｃ， Ｓｔｅｉｍｅｒ Ａ， ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ Ｕ， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． １４： １７９−１８７， ２００１）。
【０００５】
実際には、無配偶生殖を制御する最もよく知られる遺伝子は、栽培種と遠く関連する野生種内で見つけられる。種間交配は栽培及び野生種の間で可能でありうるが、ゲノム間の染色体対形成は通常低く又は存在せず、このアプローチの失敗につながる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の開示
栽培作物に無配偶生殖を導入するために考えられうる２の一般的な策がある。第一は栽培種への野生近縁系統からの遺伝子移入による。第二は無配偶生殖の局面を与えうる性種からの遺伝子の同定、続いて無配偶生殖の完全なレパートリーを作出するためにこれらの遺伝子をピラミッド状にすることによる。これらの遺伝子はその後トランスジェニック法を用いて栽培作物に導入されうる。したがって、例えば、１以上の遺伝子の発現はアポマイオシスを誘導するために使用されることができ、及びこれらの遺伝子は単為生殖胚発達を誘発するためにもう一つのセットの遺伝子及び他の処置と合わせられうる。植物において単為生殖を誘発する方法は本分野において知られる（例えば、米国特許第５，８４０，５６７号を参照のこと）。本発明での使用のために単為生殖発達を誘発するための好ましい方法は、照射することにより受精について花粉を不活性化し、照射された花粉を用いて植物に授粉することである。（Ｐａｎｄｅｙ Ｋ．Ｋ． ａｎｄ Ｐｈｕｎｇ Ｍ．， Ｔｈｅｏｒｅｔ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， Ｖｏｌ． ６２：２９５−３００， １９８２； Ｌｏｆｔｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｄ．， Ｖｏｌ． ２１：１１２１−１１２８， ２００３）。
【０００７】
この方法はそれがいくつかの植物種において使用されており、及び不完全な花（雌雄同株の及び雌雄異株の）を有する植物に最も簡単に、一般的に適用可能であるように見える点で好ましい。しかしながら、それは雄性不稔性にされた又は受精能力のある花粉が機械的に除去された若しくは分離された完全な花を有する雌雄同花（両性花）植物に適用されうる。
【０００８】
上記花粉を不稔性にするための照射の特異的な量は種の特色に因り変化するであろう。一般的に、約１０〜２０００Ｇｒａｙの量は十分である。好ましくは、上記量は約１００〜５００Ｇｒａｙ、より好ましくは２００〜２５０Ｇｒａｙである。
【０００９】
単為生殖の誘発の成功は胚の存在についての種子のスクリーニングにより、例えば、Ｌｏｆｔｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｄ．， Ｖｏｌ． ２１：１１２１−１１２８， ２００３により示されるように液体培地中での培養後の種子の切開により又はライトボックス上での観察により検出されうる。
【００１０】
正常な性作物へ無配偶生殖形質を導入することは試みられている。Ａｓｋｅｒ Ｓ．（Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ， Ｖｏｌ． ９１：２３１−２４１， １９７９）は、試みは小麦、テンサイ、及びトウモロコシで失敗であったことを報告する。ＰＣＴ公開公報ＷＯ ８９／００８１０（Ｍａｘｏｎ ｅｔ ａｌ， １９８９）は、非栽培不稔性アルファルファ植物からの抽出物を用いて栽培植物において無配偶生殖形の生殖を誘発することを開示する。雄性不稔性の誘発がサトウモロコシ、ヒマワリ、パールミレット、及びトマトで評価されたとき、サトウモロコシ、パールミレット、及びヒマワリで減数された種子セット、及びトマトで減数された果実セットがあったことが報告された。
【００１１】
無配偶生殖は均一な及び疾患−及びウイルス−なしの根茎を作出するためにＣｉｔｒｕｓで（Ｐａｒｌｅｖｌｉｅｔ Ｊ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｉｔｒｕｓ． Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．７４： ２５２−２６０， １９５９）及び改善された栽培変種を作出するためにバッフェルグラス（Ｂａｓｈａｗ， Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２０： １１２， １９８０）及びＰｏａ（Ｐｅｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． １１： ４４５−４４８， １９７１）で効果的に使用されるが、それは栽培作物植物にうまく移動されていない。
【００１２】
無配偶生殖を作出するための第二のアプローチは性種からの無配偶生殖関連遺伝子の同定及び操作を含む。無配偶生殖の発達上の観察は、無配偶生殖は性生殖に関連し、及び性経路でも役割を果たす遺伝子の活動を含むことを示唆した（Ｔｕｃｋｅｒ Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ． １５（７）：１５２４−１５３７， ２００３）。性生殖において、通常下皮層から、発達する胚珠の頂部に向かって発生する大胞子母細胞は大きくなり、及び減数分裂及び２細胞分割を経験し、それぞれ半数染色体数を有する大胞子の直線四分子を形成する。異なる植物種の間で最も通常には、３の最も先端の胞子が退化し、一方、機能的な合点の胞子は３ラウンドの核分裂、続いて細胞拡大を経験し、卵、２の極核、２の助細胞、及び３の反足細胞を有する胚のうを形成する。無配偶生殖は、多数の遺伝子の活動を必要とすることがいくつかの種で示されているように、多段階及び無配偶生殖の完全な経路の制御を必要とするプロセスである（ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｒｅｄｉｔｙ， Ｖｏｌ． ８３： ７１５−７２１， １９９９； Ｍａｔｚｋ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １７（１）：１３−２４， ２００５）。分離において機能する経路において１又は１サブセットの遺伝子により制御される個々の成分段階は稔性に対する負の効果を有しうること（Ｓｐｉｌｌａｎｅ， Ｃ．， Ｓｔｅｉｍｅｒ Ａ． ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ Ｕ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １４： １７９−８７， ２００１）、及び無配偶生殖を効果的に促進することができるのは全経路を含む完全なセットの遺伝子の協調した活動のみであることが考えられている。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体の遺伝学的及び分子的分析は胞子生殖及び配偶子形成の段階で役割を果たすいくつかの遺伝子の同定を導いた（Ｙａｎｇ Ｗ． Ｃ． ａｎｄ Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ Ｖ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ３（１）： ５３−５７， ２０００）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｄｙａｄ変異体は雌性不稔性を引き起こすと同定され（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２７（１）：１９７−２０７， ２０００）、及びその分析はｄｙａｄ変異体植物は雌性減数分裂において欠陥があることを示した。ｄｙａｄ変異体における雌性減数母細胞の大多数は単一分割減数分裂を経験し、４の代わりに２の細胞を与え、続いて配偶子形成を含む発達のさらなる段階において止まる。ｄｙａｄ変異体における雄性減数分裂、花粉発達、及び雄性不稔性は正常であることがわかった（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２７（１）：１９７−２０７， ２０００； Ｒｅｄｄｙ Ｔ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １３０（２４）：５９７５−５９８７， ２００３）。雌性減数分裂中の減数分裂染色体の分析は、相同染色体は対合を経験しないこと、及び減数的減数分裂１分割は均等な分割により置換されることを示した（Ａｇａｓｈｅ Ｂ．， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２９（１６）， ３９３５−３９４３， ２００２）。独立した研究はＤＹＡＤと同一である、ＳＷＩ１遺伝子の同定を導いた（Ｍｏｔａｍａｙｏｒ Ｊ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １２：２０９−２１８， ２０００； Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． Ｖｏｌ． １５：１８５９−１８７１， ２００１）。これらの研究により同定された遺伝子は以下ではＤＹＡＤ遺伝子と呼ばれる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの野生型ＤＹＡＤ遺伝子は６３９アミノ酸のタンパク質をコードする（配列ＩＤ番号：５）。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＤＹＡＤ遺伝子の３の対立遺伝子が示されている。これらは：ｉ）アミノ酸５０８でのトランケーションを有するｄｙａｄ；生ずるタンパク質はそれゆえ野生型タンパク質において存在するＣ−末端１３０アミノ酸を欠く；ｉｉ）いくつかの雌性減数母細胞が均等減数分裂１分割を経験し、一方でその他は減数分裂を経験することを引き起こす減少された量の野生型タンパク質の生成をもたらすｓｗｉｌ．１；及びｉｉｉ）位置３９４に停止コドンを作出し、及びｄｙａｄと同様の雌性表現型を引き起こすが、さらに雄性不稔性をもたらす雄性減数分裂における欠陥をも引き起こすｓｗｉｌ．２である。Ｂｏｅｃｈｅｒａにおいてｄｙａｄ対立遺伝子に対応する位置は、上記アミノ酸配列の位置５０８でのフレームシフトを引き起こし、及び１０の追加のコドンの後（すなわち、位置５１８）に停止コドンをもたらす突然変異であろう。イネにおいて対応する位置はそれぞれ、５６３及び５７２である。
【００１３】
本発明のどんな理論にもとらわれることなく、発明者は、ポリペプチドカルボキシ−末端から位置３９４（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、及び他の種における対応する位置）の部分を有するＤＹＡＤタンパク質の量における減少は雌性減数母細胞が均等減数分裂１分割を経験する表現型を作出し、雌性配偶子における雌性遺伝子型（及びしたがってヘテロ接合性）の保持をもたらすことを示唆する。位置３９４から位置５０８（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、及び他の種における対応する位置）のドメインを有する正常な（又はおよそそのような）量のＤＹＡＤタンパク質の保持は正常な花粉発達を提供し、一方で植物におけるこのドメインの除去は雄性不稔性表現型を作出する。
【００１４】
本発明の作出前に、ｄｙａｄ又はｓｗｉｌ．２対立遺伝子についてホモ接合である植物は種子セットを示すことが報告されていなかった。ｓｗｉｌ．１対立遺伝子を有する植物はホモ接合であるとき減数された種子セットを示すことが報告されているが、生成される種子はそれらの染色体構成について分析され、及び二倍体であることがわかっており、それにより上記種子は正常な大胞子形成及び大配偶子形成から生ずることを示す（Ｍｏｔａｍａｙｏｒ Ｊ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ．１２：２０９−２１８， ２０００）。以前に示されるように、ｄｙａｄ、ｓｗｉｌ．１、及びｓｗｉｌ．２における均等単一分割減数分裂の結果として生成された胞子は停止されたままであり、及び本発明の作出までは、これらのいずれかが雌性配偶子に発達する可能性を有するかどうかは知られていなかった。また本発明の作出までは、染色体が均等単一分割雌性減数分裂の間に組換えを経験したかどうか、及びその結果として分裂産物は親のヘテロ接合性を失ったかどうかも知られていなかった。均等分割に付随する組換えのもっともらしさは、二倍体細胞は減数分裂に入り、減数分裂組換えを経験し、その後生育培地への移動に際して減数分裂から引き、及び有糸分裂的に分裂しうることを示す酵母における研究により支持される。組換えが上記遺伝子及びセントロメアの間で起こった場合、上記有糸分裂は遺伝子マーカーについてのヘテロ接合性の喪失を導きうる（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｒ． Ｅ． ａｎｄ Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｍ． Ｓ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ Ｖｏｌ． ７１（８）： ３１７２−３１７６ １９７４）。本発明は、異なるｄｙａｄホモ接合変異体植物において見られる均等減数分裂１分割の産物は無配偶生殖の重要な成分であるアポマイオシスの特徴的な特徴を有する機能的な減数されていない胚のうを発生させることができるという発見に関連する。
【００１５】
本発明は、それらの胚遺伝子型が母系ゲノムの完全な二倍体補完物を含む種子を作出するために配偶子形成及び種子発達を操作するためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｏｅｃｈｅｒａ、Ｒｉｃｅ、Ｐｏｐｕｌｕｓ及び他の植物のＤＹＡＤ遺伝子、特にその変異体対立遺伝子、及びそれらの遺伝子産物の使用に関する。１の態様において、三倍体種子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及び他の植物型において作出される。
【００１６】
本発明はまたＤＹＡＤ遺伝子の変異体対立遺伝子及び遺伝子産物を用いたヘテロ植物の作出方法をも提供する。いくつかの態様において、上記植物及び種子は母系ゲノムの完全二倍体補完物を含み、及び父系ゲノムからの寄与を全く含まない、及びしたがって真のアポミクトを示す。これらの態様のいくつかの場合において、母系ゲノムに寄与する植物は所望の表現型を有する対立遺伝子の寄せ集めを有するハイブリッドであり、及び本発明に係る方法はその対立遺伝子の組み合わせの固定及び容易な繁殖を許容する。
【００１７】
本発明は母系ゲノムの完全二倍体補完物を含む種子の形成を導くＤＹＡＤ遺伝子及びその遺伝子産物の使用に関する。本発明は種なし果実を作出するために使用されうる三倍体植物を作出するために、マッピング研究のための三染色体系を構築するために、及び親植物のヘテロ接合性及び無配偶生殖の維持のために有用である。本発明において使用されるＤＹＡＤの対立遺伝子は減数されていない（二倍体）胚のうの形成を引き起こす。本発明はまた花粉発達に実質的に影響することなく減数されていない胚のうの形成を引き起こすためのＤＹＡＤ遺伝子の使用にも関する。本発明は、増大されたバイオマスを有する植物を作出する目的のために有用であろう、三倍体の自家受粉による、より高次の倍数体を作出するためのＤＹＡＤ遺伝子の使用にさらに関する。
【００１８】
本発明のさまざまな態様は本発明の異なる局面を示すであろう、及び本発明の異なる利点を提供しうることが理解されるべきである。必ずしも全ての態様が本発明の利点の全てを享受するわけではない。
【００１９】
定義：
句「核酸配列」は５’から３’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の重合体の構造をいう。二重鎖核酸の場合、「核酸配列」はもう一方の鎖上のその相補物を含む。
【００２０】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡの一重鎖又は二重鎖重合体（又はいくつかの場合、チオフォスフェート又はＰＮＡアナログの如きデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのアナログ又は上記ヌクレオチド塩基の誘導体を有するヌクレオチド）をいい、及び染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡ又はＲＮＡ（又はアナログ）の感染性重合体及び主に構造的役割を果たすＤＮＡ又はＲＮＡ（又はアナログ）を含む。
【００２１】
用語「ポリヌクレオチド配列」はしばしば「ポリヌクレオチド」と相互変換可能であるが、ときどき、分子自体よりむしろ、分子の配列の情報をいいうる。
「プロモーター」は使用可能につなげられた核酸の転写を指揮する核酸制御配列の並びとして定義される。本明細書中で使用されるとき、「植物プロモーター」は植物において機能するプロモーターである。プロモーターは、基礎的なポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントの如き、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた場合により、転写開始部位から何千塩基対も離れて位置されうる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターはほとんどの環境的及び発達的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導可能」プロモーターは環境的又は発達的調節下で活性であるプロモーターである。用語「使用可能につなげられる」は（プロモーター又は転写因子結合部位の配列の如き）核酸発現制御配列及び第二の核酸配列の間での機能的つながりをいい、ここで、上記発現制御配列は上記第二の配列に対応する核酸の転写を指揮する。
【００２２】
「発現カセット」は３の主なエレメント：ｉ）プロモーター；ｉｉ）上記プロモーターに使用可能につなげられ、及び上記発現カセットが細胞内に導入されるときその転写が前記プロモーターにより指揮される「コードポリヌクレオチド」又は「コード配列」と呼ばれうる第二のポリヌクレオチド；及びｉｉｉ）転写の停止を指揮し、及び前記第二のポリヌクレオチドのすぐ下流に位置されるターミネーターポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
用語「植物」は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、花、根等）、種子及び植物細胞及び同じものの子孫を含む。本発明に係る方法において使用されうるクラスの植物は一般的に、被子植物（単子葉及び双子葉植物）及び裸子植物を含む、形質転換技術の影響を受けやすいより高次の植物のクラスと同じくらい広い。それは倍数体、二倍体、及び半数体を含む、さまざまな倍数値の植物を含む。本発明のいくつかの態様において、上記植物は雌雄同株植物であることは好ましい。
【００２４】
ポリヌクレオチドは、それが異なる配列を有し、及び外来種から生ずる場合又は同じ種からでそのもともとの形態から改変される場合、生物又は第二のポリヌクレオチドと「異種」である。例えば、異種コード配列に使用可能につなげられたプロモーターは、プロモーターが由来する種とは異なる種からのコード配列又は同じ種からの場合、天然に起こる対立遺伝子変形とは異なるコード配列をいう。
【００２５】
個々の植物に「外因性の」ポリヌクレオチドは性交配による以外の手段により上記植物に導入されるポリヌクレオチドである。これが達成されうる手段の例は以下に示され、及び土壌細菌仲介形質転換、バイオリスティック法、エレクトロポーレーション等を含む。外因性核酸を含む上記植物はＲ１世代トランスジェニック植物とここで呼ばれる。性交配から又は自家受粉により生ずるトランスジェニック植物は上記植物の子孫である。
【００２６】
本発明において使用される「ＤＹＡＤ核酸」又は「ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列」は減数分裂の制御に関連するポリペプチドをコードする、及び突然変異されるとき、減数されていない雌性配偶体形成について無配偶生殖の局面を許容する核酸のサブ配列又は全長ポリヌクレオチド配列である。
【００２７】
「ＤＹＡＤ遺伝子」はホスト細胞内で、好ましくは植物内でＤＹＡＤ遺伝子産物の発現を提供するプロモーター及び他の転写及び翻訳制御配列を伴うＤＹＡＤ核酸を含む。
ＤＹＡＤ遺伝子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤ遺伝子（配列ＩＤ番号：１）によりコードされるポリペプチドと実質的な配列同一性を有する及びイネ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：６２７３３４１４）及び他の植物において同定されているポリペプチドをコードするタンパク質コード部分を含む転写産物を生成する植物遺伝子の１のクラスである。ＤＹＡＤ遺伝子はまたブラックコットンウッド及びトウモロコシにおいても同定されている（実施例９）。ＤＹＡＤ遺伝子は野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて単一コピーで存在する。さらに、それは生殖組織内の非常に小集団の細胞を構成する胞子母細胞においてのみ発現されるので、転写産物の豊富さは非常に低い。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤ遺伝子は減数分裂染色体組織化において重要な役割を果たすことが以前に示されている（Ａｇａｓｈｅ Ｂ．， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３ ２００２）。したがって、その機能はイネにおける親密に関連する遺伝子の存在により示されるように、他の植物種において高く保存されているようである。本出願におけるデータはＢｏｅｃｈｅｒａもまたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤ遺伝子に配列において親密に関連するＤＹＡＤ遺伝子を有することを確立する。
【００２８】
トランスジーンの発現及び内因性遺伝子の阻害（例えば、ＲＮＡ妨害、アンチセンス又はセンス抑制による）の両方の場合、当業者は使用されるポリヌクレオチド配列が、それが由来する又は阻害されるべきポリヌクレオチドの、遺伝子の配列に同一である必要はないが、単に「実質的に同一」でありうることを認識するであろう。以下に説明されるように、これらの実質的に同一の変形は用語ＤＹＡＤ核酸により特に含まれる。
【００２９】
ポリヌクレオチド配列が機能的なポリペプチドを作出するよう転写され及び翻訳される場合、当業者はコドン縮重のためにいくつかのポリヌクレオチド配列は同じポリペプチドをコードするであろうことを認識するであろう。これらの変形は用語「ＤＹＡＤ核酸」により特に含まれる。さらに、上記用語は本明細書中に開示されるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列に（以下に示されるように決定される）実質的に同一の、及び野生型ＤＹＡＤポリペプチドの変異体である又は（例えば、ＤＹＡＤポリペプチド中のアミノ酸の保存的置換から生ずる）ＤＹＡＤポリペプチドの機能を保持するポリペプチドをコードするそれらの配列を特に含む。さらに、変形は以下に示されるようにドミナントネガティブ変異体及びナンセンス変異体又は成熟前翻訳停止をもたらすフレームシフト変異体をコードするものでありうる。
【００３０】
２の核酸又はポリペプチドは２の分子における、それぞれ、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が以下に示されるように最大一致のために整列されるとき同じである場合、「同一で」あると言われる。２以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一で」又は「パーセント同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１を用いて又は手動整列及び視覚的観察により計測されるように、比較され及び比較ウィンドウにわたり最大一致のために整列されるとき、同じである又は同じである特定の割合のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する２以上の配列又はサブ配列をいう。配列同一性の割合がタンパク質又はペプチドに関して使用されるとき、同一でない残基位置はしばしば、アミノ酸残基が同様の化学特性（例えば、チャージ又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基について置換され、及びそれゆえ上記分子の機能的特性を変えない、保存的アミノ酸置換により異なることが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は上記置換の保存的性質について修正するために上方調節されうる。この調節を作出する手段は当業者に周知である。典型的には、これは完全ミスマッチよりむしろ部分ミスマッチとして保存的置換をスコアリングし、それによりパーセンテージ配列同一性を増大させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、及び非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は０〜１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．， ＵＳＡ）において実行されるように、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ４：１１−１７（１９８８）にしたがって計算される。
【００３１】
２の核酸又はポリペプチドの文脈における句「実質的に同一」は、以下の配列比較アルゴリズムの１を用いて又は手動整列及び視覚的観察により計測されるように比較ウィンドウにわたり最大一致のために整列されるとき、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０−９５％ヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有する配列又はサブ配列をいう。この定義はまた、試験配列が引用配列と実質的な同一性を有するとき実質的な配列又はサブ配列相補性を有する、試験配列の相補物をもいう。
【００３２】
配列比較のために、典型的に１の配列は試験配列が比較される引用配列としてはたらく。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験及び引用配列はコンピューターに入力され、必要な場合サブ配列コーディネートが示され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメーターが示される。プログラムパラメーターについてのデフォルト値は通常使用されるが、パラメーターについての代替の値が示されうる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメーターに基づいて、引用配列に比較した試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、「比較ウィンドウ」は連続位置、典型的に２０〜６００の、通常約５０〜約２００の、より通常には約１００〜約１５０の連続位置のセグメントについての引用を含み、ここで、２の配列が最適に整列された後、配列は同じ数の連続位置の引用配列に比較されうる。比較のための配列の整列方法は本分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）のホモロジー整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の同様の方法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピューターで処理される実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により又は手動整列及び視覚的観察により実施されうる。
【００３４】
有用なアルゴリズムの１の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは連続的な対様式の整列を用いて関連する配列の群から複数の配列整列を作出し、関係及びパーセント配列同一性を示す。それはまた上記整列を作出するために使用されるクラスタリング関係を示す系図又は樹状図をもプロットする。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ Ｄ． Ｆ．， ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｒ． Ｆ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． Ｖｏｌ． ３５：３５１−３６０（１９８７）の連続整列方法の簡易化法を使用する。使用される方法はＨｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）により示される方法と同様である。上記プログラムはそれぞれ最長５，０００ヌクレオチド又はアミノ酸の、３００配列までを整列しうる。上記複数整列手順は２の整列された配列のクラスターを作出する、２の最も類似の配列の対様式の整列で始まる。このクラスターはその後次に最も関連する配列又は整列された配列のクラスターに整列される。配列の２のクラスターは２の個々の配列の対様式の整列の単純な拡張により整列される。最終的な整列は一連の連続的な対様式の整列により達成される。上記プログラムは配列比較の領域についての特異的配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチドコーディネートを示すことにより及びプログラムパラメーターを示すことにより行われる。例えば、引用配列は以下のパラメーター：デフォルトギャップ重（３．００）、デフォルトギャップ長重（０．１０）、及び加重エンドギャップ用いてパーセント配列同一性関係を決定するために他の試験配列と比較されうる。
【００３５】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの他の例はＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）中に示されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎをとおして公けに入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムははじめに、データベース配列中の同じ長さのワードで整列されるときいくつかの正に評価された閾値スコアＴに合う又はそれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによりハイスコアリング配列対（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。Ｔは近隣ワードスコア閾値と言われる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ２１５： ４０３−４１０（１９９０））。これらのはじめの近隣ワードヒットはそれらを含むより長いＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するためのシードとしてはたらく。上記ワードヒットは累積整列スコアが増大されうる限り、それぞれの配列に沿って両方の方向に延長される。それぞれの方向の上記ワードヒットの延長は：上記累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちる；上記累積スコアが、１以上のネガティブ−スコアリング残基整列の蓄積のために０以下になる；又はいずれかの配列の末端に到達するとき止められる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは整列の感度及び速さを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９））整列（Ｂ）、１０の確率（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００３６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた２の配列の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１の類似性計測は、２のヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こりうる可能性の表示を提供する、最小合計可能性（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、引用核酸に対する試験核酸の比較における最小合計可能性が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、引用配列に類似であると考えられる。「保存的に改変された変形」はアミノ酸及び核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列について、保存的に改変された変形は同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸を又は上記核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸はあるタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるそれぞれの位置で、上記コドンはコードされるポリペプチドを変えることなく示される対応するコドンのいずれかに変えられうる。上記核酸変異は保存的に改変された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のそれぞれの核酸配列はまた核酸のそれぞれの可能なサイレント変異を示す。当業者は、核酸中のそれぞれのコドン（通常メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧを除いて）は機能的に同一の分子を生成するよう改変されうることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異はそれぞれ示される配列中に内在する。
【００３７】
「本質的に同一の配列」は配列中の変異が分子の意図される機能に影響しないものである。
アミノ酸配列について、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸を変える、付加する又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加は、上記変化が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすとき、「保存的に改変された変形」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は本分野において周知である。
【００３８】
以下の６群はそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００３９】
２の核酸配列又はポリペプチドは実質的に同一であるという表示は、第一の核酸によりコードされるポリペプチドは第二の核酸によりコードされるポリペプチドに対して起こされる抗体と免疫学的にクロス反応性であるということである。したがって、ポリペプチドは典型的に、例えば、２のペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第二のポリペプチドに実質的に同一である。２の核酸配列は実質的に同一であるという他の表示は、２の分子又はそれらの相補物は以下に示されるように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。
【００４０】
句「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」は、その配列が複合的な混合物（例えば、全細胞又はライブラリーＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在するとき、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のヌクレオチド配列にのみの分子の結合、二重鎖化又はハイブリダイズすることをいう。
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが典型的には核酸の複合的な混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしないであろう条件をいう。ストリンジェント（厳密な）条件は配列依存的であり、及び異なる状況において異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲なガイドはＴｉｊｓｓｅｎ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ， “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）中に見られる。一般的に、高ストリンジェントな条件は定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列についての熱融解点（Ｔm）より約５〜１０℃低いように選択される。低ストリンジェント条件は一般的にＴmより約１５〜３０℃低いように選択される。Ｔmは標的に相補的なプローブの５０％が平衡で上記標的配列にハイブリダイズする（定義されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下での）温度である（上記標的配列は過剰に存在するので、Ｔmで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、及び温度は短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃及び長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェントな条件はまたホルムアミドの如き不安定化剤の添加でも達成されうる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍ハイブリダイゼーションである。
【００４１】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、まだ実質的に同一である。例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより許容される最大コドン縮重を用いて作出されるとき、これは起こる。上記の場合、上記核酸は典型的に中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００４２】
本発明において、本発明において使用されるべきＤＹＡＤ核酸を含むゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは本明細書中に開示される核酸配列を用いてストリンジェントな条件下で標準のサザンブロットにおいて同定されうる。本開示の目的のために、上記ハイブリダイゼーションに好適なストリンジェントな条件は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション及び少なくとも約５０℃、通常約５５℃、約６０℃までの温度で２０分間の０．１×〜１×ＳＳＣ、好ましくは０．５×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ中での少なくとも１の洗浄又は同等の条件を含む条件である。陽性ハイブリダイゼーションは少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者は代替のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は同様のストリンジェントの条件を提供するために利用されうることを容易に認識するであろう。
【００４３】
２のポリヌクレオチドは実質的に同一であるというさらなる表示は、１対のオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅された引用配列がその後ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから試験配列を単離するために又は例えば、ノザン又はサザンブロットにおいて試験配列を同定するためにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブとして使用されうる場合である。
【００４４】
「植物ハイブリッド」は同じ植物種の２の栽培変種を交配することにより得られる植物として定義される。
「種間ハイブリッド」は異なる種の２の植物を交配することにより得られる植物として定義される。
生殖事件における「雌親」は種子を有する植物として定義される。
【００４５】
本発明はＤＹＡＤ遺伝子及びその産物並びに種子発達及び無配偶生殖の制御のための分子遺伝学的アプローチの適用を含む方法を提供する。本発明はさらに天然タンパク質のＣ−末端部分を欠くＤＹＡＤポリペプチドの切り取られた形態を発現する、及び減数されていない雌性配偶体の発達を引き起こし、一方で同時に花粉生存力分析及び雄性減数分裂における染色体分離の顕微鏡検査により決定されるように花粉発達は実質的に変えないＤＹＡＤ遺伝子の変異体対立遺伝子に関する。それはまた天然ＤＹＡＤポリペプチドのＣ−末端部分を欠くＤＹＡＤポリペプチドをコードするＤＹＡＤ遺伝子の雌性特異的変異体対立遺伝子についてのヌクレオチド配列にも関し、及び植物における変異体ポリペプチドのそのような発現は減数されていない雌性配偶体発達を導くが、花粉発達には実質的に影響しない。上記変異体対立遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの変異体対立遺伝子の場合には配列ＩＤ番号：５中のアミノ酸５０９〜アミノ酸６３９の間の天然ポリペプチド配列の部分の全て又は一部を欠くが、アミノ酸３９４までのポリペプチド配列をコードする領域全てを含むＤＹＡＤポリペプチドを発現しうる。さらに、それはまた配列ＩＤ番号：４中に与えられる配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする及び天然ＤＹＡＤポリペプチドのＣ−末端欠損誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供し、ここで、上記欠損は比較ウィンドウを用いる配列ＩＤ番号：５との比較により決定されるように配列ＩＤ番号：５中のアミノ酸５０９〜６３９の間の領域に対応する。Ｂｏｅｃｈｅｒａ、Ｒｉｃｅ、及びＰｏｐｕｌｕｓ ＤＹＡＤタンパク質の対応する部分は図１１の参照により同定されうる。本発明に係る組成物はまた天然ＤＹＡＤポリペプチド配列のＣ−末端欠損誘導体、並びに上記ＤＹＡＤポリペプチド及び植物細胞の核へ融合タンパク質を条件付きで輸送するグルココルチコイドホルモン受容体タンパク質の如きタンパク質配列から形成される、融合タンパク質及びそれらをコードする核酸をも含む。
【００４６】
本発明に係る方法は親の遺伝子型を保持する減数されていない雌性配偶子を作出するための植物におけるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現を含む。上記減数されていない雌性配偶子の作出は無配偶生殖を作出するために及び雑種強勢を固定するために並びに三倍体植物の作出のために有用である。本発明の１の態様において、ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列は形質転換のためのいくつかの周知の方法のいずれかにより植物のゲノムに導入されることができ、ここで、それはアンチセンスとして又は二重鎖ＲＮＡとして上記植物内で発現され、それにより内因性ＤＹＡＤ遺伝子の阻害を導き、及び減数されていない雌性配偶子の作出を引き起こす。本発明の他の態様において、ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列のＣ−末端欠損は発現カセットの部分として植物のゲノムに導入され、及び減数されていない雌性配偶体の形成を導き、一方で同時に花粉の発達は実質的に影響されないままである。減数されていない雌性配偶体形成を導く植物におけるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現はその後卵細胞の胚への単為生殖的発達により無配偶生殖種子を作出するために使用されうる。植物ハイブリッドにおける上記ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現は親の遺伝子型を保持する減数されていない雌性配偶体の形成を導き、それにより次の世代において雑種強勢の固定を導く。雑種強勢の固定は異なる遺伝子型の２の親栽培変種の間の交配にたよらなければならないことなしに自家受粉することによりハイブリッド種子の繁殖を許容しうるので、雑種強勢の固定は非常に有用である。
【００４７】
本発明のさらに他の態様は、無配偶生殖種子を作出するために使用されうる、減数されていない雌性配偶子の形成を導く植物種の種間ハイブリッドにおけるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現である。上記無配偶生殖種子の作出は１の植物種から他の種へ作物学的に有用な遺伝子を遺伝子移入するために有用である。本発明のまた他の態様はＤＹＡＤポリヌクレオチド配列又はＤＹＡＤポリペプチド配列の条件付きの又は制御された発現及び／又はそれらの活性を含む。上記条件付き発現は減数されていない雌性配偶子及びそれゆえ所望のときに限り無配偶生殖種子の作出を促進するために使用されうる。植物におけるポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の条件付き発現又は活性に影響する方法は本分野において周知であり、及び非限定的にエタノール誘導可能遺伝子発現（Ｄｅｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， Ｖｏｌ． ３６（６）：９１８−９３０， ２００３）、活性のステロイドホルモン誘導可能制御（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．， Ｌｌｏｙｄ Ａ． Ｍ． ａｎｄ Ｄａｖｉｓ Ｒ． Ｗ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ Ｖｏｌ．８８（２３）：１０４２１−１０４２５，１９９１）、及び発現のテトラサイクリン仲介制御（Ｂｏｈｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． Ｖｏｌ．９（１）：８７−９５， １９９９）を含む。
【００４８】
以下の実施例６はｄｙａｄ変異体表現型を示す植物の同種集団が発達されうる本発明の１の態様を示す。同様のことはＤＹＡＤ ＲＮＡｉ又はアンチセンス構築物が条件付きプロモーターの制御下で発現される条件付きＤＹＡＤ ＲＮＡｉ又はアンチセンスを使用することにより達成されうる。本発明の他の表明はＤＹＡＤ遺伝子の補完的コピーがｄｙａｄの変異体対立遺伝子についてホモ接合である遺伝学的なバックグラウンドにおいて、条件付きプロモーターの制御下で植物において発現されるものである。本発明のまた他の表明は、トランスアクチベーターの制御下で発現され及びここで第一の植物はトランスアクチベーターを欠く、プロモーターの制御下で発現されるＤＹＡＤ ＲＮＡｉ又はアンチセンス構築物を有する第一の植物を、トランスアクチベーターを発現する第二の植物に交配することを使用しうる。
【００４９】
本明細書中に示されるように調製される単離された配列は例えば、内因性ＤＹＡＤ遺伝子発現を抑制する又は変えるために、いくつかの技術において使用されうる。植物におけるＤＹＡＤ遺伝子発現又はＤＹＡＤ活性の調節は例えば、無配偶生殖種子を作出するシステムの部分として、特に有用である。
【００５０】
ＤＹＡＤ核酸の単離
一般的に、以下に示される組換えＤＮＡ技術における名称及び研究室手順は本分野において周知の及び通常使用されるものである。標準の技術がクローニング、ＤＮＡ及びＲＮＡ単離、増幅及び精製のために使用される。一般的にＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応は製造者の仕様書にしたがって行われる。これらの技術及びさまざまな他の技術は一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．，（１９８９）にしたがって行われる。
【００５１】
ＤＹＡＤ核酸の単離はいくつかの技術により達成されうる。例えば、本明細書中に開示される配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーにおいて所望の遺伝子を同定するために使用されうる。ゲノムライブラリーを構築するために、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントが、例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いてランダム断片化により作出され、及びベクターＤＮＡとライゲーションされ、適切なベクターに導入されうるコンカテマーを形成する。ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、ｍＲＮＡは胚珠の如き所望の器官から単離され、及びＤＹＡＤ遺伝子転写産物を含むｃＤＮＡライブラリーはｍＲＮＡから調製される。あるいは、ｃＤＮＡはＤＹＡＤ遺伝子又はホモログが発現される他の組織から抽出されたｍＲＮＡから調製されうる。
【００５２】
ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーはその後本明細書中に開示されるクローニングされたＤＹＡＤ遺伝子の配列に基づいたプローブを用いてスクリーニングされうる。プローブは同じ又は異なる植物種において相同遺伝子を単離するためにゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズするために使用されうる。あるいは、ＤＹＡＤポリペプチドに対して生成された抗体はｍＲＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されうる。
【００５３】
あるいは、問題の核酸は増幅技術を用いて核酸サンプルから増幅されうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術はゲノムＤＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから直接的にＤＹＡＤ遺伝子の配列を増幅させるために使用されうる。ＰＣＲ及び他のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法はまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするために、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作出するために、核酸シークエンシングのために又は他の目的のためにも有用でありうる。ＰＣＲの一般的な概略のために、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． （Ｉｎｎｉｓ， Ｍ， Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｄ．， Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， Ｔ．， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）を参照のこと。
【００５４】
植物組織からＤＹＡＤ配列を同定するために適切なプライマー及びプローブは本明細書中に提供される配列の他のＤＹＡＤ関連遺伝子又はそれらがコードするタンパク質との比較から作出される。例えば、Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉ ＤＹＡＤはイネからの親密に関連する遺伝子と比較されうる（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．５０９１７２４３）。これらの技術を用いて、当業者は適切なプライマー及びプローブ配列を調製するために本明細書中に開示される遺伝子又はポリペプチドにおいて保存される領域を同定しうる。ＤＹＡＤ関連遺伝子において保存される領域に特異的にハイブリダイズするプライマーは広く分岐する植物種からの配列を増幅するために使用されうる。上記に開示される条件を用いる標準の核酸ハイブリダイゼーション技術はそれから全長ｃＤＮＡ又はゲノムクローンを同定するために使用されうる。
【００５５】
ＤＹＡＤ活性又は遺伝子発現の制御
ＤＹＡＤ遺伝子は減数分裂及び雌性配偶体の倍数性の制御に関連しているので、内因性ＤＹＡＤ活性又は遺伝子発現の阻害はいくつかの事情において有用である。例えば、上記に示されるＣ−末端欠損を有する対立遺伝子の使用による発現の阻害又はＤＹＡＤ活性の改変は（「種なし果実」と本明細書中で呼ばれる）種なし又は小／退化種子の果実の生成のために使用されうる。ほとんどの植物種において、三倍体の作出は減数分裂における不均衡な染色体分離のために生殖細胞の形成において欠陥を引き起こし、及び種子の欠損又は小／退化種子の形成を導く。内因性ＤＹＡＤ発現又は活性の阻害は倍数性の制御を許容しうる。したがって、ＤＹＡＤ活性が阻害される又は改変される本発明に係る植物のいくつかの態様において、種子は欠損し又は退化し、及び種なし果実が作出される。
【００５６】
本発明に係る核酸の他の使用は無配偶生殖植物系（すなわち、無性生殖プロセスが胚珠において起こる植物、無配偶生殖の議論についてはＫｏｌｔｕｎｏｗ Ａ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ．５：１４２５−１４７３（１９９３）を参照のこと）の開発における。無配偶生殖は伝統的な交配によっては容易に維持されえない複雑なヘテロ接合遺伝子型を選択する及び固定する新規手段を提供する。したがって、例えば、所望の形質（例えば、ハイブリッド生長力）を有する新規ハイブリッド系が得られ及び容易に維持されうる。
【００５７】
当業者は、いくつかの方法がＤＹＡＤ活性又は遺伝子発現を調節するために使用されうることを認識するであろう。ＤＹＡＤ活性は遺伝子、転写、転写後、翻訳又は翻訳後レベルで植物細胞において調節されうる。これらのレベルのそれぞれでＤＹＡＤ活性を調節するための技術は一般的に当業者に周知であり、及びいくつかは以下に簡単に議論される。
【００５８】
植物遺伝子に遺伝的突然変異を導入する方法は周知である。例えば、種子又は他の植物材料は標準の技術にしたがって、突然変異誘発性化学物質で処理されうる。上記化学物質は、非限定的に、以下のもの：ヂエチル硫酸塩、エチレンイミン、エチルメタンスルフォン酸塩及びＮ−ニトロソ−Ｎ−エチル尿素を含む。あるいは、例えば、Ｘ−線、ガンマ線又はファストニュートロンの如き源からのイオン化照射が使用されうる。ＤＹＡＤ遺伝子配列中に突然変異を有する植物はＤＹＡＤヌクレオチド配列を増幅するためのＰＣＲプライマーを用いた突然変異された植物の集められた集団の分子スクリーニング、続いてＤＹＡＤポリヌクレオチド配列中に遺伝的突然変異を有する植物を同定するためのＰＣＲ産物の分析により同定されうる。特定の遺伝子配列中に突然変異を有する植物のスクリーニング及び同定方法は示されている（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ．， Ｂｒａｄｌｅｙ Ｔ． Ｊ． ａｎｄ Ｃｏｍａｉ Ｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｖｏｌ． １３５（２）：６３０−６３６， ２００４）。
【００５９】
あるいは、相同組換えはｉｎ ｖｉｖｏでＤＹＡＤ遺伝子を特異的に欠損させる又は変えることにより標的化された遺伝子破壊を誘発するために使用されうる（一般的に、Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｋｌａｒ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４６： １２２１−１２３８（１９９７）及びＸｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０： ２４１１−２４２２（１９９６）を参照のこと）。相同組換えは植物において示されている（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０： ２７７−２８４（１９９４）， Ｓｗｏｂｏｄａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １３： ４８４−４８９（１９９４）； Ｏｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ７３４６−７３５０（１９９３）；及び Ｋｅｍｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９：８０２−８０３（１９９７））。
【００６０】
本発明に係る遺伝子に相同組換え技術を適用することにおいて、本明細書中に開示されるものの如き（５’上流、３’下流、及び遺伝子内領域を含む）ＤＹＡＤ遺伝子配列の選択された部分における突然変異はｉｎ ｖｉｔｒｏで作出され、及びその後標準の技術を用いて所望の植物に導入される。相同組換えの効率は使用されるベクターに因ることが知られるので、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４３０３−４３０７（１９９４）；及びＶａｕｌｏｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ４： ２４７−２５５（１９９５）により示されるようにヂシストロン遺伝子標的化ベクターの使用はトランスジェニック植物における変えられたＤＹＡＤ遺伝子発現の選択の効率を増大させるために便利に使用される。上記突然変異された遺伝子は相同組換え及び野生型遺伝子の標的化置換がトランスジェニック植物細胞において起こり、ＤＹＡＤ活性の抑制をもたらすであろうような様式で、標的野生型遺伝子と相互作用するであろう。
【００６１】
あるいは、末端上に二つのヘアピンキャップを有する二重鎖コンフォメーション中のＲＮＡ及びＤＮＡ残基の連続的な範囲から成るオリゴヌクレオチドが使用されうる。上記ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は標的ＤＹＡＤ遺伝子の配列と整列するように、及び所望のヌクレオチド変化を含むように設計される。染色体外Ｔ−ＤＮＡプラスミド上のキメラオリゴヌクレオチドの導入は少数の形質転換された植物細胞中でキメラ分子により方向付けられる効果的な及び特異的なＤＹＡＤ遺伝子変換をもたらす。この方法はＣｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３８６−１３８９（１９９６）及びＹｏｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：２０７１−２０７６（１９９６）中に示される。
【００６２】
遺伝子発現はトランスポゾン又はＴ−ＤＮＡ配列を含む構築物で植物細胞を形質転換することにより組換えＤＮＡ技術を用いて不活性化されうる。これらの方法により調製されるＤＹＡＤ変異体は標準の技術にしたがって同定される。例えば、変異体はＰＣＲにより又はＤＹＡＤ ｍＲＮＡの存在又は不在を検出することにより、例えば、ノザンブロット又は逆転写後にＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出されうる。変異体はまた繁殖力、雌性減数分裂、及び大胞子発達における変化について分析することによっても選択されうる。
【００６３】
本明細書中に示されるように調製される単離された核酸配列はまたさまざまなレベルで内因性ＤＹＡＤ遺伝子発現を制御するためにいくつかの技術において使用されうる。本明細書中に開示される配列からのサブ配列は転写、ＲＮＡ蓄積、翻訳等を制御するために使用されうる。
【００６４】
多数の方法が植物において遺伝子発現を阻害するために使用されうる。例えば、ＲＮＡ妨害（ＲＮＡｉ）技術は便利に使用されうる。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントは２のコピーが通常５〜２０００ヌクレオチド、好ましくは３０〜５００ヌクレオチド、及びより好ましくは５０〜２００ヌクレオチド長でありうるスペーサーにより分離される逆リピートとしてクローニングされる。上記逆リピートは両方のコピーが転写され、及びその長さの全体又は部分に沿って自己相補的であるＲＮＡ種を生ずるであろうように、プロモーターに使用可能につなげられ、ターミネーターが続く。上記構築物でその後植物は形質転換され、及び二重鎖ＲＮＡが生成される。
【００６５】
他の場合として、アンチセンス技術はＤＹＡＤ遺伝子発現を阻害するために便利に使用されうる。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントはクローニングされ、及びＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるであろうようにプロモーターに使用可能につなげられる。上記構築物でその後植物は形質転換され、及びＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。植物細胞において、アンチセンス抑制はＲＮＡ翻訳の抑制を含む全てのレベルの遺伝子調節で（Ｂｏｕｒｑｕｅ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． （Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）１０５： １２５−１４９（１９９５）； Ｐａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４８． Ｃｏｈｎ， Ｗ． Ｅ． ａｎｄ Ｋ． Ｍｏｌｄａｖｅ（Ｅｄ．）． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．， ＵＳＡ； Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ． ｐ．１８１−２３８； Ｈｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． （Ｓｈａｎｎｏｎ） １２７：６１−６９（１９９７）を参照のこと）及び問題のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることにより（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ３２：７９−８８（１９９６）； Ｐｒｉｎｓ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂａｃｈ Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １４１：２２５９−２２７６（１９９６）； Ｍｅｔｚｌａｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ８８：８４５−８５４（１９９７）， Ｓｈｅｅｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：８８０５−８８０９（１９８８）、及びＨｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８０１，３４０号を参照のこと）はたらきうることが示唆されている。
【００６６】
一般的に導入されるべき核酸セグメントは内因性ＤＹＡＤ遺伝子又は抑制されるべき遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であろう。しかしながら、上記配列は発現を阻害するために完全に同一である必要はない。本発明に係るベクターは、阻害効果が標的遺伝子に対してホモロジー又は実質的なホモロジーを示す遺伝子のファミリー内の他の遺伝子に適用するように設計されうる。
【００６７】
アンチセンス抑制のために、導入される配列はまた第一転写産物又は完全にプロセスされたｍＲＮＡのいずれかに比較して全長である必要もない。一般的に、より高いホモロジーはより短い配列の使用を補うために使用されうる。さらに、導入される配列は同じイントロン又はエクソンパターンを有する必要はなく、及び非コードセグメントのホモロジーは同等に有効でありうる。通常、約３０又は４０ヌクレオチド〜およそ全長のヌクレオチドの配列が使用されるべきであるが、少なくとも約１００ヌクレオチドの配列が好ましく、少なくとも約２００ヌクレオチドの配列がより好ましく、及び約５００〜約１７００ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【００６８】
多数の遺伝子領域はＤＹＡＤ遺伝子発現を抑制するために標的化されうる。上記標的は、例えば、コード領域、イントロン、エクソン／イントロン接合点からの配列、５’又は３’非翻訳領域等を含みうる。いくつかの態様において、上記構築物は調節タンパク質のその細胞−及び／又は組織−特異的発現に必要とされるＤＹＡＤ遺伝子配列に結合する能力を消去するよう設計されうる。上記転写調節配列は５’−、３’−又は上記遺伝子のコード領域内のいずれかに位置されうる、及び遺伝子転写を促進し（正の調節エレメント）又は抑制し（負の調節エレメント）うる。これらの配列は当業者に周知の標準の欠損分析を用いて同定されうる。一旦、上記配列が同定されたら、これらの配列を標的にするアンチセンス構築物は特定の組織において、例えば、発達中の胚珠及び／又は種子において、遺伝子転写を制御するために植物内に導入される。
【００６９】
オリゴヌクレオチドに基づいた三重ヘリックス形成はＤＹＡＤ遺伝子発現を破壊するために使用されうる。三重鎖ＤＮＡはＤＮＡ転写及び複製を阻害し、部位特異的突然変異を作出し、ＤＮＡを切断し、及び相同組換えを誘発しうる（例えば、Ｈａｖｒｅ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：７３２４−７３３１（１９９３）； Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：１２８８−１２９６（１９９５）； Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１０５３９−１０５４８（１９９６）； Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｂｅｒｌｉｎ）７５：２６７−２８２（１９９７）を参照のこと）。三重ヘリックスＤＮＡはアンチセンス調節のために同定されたのと同じ配列を標的化するために使用されうる。
【００７０】
触媒ＲＮＡ分子又はリボザイムもまたＤＹＡＤ遺伝子の発現を阻害するために使用されうる。事実上どんな標的ＲＮＡとも特異的に対を形成し、及び特異的な位置でフォスフォヂエステル骨格を切断し、それにより上記標的ＲＮＡを機能的に不活性化するリボザイムを設計することは可能である。この切断を行うことにおいて、上記リボザイムはそれ自体変えられず、及びしたがってリサイクルし及び他の分子を切断することができ、そのことはそれを真の酵素にする。アンチセンスＲＮＡ内のリボザイム配列の包含はそれらにＲＮＡ−切断活性を与え、それにより上記構築物の活性を増大させる。したがって、リボザイムはアンチセンス調節のために同定されたのと同じ配列を標的化するために使用されうる。
【００７１】
多数のクラスのリボザイムが同定されている。リボザイムの１のクラスは植物内で自己切断及び複製することができるいくつかの小環状ＲＮＡに由来する。上記ＲＮＡは単独で（ウイロイドＲＮＡ）又はヘルパーウイルスと共に（サテライトＲＮＡ）複製する。例はアボカドサンブロッチウイロイドからのＲＮＡ及びタバコ輪紋病ウイルス、アルファルファ一過性条斑病ウイルス、ベルベットタバコモザイク病ウイルス、テリミノイヌホオズキモザイク病ウイルス及び地下クローバーモザイク病ウイルスからのサテライトＲＮＡを含む。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計及び使用はＺｈａｏ ａｎｄ Ｐｉｃｋ Ｎａｔｕｒｅ ３６５：４４８−４５１（１９９３）；Ｅａｓｔｈａｍ ａｎｄ Ａｈｌｅｒｉｎｇ Ｊ． Ｕｒｏｌｏｇｙ １５６：１１８６−１１８８（１９９６）； Ｓｏｋｏｌ ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ５：３６３−３７１（１９９６）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：２４１−２５１（１９９７）；及びＨａｓｅｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３４：５８５−５９１（１９８８）中に示される。
【００７２】
他の抑制方法はセンス共抑制である。センスの方向に配列される核酸の導入は標的遺伝子の転写をブロックするための効果的な手段であることが示されている。内因性遺伝子の発現を調節するためのこの方法の使用の例のために、Ａｓｓａａｄ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２２：１０６７−１０８５（１９９３）； Ｆｌａｖｅｌｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３４９０−３４９６（１９９４）；Ｓｔａｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔ． ７９：３−１２（１９９７）； Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９（１９９０）；及び米国特許第５，０３４，３２３号、第５，２３１，０２０号、及び第５，２８３，１８４号を参照のこと。
【００７３】
上記抑制効果は導入された配列がそれ自体コード配列を含まないが、内因性配列の第一転写産物中に存在する配列に相同のイントロン又は非翻訳配列のみを含む場合に起こりうる。導入された配列は一般的に抑制されるよう意図される内因性配列に実質的に同一であろう。この最小限の同一性は典型的に約６５％超であろうが、より高い同一性は内因性配列の発現のより効果的な抑制を発揮しうる。約８０％超の実質的により大きな同一性は好ましいが、約９５％〜絶対同一性は最も好ましいであろう。アンチセンス調節のように、上記効果はホモロジー又は実質的なホモロジーを示す同様の遺伝子ファミリー内の他のタンパク質に適用するはずである。
【００７４】
センス抑制のために、絶対未満の同一性を必要とする導入された配列もまた第一転写産物又は完全にプロセスされたｍＲＮＡのいずれかに比較して全長である必要はない。これは過剰発現体であるいくつかの植物の同時作出を避けるために好まれうる。全長よりも短い配列におけるより高い同一性はより長い、より低い同一性の配列を補う。さらに、導入される配列は同じイントロン又はエクソンパターンを有する必要はなく、及び非コードセグメントの同一性は同等に有効であろう。通常、アンチセンス調節について上記に留意される大きさ範囲の配列が使用される。さらに、アンチセンス調節について留意されるのと同じ遺伝子領域が共抑制技術を用いて標的化されうる。
【００７５】
あるいは、ＤＹＡＤ細胞特異的遺伝子発現に必要とされるタンパク質を消去することはＤＹＡＤ活性を調節しうる。したがって、調節タンパク質の発現及び／又はＤＹＡＤ遺伝子発現を制御する配列は本明細書中に示される方法を用いて調節されうる。
【００７６】
他の方法はＤＹＡＤ ｍＲＮＡ翻訳の遺伝子工学ｔＲＮＡ抑制の使用である。この方法は成熟前停止コドンを含む標的遺伝子をトランスアクチベートするためのサプレッサーｔＲＮＡの使用を含む（Ｂｅｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：５８７−５９５（１９９７）；及びＣｈｏｉｓｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１： ５９７−６０４（１９９７）を参照のこと）。アンバー停止コドンを含む構成的に発現されるＤＹＡＤ遺伝子を含む植物系がはじめに作出される。それぞれ細胞型特異的プロモーターの指揮下にｔＲＮＡサプレッサー遺伝子構築物を含む、複数の植物系もまた作出される。上記ｔＲＮＡ遺伝子構築物はその後ＤＹＡＤ系に交配され、標的化された様式でＤＹＡＤ活性を活性化する。これらのｔＲＮＡサプレッサー系はまたどんな型の遺伝子の発現も同じ細胞又は組織型に標的化するために使用されうる。
【００７７】
それらの他のタンパク質に結合する能力において欠陥があるＤＹＡＤポリペプチドのドミナントネガティブ形の作出は内因性ＤＹＡＤ活性を阻害する便利な手段である。このアプローチは、内因性タンパク質と欠陥複合体を形成し、及びそれにより上記複合体が適切に形成することを妨げる変異ＤＹＡＤポリペプチドをコードする構築物での植物の形質転換を含む。上記変異ポリペプチドはアミノ酸置換、追加、欠失等により第一構造レベルで天然配列とは異なりうる。これらの改変は最終的な改変されたタンパク質鎖を作出するためにいくつかの組み合わせで使用されうる。標的遺伝子を不活性化するためのドミナントネガティブ変異体の使用はＭｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：８３１−８４５（１９９６）中に示される。
【００７８】
ＤＹＡＤタンパク質のそれ自身と又は他のタンパク質と相互作用する能力に影響するための他の策はＤＹＡＤに特異的な抗体の使用を含む。この方法において、ＤＹＡＤ特異的Ａｂｓの細胞特異的発現は抗体：抗原認識をとおして機能的ドメインを不活性化するために使用される（Ｈｕｐｐ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ８３：２３７−２４５（１９９５）を参照のこと）。
【００７９】
ＤＹＡＤ遺伝子発現を高めるための本発明に係る核酸の使用
本明細書中に示されるように調製される単離された配列はまた内因性遺伝子発現を高める又は増大させるために特定のＤＹＡＤ核酸の発現を導入するために使用されうる。高められた発現はまた、例えば、植物が種子を有するのを妨害することにより、栄養器官の生長を増大させるために使用されうる。遺伝子の過剰発現が所望される場合、異なる種からの所望の遺伝子は可能性のあるセンス抑制効果を減少させるために使用されうる。
【００８０】
当業者は、本発明に係る遺伝子によりコードされるポリペプチドは、他のタンパク質と同様に、異なる機能を行う異なるドメインを有することを認識するであろう。したがって、上記遺伝子配列は、上記タンパク質の所望の機能ドメインが発現される限り、全長である必要はない。
【００８１】
改変されたタンパク質鎖はまた当業者に周知の及び以下に詳細に示されるさまざまな組換えＤＮＡ技術を利用して容易に設計されうる。例えば、上記鎖はアミノ酸置換、追加、欠失等により第一構造レベルで天然配列とは異なりうる。これらの改変は最終的な改変されたタンパク質鎖を作出するためにいくつかの組み合わせで使用されうる。
【００８２】
組換えベクターの調製
上記技術において単離された配列を使用するために、植物細胞の形質転換に好適な組換えＤＮＡベクターが調製される。広くさまざまなより高度な植物種を形質転換する技術は周知であり、及び技術及び科学文献中に示される。例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）を参照のこと。所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、例えば、全長タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列又は細胞内局在化配列へのＤＹＡＤの融合タンパク質又は切り取られたＤＹＡＤタンパク質は形質転換された植物の意図される組織中で上記遺伝子からの配列の転写を指揮するであろう転写及び翻訳開始調節配列と好ましく結合されるであろう。
【００８３】
例えば、過剰発現のために、再生された植物の全ての組織中で遺伝子の発現を指揮するであろう植物プロモーター断片が使用されうる。上記プロモーターは「構成的」プロモーターと本明細書中で呼ばれ、及びほとんどの環境条件及び発達又は細胞分化の状態下で活性である。構成的プロモーターの例はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域を含む。１’−又は２’−プロモーターは土壌細菌の根頭癌腫病細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡ、及び当業者に知られるさまざまな植物遺伝子からの他の転写開始領域に由来する。上記遺伝子は、例えば、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：１２５−１３９（１９９６））、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４３１４７、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５１：１９６−２０３（１９９６））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのステアロイル−アシル担体タンパク質脱飽和酵素をコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ７４７８２、Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４：１１６７−１１７６（１９９４））、トウモロコシからのＧＰｃ１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ１５５９６、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ２０８：５５１−５６５（１９８９））、及びトウモロコシからのＧｐｃ２（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ４５８５５、Ｍａｎｊｕｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：９７−１１２（１９９７））を含む。
【００８４】
あるいは、上記植物プロモーターは特異的組織におけるＤＹＡＤ核酸の発現を指揮しうる又はそうでなければより正確な環境又は発達制御下にありうる。誘発可能プロモーターにより転写に影響しうる環境条件の例は嫌気性条件、高温又は光の存在を含む。上記プロモーターは「誘発可能」又は「組織特異的」プロモーターと本明細書中で呼ばれる。当業者は、組織特異的プロモーターは標的組織以外の組織において使用可能につなげられた配列の発現を駆動しうることを認識するであろう。したがって、本明細書中で使用されるとき、組織特異的プロモーターは標的組織において優先的に発現を駆動するが、また他の組織においてもいくらかの発現を引き起こしうるものである。条件付き発現、組織特異的発現又は上記２の組み合わせはまたトランスアクチベーターを用いることによっても達成されることができ、ここで、ＤＹＡＤ核酸は異種の又は合成トランスアクチベーターにより駆動される合成プロモーターの制御下に置かれうる。トランスアクチベーターの組織特異的及び／又は条件付き発現はその後ＤＹＡＤ核酸の対応する発現を駆動しうる。植物において使用されているトランスアクチベート可能な及び誘発可能な系の例はｍＧａｌ４：ＶＰ１６／ＵＡＳ、ｐＯｐ／ＬｈＧ４、ＧＶＥ／ＶＧＥ、ＧＶＧ、ｐＯｐ６／ＬｈＧＲ、及びＸＶＥを含む（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４５： ６５１−６８３（２００６）中に概略される）。
【００８５】
発達制御下のプロモーターの例は果実、種子又は花の如き、ある組織においてのみ（又は主としてのみ）転写を開始するプロモーターを含む。胚珠、花又は種子において核酸の発現を指揮するプロモーターは本発明において特に有用である。本明細書中で使用されるとき、種子特異的プロモーターは種子組織において発現を指揮するものである。上記プロモーターは、例えば、（卵細胞又は中心細胞の如き、母系組織又は雌性配偶体中で発現を指揮するプロモーターを含む）胚珠特異的、胚特異的、内胚乳特異的、珠皮特異的、種子の殻特異的又はそれらのいくつかの組み合わせでありうる。例はＲｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ８３：７３５−７４２（１９９５）中に示される胚珠特異的ＢＥＬ１遺伝子からのプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ３９９４４）、及び雄性減数母細胞特異的ＤＵＥＴ遺伝子からのプロモーター（Ｒｅｄｄｙ Ｔ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １３０（２４）：５９７５−５９８７，２００３）を含む。他の好適な種子特異的プロモーターは以下の遺伝子：トウモロコシからのＭＡＣ１（Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４２：１００９−１０２０（１９９６））、トウモロコシからのＣａｔ３（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｌ０５９３４， Ａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２：１０１３１−１０３８（１９９３））、トウモロコシからのオレオシン１８ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０５２１２，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：１９８１−１９８７（１９９４））、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ９３２１５）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのオレオシンをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｚ１７６５７）、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡｔｍｙｃｌ（Ｕｒａｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２：５７１−５７６（１９９６））、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの２Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子ファミリー（Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５：４９３−５０５（１９９４））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのオレオシン２０ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ６３９８５）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのｎａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０２７９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ＪＢＬ ２６： １２１９６−１３０１（１９８７））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのｎａｐｉｎ遺伝子ファミリー（Ｓｊｏｄａｈｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔａ １９７： ２６４−２７１（１９９５））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からの２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子（Ｄａｓｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １３３：３０１−３０２（１９９３））、大豆からのオレオシンＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１８）及びオレオシンＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１９）をコードする遺伝子及び大豆からの低分子量硫黄リッチタンパク質をコードする遺伝子（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．， Ｇｅｎｅｔ． ２４６：２６６−２６８（１９９５））に由来する。
【００８６】
さらに、本明細書中に開示されるＤＹＡＤ遺伝子からのプロモーター配列は本発明に係るＤＹＡＤポリヌクレオチド又は異種の配列の発現を駆動するために使用されうる。適切なポリペプチド発現が所望される場合、コード領域の３’−末端のポリアデニル化領域は含まれるべきである。上記ポリアデニル化領域は天然遺伝子に、さまざまな他の植物遺伝子に又はＴ−ＤＮＡに由来しうる。
【００８７】
本発明に係る遺伝子からの配列（例えば、プロモーター又はコード領域）を含むベクターは典型的に植物細胞上で選択可能表現型を与えるマーカー遺伝子を含むであろう。例えば、上記マーカーは殺生物剤耐性、特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性の如き抗生物質耐性又はクロロサルフロン又はＢａｓｔａに対する耐性の如き除草剤耐性をコードしうる。
【００８８】
トランスジェニック植物の作出
本発明に係るＤＮＡ構築物はさまざまな慣用の技術により所望の植物ホストのゲノムに導入されうる。例えば、上記ＤＮＡ構築物は植物細胞プロトプラストのエレクトロポーレーション及びマイクロインジェクションの如き技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接的に導入されうる又は上記ＤＮＡ構築物はＤＮＡ粒子衝撃の如き衝撃方法を用いて植物組織に直接的に導入されうる。
【００８９】
マイクロインジェクション技術は本分野において知られ、及び科学及び特許文献中に十分に示される。ポリエチレングリコール沈殿を用いたＤＮＡ構築物の導入はＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ Ｊ． ３：２７１７−２７２２（１９８４）中に示される。エレクトロポーレーション技術はＦｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５８２４（１９８５）中に示される。衝撃形質転換技術はＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３（１９８７）中に示される。
【００９０】
あるいは、上記ＤＮＡ構築物は好適なＴ−ＤＮＡフランキング領域と結合され、及び慣用の土壌細菌の根頭癌腫病細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ホストベクターに導入されうる。土壌細菌の根頭癌腫病細菌ホストの有毒機能は、細胞が上記細菌に感染するとき、植物細胞ＤＮＡへの上記構築物及び近隣マーカーの挿入を指揮するであろう。二種混合型ベクターの無力化及び使用を含む、土壌細菌の根頭癌腫病細菌仲介形質転換技術は科学文献中に十分に示される。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４９６−４９８（１９８４）、及びＦｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：４８０３（１９８３）を参照のこと。
【００９１】
上記形質転換技術のいずれかにより導かれる形質転換された植物細胞は形質転換された遺伝子型及びしたがって増大された種子の大きさの如き所望の表現型を有する植物全体を再生するために栽培されうる。上記再生技術は、典型的には所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤及び／又は除草剤マーカーに頼って、組織培養生育培地中のある植物ホルモンの操作に頼る。培養プロトプラストからの植物再生はＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐｐ．１２４−１７６， ＭａｃＭｉｌｌｉｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３；及びＢｉｎｄｉｎｇ， Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ， ｐｐ．２１−７３， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９８５中に示される。再生はまた植物カルス、外植片、器官又はそれらの部分からも得られうる。上記再生技術はＫｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ． ３８：４６７−４８６（１９８７）中に一般的に示される。
【００９２】
本発明に係る核酸は本質的にどんな植物に対しても所望の特性を与えるために使用されうる。したがって、本発明はＡｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｅｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｈｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｔｉｓ、Ｖｉｇｎａ、及びＺｅａ属からの種を含む、広い範囲の植物にわたり使用を有する。
【００９３】
当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、及び使用可能であることが確認された後、それは性交配により他の植物に導入されうることを認識するであろう。いくつかの標準の交配技術のいずれかが交配される種に因り使用されうる。
【００９４】
本発明に係る植物から得られる種子は所望の特性を有する植物を同定する周知の手順にしたがって分析されうる。アンチセンス又は他の技術がＤＹＡＤ遺伝子発現を制御するために使用される場合、ＲＴ−ＰＣＲ又はノザンブロット分析が所望の植物をスクリーニングするために使用されうる。さらに、受精非依存的生殖発達の存在が検出されうる。植物は、例えば、胚なし種子を形成する、受精後に発育不全となる種子を形成する又は受精なしで果実を結ばせる能力についてスクリーニングされうる。これらの手順は部分的には使用される特定の植物種に因るであろうが、当業者に周知の方法にしたがって行われるであろう。
以下の実施例は本発明の例示のために与えられ、及び本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００９５】
実施例１：ｄｙａｄ変異体は欠陥雌性稔性及び減数された種子セットを示す
ｄｙａｄ変異体をＥＭＳ変異Ｍ２植物の集団中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの不稔性変異体についてのスクリーニングにおいて単離した（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２７（１）：１９７−２０７（２０００））。相反交配による稔性の分析は、上記変異体は雌性不稔性であるが、雄性稔性であることを示した。雌性胞子生殖及び胚珠発達の分析は、ｄｙａｄは欠陥雌性減数分裂を経験し、減数分裂細胞周期をとおした欠陥のある進行のために単一の減数分裂分割、続いて大多数の胚珠における雌性配偶子の発達の停止及び失敗をもたらしたことを示した。減数母細胞の染色体スプレッドの観察による雌性減数分裂の分析は、雌性減数分裂はｄｙａｄ変異体において異常であることを示した：染色体はシナプスを形成することに失敗し、及び通常減数分裂１で起こりうる減数分割の代わりに等分割を経験した（Ａｇａｓｈｅ Ｂ．， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。
【００９６】
図１中に示されるように、ｄｙａｄ変異体中の種子セットは野生型と比較されるとき非常に減数されており、及び変化は異なるｄｙａｄ変異体植物の間で種子セットの程度において観察された。数の点での均一性は上記集団中の植物の間で観察されなかったので、上記種子セットは時々起こるものであり及びランダムであった。種子セットについてのモードは植物当たり１〜１０であったが、最大約２７５までに及び、２７５はめったに観察されなかった（５００植物中に１）。
【００９７】
実施例２：雄性減数分裂及び稔性はｄｙａｄ変異体において正常である
花粉生存能力をＡｌｅｘａｎｄｅｒ染色を用いて調べ、及び花粉は完全に生存能力があり、及び野生型に匹敵することがわかった（図２）。減数母細胞の染色体スプレッドの分析による雄性減数分裂の調査は、雄性減数分裂は正常であり、及び四分子の半数体胞子の生成をもたらしたことを示した（図３）。雄性減数分裂、雄性稔性、及び花粉発達及び機能はそれゆえｄｙａｄ変異体において正常であった。一方、雌性減数分裂はｄｙａｄにおいて異常である。相同染色体のシナプス形成が起こるのは見られず、及び野生型雌性減数分裂の減数分裂１分割（図３Ｃ）はｄｙａｄにおいて等分割により置換される（図３Ｅ）。
【００９８】
実施例３：ｄｙａｄ変異体から得られた種子は発芽し、三倍体植物を与える
ｄｙａｄ変異体において生成される種子が少数の雌性減数母細胞における正常な減数分裂から生じ、正常な機能的胚のうを生ずるよう進み、正常な機能的胚のうがその後半数体花粉により受精され種子に発達することは可能である。これが事実であった場合、これらの種子はｄｙａｄ変異体において起こる異常な雌性減数分裂から逃避した種子を代表しうる。この可能性を調べるために、ｄｙａｄ植物からの種子（ｎ＝１６９）を発芽させ、及び高い効率（＞９０％）で発芽し及び異常な種苗を与えたいくつか（１０％）を除いては形態学的に正常な種苗を生成することを見出した。子葉の形、対称性及び数における変化の例は発芽する種苗において観察されなかった。これは、減数分裂１における染色体のランダム分離を経験し、種苗段階である範囲の発達異常を示すより高い割合の異数性子孫をもたらすＡｔＳｐｏ１１−１及びＡｔＤｍｃ１の如き、他の減数分裂変異体に由来する種苗とは対照的である（Ｇｒｅｌｏｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．， Ｖｏｌ ２０：５８９−６００，２００１，Ｃｏｕｔｅａｕ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ． １１（９）：１６２３−１６３４，１９９９）。土壌への移行に際しての続く種苗の栄養器官の生長もまた正常であり、及び栄養器官の生長が親ｄｙａｄ変異体植物はもちろん野生型に同様である植物を生じた。観察された主な相違は、上記植物がとう立ちし始めたときの花の大きさにおいてであった。大多数の植物（ｎ＝４１／５２）において花の大きさにおける相対的増大は野生型に対して観察された。増大した花の大きさは可能性として生長力における増大又は好ましい環境の影響に帰することができる。上記植物は制御された環境において生育されるので、私たちは後者の可能性を除外した。花器官の大きさにおける増大についての他の可能性のある理由は倍数性における増大でありうる。倍数性における増大は栄養器官及び花の構造、特に花粉粒の大きさにおける増大により表される（Ａｌｔｍａｎｎ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ． Ｖｏｌ． １３：６５２−６５６，１９９４）。ランダムに摘まれた植物からの花のつぼみを体細胞中の及び雄性減数母細胞中の染色体の分析によりそれらの倍数性の値について調べた。減数分裂染色体スプレッドの調査により、１７／１９の場合において、上記植物は三倍体であることが発見され、及び残りの２は二倍体であることがわかった（図４）。花粉発達及び雄性減数分裂はｄｙａｄ変異体において正常であるが、一方で減数雌性減数分裂は等分割により置換されるので、これらの結果は、三倍体である大多数の上記種子は正常な半数体精子による減数されていない（二倍体）卵細胞の受精から生じ、及び少数の胚珠における正常な雌性減数分裂からは生じない、すなわち、上記大多数の種子は異常な減数分裂から逃避した種子を代表しないことを示す。
【００９９】
実施例４：ｄｙａｄに由来する三倍体植物は全てのヘテロ接合マーカーの保持を示す
ｄｙａｄ変異体において形成された三倍体種子は、ｄｙａｄにおいて起こる等しい雌性減数分裂と一致しうる、正常な半数体花粉による減数されていない胚のうの受精の産物でありうる。上記減数されていない胚のうが大胞子母細胞の等分割の産物から生ずる減数されていない大胞子から形成され、ここで、染色体は一価として残り、及び組換えを経験しない場合、上記減数されていない胚のうの遺伝子型は二倍体親植物のそれと同一であろう。それゆえ、上記親植物が分子マーカーについてヘテロ接合である場合、三倍体子孫もまたそのマーカーについてヘテロ接合であろう。セントロメアに結合されていないマーカーがヘテロ接合状態で考えられる場合、組換えの完全な不在において、親のヘテロ接合性の１００％伝達は生ずる雌性配偶子及び三倍体子孫において達成されるであろう。組換え及び交差が起こる場合、１００％ヘテロ接合性は生ずる三倍体子孫において維持されないであろう。セントロメアに結合されていないマーカーについては、減数されていない胚のうにおいてホモ接合性を３３％の頻度で、及び三倍体子孫において１６．７％の頻度で期待することができるが、一方で組換えの完全な不在においてはホモ接合体は全くないであろう。ヘテロ接合性の喪失を伴わない減数されていない胚のうの形成は無配偶生殖を作出すること及び雑種強勢の固定のために高く所望される。私たちはｄｙａｄ変異体植物の三倍体子孫中でヘテロ接合性の喪失を計測するためにマイクロサテライトを使用した。ｄｙａｄ変異体植物を野生型Ｎｏｓｓｅｎ（Ｎｏ−Ｏ）及びｄｙａｄ変異体Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）生態型の間での交配の分離するＦ２集団において同定した。５のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ染色体のそれぞれにわたり分布し、及びセントロメアに結合しない（＞３５ｃＭ）候補マーカーをＴＡＩＲデータベースから得た（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）。Ｆ２集団を作出するために使用される親植物を多形性を確かめるために調べ、及び上記結果に基づいて私たちは遺伝子型５０ Ｆ２ｄｙａｄ変異体植物に対する４の異なる染色体上の５の異なるマーカー（表１）を選択し、及びそれぞれの植物がヘテロ接合であるそれらのマーカーを同定する。自家受粉させた種子を個々に５０ Ｆ２植物から集め、及びさまざまな数の同胞から成る５０の異なるファミリーとして生育させた。これは５０ファミリーにわたり分布される全部で１９６の植物を与えた。それぞれのファミリーの全てのメンバーは、親植物がヘテロ接合であるそれらのマーカーについて遺伝子タイピングされ、それぞれのマーカーについて５０ Ｆ２ファミリーの全てにわたり分布される７４〜１１９植物を与えた。
【０１００】
表１：ヘテロ接合性及び組換えの喪失を計測するためのｄｙａｄ植物の子孫のマーカー分析。
カラム６中の括弧内のaの印はそのマーカーについて分析された全ての植物のホモ接合体の割合を示す。
【表１】
【０１０１】
スクリーニングされた１９６の植物から、私たちは親植物がヘテロ接合である少なくとも１のマーカーについてホモ接合である３５の植物を得た。これらの３５植物のうちの２２の倍数性を減数分裂染色体スプレッドを行うことにより決定した。２１は二倍体であり、及びもう一つは１３染色体を有する高二倍体であることがわかった。したがって、上記分析にしたがって、ヘテロ接合性の喪失は二倍体においてのみほとんど排他的に見つけられた。ヘテロ接合性の喪失を示さなかった植物のうち、１５植物を別々のＦ２ファミリーからランダムに選択し、及びそれらの倍数性について調べた。１５全てが三倍体であることがわかった。
【０１０２】
上記結果はそれゆえ、二倍体ｄｙａｄ変異体植物からの子孫の大多数のクラスを構成する三倍体においてヘテロ接合性の喪失はないことを示す。三倍体においてヘテロ接合性の喪失を発見することができなかったことはまたそれらの形成についての代替の可能性のある機構、つまり多精、すなわち、またヘテロ接合性の喪失を予想するであろう２の別々の雄性配偶子による半数体雌性配偶子の受精の可能性をも排除する。私たちの発見は、ｄｙａｄ変異体植物の三倍体子孫は親植物の遺伝子型を保持する減数されていない胚のうの受精から生ずることを示す。減数されていない胚のうの形成は無配偶生殖の鍵となる局面である。
【０１０３】
実施例５：Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉからのＤＹＡＤホモログの単離及び機能的特徴付け
条件的に無配偶生殖のＢｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ Ｄｉｐｌｏｉｄ Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ及びＴｒｉｐｌｏｉｄ Ｃｏｌｏｒａｄｏ（Ｎａｕｍｏｖａ Ｔ． Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １４：１９５−２００，２００１）からのＤＹＡＤホモログの３ｋＢゲノムコード領域をＢｈｏ５Ｂａｍ（配列ＩＤ番号：３９）及びＢｈｏ３Ｂａｍ（配列ＩＤ番号：４０）プライマーを用いてクローニングした。ＢｈＤＹＡＤゲノムクローン（配列ＩＤ番号：１６）をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤプロモーターに使用可能につなげ、及び補完について試験するためにｄｙａｄ変異体植物を形質転換するために使用した。上記ＢｈＤＹＡＤ ｃＤＮＡをまた増幅し及びシークエンスした（配列ＩＤ番号：１７）。土壌細菌仲介ｉｎ ｐｌａｎｔａ減圧浸潤形質転換はｄｙａｄについてヘテロ接合であるＦ１植物に発現構築物を動員させた。私たちは４２の形質転換体を得、そのうち９の形質転換体はｄｙａｄ位置の側面に位置するＣＡＰＳ及びマイクロサテライトマーカーにより決定されるようにｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてホモ接合であった（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。９の形質転換体のうち４の形質転換体は、完全な種子セットを含むことがわかった十分に伸長した長角果（図５）により判断されうるｄｙａｄ変異体表現型の補完を示した。残りの５植物はおそらく共抑制のために不稔性であった。
【０１０４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の生長
ｄｙａｄ変異体を含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ株はより初期に示されるとおりであった（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖｏｌ．１２７（１）：１９７−２０７（２０００））。マイクロサテライトマーカー分析について使用されるＦ２集団は示されるように（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖｏｌ．１２７（１）：１９７−２０７（２０００））株Ｎｏ−Ｏ（Ｎｏｓｓｅｎ 生態型）及びＣｏｌ−０生態型バックグラウンドにおけるｄｙａｄ変異体の間の交配に由来した。植物を示されるように（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖｏｌ．１２７（１）：１９７−２０７（２０００））制御された環境で生育させた。
【０１０５】
ペトリ皿で種子を発芽させるために、上記種子を１０分間エタノールで表面滅菌し、続いてそれらを０．０２５％塩化水銀（ＩＩ）で５分間処理した。さらに、上記種子を塩化水銀（ＩＩ）の痕跡を除去するために滅菌水で３回洗浄した。上記種子をなまぬるい０．５％トップアガー中に再懸濁し、及び２％スクロースで補充されたＭＳアガープレート（０．７％）上に均一に広げた。上記プレートを薄層流フード中で１時間乾燥させ、及び上記プレートをパラフィルムで密閉し、及び４℃の低温室で層化のために３日間維持した。その後、上記プレートを生育チャンバーに移した。発芽頻度をその２週間後にカウントした。
【０１０６】
ポット中で種子を生育させるために、生育中の植物のために使用される合成培地を等しい割合のＳｏｉｌｒｉｔｅ： Ｐｅｒｌｉｔｅ： Ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ（Ｋｅｌｔｅｃｈ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ｌｔｄ．， Ｋａｍａｔａｋａ ５７４ １０８、 Ｉｎｄｉａ）を混合することにより調製した。上記ポット混合物を毛細管上昇を許容する底に穴をあけられたポットに均等に適用し、及び上記ポットを、１ｍｌ（１０００×）Ｍｉｎｏｒ Ｓａｌｔｓ：（Ｈ３ＢＯ３（７０ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１４ｍＭ）、ＣｕＳＯ４（０．５ｍＭ）、ＺｎＳＯ４（１ｍＭ）、ＮａＭｏＯ４（０．２ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＣｏＣｌ２（０．０１ｍＭ））がリットル当たり添加された、Ｍａｊｏｒ Ｓａｌｔｓ：ＣａＣｌ２（４ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１．５ｍＭ）、ＫＮＯ３（１８．８ｍＭ）、ＮＨ４ＮＯ３（２０．６ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２５ｍＭ ｐＨ５．６）、Ｆｅ−ＥＤＴＡ（２０ｍＭ）を含む１×ＭＳ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に浸漬した。上記種子を上記ポットの表面上に均等に広げ、及びサランラップで覆い、及び層化のために４〜８℃で３日間維持し、及びその後生育チャンバーに移した。移植の場合、上記ポットを種苗が土壌培地に移された後サランラップで覆い、生育チャンバー中に直接入れた。一旦上記植物が鉢植えミックス中に確立されたら、上記サランラップを除去した。水やりを蒸留水を用いて規則的な間隔で行った。
【０１０７】
種子セット分析
Ｃｏｌ−０生態型バックグラウンド中にｄｙａｄ変異を有するＦ２分離集団をｄｙａｄホモ接合植物中の種子セットの頻度をスコアリングするために使用した。ｄｙａｄ変異体植物を上記植物が花を咲かせ終わるそれらの最終段階まで生育させた。この段階後、水やりを長角果が収穫完熟に達するようｗｉｔｈｅｌｄさせた。その間、黄色くなった及びこなごなになりそうな最も低い長角果を個々に裂け開き、及び存在する場合は種子を単一の植物ベースで収穫した。そのようにして、必要な種子を可能性のある種子損失を避けるために規則的な間隔で収穫した。最後に、回収した種子を単一の植物ベースで集め、植物当たりの種子の総数をカウントした。
【０１０８】
花粉生存力
葯中の小胞子についての生命力染色を示されるように（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｍ． Ｐ．， Ｓｔａｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．４４（３）：１１７−１２２，１９７１）行った。
【０１０９】
減数分裂スプレッド
雄性及び雌性減数分裂スプレッドの分析は示されるとおりである（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。
【０１１０】
植物ＤＮＡ単離
マイクロサテライトマーカー分析のためのゲノムＤＮＡを、少しの改変を伴うＤｅｌｌａｐｏｒｔａ Ｓ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｐ．， Ｖｏｌ．１：１９−２１（１９８３）により示される方法にしたがって単離した。約５００ｍｇの葉組織を１．５ｍｌエッペンドルフ管中に個々の植物から集め、及び液体窒素中で急速冷凍した。その後上記組織を微小乳棒を用いて細かい粉末になるまでひいた。この粉末に２００μｌの新たに調製した抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１．４％ ＳＤＳ、及び１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）を添加し、及び微小乳棒で細かくホモジェナイズした。その後等体積の２×ＣＴＡＢを添加し、及び上記混合物をおだやかにヴォルテックスした。その後上記混合物を振騰水槽中で６５℃で５分間インキュベートした。その後上記サンプルを冷却させ、及び等体積の２４：１ クロロフォルム：イソアミルアルコールを添加し、及びおだやかに混合し、及び１３０００ｒｍｐで１０分間遠心分離した。ＤＮＡを含む水相を新しいエッペンドルフ管に移し、及び２／３体積の氷で冷却したイソプロパノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。上記ＤＮＡを４℃で１３０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によりペレット化した。上記ＤＮＡペレットを７０％エタノール洗浄し、及び上記ペレットを３０分間風乾し、及びＤＮＡｓｅフリーＲＮＡｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）を含む５０μｌの滅菌水又はＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中に懸濁した。
【０１１１】
マーカー分析
Ｃｏｌ−０及びＮｏ−Ｏ生態型の親調査に基づいて、セントロメアに理にかなって結合されていない、４の異なる染色体からの５のマイクロサテライトマーカーを選択した。これらのマーカーをあるマーカーについてヘテロ接合であるｄｙａｄ植物を選択するためにＦ２（Ｎｏ−Ｏ×Ｃｏｌ−０（ｄｙａｄ））分離集団について使用した。これらのｄｙａｄ植物からの種子を集め、及びそれぞれの子孫が特定の母ｄｙａｄ植物の同胞を構成するよう個々のペトリ皿中で発芽させた。そのようにして、あるマーカーについてヘテロ接合であるさまざまな植物からの同胞についてのデータをマーカー分析について共に考慮した。
【０１１２】
マイクロサテライトマーカー及びそれらの位置のリストは表１中に示されるとおりである。マイクロサテライトを増幅するために使用されるプライマー配列はＴＡＩＲウェブサイトからである（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）：
ｎｇａ１６２
ｎｇａ１６２Ｆ 配列ＩＤ番号：６
ｎｇａ１６２Ｒ 配列ＩＤ番号：７
ｎｇａ２２５
ｎｇａ２２５Ｆ 配列ＩＤ番号：８
ｎｇａ２２５Ｒ 配列ＩＤ番号：９
ｎｇａ１６８
ｎｇａ１６８Ｆ 配列ＩＤ番号：１０
ｎｇａ１６８Ｒ 配列ＩＤ番号：１１
ｎｇａ１１０７
ｎｇａ１１０７Ｆ 配列ＩＤ番号：１２
ｎｇａ１１０７Ｒ 配列ＩＤ番号：１３
ｎｇａ６
ｎｇａ６Ｆ 配列ＩＤ番号：１４
ｎｇａ６Ｒ 配列ＩＤ番号：１５
【０１１３】
ＰＣＲを２ｍＭ ＭｇＣｌ、０．２ｍＭ それぞれのｄＮＴＰ、１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）、及び５ｐｍｏｌｅｓの前向き及び逆向きフランキングプライマーを含む１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中で５５℃のアニーリング温度で７２℃で２０秒間の伸長で行った。ＰＣＲ産物を８％ポリアクリルアミドゲル上で１５０Ｖで３時間分析し、及び臭化エチヂウムで染色し、及びＳｙｎｇｅｎｅゲルドキュメンテーションシステム（Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ． ＵＫ）を用いて捕えた。
【０１１４】
植物材料
Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉの条件的無配偶生殖二倍体Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ及び三倍体Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓはＫｉｍ Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ（Ｎａｕｍｏｖａ Ｔ． Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １４：１９５−２００，２００１）からの好意的な贈与であった。植物をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓについて示される培地を含むポットで生育させ、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓについての条件と同一の条件下で生育させた。
【０１１５】
ＤＹＡＤプロモーターのクローニング
１．８ｋｂのＤＹＡＤプロモーター領域をプライマーｐｇ２ｒ４（配列ＩＤ番号：４８）及びＰＤＹＢＡＭ（配列ＩＤ番号：４７）を用いてＣｏｌ−０生態型から増幅し、及び生成物を製造業者の教示によりｐＧＥＭＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【０１１６】
Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉからのＤＹＡＤホモログのクローニング
Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉからのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤホモログのゲノムコード領域（ＢｈＤＹＡＤ）を５’末端上にＢａｍＨＩサイトを有するプライマー：Ｂｈｏ５ＢＡＭ（配列ＩＤ番号：３９）及びＢｈｏ３ＢＡＭ（配列ＩＤ番号：４０）で増幅した。生ずる３ｋｂ断片をｐＧＥＭＴにクローニングした。
【０１１７】
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤプロモーター下でＢｈＤＹＡＤを駆動する二種混合型ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００の構築
ＢｈＤＹＡＤを３ｋｂ ＢａｍＨＩ断片としてｐＧＥＭＴから放出させ、及び植物選択可能マーカーヒグロマイシンを有するｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにクローニングした。方向をプライマーＢＤＹ３（配列ＩＤ番号：３６）及びＯＣＳＲ（配列ＩＤ番号：３８）を用いてチェックした。１．６ｋｂ ＤＹＡＤプロモーター領域（配列ＩＤ番号：２２）をｐＧＥＭＴベクターからＳａｃＩ断片として放出させ、及びｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクター中のＢｈＤＹＡＤの上流に挿入した。ＢｈＤＹＡＤゲノム配列についてのプロモーターの方向をプライマーｉｓｍｒ４（配列ＩＤ番号：３７）及びｂｄｙ１（配列ＩＤ番号：３５）を用いて確認した。
【０１１８】
三親交配
上記構築された二種混合型ベクターｐＣＡＭＢＩＡの土壌細菌（ＡＧＬ１）への移行は示されるように（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））三親交配によった。
【０１１９】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の形質転換
ＢｈＤＹＡＤの補完分析のために、Ｃｏｌ−０×ｄｙａｄのＦ１植物をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤプロモーターにより駆動されるＢｈＤＹＡＤを有する構築物で形質転換した。土壌細菌仲介ｉｎ ｐｌａｎｔａ減圧浸潤形質転換をＢｅｃｈｔｏｌｄ Ｎ． ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｇ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ８２：２５９−６６（１９９８）にしたがって行った。
【０１２０】
形質転換体の選択
減圧浸潤されたＦ１植物からのＴ０種子を２０μｇ／ｍｌヒグロマイシンを有する０．８％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、１ｍＭ ＫＮＯ３及び１％ Ｓｕｃｒｏｓｅを含むペトリ皿上にまいた。３日間の冷却層化後、上記プレートを生育チャンバーに移した。ヒグロマイシンに対して耐性である形質転換体は十分に伸長した根、直立した胚軸及び十分に広がった子葉の葉によって早くも移行後５日で同定されうる。選択された形質転換体をヒグロマイシンを含むＭＳプレートにさらに移し、及び耐性が確立された後、それらを最終的に土壌培地に移した。さらに、上記植物を先に示されるようにｂｄｙ３及びＯＣＳＲプライマーを用いて挿入物の存在についてチェックした。
【０１２１】
ｄｙａｄ位置での接合性についての遺伝子タイピング
分離ｄｙａｄＦ２集団からの３の遺伝子型を共ドミナントＣＡＰＳマーカー（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ Ａ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ． Ｍ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， Ｖｏｌ． ４（２）：４０３−４１０， １９９３）及び変動マイクロサテライトにより同定した。ｄｙａｄ変異体対立遺伝子のフランキング配列はＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ生態型に由来し、及び野生型対立遺伝子からのフランキング配列はＣｏｌｏｍｂｉａ生態型配列を有する。したがって、これらのフランキング配列中のＳＮＰｓをｄｙａｄ位置のいずれかの側に密接に結合される及びフランキングするＣＡＰｓマーカー（ＫＮＥＦ（配列ＩＤ番号：３１）及びＫＮＥＲ（配列ＩＤ番号：３２）、ＫＫＦ（配列ＩＤ番号：３３）及びＫＫＲ（配列ＩＤ番号：３４））及びＤＹＡＤに密接に結合されるマイクロサテライトマーカープライマー（ＫＭＦ（配列ＩＤ番号：２９）及びＫＭＲ（配列ＩＤ番号：３０））を開発するために利用した（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。上記マーカーを用いたｄｙａｄ位置での遺伝子タイピングは示されるとおりであった（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。
【０１２２】
ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成
二倍体Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ植物からの十分に発達した単一のつぼみ（芽）を製造業者の教示によるＴｒｉＺｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるトータルＲＮＡ単離のために使用した。４μｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｃｈｏｉｃｅシステム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いたはじめの鎖ｃＤＮＡ合成のために使用した。上記ｃＤＮＡをプライマー５ＲＦ３（配列ＩＤ番号：４１）及びＢｈｏ３ＢＡＭ（配列ＩＤ番号：４０）を用いることによりクローニングのためにさらに増幅させた。生ずる１．９ＫＢ断片をｐＧＥＭＴにクローニングし、及びシークエンスした。結果は配列ＩＤ番号：１７として配列リスト中に示される。対応するＤＹＡＤタンパク質のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号：１８中に示される。
【０１２３】
実施例６：ＤＹＡＤの条件付き対立遺伝子の構築及びｄｙａｄ変異体表現型を示すトランスジェニック植物の同種集団の開発
ＤＹＡＤ遺伝子の条件付き対立遺伝子を構築するために使用される策はＤＹＡＤのＣ−末端にラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）のホルモン結合ドメイン（配列ＩＤ番号：２７）を融合すること、及びｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてホモ接合である（ｄｙ／ｄｙ）植物のゲノムに上記融合構築物を統合することに基づいた。上記ＧＲドメインはステロイドホルモンの不在下では細胞質局在を与えるが、一方でＤＹＡＤの活動部位は核内であるので、ＤＹＡＤ−ＧＲ融合タンパク質はそれだけではｄｙａｄ変異体を補完することができない。しかしながら、ステロイドホルモンの存在下では、上記融合タンパク質は細胞質結合部位から放出され、及び核へ移行することができるようになり、そこでそれはｄｙａｄ変異体を補完しうる。上記構築における段階は以下のものであった：上記植物二種混合型ベクターｐＢＩ１０１．３を、ＧＵＳ受容体遺伝子を除去し、及びＧＲドメインを含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片でそれを置き換えるために、ＢａｍＨＩ＋ＳａｃＩで消化した（Ａ．Ｍ． Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， ４３６−４３９（１９９４））。
【０１２４】
生ずるプラスミドをｐＢＩ１０１．３：：ＧＲと名付けた。次に、プライマーＤｙＣＦ（配列ＩＤ番号：４３）及びＤｙＰＢ（配列ＩＤ番号：４２）（停止コドンを改変する及びＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩのための制限酵素部位を導入するための配列を含む）をＤＹＡＤ遺伝子の３０４ｂｐＣ−末端領域をＰＣＲ増幅するために使用した。改変された配列を２１６ｂｐ ＰｓｔＩ断片として、Ｐ１クローンＭＦＧ１３（Ａｃｃ番号ＡＢ０２５６２１）のコーディネート９６８４〜３８７８に対応する全ＤＹＡＤ遺伝子を含む５．８ｋｂゲノムクローン（配列ＩＤ番号：２８）を有するｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄプラスミドにクローニングし、ｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ*を得た。生ずるプラスミドは、その停止コドンＴＧＡはＧＧＧにより置き換えられた及びまた上記置き換えられたコドンと共にＢａｍＨＩサイトを有するＤＹＡＤ遺伝子を含んだ。ＭＦＧ１３のヌクレオチド９６８４〜９４１６を含むｐＢＳＩＩ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ*からの２６９ｂｐ ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片をＳａｌＩ＋ＢａｍＨＩでの消化後、ｐＢＩ１０１．３：：ＧＲにクローニングした。９４１７〜５３３５からのＤＹＡＤの残りの部分をその後ｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ*からのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片として前の段階の産物にクローニングし、ＤＹＡＤのＣ−末端へのＧＲドメインのフレーム内融合をもたらした。ｐＢＩ１０１．３：：ＤｙａｄΔＧＲと名付けられた最終的なプラスミドは図６中に示される。
【０１２５】
上記構築物をヘルパーＥ． ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１［ｐＲＫ２０１３］を用いて三親交配により土壌細菌株ＡＧＬ１に導入した。Ｔ−ＤＮＡ領域でｉｎ−ｐｌａｎｔａ形質転換により、ｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてヘテロ接合である（＋／ｄｙ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（Ｔ０）を形質転換した（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ Ｎ． ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｇ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．８２：２５９−６６，１９９８）。カナマイシン耐性Ｔ１種苗をカナマイシン（５０ｍｇ／リットル）を含むＭＳアガープレート上に種子をまくことにより選択し、及び耐性表現型を確認するためにＭＳ＋カナマイシンプレートに移した。形質転換体をＤｙＣＦ（配列ＩＤ番号：４３）及びＧＲｒｅｖ（配列ＩＤ番号：４４）プライマーを用いてＰＣＲによりさらに同定した。確認されたカナマイシン耐性種苗を土壌に移し、及び成体段階まで生育させた。とう立ち及びはじめの８〜１０の長角果の発達後、植物に１０μＭデキサメタゾン＋０．０１５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を毎日噴霧することに加えて、１０μＭデキサメタゾンを伴って３日毎に水やりをした。デキサメタゾン処理前に不稔性を示したいくつかの植物はデキサメタゾン処理の開始５〜７日後に稔性長角果を発達したことが留意された。植物材料の一部を挿入物のコピー数を決定するためにサザン分析に使用し、及びまたｄｙａｄ位置に密接に結合した及びフランキングするＰＣＲに基づいたＣＡＰＳマーカーを用いてｄｙａｄ位置について遺伝子タイピングした。上記ｄｙａｄ変異体はＬｅｒバックグラウンド中でもともと単離され、及びその後Ｃｏｌ株に遺伝子移入された。それゆえ、ＣＡＰＳマーカーのＬｅｒ対立遺伝子はｄｙａｄ変異体について特徴的であるが、一方でＣｏｌ対立遺伝子は野生型の表示である（図７）。単一コピー挿入物を少なくとも１コピーのｄｙａｄ変異体対立遺伝子を有する植物の中で同定し、及びこれらの植物からの種子をＭＳ＋カナマイシンプレート上にまいた。カナマイシン耐性種苗を土壌に移し、及びｄｙａｄ位置について遺伝子タイピングした。ｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてホモ接合である植物を同定し、及び成体になるまで生育させた。とう立ち後、全ての植物に、はじめの８〜１０の花の開花までのはじめの相の間水をやり、その後上記に示されるようにデキサメタゾンを含む溶液を伴って水やりをした。条件付き不稔性を示した系を異なる単一コピー挿入物をスクリーニングすることにより同定した。例として、図８中に示される１の系番号３３は、その全てが生殖生育のはじめの相の間不稔性を示し、及びデキサメタゾン処理後稔性になったｄｙａｄ変異体植物（ｄｙ／ｄｙ）を与えた。デキサメタゾン処理前に単離されたつぼみ（芽）からの胚珠はｄｙａｄ変異体表現型を示したが、一方でデキサメタゾン処理後に単離されたものは野生型表現型を示した（図９）。種子をホモ接合ｄｙａｄ変異体植物から集め、Ｔ３ファミリーを得、及びＤＹＡＤ−ＧＲ挿入物についてホモ接合であるＴ３ファミリーを全てカナマイシン耐性種苗を与えるファミリーについてスクリーニングすることにより同定した。これらの結果はＤＹＡＤの条件付き対立遺伝子の構築及び植物へのその導入、それによる１セットの条件（デキサメタゾンの不在）下でｄｙａｄ変異体表現型及びデキサメタゾンを与えられた（又は噴霧された）とき野生型表現型を示す植物を与えることを例示する。これらの結果はまたその全てがｄｙａｄ変異体表現型を示す植物の均一な集団の発達を可能にする。
【０１２６】
この研究において使用されたグルココルチコイド受容体ドメイン配列（９１４ｂｐ）（配列ＩＤ番号：２７）
【化１】
【０１２７】
ｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ中のＳａｌＩ断片としてクローニングするために使用されるＤｙａｄゲノム配列（５８０７ｂｐ）（配列ＩＤ番号：２８）
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【０１２８】
実施例７：三倍体（３ｎ）であるｄｙａｄ変異体の自家受粉種子は雌性配偶子からの二倍体（２ｎ）寄与を含む
相反交配を四倍体（４ｎ）及び二倍体（２ｎ）野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の間で行った。両方の場合で、生成される種子は三倍体である。しかしながら、雄親が四倍体であり、及び雌親が二倍体であったとき、生成された種子は大きく、一方で雄親が二倍体であり、及び雌親が四倍体であったとき、種子は縮んでいた。これらの結果は図１０中に示され、及び種子のそれぞれのカテゴリーについての１００種子の重量は表２中に示される。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
これらの発見は先行分野において知られることを再生する（Ｓｃｏｔｔ ＲＪ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５， ３３２９−３３４１， １９９８）。いずれの機構の理論にもとらわれることなく、種子発達の調節における父性及び母性ゲノムの不等は、全ての種子の間での源の公平な分布を好むことにより胚の生育を制限する母親、及びその適応度はより大きな源の蓄積により増大されるそれぞれの胚の間の源配分についての競合から生ずるとして、親−子孫衝突理論にしたがって説明されている（Ｈａｉｇ Ｄ． ａｎｄ Ｗｅｓｔｏｂｙ Ｍ．， Ａｍ． Ｎａｔ． Ｖｏｌ．１３４：１４７−１５５，１９８９）。Ｈａｉｇ Ｄ． ａｎｄ Ｗｅｓｔｏｂｙ Ｍ．， Ａｍ． Ｎａｔ． Ｖｏｌ． １３４：１４７−１５５，１９８９にしたがって、胚において母系で発現される刷り込みされる遺伝子は胚の生育を制限するようはたらきうるが、一方で父系で発現される遺伝子は胚の増大される生育を好みうる。したがって、余分の父系ゲノム同等物を含む種子は胚の生育を促進する過剰な量の遺伝子産物のために正常より大きいであろうが、一方で余分の母系ゲノム同等物を含む種子は胚の生育を制限する過剰な量の遺伝子産物のために正常より小さいであろう。
【０１３１】
ｄｙａｄ変異体の自家受粉種子中の母系及び父系寄与を扱うために、上記種子を大きさについて分析した。ｄｙａｄ変異体植物から得られた自家受粉種子は大きさにおいて不均一であり、及び図１０中に示されるように３のカテゴリー：大きい、正常、及び縮んでいるのいずれかに分類された。７の個々のｄｙａｄ変異体植物からの大きさクラスの分布は以下に示される：
【表３】
【０１３２】
それぞれのクラスからの種子を複数の植物からサンプリングし、発芽させ、及び苗になるまで生育させた。それぞれの植物の倍数性を減数分裂スプレッド中の染色体カウントにより決定した。結果は以下の表４中に示される：
【表４】
括弧内の数字はそれぞれのカテゴリー内で調べられた全植物の割合を示す。
【０１３３】
これらのデータは、ほとんどの三倍体が大きさにおいて縮んでおり、及び種子の縮んだカテゴリーの大きな部分を構成することを示す。ほとんどの三倍体が縮んでいるという観察は、それらが過剰な母系寄与（２ｎ）から生じ、及び過剰な父系寄与から生じないこと、及び父系寄与はそれゆえ三倍体において１ｎであろうことを示す。全ての三倍体は親のヘテロ接合性を保持するという実施例４の発見と共に、これらの結果は、ヘテロ接合性の保持は雌親から得られ、及びそれゆえ三倍体は親のヘテロ接合性を保持する減数されていない雌性配偶子から生ずることを示す。
【０１３４】
ｄｙａｄにおける三倍体は２ｎ雌性寄与から生ずることを確認するために、私たちは雌としてのｄｙａｄ変異体を雄としての系ＥＴＣ６０（ＤＹＡＤについて野生型）に交配し、Ｆ１種子を得た。ＥＴＣ６０系（米国特許出願第１０／８５７，５３９号中に示される）はカナマイシン耐性遺伝子を有するＤｓトランスポゾンの単一コピーを有する。上記Ｆ１の野生型二倍体植物へのさらなる交配後のカナマイシン耐性の分離にしたがうことにより、Ｆ１植物中の雄性配偶子からの倍数性の寄与を決定することが可能である。はじめの交配からの種子を発芽させ、及び種苗を土壌に移した。６のＦ１植物をカナマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（ＫａｎＦ 配列ＩＤ番号：４９及びＫａｎＲ 配列ＩＤ番号：５０）を用いてカナマイシン耐性遺伝子の存在について、及び遺伝子特異的プライマーＧＬＴＦ（配列ＩＤ番号：４６）と共にトランスポゾン特異的Ｄｓ５−２プライマー（配列ＩＤ番号：４５）を用いてＥＴＣ６０中のトランスポゾンのコピーについて試験した。全ての６の植物はカナマイシン耐性を有するＤｓエレメントについて陽性であり、及びまたＤＹＡＤの野生型コピーを含む交配された植物について予想されるであろうように稔性であった。６の植物の倍数性を減数分裂染色体のスプレッドを用いて調べた。３の植物は１５の染色体を有する三倍体であり、２の植物は１６の染色体を有し、及び１は１７の染色体を有することがわかった。これらの結果は、雌性配偶子は減数されていない／高二倍体胞子から生じた可能性を示唆する。半数体花粉による減数されていない雌性配偶子の受精はカナマイシン耐性遺伝子について単体（Ｋｋｋ）である（ほぼ）三倍体を与えうる。あるいは、上記三倍体は減数されていない雄性配偶子又は２の減数された雄性配偶子による半数体雌性配偶子の受精から生じることができ、その場合、上記三倍体はカナマイシン耐性遺伝子について二重体（ＫＫｋ）でありうる。
【０１３５】
単体条件植物がカナマイシン耐性を有しない野生型植物に交配される場合、生ずる植物における感受性に対するカナマイシン耐性についての分離の割合は１：１であろう。しかしながら、二重体条件植物が野生型植物に交配される場合、分離の割合は５：１であると予想されうる。交配を上記で得られた三倍体植物のうちの２について野生型に対して行い、及び得られた種子をカナマイシン耐性の分離についてスコア付けした。表５中に示される結果はカナマイシン耐性についての１：１分離を示し、多精の可能性を排除し、及び上記三倍体は減数されていない雌性配偶子から生ずることを示す。
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
*種子は三倍体親の二倍体親への交配の結果であるので、いくつかの種子は異数性のために発芽しないことが予想される。
**１：１の割合についてのフィットのよさについての有意性試験は発芽しなかった種子を除いて計算される。
***５：１の割合についてのフィットのよさについての有意性試験はＫａｎRカテゴリー中に発芽しなかった種子を含むことにより計算される。理論的には、発芽しなかった種子の５０％のみが（得られたＫａｎR及びＫａｎS種苗の割合に基づいて）いずれかのカテゴリー中に含まれるべきであるが、有意性の値を増大させるために、私たちは全ての発芽しなかったロットをＫａｎRカテゴリーに含めた。これは、私たちが全ての発芽しなかったロットをＫａｎRカテゴリーに含んでも５：１の割合についてのフィットのよさは有意でないという可能性を排除し、及びしたがって１：１の割合のみを好む条件を強く支持する。
Ｓ それがある割合に従わないことを示す、χ2試験について有意
ＮＳ それがある割合に従うことを示す、χ2試験について有意でない
【０１３８】
実施例８：ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からのＤＹＡＤ遺伝子及びコード配列
ポプラからのＤＹＡＤ遺伝子の追加の実施例はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｓｃｉ／ｉｐｇｃで見られる。
ｃＤＮＡ配列のコード部分の翻訳は図１１中でＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからの野生型ＤＹＡＤタンパク質のアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列を提供する。
【０１３９】
ＡｔＤｙａｄホモログＰｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｓｃｉ／ｉｐｇｃ中のとおり
ゲノム領域（配列ＩＤ番号：２４）
【０１４０】
ＥＸＯＮ
ＩＮＴＲＯＮ
はじめのＡＴＧの２４４４ｂｐ上流を含む
【０１４１】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【０１４２】
データベース中のとおりのタンパク質配列（８３０ａａ）（配列ＩＤ番号：２６）
＞ｅｕｇｅｎｅ３．０００３０７９１［Ｐｏｐｔｒ１：５５４１５８］
【化１４】
【０１４３】
実施例９：トウモロコシＤＹＡＤポリヌクレオチド及びポリペプチドの同定
ウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ）でクエリーとしてＴＢＬＡＳＴＮ及びイネＤＹＡＤタンパク質（配列ＩＤ番号：５１）を用いたトウモロコシゲノムの検索はコンティグＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．１（配列ＩＤ番号：５２）及びＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．２（配列ＩＤ番号：５３）に対応するトウモロコシゲノムの領域内の推定上のＤＹＡＤ遺伝子の存在を明らかにした。手動編集との組み合わせのＧＥＮＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を用いた領域のアノテーションはイネＤＹＡＤポリペプチド配列と整列されうる推定上のトウモロコシポリペプチド配列の同定を導いた（図１２）。本発明は前記トウモロコシポリペプチド配列及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用を含む。
【０１４４】
トウモロコシから得られたポリペプチド配列は以下のヌクレオチドコーディネートにより示されるようにコンティグヌクレオチド配列にマッピングされる。上記コンティグ配列によりコードされる整列された部分的なＺｍＤＹＡＤポリペプチド配列もまた示される。
【０１４５】
ＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．１（配列ＩＤ番号：５２）コーディネート及び概念上の翻訳
【化１５】
【０１４６】
トウモロコシ 整列されたポリペプチド：
（配列ＩＤ番号：５４）
【化１６】
【０１４７】
ＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．２（配列ＩＤ番号：５３）コーディネート及び概念上の翻訳
【化１７】
【０１４８】
トウモロコシ 整列されたポリペプチド：
（配列ＩＤ番号：５５）
【化１８】
【０１４９】
実施例１０：単為生殖のための一般的手順
最適照射量の決定：
１．使用される予定の雌親植物と同種又は関連種の雄親植物から葯を集め、及び１、５、１０、２０、３０、５０、７０、１００、１５０、２００ｋｒａｄを含む量範囲のイオン化照射で照射する。
２．１以上の劣性表現型マーカー又はＤＮＡマーカーについてのその他（マイクロサテライト、ＣＡＰＳ又はＲＡＰＤ）を有することで上記照射された花粉親とは異なる雌性植物からの除雄された花又は雌花に授粉する。好ましくはイオン化照射のそれぞれの量で授粉に１０〜５０の花を使用する。
３．授粉された花から種子を集め、及び同じ照射量を受けた花粉で授粉された花からの種子を集める。
４．種子を発芽させ、及び苗になるまで生育させ、照射のそれぞれの量について約２０〜１００の植物を得る。
５．表現型マーカー又はＤＮＡマーカーについて植物の遺伝子型をスコア付けし、及び母親に似る植物の割合を計算する。
６．高い割合の生存力のある植物及び高い割合の母親に似る植物の両方の最適な組み合わせを与える量を選択する。
【０１５０】
ｄｙａｄ変異体植物における単為生殖の誘発：
１．上記に示されるように決定される適切な量のイオン化照射を用いて照射された花粉でｄｙａｄ変異体植物に授粉する。
２．種子を集める。
３．種子を発芽させ、及び苗になるまで生育させる。
【０１５１】
単為生殖植物の同定：
１．雌親が有する劣性表現型マーカーについて植物をスコア付けする。劣性表現型を示す植物は単為生殖であるとして分類される。さらに、上記植物は植物組織からＤＮＡを単離し、多形マーカーについてＤＮＡ分析することによりＤＮＡマーカーについてスコア付けされうる。雌親に特徴的である及び雄親についてのマーカーバンドを欠くマーカーパターンを示す植物は単為生殖であるとして分類される。授粉実験からの単為生殖植物の割合はそのようにして計算されうる。
２．単為生殖植物は雌親がヘテロ接合であったマーカーについて調べられうる。雌性ｄｙａｄ変異体親がヘテロ接合であった全てのマーカーについてヘテロ接合性を保持するそれらの植物は無配偶生殖植物である。
【０１５２】
異なる作物種に使用されうる可能性のある分子マーカーについての引用文献は以下に列挙される：
小麦：
ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
１．Ｔｏｒａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００６）．ＳＳＲ−ｂａｓｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｗｈｅａｔ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００６ Ａｐｒ；１１２（６）：１０４２−５１．
２．Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ （ＳＳＲ） ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｗｈｅａｔ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００５ Ｆｅｂ；１１０（３）：５５０−６０．
【０１５３】
イネ：
ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
１．Ｈａｒｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）． Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ２２７５ ｍａｒｋｅｒｓ．．．” Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４８：４７９−４９４．
２．Ｃａｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）． Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． １９９４ Ｄｅｃ；１３８（４）：１２５１−７４．
【０１５４】
トウモロコシ：Ｃｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）． “Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ”． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２８：９−１２．
ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
【０１５５】
大麦： ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
Ｗｅｎｚｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）． Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍａｐ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ ｌｉｎｋｉｎｇ ＤＡｒＴ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ＳＳＲ，ＲＦＬＰ ａｎｄ ＳＴＳ ｌｏｃｉ ａｎｄ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｔｒａｉｔｓ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２００６ Ａｕｇ １２：７（１）：２０６
【０１５６】
オート麦： ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
Ｄｅ Ｋｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）． Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＱＴＬｓ ｆｒｏｍ ａ ｈｕｌｌｅｓｓ ｘ ｃｏｖｅｒｅｄ ｓｐｒｉｎｇ ｏａｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００４ Ｍａｙ；１０８（７）：１２８５−９８．
【０１５７】
パールミレット： ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｓｅｔ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐｅａｒｌ ｍｉｌｌｅｔ， Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００４ Ｎｏｖ；１０９（７）：１４８５−９３．
【０１５８】
ソルガム：Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）． “Ａ ｄｅｔａｉｌｅｄ ＲＦＬＰ ｍａｐ ｏｆ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ．．．”． Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８７：９２５−９３３．
【０１５９】
キャベツ、ブロッコリー等（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）： Ｂｏｈｕｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）． “Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ”． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５０：３９３−４０１．
【０１６０】
セイヨウカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）： Ｐｒａｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）． Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ（Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｓｔａｒｄ）ｕｓｉｎｇ ＡＦＬＰ ａｎｄ ＲＦＬＰ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００３ Ｆｅｂ；１０６（４）：６０７−１４．
【０１６１】
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）：Ｐｉｑｕｅｍａｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｗｉｔｈ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００５ Ｎｏｖ；１１１（８）：１５１４−２３．
【０１６２】
カブ、ハクサイ等（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）：Ｋｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｈｅｒｅｄ． ８８：５５３−５５７
【０１６３】
綿：Ｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）． “Ａ ３３４７−ｌｏｃｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍａｐ．．．” Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６６：３８９−４１７．
【０１６４】
トマト：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）． Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｘ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｃｒｏｓｓ． Ｇｅｎｏｍｅ ２００２ Ｆｅｂ；４５（１）：１３３−４６．
【０１６５】
ナス： Ｄｏｇａｎｌａｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ｅｇｇｐｌａｎｔ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌａｎａｃｅａｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１（４）：１６９７−７１１
【０１６６】
トウガラシ：Ｇｅｎｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌａｎａｃｅａｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２（３）：１１８３−２０２．
【０１６７】
ジャガイモ：Ｔａｎｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）． Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２（４）：１１４１−１１６０．
【０１６８】
ダイズ：Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）． Ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ ａｓｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ａｎ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄ ＲＦＬＰ ｍａｐ． Ｊ． Ｈｅｒｅｄ． ９１（５）：３９２−３９６．
【０１６９】
ポプラ：Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）． Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｇｅｎｏｍｅ ２００１ Ａｕｇ；４４（４）：６０２−９．
Ｔｕｓｋａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ． Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ．３４（１）：８５−９３．
【０１７０】
プラスミドｐＢＩ１０１．３：：ＤｙａｄΔＧＲで形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ株ＤＨ５αのサンプルはｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（ＭＴＣＣ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＩＭＴＥＣＨ）， Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＳＩＲ）， Ｓｅｃｔｏｒ−３９Ａ， Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ−１６０ ０３６，Ｉｎｄｉａ）で寄託されている。上記サンプルは２００６年１２月１日に寄託され、及びｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｎｏ．ＢＩ５０７を有する。雄としてのｄｙａｄ変異体と野生型雌性植物の間の交配のＦ２集団の少なくとも２５００種子を含む、及びｄｙａｄ変異体について分離するサンプルはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ２０１０８， ＵＳＡ）で寄託されている。上記サンプルは２００６年１２月１日に送られ、及びｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｎｏ．ＩＳＤＹＦ２Ｃを有する。ｄｙａｄについて及びＤｙａｄΔＧＲ挿入物についてホモ接合である及びデキサメタゾンに応答して条件付き稔性を示す（系番号３３に由来する）少なくとも２５００種子を含むサンプルはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ２０１０８， ＵＳＡ）で寄託されている。上記サンプルは２００６年１２月１日に送られ、及びｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｎｏ．３３−５ＤＹＧＲを有する。
【０１７１】
学術定期刊行物及び特許文献のさまざまな論文を本明細書中に引用する。それぞれの上記論文をそれを全体として及びそのような引用による全ての目的のために本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１はｄｙａｄ変異体植物中の減数された種子セットを示す。形式上の範囲は植物当たり１〜１０種子である。
【図２】図２はＡｌｅｘａｎｄｅｒ染色を用いたｄｙａｄ変異体植物中の正常花粉生存力を示す。（図２Ａ）野生型。（図２Ｂ）ｄｙａｄ。
【図３】図３は野生型及びｄｙａｄ変異体中の雄性及び雌性減数分裂を示す。（図３Ａ−Ｃ）野生型。（図３Ｄ−Ｆ）ｄｙａｄ。（図３Ａ、Ｄ）減数分裂１の終わり（終期）の雄性減数母細胞。（図３Ｂ、Ｅ）四分子段階での雄性減数母細胞。（図３Ｃ、Ｆ）後期１での雌性減数母細胞。ｄｙａｄは均等雌性減数分裂を経験する。
【図４】図４は二倍体ｄｙａｄ変異体植物の代表的な子孫の染色体倍数性を示す。（図４Ａ）１５の染色体を示す三倍体子孫植物の体細胞。（図４Ｂ）９：６分離を示す１５の染色体を有する三倍体子孫植物中の雄性減数分裂１。（図４Ｃ）１０の染色体を示す二倍体子孫植物の体細胞。
【図５】図５はＢｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉ ＤＹＡＤホモログによるｄｙａｄ変異体の補完を示す：（図５Ａ）伸長していない長角果を示すｄｙａｄ変異体。（図５Ｂ）種子を含む伸長した長角果を示すＢｈＤＹＡＤ遺伝子で形質転換されたｄｙａｄ変異体。（図５Ｃ）ｄｙａｄ変異体植物（１）、補完された植物（２）及び野生型植物（３）からの長角果の比較。（図５Ｄ）完全な種子セットを示す補完された植物からの切開された長角果。（図５Ｅ）野生型植物からの切開された長角果。
【図６】図６はＤＹＡＤ条件付き補完系を構築するために使用されるｐＢＩ１０１．３：：Ｄｙａｄ：：（Δ）ＧＲカセットを示す図である。
【図７】図７は図６中に示されるＤＹＡＤの内生位置を遺伝子タイピングするためのＣＡＰＳ多形性を示すポリアクリルアミドゲルである。図７Ａ：ＫＮＥＦ／ＫＮＥＲプライマー増幅産物からの溶解ＨｉｎＦ１消化断片。図７Ｂ：ＫＫＦ／ＫＫＲプライマー増幅産物からの溶解ＨｉｎＦ１消化断片。
【図８】図８は実施例６中のｄｙａｄ表現型の条件付き補完を示す。 図８Ａ：デキサメタゾン処置前及び後の非伸長長角果（ｄｙａｄ表現型）を示す花序。矢印は処置の開始時の最も若い開花した花の位置を示す。処置開始５〜７日後、長角果は伸長を示した（野生型表現型）。図８Ｂ：デキサメタゾン処置前の不稔性（ｄｙａｄ）表現型を示す単離された長角果。図８Ｃはデキサメタゾン処置による条件付き補完後の回復された野生型表現型を示す。図８Ｄ：デキサメタゾン処置後の完全な種子セットを示す、裂いて開いた長角果。
【図９】図９は実施例６中のｄｙａｄ表現型の条件付き補完後の胚珠の形態を示す。 図９Ａ：デキサメタゾン処置前の成熟胚珠段階でｄｙａｄ表現型及び胚のうの不在を示す透明にされた胚珠。図９Ｂ：デキサメタゾン処置後に回復された胚のう。
【図１０】図１０はｄｙａｄ変異体により生成された種子の大きさにおける変動及び二倍体及び四倍体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ株の間での相互交配から得られた種子の大きさにおける相違を示す。 図１０Ａ：自家受粉された野生型二倍体Ｃｏｌ−Ｏ植物からの種子は均一に正常な大きさである。図１０Ｂ：四倍体植物からの種子。図１０Ｃ：自家受粉されたｄｙａｄ植物からの種子の大きさは大きい（Ｌ）、正常（Ｎ）、及び縮んでいる（Ｓ）の間で変化する。図１０Ｄ：母系過剰−二倍体雄株に交配された四倍体雌株からの種子は縮んでいる。図１０Ｅ：父系過剰−二倍体雌株に交配された四倍体雄株からの種子は母系過剰交配からの種子と比較されるとき大きさが大きい。
【図１１】図１１はデフォルトパラメーターでのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗにおけるようにＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（配列ＩＤ番号：５）、Ｂｏｅｃｈｅｒａ（配列ＩＤ番号：１８）、イネ（配列ＩＤ番号：５１）からの、及びポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（配列ＩＤ番号：２６）からのＤＹＡＤタンパク質のタンパク質配列の配列を示す。
【図１２】図１２はＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（１．８２）を用いた推定上のトウモロコシＤＹＡＤポリペプチド配列（配列ＩＤ番号：５５及び５４）を伴うイネＤＹＡＤポリペプチド配列（配列ＩＤ番号：５１）の配列を示す。図１２Ａ：イネＤＹＡＤアミノ酸１−１４７の配列。図１２Ｂ：イネＤＹＡＤアミノ酸３１７−８０３の配列。
【図１３】図１３はＤＹＡＤをコードする配列を含むと同定される２のトウモロコシコンティグ（連続配列）に対するイネからのＤＹＡＤポリペプチド配列のマッピングを示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は胚中で母系ゲノムの完全二倍体補完物を有する種子を作出する目的のために配偶子形成及び種子発達を操作するためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｏｅｃｈｅｒａ、イネ及び他の植物のＤＹＡＤ遺伝子の対立遺伝子及び遺伝子産物の使用に関する。本発明はまた花粉発達に対して実質的な影響なしに減数されていない雌性配偶体を作出するための変えられたＤＹＡＤ遺伝子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
植物の生活環は二倍胞子体世代及び半数配偶体世代の間を交替する。減数分裂は植物生活環の二倍胞子体及び半数配偶体相の間の変遷を代表する。減数分裂は半数体胞子の形成を導く。動物とは違って、植物においては、減数分裂生成物は多細胞半数配偶体を形成するために追加の分裂を経験する。配偶子の分化は、減数分裂生成物の分裂後、配偶体発達の後期段階に向かって起こる。受精前の性プロセスはそれゆえ２の明確な段階：減数分裂及び半数体胞子の形成を含む胞子生殖；及び受精に及び胚の生長を支持するために必要とされる配偶子及び関連細胞を含む配偶体への胞子の発達をいう配偶子形成を含む。
【０００３】
ほとんどの植物種は性生殖を経験する；しかしながら、いくつかの植物種は無性生殖をすることができる。用語無配偶生殖は一般的に無性生殖のある形態のいずれかによる性生殖の置換として認められる（Ｋｏｌｔｕｎｏｗ Ａ． ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓｓ Ｕ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ５４： ５４７−７４， ２００３）。無配偶生殖は、胚が卵及び精子の合体なしに形成される種子形成を含む、植物における生殖の遺伝学的に制御された方法である。無配偶生殖の３の基本的な型：１）胚が珠心に由来する胚のう内で染色体として減数されていない卵から単為生殖的に発達する、無胞子生殖、２）胚が大胞子母細胞に由来する胚のう内で減数されていない卵から単為生殖的に発達する、複相胞子生殖、及び３）胚が体細胞から直接的に発達する、不定胚形成がある。はじめの２の型の無配偶生殖は、両方の場合において胚は雌性配偶体又は胚のうから発達するので、配偶体の無配偶生殖の下に共に分類されるが、一方、不定胚形成においては、胚は中間雌性配偶体段階なしに体細胞から直接的に発達する。それゆえ配偶体の無配偶生殖は２の成分：ｉ）アポマイオシス又は親の遺伝子型を保持する減数されていない雌性配偶体（胚のう）の生成、及びｉｉ）内胚乳に発達する中心細胞の受精を伴う又は伴わない、胚の単為生殖的発達を含む。
【０００４】
無配偶生殖はしたがって母親と遺伝的に同一の胚を作出するための雌性減数分裂及び配偶子合体（有性生殖）をバイパスする生殖プロセスである。３の型の無配偶生殖は、それらは純種を繁殖させるためにどんなヘテロ接合にもかかわらず、どんな遺伝子型でも起こしうるので、経済的な可能性を有する。無配偶生殖で、特に適応性のある又はハイブリッドの遺伝子型の子孫は繰り返される生活環をとおしてそれらの遺伝子型を維持するであろう。ハイブリッドの生長力を固定することに加えて、無配偶生殖は、ハイブリッドを作出するための効果的な雄性不稔性又は稔性回復システムが知られていない又は開発されていない作物における可能性のある商業的ハイブリッド生産を作出しうる。無配偶生殖はそれゆえハイブリッド開発をより効率的にしうる。無配偶生殖はまた優れた雄性不稔性システムを有する植物種におけるハイブリッド生産を単純化し、及び遺伝的多様性を増大させる。栽培種に絶対的な又は高いレベルの無配偶生殖を制御する遺伝子を導入すること及び純種繁殖Ｆ１ハイブリッドを作出するために交雑適合性の性及び無配偶生殖遺伝子型を容易にハイブリダイズすることができることは非常に好ましいであろう。重要な作物への無配偶生殖の移動は細胞質−核雄性不稔性及び高いコストの、労働の激しい生産プロセスの必要性なしに、純種繁殖ハイブリッドの可能性のある開発及びハイブリッドの商業的生産を作出しうる。絶対的無配偶生殖Ｆ１ハイブリッドは無期限にその種子をとおして純種を繁殖するであろう、及びその種子をとおして栄養器官の又はクローンの生殖方法を提供すると考えられうる。無配偶生殖的に生殖する栽培作物の開発はまた発展する世界諸国民における食物安全性に対して主要な貢献を提供しうる（Ｓｐｉｌｌａｎｅ Ｃ， Ｓｔｅｉｍｅｒ Ａ， ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ Ｕ， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． １４： １７９−１８７， ２００１）。
【０００５】
実際には、無配偶生殖を制御する最もよく知られる遺伝子は、栽培種と遠く関連する野生種内で見つけられる。種間交配は栽培及び野生種の間で可能でありうるが、ゲノム間の染色体対形成は通常低く又は存在せず、このアプローチの失敗につながる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の開示
栽培作物に無配偶生殖を導入するために考えられうる２の一般的な策がある。第一は栽培種への野生近縁系統からの遺伝子移入による。第二は無配偶生殖の局面を与えうる性種からの遺伝子の同定、続いて無配偶生殖の完全なレパートリーを作出するためにこれらの遺伝子をピラミッド状にすることによる。これらの遺伝子はその後トランスジェニック法を用いて栽培作物に導入されうる。したがって、例えば、１以上の遺伝子の発現はアポマイオシスを誘導するために使用されることができ、及びこれらの遺伝子は単為生殖胚発達を誘発するためにもう一つのセットの遺伝子及び他の処置と合わせられうる。植物において単為生殖を誘発する方法は本分野において知られる（例えば、米国特許第５，８４０，５６７号を参照のこと）。本発明での使用のために単為生殖発達を誘発するための好ましい方法は、照射することにより受精について花粉を不活性化し、照射された花粉を用いて植物に授粉することである。（Ｐａｎｄｅｙ Ｋ．Ｋ． ａｎｄ Ｐｈｕｎｇ Ｍ．， Ｔｈｅｏｒｅｔ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， Ｖｏｌ． ６２：２９５−３００， １９８２； Ｌｏｆｔｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｄ．， Ｖｏｌ． ２１：１１２１−１１２８， ２００３）。
【０００７】
この方法はそれがいくつかの植物種において使用されており、及び不完全な花（雌雄同株の及び雌雄異株の）を有する植物に最も簡単に、一般的に適用可能であるように見える点で好ましい。しかしながら、それは雄性不稔性にされた又は受精能力のある花粉が機械的に除去された若しくは分離された完全な花を有する雌雄同花（両性花）植物に適用されうる。
【０００８】
上記花粉を不稔性にするための照射の特異的な量は種の特色に因り変化するであろう。一般的に、約１０〜２０００Ｇｒａｙの量は十分である。好ましくは、上記量は約１００〜５００Ｇｒａｙ、より好ましくは２００〜２５０Ｇｒａｙである。
【０００９】
単為生殖の誘発の成功は胚の存在についての種子のスクリーニングにより、例えば、Ｌｏｆｔｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｒｏｄ．， Ｖｏｌ． ２１：１１２１−１１２８， ２００３により示されるように液体培地中での培養後の種子の切開により又はライトボックス上での観察により検出されうる。
【００１０】
正常な性作物へ無配偶生殖形質を導入することは試みられている。Ａｓｋｅｒ Ｓ．（Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ， Ｖｏｌ． ９１：２３１−２４１， １９７９）は、試みは小麦、テンサイ、及びトウモロコシで失敗であったことを報告する。ＰＣＴ公開公報ＷＯ ８９／００８１０（Ｍａｘｏｎ ｅｔ ａｌ， １９８９）は、非栽培不稔性アルファルファ植物からの抽出物を用いて栽培植物において無配偶生殖形の生殖を誘発することを開示する。雄性不稔性の誘発がサトウモロコシ、ヒマワリ、パールミレット、及びトマトで評価されたとき、サトウモロコシ、パールミレット、及びヒマワリで減数された種子セット、及びトマトで減数された果実セットがあったことが報告された。
【００１１】
無配偶生殖は均一な及び疾患−及びウイルス−なしの根茎を作出するためにＣｉｔｒｕｓで（Ｐａｒｌｅｖｌｉｅｔ Ｊ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｉｔｒｕｓ． Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．７４： ２５２−２６０， １９５９）及び改善された栽培変種を作出するためにバッフェルグラス（Ｂａｓｈａｗ， Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２０： １１２， １９８０）及びＰｏａ（Ｐｅｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． １１： ４４５−４４８， １９７１）で効果的に使用されるが、それは栽培作物植物にうまく移動されていない。
【００１２】
無配偶生殖を作出するための第二のアプローチは性種からの無配偶生殖関連遺伝子の同定及び操作を含む。無配偶生殖の発達上の観察は、無配偶生殖は性生殖に関連し、及び性経路でも役割を果たす遺伝子の活動を含むことを示唆した（Ｔｕｃｋｅｒ Ｍ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ． １５（７）：１５２４−１５３７， ２００３）。性生殖において、通常下皮層から、発達する胚珠の頂部に向かって発生する大胞子母細胞は大きくなり、及び減数分裂及び２細胞分割を経験し、それぞれ半数染色体数を有する大胞子の直線四分子を形成する。異なる植物種の間で最も通常には、３の最も先端の胞子が退化し、一方、機能的な合点の胞子は３ラウンドの核分裂、続いて細胞拡大を経験し、卵、２の極核、２の助細胞、及び３の反足細胞を有する胚のうを形成する。無配偶生殖は、多数の遺伝子の活動を必要とすることがいくつかの種で示されているように、多段階及び無配偶生殖の完全な経路の制御を必要とするプロセスである（ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｒｅｄｉｔｙ， Ｖｏｌ． ８３： ７１５−７２１， １９９９； Ｍａｔｚｋ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １７（１）：１３−２４， ２００５）。分離において機能する経路において１又は１サブセットの遺伝子により制御される個々の成分段階は稔性に対する負の効果を有しうること（Ｓｐｉｌｌａｎｅ， Ｃ．， Ｓｔｅｉｍｅｒ Ａ． ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ Ｕ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １４： １７９−８７， ２００１）、及び無配偶生殖を効果的に促進することができるのは全経路を含む完全なセットの遺伝子の協調した活動のみであることが考えられている。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体の遺伝学的及び分子的分析は胞子生殖及び配偶子形成の段階で役割を果たすいくつかの遺伝子の同定を導いた（Ｙａｎｇ Ｗ． Ｃ． ａｎｄ Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ Ｖ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ３（１）： ５３−５７， ２０００）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｄｙａｄ変異体は雌性不稔性を引き起こすと同定され（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２７（１）：１９７−２０７， ２０００）、及びその分析はｄｙａｄ変異体植物は雌性減数分裂において欠陥があることを示した。ｄｙａｄ変異体における雌性減数母細胞の大多数は単一分割減数分裂を経験し、４の代わりに２の細胞を与え、続いて配偶子形成を含む発達のさらなる段階において止まる。ｄｙａｄ変異体における雄性減数分裂、花粉発達、及び雄性不稔性は正常であることがわかった（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２７（１）：１９７−２０７， ２０００； Ｒｅｄｄｙ Ｔ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １３０（２４）：５９７５−５９８７， ２００３）。雌性減数分裂中の減数分裂染色体の分析は、相同染色体は対合を経験しないこと、及び減数的減数分裂１分割は均等な分割により置換されることを示した（Ａｇａｓｈｅ Ｂ．， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２９（１６）， ３９３５−３９４３， ２００２）。独立した研究はＤＹＡＤと同一である、ＳＷＩ１遺伝子の同定を導いた（Ｍｏｔａｍａｙｏｒ Ｊ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １２：２０９−２１８， ２０００； Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． Ｖｏｌ． １５：１８５９−１８７１， ２００１）。これらの研究により同定された遺伝子は以下ではＤＹＡＤ遺伝子と呼ばれる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの野生型ＤＹＡＤ遺伝子は６３９アミノ酸のタンパク質をコードする（配列ＩＤ番号：５）。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＤＹＡＤ遺伝子の３の対立遺伝子が示されている。これらは：ｉ）アミノ酸５０８でのトランケーションを有するｄｙａｄ；生ずるタンパク質はそれゆえ野生型タンパク質において存在するＣ−末端１３０アミノ酸を欠く；ｉｉ）いくつかの雌性減数母細胞が均等減数分裂１分割を経験し、一方でその他は減数分裂を経験することを引き起こす減少された量の野生型タンパク質の生成をもたらすｓｗｉｌ．１；及びｉｉｉ）位置３９４に停止コドンを作出し、及びｄｙａｄと同様の雌性表現型を引き起こすが、さらに雄性不稔性をもたらす雄性減数分裂における欠陥をも引き起こすｓｗｉｌ．２である。Ｂｏｅｃｈｅｒａにおいてｄｙａｄ対立遺伝子に対応する位置は、上記アミノ酸配列の位置５０８でのフレームシフトを引き起こし、及び１０の追加のコドンの後（すなわち、位置５１８）に停止コドンをもたらす突然変異であろう。イネにおいて対応する位置はそれぞれ、５６３及び５７２である。
【００１３】
本発明のどんな理論にもとらわれることなく、発明者は、ポリペプチドカルボキシ−末端から位置３９４（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、及び他の種における対応する位置）の部分を有するＤＹＡＤタンパク質の量における減少は雌性減数母細胞が均等減数分裂１分割を経験する表現型を作出し、雌性配偶子における雌性遺伝子型（及びしたがってヘテロ接合性）の保持をもたらすことを示唆する。位置３９４から位置５０８（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、及び他の種における対応する位置）のドメインを有する正常な（又はおよそそのような）量のＤＹＡＤタンパク質の保持は正常な花粉発達を提供し、一方で植物におけるこのドメインの除去は雄性不稔性表現型を作出する。
【００１４】
本発明の作出前に、ｄｙａｄ又はｓｗｉｌ．２対立遺伝子についてホモ接合である植物は種子セットを示すことが報告されていなかった。ｓｗｉｌ．１対立遺伝子を有する植物はホモ接合であるとき減数された種子セットを示すことが報告されているが、生成される種子はそれらの染色体構成について分析され、及び二倍体であることがわかっており、それにより上記種子は正常な大胞子形成及び大配偶子形成から生ずることを示す（Ｍｏｔａｍａｙｏｒ Ｊ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ．１２：２０９−２１８， ２０００）。以前に示されるように、ｄｙａｄ、ｓｗｉｌ．１、及びｓｗｉｌ．２における均等単一分割減数分裂の結果として生成された胞子は停止されたままであり、及び本発明の作出までは、これらのいずれかが雌性配偶子に発達する可能性を有するかどうかは知られていなかった。また本発明の作出までは、染色体が均等単一分割雌性減数分裂の間に組換えを経験したかどうか、及びその結果として分裂産物は親のヘテロ接合性を失ったかどうかも知られていなかった。均等分割に付随する組換えのもっともらしさは、二倍体細胞は減数分裂に入り、減数分裂組換えを経験し、その後生育培地への移動に際して減数分裂から引き、及び有糸分裂的に分裂しうることを示す酵母における研究により支持される。組換えが上記遺伝子及びセントロメアの間で起こった場合、上記有糸分裂は遺伝子マーカーについてのヘテロ接合性の喪失を導きうる（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｒ． Ｅ． ａｎｄ Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｍ． Ｓ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ Ｖｏｌ． ７１（８）： ３１７２−３１７６ １９７４）。本発明は、異なるｄｙａｄホモ接合変異体植物において見られる均等減数分裂１分割の産物は無配偶生殖の重要な成分であるアポマイオシスの特徴的な特徴を有する機能的な減数されていない胚のうを発生させることができるという発見に関連する。
【００１５】
本発明は、それらの胚遺伝子型が母系ゲノムの完全な二倍体補完物を含む種子を作出するために配偶子形成及び種子発達を操作するためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｏｅｃｈｅｒａ、Ｒｉｃｅ、Ｐｏｐｕｌｕｓ及び他の植物のＤＹＡＤ遺伝子、特にその変異体対立遺伝子、及びそれらの遺伝子産物の使用に関する。１の態様において、三倍体種子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及び他の植物型において作出される。
【００１６】
本発明はまたＤＹＡＤ遺伝子の変異体対立遺伝子及び遺伝子産物を用いたヘテロ植物の作出方法をも提供する。いくつかの態様において、上記植物及び種子は母系ゲノムの完全二倍体補完物を含み、及び父系ゲノムからの寄与を全く含まない、及びしたがって真のアポミクトを示す。これらの態様のいくつかの場合において、母系ゲノムに寄与する植物は所望の表現型を有する対立遺伝子の寄せ集めを有するハイブリッドであり、及び本発明に係る方法はその対立遺伝子の組み合わせの固定及び容易な繁殖を許容する。
【００１７】
本発明は母系ゲノムの完全二倍体補完物を含む種子の形成を導くＤＹＡＤ遺伝子及びその遺伝子産物の使用に関する。本発明は種なし果実を作出するために使用されうる三倍体植物を作出するために、マッピング研究のための三染色体系を構築するために、及び親植物のヘテロ接合性及び無配偶生殖の維持のために有用である。本発明において使用されるＤＹＡＤの対立遺伝子は減数されていない（二倍体）胚のうの形成を引き起こす。本発明はまた花粉発達に実質的に影響することなく減数されていない胚のうの形成を引き起こすためのＤＹＡＤ遺伝子の使用にも関する。本発明は、増大されたバイオマスを有する植物を作出する目的のために有用であろう、三倍体の自家受粉による、より高次の倍数体を作出するためのＤＹＡＤ遺伝子の使用にさらに関する。
【００１８】
本発明のさまざまな態様は本発明の異なる局面を示すであろう、及び本発明の異なる利点を提供しうることが理解されるべきである。必ずしも全ての態様が本発明の利点の全てを享受するわけではない。
【００１９】
定義：
句「核酸配列」は５’から３’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の重合体の構造をいう。二重鎖核酸の場合、「核酸配列」はもう一方の鎖上のその相補物を含む。
【００２０】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡの一重鎖又は二重鎖重合体（又はいくつかの場合、チオフォスフェート又はＰＮＡアナログの如きデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのアナログ又は上記ヌクレオチド塩基の誘導体を有するヌクレオチド）をいい、及び染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡ又はＲＮＡ（又はアナログ）の感染性重合体及び主に構造的役割を果たすＤＮＡ又はＲＮＡ（又はアナログ）を含む。
【００２１】
用語「ポリヌクレオチド配列」はしばしば「ポリヌクレオチド」と相互変換可能であるが、ときどき、分子自体よりむしろ、分子の配列の情報をいいうる。
「プロモーター」は使用可能につなげられた核酸の転写を指揮する核酸制御配列の並びとして定義される。本明細書中で使用されるとき、「植物プロモーター」は植物において機能するプロモーターである。プロモーターは、基礎的なポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントの如き、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた場合により、転写開始部位から何千塩基対も離れて位置されうる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターはほとんどの環境的及び発達的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導可能」プロモーターは環境的又は発達的調節下で活性であるプロモーターである。用語「使用可能につなげられる」は（プロモーター又は転写因子結合部位の配列の如き）核酸発現制御配列及び第二の核酸配列の間での機能的つながりをいい、ここで、上記発現制御配列は上記第二の配列に対応する核酸の転写を指揮する。
【００２２】
「発現カセット」は３の主なエレメント：ｉ）プロモーター；ｉｉ）上記プロモーターに使用可能につなげられ、及び上記発現カセットが細胞内に導入されるときその転写が前記プロモーターにより指揮される「コードポリヌクレオチド」又は「コード配列」と呼ばれうる第二のポリヌクレオチド；及びｉｉｉ）転写の停止を指揮し、及び前記第二のポリヌクレオチドのすぐ下流に位置されるターミネーターポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
用語「植物」は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、花、根等）、種子及び植物細胞及び同じものの子孫を含む。本発明に係る方法において使用されうるクラスの植物は一般的に、被子植物（単子葉及び双子葉植物）及び裸子植物を含む、形質転換技術の影響を受けやすいより高次の植物のクラスと同じくらい広い。それは倍数体、二倍体、及び半数体を含む、さまざまな倍数値の植物を含む。本発明のいくつかの態様において、上記植物は雌雄同株植物であることは好ましい。
【００２４】
ポリヌクレオチドは、それが異なる配列を有し、及び外来種から生ずる場合又は同じ種からでそのもともとの形態から改変される場合、生物又は第二のポリヌクレオチドと「異種」である。例えば、異種コード配列に使用可能につなげられたプロモーターは、プロモーターが由来する種とは異なる種からのコード配列又は同じ種からの場合、天然に起こる対立遺伝子変形とは異なるコード配列をいう。
【００２５】
個々の植物に「外因性の」ポリヌクレオチドは性交配による以外の手段により上記植物に導入されるポリヌクレオチドである。これが達成されうる手段の例は以下に示され、及び土壌細菌仲介形質転換、バイオリスティック法、エレクトロポーレーション等を含む。外因性核酸を含む上記植物はＲ１世代トランスジェニック植物とここで呼ばれる。性交配から又は自家受粉により生ずるトランスジェニック植物は上記植物の子孫である。
【００２６】
本発明において使用される「ＤＹＡＤ核酸」又は「ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列」は減数分裂の制御に関連するポリペプチドをコードする、及び突然変異されるとき、減数されていない雌性配偶体形成について無配偶生殖の局面を許容する核酸のサブ配列又は全長ポリヌクレオチド配列である。
【００２７】
「ＤＹＡＤ遺伝子」はホスト細胞内で、好ましくは植物内でＤＹＡＤ遺伝子産物の発現を提供するプロモーター及び他の転写及び翻訳制御配列を伴うＤＹＡＤ核酸を含む。
ＤＹＡＤ遺伝子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤ遺伝子（配列ＩＤ番号：１）によりコードされるポリペプチドと実質的な配列同一性を有する及びイネ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：６２７３３４１４）及び他の植物において同定されているポリペプチドをコードするタンパク質コード部分を含む転写産物を生成する植物遺伝子の１のクラスである。ＤＹＡＤ遺伝子はまたブラックコットンウッド及びトウモロコシにおいても同定されている（実施例９）。ＤＹＡＤ遺伝子は野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて単一コピーで存在する。さらに、それは生殖組織内の非常に小集団の細胞を構成する胞子母細胞においてのみ発現されるので、転写産物の豊富さは非常に低い。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤ遺伝子は減数分裂染色体組織化において重要な役割を果たすことが以前に示されている（Ａｇａｓｈｅ Ｂ．， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３ ２００２）。したがって、その機能はイネにおける親密に関連する遺伝子の存在により示されるように、他の植物種において高く保存されているようである。本出願におけるデータはＢｏｅｃｈｅｒａもまたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤ遺伝子に配列において親密に関連するＤＹＡＤ遺伝子を有することを確立する。
【００２８】
トランスジーンの発現及び内因性遺伝子の阻害（例えば、ＲＮＡ妨害、アンチセンス又はセンス抑制による）の両方の場合、当業者は使用されるポリヌクレオチド配列が、それが由来する又は阻害されるべきポリヌクレオチドの、遺伝子の配列に同一である必要はないが、単に「実質的に同一」でありうることを認識するであろう。以下に説明されるように、これらの実質的に同一の変形は用語ＤＹＡＤ核酸により特に含まれる。
【００２９】
ポリヌクレオチド配列が機能的なポリペプチドを作出するよう転写され及び翻訳される場合、当業者はコドン縮重のためにいくつかのポリヌクレオチド配列は同じポリペプチドをコードするであろうことを認識するであろう。これらの変形は用語「ＤＹＡＤ核酸」により特に含まれる。さらに、上記用語は本明細書中に開示されるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列に（以下に示されるように決定される）実質的に同一の、及び野生型ＤＹＡＤポリペプチドの変異体である又は（例えば、ＤＹＡＤポリペプチド中のアミノ酸の保存的置換から生ずる）ＤＹＡＤポリペプチドの機能を保持するポリペプチドをコードするそれらの配列を特に含む。さらに、変形は以下に示されるようにドミナントネガティブ変異体及びナンセンス変異体又は成熟前翻訳停止をもたらすフレームシフト変異体をコードするものでありうる。
【００３０】
２の核酸又はポリペプチドは２の分子における、それぞれ、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が以下に示されるように最大一致のために整列されるとき同じである場合、「同一で」あると言われる。２以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一で」又は「パーセント同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１を用いて又は手動整列及び視覚的観察により計測されるように、比較され及び比較ウィンドウにわたり最大一致のために整列されるとき、同じである又は同じである特定の割合のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する２以上の配列又はサブ配列をいう。配列同一性の割合がタンパク質又はペプチドに関して使用されるとき、同一でない残基位置はしばしば、アミノ酸残基が同様の化学特性（例えば、チャージ又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基について置換され、及びそれゆえ上記分子の機能的特性を変えない、保存的アミノ酸置換により異なることが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は上記置換の保存的性質について修正するために上方調節されうる。この調節を作出する手段は当業者に周知である。典型的には、これは完全ミスマッチよりむしろ部分ミスマッチとして保存的置換をスコアリングし、それによりパーセンテージ配列同一性を増大させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、及び非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は０〜１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．， ＵＳＡ）において実行されるように、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ４：１１−１７（１９８８）にしたがって計算される。
【００３１】
２の核酸又はポリペプチドの文脈における句「実質的に同一」は、以下の配列比較アルゴリズムの１を用いて又は手動整列及び視覚的観察により計測されるように比較ウィンドウにわたり最大一致のために整列されるとき、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０−９５％ヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有する配列又はサブ配列をいう。この定義はまた、試験配列が引用配列と実質的な同一性を有するとき実質的な配列又はサブ配列相補性を有する、試験配列の相補物をもいう。
【００３２】
配列比較のために、典型的に１の配列は試験配列が比較される引用配列としてはたらく。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験及び引用配列はコンピューターに入力され、必要な場合サブ配列コーディネートが示され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメーターが示される。プログラムパラメーターについてのデフォルト値は通常使用されるが、パラメーターについての代替の値が示されうる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメーターに基づいて、引用配列に比較した試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、「比較ウィンドウ」は連続位置、典型的に２０〜６００の、通常約５０〜約２００の、より通常には約１００〜約１５０の連続位置のセグメントについての引用を含み、ここで、２の配列が最適に整列された後、配列は同じ数の連続位置の引用配列に比較されうる。比較のための配列の整列方法は本分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）のホモロジー整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の同様の方法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピューターで処理される実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により又は手動整列及び視覚的観察により実施されうる。
【００３４】
有用なアルゴリズムの１の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは連続的な対様式の整列を用いて関連する配列の群から複数の配列整列を作出し、関係及びパーセント配列同一性を示す。それはまた上記整列を作出するために使用されるクラスタリング関係を示す系図又は樹状図をもプロットする。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ Ｄ． Ｆ．， ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｒ． Ｆ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． Ｖｏｌ． ３５：３５１−３６０（１９８７）の連続整列方法の簡易化法を使用する。使用される方法はＨｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）により示される方法と同様である。上記プログラムはそれぞれ最長５，０００ヌクレオチド又はアミノ酸の、３００配列までを整列しうる。上記複数整列手順は２の整列された配列のクラスターを作出する、２の最も類似の配列の対様式の整列で始まる。このクラスターはその後次に最も関連する配列又は整列された配列のクラスターに整列される。配列の２のクラスターは２の個々の配列の対様式の整列の単純な拡張により整列される。最終的な整列は一連の連続的な対様式の整列により達成される。上記プログラムは配列比較の領域についての特異的配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチドコーディネートを示すことにより及びプログラムパラメーターを示すことにより行われる。例えば、引用配列は以下のパラメーター：デフォルトギャップ重（３．００）、デフォルトギャップ長重（０．１０）、及び加重エンドギャップ用いてパーセント配列同一性関係を決定するために他の試験配列と比較されうる。
【００３５】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの他の例はＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）中に示されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎをとおして公けに入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムははじめに、データベース配列中の同じ長さのワードで整列されるときいくつかの正に評価された閾値スコアＴに合う又はそれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによりハイスコアリング配列対（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。Ｔは近隣ワードスコア閾値と言われる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ２１５： ４０３−４１０（１９９０））。これらのはじめの近隣ワードヒットはそれらを含むより長いＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するためのシードとしてはたらく。上記ワードヒットは累積整列スコアが増大されうる限り、それぞれの配列に沿って両方の方向に延長される。それぞれの方向の上記ワードヒットの延長は：上記累積整列スコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちる；上記累積スコアが、１以上のネガティブ−スコアリング残基整列の蓄積のために０以下になる；又はいずれかの配列の末端に到達するとき止められる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは整列の感度及び速さを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９））整列（Ｂ）、１０の確率（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００３６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた２の配列の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１の類似性計測は、２のヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こりうる可能性の表示を提供する、最小合計可能性（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、引用核酸に対する試験核酸の比較における最小合計可能性が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、引用配列に類似であると考えられる。「保存的に改変された変形」はアミノ酸及び核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列について、保存的に改変された変形は同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸を又は上記核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸はあるタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるそれぞれの位置で、上記コドンはコードされるポリペプチドを変えることなく示される対応するコドンのいずれかに変えられうる。上記核酸変異は保存的に改変された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のそれぞれの核酸配列はまた核酸のそれぞれの可能なサイレント変異を示す。当業者は、核酸中のそれぞれのコドン（通常メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧを除いて）は機能的に同一の分子を生成するよう改変されうることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異はそれぞれ示される配列中に内在する。
【００３７】
「本質的に同一の配列」は配列中の変異が分子の意図される機能に影響しないものである。
アミノ酸配列について、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸又は小さい割合のアミノ酸を変える、付加する又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加は、上記変化が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすとき、「保存的に改変された変形」であることを認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は本分野において周知である。
【００３８】
以下の６群はそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００３９】
２の核酸配列又はポリペプチドは実質的に同一であるという表示は、第一の核酸によりコードされるポリペプチドは第二の核酸によりコードされるポリペプチドに対して起こされる抗体と免疫学的にクロス反応性であるということである。したがって、ポリペプチドは典型的に、例えば、２のペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第二のポリペプチドに実質的に同一である。２の核酸配列は実質的に同一であるという他の表示は、２の分子又はそれらの相補物は以下に示されるように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。
【００４０】
句「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」は、その配列が複合的な混合物（例えば、全細胞又はライブラリーＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在するとき、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のヌクレオチド配列にのみの分子の結合、二重鎖化又はハイブリダイズすることをいう。
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが典型的には核酸の複合的な混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしないであろう条件をいう。ストリンジェント（厳密な）条件は配列依存的であり、及び異なる状況において異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲なガイドはＴｉｊｓｓｅｎ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ， “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）中に見られる。一般的に、高ストリンジェントな条件は定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列についての熱融解点（Ｔm）より約５〜１０℃低いように選択される。低ストリンジェント条件は一般的にＴmより約１５〜３０℃低いように選択される。Ｔmは標的に相補的なプローブの５０％が平衡で上記標的配列にハイブリダイズする（定義されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下での）温度である（上記標的配列は過剰に存在するので、Ｔmで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、及び温度は短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃及び長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェントな条件はまたホルムアミドの如き不安定化剤の添加でも達成されうる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍ハイブリダイゼーションである。
【００４１】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、まだ実質的に同一である。例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより許容される最大コドン縮重を用いて作出されるとき、これは起こる。上記の場合、上記核酸は典型的に中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【００４２】
本発明において、本発明において使用されるべきＤＹＡＤ核酸を含むゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡは本明細書中に開示される核酸配列を用いてストリンジェントな条件下で標準のサザンブロットにおいて同定されうる。本開示の目的のために、上記ハイブリダイゼーションに好適なストリンジェントな条件は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション及び少なくとも約５０℃、通常約５５℃、約６０℃までの温度で２０分間の０．１×〜１×ＳＳＣ、好ましくは０．５×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ中での少なくとも１の洗浄又は同等の条件を含む条件である。陽性ハイブリダイゼーションは少なくともバックグラウンドの２倍である。当業者は代替のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は同様のストリンジェントの条件を提供するために利用されうることを容易に認識するであろう。
【００４３】
２のポリヌクレオチドは実質的に同一であるというさらなる表示は、１対のオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅された引用配列がその後ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーから試験配列を単離するために又は例えば、ノザン又はサザンブロットにおいて試験配列を同定するためにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブとして使用されうる場合である。
【００４４】
「植物ハイブリッド」は同じ植物種の２の栽培変種を交配することにより得られる植物として定義される。
「種間ハイブリッド」は異なる種の２の植物を交配することにより得られる植物として定義される。
生殖事件における「雌親」は種子を有する植物として定義される。
【００４５】
本発明はＤＹＡＤ遺伝子及びその産物並びに種子発達及び無配偶生殖の制御のための分子遺伝学的アプローチの適用を含む方法を提供する。本発明はさらに天然タンパク質のＣ−末端部分を欠くＤＹＡＤポリペプチドの切り取られた形態を発現する、及び減数されていない雌性配偶体の発達を引き起こし、一方で同時に花粉生存力分析及び雄性減数分裂における染色体分離の顕微鏡検査により決定されるように花粉発達は実質的に変えないＤＹＡＤ遺伝子の変異体対立遺伝子に関する。それはまた天然ＤＹＡＤポリペプチドのＣ−末端部分を欠くＤＹＡＤポリペプチドをコードするＤＹＡＤ遺伝子の雌性特異的変異体対立遺伝子についてのヌクレオチド配列にも関し、及び植物における変異体ポリペプチドのそのような発現は減数されていない雌性配偶体発達を導くが、花粉発達には実質的に影響しない。上記変異体対立遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの変異体対立遺伝子の場合には配列ＩＤ番号：５中のアミノ酸５０９〜アミノ酸６３９の間の天然ポリペプチド配列の部分の全て又は一部を欠くが、アミノ酸３９４までのポリペプチド配列をコードする領域全てを含むＤＹＡＤポリペプチドを発現しうる。さらに、それはまた配列ＩＤ番号：４中に与えられる配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする及び天然ＤＹＡＤポリペプチドのＣ−末端欠損誘導体をコードするヌクレオチド配列を提供し、ここで、上記欠損は比較ウィンドウを用いる配列ＩＤ番号：５との比較により決定されるように配列ＩＤ番号：５中のアミノ酸５０９〜６３９の間の領域に対応する。Ｂｏｅｃｈｅｒａ、Ｒｉｃｅ、及びＰｏｐｕｌｕｓ ＤＹＡＤタンパク質の対応する部分は図１１の参照により同定されうる。本発明に係る組成物はまた天然ＤＹＡＤポリペプチド配列のＣ−末端欠損誘導体、並びに上記ＤＹＡＤポリペプチド及び植物細胞の核へ融合タンパク質を条件付きで輸送するグルココルチコイドホルモン受容体タンパク質の如きタンパク質配列から形成される、融合タンパク質及びそれらをコードする核酸をも含む。
【００４６】
本発明に係る方法は親の遺伝子型を保持する減数されていない雌性配偶子を作出するための植物におけるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現を含む。上記減数されていない雌性配偶子の作出は無配偶生殖を作出するために及び雑種強勢を固定するために並びに三倍体植物の作出のために有用である。本発明の１の態様において、ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列は形質転換のためのいくつかの周知の方法のいずれかにより植物のゲノムに導入されることができ、ここで、それはアンチセンスとして又は二重鎖ＲＮＡとして上記植物内で発現され、それにより内因性ＤＹＡＤ遺伝子の阻害を導き、及び減数されていない雌性配偶子の作出を引き起こす。本発明の他の態様において、ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列のＣ−末端欠損は発現カセットの部分として植物のゲノムに導入され、及び減数されていない雌性配偶体の形成を導き、一方で同時に花粉の発達は実質的に影響されないままである。減数されていない雌性配偶体形成を導く植物におけるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現はその後卵細胞の胚への単為生殖的発達により無配偶生殖種子を作出するために使用されうる。植物ハイブリッドにおける上記ＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現は親の遺伝子型を保持する減数されていない雌性配偶体の形成を導き、それにより次の世代において雑種強勢の固定を導く。雑種強勢の固定は異なる遺伝子型の２の親栽培変種の間の交配にたよらなければならないことなしに自家受粉することによりハイブリッド種子の繁殖を許容しうるので、雑種強勢の固定は非常に有用である。
【００４７】
本発明のさらに他の態様は、無配偶生殖種子を作出するために使用されうる、減数されていない雌性配偶子の形成を導く植物種の種間ハイブリッドにおけるＤＹＡＤポリヌクレオチド配列の発現である。上記無配偶生殖種子の作出は１の植物種から他の種へ作物学的に有用な遺伝子を遺伝子移入するために有用である。本発明のまた他の態様はＤＹＡＤポリヌクレオチド配列又はＤＹＡＤポリペプチド配列の条件付きの又は制御された発現及び／又はそれらの活性を含む。上記条件付き発現は減数されていない雌性配偶子及びそれゆえ所望のときに限り無配偶生殖種子の作出を促進するために使用されうる。植物におけるポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の条件付き発現又は活性に影響する方法は本分野において周知であり、及び非限定的にエタノール誘導可能遺伝子発現（Ｄｅｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， Ｖｏｌ． ３６（６）：９１８−９３０， ２００３）、活性のステロイドホルモン誘導可能制御（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．， Ｌｌｏｙｄ Ａ． Ｍ． ａｎｄ Ｄａｖｉｓ Ｒ． Ｗ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ Ｖｏｌ．８８（２３）：１０４２１−１０４２５，１９９１）、及び発現のテトラサイクリン仲介制御（Ｂｏｈｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． Ｖｏｌ．９（１）：８７−９５， １９９９）を含む。
【００４８】
以下の実施例６はｄｙａｄ変異体表現型を示す植物の同種集団が発達されうる本発明の１の態様を示す。同様のことはＤＹＡＤ ＲＮＡｉ又はアンチセンス構築物が条件付きプロモーターの制御下で発現される条件付きＤＹＡＤ ＲＮＡｉ又はアンチセンスを使用することにより達成されうる。本発明の他の表明はＤＹＡＤ遺伝子の補完的コピーがｄｙａｄの変異体対立遺伝子についてホモ接合である遺伝学的なバックグラウンドにおいて、条件付きプロモーターの制御下で植物において発現されるものである。本発明のまた他の表明は、トランスアクチベーターの制御下で発現され及びここで第一の植物はトランスアクチベーターを欠く、プロモーターの制御下で発現されるＤＹＡＤ ＲＮＡｉ又はアンチセンス構築物を有する第一の植物を、トランスアクチベーターを発現する第二の植物に交配することを使用しうる。
【００４９】
本明細書中に示されるように調製される単離された配列は例えば、内因性ＤＹＡＤ遺伝子発現を抑制する又は変えるために、いくつかの技術において使用されうる。植物におけるＤＹＡＤ遺伝子発現又はＤＹＡＤ活性の調節は例えば、無配偶生殖種子を作出するシステムの部分として、特に有用である。
【００５０】
ＤＹＡＤ核酸の単離
一般的に、以下に示される組換えＤＮＡ技術における名称及び研究室手順は本分野において周知の及び通常使用されるものである。標準の技術がクローニング、ＤＮＡ及びＲＮＡ単離、増幅及び精製のために使用される。一般的にＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応は製造者の仕様書にしたがって行われる。これらの技術及びさまざまな他の技術は一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．，（１９８９）にしたがって行われる。
【００５１】
ＤＹＡＤ核酸の単離はいくつかの技術により達成されうる。例えば、本明細書中に開示される配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブはｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーにおいて所望の遺伝子を同定するために使用されうる。ゲノムライブラリーを構築するために、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントが、例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いてランダム断片化により作出され、及びベクターＤＮＡとライゲーションされ、適切なベクターに導入されうるコンカテマーを形成する。ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、ｍＲＮＡは胚珠の如き所望の器官から単離され、及びＤＹＡＤ遺伝子転写産物を含むｃＤＮＡライブラリーはｍＲＮＡから調製される。あるいは、ｃＤＮＡはＤＹＡＤ遺伝子又はホモログが発現される他の組織から抽出されたｍＲＮＡから調製されうる。
【００５２】
ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーはその後本明細書中に開示されるクローニングされたＤＹＡＤ遺伝子の配列に基づいたプローブを用いてスクリーニングされうる。プローブは同じ又は異なる植物種において相同遺伝子を単離するためにゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズするために使用されうる。あるいは、ＤＹＡＤポリペプチドに対して生成された抗体はｍＲＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されうる。
【００５３】
あるいは、問題の核酸は増幅技術を用いて核酸サンプルから増幅されうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術はゲノムＤＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから直接的にＤＹＡＤ遺伝子の配列を増幅させるために使用されうる。ＰＣＲ及び他のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法はまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするために、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作出するために、核酸シークエンシングのために又は他の目的のためにも有用でありうる。ＰＣＲの一般的な概略のために、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． （Ｉｎｎｉｓ， Ｍ， Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｄ．， Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， Ｔ．， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）を参照のこと。
【００５４】
植物組織からＤＹＡＤ配列を同定するために適切なプライマー及びプローブは本明細書中に提供される配列の他のＤＹＡＤ関連遺伝子又はそれらがコードするタンパク質との比較から作出される。例えば、Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉ ＤＹＡＤはイネからの親密に関連する遺伝子と比較されうる（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．５０９１７２４３）。これらの技術を用いて、当業者は適切なプライマー及びプローブ配列を調製するために本明細書中に開示される遺伝子又はポリペプチドにおいて保存される領域を同定しうる。ＤＹＡＤ関連遺伝子において保存される領域に特異的にハイブリダイズするプライマーは広く分岐する植物種からの配列を増幅するために使用されうる。上記に開示される条件を用いる標準の核酸ハイブリダイゼーション技術はそれから全長ｃＤＮＡ又はゲノムクローンを同定するために使用されうる。
【００５５】
ＤＹＡＤ活性又は遺伝子発現の制御
ＤＹＡＤ遺伝子は減数分裂及び雌性配偶体の倍数性の制御に関連しているので、内因性ＤＹＡＤ活性又は遺伝子発現の阻害はいくつかの事情において有用である。例えば、上記に示されるＣ−末端欠損を有する対立遺伝子の使用による発現の阻害又はＤＹＡＤ活性の改変は（「種なし果実」と本明細書中で呼ばれる）種なし又は小／退化種子の果実の生成のために使用されうる。ほとんどの植物種において、三倍体の作出は減数分裂における不均衡な染色体分離のために生殖細胞の形成において欠陥を引き起こし、及び種子の欠損又は小／退化種子の形成を導く。内因性ＤＹＡＤ発現又は活性の阻害は倍数性の制御を許容しうる。したがって、ＤＹＡＤ活性が阻害される又は改変される本発明に係る植物のいくつかの態様において、種子は欠損し又は退化し、及び種なし果実が作出される。
【００５６】
本発明に係る核酸の他の使用は無配偶生殖植物系（すなわち、無性生殖プロセスが胚珠において起こる植物、無配偶生殖の議論についてはＫｏｌｔｕｎｏｗ Ａ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ．５：１４２５−１４７３（１９９３）を参照のこと）の開発における。無配偶生殖は伝統的な交配によっては容易に維持されえない複雑なヘテロ接合遺伝子型を選択する及び固定する新規手段を提供する。したがって、例えば、所望の形質（例えば、ハイブリッド生長力）を有する新規ハイブリッド系が得られ及び容易に維持されうる。
【００５７】
当業者は、いくつかの方法がＤＹＡＤ活性又は遺伝子発現を調節するために使用されうることを認識するであろう。ＤＹＡＤ活性は遺伝子、転写、転写後、翻訳又は翻訳後レベルで植物細胞において調節されうる。これらのレベルのそれぞれでＤＹＡＤ活性を調節するための技術は一般的に当業者に周知であり、及びいくつかは以下に簡単に議論される。
【００５８】
植物遺伝子に遺伝的突然変異を導入する方法は周知である。例えば、種子又は他の植物材料は標準の技術にしたがって、突然変異誘発性化学物質で処理されうる。上記化学物質は、非限定的に、以下のもの：ヂエチル硫酸塩、エチレンイミン、エチルメタンスルフォン酸塩及びＮ−ニトロソ−Ｎ−エチル尿素を含む。あるいは、例えば、Ｘ−線、ガンマ線又はファストニュートロンの如き源からのイオン化照射が使用されうる。ＤＹＡＤ遺伝子配列中に突然変異を有する植物はＤＹＡＤヌクレオチド配列を増幅するためのＰＣＲプライマーを用いた突然変異された植物の集められた集団の分子スクリーニング、続いてＤＹＡＤポリヌクレオチド配列中に遺伝的突然変異を有する植物を同定するためのＰＣＲ産物の分析により同定されうる。特定の遺伝子配列中に突然変異を有する植物のスクリーニング及び同定方法は示されている（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ．， Ｂｒａｄｌｅｙ Ｔ． Ｊ． ａｎｄ Ｃｏｍａｉ Ｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｖｏｌ． １３５（２）：６３０−６３６， ２００４）。
【００５９】
あるいは、相同組換えはｉｎ ｖｉｖｏでＤＹＡＤ遺伝子を特異的に欠損させる又は変えることにより標的化された遺伝子破壊を誘発するために使用されうる（一般的に、Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｋｌａｒ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４６： １２２１−１２３８（１９９７）及びＸｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０： ２４１１−２４２２（１９９６）を参照のこと）。相同組換えは植物において示されている（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０： ２７７−２８４（１９９４）， Ｓｗｏｂｏｄａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １３： ４８４−４８９（１９９４）； Ｏｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ７３４６−７３５０（１９９３）；及び Ｋｅｍｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９：８０２−８０３（１９９７））。
【００６０】
本発明に係る遺伝子に相同組換え技術を適用することにおいて、本明細書中に開示されるものの如き（５’上流、３’下流、及び遺伝子内領域を含む）ＤＹＡＤ遺伝子配列の選択された部分における突然変異はｉｎ ｖｉｔｒｏで作出され、及びその後標準の技術を用いて所望の植物に導入される。相同組換えの効率は使用されるベクターに因ることが知られるので、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４３０３−４３０７（１９９４）；及びＶａｕｌｏｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ４： ２４７−２５５（１９９５）により示されるようにヂシストロン遺伝子標的化ベクターの使用はトランスジェニック植物における変えられたＤＹＡＤ遺伝子発現の選択の効率を増大させるために便利に使用される。上記突然変異された遺伝子は相同組換え及び野生型遺伝子の標的化置換がトランスジェニック植物細胞において起こり、ＤＹＡＤ活性の抑制をもたらすであろうような様式で、標的野生型遺伝子と相互作用するであろう。
【００６１】
あるいは、末端上に二つのヘアピンキャップを有する二重鎖コンフォメーション中のＲＮＡ及びＤＮＡ残基の連続的な範囲から成るオリゴヌクレオチドが使用されうる。上記ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は標的ＤＹＡＤ遺伝子の配列と整列するように、及び所望のヌクレオチド変化を含むように設計される。染色体外Ｔ−ＤＮＡプラスミド上のキメラオリゴヌクレオチドの導入は少数の形質転換された植物細胞中でキメラ分子により方向付けられる効果的な及び特異的なＤＹＡＤ遺伝子変換をもたらす。この方法はＣｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３８６−１３８９（１９９６）及びＹｏｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：２０７１−２０７６（１９９６）中に示される。
【００６２】
遺伝子発現はトランスポゾン又はＴ−ＤＮＡ配列を含む構築物で植物細胞を形質転換することにより組換えＤＮＡ技術を用いて不活性化されうる。これらの方法により調製されるＤＹＡＤ変異体は標準の技術にしたがって同定される。例えば、変異体はＰＣＲにより又はＤＹＡＤ ｍＲＮＡの存在又は不在を検出することにより、例えば、ノザンブロット又は逆転写後にＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出されうる。変異体はまた繁殖力、雌性減数分裂、及び大胞子発達における変化について分析することによっても選択されうる。
【００６３】
本明細書中に示されるように調製される単離された核酸配列はまたさまざまなレベルで内因性ＤＹＡＤ遺伝子発現を制御するためにいくつかの技術において使用されうる。本明細書中に開示される配列からのサブ配列は転写、ＲＮＡ蓄積、翻訳等を制御するために使用されうる。
【００６４】
多数の方法が植物において遺伝子発現を阻害するために使用されうる。例えば、ＲＮＡ妨害（ＲＮＡｉ）技術は便利に使用されうる。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントは２のコピーが通常５〜２０００ヌクレオチド、好ましくは３０〜５００ヌクレオチド、及びより好ましくは５０〜２００ヌクレオチド長でありうるスペーサーにより分離される逆リピートとしてクローニングされる。上記逆リピートは両方のコピーが転写され、及びその長さの全体又は部分に沿って自己相補的であるＲＮＡ種を生ずるであろうように、プロモーターに使用可能につなげられ、ターミネーターが続く。上記構築物でその後植物は形質転換され、及び二重鎖ＲＮＡが生成される。
【００６５】
他の場合として、アンチセンス技術はＤＹＡＤ遺伝子発現を阻害するために便利に使用されうる。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントはクローニングされ、及びＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるであろうようにプロモーターに使用可能につなげられる。上記構築物でその後植物は形質転換され、及びＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。植物細胞において、アンチセンス抑制はＲＮＡ翻訳の抑制を含む全てのレベルの遺伝子調節で（Ｂｏｕｒｑｕｅ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． （Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）１０５： １２５−１４９（１９９５）； Ｐａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４８． Ｃｏｈｎ， Ｗ． Ｅ． ａｎｄ Ｋ． Ｍｏｌｄａｖｅ（Ｅｄ．）． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．， ＵＳＡ； Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ＵＫ． ｐ．１８１−２３８； Ｈｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． （Ｓｈａｎｎｏｎ） １２７：６１−６９（１９９７）を参照のこと）及び問題のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることにより（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ３２：７９−８８（１９９６）； Ｐｒｉｎｓ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂａｃｈ Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １４１：２２５９−２２７６（１９９６）； Ｍｅｔｚｌａｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ８８：８４５−８５４（１９９７）， Ｓｈｅｅｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：８８０５−８８０９（１９８８）、及びＨｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８０１，３４０号を参照のこと）はたらきうることが示唆されている。
【００６６】
一般的に導入されるべき核酸セグメントは内因性ＤＹＡＤ遺伝子又は抑制されるべき遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であろう。しかしながら、上記配列は発現を阻害するために完全に同一である必要はない。本発明に係るベクターは、阻害効果が標的遺伝子に対してホモロジー又は実質的なホモロジーを示す遺伝子のファミリー内の他の遺伝子に適用するように設計されうる。
【００６７】
アンチセンス抑制のために、導入される配列はまた第一転写産物又は完全にプロセスされたｍＲＮＡのいずれかに比較して全長である必要もない。一般的に、より高いホモロジーはより短い配列の使用を補うために使用されうる。さらに、導入される配列は同じイントロン又はエクソンパターンを有する必要はなく、及び非コードセグメントのホモロジーは同等に有効でありうる。通常、約３０又は４０ヌクレオチド〜およそ全長のヌクレオチドの配列が使用されるべきであるが、少なくとも約１００ヌクレオチドの配列が好ましく、少なくとも約２００ヌクレオチドの配列がより好ましく、及び約５００〜約１７００ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【００６８】
多数の遺伝子領域はＤＹＡＤ遺伝子発現を抑制するために標的化されうる。上記標的は、例えば、コード領域、イントロン、エクソン／イントロン接合点からの配列、５’又は３’非翻訳領域等を含みうる。いくつかの態様において、上記構築物は調節タンパク質のその細胞−及び／又は組織−特異的発現に必要とされるＤＹＡＤ遺伝子配列に結合する能力を消去するよう設計されうる。上記転写調節配列は５’−、３’−又は上記遺伝子のコード領域内のいずれかに位置されうる、及び遺伝子転写を促進し（正の調節エレメント）又は抑制し（負の調節エレメント）うる。これらの配列は当業者に周知の標準の欠損分析を用いて同定されうる。一旦、上記配列が同定されたら、これらの配列を標的にするアンチセンス構築物は特定の組織において、例えば、発達中の胚珠及び／又は種子において、遺伝子転写を制御するために植物内に導入される。
【００６９】
オリゴヌクレオチドに基づいた三重ヘリックス形成はＤＹＡＤ遺伝子発現を破壊するために使用されうる。三重鎖ＤＮＡはＤＮＡ転写及び複製を阻害し、部位特異的突然変異を作出し、ＤＮＡを切断し、及び相同組換えを誘発しうる（例えば、Ｈａｖｒｅ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：７３２４−７３３１（１９９３）； Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：１２８８−１２９６（１９９５）； Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１０５３９−１０５４８（１９９６）； Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｂｅｒｌｉｎ）７５：２６７−２８２（１９９７）を参照のこと）。三重ヘリックスＤＮＡはアンチセンス調節のために同定されたのと同じ配列を標的化するために使用されうる。
【００７０】
触媒ＲＮＡ分子又はリボザイムもまたＤＹＡＤ遺伝子の発現を阻害するために使用されうる。事実上どんな標的ＲＮＡとも特異的に対を形成し、及び特異的な位置でフォスフォヂエステル骨格を切断し、それにより上記標的ＲＮＡを機能的に不活性化するリボザイムを設計することは可能である。この切断を行うことにおいて、上記リボザイムはそれ自体変えられず、及びしたがってリサイクルし及び他の分子を切断することができ、そのことはそれを真の酵素にする。アンチセンスＲＮＡ内のリボザイム配列の包含はそれらにＲＮＡ−切断活性を与え、それにより上記構築物の活性を増大させる。したがって、リボザイムはアンチセンス調節のために同定されたのと同じ配列を標的化するために使用されうる。
【００７１】
多数のクラスのリボザイムが同定されている。リボザイムの１のクラスは植物内で自己切断及び複製することができるいくつかの小環状ＲＮＡに由来する。上記ＲＮＡは単独で（ウイロイドＲＮＡ）又はヘルパーウイルスと共に（サテライトＲＮＡ）複製する。例はアボカドサンブロッチウイロイドからのＲＮＡ及びタバコ輪紋病ウイルス、アルファルファ一過性条斑病ウイルス、ベルベットタバコモザイク病ウイルス、テリミノイヌホオズキモザイク病ウイルス及び地下クローバーモザイク病ウイルスからのサテライトＲＮＡを含む。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計及び使用はＺｈａｏ ａｎｄ Ｐｉｃｋ Ｎａｔｕｒｅ ３６５：４４８−４５１（１９９３）；Ｅａｓｔｈａｍ ａｎｄ Ａｈｌｅｒｉｎｇ Ｊ． Ｕｒｏｌｏｇｙ １５６：１１８６−１１８８（１９９６）； Ｓｏｋｏｌ ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ５：３６３−３７１（１９９６）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：２４１−２５１（１９９７）；及びＨａｓｅｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３４：５８５−５９１（１９８８）中に示される。
【００７２】
他の抑制方法はセンス共抑制である。センスの方向に配列される核酸の導入は標的遺伝子の転写をブロックするための効果的な手段であることが示されている。内因性遺伝子の発現を調節するためのこの方法の使用の例のために、Ａｓｓａａｄ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２２：１０６７−１０８５（１９９３）； Ｆｌａｖｅｌｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３４９０−３４９６（１９９４）；Ｓｔａｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔ． ７９：３−１２（１９９７）； Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９（１９９０）；及び米国特許第５，０３４，３２３号、第５，２３１，０２０号、及び第５，２８３，１８４号を参照のこと。
【００７３】
上記抑制効果は導入された配列がそれ自体コード配列を含まないが、内因性配列の第一転写産物中に存在する配列に相同のイントロン又は非翻訳配列のみを含む場合に起こりうる。導入された配列は一般的に抑制されるよう意図される内因性配列に実質的に同一であろう。この最小限の同一性は典型的に約６５％超であろうが、より高い同一性は内因性配列の発現のより効果的な抑制を発揮しうる。約８０％超の実質的により大きな同一性は好ましいが、約９５％〜絶対同一性は最も好ましいであろう。アンチセンス調節のように、上記効果はホモロジー又は実質的なホモロジーを示す同様の遺伝子ファミリー内の他のタンパク質に適用するはずである。
【００７４】
センス抑制のために、絶対未満の同一性を必要とする導入された配列もまた第一転写産物又は完全にプロセスされたｍＲＮＡのいずれかに比較して全長である必要はない。これは過剰発現体であるいくつかの植物の同時作出を避けるために好まれうる。全長よりも短い配列におけるより高い同一性はより長い、より低い同一性の配列を補う。さらに、導入される配列は同じイントロン又はエクソンパターンを有する必要はなく、及び非コードセグメントの同一性は同等に有効であろう。通常、アンチセンス調節について上記に留意される大きさ範囲の配列が使用される。さらに、アンチセンス調節について留意されるのと同じ遺伝子領域が共抑制技術を用いて標的化されうる。
【００７５】
あるいは、ＤＹＡＤ細胞特異的遺伝子発現に必要とされるタンパク質を消去することはＤＹＡＤ活性を調節しうる。したがって、調節タンパク質の発現及び／又はＤＹＡＤ遺伝子発現を制御する配列は本明細書中に示される方法を用いて調節されうる。
【００７６】
他の方法はＤＹＡＤ ｍＲＮＡ翻訳の遺伝子工学ｔＲＮＡ抑制の使用である。この方法は成熟前停止コドンを含む標的遺伝子をトランスアクチベートするためのサプレッサーｔＲＮＡの使用を含む（Ｂｅｔｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：５８７−５９５（１９９７）；及びＣｈｏｉｓｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１： ５９７−６０４（１９９７）を参照のこと）。アンバー停止コドンを含む構成的に発現されるＤＹＡＤ遺伝子を含む植物系がはじめに作出される。それぞれ細胞型特異的プロモーターの指揮下にｔＲＮＡサプレッサー遺伝子構築物を含む、複数の植物系もまた作出される。上記ｔＲＮＡ遺伝子構築物はその後ＤＹＡＤ系に交配され、標的化された様式でＤＹＡＤ活性を活性化する。これらのｔＲＮＡサプレッサー系はまたどんな型の遺伝子の発現も同じ細胞又は組織型に標的化するために使用されうる。
【００７７】
それらの他のタンパク質に結合する能力において欠陥があるＤＹＡＤポリペプチドのドミナントネガティブ形の作出は内因性ＤＹＡＤ活性を阻害する便利な手段である。このアプローチは、内因性タンパク質と欠陥複合体を形成し、及びそれにより上記複合体が適切に形成することを妨げる変異ＤＹＡＤポリペプチドをコードする構築物での植物の形質転換を含む。上記変異ポリペプチドはアミノ酸置換、追加、欠失等により第一構造レベルで天然配列とは異なりうる。これらの改変は最終的な改変されたタンパク質鎖を作出するためにいくつかの組み合わせで使用されうる。標的遺伝子を不活性化するためのドミナントネガティブ変異体の使用はＭｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：８３１−８４５（１９９６）中に示される。
【００７８】
ＤＹＡＤタンパク質のそれ自身と又は他のタンパク質と相互作用する能力に影響するための他の策はＤＹＡＤに特異的な抗体の使用を含む。この方法において、ＤＹＡＤ特異的Ａｂｓの細胞特異的発現は抗体：抗原認識をとおして機能的ドメインを不活性化するために使用される（Ｈｕｐｐ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ８３：２３７−２４５（１９９５）を参照のこと）。
【００７９】
ＤＹＡＤ遺伝子発現を高めるための本発明に係る核酸の使用
本明細書中に示されるように調製される単離された配列はまた内因性遺伝子発現を高める又は増大させるために特定のＤＹＡＤ核酸の発現を導入するために使用されうる。高められた発現はまた、例えば、植物が種子を有するのを妨害することにより、栄養器官の生長を増大させるために使用されうる。遺伝子の過剰発現が所望される場合、異なる種からの所望の遺伝子は可能性のあるセンス抑制効果を減少させるために使用されうる。
【００８０】
当業者は、本発明に係る遺伝子によりコードされるポリペプチドは、他のタンパク質と同様に、異なる機能を行う異なるドメインを有することを認識するであろう。したがって、上記遺伝子配列は、上記タンパク質の所望の機能ドメインが発現される限り、全長である必要はない。
【００８１】
改変されたタンパク質鎖はまた当業者に周知の及び以下に詳細に示されるさまざまな組換えＤＮＡ技術を利用して容易に設計されうる。例えば、上記鎖はアミノ酸置換、追加、欠失等により第一構造レベルで天然配列とは異なりうる。これらの改変は最終的な改変されたタンパク質鎖を作出するためにいくつかの組み合わせで使用されうる。
【００８２】
組換えベクターの調製
上記技術において単離された配列を使用するために、植物細胞の形質転換に好適な組換えＤＮＡベクターが調製される。広くさまざまなより高度な植物種を形質転換する技術は周知であり、及び技術及び科学文献中に示される。例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）を参照のこと。所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、例えば、全長タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列又は細胞内局在化配列へのＤＹＡＤの融合タンパク質又は切り取られたＤＹＡＤタンパク質は形質転換された植物の意図される組織中で上記遺伝子からの配列の転写を指揮するであろう転写及び翻訳開始調節配列と好ましく結合されるであろう。
【００８３】
例えば、過剰発現のために、再生された植物の全ての組織中で遺伝子の発現を指揮するであろう植物プロモーター断片が使用されうる。上記プロモーターは「構成的」プロモーターと本明細書中で呼ばれ、及びほとんどの環境条件及び発達又は細胞分化の状態下で活性である。構成的プロモーターの例はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域を含む。１’−又は２’−プロモーターは土壌細菌の根頭癌腫病細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡ、及び当業者に知られるさまざまな植物遺伝子からの他の転写開始領域に由来する。上記遺伝子は、例えば、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：１２５−１３９（１９９６））、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４３１４７、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５１：１９６−２０３（１９９６））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのステアロイル−アシル担体タンパク質脱飽和酵素をコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ７４７８２、Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４：１１６７−１１７６（１９９４））、トウモロコシからのＧＰｃ１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ１５５９６、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ２０８：５５１−５６５（１９８９））、及びトウモロコシからのＧｐｃ２（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ４５８５５、Ｍａｎｊｕｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：９７−１１２（１９９７））を含む。
【００８４】
あるいは、上記植物プロモーターは特異的組織におけるＤＹＡＤ核酸の発現を指揮しうる又はそうでなければより正確な環境又は発達制御下にありうる。誘発可能プロモーターにより転写に影響しうる環境条件の例は嫌気性条件、高温又は光の存在を含む。上記プロモーターは「誘発可能」又は「組織特異的」プロモーターと本明細書中で呼ばれる。当業者は、組織特異的プロモーターは標的組織以外の組織において使用可能につなげられた配列の発現を駆動しうることを認識するであろう。したがって、本明細書中で使用されるとき、組織特異的プロモーターは標的組織において優先的に発現を駆動するが、また他の組織においてもいくらかの発現を引き起こしうるものである。条件付き発現、組織特異的発現又は上記２の組み合わせはまたトランスアクチベーターを用いることによっても達成されることができ、ここで、ＤＹＡＤ核酸は異種の又は合成トランスアクチベーターにより駆動される合成プロモーターの制御下に置かれうる。トランスアクチベーターの組織特異的及び／又は条件付き発現はその後ＤＹＡＤ核酸の対応する発現を駆動しうる。植物において使用されているトランスアクチベート可能な及び誘発可能な系の例はｍＧａｌ４：ＶＰ１６／ＵＡＳ、ｐＯｐ／ＬｈＧ４、ＧＶＥ／ＶＧＥ、ＧＶＧ、ｐＯｐ６／ＬｈＧＲ、及びＸＶＥを含む（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４５： ６５１−６８３（２００６）中に概略される）。
【００８５】
発達制御下のプロモーターの例は果実、種子又は花の如き、ある組織においてのみ（又は主としてのみ）転写を開始するプロモーターを含む。胚珠、花又は種子において核酸の発現を指揮するプロモーターは本発明において特に有用である。本明細書中で使用されるとき、種子特異的プロモーターは種子組織において発現を指揮するものである。上記プロモーターは、例えば、（卵細胞又は中心細胞の如き、母系組織又は雌性配偶体中で発現を指揮するプロモーターを含む）胚珠特異的、胚特異的、内胚乳特異的、珠皮特異的、種子の殻特異的又はそれらのいくつかの組み合わせでありうる。例はＲｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ８３：７３５−７４２（１９９５）中に示される胚珠特異的ＢＥＬ１遺伝子からのプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ３９９４４）、及び雄性減数母細胞特異的ＤＵＥＴ遺伝子からのプロモーター（Ｒｅｄｄｙ Ｔ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １３０（２４）：５９７５−５９８７，２００３）を含む。他の好適な種子特異的プロモーターは以下の遺伝子：トウモロコシからのＭＡＣ１（Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４２：１００９−１０２０（１９９６））、トウモロコシからのＣａｔ３（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｌ０５９３４， Ａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２：１０１３１−１０３８（１９９３））、トウモロコシからのオレオシン１８ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０５２１２，Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：１９８１−１９８７（１９９４））、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ９３２１５）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのオレオシンをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｚ１７６５７）、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡｔｍｙｃｌ（Ｕｒａｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２：５７１−５７６（１９９６））、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの２Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子ファミリー（Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ５：４９３−５０５（１９９４））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのオレオシン２０ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ６３９８５）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのｎａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｊ０２７９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ＪＢＬ ２６： １２１９６−１３０１（１９８７））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からのｎａｐｉｎ遺伝子ファミリー（Ｓｊｏｄａｈｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔａ １９７： ２６４−２７１（１９９５））、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からの２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子（Ｄａｓｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １３３：３０１−３０２（１９９３））、大豆からのオレオシンＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１８）及びオレオシンＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ０９１１９）をコードする遺伝子及び大豆からの低分子量硫黄リッチタンパク質をコードする遺伝子（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．， Ｇｅｎｅｔ． ２４６：２６６−２６８（１９９５））に由来する。
【００８６】
さらに、本明細書中に開示されるＤＹＡＤ遺伝子からのプロモーター配列は本発明に係るＤＹＡＤポリヌクレオチド又は異種の配列の発現を駆動するために使用されうる。適切なポリペプチド発現が所望される場合、コード領域の３’−末端のポリアデニル化領域は含まれるべきである。上記ポリアデニル化領域は天然遺伝子に、さまざまな他の植物遺伝子に又はＴ−ＤＮＡに由来しうる。
【００８７】
本発明に係る遺伝子からの配列（例えば、プロモーター又はコード領域）を含むベクターは典型的に植物細胞上で選択可能表現型を与えるマーカー遺伝子を含むであろう。例えば、上記マーカーは殺生物剤耐性、特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性の如き抗生物質耐性又はクロロサルフロン又はＢａｓｔａに対する耐性の如き除草剤耐性をコードしうる。
【００８８】
トランスジェニック植物の作出
本発明に係るＤＮＡ構築物はさまざまな慣用の技術により所望の植物ホストのゲノムに導入されうる。例えば、上記ＤＮＡ構築物は植物細胞プロトプラストのエレクトロポーレーション及びマイクロインジェクションの如き技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接的に導入されうる又は上記ＤＮＡ構築物はＤＮＡ粒子衝撃の如き衝撃方法を用いて植物組織に直接的に導入されうる。
【００８９】
マイクロインジェクション技術は本分野において知られ、及び科学及び特許文献中に十分に示される。ポリエチレングリコール沈殿を用いたＤＮＡ構築物の導入はＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｍｂｏ Ｊ． ３：２７１７−２７２２（１９８４）中に示される。エレクトロポーレーション技術はＦｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：５８２４（１９８５）中に示される。衝撃形質転換技術はＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３（１９８７）中に示される。
【００９０】
あるいは、上記ＤＮＡ構築物は好適なＴ−ＤＮＡフランキング領域と結合され、及び慣用の土壌細菌の根頭癌腫病細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ホストベクターに導入されうる。土壌細菌の根頭癌腫病細菌ホストの有毒機能は、細胞が上記細菌に感染するとき、植物細胞ＤＮＡへの上記構築物及び近隣マーカーの挿入を指揮するであろう。二種混合型ベクターの無力化及び使用を含む、土壌細菌の根頭癌腫病細菌仲介形質転換技術は科学文献中に十分に示される。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４９６−４９８（１９８４）、及びＦｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：４８０３（１９８３）を参照のこと。
【００９１】
上記形質転換技術のいずれかにより導かれる形質転換された植物細胞は形質転換された遺伝子型及びしたがって増大された種子の大きさの如き所望の表現型を有する植物全体を再生するために栽培されうる。上記再生技術は、典型的には所望のヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤及び／又は除草剤マーカーに頼って、組織培養生育培地中のある植物ホルモンの操作に頼る。培養プロトプラストからの植物再生はＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐｐ．１２４−１７６， ＭａｃＭｉｌｌｉｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３；及びＢｉｎｄｉｎｇ， Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ， ｐｐ．２１−７３， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９８５中に示される。再生はまた植物カルス、外植片、器官又はそれらの部分からも得られうる。上記再生技術はＫｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ． ３８：４６７−４８６（１９８７）中に一般的に示される。
【００９２】
本発明に係る核酸は本質的にどんな植物に対しても所望の特性を与えるために使用されうる。したがって、本発明はＡｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｅｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｈｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｔｉｓ、Ｖｉｇｎａ、及びＺｅａ属からの種を含む、広い範囲の植物にわたり使用を有する。
【００９３】
当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、及び使用可能であることが確認された後、それは性交配により他の植物に導入されうることを認識するであろう。いくつかの標準の交配技術のいずれかが交配される種に因り使用されうる。
【００９４】
本発明に係る植物から得られる種子は所望の特性を有する植物を同定する周知の手順にしたがって分析されうる。アンチセンス又は他の技術がＤＹＡＤ遺伝子発現を制御するために使用される場合、ＲＴ−ＰＣＲ又はノザンブロット分析が所望の植物をスクリーニングするために使用されうる。さらに、受精非依存的生殖発達の存在が検出されうる。植物は、例えば、胚なし種子を形成する、受精後に発育不全となる種子を形成する又は受精なしで果実を結ばせる能力についてスクリーニングされうる。これらの手順は部分的には使用される特定の植物種に因るであろうが、当業者に周知の方法にしたがって行われるであろう。
以下の実施例は本発明の例示のために与えられ、及び本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００９５】
実施例１：ｄｙａｄ変異体は欠陥雌性稔性及び減数された種子セットを示す
ｄｙａｄ変異体をＥＭＳ変異Ｍ２植物の集団中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの不稔性変異体についてのスクリーニングにおいて単離した（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２７（１）：１９７−２０７（２０００））。相反交配による稔性の分析は、上記変異体は雌性不稔性であるが、雄性稔性であることを示した。雌性胞子生殖及び胚珠発達の分析は、ｄｙａｄは欠陥雌性減数分裂を経験し、減数分裂細胞周期をとおした欠陥のある進行のために単一の減数分裂分割、続いて大多数の胚珠における雌性配偶子の発達の停止及び失敗をもたらしたことを示した。減数母細胞の染色体スプレッドの観察による雌性減数分裂の分析は、雌性減数分裂はｄｙａｄ変異体において異常であることを示した：染色体はシナプスを形成することに失敗し、及び通常減数分裂１で起こりうる減数分割の代わりに等分割を経験した（Ａｇａｓｈｅ Ｂ．， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。
【００９６】
図１中に示されるように、ｄｙａｄ変異体中の種子セットは野生型と比較されるとき非常に減数されており、及び変化は異なるｄｙａｄ変異体植物の間で種子セットの程度において観察された。数の点での均一性は上記集団中の植物の間で観察されなかったので、上記種子セットは時々起こるものであり及びランダムであった。種子セットについてのモードは植物当たり１〜１０であったが、最大約２７５までに及び、２７５はめったに観察されなかった（５００植物中に１）。
【００９７】
実施例２：雄性減数分裂及び稔性はｄｙａｄ変異体において正常である
花粉生存能力をＡｌｅｘａｎｄｅｒ染色を用いて調べ、及び花粉は完全に生存能力があり、及び野生型に匹敵することがわかった（図２）。減数母細胞の染色体スプレッドの分析による雄性減数分裂の調査は、雄性減数分裂は正常であり、及び四分子の半数体胞子の生成をもたらしたことを示した（図３）。雄性減数分裂、雄性稔性、及び花粉発達及び機能はそれゆえｄｙａｄ変異体において正常であった。一方、雌性減数分裂はｄｙａｄにおいて異常である。相同染色体のシナプス形成が起こるのは見られず、及び野生型雌性減数分裂の減数分裂１分割（図３Ｃ）はｄｙａｄにおいて等分割により置換される（図３Ｅ）。
【００９８】
実施例３：ｄｙａｄ変異体から得られた種子は発芽し、三倍体植物を与える
ｄｙａｄ変異体において生成される種子が少数の雌性減数母細胞における正常な減数分裂から生じ、正常な機能的胚のうを生ずるよう進み、正常な機能的胚のうがその後半数体花粉により受精され種子に発達することは可能である。これが事実であった場合、これらの種子はｄｙａｄ変異体において起こる異常な雌性減数分裂から逃避した種子を代表しうる。この可能性を調べるために、ｄｙａｄ植物からの種子（ｎ＝１６９）を発芽させ、及び高い効率（＞９０％）で発芽し及び異常な種苗を与えたいくつか（１０％）を除いては形態学的に正常な種苗を生成することを見出した。子葉の形、対称性及び数における変化の例は発芽する種苗において観察されなかった。これは、減数分裂１における染色体のランダム分離を経験し、種苗段階である範囲の発達異常を示すより高い割合の異数性子孫をもたらすＡｔＳｐｏ１１−１及びＡｔＤｍｃ１の如き、他の減数分裂変異体に由来する種苗とは対照的である（Ｇｒｅｌｏｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．， Ｖｏｌ ２０：５８９−６００，２００１，Ｃｏｕｔｅａｕ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ． １１（９）：１６２３−１６３４，１９９９）。土壌への移行に際しての続く種苗の栄養器官の生長もまた正常であり、及び栄養器官の生長が親ｄｙａｄ変異体植物はもちろん野生型に同様である植物を生じた。観察された主な相違は、上記植物がとう立ちし始めたときの花の大きさにおいてであった。大多数の植物（ｎ＝４１／５２）において花の大きさにおける相対的増大は野生型に対して観察された。増大した花の大きさは可能性として生長力における増大又は好ましい環境の影響に帰することができる。上記植物は制御された環境において生育されるので、私たちは後者の可能性を除外した。花器官の大きさにおける増大についての他の可能性のある理由は倍数性における増大でありうる。倍数性における増大は栄養器官及び花の構造、特に花粉粒の大きさにおける増大により表される（Ａｌｔｍａｎｎ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ． Ｖｏｌ． １３：６５２−６５６，１９９４）。ランダムに摘まれた植物からの花のつぼみを体細胞中の及び雄性減数母細胞中の染色体の分析によりそれらの倍数性の値について調べた。減数分裂染色体スプレッドの調査により、１７／１９の場合において、上記植物は三倍体であることが発見され、及び残りの２は二倍体であることがわかった（図４）。花粉発達及び雄性減数分裂はｄｙａｄ変異体において正常であるが、一方で減数雌性減数分裂は等分割により置換されるので、これらの結果は、三倍体である大多数の上記種子は正常な半数体精子による減数されていない（二倍体）卵細胞の受精から生じ、及び少数の胚珠における正常な雌性減数分裂からは生じない、すなわち、上記大多数の種子は異常な減数分裂から逃避した種子を代表しないことを示す。
【００９９】
実施例４：ｄｙａｄに由来する三倍体植物は全てのヘテロ接合マーカーの保持を示す
ｄｙａｄ変異体において形成された三倍体種子は、ｄｙａｄにおいて起こる等しい雌性減数分裂と一致しうる、正常な半数体花粉による減数されていない胚のうの受精の産物でありうる。上記減数されていない胚のうが大胞子母細胞の等分割の産物から生ずる減数されていない大胞子から形成され、ここで、染色体は一価として残り、及び組換えを経験しない場合、上記減数されていない胚のうの遺伝子型は二倍体親植物のそれと同一であろう。それゆえ、上記親植物が分子マーカーについてヘテロ接合である場合、三倍体子孫もまたそのマーカーについてヘテロ接合であろう。セントロメアに結合されていないマーカーがヘテロ接合状態で考えられる場合、組換えの完全な不在において、親のヘテロ接合性の１００％伝達は生ずる雌性配偶子及び三倍体子孫において達成されるであろう。組換え及び交差が起こる場合、１００％ヘテロ接合性は生ずる三倍体子孫において維持されないであろう。セントロメアに結合されていないマーカーについては、減数されていない胚のうにおいてホモ接合性を３３％の頻度で、及び三倍体子孫において１６．７％の頻度で期待することができるが、一方で組換えの完全な不在においてはホモ接合体は全くないであろう。ヘテロ接合性の喪失を伴わない減数されていない胚のうの形成は無配偶生殖を作出すること及び雑種強勢の固定のために高く所望される。私たちはｄｙａｄ変異体植物の三倍体子孫中でヘテロ接合性の喪失を計測するためにマイクロサテライトを使用した。ｄｙａｄ変異体植物を野生型Ｎｏｓｓｅｎ（Ｎｏ−Ｏ）及びｄｙａｄ変異体Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）生態型の間での交配の分離するＦ２集団において同定した。５のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ染色体のそれぞれにわたり分布し、及びセントロメアに結合しない（＞３５ｃＭ）候補マーカーをＴＡＩＲデータベースから得た（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）。Ｆ２集団を作出するために使用される親植物を多形性を確かめるために調べ、及び上記結果に基づいて私たちは遺伝子型５０ Ｆ２ｄｙａｄ変異体植物に対する４の異なる染色体上の５の異なるマーカー（表１）を選択し、及びそれぞれの植物がヘテロ接合であるそれらのマーカーを同定する。自家受粉させた種子を個々に５０ Ｆ２植物から集め、及びさまざまな数の同胞から成る５０の異なるファミリーとして生育させた。これは５０ファミリーにわたり分布される全部で１９６の植物を与えた。それぞれのファミリーの全てのメンバーは、親植物がヘテロ接合であるそれらのマーカーについて遺伝子タイピングされ、それぞれのマーカーについて５０ Ｆ２ファミリーの全てにわたり分布される７４〜１１９植物を与えた。
【０１００】
表１：ヘテロ接合性及び組換えの喪失を計測するためのｄｙａｄ植物の子孫のマーカー分析。
カラム６中の括弧内のaの印はそのマーカーについて分析された全ての植物のホモ接合体の割合を示す。
【表１】
【０１０１】
スクリーニングされた１９６の植物から、私たちは親植物がヘテロ接合である少なくとも１のマーカーについてホモ接合である３５の植物を得た。これらの３５植物のうちの２２の倍数性を減数分裂染色体スプレッドを行うことにより決定した。２１は二倍体であり、及びもう一つは１３染色体を有する高二倍体であることがわかった。したがって、上記分析にしたがって、ヘテロ接合性の喪失は二倍体においてのみほとんど排他的に見つけられた。ヘテロ接合性の喪失を示さなかった植物のうち、１５植物を別々のＦ２ファミリーからランダムに選択し、及びそれらの倍数性について調べた。１５全てが三倍体であることがわかった。
【０１０２】
上記結果はそれゆえ、二倍体ｄｙａｄ変異体植物からの子孫の大多数のクラスを構成する三倍体においてヘテロ接合性の喪失はないことを示す。三倍体においてヘテロ接合性の喪失を発見することができなかったことはまたそれらの形成についての代替の可能性のある機構、つまり多精、すなわち、またヘテロ接合性の喪失を予想するであろう２の別々の雄性配偶子による半数体雌性配偶子の受精の可能性をも排除する。私たちの発見は、ｄｙａｄ変異体植物の三倍体子孫は親植物の遺伝子型を保持する減数されていない胚のうの受精から生ずることを示す。減数されていない胚のうの形成は無配偶生殖の鍵となる局面である。
【０１０３】
実施例５：Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉからのＤＹＡＤホモログの単離及び機能的特徴付け
条件的に無配偶生殖のＢｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ Ｄｉｐｌｏｉｄ Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ及びＴｒｉｐｌｏｉｄ Ｃｏｌｏｒａｄｏ（Ｎａｕｍｏｖａ Ｔ． Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １４：１９５−２００，２００１）からのＤＹＡＤホモログの３ｋＢゲノムコード領域をＢｈｏ５Ｂａｍ（配列ＩＤ番号：３９）及びＢｈｏ３Ｂａｍ（配列ＩＤ番号：４０）プライマーを用いてクローニングした。ＢｈＤＹＡＤゲノムクローン（配列ＩＤ番号：１６）をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤプロモーターに使用可能につなげ、及び補完について試験するためにｄｙａｄ変異体植物を形質転換するために使用した。上記ＢｈＤＹＡＤ ｃＤＮＡをまた増幅し及びシークエンスした（配列ＩＤ番号：１７）。土壌細菌仲介ｉｎ ｐｌａｎｔａ減圧浸潤形質転換はｄｙａｄについてヘテロ接合であるＦ１植物に発現構築物を動員させた。私たちは４２の形質転換体を得、そのうち９の形質転換体はｄｙａｄ位置の側面に位置するＣＡＰＳ及びマイクロサテライトマーカーにより決定されるようにｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてホモ接合であった（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。９の形質転換体のうち４の形質転換体は、完全な種子セットを含むことがわかった十分に伸長した長角果（図５）により判断されうるｄｙａｄ変異体表現型の補完を示した。残りの５植物はおそらく共抑制のために不稔性であった。
【０１０４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の生長
ｄｙａｄ変異体を含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ株はより初期に示されるとおりであった（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖｏｌ．１２７（１）：１９７−２０７（２０００））。マイクロサテライトマーカー分析について使用されるＦ２集団は示されるように（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖｏｌ．１２７（１）：１９７−２０７（２０００））株Ｎｏ−Ｏ（Ｎｏｓｓｅｎ 生態型）及びＣｏｌ−０生態型バックグラウンドにおけるｄｙａｄ変異体の間の交配に由来した。植物を示されるように（Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｖｏｌ．１２７（１）：１９７−２０７（２０００））制御された環境で生育させた。
【０１０５】
ペトリ皿で種子を発芽させるために、上記種子を１０分間エタノールで表面滅菌し、続いてそれらを０．０２５％塩化水銀（ＩＩ）で５分間処理した。さらに、上記種子を塩化水銀（ＩＩ）の痕跡を除去するために滅菌水で３回洗浄した。上記種子をなまぬるい０．５％トップアガー中に再懸濁し、及び２％スクロースで補充されたＭＳアガープレート（０．７％）上に均一に広げた。上記プレートを薄層流フード中で１時間乾燥させ、及び上記プレートをパラフィルムで密閉し、及び４℃の低温室で層化のために３日間維持した。その後、上記プレートを生育チャンバーに移した。発芽頻度をその２週間後にカウントした。
【０１０６】
ポット中で種子を生育させるために、生育中の植物のために使用される合成培地を等しい割合のＳｏｉｌｒｉｔｅ： Ｐｅｒｌｉｔｅ： Ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ（Ｋｅｌｔｅｃｈ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ｌｔｄ．， Ｋａｍａｔａｋａ ５７４ １０８、 Ｉｎｄｉａ）を混合することにより調製した。上記ポット混合物を毛細管上昇を許容する底に穴をあけられたポットに均等に適用し、及び上記ポットを、１ｍｌ（１０００×）Ｍｉｎｏｒ Ｓａｌｔｓ：（Ｈ３ＢＯ３（７０ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１４ｍＭ）、ＣｕＳＯ４（０．５ｍＭ）、ＺｎＳＯ４（１ｍＭ）、ＮａＭｏＯ４（０．２ｍＭ）、ＮａＣｌ（１０ｍＭ）、ＣｏＣｌ２（０．０１ｍＭ））がリットル当たり添加された、Ｍａｊｏｒ Ｓａｌｔｓ：ＣａＣｌ２（４ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１．５ｍＭ）、ＫＮＯ３（１８．８ｍＭ）、ＮＨ４ＮＯ３（２０．６ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２５ｍＭ ｐＨ５．６）、Ｆｅ−ＥＤＴＡ（２０ｍＭ）を含む１×ＭＳ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に浸漬した。上記種子を上記ポットの表面上に均等に広げ、及びサランラップで覆い、及び層化のために４〜８℃で３日間維持し、及びその後生育チャンバーに移した。移植の場合、上記ポットを種苗が土壌培地に移された後サランラップで覆い、生育チャンバー中に直接入れた。一旦上記植物が鉢植えミックス中に確立されたら、上記サランラップを除去した。水やりを蒸留水を用いて規則的な間隔で行った。
【０１０７】
種子セット分析
Ｃｏｌ−０生態型バックグラウンド中にｄｙａｄ変異を有するＦ２分離集団をｄｙａｄホモ接合植物中の種子セットの頻度をスコアリングするために使用した。ｄｙａｄ変異体植物を上記植物が花を咲かせ終わるそれらの最終段階まで生育させた。この段階後、水やりを長角果が収穫完熟に達するようｗｉｔｈｅｌｄさせた。その間、黄色くなった及びこなごなになりそうな最も低い長角果を個々に裂け開き、及び存在する場合は種子を単一の植物ベースで収穫した。そのようにして、必要な種子を可能性のある種子損失を避けるために規則的な間隔で収穫した。最後に、回収した種子を単一の植物ベースで集め、植物当たりの種子の総数をカウントした。
【０１０８】
花粉生存力
葯中の小胞子についての生命力染色を示されるように（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｍ． Ｐ．， Ｓｔａｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．４４（３）：１１７−１２２，１９７１）行った。
【０１０９】
減数分裂スプレッド
雄性及び雌性減数分裂スプレッドの分析は示されるとおりである（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。
【０１１０】
植物ＤＮＡ単離
マイクロサテライトマーカー分析のためのゲノムＤＮＡを、少しの改変を伴うＤｅｌｌａｐｏｒｔａ Ｓ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｐ．， Ｖｏｌ．１：１９−２１（１９８３）により示される方法にしたがって単離した。約５００ｍｇの葉組織を１．５ｍｌエッペンドルフ管中に個々の植物から集め、及び液体窒素中で急速冷凍した。その後上記組織を微小乳棒を用いて細かい粉末になるまでひいた。この粉末に２００μｌの新たに調製した抽出緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１．４％ ＳＤＳ、及び１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）を添加し、及び微小乳棒で細かくホモジェナイズした。その後等体積の２×ＣＴＡＢを添加し、及び上記混合物をおだやかにヴォルテックスした。その後上記混合物を振騰水槽中で６５℃で５分間インキュベートした。その後上記サンプルを冷却させ、及び等体積の２４：１ クロロフォルム：イソアミルアルコールを添加し、及びおだやかに混合し、及び１３０００ｒｍｐで１０分間遠心分離した。ＤＮＡを含む水相を新しいエッペンドルフ管に移し、及び２／３体積の氷で冷却したイソプロパノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。上記ＤＮＡを４℃で１３０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によりペレット化した。上記ＤＮＡペレットを７０％エタノール洗浄し、及び上記ペレットを３０分間風乾し、及びＤＮＡｓｅフリーＲＮＡｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）を含む５０μｌの滅菌水又はＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中に懸濁した。
【０１１１】
マーカー分析
Ｃｏｌ−０及びＮｏ−Ｏ生態型の親調査に基づいて、セントロメアに理にかなって結合されていない、４の異なる染色体からの５のマイクロサテライトマーカーを選択した。これらのマーカーをあるマーカーについてヘテロ接合であるｄｙａｄ植物を選択するためにＦ２（Ｎｏ−Ｏ×Ｃｏｌ−０（ｄｙａｄ））分離集団について使用した。これらのｄｙａｄ植物からの種子を集め、及びそれぞれの子孫が特定の母ｄｙａｄ植物の同胞を構成するよう個々のペトリ皿中で発芽させた。そのようにして、あるマーカーについてヘテロ接合であるさまざまな植物からの同胞についてのデータをマーカー分析について共に考慮した。
【０１１２】
マイクロサテライトマーカー及びそれらの位置のリストは表１中に示されるとおりである。マイクロサテライトを増幅するために使用されるプライマー配列はＴＡＩＲウェブサイトからである（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）：
ｎｇａ１６２
ｎｇａ１６２Ｆ 配列ＩＤ番号：６
ｎｇａ１６２Ｒ 配列ＩＤ番号：７
ｎｇａ２２５
ｎｇａ２２５Ｆ 配列ＩＤ番号：８
ｎｇａ２２５Ｒ 配列ＩＤ番号：９
ｎｇａ１６８
ｎｇａ１６８Ｆ 配列ＩＤ番号：１０
ｎｇａ１６８Ｒ 配列ＩＤ番号：１１
ｎｇａ１１０７
ｎｇａ１１０７Ｆ 配列ＩＤ番号：１２
ｎｇａ１１０７Ｒ 配列ＩＤ番号：１３
ｎｇａ６
ｎｇａ６Ｆ 配列ＩＤ番号：１４
ｎｇａ６Ｒ 配列ＩＤ番号：１５
【０１１３】
ＰＣＲを２ｍＭ ＭｇＣｌ、０．２ｍＭ それぞれのｄＮＴＰ、１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）、及び５ｐｍｏｌｅｓの前向き及び逆向きフランキングプライマーを含む１×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中で５５℃のアニーリング温度で７２℃で２０秒間の伸長で行った。ＰＣＲ産物を８％ポリアクリルアミドゲル上で１５０Ｖで３時間分析し、及び臭化エチヂウムで染色し、及びＳｙｎｇｅｎｅゲルドキュメンテーションシステム（Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ． ＵＫ）を用いて捕えた。
【０１１４】
植物材料
Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉの条件的無配偶生殖二倍体Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ及び三倍体Ｃｏｌｏｒａｄｏ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓはＫｉｍ Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ（Ｎａｕｍｏｖａ Ｔ． Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｘ． Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ． Ｖｏｌ． １４：１９５−２００，２００１）からの好意的な贈与であった。植物をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓについて示される培地を含むポットで生育させ、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓについての条件と同一の条件下で生育させた。
【０１１５】
ＤＹＡＤプロモーターのクローニング
１．８ｋｂのＤＹＡＤプロモーター領域をプライマーｐｇ２ｒ４（配列ＩＤ番号：４８）及びＰＤＹＢＡＭ（配列ＩＤ番号：４７）を用いてＣｏｌ−０生態型から増幅し、及び生成物を製造業者の教示によりｐＧＥＭＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【０１１６】
Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉからのＤＹＡＤホモログのクローニング
Ｂｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉｉからのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤホモログのゲノムコード領域（ＢｈＤＹＡＤ）を５’末端上にＢａｍＨＩサイトを有するプライマー：Ｂｈｏ５ＢＡＭ（配列ＩＤ番号：３９）及びＢｈｏ３ＢＡＭ（配列ＩＤ番号：４０）で増幅した。生ずる３ｋｂ断片をｐＧＥＭＴにクローニングした。
【０１１７】
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤプロモーター下でＢｈＤＹＡＤを駆動する二種混合型ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００の構築
ＢｈＤＹＡＤを３ｋｂ ＢａｍＨＩ断片としてｐＧＥＭＴから放出させ、及び植物選択可能マーカーヒグロマイシンを有するｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにクローニングした。方向をプライマーＢＤＹ３（配列ＩＤ番号：３６）及びＯＣＳＲ（配列ＩＤ番号：３８）を用いてチェックした。１．６ｋｂ ＤＹＡＤプロモーター領域（配列ＩＤ番号：２２）をｐＧＥＭＴベクターからＳａｃＩ断片として放出させ、及びｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクター中のＢｈＤＹＡＤの上流に挿入した。ＢｈＤＹＡＤゲノム配列についてのプロモーターの方向をプライマーｉｓｍｒ４（配列ＩＤ番号：３７）及びｂｄｙ１（配列ＩＤ番号：３５）を用いて確認した。
【０１１８】
三親交配
上記構築された二種混合型ベクターｐＣＡＭＢＩＡの土壌細菌（ＡＧＬ１）への移行は示されるように（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））三親交配によった。
【０１１９】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の形質転換
ＢｈＤＹＡＤの補完分析のために、Ｃｏｌ−０×ｄｙａｄのＦ１植物をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＹＡＤプロモーターにより駆動されるＢｈＤＹＡＤを有する構築物で形質転換した。土壌細菌仲介ｉｎ ｐｌａｎｔａ減圧浸潤形質転換をＢｅｃｈｔｏｌｄ Ｎ． ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｇ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ８２：２５９−６６（１９９８）にしたがって行った。
【０１２０】
形質転換体の選択
減圧浸潤されたＦ１植物からのＴ０種子を２０μｇ／ｍｌヒグロマイシンを有する０．８％ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、１ｍＭ ＫＮＯ３及び１％ Ｓｕｃｒｏｓｅを含むペトリ皿上にまいた。３日間の冷却層化後、上記プレートを生育チャンバーに移した。ヒグロマイシンに対して耐性である形質転換体は十分に伸長した根、直立した胚軸及び十分に広がった子葉の葉によって早くも移行後５日で同定されうる。選択された形質転換体をヒグロマイシンを含むＭＳプレートにさらに移し、及び耐性が確立された後、それらを最終的に土壌培地に移した。さらに、上記植物を先に示されるようにｂｄｙ３及びＯＣＳＲプライマーを用いて挿入物の存在についてチェックした。
【０１２１】
ｄｙａｄ位置での接合性についての遺伝子タイピング
分離ｄｙａｄＦ２集団からの３の遺伝子型を共ドミナントＣＡＰＳマーカー（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ Ａ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ． Ｍ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， Ｖｏｌ． ４（２）：４０３−４１０， １９９３）及び変動マイクロサテライトにより同定した。ｄｙａｄ変異体対立遺伝子のフランキング配列はＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ生態型に由来し、及び野生型対立遺伝子からのフランキング配列はＣｏｌｏｍｂｉａ生態型配列を有する。したがって、これらのフランキング配列中のＳＮＰｓをｄｙａｄ位置のいずれかの側に密接に結合される及びフランキングするＣＡＰｓマーカー（ＫＮＥＦ（配列ＩＤ番号：３１）及びＫＮＥＲ（配列ＩＤ番号：３２）、ＫＫＦ（配列ＩＤ番号：３３）及びＫＫＲ（配列ＩＤ番号：３４））及びＤＹＡＤに密接に結合されるマイクロサテライトマーカープライマー（ＫＭＦ（配列ＩＤ番号：２９）及びＫＭＲ（配列ＩＤ番号：３０））を開発するために利用した（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。上記マーカーを用いたｄｙａｄ位置での遺伝子タイピングは示されるとおりであった（Ａｇａｓｈｅ Ｂ， Ｐｒａｓａｄ Ｃ． Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｄｄｉｑｉ Ｉ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ． １２９（１６）：３９３５−３９４３（２００２））。
【０１２２】
ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成
二倍体Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ植物からの十分に発達した単一のつぼみ（芽）を製造業者の教示によるＴｒｉＺｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるトータルＲＮＡ単離のために使用した。４μｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｃｈｏｉｃｅシステム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いたはじめの鎖ｃＤＮＡ合成のために使用した。上記ｃＤＮＡをプライマー５ＲＦ３（配列ＩＤ番号：４１）及びＢｈｏ３ＢＡＭ（配列ＩＤ番号：４０）を用いることによりクローニングのためにさらに増幅させた。生ずる１．９ＫＢ断片をｐＧＥＭＴにクローニングし、及びシークエンスした。結果は配列ＩＤ番号：１７として配列リスト中に示される。対応するＤＹＡＤタンパク質のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号：１８中に示される。
【０１２３】
実施例６：ＤＹＡＤの条件付き対立遺伝子の構築及びｄｙａｄ変異体表現型を示すトランスジェニック植物の同種集団の開発
ＤＹＡＤ遺伝子の条件付き対立遺伝子を構築するために使用される策はＤＹＡＤのＣ−末端にラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）のホルモン結合ドメイン（配列ＩＤ番号：２７）を融合すること、及びｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてホモ接合である（ｄｙ／ｄｙ）植物のゲノムに上記融合構築物を統合することに基づいた。上記ＧＲドメインはステロイドホルモンの不在下では細胞質局在を与えるが、一方でＤＹＡＤの活動部位は核内であるので、ＤＹＡＤ−ＧＲ融合タンパク質はそれだけではｄｙａｄ変異体を補完することができない。しかしながら、ステロイドホルモンの存在下では、上記融合タンパク質は細胞質結合部位から放出され、及び核へ移行することができるようになり、そこでそれはｄｙａｄ変異体を補完しうる。上記構築における段階は以下のものであった：上記植物二種混合型ベクターｐＢＩ１０１．３を、ＧＵＳ受容体遺伝子を除去し、及びＧＲドメインを含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片でそれを置き換えるために、ＢａｍＨＩ＋ＳａｃＩで消化した（Ａ．Ｍ． Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， ４３６−４３９（１９９４））。
【０１２４】
生ずるプラスミドをｐＢＩ１０１．３：：ＧＲと名付けた。次に、プライマーＤｙＣＦ（配列ＩＤ番号：４３）及びＤｙＰＢ（配列ＩＤ番号：４２）（停止コドンを改変する及びＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩのための制限酵素部位を導入するための配列を含む）をＤＹＡＤ遺伝子の３０４ｂｐＣ−末端領域をＰＣＲ増幅するために使用した。改変された配列を２１６ｂｐ ＰｓｔＩ断片として、Ｐ１クローンＭＦＧ１３（Ａｃｃ番号ＡＢ０２５６２１）のコーディネート９６８４〜３８７８に対応する全ＤＹＡＤ遺伝子を含む５．８ｋｂゲノムクローン（配列ＩＤ番号：２８）を有するｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄプラスミドにクローニングし、ｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ*を得た。生ずるプラスミドは、その停止コドンＴＧＡはＧＧＧにより置き換えられた及びまた上記置き換えられたコドンと共にＢａｍＨＩサイトを有するＤＹＡＤ遺伝子を含んだ。ＭＦＧ１３のヌクレオチド９６８４〜９４１６を含むｐＢＳＩＩ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ*からの２６９ｂｐ ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片をＳａｌＩ＋ＢａｍＨＩでの消化後、ｐＢＩ１０１．３：：ＧＲにクローニングした。９４１７〜５３３５からのＤＹＡＤの残りの部分をその後ｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ*からのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片として前の段階の産物にクローニングし、ＤＹＡＤのＣ−末端へのＧＲドメインのフレーム内融合をもたらした。ｐＢＩ１０１．３：：ＤｙａｄΔＧＲと名付けられた最終的なプラスミドは図６中に示される。
【０１２５】
上記構築物をヘルパーＥ． ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１［ｐＲＫ２０１３］を用いて三親交配により土壌細菌株ＡＧＬ１に導入した。Ｔ−ＤＮＡ領域でｉｎ−ｐｌａｎｔａ形質転換により、ｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてヘテロ接合である（＋／ｄｙ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（Ｔ０）を形質転換した（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ Ｎ． ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｇ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．８２：２５９−６６，１９９８）。カナマイシン耐性Ｔ１種苗をカナマイシン（５０ｍｇ／リットル）を含むＭＳアガープレート上に種子をまくことにより選択し、及び耐性表現型を確認するためにＭＳ＋カナマイシンプレートに移した。形質転換体をＤｙＣＦ（配列ＩＤ番号：４３）及びＧＲｒｅｖ（配列ＩＤ番号：４４）プライマーを用いてＰＣＲによりさらに同定した。確認されたカナマイシン耐性種苗を土壌に移し、及び成体段階まで生育させた。とう立ち及びはじめの８〜１０の長角果の発達後、植物に１０μＭデキサメタゾン＋０．０１５％Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を毎日噴霧することに加えて、１０μＭデキサメタゾンを伴って３日毎に水やりをした。デキサメタゾン処理前に不稔性を示したいくつかの植物はデキサメタゾン処理の開始５〜７日後に稔性長角果を発達したことが留意された。植物材料の一部を挿入物のコピー数を決定するためにサザン分析に使用し、及びまたｄｙａｄ位置に密接に結合した及びフランキングするＰＣＲに基づいたＣＡＰＳマーカーを用いてｄｙａｄ位置について遺伝子タイピングした。上記ｄｙａｄ変異体はＬｅｒバックグラウンド中でもともと単離され、及びその後Ｃｏｌ株に遺伝子移入された。それゆえ、ＣＡＰＳマーカーのＬｅｒ対立遺伝子はｄｙａｄ変異体について特徴的であるが、一方でＣｏｌ対立遺伝子は野生型の表示である（図７）。単一コピー挿入物を少なくとも１コピーのｄｙａｄ変異体対立遺伝子を有する植物の中で同定し、及びこれらの植物からの種子をＭＳ＋カナマイシンプレート上にまいた。カナマイシン耐性種苗を土壌に移し、及びｄｙａｄ位置について遺伝子タイピングした。ｄｙａｄ変異体対立遺伝子についてホモ接合である植物を同定し、及び成体になるまで生育させた。とう立ち後、全ての植物に、はじめの８〜１０の花の開花までのはじめの相の間水をやり、その後上記に示されるようにデキサメタゾンを含む溶液を伴って水やりをした。条件付き不稔性を示した系を異なる単一コピー挿入物をスクリーニングすることにより同定した。例として、図８中に示される１の系番号３３は、その全てが生殖生育のはじめの相の間不稔性を示し、及びデキサメタゾン処理後稔性になったｄｙａｄ変異体植物（ｄｙ／ｄｙ）を与えた。デキサメタゾン処理前に単離されたつぼみ（芽）からの胚珠はｄｙａｄ変異体表現型を示したが、一方でデキサメタゾン処理後に単離されたものは野生型表現型を示した（図９）。種子をホモ接合ｄｙａｄ変異体植物から集め、Ｔ３ファミリーを得、及びＤＹＡＤ−ＧＲ挿入物についてホモ接合であるＴ３ファミリーを全てカナマイシン耐性種苗を与えるファミリーについてスクリーニングすることにより同定した。これらの結果はＤＹＡＤの条件付き対立遺伝子の構築及び植物へのその導入、それによる１セットの条件（デキサメタゾンの不在）下でｄｙａｄ変異体表現型及びデキサメタゾンを与えられた（又は噴霧された）とき野生型表現型を示す植物を与えることを例示する。これらの結果はまたその全てがｄｙａｄ変異体表現型を示す植物の均一な集団の発達を可能にする。
【０１２６】
この研究において使用されたグルココルチコイド受容体ドメイン配列（９１４ｂｐ）（配列ＩＤ番号：２７）
【化１】
【０１２７】
ｐＢＳ（ＫＳ）：：Ｄｙａｄ中のＳａｌＩ断片としてクローニングするために使用されるＤｙａｄゲノム配列（５８０７ｂｐ）（配列ＩＤ番号：２８）
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【０１２８】
実施例７：三倍体（３ｎ）であるｄｙａｄ変異体の自家受粉種子は雌性配偶子からの二倍体（２ｎ）寄与を含む
相反交配を四倍体（４ｎ）及び二倍体（２ｎ）野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の間で行った。両方の場合で、生成される種子は三倍体である。しかしながら、雄親が四倍体であり、及び雌親が二倍体であったとき、生成された種子は大きく、一方で雄親が二倍体であり、及び雌親が四倍体であったとき、種子は縮んでいた。これらの結果は図１０中に示され、及び種子のそれぞれのカテゴリーについての１００種子の重量は表２中に示される。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
これらの発見は先行分野において知られることを再生する（Ｓｃｏｔｔ ＲＪ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５， ３３２９−３３４１， １９９８）。いずれの機構の理論にもとらわれることなく、種子発達の調節における父性及び母性ゲノムの不等は、全ての種子の間での源の公平な分布を好むことにより胚の生育を制限する母親、及びその適応度はより大きな源の蓄積により増大されるそれぞれの胚の間の源配分についての競合から生ずるとして、親−子孫衝突理論にしたがって説明されている（Ｈａｉｇ Ｄ． ａｎｄ Ｗｅｓｔｏｂｙ Ｍ．， Ａｍ． Ｎａｔ． Ｖｏｌ．１３４：１４７−１５５，１９８９）。Ｈａｉｇ Ｄ． ａｎｄ Ｗｅｓｔｏｂｙ Ｍ．， Ａｍ． Ｎａｔ． Ｖｏｌ． １３４：１４７−１５５，１９８９にしたがって、胚において母系で発現される刷り込みされる遺伝子は胚の生育を制限するようはたらきうるが、一方で父系で発現される遺伝子は胚の増大される生育を好みうる。したがって、余分の父系ゲノム同等物を含む種子は胚の生育を促進する過剰な量の遺伝子産物のために正常より大きいであろうが、一方で余分の母系ゲノム同等物を含む種子は胚の生育を制限する過剰な量の遺伝子産物のために正常より小さいであろう。
【０１３１】
ｄｙａｄ変異体の自家受粉種子中の母系及び父系寄与を扱うために、上記種子を大きさについて分析した。ｄｙａｄ変異体植物から得られた自家受粉種子は大きさにおいて不均一であり、及び図１０中に示されるように３のカテゴリー：大きい、正常、及び縮んでいるのいずれかに分類された。７の個々のｄｙａｄ変異体植物からの大きさクラスの分布は以下に示される：
【表３】
【０１３２】
それぞれのクラスからの種子を複数の植物からサンプリングし、発芽させ、及び苗になるまで生育させた。それぞれの植物の倍数性を減数分裂スプレッド中の染色体カウントにより決定した。結果は以下の表４中に示される：
【表４】
括弧内の数字はそれぞれのカテゴリー内で調べられた全植物の割合を示す。
【０１３３】
これらのデータは、ほとんどの三倍体が大きさにおいて縮んでおり、及び種子の縮んだカテゴリーの大きな部分を構成することを示す。ほとんどの三倍体が縮んでいるという観察は、それらが過剰な母系寄与（２ｎ）から生じ、及び過剰な父系寄与から生じないこと、及び父系寄与はそれゆえ三倍体において１ｎであろうことを示す。全ての三倍体は親のヘテロ接合性を保持するという実施例４の発見と共に、これらの結果は、ヘテロ接合性の保持は雌親から得られ、及びそれゆえ三倍体は親のヘテロ接合性を保持する減数されていない雌性配偶子から生ずることを示す。
【０１３４】
ｄｙａｄにおける三倍体は２ｎ雌性寄与から生ずることを確認するために、私たちは雌としてのｄｙａｄ変異体を雄としての系ＥＴＣ６０（ＤＹＡＤについて野生型）に交配し、Ｆ１種子を得た。ＥＴＣ６０系（米国特許出願第１０／８５７，５３９号中に示される）はカナマイシン耐性遺伝子を有するＤｓトランスポゾンの単一コピーを有する。上記Ｆ１の野生型二倍体植物へのさらなる交配後のカナマイシン耐性の分離にしたがうことにより、Ｆ１植物中の雄性配偶子からの倍数性の寄与を決定することが可能である。はじめの交配からの種子を発芽させ、及び種苗を土壌に移した。６のＦ１植物をカナマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（ＫａｎＦ 配列ＩＤ番号：４９及びＫａｎＲ 配列ＩＤ番号：５０）を用いてカナマイシン耐性遺伝子の存在について、及び遺伝子特異的プライマーＧＬＴＦ（配列ＩＤ番号：４６）と共にトランスポゾン特異的Ｄｓ５−２プライマー（配列ＩＤ番号：４５）を用いてＥＴＣ６０中のトランスポゾンのコピーについて試験した。全ての６の植物はカナマイシン耐性を有するＤｓエレメントについて陽性であり、及びまたＤＹＡＤの野生型コピーを含む交配された植物について予想されるであろうように稔性であった。６の植物の倍数性を減数分裂染色体のスプレッドを用いて調べた。３の植物は１５の染色体を有する三倍体であり、２の植物は１６の染色体を有し、及び１は１７の染色体を有することがわかった。これらの結果は、雌性配偶子は減数されていない／高二倍体胞子から生じた可能性を示唆する。半数体花粉による減数されていない雌性配偶子の受精はカナマイシン耐性遺伝子について単体（Ｋｋｋ）である（ほぼ）三倍体を与えうる。あるいは、上記三倍体は減数されていない雄性配偶子又は２の減数された雄性配偶子による半数体雌性配偶子の受精から生じることができ、その場合、上記三倍体はカナマイシン耐性遺伝子について二重体（ＫＫｋ）でありうる。
【０１３５】
単体条件植物がカナマイシン耐性を有しない野生型植物に交配される場合、生ずる植物における感受性に対するカナマイシン耐性についての分離の割合は１：１であろう。しかしながら、二重体条件植物が野生型植物に交配される場合、分離の割合は５：１であると予想されうる。交配を上記で得られた三倍体植物のうちの２について野生型に対して行い、及び得られた種子をカナマイシン耐性の分離についてスコア付けした。表５中に示される結果はカナマイシン耐性についての１：１分離を示し、多精の可能性を排除し、及び上記三倍体は減数されていない雌性配偶子から生ずることを示す。
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
*種子は三倍体親の二倍体親への交配の結果であるので、いくつかの種子は異数性のために発芽しないことが予想される。
**１：１の割合についてのフィットのよさについての有意性試験は発芽しなかった種子を除いて計算される。
***５：１の割合についてのフィットのよさについての有意性試験はＫａｎRカテゴリー中に発芽しなかった種子を含むことにより計算される。理論的には、発芽しなかった種子の５０％のみが（得られたＫａｎR及びＫａｎS種苗の割合に基づいて）いずれかのカテゴリー中に含まれるべきであるが、有意性の値を増大させるために、私たちは全ての発芽しなかったロットをＫａｎRカテゴリーに含めた。これは、私たちが全ての発芽しなかったロットをＫａｎRカテゴリーに含んでも５：１の割合についてのフィットのよさは有意でないという可能性を排除し、及びしたがって１：１の割合のみを好む条件を強く支持する。
Ｓ それがある割合に従わないことを示す、χ2試験について有意
ＮＳ それがある割合に従うことを示す、χ2試験について有意でない
【０１３８】
実施例８：ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からのＤＹＡＤ遺伝子及びコード配列
ポプラからのＤＹＡＤ遺伝子の追加の実施例はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｓｃｉ／ｉｐｇｃで見られる。
ｃＤＮＡ配列のコード部分の翻訳は図１１中でＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからの野生型ＤＹＡＤタンパク質のアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列を提供する。
【０１３９】
ＡｔＤｙａｄホモログＰｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｓｃｉ／ｉｐｇｃ中のとおり
ゲノム領域（配列ＩＤ番号：２４）
【０１４０】
ＥＸＯＮ
ＩＮＴＲＯＮ
はじめのＡＴＧの２４４４ｂｐ上流を含む
【０１４１】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【０１４２】
データベース中のとおりのタンパク質配列（８３０ａａ）（配列ＩＤ番号：２６）
＞ｅｕｇｅｎｅ３．０００３０７９１［Ｐｏｐｔｒ１：５５４１５８］
【化１４】
【０１４３】
実施例９：トウモロコシＤＹＡＤポリヌクレオチド及びポリペプチドの同定
ウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｇｄｂ．ｏｒｇ）でクエリーとしてＴＢＬＡＳＴＮ及びイネＤＹＡＤタンパク質（配列ＩＤ番号：５１）を用いたトウモロコシゲノムの検索はコンティグＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．１（配列ＩＤ番号：５２）及びＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．２（配列ＩＤ番号：５３）に対応するトウモロコシゲノムの領域内の推定上のＤＹＡＤ遺伝子の存在を明らかにした。手動編集との組み合わせのＧＥＮＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を用いた領域のアノテーションはイネＤＹＡＤポリペプチド配列と整列されうる推定上のトウモロコシポリペプチド配列の同定を導いた（図１２）。本発明は前記トウモロコシポリペプチド配列及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用を含む。
【０１４４】
トウモロコシから得られたポリペプチド配列は以下のヌクレオチドコーディネートにより示されるようにコンティグヌクレオチド配列にマッピングされる。上記コンティグ配列によりコードされる整列された部分的なＺｍＤＹＡＤポリペプチド配列もまた示される。
【０１４５】
ＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．１（配列ＩＤ番号：５２）コーディネート及び概念上の翻訳
【化１５】
【０１４６】
トウモロコシ 整列されたポリペプチド：
（配列ＩＤ番号：５４）
【化１６】
【０１４７】
ＺｍＧＳＳｔｕｃ１１−１２−０４．１０１６．２（配列ＩＤ番号：５３）コーディネート及び概念上の翻訳
【化１７】
【０１４８】
トウモロコシ 整列されたポリペプチド：
（配列ＩＤ番号：５５）
【化１８】
【０１４９】
実施例１０：単為生殖のための一般的手順
最適照射量の決定：
１．使用される予定の雌親植物と同種又は関連種の雄親植物から葯を集め、及び１、５、１０、２０、３０、５０、７０、１００、１５０、２００ｋｒａｄを含む量範囲のイオン化照射で照射する。
２．１以上の劣性表現型マーカー又はＤＮＡマーカーについてのその他（マイクロサテライト、ＣＡＰＳ又はＲＡＰＤ）を有することで上記照射された花粉親とは異なる雌性植物からの除雄された花又は雌花に授粉する。好ましくはイオン化照射のそれぞれの量で授粉に１０〜５０の花を使用する。
３．授粉された花から種子を集め、及び同じ照射量を受けた花粉で授粉された花からの種子を集める。
４．種子を発芽させ、及び苗になるまで生育させ、照射のそれぞれの量について約２０〜１００の植物を得る。
５．表現型マーカー又はＤＮＡマーカーについて植物の遺伝子型をスコア付けし、及び母親に似る植物の割合を計算する。
６．高い割合の生存力のある植物及び高い割合の母親に似る植物の両方の最適な組み合わせを与える量を選択する。
【０１５０】
ｄｙａｄ変異体植物における単為生殖の誘発：
１．上記に示されるように決定される適切な量のイオン化照射を用いて照射された花粉でｄｙａｄ変異体植物に授粉する。
２．種子を集める。
３．種子を発芽させ、及び苗になるまで生育させる。
【０１５１】
単為生殖植物の同定：
１．雌親が有する劣性表現型マーカーについて植物をスコア付けする。劣性表現型を示す植物は単為生殖であるとして分類される。さらに、上記植物は植物組織からＤＮＡを単離し、多形マーカーについてＤＮＡ分析することによりＤＮＡマーカーについてスコア付けされうる。雌親に特徴的である及び雄親についてのマーカーバンドを欠くマーカーパターンを示す植物は単為生殖であるとして分類される。授粉実験からの単為生殖植物の割合はそのようにして計算されうる。
２．単為生殖植物は雌親がヘテロ接合であったマーカーについて調べられうる。雌性ｄｙａｄ変異体親がヘテロ接合であった全てのマーカーについてヘテロ接合性を保持するそれらの植物は無配偶生殖植物である。
【０１５２】
異なる作物種に使用されうる可能性のある分子マーカーについての引用文献は以下に列挙される：
小麦：
ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
１．Ｔｏｒａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００６）．ＳＳＲ−ｂａｓｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｗｈｅａｔ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００６ Ａｐｒ；１１２（６）：１０４２−５１．
２．Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ （ＳＳＲ） ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｗｈｅａｔ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００５ Ｆｅｂ；１１０（３）：５５０−６０．
【０１５３】
イネ：
ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
１．Ｈａｒｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）． Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ２２７５ ｍａｒｋｅｒｓ．．．” Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４８：４７９−４９４．
２．Ｃａｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）． Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． １９９４ Ｄｅｃ；１３８（４）：１２５１−７４．
【０１５４】
トウモロコシ：Ｃｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）． “Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ”． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２８：９−１２．
ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
【０１５５】
大麦： ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
Ｗｅｎｚｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）． Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍａｐ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ ｌｉｎｋｉｎｇ ＤＡｒＴ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ＳＳＲ，ＲＦＬＰ ａｎｄ ＳＴＳ ｌｏｃｉ ａｎｄ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｔｒａｉｔｓ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２００６ Ａｕｇ １２：７（１）：２０６
【０１５６】
オート麦： ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
Ｄｅ Ｋｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）． Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｗｉｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＱＴＬｓ ｆｒｏｍ ａ ｈｕｌｌｅｓｓ ｘ ｃｏｖｅｒｅｄ ｓｐｒｉｎｇ ｏａｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００４ Ｍａｙ；１０８（７）：１２８５−９８．
【０１５７】
パールミレット： ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｓｅｔ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｐｅａｒｌ ｍｉｌｌｅｔ， Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００４ Ｎｏｖ；１０９（７）：１４８５−９３．
【０１５８】
ソルガム：Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）． “Ａ ｄｅｔａｉｌｅｄ ＲＦＬＰ ｍａｐ ｏｆ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ．．．”． Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８７：９２５−９３３．
【０１５９】
キャベツ、ブロッコリー等（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）： Ｂｏｈｕｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）． “Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ”． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５０：３９３−４０１．
【０１６０】
セイヨウカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）： Ｐｒａｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）． Ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ（Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｓｔａｒｄ）ｕｓｉｎｇ ＡＦＬＰ ａｎｄ ＲＦＬＰ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００３ Ｆｅｂ；１０６（４）：６０７−１４．
【０１６１】
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）：Ｐｉｑｕｅｍａｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｗｉｔｈ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ２００５ Ｎｏｖ；１１１（８）：１５１４−２３．
【０１６２】
カブ、ハクサイ等（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）：Ｋｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｈｅｒｅｄ． ８８：５５３−５５７
【０１６３】
綿：Ｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）． “Ａ ３３４７−ｌｏｃｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍａｐ．．．” Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６６：３８９−４１７．
【０１６４】
トマト：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）． Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｘ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｃｒｏｓｓ． Ｇｅｎｏｍｅ ２００２ Ｆｅｂ；４５（１）：１３３−４６．
【０１６５】
ナス： Ｄｏｇａｎｌａｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ｅｇｇｐｌａｎｔ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌａｎａｃｅａｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１（４）：１６９７−７１１
【０１６６】
トウガラシ：Ｇｅｎｏｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌａｎａｃｅａｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２（３）：１１８３−２０２．
【０１６７】
ジャガイモ：Ｔａｎｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）． Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２（４）：１１４１−１１６０．
【０１６８】
ダイズ：Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）． Ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ ａｓｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ａｎ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄ ＲＦＬＰ ｍａｐ． Ｊ． Ｈｅｒｅｄ． ９１（５）：３９２−３９６．
【０１６９】
ポプラ：Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）． Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｇｅｎｏｍｅ ２００１ Ａｕｇ；４４（４）：６０２−９．
Ｔｕｓｋａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ． Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ．３４（１）：８５−９３．
【０１７０】
プラスミドｐＢＩ１０１．３：：ＤｙａｄΔＧＲで形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ株ＤＨ５αのサンプルはｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ（ＭＴＣＣ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＩＭＴＥＣＨ）， Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＳＩＲ）， Ｓｅｃｔｏｒ−３９Ａ， Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ−１６０ ０３６，Ｉｎｄｉａ）で寄託されている。上記サンプルは２００６年１２月１日に寄託され、及びｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｎｏ．ＢＩ５０７を有する。雄としてのｄｙａｄ変異体と野生型雌性植物の間の交配のＦ２集団の少なくとも２５００種子を含む、及びｄｙａｄ変異体について分離するサンプルはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ２０１０８， ＵＳＡ）で寄託されている。上記サンプルは２００６年１２月１日に送られ、及びｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｎｏ．ＩＳＤＹＦ２Ｃを有する。ｄｙａｄについて及びＤｙａｄΔＧＲ挿入物についてホモ接合である及びデキサメタゾンに応答して条件付き稔性を示す（系番号３３に由来する）少なくとも２５００種子を含むサンプルはｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ２０１０８， ＵＳＡ）で寄託されている。上記サンプルは２００６年１２月１日に送られ、及びｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｎｏ．３３−５ＤＹＧＲを有する。
【０１７１】
学術定期刊行物及び特許文献のさまざまな論文を本明細書中に引用する。それぞれの上記論文をそれを全体として及びそのような引用による全ての目的のために本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１はｄｙａｄ変異体植物中の減数された種子セットを示す。形式上の範囲は植物当たり１〜１０種子である。
【図２】図２はＡｌｅｘａｎｄｅｒ染色を用いたｄｙａｄ変異体植物中の正常花粉生存力を示す。（図２Ａ）野生型。（図２Ｂ）ｄｙａｄ。
【図３】図３は野生型及びｄｙａｄ変異体中の雄性及び雌性減数分裂を示す。（図３Ａ−Ｃ）野生型。（図３Ｄ−Ｆ）ｄｙａｄ。（図３Ａ、Ｄ）減数分裂１の終わり（終期）の雄性減数母細胞。（図３Ｂ、Ｅ）四分子段階での雄性減数母細胞。（図３Ｃ、Ｆ）後期１での雌性減数母細胞。ｄｙａｄは均等雌性減数分裂を経験する。
【図４】図４は二倍体ｄｙａｄ変異体植物の代表的な子孫の染色体倍数性を示す。（図４Ａ）１５の染色体を示す三倍体子孫植物の体細胞。（図４Ｂ）９：６分離を示す１５の染色体を有する三倍体子孫植物中の雄性減数分裂１。（図４Ｃ）１０の染色体を示す二倍体子孫植物の体細胞。
【図５】図５はＢｏｅｃｈｅｒａ ｈｏｌｂｏｅｌｌｉ ＤＹＡＤホモログによるｄｙａｄ変異体の補完を示す：（図５Ａ）伸長していない長角果を示すｄｙａｄ変異体。（図５Ｂ）種子を含む伸長した長角果を示すＢｈＤＹＡＤ遺伝子で形質転換されたｄｙａｄ変異体。（図５Ｃ）ｄｙａｄ変異体植物（１）、補完された植物（２）及び野生型植物（３）からの長角果の比較。（図５Ｄ）完全な種子セットを示す補完された植物からの切開された長角果。（図５Ｅ）野生型植物からの切開された長角果。
【図６】図６はＤＹＡＤ条件付き補完系を構築するために使用されるｐＢＩ１０１．３：：Ｄｙａｄ：：（Δ）ＧＲカセットを示す図である。
【図７】図７は図６中に示されるＤＹＡＤの内生位置を遺伝子タイピングするためのＣＡＰＳ多形性を示すポリアクリルアミドゲルである。図７Ａ：ＫＮＥＦ／ＫＮＥＲプライマー増幅産物からの溶解ＨｉｎＦ１消化断片。図７Ｂ：ＫＫＦ／ＫＫＲプライマー増幅産物からの溶解ＨｉｎＦ１消化断片。
【図８】図８は実施例６中のｄｙａｄ表現型の条件付き補完を示す。 図８Ａ：デキサメタゾン処置前及び後の非伸長長角果（ｄｙａｄ表現型）を示す花序。矢印は処置の開始時の最も若い開花した花の位置を示す。処置開始５〜７日後、長角果は伸長を示した（野生型表現型）。図８Ｂ：デキサメタゾン処置前の不稔性（ｄｙａｄ）表現型を示す単離された長角果。図８Ｃはデキサメタゾン処置による条件付き補完後の回復された野生型表現型を示す。図８Ｄ：デキサメタゾン処置後の完全な種子セットを示す、裂いて開いた長角果。
【図９】図９は実施例６中のｄｙａｄ表現型の条件付き補完後の胚珠の形態を示す。 図９Ａ：デキサメタゾン処置前の成熟胚珠段階でｄｙａｄ表現型及び胚のうの不在を示す透明にされた胚珠。図９Ｂ：デキサメタゾン処置後に回復された胚のう。
【図１０】図１０はｄｙａｄ変異体により生成された種子の大きさにおける変動及び二倍体及び四倍体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ株の間での相互交配から得られた種子の大きさにおける相違を示す。 図１０Ａ：自家受粉された野生型二倍体Ｃｏｌ−Ｏ植物からの種子は均一に正常な大きさである。図１０Ｂ：四倍体植物からの種子。図１０Ｃ：自家受粉されたｄｙａｄ植物からの種子の大きさは大きい（Ｌ）、正常（Ｎ）、及び縮んでいる（Ｓ）の間で変化する。図１０Ｄ：母系過剰−二倍体雄株に交配された四倍体雌株からの種子は縮んでいる。図１０Ｅ：父系過剰−二倍体雌株に交配された四倍体雄株からの種子は母系過剰交配からの種子と比較されるとき大きさが大きい。
【図１１】図１１はデフォルトパラメーターでのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗにおけるようにＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（配列ＩＤ番号：５）、Ｂｏｅｃｈｅｒａ（配列ＩＤ番号：１８）、イネ（配列ＩＤ番号：５１）からの、及びポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（配列ＩＤ番号：２６）からのＤＹＡＤタンパク質のタンパク質配列の配列を示す。
【図１２】図１２はＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（１．８２）を用いた推定上のトウモロコシＤＹＡＤポリペプチド配列（配列ＩＤ番号：５５及び５４）を伴うイネＤＹＡＤポリペプチド配列（配列ＩＤ番号：５１）の配列を示す。図１２Ａ：イネＤＹＡＤアミノ酸１−１４７の配列。図１２Ｂ：イネＤＹＡＤアミノ酸３１７−８０３の配列。
【図１３】図１３はＤＹＡＤをコードする配列を含むと同定される２のトウモロコシコンティグ（連続配列）に対するイネからのＤＹＡＤポリペプチド配列のマッピングを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄｙａｄ対立遺伝子についてホモ接合であるゲノムを含み、及びその植物の細胞の核内でＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する植物。
【請求項２】
前記植物は条件付きで雌性稔性になる、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記植物は前記植物が生成する種子中の雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きになる、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
前記ゲノムはステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインに融合されたＤＹＡＤタンパク質をコードする少なくとも１コピーのポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
前記ステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインはグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインである、請求項４に記載の植物。
【請求項６】
上記ｄｙａｄ対立遺伝子は、５０８〜５７２のアミノ酸位置で切り取られたＤＹＡＤタンパク質が発現されるものである、請求項１に記載の植物。
【請求項７】
上記ｄｙａｄ対立遺伝子は配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む又は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの条件又はそれに相当する条件下で配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２３又は配列ＩＤ番号：２５のポリヌクレオチドの相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の植物。
【請求項８】
上記ＤＹＡＤタンパク質は配列ＩＤ番号：４の又は配列ＩＤ番号：１７の又は配列ＩＤ番号：２３の又は配列ＩＤ番号：２５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより又は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの条件又はそれに相当する条件下で配列ＩＤ番号：１又は配列ＩＤ番号：２３又は配列ＩＤ番号：２５の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１に記載の植物。
【請求項９】
上記ＤＹＡＤタンパク質は配列ＩＤ番号：４の又は配列ＩＤ番号：１７の又は配列ＩＤ番号：２３の又は配列ＩＤ番号：２５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより又は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの条件又はそれに相当する条件下で配列ＩＤ番号：１又は配列ＩＤ番号：２３又は配列ＩＤ番号：２５の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項７に記載の植物。
【請求項１０】
ｉ）ｄｙａｄについてホモ接合である雌親植物に雄親植物からの花粉で授粉すること又はｄｙａｄについてホモ接合である前記植物を自家受粉させること；及び
ｉｉ）前記授粉された雌親植物からの種子を得ること
を含む、雌親のヘテロ接合性を保持する種子の作出方法。
【請求項１１】
前記種子は正常な大きさ又は縮んだ大きさである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階ｉ）で使用される花粉は照射された、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
段階ｉ）で使用される花粉は稔性であり、及び段階ｉｉ）で得られる種子は三倍体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ｄｙａｄ対立遺伝子についてホモ接合であり、及び前記植物の細胞の核内のＤＹＡＤタンパク質の発現について条件付きである植物を提供する、胚性ゲノムを有する種子を得る方法であって
ｉ）ｄｙａｄ対立遺伝子についてヘテロ接合であり又はホモ接合であり、及び核内でＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する発現構築物を含む第一の植物を自家受粉させること及びｄｙａｄについて及び上記発現構築物についてホモ接合である第二の植物を得るために選択すること
ｉｉ）上記第二の植物の種子又は上記第二の植物に由来した植物の種子を得ること及び大きさが正常である又は縮んだ種子を選択すること
を含む方法。
【請求項１５】
前記第二の植物は前記第二の植物により生成される種子の胚中の雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の植物は雌性不稔性について条件付きである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ｄｙａｄ対立遺伝子についてホモ接合である及びその植物の細胞の核内でのＤＹＡＤタンパク質の発現について条件付きである植物を得る方法であって
ｉ）ｄｙａｄ対立遺伝子について及び核内でＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する発現構築物についてヘテロ接合である又はホモ接合である第一の植物を自家受粉させること及びｄｙａｄについて及び上記発現構築物についてホモ接合である第二の植物を得るために選択すること
ｉｉ）上記ＤＹＡＤタンパク質が発現される条件に前記選択された第二の植物を導入すること
を含む方法。
【請求項１８】
前記第二の植物は前記Ｔ２植物により生成される種子の胚における雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二の植物は雌性不稔性について条件付きである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の植物の種子又は組織。
【請求項２１】
請求項１０に記載の方法により得られる種子。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法により得られる三倍体種子。
【請求項２３】
上記ＤＹＡＤタンパク質の発現について十分な条件下で請求項１に記載の植物を繁殖させることを含む、ｄｙａｄについてホモ接合である植物系の維持方法。
【請求項２４】
上記ＤＹＡＤタンパク質の発現について十分な条件下で請求項４に記載の植物を繁殖させることを含む、ｄｙａｄについてホモ接合である植物系の維持方法。
【請求項２５】
前記条件は前記植物にステロイドホルモンを適用することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核内で条件付きで発現されるＤＹＡＤ遺伝子のコピーを含む植物を得る方法であって
ｉ）第二の植物を得るために前記植物の核内で条件付きでＤＹＡＤタンパク質を発現する発現構築物を含む第一の植物を自家受粉させること又は２の前記第一の植物を交配すること、及び短くなった長角果若しくは縮んだ果実又は減数された種子セットを示す第二の植物を選択すること
ｉｉ）上記ＤＹＡＤタンパク質が発現される条件に前記選択された第二の植物を導入すること
を含む方法。
【請求項２７】
上記第一の植物はＤＹＡＤについて野生型であり、ｄｙａｄについてヘテロ接合である又はｄｙａｄについてホモ接合である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物の細胞の核内で野生型ＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する構築物を含むベクターで植物の細胞を形質転換することを含む、前記植物の細胞の核内で野生型ＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する植物を得る方法。
【請求項２９】
上記植物はｄｙａｄについてホモ接合である植物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記植物はｄｙａｄについてヘテロ接合である植物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記植物の細胞の核内での野生型ＤＹＡＤタンパク質の条件付き発現を提供する構築物についてホモ接合である植物。
【請求項３２】
植物細胞の核内でＤＹＡＤ遺伝子の条件付き発現を与える発現構築物。
【請求項３３】
前記植物細胞は大胞子母細胞である、請求項３２に記載の構築物。
【請求項３４】
前記ＤＹＡＤ遺伝子はステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインに融合される、請求項３２に記載の構築物。
【請求項３５】
前記ステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインはグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインである、請求項３４に記載の構築物。
【請求項１】
ｄｙａｄ対立遺伝子についてホモ接合であるゲノムを含み、及びその植物の細胞の核内でＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する植物。
【請求項２】
前記植物は条件付きで雌性稔性になる、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記植物は前記植物が生成する種子中の雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きになる、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
前記ゲノムはステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインに融合されたＤＹＡＤタンパク質をコードする少なくとも１コピーのポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
前記ステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインはグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインである、請求項４に記載の植物。
【請求項６】
上記ｄｙａｄ対立遺伝子は、５０８〜５７２のアミノ酸位置で切り取られたＤＹＡＤタンパク質が発現されるものである、請求項１に記載の植物。
【請求項７】
上記ｄｙａｄ対立遺伝子は配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む又は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの条件又はそれに相当する条件下で配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２３又は配列ＩＤ番号：２５のポリヌクレオチドの相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の植物。
【請求項８】
上記ＤＹＡＤタンパク質は配列ＩＤ番号：４の又は配列ＩＤ番号：１７の又は配列ＩＤ番号：２３の又は配列ＩＤ番号：２５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより又は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの条件又はそれに相当する条件下で配列ＩＤ番号：１又は配列ＩＤ番号：２３又は配列ＩＤ番号：２５の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１に記載の植物。
【請求項９】
上記ＤＹＡＤタンパク質は配列ＩＤ番号：４の又は配列ＩＤ番号：１７の又は配列ＩＤ番号：２３の又は配列ＩＤ番号：２５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにより又は３７℃で４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの条件又はそれに相当する条件下で配列ＩＤ番号：１又は配列ＩＤ番号：２３又は配列ＩＤ番号：２５の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、請求項７に記載の植物。
【請求項１０】
ｉ）ｄｙａｄについてホモ接合である雌親植物に雄親植物からの花粉で授粉すること又はｄｙａｄについてホモ接合である前記植物を自家受粉させること；及び
ｉｉ）前記授粉された雌親植物からの種子を得ること
を含む、雌親のヘテロ接合性を保持する種子の作出方法。
【請求項１１】
前記種子は正常な大きさ又は縮んだ大きさである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階ｉ）で使用される花粉は照射された、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
段階ｉ）で使用される花粉は稔性であり、及び段階ｉｉ）で得られる種子は三倍体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ｄｙａｄ対立遺伝子についてホモ接合であり、及び前記植物の細胞の核内のＤＹＡＤタンパク質の発現について条件付きである植物を提供する、胚性ゲノムを有する種子を得る方法であって
ｉ）ｄｙａｄ対立遺伝子についてヘテロ接合であり又はホモ接合であり、及び核内でＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する発現構築物を含む第一の植物を自家受粉させること及びｄｙａｄについて及び上記発現構築物についてホモ接合である第二の植物を得るために選択すること
ｉｉ）上記第二の植物の種子又は上記第二の植物に由来した植物の種子を得ること及び大きさが正常である又は縮んだ種子を選択すること
を含む方法。
【請求項１５】
前記第二の植物は前記第二の植物により生成される種子の胚中の雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の植物は雌性不稔性について条件付きである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ｄｙａｄ対立遺伝子についてホモ接合である及びその植物の細胞の核内でのＤＹＡＤタンパク質の発現について条件付きである植物を得る方法であって
ｉ）ｄｙａｄ対立遺伝子について及び核内でＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する発現構築物についてヘテロ接合である又はホモ接合である第一の植物を自家受粉させること及びｄｙａｄについて及び上記発現構築物についてホモ接合である第二の植物を得るために選択すること
ｉｉ）上記ＤＹＡＤタンパク質が発現される条件に前記選択された第二の植物を導入すること
を含む方法。
【請求項１８】
前記第二の植物は前記Ｔ２植物により生成される種子の胚における雌親ヘテロ接合性の保持について条件付きである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二の植物は雌性不稔性について条件付きである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の植物の種子又は組織。
【請求項２１】
請求項１０に記載の方法により得られる種子。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法により得られる三倍体種子。
【請求項２３】
上記ＤＹＡＤタンパク質の発現について十分な条件下で請求項１に記載の植物を繁殖させることを含む、ｄｙａｄについてホモ接合である植物系の維持方法。
【請求項２４】
上記ＤＹＡＤタンパク質の発現について十分な条件下で請求項４に記載の植物を繁殖させることを含む、ｄｙａｄについてホモ接合である植物系の維持方法。
【請求項２５】
前記条件は前記植物にステロイドホルモンを適用することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核内で条件付きで発現されるＤＹＡＤ遺伝子のコピーを含む植物を得る方法であって
ｉ）第二の植物を得るために前記植物の核内で条件付きでＤＹＡＤタンパク質を発現する発現構築物を含む第一の植物を自家受粉させること又は２の前記第一の植物を交配すること、及び短くなった長角果若しくは縮んだ果実又は減数された種子セットを示す第二の植物を選択すること
ｉｉ）上記ＤＹＡＤタンパク質が発現される条件に前記選択された第二の植物を導入すること
を含む方法。
【請求項２７】
上記第一の植物はＤＹＡＤについて野生型であり、ｄｙａｄについてヘテロ接合である又はｄｙａｄについてホモ接合である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物の細胞の核内で野生型ＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する構築物を含むベクターで植物の細胞を形質転換することを含む、前記植物の細胞の核内で野生型ＤＹＡＤタンパク質を条件付きで発現する植物を得る方法。
【請求項２９】
上記植物はｄｙａｄについてホモ接合である植物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記植物はｄｙａｄについてヘテロ接合である植物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記植物の細胞の核内での野生型ＤＹＡＤタンパク質の条件付き発現を提供する構築物についてホモ接合である植物。
【請求項３２】
植物細胞の核内でＤＹＡＤ遺伝子の条件付き発現を与える発現構築物。
【請求項３３】
前記植物細胞は大胞子母細胞である、請求項３２に記載の構築物。
【請求項３４】
前記ＤＹＡＤ遺伝子はステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインに融合される、請求項３２に記載の構築物。
【請求項３５】
前記ステロイドホルモン受容体リガンド結合ドメインはグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメインである、請求項３４に記載の構築物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００９−５２４４０９（Ｐ２００９−５２４４０９Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３９３６（Ｐ２００８−５４３９３６）
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３５２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６２１４
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（５９５０５９８７２）カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ (81)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００３５２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６６２１４
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（５９５０５９８７２）カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ (81)
【Ｆターム（参考）】
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