脱活性化Ｂ１Ｂ細胞
本発明は、脱活性化したＢ１Ｂ細胞及び該Ｂ１Ｂ細胞を有効成分とする免疫抑制剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱活性化したＢ１Ｂ細胞、及びその調製方法、脱活性化したＢ１Ｂ細胞を用いた免疫抑制剤ならびに臓器ないし器官の移植方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ１Ｂ細胞は、自己免疫の発症に関わっていることが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
またヒトでは、Ｂ１Ｂ細胞が新生児期に多く存在し、加齢とともに減少してくるものの、生体内に存在していることが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、Ｂ１Ｂ細胞の免疫抑制作用については、報告されていない。
【非特許文献１】Rheumatoid factor secretion from human Leu-1+ B cells.Science. 1987 Apr 3; 236(4797): 81-3.
【非特許文献２】The ontogeny and functional characteristics of human B-1 (CD5+ B) cells. International Immunology 1992; 4: 243-252.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｂ１Ｂ細胞の成熟過程に関する新たな知見を提供することを目的とする。
【０００６】
具体的には、本発明は、免疫抑制機能を有する脱活性化したＢ１Ｂ細胞、を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、免疫抑制剤、並びに拒絶反応が抑制された臓器、器官の移植方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、エンドトキシン（ＬＰＳ）などの自然免疫刺激剤を用いて、未刺激Ｂ１Ｂ細胞（immature B1B cell）の成熟を評価した。
【０００９】
本発明者は、自然免疫刺激剤によって誘導される、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞について記載する。この脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、高レベルなＭＨＣクラスII発現、ＩＬ−１０産生、および別の方法で成熟を誘導する刺激に対する非反応性を除いて、多くの点で未刺激Ｂ１Ｂ細胞に類似している。
【００１０】
このような脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、未反応のヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を刺激することができない。むしろ、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導し、免疫抑制作用を有する。
【００１１】
Ｂ１Ｂ細胞の成熟過程の詳細を明らかにしたのは本発明者が初めてである。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
１． 脱活性化した(expired)Ｂ１Ｂ細胞。
２． ＩＬ−１０を発現する項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。３． ＭＨＣクラスIIを高発現する項１または２に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
４． ＭＨＣクラスIを低発現する項１〜３のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
５． ヘルパーＴ細胞のアナジー(anergy)を誘導する項１〜４のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
６． 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のアナジー(anergy)を誘導する項１〜５のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
７． ナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導する項１〜６のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
８． 自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用により成熟型に移行しない項１〜７のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
９． CD80/CD83/CD86の発現量が低い項１〜８のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
１０． 前記Ｂ１Ｂ細胞がヒトのＢ１Ｂ細胞である項１〜９のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
１１． さらに下記の特徴を有する項１０に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＣＤ８０の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い；及び／又は
ＣＤ８３の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い。
１２． さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する項１０または１１に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＭＨＣクラスIIを高発現する（ＭＨＣクラスIIｈｉｇｈ）；
ＭＨＣクラスIを低発現する（ＭＨＣクラスIｌｏｗ）；
１３． 未刺激Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟Ｂ１Ｂ細胞に導く工程、該成熟Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤の存在下又は非存在下でさらに培養する工程を含む脱活性化されたＢ１Ｂ細胞（expired B1B）の調製方法。
１４． 項１〜１２のいずれかに記載の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または項１３に記載の方法により得られた脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を有効成分とする免疫抑制剤。
１５． ヒト移植ドナー由来の項１０〜１２のいずれかに記載のヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または項１３に記載の方法により得られたヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することを包含する拒絶反応を抑制した臓器ないし器官の移植方法。
１６． 前記臓器ないし器官が骨髄細胞である項１５に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、免疫抑制剤として有用な脱活性化されたＢ１Ｂ細胞が得られる。
【００１４】
ヒト移植ドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することにより、移植の拒絶反応を効果的に抑制することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】フローサイトメーターによるＢ１Ｂ分画とマクロファージ（Ｍφ）の比較。
【図２】各刺激によるＢ１Ｂ細胞ＣＤ８６発現の時間的推移。
【図３】ＣｐＧ刺激によるＢ１Ｂ細胞ＭＨＣ分子発現の時間的推移。
【図４】脱活性化Ｂ１Ｂ細胞分画。
【図５】脱活性化Ｂ１Ｂと共培養したナイーブＴ細胞の増殖活性とその際のＴ細胞表面抗原（ＣＤ２５／ＣＤ６９）の変化。
【図６】ｅＢ１Ｂ細胞により誘導されたサプレッサーＴ細胞のＴ細胞増殖抑制効果。
【図７】ＣｐＧまたは抗ＣＤ４０抗体刺激によるＢ１Ｂ細胞からのＩＬ−１０およびＩＬ−１２分泌の時間的推移。
【図８】ｅＢ１Ｂにより誘導されたサプレッサーＴ細胞内に発現するＦｏｘＰ３遺伝子の発現量と調節性Ｔ細胞（Treg）のＦｏｘＰ３遺伝子の発現量との比較。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において、「B1B細胞」は、リンパ球よりもやや大きく（直径13〜30μm）、細胞内顆粒が少ない（SSCでMφの1/3〜1/6の散乱光強度）細胞分画である（図１）。図１において、直径が13〜30μm程度であることは、横軸のForward Scatterの赤血球に対する相対値により確認することができ、一方、細胞内顆粒がマクロファージ（Mφ）の1/3〜1/6程度であることは、図１の縦軸のSide Scatter（散乱光強度）の値により確認できる。
【００１７】
B1B細胞の表面抗原の特性は、図１に示すようにCD11b抗原は陽性であるものの、マクロファージに特異的とされるF4/80抗原とCD115抗原はほとんど発現が認められない。B1B細胞のCD5抗原は陽性（Ｂ１Ｂａ）と陰性（Ｂ１Ｂｂ）の両方が包含される。
【００１８】
Ｂ１Ｂ細胞の供給源としては、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サル等の哺乳動物が好ましく例示され、より好ましくはヒトが例示される。
【００１９】
本発明では、未刺激Ｂ１Ｂ細胞が以下の経路で変換される。
経路１：未刺激Ｂ１Ｂ細胞 → 一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞
→ 脱活性化Ｂ１Ｂ細胞(expired Ｂ１Ｂ細胞)
経路１において、未刺激Ｂ１Ｂ細胞から一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞へは、自然免疫刺激剤ないしdanger signal（細胞破砕物、尿酸結晶等）により誘導される。
【００２０】
自然免疫刺激剤は、未刺激Ｂ１Ｂ細胞から一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞への成熟化を誘導するものであれば特に限定されず、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ＣｐＧ、ペプチドグリカン、壊死細胞成分、ＴＮＦα等のToll-like receptors（ＴＬＲｓ）に結合し、活性化シグナルを誘導するものや、ＯＫ４３２（ピシバニール）が包含される。さらに好ましい自然免疫刺激剤としてＬＰＳ，ＣｐＧなどが挙げられる。
【００２１】
経路１において、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から脱活性化Ｂ１Ｂ細胞への移行は、特別な物質は必要なく、通常の培養液中で５〜１００時間程度培養することで、行うことができる。当該培養を自然免疫刺激剤の存在下に行っても、同様に５〜１００時間程度培養することで、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から脱活性化Ｂ１Ｂ細胞への移行が行われる。この移行は、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から放出されるＩＬ−１０が関与するものと考えられる。これは、抗ＩＬ−１０抗体を一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞と共存させて、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞への移行が抑制されることにより確認できる。
【００２２】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞は、臍帯血から分離することができ、さらに増殖され得る。また、幹細胞からも誘導され得る。未刺激Ｂ１Ｂ細胞、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞の分離は、例えば蛍光標識又は染色を行った後、セルソーターにより行うことができる。例えば、マウスＢ１Ｂ細胞では、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞と一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞を、ＣＤ８６で染色後に細胞分離装置（セルソーター）により分離することができる。また、ヒトＢ１Ｂ細胞は、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞と一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞を、CD80又はCD83で染色後に細胞分離装置（セルソーター）により分離することができる。
【００２３】
さらに、マウス脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はLPSで刺激４８時間後のCD86-lowをセルソーターで分離精製することができ、ヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はLPSで刺激４８時間後のCD83-low又はCD80-lowをセルソーターで分離精製することができる。
【００２４】
本発明により、初めて脱活性化Ｂ１Ｂ細胞が提供される。
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞のキャラクタリゼーション
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、例えば、以下に示すような１種以上の性質を有している。
(E1)自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用により活性型に移行しない。
【００２５】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞が自然免疫刺激剤により活性化され、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞となった後、さらに培養を継続することにより脱活性化Ｂ１Ｂ細胞へ移行し得る。いったん脱活性化Ｂ１Ｂ細胞へ移行すると、さらに自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）を作用させても脱活性化Ｂ１Ｂ細胞のままである。
（E2）ＩＬ−１０を発現する
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、ＩＬ−１０を発現、分泌する。未刺激Ｂ１Ｂ細胞は、ＩＬ−１０を意味のある程度に発現しない。脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はＩＬ−１０の発現量が高く、例えば1x106個あたり６時間で約0.5〜3ngを分泌する。
【００２６】
一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞は、ＩＬ−１０を高発現し、このＩＬ−１０により一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から脱活性化Ｂ１Ｂ細胞に移行すると考えられる。
（E3） CD80/CD83/CD86の発現量が低い(CD80low/CD83low/CD86low)
例えば、マウス由来のＢ１Ｂ細胞では、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞においてＣＤ８６発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも明らかに多く、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は未刺激Ｂ１Ｂ細胞と同程度かやや多いＣＤ８６発現量を有する（ＣＤ８６ｌｏｗ）。
【００２７】
一方、ヒト由来のＢ１Ｂ細胞では、樹状細胞との相同性から、ＣＤ８０および／またはＣＤ８３の緩やかな発現量の変化を経て未成熟Ｂ１Ｂ細胞から低発現量の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞（ＣＤ８０ｌｏｗ／ＣＤ８３ｌｏｗ）に変化すると考えられる。
【００２８】
なお、本発明者はB1B細胞が貪食（phagocytosis）をほとんど行わないにも関わらず、飲作用（pinocytosis/endocytosis）により外来蛋白抗原を取込み、さらにプロセッシングを経てペプチド抗原としてMHC上に提示しうることをマウスにおいて確認した。
（E4）ＭＨＣクラスIIの発現量が高い
未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりもＭＨＣクラスIIの発現レベルが高く、ＭＨＣクラスIIの発現量が低い未刺激Ｂ１Ｂ細胞と区別可能である。
（E5）抗原ペプチドの存在下で未反応Ｔ細胞を活性化しない；
一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞は抗原ペプチドの存在下でナイーブのヘルパーＴ細胞及びナイーブのＣＴＬを活性化し得るが、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は抗原ペプチドの存在下でナイーブのヘルパーＴ細胞及びナイーブのＣＴＬを活性化せず、Ｔ細胞アナジーを誘導する。
【００２９】
さらに、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導し、免疫抑制作用を有する。
【００３０】
本明細書において、「ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが低い(ＣＤ８６ｌｏｗ／ＣＤ８３ｌｏｗ／ＣＤ８０ｌｏｗ)」とは、色素物質（例えばフィコエリトリン）または蛍光物質（ＦＩＴＣなど）等のマーカーを結合した抗ＣＤ８６抗体／抗ＣＤ８３抗体／抗ＣＤ８０抗体を使用し、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞と反応させると、コントロール（脱活性化Ｂ１Ｂ細胞のみを用い、マーカー結合抗ＣＤ８６抗体／抗ＣＤ８３抗体／抗ＣＤ８０抗体を使用しない）に比べて１０倍以下（通常１〜１０倍、特に３〜８倍程度）の吸光度または蛍光強度を有することを意味する。なお、「ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが高い（ＣＤ８６ｈｉｇｈ／ＣＤ８３ｈｉｇｈ／ＣＤ８０ｈｉｇｈ）」一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞では、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞に対し３〜１０倍程度の吸光度または蛍光強度を有する。CD80-high ／CD83-high ／CD86-highとはCD80-low ／CD83-low ／CD86-lowと比べて３〜１０倍程度の吸光度または蛍光強度を示すものを指す。
【００３１】
本発明の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが未刺激Ｂ１Ｂよりも低い点で未刺激Ｂ１Ｂ細胞と相違するが、以下の点で、さらに未刺激Ｂ１Ｂ細胞と異なっている：
(i) ＬＰＳなどの自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種を作用させても成熟Ｂ１Ｂ細胞に移行しない；
(ii) ＩＬ−１０の発現レベルが未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも高く、これらを放出する。特に免疫抑制性のＩＬ−１０の産生は重要と考えられる。
(iii) ＭＨＣクラスII（ＭＨＣクラスII／ペプチド複合体）を高発現する
(iv) 未反応Ｔ細胞を活性化しない；
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞の表面抗原の相違を以下の表に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞は、ＣＤ８０／ＣＤ８３／ＣＤ８６の発現量が低いので、レシピエントに導入された場合にキラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞のアナジーを誘導する可能性があるが、未刺激Ｂ１Ｂ細胞はレシピエント内で活性化されて成熟Ｂ１Ｂ細胞になって、免疫系を賦活する可能性が高い。
【００３４】
一方、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は再び成熟Ｂ１Ｂ細胞に戻ることはなく、安定している。従って、ドナーの脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をレシピエントに予め投与するとドナー移植片を拒絶可能なレシピエントのキラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞の両方を刺激することができず、むしろナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導し、次にドナーの臓器ないし器官等を移植した場合に、拒絶反応を抑制することが可能となる。
【００３５】
例えば臓器移植や骨髄移植の場合、一般的に６種類のＨＬＡのうち、５種ないし６種の型が一致している必要があるが、ドナーの脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を予めレシピエントに投与しておくことで、ＨＬＡの適合性の低いドナーの臓器ないし骨髄をレシピエントに移植することができるようになるため、臓器移植や骨髄移植が容易に行えるようになる。
【００３６】
本発明の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞が免疫拒絶を抑制することは、ＭＬＣ法(mixed Lymphocyte reaction culture)により確認することが可能である。具体的には、ドナーとレシピエント（脱活性化Ｂ１Ｂ細胞投与前）の脾臓組織の一部を取り出し、該組織の脾臓細胞を混合培養したとき、Ｔ細胞数が増加するが、レシピエントにドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を投与してレシピエントのキラーＴ細胞、及び任意にヘルパーＴ細胞のアナジーを誘発し、次にＭＬＣ法を行った場合にはＴ細胞数が増加しないことから、ドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞がレシピエントの免疫拒絶を抑制することが確認できる。データは示さないが、本発明者は、ドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をレシピエントに投与後に、ドナーの骨髄をレシピエントに移植すると、ＭＬＣ反応（Mixed Lymphocyte culture 混合リンパ球培養）が起こらなかったことを確認している。
【００３７】
該移植される臓器ないし器官等としては、心臓、肝臓、腎臓、肺、小腸、膵臓、皮膚、骨髄が例示される。移植される臓器ないし器官等は、全体又は一部であってもよい。
【００３８】
さらに、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は移植拒絶の抑制だけでなく、アレルギー、自己免疫疾患の治療剤としても有効である。
【００３９】
アレルギーとしては、アトピー性皮膚炎、花粉症、喘息などが挙げられる。
【００４０】
自己免疫疾患としては、クローン病、交感性眼炎、無精子症、血小板減少症、神経細胞に親和性を持つウイルス感染によるアレルギー性脳脊髄炎、レンサ球菌感染後のリウマチ熱や糸球体腎炎、関節リウマチ（RA）、全身性エリテマトーデス（SLE）、溶血性貧血、甲状腺機能亢進症（バセドウ病）、慢性甲状腺炎（橋本病）、重症筋無力症、インスリン抵抗性糖尿病などが挙げられる。
【００４１】
本発明の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、患者当たり１×１０３〜１×１０８個の細胞を投与することで、移植拒絶の抑制を含む免疫抑制剤、アレルギーないし自己免疫疾患の治療剤として有効である。
【００４２】
本発明者は、本明細書において、自然免疫刺激剤による刺激後の未刺激Ｂ１Ｂ細胞の急速な成熟およびそれに続く脱活性化（ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎ）について記載した。脱活性化したＢ１Ｂ細胞（ｅｘｐｉｒｅｄ Ｂ１Ｂ細胞）は、高レベルなＭＨＣクラスIＩ発現および大量のＩＬ−１０産生、それ以上の活性化を受けないことを除いて、未刺激Ｂ１Ｂ細胞に似ている。このような脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、未反応のヘルパーＴ細胞およびＣＴＬを刺激することができず、むしろナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導した。
【００４３】
これらの結果は、免疫調節への新たな手段を提供するものである。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に従って説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１
1. ＣｐＧ刺激によるＢ１Ｂ細胞表面抗原の変化
マウスＢ１Ｂ細胞をＣｐＧで刺激すると２０時間後には副刺激分子であるＣＤ８６の細胞表面の発現量が増加するが、刺激後４０時間にはその発現強度は１／４以下に低下する。一方、ＣＤ４０を刺激したＢ１Ｂ細胞は４０時間経過時もＣＤ８６分子の高発現を維持していた（図２）。Ｔ細胞に抗原を提示する分子である主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の発現量の変化は、クラスＩＩ分子の発現がCpG刺激により増加し４０時間後も発現を維持していたのに対し、クラスＩ分子は刺激後徐々に発現低下し、最終的に発現強度が刺激前の１／２０にまで低下した（図３）。
2. eB1Bの調製
マウス腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を採取し、培養液（10%FCS含有RPMI-1640）で1x106/mlの濃度に調整し、最終濃度1μMのCpG5002（塩基配列5' TCCATGACGTTCTTGATGTT 3' 、phosphorothioate保護処理）を添加して24well培養プレートに1ml/wellの密度で２日間（48時間）培養した。培養後の細胞集団は均一ではないので、FITCにより蛍光標識した抗CD11b抗体により細胞を染色し、細胞分離装置（セルソータ）によりCD11b-FITCの蛍光強度がマクロファージと比較して1/20〜1/200で、かつCD86が弱陽性〜陰性の細胞分画を精製した（図４左）。図４左の線の枠内がｅＢ１Ｂ細胞に該当する。
3. eB1Bの機能
Ｉ．サプレッサーT細胞の誘導
実験プロトコール：
(i) 抗原特異的ナイーブＴ細胞の分離：ハトチトクローム抗原（PCC）に反応するT細胞受容体を遺伝子導入したマウス（5CC7）より脾臓を摘出し、ナイロンメッシュを使って細胞浮遊液を調製する。細胞浮遊液は5%ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMI-1640培養液で調製し、これをナイロンウールカラムに移して一時間培養する。培養後、カラムに吸着しない細胞成分のみを自然滴下により回収し、1%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（PBS）に浮遊させる。次にマグネットビーズで標識された抗CD62L抗体で回収した細胞に氷上で１５分反応させ、MACSカラム（Miltenyi Biotech社）により抗体の結合した細胞のみを精製し、抗原特異的ナイーブＴ細胞を分離する。
(ii) サプレッサーＴ細胞の誘導：5CC7由来のナイーブＴ細胞をPCC 88-104 (KAERADLIAYLKQATAK) 10μM存在下にeB1Bと５日間培養する。培養液は10%FCS含RPMI-1640である。抗原刺激後約７２時間後のeB1BによるＴ細胞増殖活性をトリチウムの取込みで測定すると、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理により増殖能を抑制した脾細胞やaB1B（活性化BIB細胞）と比較してかなり低いことがわかる（図５下）。さらにその２日後（抗原刺激開始より５日後）のＴ細胞の活性化状態を表面マーカーの発現量により評価すると、脾細胞を抗原提示細胞に用いてナイーブＴ細胞と共培養した場合には活性化マーカーであるCD25およびCD69の発現増加がみられるが、eB1BとナイーブＴ細胞を共培養した場合はCD25のみ陽性に転じ、CD69は約８割の細胞で陰性になる（図５上）。
【００４５】
表面マーカーがCD4+CD25+CD69- Ｔ細胞は一般に調節性Ｔ細胞（regulatory T cell）と呼ばれているが、本発明者が誘導したサプレッサーＴ細胞は機能的には調節性Ｔ細胞（regulatory T cell）と同等もしくはそれ以上の抑制活性を持つ。
(iii) サプレッサーＴ細胞の増殖抑制機能の解析：生体中のヘルパーＴ細胞は一度も抗原刺激を受けた事の無いナイーブＴ細胞と、抗原刺激を受けて活性化したエフェクターＴ細胞に分類される。ナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の抗原特異的増殖がどの程度サプレッサーＴ細胞により抑制されるかを検討するため、次の実験を行った。
【００４６】
抑制を受ける側のＴ細胞として次の３種類の細胞を用意した。まずナイーブＴ細胞（Naive T）は5CC7トランスジェニックマウスから(i)の方法で精製したもの、またエフェクターＴ細胞としてナイーブＴ細胞をin vitroで抗原刺激と共にＩＬ-１２と抗ＩＬ−４抗体存在下で誘導したＴｈ１ライン、またはＩＬ?４および抗ＩＬ?１２抗体存在下で誘導したＴｈ２ラインの２種類である。
サプレッサーＴ細胞の抑制が、ＴＧＦ-bやＩＬ-１０などの抑制性サイトカインによるものかどうかを確認するため、サプレッサーＴ細胞と抗原刺激を受けたＴ細胞の培養と共に、抗ＴＧＦ-b抗体または抗ＩＬ-１０抗体そしてコントロールとして抗ＩＬ-６抗体を加えたものも作成した。
【００４７】
細胞増殖反応は、96well フラットボトムプレートに、1wellあたりナイーブＴ細胞もしくはＴ細胞ラインを5x104ずつと、抗原提示細胞としてマイトマイシン処理した脾細胞を5x105ずつと各濃度の抗原（ハトチトクロームＣ（ＰＣＣ））を入れ、CO2インキュベータで４０時間培養後にトリチウム−チミジンを加え更に８時間培養した。細胞増殖はトリチウムの取り込みをカウントして評価した。サプレッサーＴ細胞は5x104ずつ、または1x104ずつ各wellに加えた。
【００４８】
結果を図６に示す。
成績：図６に示されるように、まず、誘導されたサプレッサーＴ細胞自身は、あらゆる濃度の抗原に対しても抗原特異的T細胞増殖誘導は起こらなかった（図６右上）。さらには完全刺激であるIL-2+Con. Aに対しても、それ自身の増殖はもちろん、共培養したヘルパーT細胞ラインの増殖をも抑制した（図６左上）。次に、サプレッサーＴ細胞とナイーブＴ細胞またはＴｈ１細胞ラインを１：１で混合して各抗原濃度においてＴ細胞増殖反応を誘導したところ、ナイーブＴ、Ｔｈ１ラインともに単独では増殖するものが、サプレッサーＴ細胞（eB1Bで誘導されたもの）と共培養することでその増殖がどの抗原濃度でも完全に抑制された（図６上から２段目）。これらの実験から、Ｔ細胞が抗原に感作される前あるいは感作後においても、eB1Bによって誘導されるサプレッサーＴ細胞は抑制作用を示すことが明らかとなった。従って、少なくともヘルパーＴ細胞が深く関与する免疫疾患（自己免疫やアレルギー反応など）の予防／抑制に対して、eB1Bが効果を持つことが示された。次に、eB1Bによって誘導されたサプレッサーＴ細胞により、Ｔｈ１とＴｈ２のどちらがより抑制されるかを比較した。結果としてＴｈ１、Ｔｈ２ともに、数にしてわずか１／５のサプレッサーＴ細胞により増殖反応が完全に抑制され、Th1/Th2への分化による抑制の受けやすさに差はみられなかった（図６下から２段目）。さらに、eB1Bにより誘導されたサプレッサーＴ細胞は、ＴＧＦ−βやＩＬ−１０によってＴ細胞増殖反応を抑制しているのではないことも、抗サイトカイン抗体を用いた実験により明らかになった（図６最下段）。
【００４９】
II.急性移植片対宿主反応（ＧＶＨＤ）の抑制
実験プロトコール：C57BL/6マウスに900レントゲンの放射線照射を行い、翌日にＭＨＣの異なるBALB/cマウスの骨髄細胞を静脈内注射する。投与する骨髄細胞はＴ細胞を除いておらず、ＭＨＣの異なるマウスの体内に入ると増殖して、移入後１０日前後に脾臓が大きくなる（ＧＶＨＤの指標）。骨髄細胞とともにeB1B細胞を２時間インキュベートしてから移植したものと、骨髄細胞のみ移植したものとを比較した。
【００５０】
成績：eB1B細胞を投与したマウスの脾臓は、119mgと比較的小さく（通常のマウス脾臓は100mg前後）、一方骨髄細胞のみ投与したものは168mgと著明に脾臓重量が増加していた（表２）。
【００５１】
表２の結果から、eB1B細胞は、強力な免疫抑制作用を有し、臓器ないし器官等の移植時の免疫抑制剤として有効であることが実証された。
【００５２】
【表２】
【００５３】
４．Ｂ１Ｂ細胞からのサイトカイン分泌
マウスＢ１Ｂ細胞をＰＥＣから分離して1x106/mlの濃度で培養液（RPMI-1640 + 10% FBS）に浮遊させ、２４ｗｅｌｌプレートに移して培養する。ＣｐＧまたは抗ＣＤ４０抗体により刺激し、６時間ごとに培養液を交換して行く。刺激開始から６時間の培養液と２１〜２７時間、そして４５〜５１時間の培養液に含まれるＩＬ−１０およびＩＬ−１２の量をＥＬＩＳＡ法により測定した（図７）。
【００５４】
成績：ＣｐＧによる刺激では、刺激後２７時間までに多量のＩＬ−１０を分泌していた。一方、抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０を介した刺激では、２４時間前後でＩＬ−１０の有意な分泌を認めたものの、分泌時間はごく短かった。一方、ＩＬ−１２はＣｐＧ刺激直後にごく少量分泌されたが、全体的に量がかなり少なく（せいぜい100pg/ml/1x106 cells以下）、サイトカインとしての機能を発揮できるか疑わしいレベルにとどまった（図７）。
5. Ｂ１Ｂにより誘導されたサプレッサーＴ細胞と調節性Ｔ細胞の区別
サプレッサーＴ細胞と調節性Ｔ細胞の表面マーカーによる区別は困難である。調節性Ｔ細胞に多く発現しているとされるＦｏｘＰ３遺伝子をB1B細胞により誘導したサプレッサーＴ細胞で検討した。Ｂ１Ｂにより誘導したサプレッサーＴ細胞、マウス脾細胞よりフローサイトメーターで精製した調節性Ｔ細胞より、それぞれＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、その量をＦｏｘＰ３特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ法で定量した。その結果、１細胞あたりに含まれるＦｏｘＰ３のｍＲＮＡコピー数の相対比見ると、Ｂ１Ｂ誘導サプレッサーＴ細胞は、調節性Ｔ細胞よりもかなり少ない量のＦｏｘＰ３しかもっておらず、これらの細胞が同一のものでは無いことが明らかとなった（図８）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱活性化したＢ１Ｂ細胞、及びその調製方法、脱活性化したＢ１Ｂ細胞を用いた免疫抑制剤ならびに臓器ないし器官の移植方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ１Ｂ細胞は、自己免疫の発症に関わっていることが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
またヒトでは、Ｂ１Ｂ細胞が新生児期に多く存在し、加齢とともに減少してくるものの、生体内に存在していることが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、Ｂ１Ｂ細胞の免疫抑制作用については、報告されていない。
【非特許文献１】Rheumatoid factor secretion from human Leu-1+ B cells.Science. 1987 Apr 3; 236(4797): 81-3.
【非特許文献２】The ontogeny and functional characteristics of human B-1 (CD5+ B) cells. International Immunology 1992; 4: 243-252.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｂ１Ｂ細胞の成熟過程に関する新たな知見を提供することを目的とする。
【０００６】
具体的には、本発明は、免疫抑制機能を有する脱活性化したＢ１Ｂ細胞、を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、免疫抑制剤、並びに拒絶反応が抑制された臓器、器官の移植方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、エンドトキシン（ＬＰＳ）などの自然免疫刺激剤を用いて、未刺激Ｂ１Ｂ細胞（immature B1B cell）の成熟を評価した。
【０００９】
本発明者は、自然免疫刺激剤によって誘導される、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞について記載する。この脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、高レベルなＭＨＣクラスII発現、ＩＬ−１０産生、および別の方法で成熟を誘導する刺激に対する非反応性を除いて、多くの点で未刺激Ｂ１Ｂ細胞に類似している。
【００１０】
このような脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、未反応のヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を刺激することができない。むしろ、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導し、免疫抑制作用を有する。
【００１１】
Ｂ１Ｂ細胞の成熟過程の詳細を明らかにしたのは本発明者が初めてである。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
１． 脱活性化した(expired)Ｂ１Ｂ細胞。
２． ＩＬ−１０を発現する項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。３． ＭＨＣクラスIIを高発現する項１または２に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
４． ＭＨＣクラスIを低発現する項１〜３のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
５． ヘルパーＴ細胞のアナジー(anergy)を誘導する項１〜４のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
６． 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のアナジー(anergy)を誘導する項１〜５のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
７． ナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導する項１〜６のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
８． 自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用により成熟型に移行しない項１〜７のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
９． CD80/CD83/CD86の発現量が低い項１〜８のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
１０． 前記Ｂ１Ｂ細胞がヒトのＢ１Ｂ細胞である項１〜９のいずれかに記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
１１． さらに下記の特徴を有する項１０に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＣＤ８０の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い；及び／又は
ＣＤ８３の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い。
１２． さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する項１０または１１に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＭＨＣクラスIIを高発現する（ＭＨＣクラスIIｈｉｇｈ）；
ＭＨＣクラスIを低発現する（ＭＨＣクラスIｌｏｗ）；
１３． 未刺激Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟Ｂ１Ｂ細胞に導く工程、該成熟Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤の存在下又は非存在下でさらに培養する工程を含む脱活性化されたＢ１Ｂ細胞（expired B1B）の調製方法。
１４． 項１〜１２のいずれかに記載の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または項１３に記載の方法により得られた脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を有効成分とする免疫抑制剤。
１５． ヒト移植ドナー由来の項１０〜１２のいずれかに記載のヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または項１３に記載の方法により得られたヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することを包含する拒絶反応を抑制した臓器ないし器官の移植方法。
１６． 前記臓器ないし器官が骨髄細胞である項１５に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、免疫抑制剤として有用な脱活性化されたＢ１Ｂ細胞が得られる。
【００１４】
ヒト移植ドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することにより、移植の拒絶反応を効果的に抑制することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】フローサイトメーターによるＢ１Ｂ分画とマクロファージ（Ｍφ）の比較。
【図２】各刺激によるＢ１Ｂ細胞ＣＤ８６発現の時間的推移。
【図３】ＣｐＧ刺激によるＢ１Ｂ細胞ＭＨＣ分子発現の時間的推移。
【図４】脱活性化Ｂ１Ｂ細胞分画。
【図５】脱活性化Ｂ１Ｂと共培養したナイーブＴ細胞の増殖活性とその際のＴ細胞表面抗原（ＣＤ２５／ＣＤ６９）の変化。
【図６】ｅＢ１Ｂ細胞により誘導されたサプレッサーＴ細胞のＴ細胞増殖抑制効果。
【図７】ＣｐＧまたは抗ＣＤ４０抗体刺激によるＢ１Ｂ細胞からのＩＬ−１０およびＩＬ−１２分泌の時間的推移。
【図８】ｅＢ１Ｂにより誘導されたサプレッサーＴ細胞内に発現するＦｏｘＰ３遺伝子の発現量と調節性Ｔ細胞（Treg）のＦｏｘＰ３遺伝子の発現量との比較。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において、「B1B細胞」は、リンパ球よりもやや大きく（直径13〜30μm）、細胞内顆粒が少ない（SSCでMφの1/3〜1/6の散乱光強度）細胞分画である（図１）。図１において、直径が13〜30μm程度であることは、横軸のForward Scatterの赤血球に対する相対値により確認することができ、一方、細胞内顆粒がマクロファージ（Mφ）の1/3〜1/6程度であることは、図１の縦軸のSide Scatter（散乱光強度）の値により確認できる。
【００１７】
B1B細胞の表面抗原の特性は、図１に示すようにCD11b抗原は陽性であるものの、マクロファージに特異的とされるF4/80抗原とCD115抗原はほとんど発現が認められない。B1B細胞のCD5抗原は陽性（Ｂ１Ｂａ）と陰性（Ｂ１Ｂｂ）の両方が包含される。
【００１８】
Ｂ１Ｂ細胞の供給源としては、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サル等の哺乳動物が好ましく例示され、より好ましくはヒトが例示される。
【００１９】
本発明では、未刺激Ｂ１Ｂ細胞が以下の経路で変換される。
経路１：未刺激Ｂ１Ｂ細胞 → 一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞
→ 脱活性化Ｂ１Ｂ細胞(expired Ｂ１Ｂ細胞)
経路１において、未刺激Ｂ１Ｂ細胞から一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞へは、自然免疫刺激剤ないしdanger signal（細胞破砕物、尿酸結晶等）により誘導される。
【００２０】
自然免疫刺激剤は、未刺激Ｂ１Ｂ細胞から一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞への成熟化を誘導するものであれば特に限定されず、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ＣｐＧ、ペプチドグリカン、壊死細胞成分、ＴＮＦα等のToll-like receptors（ＴＬＲｓ）に結合し、活性化シグナルを誘導するものや、ＯＫ４３２（ピシバニール）が包含される。さらに好ましい自然免疫刺激剤としてＬＰＳ，ＣｐＧなどが挙げられる。
【００２１】
経路１において、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から脱活性化Ｂ１Ｂ細胞への移行は、特別な物質は必要なく、通常の培養液中で５〜１００時間程度培養することで、行うことができる。当該培養を自然免疫刺激剤の存在下に行っても、同様に５〜１００時間程度培養することで、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から脱活性化Ｂ１Ｂ細胞への移行が行われる。この移行は、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から放出されるＩＬ−１０が関与するものと考えられる。これは、抗ＩＬ−１０抗体を一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞と共存させて、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞への移行が抑制されることにより確認できる。
【００２２】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞は、臍帯血から分離することができ、さらに増殖され得る。また、幹細胞からも誘導され得る。未刺激Ｂ１Ｂ細胞、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞の分離は、例えば蛍光標識又は染色を行った後、セルソーターにより行うことができる。例えば、マウスＢ１Ｂ細胞では、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞と一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞を、ＣＤ８６で染色後に細胞分離装置（セルソーター）により分離することができる。また、ヒトＢ１Ｂ細胞は、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞と一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞を、CD80又はCD83で染色後に細胞分離装置（セルソーター）により分離することができる。
【００２３】
さらに、マウス脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はLPSで刺激４８時間後のCD86-lowをセルソーターで分離精製することができ、ヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はLPSで刺激４８時間後のCD83-low又はCD80-lowをセルソーターで分離精製することができる。
【００２４】
本発明により、初めて脱活性化Ｂ１Ｂ細胞が提供される。
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞のキャラクタリゼーション
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、例えば、以下に示すような１種以上の性質を有している。
(E1)自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用により活性型に移行しない。
【００２５】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞が自然免疫刺激剤により活性化され、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞となった後、さらに培養を継続することにより脱活性化Ｂ１Ｂ細胞へ移行し得る。いったん脱活性化Ｂ１Ｂ細胞へ移行すると、さらに自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）を作用させても脱活性化Ｂ１Ｂ細胞のままである。
（E2）ＩＬ−１０を発現する
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、ＩＬ−１０を発現、分泌する。未刺激Ｂ１Ｂ細胞は、ＩＬ−１０を意味のある程度に発現しない。脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はＩＬ−１０の発現量が高く、例えば1x106個あたり６時間で約0.5〜3ngを分泌する。
【００２６】
一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞は、ＩＬ−１０を高発現し、このＩＬ−１０により一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞から脱活性化Ｂ１Ｂ細胞に移行すると考えられる。
（E3） CD80/CD83/CD86の発現量が低い(CD80low/CD83low/CD86low)
例えば、マウス由来のＢ１Ｂ細胞では、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞においてＣＤ８６発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも明らかに多く、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は未刺激Ｂ１Ｂ細胞と同程度かやや多いＣＤ８６発現量を有する（ＣＤ８６ｌｏｗ）。
【００２７】
一方、ヒト由来のＢ１Ｂ細胞では、樹状細胞との相同性から、ＣＤ８０および／またはＣＤ８３の緩やかな発現量の変化を経て未成熟Ｂ１Ｂ細胞から低発現量の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞（ＣＤ８０ｌｏｗ／ＣＤ８３ｌｏｗ）に変化すると考えられる。
【００２８】
なお、本発明者はB1B細胞が貪食（phagocytosis）をほとんど行わないにも関わらず、飲作用（pinocytosis/endocytosis）により外来蛋白抗原を取込み、さらにプロセッシングを経てペプチド抗原としてMHC上に提示しうることをマウスにおいて確認した。
（E4）ＭＨＣクラスIIの発現量が高い
未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりもＭＨＣクラスIIの発現レベルが高く、ＭＨＣクラスIIの発現量が低い未刺激Ｂ１Ｂ細胞と区別可能である。
（E5）抗原ペプチドの存在下で未反応Ｔ細胞を活性化しない；
一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞は抗原ペプチドの存在下でナイーブのヘルパーＴ細胞及びナイーブのＣＴＬを活性化し得るが、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は抗原ペプチドの存在下でナイーブのヘルパーＴ細胞及びナイーブのＣＴＬを活性化せず、Ｔ細胞アナジーを誘導する。
【００２９】
さらに、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞はナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導し、免疫抑制作用を有する。
【００３０】
本明細書において、「ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが低い(ＣＤ８６ｌｏｗ／ＣＤ８３ｌｏｗ／ＣＤ８０ｌｏｗ)」とは、色素物質（例えばフィコエリトリン）または蛍光物質（ＦＩＴＣなど）等のマーカーを結合した抗ＣＤ８６抗体／抗ＣＤ８３抗体／抗ＣＤ８０抗体を使用し、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞と反応させると、コントロール（脱活性化Ｂ１Ｂ細胞のみを用い、マーカー結合抗ＣＤ８６抗体／抗ＣＤ８３抗体／抗ＣＤ８０抗体を使用しない）に比べて１０倍以下（通常１〜１０倍、特に３〜８倍程度）の吸光度または蛍光強度を有することを意味する。なお、「ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが高い（ＣＤ８６ｈｉｇｈ／ＣＤ８３ｈｉｇｈ／ＣＤ８０ｈｉｇｈ）」一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞では、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞に対し３〜１０倍程度の吸光度または蛍光強度を有する。CD80-high ／CD83-high ／CD86-highとはCD80-low ／CD83-low ／CD86-lowと比べて３〜１０倍程度の吸光度または蛍光強度を示すものを指す。
【００３１】
本発明の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが未刺激Ｂ１Ｂよりも低い点で未刺激Ｂ１Ｂ細胞と相違するが、以下の点で、さらに未刺激Ｂ１Ｂ細胞と異なっている：
(i) ＬＰＳなどの自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種を作用させても成熟Ｂ１Ｂ細胞に移行しない；
(ii) ＩＬ−１０の発現レベルが未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも高く、これらを放出する。特に免疫抑制性のＩＬ−１０の産生は重要と考えられる。
(iii) ＭＨＣクラスII（ＭＨＣクラスII／ペプチド複合体）を高発現する
(iv) 未反応Ｔ細胞を活性化しない；
脱活性化Ｂ１Ｂ細胞、一過性活性化Ｂ１Ｂ細胞の表面抗原の相違を以下の表に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞は、ＣＤ８０／ＣＤ８３／ＣＤ８６の発現量が低いので、レシピエントに導入された場合にキラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞のアナジーを誘導する可能性があるが、未刺激Ｂ１Ｂ細胞はレシピエント内で活性化されて成熟Ｂ１Ｂ細胞になって、免疫系を賦活する可能性が高い。
【００３４】
一方、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は再び成熟Ｂ１Ｂ細胞に戻ることはなく、安定している。従って、ドナーの脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をレシピエントに予め投与するとドナー移植片を拒絶可能なレシピエントのキラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞の両方を刺激することができず、むしろナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導し、次にドナーの臓器ないし器官等を移植した場合に、拒絶反応を抑制することが可能となる。
【００３５】
例えば臓器移植や骨髄移植の場合、一般的に６種類のＨＬＡのうち、５種ないし６種の型が一致している必要があるが、ドナーの脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を予めレシピエントに投与しておくことで、ＨＬＡの適合性の低いドナーの臓器ないし骨髄をレシピエントに移植することができるようになるため、臓器移植や骨髄移植が容易に行えるようになる。
【００３６】
本発明の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞が免疫拒絶を抑制することは、ＭＬＣ法(mixed Lymphocyte reaction culture)により確認することが可能である。具体的には、ドナーとレシピエント（脱活性化Ｂ１Ｂ細胞投与前）の脾臓組織の一部を取り出し、該組織の脾臓細胞を混合培養したとき、Ｔ細胞数が増加するが、レシピエントにドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を投与してレシピエントのキラーＴ細胞、及び任意にヘルパーＴ細胞のアナジーを誘発し、次にＭＬＣ法を行った場合にはＴ細胞数が増加しないことから、ドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞がレシピエントの免疫拒絶を抑制することが確認できる。データは示さないが、本発明者は、ドナー由来の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をレシピエントに投与後に、ドナーの骨髄をレシピエントに移植すると、ＭＬＣ反応（Mixed Lymphocyte culture 混合リンパ球培養）が起こらなかったことを確認している。
【００３７】
該移植される臓器ないし器官等としては、心臓、肝臓、腎臓、肺、小腸、膵臓、皮膚、骨髄が例示される。移植される臓器ないし器官等は、全体又は一部であってもよい。
【００３８】
さらに、脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は移植拒絶の抑制だけでなく、アレルギー、自己免疫疾患の治療剤としても有効である。
【００３９】
アレルギーとしては、アトピー性皮膚炎、花粉症、喘息などが挙げられる。
【００４０】
自己免疫疾患としては、クローン病、交感性眼炎、無精子症、血小板減少症、神経細胞に親和性を持つウイルス感染によるアレルギー性脳脊髄炎、レンサ球菌感染後のリウマチ熱や糸球体腎炎、関節リウマチ（RA）、全身性エリテマトーデス（SLE）、溶血性貧血、甲状腺機能亢進症（バセドウ病）、慢性甲状腺炎（橋本病）、重症筋無力症、インスリン抵抗性糖尿病などが挙げられる。
【００４１】
本発明の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、患者当たり１×１０３〜１×１０８個の細胞を投与することで、移植拒絶の抑制を含む免疫抑制剤、アレルギーないし自己免疫疾患の治療剤として有効である。
【００４２】
本発明者は、本明細書において、自然免疫刺激剤による刺激後の未刺激Ｂ１Ｂ細胞の急速な成熟およびそれに続く脱活性化（ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎ）について記載した。脱活性化したＢ１Ｂ細胞（ｅｘｐｉｒｅｄ Ｂ１Ｂ細胞）は、高レベルなＭＨＣクラスIＩ発現および大量のＩＬ−１０産生、それ以上の活性化を受けないことを除いて、未刺激Ｂ１Ｂ細胞に似ている。このような脱活性化Ｂ１Ｂ細胞は、未反応のヘルパーＴ細胞およびＣＴＬを刺激することができず、むしろナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導した。
【００４３】
これらの結果は、免疫調節への新たな手段を提供するものである。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に従って説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１
1. ＣｐＧ刺激によるＢ１Ｂ細胞表面抗原の変化
マウスＢ１Ｂ細胞をＣｐＧで刺激すると２０時間後には副刺激分子であるＣＤ８６の細胞表面の発現量が増加するが、刺激後４０時間にはその発現強度は１／４以下に低下する。一方、ＣＤ４０を刺激したＢ１Ｂ細胞は４０時間経過時もＣＤ８６分子の高発現を維持していた（図２）。Ｔ細胞に抗原を提示する分子である主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の発現量の変化は、クラスＩＩ分子の発現がCpG刺激により増加し４０時間後も発現を維持していたのに対し、クラスＩ分子は刺激後徐々に発現低下し、最終的に発現強度が刺激前の１／２０にまで低下した（図３）。
2. eB1Bの調製
マウス腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を採取し、培養液（10%FCS含有RPMI-1640）で1x106/mlの濃度に調整し、最終濃度1μMのCpG5002（塩基配列5' TCCATGACGTTCTTGATGTT 3' 、phosphorothioate保護処理）を添加して24well培養プレートに1ml/wellの密度で２日間（48時間）培養した。培養後の細胞集団は均一ではないので、FITCにより蛍光標識した抗CD11b抗体により細胞を染色し、細胞分離装置（セルソータ）によりCD11b-FITCの蛍光強度がマクロファージと比較して1/20〜1/200で、かつCD86が弱陽性〜陰性の細胞分画を精製した（図４左）。図４左の線の枠内がｅＢ１Ｂ細胞に該当する。
3. eB1Bの機能
Ｉ．サプレッサーT細胞の誘導
実験プロトコール：
(i) 抗原特異的ナイーブＴ細胞の分離：ハトチトクローム抗原（PCC）に反応するT細胞受容体を遺伝子導入したマウス（5CC7）より脾臓を摘出し、ナイロンメッシュを使って細胞浮遊液を調製する。細胞浮遊液は5%ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMI-1640培養液で調製し、これをナイロンウールカラムに移して一時間培養する。培養後、カラムに吸着しない細胞成分のみを自然滴下により回収し、1%ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（PBS）に浮遊させる。次にマグネットビーズで標識された抗CD62L抗体で回収した細胞に氷上で１５分反応させ、MACSカラム（Miltenyi Biotech社）により抗体の結合した細胞のみを精製し、抗原特異的ナイーブＴ細胞を分離する。
(ii) サプレッサーＴ細胞の誘導：5CC7由来のナイーブＴ細胞をPCC 88-104 (KAERADLIAYLKQATAK) 10μM存在下にeB1Bと５日間培養する。培養液は10%FCS含RPMI-1640である。抗原刺激後約７２時間後のeB1BによるＴ細胞増殖活性をトリチウムの取込みで測定すると、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理により増殖能を抑制した脾細胞やaB1B（活性化BIB細胞）と比較してかなり低いことがわかる（図５下）。さらにその２日後（抗原刺激開始より５日後）のＴ細胞の活性化状態を表面マーカーの発現量により評価すると、脾細胞を抗原提示細胞に用いてナイーブＴ細胞と共培養した場合には活性化マーカーであるCD25およびCD69の発現増加がみられるが、eB1BとナイーブＴ細胞を共培養した場合はCD25のみ陽性に転じ、CD69は約８割の細胞で陰性になる（図５上）。
【００４５】
表面マーカーがCD4+CD25+CD69- Ｔ細胞は一般に調節性Ｔ細胞（regulatory T cell）と呼ばれているが、本発明者が誘導したサプレッサーＴ細胞は機能的には調節性Ｔ細胞（regulatory T cell）と同等もしくはそれ以上の抑制活性を持つ。
(iii) サプレッサーＴ細胞の増殖抑制機能の解析：生体中のヘルパーＴ細胞は一度も抗原刺激を受けた事の無いナイーブＴ細胞と、抗原刺激を受けて活性化したエフェクターＴ細胞に分類される。ナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の抗原特異的増殖がどの程度サプレッサーＴ細胞により抑制されるかを検討するため、次の実験を行った。
【００４６】
抑制を受ける側のＴ細胞として次の３種類の細胞を用意した。まずナイーブＴ細胞（Naive T）は5CC7トランスジェニックマウスから(i)の方法で精製したもの、またエフェクターＴ細胞としてナイーブＴ細胞をin vitroで抗原刺激と共にＩＬ-１２と抗ＩＬ−４抗体存在下で誘導したＴｈ１ライン、またはＩＬ?４および抗ＩＬ?１２抗体存在下で誘導したＴｈ２ラインの２種類である。
サプレッサーＴ細胞の抑制が、ＴＧＦ-bやＩＬ-１０などの抑制性サイトカインによるものかどうかを確認するため、サプレッサーＴ細胞と抗原刺激を受けたＴ細胞の培養と共に、抗ＴＧＦ-b抗体または抗ＩＬ-１０抗体そしてコントロールとして抗ＩＬ-６抗体を加えたものも作成した。
【００４７】
細胞増殖反応は、96well フラットボトムプレートに、1wellあたりナイーブＴ細胞もしくはＴ細胞ラインを5x104ずつと、抗原提示細胞としてマイトマイシン処理した脾細胞を5x105ずつと各濃度の抗原（ハトチトクロームＣ（ＰＣＣ））を入れ、CO2インキュベータで４０時間培養後にトリチウム−チミジンを加え更に８時間培養した。細胞増殖はトリチウムの取り込みをカウントして評価した。サプレッサーＴ細胞は5x104ずつ、または1x104ずつ各wellに加えた。
【００４８】
結果を図６に示す。
成績：図６に示されるように、まず、誘導されたサプレッサーＴ細胞自身は、あらゆる濃度の抗原に対しても抗原特異的T細胞増殖誘導は起こらなかった（図６右上）。さらには完全刺激であるIL-2+Con. Aに対しても、それ自身の増殖はもちろん、共培養したヘルパーT細胞ラインの増殖をも抑制した（図６左上）。次に、サプレッサーＴ細胞とナイーブＴ細胞またはＴｈ１細胞ラインを１：１で混合して各抗原濃度においてＴ細胞増殖反応を誘導したところ、ナイーブＴ、Ｔｈ１ラインともに単独では増殖するものが、サプレッサーＴ細胞（eB1Bで誘導されたもの）と共培養することでその増殖がどの抗原濃度でも完全に抑制された（図６上から２段目）。これらの実験から、Ｔ細胞が抗原に感作される前あるいは感作後においても、eB1Bによって誘導されるサプレッサーＴ細胞は抑制作用を示すことが明らかとなった。従って、少なくともヘルパーＴ細胞が深く関与する免疫疾患（自己免疫やアレルギー反応など）の予防／抑制に対して、eB1Bが効果を持つことが示された。次に、eB1Bによって誘導されたサプレッサーＴ細胞により、Ｔｈ１とＴｈ２のどちらがより抑制されるかを比較した。結果としてＴｈ１、Ｔｈ２ともに、数にしてわずか１／５のサプレッサーＴ細胞により増殖反応が完全に抑制され、Th1/Th2への分化による抑制の受けやすさに差はみられなかった（図６下から２段目）。さらに、eB1Bにより誘導されたサプレッサーＴ細胞は、ＴＧＦ−βやＩＬ−１０によってＴ細胞増殖反応を抑制しているのではないことも、抗サイトカイン抗体を用いた実験により明らかになった（図６最下段）。
【００４９】
II.急性移植片対宿主反応（ＧＶＨＤ）の抑制
実験プロトコール：C57BL/6マウスに900レントゲンの放射線照射を行い、翌日にＭＨＣの異なるBALB/cマウスの骨髄細胞を静脈内注射する。投与する骨髄細胞はＴ細胞を除いておらず、ＭＨＣの異なるマウスの体内に入ると増殖して、移入後１０日前後に脾臓が大きくなる（ＧＶＨＤの指標）。骨髄細胞とともにeB1B細胞を２時間インキュベートしてから移植したものと、骨髄細胞のみ移植したものとを比較した。
【００５０】
成績：eB1B細胞を投与したマウスの脾臓は、119mgと比較的小さく（通常のマウス脾臓は100mg前後）、一方骨髄細胞のみ投与したものは168mgと著明に脾臓重量が増加していた（表２）。
【００５１】
表２の結果から、eB1B細胞は、強力な免疫抑制作用を有し、臓器ないし器官等の移植時の免疫抑制剤として有効であることが実証された。
【００５２】
【表２】
【００５３】
４．Ｂ１Ｂ細胞からのサイトカイン分泌
マウスＢ１Ｂ細胞をＰＥＣから分離して1x106/mlの濃度で培養液（RPMI-1640 + 10% FBS）に浮遊させ、２４ｗｅｌｌプレートに移して培養する。ＣｐＧまたは抗ＣＤ４０抗体により刺激し、６時間ごとに培養液を交換して行く。刺激開始から６時間の培養液と２１〜２７時間、そして４５〜５１時間の培養液に含まれるＩＬ−１０およびＩＬ−１２の量をＥＬＩＳＡ法により測定した（図７）。
【００５４】
成績：ＣｐＧによる刺激では、刺激後２７時間までに多量のＩＬ−１０を分泌していた。一方、抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０を介した刺激では、２４時間前後でＩＬ−１０の有意な分泌を認めたものの、分泌時間はごく短かった。一方、ＩＬ−１２はＣｐＧ刺激直後にごく少量分泌されたが、全体的に量がかなり少なく（せいぜい100pg/ml/1x106 cells以下）、サイトカインとしての機能を発揮できるか疑わしいレベルにとどまった（図７）。
5. Ｂ１Ｂにより誘導されたサプレッサーＴ細胞と調節性Ｔ細胞の区別
サプレッサーＴ細胞と調節性Ｔ細胞の表面マーカーによる区別は困難である。調節性Ｔ細胞に多く発現しているとされるＦｏｘＰ３遺伝子をB1B細胞により誘導したサプレッサーＴ細胞で検討した。Ｂ１Ｂにより誘導したサプレッサーＴ細胞、マウス脾細胞よりフローサイトメーターで精製した調節性Ｔ細胞より、それぞれＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いてｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、その量をＦｏｘＰ３特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ法で定量した。その結果、１細胞あたりに含まれるＦｏｘＰ３のｍＲＮＡコピー数の相対比見ると、Ｂ１Ｂ誘導サプレッサーＴ細胞は、調節性Ｔ細胞よりもかなり少ない量のＦｏｘＰ３しかもっておらず、これらの細胞が同一のものでは無いことが明らかとなった（図８）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱活性化した(expired)Ｂ１Ｂ細胞。
【請求項２】
ＩＬ−１０を発現する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項３】
ＭＨＣクラスIIを高発現する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項４】
ＭＨＣクラスIを低発現する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項５】
ヘルパーＴ細胞のアナジー(anergy)を誘導する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項６】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のアナジー(anergy)を誘導する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項７】
ナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項８】
自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用により成熟型に移行しない請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項９】
CD80/CD83/CD86の発現量が低い請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項１０】
前記Ｂ１Ｂ細胞がヒトのＢ１Ｂ細胞である請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項１１】
さらに下記の特徴を有する請求項１０に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＣＤ８０の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い；及び／又は
ＣＤ８３の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い。
【請求項１２】
さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する請求項１０に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＭＨＣクラスIIを高発現する（ＭＨＣクラスIIｈｉｇｈ）；
ＭＨＣクラスIを低発現する（ＭＨＣクラスIｌｏｗ）；
【請求項１３】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟Ｂ１Ｂ細胞に導く工程、該成熟Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤の存在下又は非存在下でさらに培養する工程を含む脱活性化されたＢ１Ｂ細胞（expired B1B）の調製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または請求項１３に記載の方法により得られた脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を有効成分とする免疫抑制剤。
【請求項１５】
ヒト移植ドナー由来の請求項１０〜１２のいずれかに記載のヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または請求項１３に記載の方法により得られたヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することを包含する拒絶反応を抑制した臓器ないし器官の移植方法。
【請求項１６】
前記臓器ないし器官が骨髄細胞である請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
脱活性化した(expired)Ｂ１Ｂ細胞。
【請求項２】
ＩＬ−１０を発現する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項３】
ＭＨＣクラスIIを高発現する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項４】
ＭＨＣクラスIを低発現する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項５】
ヘルパーＴ細胞のアナジー(anergy)を誘導する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項６】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のアナジー(anergy)を誘導する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項７】
ナイーブヘルパーＴ細胞からサプレッサーＴ細胞を誘導する請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項８】
自然免疫刺激剤及びCD40を介する刺激剤（抗CD40抗体を含む）からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用により成熟型に移行しない請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項９】
CD80/CD83/CD86の発現量が低い請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項１０】
前記Ｂ１Ｂ細胞がヒトのＢ１Ｂ細胞である請求項１に記載の脱活性化したＢ１Ｂ細胞。
【請求項１１】
さらに下記の特徴を有する請求項１０に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＣＤ８０の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い；及び／又は
ＣＤ８３の発現量が未刺激Ｂ１Ｂ細胞よりも低い。
【請求項１２】
さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する請求項１０に記載のヒトの脱活性化したＢ１Ｂ細胞：
ＭＨＣクラスIIを高発現する（ＭＨＣクラスIIｈｉｇｈ）；
ＭＨＣクラスIを低発現する（ＭＨＣクラスIｌｏｗ）；
【請求項１３】
未刺激Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟Ｂ１Ｂ細胞に導く工程、該成熟Ｂ１Ｂ細胞を自然免疫刺激剤の存在下又は非存在下でさらに培養する工程を含む脱活性化されたＢ１Ｂ細胞（expired B1B）の調製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または請求項１３に記載の方法により得られた脱活性化Ｂ１Ｂ細胞を有効成分とする免疫抑制剤。
【請求項１５】
ヒト移植ドナー由来の請求項１０〜１２のいずれかに記載のヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞または請求項１３に記載の方法により得られたヒト脱活性化Ｂ１Ｂ細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することを包含する拒絶反応を抑制した臓器ないし器官の移植方法。
【請求項１６】
前記臓器ないし器官が骨髄細胞である請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６２８
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１７６７７（Ｐ２００５−５１７６７７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１４０２
【国際出願日】平成１７年２月１日（２００５．２．１）
【出願人】（８９９００００４６）関西ティー・エル・オー株式会社 (75)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１４０２
【国際出願日】平成１７年２月１日（２００５．２．１）
【出願人】（８９９００００４６）関西ティー・エル・オー株式会社 (75)
【Ｆターム（参考）】
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