脱顆粒促進剤及び脱顆粒抑制物質の評価方法
【課題】顆粒球における脱顆粒の促進剤、アレルギー剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法等を提供すること。
【解決手段】カンジダ由来のβ−グルカンを有効成分とする顆粒球の脱顆粒の促進剤。次のステップを含む顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法又は抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法；被験物質、カンジダ由来のβ−グルカン、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ、前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。カンジダ由来のβ−グルカンを構成成分として含む顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キット又は抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキット。
【解決手段】カンジダ由来のβ−グルカンを有効成分とする顆粒球の脱顆粒の促進剤。次のステップを含む顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法又は抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法；被験物質、カンジダ由来のβ−グルカン、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ、前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。カンジダ由来のβ−グルカンを構成成分として含む顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キット又は抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顆粒球における脱顆粒の促進剤、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法及びこれらの方法に用いるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類において使用する略号及びその意義は以下の通りである。
ＢＧ：β−グルカン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＳＢＧ：カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）由来の1,6−β−long glucosyl branched 1,3−β−グルカン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＦＢＳ：ウシ胎児血清（fetal bovine serum）
ＳＰＧ：Schizophyllum commune由来の1,6−β−mono glucosyl branched 1,3−β−グルカン
ＴＮＰ：トリニトロフェニル
特許文献１には、パン酵母由来のＢＧを含有することを特徴とする免疫力改善食品が記載されており、その「免疫力改善」として抗アレルギーが記載されている。また特許文献２には、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液またはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを有効成分とするアレルギー抑制剤が記載されている。
しかし、カンジダ由来のＢＧが顆粒球の脱顆粒を促進すること、これを脱顆粒抑制物質の評価に用いること、これを抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングに用いること等については、開示も示唆もない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１８７２５８号公報
【特許文献２】特開２００６−１０４４３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、顆粒球における脱顆粒の促進剤、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法及びこれらの方法に用いるキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、カンジダ由来のＢＧが顆粒球の脱顆粒を促進することを見出し、さらにこれを脱顆粒抑制物質の評価や、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングに用いることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、カンジダ由来のＢＧを有効成分とする、顆粒球の脱顆粒の促進剤（以下、「本発明促進剤」という。）を提供する。このカンジダ由来のＢＧは、カンジダ・アルビカンス由来のＢＧであることが好ましい。またＢＧは、１，３−β−グルカンであることが好ましい。またＢＧは、ＣＳＢＧであることが好ましい。また「顆粒球」は、好塩基球であることが好ましい。
【０００７】
また本発明は、以下のステップを少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法（以下、「本発明評価方法」という。）を提供する。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【０００８】
また本発明は、以下の構成成分を少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キット（以下、「本発明評価キット」という。）を提供する。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
本発明評価キットは、さらに以下の構成成分を含むものが好ましい。
（２）顆粒球。
また本発明は、以下のステップを少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法（以下、「本発明スクリーニング方法」という。）を提供する。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
また本発明は、以下の構成を少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキット（以下、「本発明スクリーニングキット」という。）を提供する。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
本発明スクリーニングキットは、さらに以下の構成成分を含むものが好ましい。
（２）顆粒球。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、顆粒球における脱顆粒の促進に有用な本発明促進剤が提供され、さらにこれを応用した顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の極めて有効な評価方法（本発明評価方法）や、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質の極めて有効なスクリーニング方法（本発明スクリーニング方法）が提供されることから、極めて有用である。
また、本発明評価キットや本発明スクリーニングキットを用いれば、このような評価やスクリーニングをさらに簡便、迅速、高感度かつ安価に実施することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、発明を実施するための最良の形態によって本発明を詳説する。
【００１１】
＜１＞本発明促進剤
本発明促進剤は、カンジダ由来のＢＧを有効成分とする、顆粒球の脱顆粒の促進剤である。
ここで用いるカンジダ由来のＢＧは、カンジダ属に属する真菌に由来するＢＧである限りにおいて特に限定されず、このようなＢＧは自体公知の方法で製造することができる。カンジダ由来のＢＧのなかでも、カンジダ・アルビカンス由来のＢＧであることが好ましい。またＢＧは、１，３−β−グルカンであることが好ましい。またＢＧは、ＣＳＢＧであることが好ましい。このＣＳＢＧも、公知の方法で製造することができる。
【００１２】
本発明促進剤は、顆粒球の脱顆粒を促進するために用いられる。本出願書類における「顆粒球」の語は、好中球、好酸球、好塩基球のみならず、肥満細胞をも含む概念として用いる。本発明促進剤はこれらのいずれの顆粒球における脱顆粒を促進するために用いることができるが、なかでも好塩基球及び／又は肥満細胞の脱顆粒を促進するために用いるものであることが好ましい。
【００１３】
なお、本出願書類における「脱顆粒」とは、顆粒球の細胞内にある顆粒に蓄積されているヒスタミンなどの化学伝達物質が細胞外に放出されることを意味する。この脱顆粒の有無やレベルは、細胞外に放出されたβ−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性を測定することによって評価することができる。例えば、細胞外に放出されたβ−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）が増加すれば脱顆粒が起きた（又は促進された）と評価でき、逆に減少すれば脱顆粒が抑制されたと評価することができる。より具体的な
評価方法については、後述の実施例を参照されたい。
【００１４】
本発明促進剤は、このような顆粒球の脱顆粒を促進せしめる程度の量のカンジダ由来のＢＧを含有していればよい。本発明促進剤中に含有させるカンジダ由来のＢＧの量は、その具体的用途（医薬・試薬など）、適用対象、適用方法等に応じて当業者が適宜設定すべき事項であり、特に限定されないが、例えば本発明促進剤を溶液状態の剤として提供する場合には、カンジダ由来のＢＧとして５μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度を例示することができる。ただし、これはあくまで例示であって、本発明促進剤中のカンジダ由来のＢＧの量（濃度）は、これに限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明促進剤は、カンジダ由来のＢＧを有効成分として含有しており、かつ、かかるカンジダ由来のＢＧの作用・機能に悪影響を与えない限りにおいて、他の薬学的又は試薬的に許容される成分をさらに含有していてもよい。このような他の成分は、本発明促進剤の具体的用途、適用対象、適用方法等に応じて当業者が適宜設定することができる。本発明促進剤の剤形や、本発明促進剤が提供される際の形態などについても同様である。
【００１６】
本発明促進剤は、固体（乾燥）状態、溶液状態、凍結状態などのさまざまな形態で提供されうる。そして本発明促進剤は、このような提供される際の状態に応じて、公知の薬学的又は試薬的方法に従って当業者が容易に製造することができる。
【００１７】
本発明促進剤は、医薬や試薬、また後述するキットの構成成分等として利用することができる。
【００１８】
＜２＞本発明評価方法
本発明評価方法は、以下のステップを少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法である。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【００１９】
以下、ステップごとに説明する。
【００２０】
ステップ（１）は、被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップである。
【００２１】
ここにいう「被験物質」は、本発明評価方法における評価に付される物質である。またここにいう「カンジダ由来のＢＧ」については、前記の＜１＞と同様である。またここで用いることができる「抗原物質」及び「当該抗原物質に対する抗体」は、その「抗原物質」と「当該抗原物質に対する抗体」が反応することにより、顆粒球における脱顆粒が惹起されるようなものである限りにおいて特に限定されず、目的等に応じて当業者が適宜選択することができる。「抗原物質」及び「当該抗原物質に対する抗体」の一例として、それぞれＴＮＰ−ＢＳＡ抗原及び抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体を例示することができる。またここにいう「顆粒球」についても、前記の＜１＞と同様である。
【００２２】
ステップ（１）は、これらのものを共存させることにより行われる。本出願書類において「共存」とは、これらの物質分子や細胞の表面が相互に接触しうる状態にあることを意味する。これらのものを共存させる順序も、目的等に応じて当業者が適宜設定することができるが、顆粒球と抗原物質に対する抗体を予め共存させておき（感作）、その後、更にこれらに当該抗原物質とカンジダ由来のＢＧとを共存させる方法を採用することが好ましい。この場合において被験物質を共存させるタイミングは、その評価の目的等に応じて適宜設定することができる。例えば、顆粒球の脱顆粒を事前に抑制（予防）できるか否かを評価する場合には、顆粒球と抗原物質に対する抗体を予め共存させておく段階において被験物質を更に共存させておけばよい。また、顆粒球の脱顆粒を事後的に抑制できるか否かを評価する場合には、当該抗原物質とカンジダ由来のＢＧとを更に共存させた段階以後に被験物質を共存させればよい。
【００２３】
これらの物質を共存させる条件も、目的等に応じて当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではない。その一例は、実施例を参照されたい。
【００２４】
ステップ（２）は、ステップ（１）によって得られる脱顆粒のレベルと、ステップ（１）において被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップである。すなわち、ステップ（１）において被験物質が共存させた場合と、ステップ（１）において被験物質を共存させなかった場合における双方の脱顆粒のレベルを求め、これらを比較するステップである。
脱顆粒のレベルは、前記＜１＞で述べた通り、β−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性を測定し、これを指標とすることができる。より具体的な方法については、後述の実施例を参照されたい。
【００２５】
そして、ステップ（１）によって求められた脱顆粒のレベルが、ステップ（１）において被験物質が共存していない状態において求めた脱顆粒のレベルよりも低い場合には、当該被験物質が「顆粒球の脱顆粒を抑制する物質」であると評価することができる。
【００２６】
＜３＞本発明評価キット
本発明評価キットは、以下の構成成分を少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キットである。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
【００２７】
ここで用いることができる「カンジダ由来のＢＧ」については、前記の＜１＞と同様である。本発明評価キットは、このカンジダ由来のＢＧを少なくとも構成成分として含んでいる限りにおいて、さらに他の構成成分を含んでいてもよい。例えば、さらに「顆粒球」を構成成分として含んでいてもよい。ここで用いることができる「顆粒球」についても、前記の＜１＞を同様である。
また、抗原物質や、当該抗原物質に対する抗体を、更に構成成分として含んでいてもよい。ここで用いることができる「抗原物質」や「当該抗原物質に対する抗体」については、前記＜２＞と同様である。また、β−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性測定用の試薬や、陽性対照物質などを更に構成成分として含んでいてもよい。
【００２８】
本発明評価キットは、本発明評価方法に従って使用することができる。
【００２９】
＜４＞本発明スクリーニング方法
本発明スクリーニング方法は、以下のステップを少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法である。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【００３０】
本発明スクリーニング方法は、前記の本発明評価方法を、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法に応用したものである。したがってその具体的な説明は、前記＜２＞の本発明評価方法における「顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価」の語を「抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング」に置き換えたものと同じである。
【００３１】
したがって、例えばステップ（１）において、アレルギーの「予防」に着目した抗アレルギー剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする場合には、顆粒球と抗原物質に対する抗体を予め共存させておく段階において被験物質を更に共存させておけばよく、アレルギーの治療（事後的処置）に着目した抗アレルギー剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする場合には、抗原物質とカンジダ由来のＢＧとを更に共存させた段階以後に被験物質を共存させればよい。
【００３２】
同様に、ステップ（２）においては、ステップ（１）によって求められた脱顆粒のレベルが、ステップ（１）において被験物質が共存していない状態において求めた脱顆粒のレベルよりも低い場合に、当該被験物質を「抗アレルギー剤の有効成分の候補物質」として選択できることとなる。
【００３３】
＜５＞本発明スクリーニングキット
また本発明スクリーニングキットは、以下の構成を少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキットである。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
【００３４】
本発明スクリーニングキットは、前記の本発明評価キットを、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキットに応用したものである。したがってその具体的な説明は、前記＜３＞の本発明評価キットにおける「顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価」の語を「抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング」に置き換えたものと同じである。したがって、本発明スクリーニングキットは、さらに「顆粒球」などを構成成分として含んでいてもよい。これらの例示も、前記＜３＞と同様であることはいうまでもない。
【００３５】
本発明スクリーニングキットは、本発明スクリーニング方法に従って使用することができる。
【００３６】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。まず、本実施例において用いた手法について説明する。
【００３７】
（１）ＢＧの調製
（１−１）ＣＳＢＧ
カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＦＯ１３８５）を５ＬのＣ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（炭素源としてｓｕｃｒｏｓｅを含む）にて２７℃で４８〜７２時間液体培養し（ジャーファメンター使用；攪拌速度：４００ｒｐｍ）、アセトン処理、脱脂した後、乾燥菌体を得た。
脱脂した乾燥菌体に、１％次亜塩素酸溶液を添加し、４℃で一晩撹拌して酸化した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を回収し、ＢＧを含有しない蒸留水を添加して撹拌後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）し、その沈殿物にアセトン２００ｍＬを加え脱水沈殿物を得た。該沈殿物にＤＭＳＯ ３０ｍＬを加え、１時間超音波をかけて溶解させた。３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を得、該上清に２倍量のエタノールを撹拌しながら加えＢＧを析出させた後、該析出物を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、沈殿物を得た。該沈殿物にアセトンを１００ｍＬ加え撹拌し、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して脱水した沈殿物を得、減圧乾燥してＢＧの粉末を得、これを０．２Ｍ ＮａＯＨに４０ｍｇ／ｍＬで溶解した。これを０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和し、２０ｍｇ／ｍＬのＣＳＢＧ溶液とした。
このＣＳＢＧ溶液をＲＰＭＩ１６４０で希釈して得た各濃度のＣＳＢＧ含有培養液を、以下の実験系で使用した。
（１−２）ＳＰＧ
ＳＰＧは、科研製薬株式会社製のものを用いた。
【００３８】
（２）脱顆粒アッセイ系
ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３（TKG0321；東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センターより購入）（２．５×１０５／ウェル）を一晩インキュベートし（培地：５６℃で３０分間加温処理したＦＢＳを終濃度10％（v/v）含有するRPMI-1640培地）、細胞培養用の２４ウェル・プレートに付着させた。終濃度２μｇ／ｍｌの抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で、３７℃の条件下で２時間感作させ、その後、終濃度５μｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加して３７℃の条件下で３０分間保持することで脱顆粒を誘導した。
抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体又はＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共にＣＳＢＧを添加し、培養上清に放出されたβ−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性を測定することによって脱顆粒を評価した。
β-hexosamindase活性の測定は、基質酵素反応により生じる４−ニトロフェノール（4-nitrophenol）を測定することにより行った。すなわち、９６ウェル・プレートを用いて、培養上清 ５０μlに３．３ｍＭ ４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide）（基質）を含有する０．１Ｍ クエン酸緩衝液（pH 4.5）を１００μｌ添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、２Ｍ グリシン−ＮａＯＨ（pH 10.7）を １００μｌ添加することによって酵素反応を停止させ、４−ニトロフェノール（4-nitrophenol）を生成させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【実施例１】
【００３９】
カンジダ由来のＢＧによる脱顆粒促進活性
上記の脱顆粒アッセイ系において、ＣＳＢＧを添加するタイミングを変えて脱顆粒実験を行った。ＣＳＢＧは、種々の終濃度となるように添加した。
結果を図１に示す。図１中、各ＣＳＢＧ濃度における左側のカラムは、上記の脱顆粒アッセイ系におけるＴＮＰ−ＢＳＡ抗原添加と同時にＣＳＢＧを添加したものを、右側のカラムは、上記の脱顆粒アッセイ系における抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体添加と同時にＣＳＢＧを添加したものをそれぞれ示す。縦軸は、コントロール（ＣＳＢＧを添加しないもの）において培養上清中に放出されたβ-hexosaminidaseの活性を１００％としたときの割合を百分率で示したものである。また横軸は、添加したＣＳＢＧの終濃度を示したものである。
また、図１中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
【００４０】
図１より、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原添加と同時にＣＳＢＧを添加した場合、ＣＳＢＧの濃度依存的に、脱顆粒量が有意に上昇した。このことから、カンジダ由来のＢＧは、脱顆粒の促進活性を有することが示された。
【実施例２】
【００４１】
抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の濃度との関係
上記の脱顆粒アッセイ系において、感作させる抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の濃度を変えて脱顆粒実験を行った。結果を図２に示す。図２中、白丸はコントロール（ＣＳＢＧを添加しないもの）を、黒丸はＴＮＰ−ＢＳＡ抗原添加と同時にＣＳＢＧを終濃度４００μｇ／ｍｌとなるように添加したものをそれぞれ示す。
縦軸は、細胞溶解液中に含まれるβ-hexosaminidaseを１００％としたときに、各実験条件において培養上清中に放出されたβ-hexosaminidaseの活性の割合を百分率で示したものである。また横軸は、感作に用いた抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の終濃度を示したものである。
また、図２中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
図２より、コントロールでは１μｇ／ｍｌ以上の抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作させると脱顆粒が定常状態に達し、細胞内に含まれるβ-hexosaminidaseの約１０％が培養上清中に放出された。ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共に４００μｇ／ｍｌのＣＳＢＧを添加すると、高濃度のＩｇＥ感作時において脱顆粒量が有意に上昇した。
【実施例３】
【００４２】
カンジダ以外に由来するＢＧの効果
上記の脱顆粒アッセイ系において、ＣＳＢＧとは由来及び構造が異なるＢＧである「ＳＰＧ」をＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共に添加し、脱顆粒実験を行った。結果を図３に示す。
図３中の縦軸は、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原及び抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体のみを添加したコントロール条件時に培養上清中に放出されるβ-hexosaminidaseの活性を１００％としたときに、各実験条件において培養上清中に放出されたβ-hexosaminidaseの活性の割合を百分率で示したものである。また横軸は、添加したＣＳＢＧ又はＳＰＧの終濃度を示したものである。
また図３中、各濃度における左側のカラムはＣＳＢＧを添加したものを、右側のカラムはＳＰＧを添加したものをそれぞれ示す。
また、図３中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
図３より、ＣＳＢＧ添加群ではＣＳＢＧの濃度依存的に脱顆粒量が有意に上昇するが、ＳＰＧ添加群では脱顆粒量の上昇は見られなかった。
【実施例４】
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現の解析
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（２．５×１０５／ウェル）を２４時間インキュベートし、細胞培養用の２４ウェル・プレートに付着させた。終濃度２μｇ／ｍｌの抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で２時間感作させ、その後、終濃度５μｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加して４時間保持した。その後、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を使用して抽出したＲＮＡ（１μｇ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒスチジンデカルボキシラーゼ（histidine decarboxylase（HDC））、ＩＬ−４及びβ−アクチンのｍＲＮＡの検出を行った。Lumino-image analyzer（富士フィルム社製）を用いてｍＲＮＡの発現強度を数値化して検討した。
ＣＳＢＧは、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４時間インキュベートする時又はＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加する時と同時に、４００μｇ／ｍｌ添加した。
ＰＣＲの条件・サイクル数は、次の通りである；（９４℃で３０秒間（変性）、５６℃で３０秒間（アニーリング）、６８℃で４０秒間（伸長））、２５又は３５回（サイクル）。
【００４４】
また、それぞれの検出対象についてのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列、ＰＣＲ産物の塩基数を以下に示す。
【００４５】
IL-4：
センスプライマー： 配列番号１に示す。
アンチセンスプライマー： 配列番号２に示す。
ＰＣＲ産物の塩基数：378bp
ＨＤＣ：
センスプライマー： 配列番号３に示す。
アンチセンスプライマー： 配列番号４に示す。
ＰＣＲ産物の塩基数：441bp
β−アクチン:
センスプライマー： 配列番号５に示す。
アンチセンスプライマー： 配列番号６に示す。
ＰＣＲ産物の塩基数：574bp
＜１＞ＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現
ＩＬ−４及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を図４に示す。
図４中の（１）は抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体及びＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加しない群（コントロール）、（２）は抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体及びＴＮＰ−ＢＳＡ抗原のみを添加した群、（３）は抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作させ、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共にＣＳＢＧを添加した群を、（４）は細胞を２４時間インキュベートする際にＣＳＢＧを共存させ、その後、抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体及びＴＮＰ−ＢＳＡ抗原
を添加しなかった群、（５）は細胞を２４時間インキュベートする際にＣＳＢＧを共存させ、その後、抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作させ、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原
と共にＣＳＢＧを添加した群をそれぞれ示す。ＰＣＲの増幅サイクル数は、ＩＬ−４が３５回（図４中の「ＩＬ−４」における各群の左側）又は４５回（図４中の「ＩＬ−４」における各群の右側）、β−アクチンが２５回（図４中の「β−actin」における各群の左側）又は３５回（図４中の「β−actin」における各群の右側）で行った。その結果、図４の（５）では、低サイクル数のＰＣＲでもバンドが確認できるほど、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルが上昇した。
【００４６】
また、Lumino-image analyzerを用いて、ＩＬ−４とβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した。結果を図５に示す。図５中の（１）〜（５）の意味は、前記と同様である。図５の縦軸は、β−アクチンのｍＲＮＡ発現レベルに対するＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現レベルの割合を、（１）（コントロール）を１００％としたときの百分率で示した。また、図５中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
その結果、（５）においては、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルが有意に上昇した。また（４）においても、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルが上昇した。
＜２＞ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ＨＤＣ） ｍＲＮＡの発現
ＨＤＣ及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を図６に示す。
図６中の（１）〜（５）の意味は図４と同様である。ただし、ＰＣＲの増幅サイクル数は、ＨＤＣ及びβ−アクチンともに２５回（図６中における各群の左側）又は３５回（図６中における各群の右側）で行った。その結果、図６の（４）及び（５）では、（１）（コントロール）に比してＨＤＣのｍＲＮＡの発現が強く現れた。
【００４７】
また、Lumino-image analyzerを用いて、ＨＤＣとβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した。結果を図７に示す。図７中の（１）〜（５）の意味は、前記と同様である。図７の縦軸は、β−アクチンのｍＲＮＡ発現レベルに対するＨＤＣ ｍＲＮＡの発現レベルの割合を、（１）（コントロール）を１００％としたときの百分率で示した。また、図７中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
その結果、（３）、（４）及び（５）において、ＨＤＣのｍＲＮＡレベルが有意に上昇した。
【実施例５】
【００４８】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞おけるＢＧレセプターの検討
ＲＴ−ＰＣＲとフローサイトメトリーを用いて、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＢＧレセプターの発現を解析した。ＲＴ−ＰＣＲの解析結果を図８に、フローサイトメトリーの解析結果を図９にそれぞれ示す。
図８中の「１」のレーンはマーカー、「２」のレーンはＣＤ１１ｂ ｍＲＮＡの発現、「３」のレーンはβ−アクチン ｍＲＮＡの発現をそれぞれ示す。
また、図９中の各グラフは、細胞表面における各分子の発現（上から順に、ＣＤ１１ｂ、ラクトシルセラミド、デクチン−１）を示すものである。各グラフの縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。また各グラフにおける黒色で塗られた実線部分はコントロールを、黒色で塗られていない実線部分は、それぞれ抗ＣＤ１１ｂ抗体（CALTAG社製）、抗ラクトシルセラミド抗体（Ancell社製）又は抗デクチン−１抗体（abcam社製）で細胞表面を染色した場合の結果を示す。
図８及び９から、デクチン−１とラクトシルセラミドの発現は観察されなかったが、ＣＤ１１ｂが、ｍＲＮＡレベル及び細胞表面において発現していることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＣＳＢＧを添加するタイミングを変えた脱顆粒実験の結果を示す図である。
【図２】感作に用いる抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の濃度を変えた脱顆粒実験の結果を示す図である。
【図３】ＳＰＧを用いた脱顆粒実験の結果を示す図である。
【図４】ＩＬ−４及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図５】ＩＬ−４とβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した結果を示す図である。
【図６】ＨＤＣ及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図７】ＨＤＣとβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した結果を示す図である。
【図８】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＢＧレセプターの発現のＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す図である。
【図９】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＢＧレセプターの発現のフローサイトメトリーによる解析結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顆粒球における脱顆粒の促進剤、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法及びこれらの方法に用いるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類において使用する略号及びその意義は以下の通りである。
ＢＧ：β−グルカン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＳＢＧ：カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）由来の1,6−β−long glucosyl branched 1,3−β−グルカン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＦＢＳ：ウシ胎児血清（fetal bovine serum）
ＳＰＧ：Schizophyllum commune由来の1,6−β−mono glucosyl branched 1,3−β−グルカン
ＴＮＰ：トリニトロフェニル
特許文献１には、パン酵母由来のＢＧを含有することを特徴とする免疫力改善食品が記載されており、その「免疫力改善」として抗アレルギーが記載されている。また特許文献２には、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液またはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを有効成分とするアレルギー抑制剤が記載されている。
しかし、カンジダ由来のＢＧが顆粒球の脱顆粒を促進すること、これを脱顆粒抑制物質の評価に用いること、これを抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングに用いること等については、開示も示唆もない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１８７２５８号公報
【特許文献２】特開２００６−１０４４３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、顆粒球における脱顆粒の促進剤、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法及びこれらの方法に用いるキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、カンジダ由来のＢＧが顆粒球の脱顆粒を促進することを見出し、さらにこれを脱顆粒抑制物質の評価や、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングに用いることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、カンジダ由来のＢＧを有効成分とする、顆粒球の脱顆粒の促進剤（以下、「本発明促進剤」という。）を提供する。このカンジダ由来のＢＧは、カンジダ・アルビカンス由来のＢＧであることが好ましい。またＢＧは、１，３−β−グルカンであることが好ましい。またＢＧは、ＣＳＢＧであることが好ましい。また「顆粒球」は、好塩基球であることが好ましい。
【０００７】
また本発明は、以下のステップを少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法（以下、「本発明評価方法」という。）を提供する。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【０００８】
また本発明は、以下の構成成分を少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キット（以下、「本発明評価キット」という。）を提供する。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
本発明評価キットは、さらに以下の構成成分を含むものが好ましい。
（２）顆粒球。
また本発明は、以下のステップを少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法（以下、「本発明スクリーニング方法」という。）を提供する。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
また本発明は、以下の構成を少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキット（以下、「本発明スクリーニングキット」という。）を提供する。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
本発明スクリーニングキットは、さらに以下の構成成分を含むものが好ましい。
（２）顆粒球。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、顆粒球における脱顆粒の促進に有用な本発明促進剤が提供され、さらにこれを応用した顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の極めて有効な評価方法（本発明評価方法）や、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質の極めて有効なスクリーニング方法（本発明スクリーニング方法）が提供されることから、極めて有用である。
また、本発明評価キットや本発明スクリーニングキットを用いれば、このような評価やスクリーニングをさらに簡便、迅速、高感度かつ安価に実施することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、発明を実施するための最良の形態によって本発明を詳説する。
【００１１】
＜１＞本発明促進剤
本発明促進剤は、カンジダ由来のＢＧを有効成分とする、顆粒球の脱顆粒の促進剤である。
ここで用いるカンジダ由来のＢＧは、カンジダ属に属する真菌に由来するＢＧである限りにおいて特に限定されず、このようなＢＧは自体公知の方法で製造することができる。カンジダ由来のＢＧのなかでも、カンジダ・アルビカンス由来のＢＧであることが好ましい。またＢＧは、１，３−β−グルカンであることが好ましい。またＢＧは、ＣＳＢＧであることが好ましい。このＣＳＢＧも、公知の方法で製造することができる。
【００１２】
本発明促進剤は、顆粒球の脱顆粒を促進するために用いられる。本出願書類における「顆粒球」の語は、好中球、好酸球、好塩基球のみならず、肥満細胞をも含む概念として用いる。本発明促進剤はこれらのいずれの顆粒球における脱顆粒を促進するために用いることができるが、なかでも好塩基球及び／又は肥満細胞の脱顆粒を促進するために用いるものであることが好ましい。
【００１３】
なお、本出願書類における「脱顆粒」とは、顆粒球の細胞内にある顆粒に蓄積されているヒスタミンなどの化学伝達物質が細胞外に放出されることを意味する。この脱顆粒の有無やレベルは、細胞外に放出されたβ−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性を測定することによって評価することができる。例えば、細胞外に放出されたβ−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）が増加すれば脱顆粒が起きた（又は促進された）と評価でき、逆に減少すれば脱顆粒が抑制されたと評価することができる。より具体的な
評価方法については、後述の実施例を参照されたい。
【００１４】
本発明促進剤は、このような顆粒球の脱顆粒を促進せしめる程度の量のカンジダ由来のＢＧを含有していればよい。本発明促進剤中に含有させるカンジダ由来のＢＧの量は、その具体的用途（医薬・試薬など）、適用対象、適用方法等に応じて当業者が適宜設定すべき事項であり、特に限定されないが、例えば本発明促進剤を溶液状態の剤として提供する場合には、カンジダ由来のＢＧとして５μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ程度を例示することができる。ただし、これはあくまで例示であって、本発明促進剤中のカンジダ由来のＢＧの量（濃度）は、これに限定されるものではない。
【００１５】
また、本発明促進剤は、カンジダ由来のＢＧを有効成分として含有しており、かつ、かかるカンジダ由来のＢＧの作用・機能に悪影響を与えない限りにおいて、他の薬学的又は試薬的に許容される成分をさらに含有していてもよい。このような他の成分は、本発明促進剤の具体的用途、適用対象、適用方法等に応じて当業者が適宜設定することができる。本発明促進剤の剤形や、本発明促進剤が提供される際の形態などについても同様である。
【００１６】
本発明促進剤は、固体（乾燥）状態、溶液状態、凍結状態などのさまざまな形態で提供されうる。そして本発明促進剤は、このような提供される際の状態に応じて、公知の薬学的又は試薬的方法に従って当業者が容易に製造することができる。
【００１７】
本発明促進剤は、医薬や試薬、また後述するキットの構成成分等として利用することができる。
【００１８】
＜２＞本発明評価方法
本発明評価方法は、以下のステップを少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法である。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【００１９】
以下、ステップごとに説明する。
【００２０】
ステップ（１）は、被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップである。
【００２１】
ここにいう「被験物質」は、本発明評価方法における評価に付される物質である。またここにいう「カンジダ由来のＢＧ」については、前記の＜１＞と同様である。またここで用いることができる「抗原物質」及び「当該抗原物質に対する抗体」は、その「抗原物質」と「当該抗原物質に対する抗体」が反応することにより、顆粒球における脱顆粒が惹起されるようなものである限りにおいて特に限定されず、目的等に応じて当業者が適宜選択することができる。「抗原物質」及び「当該抗原物質に対する抗体」の一例として、それぞれＴＮＰ−ＢＳＡ抗原及び抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体を例示することができる。またここにいう「顆粒球」についても、前記の＜１＞と同様である。
【００２２】
ステップ（１）は、これらのものを共存させることにより行われる。本出願書類において「共存」とは、これらの物質分子や細胞の表面が相互に接触しうる状態にあることを意味する。これらのものを共存させる順序も、目的等に応じて当業者が適宜設定することができるが、顆粒球と抗原物質に対する抗体を予め共存させておき（感作）、その後、更にこれらに当該抗原物質とカンジダ由来のＢＧとを共存させる方法を採用することが好ましい。この場合において被験物質を共存させるタイミングは、その評価の目的等に応じて適宜設定することができる。例えば、顆粒球の脱顆粒を事前に抑制（予防）できるか否かを評価する場合には、顆粒球と抗原物質に対する抗体を予め共存させておく段階において被験物質を更に共存させておけばよい。また、顆粒球の脱顆粒を事後的に抑制できるか否かを評価する場合には、当該抗原物質とカンジダ由来のＢＧとを更に共存させた段階以後に被験物質を共存させればよい。
【００２３】
これらの物質を共存させる条件も、目的等に応じて当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではない。その一例は、実施例を参照されたい。
【００２４】
ステップ（２）は、ステップ（１）によって得られる脱顆粒のレベルと、ステップ（１）において被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップである。すなわち、ステップ（１）において被験物質が共存させた場合と、ステップ（１）において被験物質を共存させなかった場合における双方の脱顆粒のレベルを求め、これらを比較するステップである。
脱顆粒のレベルは、前記＜１＞で述べた通り、β−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性を測定し、これを指標とすることができる。より具体的な方法については、後述の実施例を参照されたい。
【００２５】
そして、ステップ（１）によって求められた脱顆粒のレベルが、ステップ（１）において被験物質が共存していない状態において求めた脱顆粒のレベルよりも低い場合には、当該被験物質が「顆粒球の脱顆粒を抑制する物質」であると評価することができる。
【００２６】
＜３＞本発明評価キット
本発明評価キットは、以下の構成成分を少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キットである。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
【００２７】
ここで用いることができる「カンジダ由来のＢＧ」については、前記の＜１＞と同様である。本発明評価キットは、このカンジダ由来のＢＧを少なくとも構成成分として含んでいる限りにおいて、さらに他の構成成分を含んでいてもよい。例えば、さらに「顆粒球」を構成成分として含んでいてもよい。ここで用いることができる「顆粒球」についても、前記の＜１＞を同様である。
また、抗原物質や、当該抗原物質に対する抗体を、更に構成成分として含んでいてもよい。ここで用いることができる「抗原物質」や「当該抗原物質に対する抗体」については、前記＜２＞と同様である。また、β−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性測定用の試薬や、陽性対照物質などを更に構成成分として含んでいてもよい。
【００２８】
本発明評価キットは、本発明評価方法に従って使用することができる。
【００２９】
＜４＞本発明スクリーニング方法
本発明スクリーニング方法は、以下のステップを少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法である。
（１）被験物質、カンジダ由来のＢＧ、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【００３０】
本発明スクリーニング方法は、前記の本発明評価方法を、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法に応用したものである。したがってその具体的な説明は、前記＜２＞の本発明評価方法における「顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価」の語を「抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング」に置き換えたものと同じである。
【００３１】
したがって、例えばステップ（１）において、アレルギーの「予防」に着目した抗アレルギー剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする場合には、顆粒球と抗原物質に対する抗体を予め共存させておく段階において被験物質を更に共存させておけばよく、アレルギーの治療（事後的処置）に着目した抗アレルギー剤の有効成分の候補物質をスクリーニングする場合には、抗原物質とカンジダ由来のＢＧとを更に共存させた段階以後に被験物質を共存させればよい。
【００３２】
同様に、ステップ（２）においては、ステップ（１）によって求められた脱顆粒のレベルが、ステップ（１）において被験物質が共存していない状態において求めた脱顆粒のレベルよりも低い場合に、当該被験物質を「抗アレルギー剤の有効成分の候補物質」として選択できることとなる。
【００３３】
＜５＞本発明スクリーニングキット
また本発明スクリーニングキットは、以下の構成を少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキットである。
（１）カンジダ由来のＢＧ。
【００３４】
本発明スクリーニングキットは、前記の本発明評価キットを、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキットに応用したものである。したがってその具体的な説明は、前記＜３＞の本発明評価キットにおける「顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価」の語を「抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング」に置き換えたものと同じである。したがって、本発明スクリーニングキットは、さらに「顆粒球」などを構成成分として含んでいてもよい。これらの例示も、前記＜３＞と同様であることはいうまでもない。
【００３５】
本発明スクリーニングキットは、本発明スクリーニング方法に従って使用することができる。
【００３６】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。まず、本実施例において用いた手法について説明する。
【００３７】
（１）ＢＧの調製
（１−１）ＣＳＢＧ
カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＦＯ１３８５）を５ＬのＣ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（炭素源としてｓｕｃｒｏｓｅを含む）にて２７℃で４８〜７２時間液体培養し（ジャーファメンター使用；攪拌速度：４００ｒｐｍ）、アセトン処理、脱脂した後、乾燥菌体を得た。
脱脂した乾燥菌体に、１％次亜塩素酸溶液を添加し、４℃で一晩撹拌して酸化した。その後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を回収し、ＢＧを含有しない蒸留水を添加して撹拌後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）し、その沈殿物にアセトン２００ｍＬを加え脱水沈殿物を得た。該沈殿物にＤＭＳＯ ３０ｍＬを加え、１時間超音波をかけて溶解させた。３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を得、該上清に２倍量のエタノールを撹拌しながら加えＢＧを析出させた後、該析出物を３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、沈殿物を得た。該沈殿物にアセトンを１００ｍＬ加え撹拌し、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して脱水した沈殿物を得、減圧乾燥してＢＧの粉末を得、これを０．２Ｍ ＮａＯＨに４０ｍｇ／ｍＬで溶解した。これを０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和し、２０ｍｇ／ｍＬのＣＳＢＧ溶液とした。
このＣＳＢＧ溶液をＲＰＭＩ１６４０で希釈して得た各濃度のＣＳＢＧ含有培養液を、以下の実験系で使用した。
（１−２）ＳＰＧ
ＳＰＧは、科研製薬株式会社製のものを用いた。
【００３８】
（２）脱顆粒アッセイ系
ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３（TKG0321；東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センターより購入）（２．５×１０５／ウェル）を一晩インキュベートし（培地：５６℃で３０分間加温処理したＦＢＳを終濃度10％（v/v）含有するRPMI-1640培地）、細胞培養用の２４ウェル・プレートに付着させた。終濃度２μｇ／ｍｌの抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で、３７℃の条件下で２時間感作させ、その後、終濃度５μｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加して３７℃の条件下で３０分間保持することで脱顆粒を誘導した。
抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体又はＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共にＣＳＢＧを添加し、培養上清に放出されたβ−ヘキソサミニダーゼ（β-hexosaminidase）の活性を測定することによって脱顆粒を評価した。
β-hexosamindase活性の測定は、基質酵素反応により生じる４−ニトロフェノール（4-nitrophenol）を測定することにより行った。すなわち、９６ウェル・プレートを用いて、培養上清 ５０μlに３．３ｍＭ ４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide）（基質）を含有する０．１Ｍ クエン酸緩衝液（pH 4.5）を１００μｌ添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、２Ｍ グリシン−ＮａＯＨ（pH 10.7）を １００μｌ添加することによって酵素反応を停止させ、４−ニトロフェノール（4-nitrophenol）を生成させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【実施例１】
【００３９】
カンジダ由来のＢＧによる脱顆粒促進活性
上記の脱顆粒アッセイ系において、ＣＳＢＧを添加するタイミングを変えて脱顆粒実験を行った。ＣＳＢＧは、種々の終濃度となるように添加した。
結果を図１に示す。図１中、各ＣＳＢＧ濃度における左側のカラムは、上記の脱顆粒アッセイ系におけるＴＮＰ−ＢＳＡ抗原添加と同時にＣＳＢＧを添加したものを、右側のカラムは、上記の脱顆粒アッセイ系における抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体添加と同時にＣＳＢＧを添加したものをそれぞれ示す。縦軸は、コントロール（ＣＳＢＧを添加しないもの）において培養上清中に放出されたβ-hexosaminidaseの活性を１００％としたときの割合を百分率で示したものである。また横軸は、添加したＣＳＢＧの終濃度を示したものである。
また、図１中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
【００４０】
図１より、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原添加と同時にＣＳＢＧを添加した場合、ＣＳＢＧの濃度依存的に、脱顆粒量が有意に上昇した。このことから、カンジダ由来のＢＧは、脱顆粒の促進活性を有することが示された。
【実施例２】
【００４１】
抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の濃度との関係
上記の脱顆粒アッセイ系において、感作させる抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の濃度を変えて脱顆粒実験を行った。結果を図２に示す。図２中、白丸はコントロール（ＣＳＢＧを添加しないもの）を、黒丸はＴＮＰ−ＢＳＡ抗原添加と同時にＣＳＢＧを終濃度４００μｇ／ｍｌとなるように添加したものをそれぞれ示す。
縦軸は、細胞溶解液中に含まれるβ-hexosaminidaseを１００％としたときに、各実験条件において培養上清中に放出されたβ-hexosaminidaseの活性の割合を百分率で示したものである。また横軸は、感作に用いた抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の終濃度を示したものである。
また、図２中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
図２より、コントロールでは１μｇ／ｍｌ以上の抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作させると脱顆粒が定常状態に達し、細胞内に含まれるβ-hexosaminidaseの約１０％が培養上清中に放出された。ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共に４００μｇ／ｍｌのＣＳＢＧを添加すると、高濃度のＩｇＥ感作時において脱顆粒量が有意に上昇した。
【実施例３】
【００４２】
カンジダ以外に由来するＢＧの効果
上記の脱顆粒アッセイ系において、ＣＳＢＧとは由来及び構造が異なるＢＧである「ＳＰＧ」をＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共に添加し、脱顆粒実験を行った。結果を図３に示す。
図３中の縦軸は、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原及び抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体のみを添加したコントロール条件時に培養上清中に放出されるβ-hexosaminidaseの活性を１００％としたときに、各実験条件において培養上清中に放出されたβ-hexosaminidaseの活性の割合を百分率で示したものである。また横軸は、添加したＣＳＢＧ又はＳＰＧの終濃度を示したものである。
また図３中、各濃度における左側のカラムはＣＳＢＧを添加したものを、右側のカラムはＳＰＧを添加したものをそれぞれ示す。
また、図３中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
図３より、ＣＳＢＧ添加群ではＣＳＢＧの濃度依存的に脱顆粒量が有意に上昇するが、ＳＰＧ添加群では脱顆粒量の上昇は見られなかった。
【実施例４】
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現の解析
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（２．５×１０５／ウェル）を２４時間インキュベートし、細胞培養用の２４ウェル・プレートに付着させた。終濃度２μｇ／ｍｌの抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で２時間感作させ、その後、終濃度５μｇ／ｍｌのＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加して４時間保持した。その後、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を使用して抽出したＲＮＡ（１μｇ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒスチジンデカルボキシラーゼ（histidine decarboxylase（HDC））、ＩＬ−４及びβ−アクチンのｍＲＮＡの検出を行った。Lumino-image analyzer（富士フィルム社製）を用いてｍＲＮＡの発現強度を数値化して検討した。
ＣＳＢＧは、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４時間インキュベートする時又はＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加する時と同時に、４００μｇ／ｍｌ添加した。
ＰＣＲの条件・サイクル数は、次の通りである；（９４℃で３０秒間（変性）、５６℃で３０秒間（アニーリング）、６８℃で４０秒間（伸長））、２５又は３５回（サイクル）。
【００４４】
また、それぞれの検出対象についてのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列、ＰＣＲ産物の塩基数を以下に示す。
【００４５】
IL-4：
センスプライマー： 配列番号１に示す。
アンチセンスプライマー： 配列番号２に示す。
ＰＣＲ産物の塩基数：378bp
ＨＤＣ：
センスプライマー： 配列番号３に示す。
アンチセンスプライマー： 配列番号４に示す。
ＰＣＲ産物の塩基数：441bp
β−アクチン:
センスプライマー： 配列番号５に示す。
アンチセンスプライマー： 配列番号６に示す。
ＰＣＲ産物の塩基数：574bp
＜１＞ＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現
ＩＬ−４及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を図４に示す。
図４中の（１）は抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体及びＴＮＰ−ＢＳＡ抗原を添加しない群（コントロール）、（２）は抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体及びＴＮＰ−ＢＳＡ抗原のみを添加した群、（３）は抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作させ、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原と共にＣＳＢＧを添加した群を、（４）は細胞を２４時間インキュベートする際にＣＳＢＧを共存させ、その後、抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体及びＴＮＰ−ＢＳＡ抗原
を添加しなかった群、（５）は細胞を２４時間インキュベートする際にＣＳＢＧを共存させ、その後、抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作させ、ＴＮＰ−ＢＳＡ抗原
と共にＣＳＢＧを添加した群をそれぞれ示す。ＰＣＲの増幅サイクル数は、ＩＬ−４が３５回（図４中の「ＩＬ−４」における各群の左側）又は４５回（図４中の「ＩＬ−４」における各群の右側）、β−アクチンが２５回（図４中の「β−actin」における各群の左側）又は３５回（図４中の「β−actin」における各群の右側）で行った。その結果、図４の（５）では、低サイクル数のＰＣＲでもバンドが確認できるほど、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルが上昇した。
【００４６】
また、Lumino-image analyzerを用いて、ＩＬ−４とβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した。結果を図５に示す。図５中の（１）〜（５）の意味は、前記と同様である。図５の縦軸は、β−アクチンのｍＲＮＡ発現レベルに対するＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現レベルの割合を、（１）（コントロール）を１００％としたときの百分率で示した。また、図５中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
その結果、（５）においては、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルが有意に上昇した。また（４）においても、ＩＬ−４のｍＲＮＡレベルが上昇した。
＜２＞ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ＨＤＣ） ｍＲＮＡの発現
ＨＤＣ及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を図６に示す。
図６中の（１）〜（５）の意味は図４と同様である。ただし、ＰＣＲの増幅サイクル数は、ＨＤＣ及びβ−アクチンともに２５回（図６中における各群の左側）又は３５回（図６中における各群の右側）で行った。その結果、図６の（４）及び（５）では、（１）（コントロール）に比してＨＤＣのｍＲＮＡの発現が強く現れた。
【００４７】
また、Lumino-image analyzerを用いて、ＨＤＣとβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した。結果を図７に示す。図７中の（１）〜（５）の意味は、前記と同様である。図７の縦軸は、β−アクチンのｍＲＮＡ発現レベルに対するＨＤＣ ｍＲＮＡの発現レベルの割合を、（１）（コントロール）を１００％としたときの百分率で示した。また、図７中の「＊」は、コントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを、「＊＊」は、コントロールに対してｐ＜０．００１で有意差があることをそれぞれ示す。
その結果、（３）、（４）及び（５）において、ＨＤＣのｍＲＮＡレベルが有意に上昇した。
【実施例５】
【００４８】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞おけるＢＧレセプターの検討
ＲＴ−ＰＣＲとフローサイトメトリーを用いて、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＢＧレセプターの発現を解析した。ＲＴ−ＰＣＲの解析結果を図８に、フローサイトメトリーの解析結果を図９にそれぞれ示す。
図８中の「１」のレーンはマーカー、「２」のレーンはＣＤ１１ｂ ｍＲＮＡの発現、「３」のレーンはβ−アクチン ｍＲＮＡの発現をそれぞれ示す。
また、図９中の各グラフは、細胞表面における各分子の発現（上から順に、ＣＤ１１ｂ、ラクトシルセラミド、デクチン−１）を示すものである。各グラフの縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。また各グラフにおける黒色で塗られた実線部分はコントロールを、黒色で塗られていない実線部分は、それぞれ抗ＣＤ１１ｂ抗体（CALTAG社製）、抗ラクトシルセラミド抗体（Ancell社製）又は抗デクチン−１抗体（abcam社製）で細胞表面を染色した場合の結果を示す。
図８及び９から、デクチン−１とラクトシルセラミドの発現は観察されなかったが、ＣＤ１１ｂが、ｍＲＮＡレベル及び細胞表面において発現していることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＣＳＢＧを添加するタイミングを変えた脱顆粒実験の結果を示す図である。
【図２】感作に用いる抗ＴＮＰ−ＩｇＥ抗体の濃度を変えた脱顆粒実験の結果を示す図である。
【図３】ＳＰＧを用いた脱顆粒実験の結果を示す図である。
【図４】ＩＬ−４及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図５】ＩＬ−４とβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した結果を示す図である。
【図６】ＨＤＣ及びβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図７】ＨＤＣとβ−アクチンのｍＲＮＡ発現強度を数値化した結果を示す図である。
【図８】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＢＧレセプターの発現のＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す図である。
【図９】ＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＢＧレセプターの発現のフローサイトメトリーによる解析結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ由来のβ−グルカンを有効成分とする、顆粒球の脱顆粒の促進剤。
【請求項２】
カンジダ由来のβ−グルカンが、カンジダ・アルビカンス由来のβ−グルカンである、請求項１に記載の促進剤。
【請求項３】
β−グルカンが、１，３−β−グルカンである、請求項１又は２に記載の促進剤。
【請求項４】
１，３−β−グルカンが、１，６−β−ロング・グルコシル分枝１，３−β−グルカン（1,6−β−long glucosyl branched 1,3−β−グルカン）である、請求項３に記載の脱顆粒促進剤。
【請求項５】
顆粒球が、好塩基球である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脱顆粒促進剤。
【請求項６】
以下のステップを少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法；
（１）被験物質、カンジダ由来のβ−グルカン、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【請求項７】
以下の構成成分を少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キット；
（１）カンジダ由来のβ−グルカン。
【請求項８】
さらに以下の構成成分を含む、請求項７に記載の評価キット。
（２）顆粒球。
【請求項９】
以下のステップを少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法；
（１）被験物質、カンジダ由来のβ−グルカン、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【請求項１０】
以下の構成を少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキット；
（１）カンジダ由来のβ−グルカン。
【請求項１１】
さらに以下の構成成分を含む、請求項１０に記載の評価キット；
（２）顆粒球。
【請求項１】
カンジダ由来のβ−グルカンを有効成分とする、顆粒球の脱顆粒の促進剤。
【請求項２】
カンジダ由来のβ−グルカンが、カンジダ・アルビカンス由来のβ−グルカンである、請求項１に記載の促進剤。
【請求項３】
β−グルカンが、１，３−β−グルカンである、請求項１又は２に記載の促進剤。
【請求項４】
１，３−β−グルカンが、１，６−β−ロング・グルコシル分枝１，３−β−グルカン（1,6−β−long glucosyl branched 1,3−β−グルカン）である、請求項３に記載の脱顆粒促進剤。
【請求項５】
顆粒球が、好塩基球である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脱顆粒促進剤。
【請求項６】
以下のステップを少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価方法；
（１）被験物質、カンジダ由来のβ−グルカン、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【請求項７】
以下の構成成分を少なくとも含む、顆粒球の脱顆粒を抑制する物質の評価キット；
（１）カンジダ由来のβ−グルカン。
【請求項８】
さらに以下の構成成分を含む、請求項７に記載の評価キット。
（２）顆粒球。
【請求項９】
以下のステップを少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法；
（１）被験物質、カンジダ由来のβ−グルカン、抗原物質、当該抗原物質に対する抗体及び顆粒球を共存させるステップ；
（２）前記ステップによって得られる脱顆粒のレベルと、前記ステップにおいて被験物質が共存していない状態における脱顆粒のレベルとを比較するステップ。
【請求項１０】
以下の構成を少なくとも含む、抗アレルギー剤の有効成分の候補物質のスクリーニングキット；
（１）カンジダ由来のβ−グルカン。
【請求項１１】
さらに以下の構成成分を含む、請求項１０に記載の評価キット；
（２）顆粒球。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−５０３４７（Ｐ２００８−５０３４７Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９１６４４（Ｐ２００７−１９１６４４）
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５９２０６８２００）学校法人東京薬科大学 (32)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５９２０６８２００）学校法人東京薬科大学 (32)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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