腎損傷の処置における使用のための造血幹細胞
本明細書では、患者における腎損傷を処置する方法であって、腎損傷を処置するのに効果的な量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＨＳＣが腎損傷の直後に投与されないように、ＨＳＣの投与が遅延される。ある特定の態様において、ＨＳＣは、腎臓の修復期の開始期に患者に投与される。本発明のさらなる実施形態および態様は、本発明における使用のための関連した方法および組成物を含めて、本明細書に記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる、２００９年１０月２日出願の米国仮特許出願第６１／２４８，３１６号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、再生のための驚異的な能力を有しているが、急性腎損傷後、または反復性および慢性腎損傷後の慢性腎臓疾患および腎不全は、現在、世界の疾病および死亡の主要原因となっている［１〜３］。さらに、慢性腎臓疾患は、心臓血管疾患および心臓血管系死亡率の主要な独立した危険因子として同定されている［４］。慢性腎疾患は、損傷後の不成功または不十分な腎臓修復を示し得るが、現在、腎臓の修復および再生を促進する治療はほとんどない［５］。
【０００３】
近年、腎臓の傍尿細管微小血管系がますます注目されてきているが、これは、この壊れやすい血管が損傷後正常に再生することができないためである。これは、腎臓の慢性虚血にかかりやすくし［１２〜１５］、慢性腎臓疾患の特徴である、慢性炎症、尿細管萎縮、および間質性線維症の引き金となり得る［１２、１３］。損傷後の傍尿細管毛細血管の再生の失敗は、慢性腎臓疾患への進行の中核となることが示唆されている［１２〜１４］。
【０００４】
骨髄からの幹細胞の修復および血管形成特性に対して大きな関心が向けられており［６〜８］、腎臓疾患のマウスモデルにおけるいくつかの研究は、マウス骨髄間葉間質細胞（ＭＳＣ）が、おそらくはパラクリンまたは全身分泌機序によって、腎損傷を予防または軽減し得ることを示している［６、９、１０］。しかしながら、腎臓修復における造血幹細胞（ＨＳＣ）の可能な血管形成の役割はほとんど探求されておらず、臓器修復および再生を促進するために、細胞治療においてヒトＨＳＣを採集する実行可能性を究明した研究はない［１１］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｅｇｕｉｄ Ｅｌ Ｎａｈａｓ Ａ， Ｂｅｌｌｏ ＡＫ． Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ： ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｌａｎｃｅｔ． Ｊａｎ ２２−２８ ２００５；３６５（９４５６）：３３１−３４０
【非特許文献２】Ｔｈａｄｈａｎｉ Ｒ， Ｐａｓｃｕａｌ Ｍ， Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ ＪＶ． Ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．Ｍａｙ ３０， １９９６；３３４（２２）：１４４８−１４６０
【非特許文献３】Ａｌｉ Ｔ， Ｋｈａｎ Ｉ， Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｗ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ａｐｒ ２００７；１８（４）：１２９２−１２９８
【非特許文献４】Ｗｅｉｎｅｒ ＤＥ， Ｔｉｇｈｉｏｕａｒｔ Ｈ， Ａｍｉｎ ＭＧ， ｅｔ ａｌ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓ ａ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｌｌ−ｃａｕｓｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ： ａ ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｍａｙ ２００４；１５（５）：１３０７−１３１５
【非特許文献５】Ｓａｇｒｉｎａｔｉ Ｃ， Ｒｏｎｃｏｎｉ Ｅ， Ｌａｚｚｅｒｉ Ｅ， ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｋｉｄｎｅｙ ｒｅｐａｉｒ： ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．Ｊｕｌ ２００８；１４（７）：２７７−２８５
【非特許文献６】Ｔｏｇｅｌ Ｆ， Ｗｅｉｓｓ Ｋ， Ｙａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃ， ｐａｒａｃｒｉｎｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｆｕｓｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍａｙ ２００７；２９２（５）：Ｆ１６２６−１６３５
【非特許文献７】Ｌｉ Ｂ， Ｍｏｒｉｏｋａ Ｔ， Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｊａｎ ２００６；６９（２）：３２３−３３０
【非特許文献８】Ｖａｎ Ｈｕｙｅｎ ＪＰ， Ｓｍａｄｊａ ＤＭ， Ｂｒｕｎｅｖａｌ Ｐ， ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｉｓｔａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｌｏｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｅｇ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．Ｊｕｌ ２００８；２１（７）：８３７−８４６
【非特許文献９】Ｂｉ Ｂ， Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｒ， Ｉｓｒａｉｌｏｖａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ａｃｕｔｅ ｔｕｂｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ ｖｉａ ａｎ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｓｅｐ ２００７；１８（９）：２４８６−２４９６
【非特許文献１０】Ｉｍｂｅｒｔｉ Ｂ， Ｍｏｒｉｇｉ Ｍ， Ｔｏｍａｓｏｎｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１ ｓｕｓｔａｉｎｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｎａｌ ｒｅｐａｉｒ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｎｏｖ ２００７；１８（１１）：２９２１−２９２８
【非特許文献１１】Ｄｅｋｅｌ Ｂ， Ｓｈｅｚｅｎ Ｅ， Ｅｖｅｎ−Ｔｏｖ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｎｄ ｇｒｏｗｉｎｇ ｋｉｄｎｅｙｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｍａｙ ２００６；２４（５）：１１８５−１１９３
【非特許文献１２】Ｂａｓｉｌｅ ＤＰ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ａｕｇ ２００８；７４（３）：２５７−２５８
【非特許文献１３】Ｂａｓｉｌｅ ＤＰ．Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｊｕｌ ２００７；７２（２）：１５１−１５６
【非特許文献１４】Ｂａｓｉｌｅ ＤＰ， Ｄｏｎｏｈｏｅ Ｄ， Ｒｏｅｔｈｅ Ｋ， ｅｔ ａｌ．Ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｎｏｖ ２００１；２８１（５）：Ｆ８８７−８９９
【非特許文献１５】Ｙｕａｎ ＨＴ， Ｌｉ ＸＺ， Ｐｉｔｅｒａ ＪＥ， ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｌｏｓｓ ａｆｔｅｒ ｍｏｕｓｅ ａｃｕｔｅ ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１ ａｌｐｈａ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．Ｄｅｃ ２００３；１６３（６）：２２８９−２３０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当技術分野において、腎損傷の処置のための方法を開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載の研究は、ヒトＣＤ３４＋幹細胞が損傷腎臓に動員され、生存、血管再生および機能回復を促進することを、初めて実証するものである。ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞の、腎臓の修復および再生を促進する能力は、確立されているマウス虚血再かん流傷害モデルを使用して研究された。腎損傷後に例えば全身投与されたヒトＨＳＣは、マウスの損傷腎臓に選択的に動員され、血管内および周囲に顕著に局在化した。この動員は、腎臓微小血管系、小管上皮細胞の修復の向上、機能回復の向上および生存率の増加を伴った。いくつかの場合において、ＨＳＣは、腎臓内の初期骨髄およびリンパ分化マーカーを獲得し、また内皮前駆細胞マーカーの獲得を示したが、腎臓への動員後、高レベルの血管形成促進転写物の合成を維持した。注入された精製ＨＳＣは、少数の循環内皮前駆細胞および偶発的内皮細胞を含有したが、稀なヒト内皮細胞のみがマウス毛細血管壁において同定され、これは、ＨＳＣ媒介腎臓修復が、血管の交代ではなくパラクリン機序によるものであることを示唆している。これらの研究は、ヒトＨＳＣを、損傷後の腎臓修復を促進するための有望な治療戦略として発展させるものである。
【０００８】
したがって、本発明は、患者における腎損傷を処置する方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を患者に投与することを含む方法を提供する。ＨＳＣは、腎損傷を処置するのに効果的な量で患者に投与され、この量は本明細書においてさらに説明される。ある特定の実施形態において、ＨＳＣの投与が遅延される、すなわちＨＳＣは腎損傷の直後に投与されない。本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、腎臓の修復期の開始時に、例えば少なくとも損傷後約１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間で、患者に投与される。さらなる実施形態において、ＨＳＣは、損傷後約２４時間で、またはその後ある程度の時間を置いて、但し損傷後約１４日までに、患者に投与される。ＨＳＣの投与の時間に関するさらなる実施形態は、本明細書において詳説される。
【０００９】
さらに、本明細書において、ＨＳＣの投与を含む関連した方法が提供される。例えば、腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状を予防する方法、腎損傷を有する患者の生存率を増加させる方法、および腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状により引き起こされる、またはそれに伴う、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状を予防する方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるＨＳＣは、薬学的に許容される担体とともに製剤化される。したがって、本発明は、ＨＳＣの集団および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、任意でＨＳＣに結合した、追加的な治療薬または診断薬を含む。そのような薬学的組成物は、治療薬または診断薬を損傷腎臓に送達するために使用され得る。したがって、本発明は、さらに、治療薬または診断薬を患者の損傷腎臓に送達する方法であって、治療薬または診断薬に結合したＨＳＣを患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、細胞の不均一集団を含み、ＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ）は、集団の細胞の少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％）を構成する。本発明の薬学的組成物のさらなる実施形態およびその使用は、本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト造血幹細胞が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの虚血再かん流障害（ＩＲＩ）後の腎臓、脾臓および骨髄に動員されることを実証する図である。（Ａ）ＩＲＩ後１日目に適合移植ヒトＨＳＣを受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＩＲＩ後３日目の腎臓の代表的共焦点画像であり、マウスＣＤ３１標識化により示された傍尿細管毛細血管におけるＣＭＦＤＡ標識化ヒト細胞（矢印）を示している。（Ｂ）ＩＲＩ後３日目、５日目および７日目の、ＩＲＩ後および対照腎臓において確認されたヒトＨＳＣの数を示すグラフである。（Ｃ）ＩＲＩ後２４時間でヒトＨＳＣで処理されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの７日後のＩＲＩ腎臓のヒトＨＬＡクラスＩ（緑、矢印）を検出する代表的共焦点画像である。（Ｄ）ＩＲＩ後７日目、１４日目および２８日目の、ＩＲＩ後および対照腎臓における切片当たりのヒトＨＬＡクラスＩ細胞の数を示すグラフである。（Ｅ）腎臓ＩＲＩ後１日目に適合移植された、ＩＲＩ後３日目の脾臓におけるＣＭＦＤＡ標識化ヒトＨＳＣの代表的共焦点画像である。（Ｆ）ＩＲＩ後３日目、５日目および７日目の脾臓における、切片当たりのＣＭＦＤＡ陽性細胞の数を示すグラフである。（Ｇ）ＩＲＩ後１日目にヒトＨＳＣを適合移植された腎臓ＩＲＩ後７日目のマウスからの全骨髄のＣＤ１１ｂ（マウスおよびヒト抗原を検出する）およびヒトＣＤ４５の代表的フローサイトメトリープロットである。（Ｈ）１日目および２日目におけるマウス骨ＨＳＣ（Ｅ）におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。（Ｄ）における重度に損傷した小管における顕著な残屑が、（Ｅ）では、はるかに低い程度で存在することに留意されたい。（Ｆ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける尿細管損傷インデックスを示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。（Ｇ〜Ｈ）ＩＲＩ後１日目および２日目にビヒクル（Ｇ）またはＨＳＣ（Ｈ）を受けた、ＩＲＩ後２８日目のシリウスレッド染色腎臓の代表的画像である。（Ｉ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける線維症領域を示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。平均±標準偏差。＊Ｐ＜０．０５、対ビヒクル群。（バー＝５０μｍ）。
【図２】腎臓虚血再かん流障害後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対するヒトＨＳＣの適合移植が、死亡率を減少させ、腎機能を改善することを実証する図である。（Ａ）両側ＩＲＩおよびそれに続く損傷後１日目のＰＢＳ（ビヒクル、ｎ＝１６）または２．５×１０６（ＨＳＣ、ｎ＝１０）のＩＶ注射後の損傷後１日目、２日目および７日目の血漿クレアチニンレベルである。データは、平均±標準偏差である。Ｐ値＜０．０１である。（Ｂ）マウスの、両側ＩＲＩおよびそれに続く損傷後１日目のＰＢＳ（ビヒクル）または２．５×１０６ヒトＨＳＣ（ＨＳＣ）のＩＶ注射後の、生存率曲線および各時点での数である。Ｐ値＝０．０３９である。
【図３】ヒトＨＳＣの適合移植が、傍尿細管毛細血管喪失を軽減し、腎臓虚血再かん流障害後の尿細管上皮損傷を低減することを実証する図である。（Ａ〜Ｂ）１日目および２日目にビヒクル（Ａ）またはＨＳＣ（Ｂ）を受けたＩＲＩ後７日目の腎臓の、髄質外部のマウスＣＤ３１標識化傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）の代表的画像である。（Ａ）における顕著なＰＴＣ損失に留意されたい。（Ｃ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおけるＰＴＣインデックスを示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。（Ｄ〜Ｅ）１日目および２日目にビヒクル（Ｄ）またはＨＳＣ（Ｅ）を受けたマウスからの、ＩＲＩ後５日目の腎臓の髄質外部のＰＡＳ染色腎臓切片の代表的光学画像である。（Ｄ）における重度に損傷した小管における顕著な残屑が、（Ｅ）においてははるかに低い程度で存在することに留意されたい。（Ｆ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける尿細管損傷インデックスを示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。（Ｇ〜Ｈ）ＩＲＩ後１日目および２日目にビヒクル（Ｇ）またはＨＳＣ（Ｈ）を受けた、ＩＲＩ後２８日目のシリウスレッド染色腎臓の代表的画像である。（Ｉ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける線維症領域を示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。平均±標準偏差。＊Ｐ＜０．０５、対ビヒクル群。（バー＝５０μｍ）。
【図４】腎臓におけるヒトＨＳＣの分化を示す図である。腎臓髄質外部の代表的共焦点画像（Ａ、Ｃ）およびエピ蛍光画像（Ｅ）であり、マウス血管系のｍＣＤ３１（赤）を示すために共に標識化された、損傷後１日目にＨＳＣのＩＶ注射を受けたＩＲＩ後５日目の腎臓における細胞（矢尻）内のヒトＣＤ４５（Ａ）、ヒトＣＤ６８（Ｃ）、およびヒトＣＤ３（Ｅ）の発現を示している。グラフは、ＩＲＩ後腎臓および対照腎臓において確認された、ヒトＣＤ４５（Ｂ）、ヒトＣＤ６８（Ｄ）、およびヒトＣＤ３（Ｆ）細胞の数を示す。データは、平均±標準偏差である。ｎ＝６／時点である。（Ｇ〜Ｈ）ヒトＣＤ１３３（Ｇ）、ＣＤ１４６（Ｈ）およびＫＤＲ（Ｉ）に対する抗体で共に標識化された、ＣＭＦＤＡで１日目〜２日目に標識化された（矢尻）ヒトＨＳＣを受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＩＲＩ後３日目の腎臓の代表的エピ蛍光画像である。抗ＫＤＲ抗体はまた、マウス内皮（矢印）を検出したことに留意されたい（バー＝５０μｍ）。
【図５】稀なヒト内皮細胞が虚血性傷害およびＨＳＣ注入後の腎臓において検出され得ることを実証する図である。（Ａ〜Ｂ）ＩＲＩ後２８日目の腎臓の共焦点画像であり、ヒトＣＤ３１発現細胞の存在を示しており、そのいくつかは毛細血管（矢尻）（Ａ）内に統合されているようだが、大部分は形態学的に単球であり、ｈＣＤ４５を共発現している（矢尻）（Ｂ）。（Ｃ）損傷から１日後のＨＳＣの適合移植後の、ＩＲＩ後の腎臓における経時的なヒトＣＤ３１発現細胞の数を示すグラフである。（Ｄ）ＩＲＩ後腎臓におけるヒトＣＤ４５の発現を示さない細胞における、ヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）であってマウスｖＷＦではない特定の発現（矢尻）（バー＝５０μｍ）。
【図６】ヒトＨＳＣが、腎臓虚血性傷害後の腎臓において、血管形成パラクリン因子を生成することを実証する図である。適合移植前のＨＳＣ（白）および適合移植から４８時間後のＩＲＩ後腎臓から精製されたＨＳＣにおける、血管形成促進転写物のＧＡＰＤＨと比較した、相対的遺伝子発現である。腎臓に動員されたＨＳＣは、血管形成促進転写物の高レベルの発現を保持することに留意されたい。平均±標準偏差。ｎ＝６／群である。（バー＝５０μｍ）。
【図７】損傷後の腎臓の修復における、ＨＳＣの機能のモデルを示す図である。ＨＳＣは、損傷腎臓に動員され、そこでＣＥＰマーカーＣＤ１４６を獲得し、損傷した毛細血管内および間質に局在化する。アンジオポイエチンを含むサイトカイン、血管内皮成長因子、ハプトサイト（ｈａｐｔｏｃｙｔｅ）成長因子およびインスリン様成長因子の局所的産生が生じ、パラクリン機序による細胞修復を促進する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載のデータは、損傷腎臓を有する哺乳動物に対し投与されたＨＳＣの特定の局在化、およびその後の、傍尿細管微小血管系を含むがこれに限定されない損傷腎臓組織の修復を初めて実証するものであり、この修復はＨＳＣにより媒介される。したがって、本発明は、患者における腎損傷を処置する方法であって、腎損傷を処置するのに効果的な量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
「処置」という用語およびそこから派生する用語は、本明細書で使用される場合、必ずしも標的状態の１００％または完全な改善を暗示するものではない。むしろ、当業者が有益であると認識する様々な程度の治療効果が存在する。この点において、本明細書に記載の方法は、腎損傷に対する任意の量または任意のレベルの治療的利益を提供し、したがって損傷を「処置」する。例えば、様々な態様において、腎損傷を処置する方法は、患者の損傷腎臓組織の修復または再生の促進、患者の生存率の増加、腎臓の機能的回復の向上、または腎臓機能の復元のうちの１つ以上を含む。別の態様において、この方法によって提供される処置は、損傷腎臓によりもたらされる１つ以上の状態または症状の改善を含む。例えば、制限されることなく、本明細書に記載の本発明の方法は、腎臓の傍尿細管微小血管系（例えば、傍尿細管毛細血管）の修復または再生の向上、腎臓内の血管（例えば、傍尿細管微小血管系（例えば、傍尿細管毛細血管））の形成もしくは安定化、損傷腎臓内での血管形成の誘導、または小管上皮細胞の修復の向上、腎臓の負のリモデリングの発生の低減のうちの１つ以上を達成する。
【００１５】
腎損傷
本発明の様々な態様において、提供される方法は、虚血、毒素への暴露、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）もしくはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の使用、輸血反応、筋肉への損傷または外傷、手術、ショック、低血圧、または、本明細書においてさらに説明されるようなＡＲＦもしくは慢性腎疾患の原因のいずれかのうちの任意の１つ以上によって引き起こされる、腎臓に対する任意の損傷である、患者の腎損傷の処置を意図する。
【００１６】
標的とする腎損傷は、腎臓内に見られる任意の組織への損傷を含み、例えば、髄質、皮質、腎錐体、葉間動脈、腎動脈、腎静脈、腎門部、腎盂、尿管、小腎杯、腎被膜、下腎被膜、上腎被膜、葉間静脈、腎単位、大腎杯、腎乳頭、糸球体、ボーマン嚢、および腎柱の組織を含むがこれらに限定されず、これらの組織は、部分的または完全な機能喪失をもたらすほど十分損傷を受けている。損傷腎臓組織は、腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体の内皮細胞、腎臓近位小管刷子縁細胞、ヘンレ薄層部分細胞のループ（ｌｏｏｐ ｏｆ Ｈｅｎｌｅ ｔｈｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）、肥厚上行脚細胞、腎臓遠位小管細胞、腎臓集合管細胞、および間質腎細胞を含むがこれらに限定されない、腎臓内で生じ得る異なる細胞型の任意の１つ以上を含む。本発明のある特定の実施形態において、腎損傷は、腎臓の傍尿細管微小血管系への損傷を含む。ある特定の態様において、腎損傷は、傍尿細管毛細血管への損傷を含む。いくつかの態様において、腎損傷は、小管（尿細管）上皮細胞への損傷を含む。
【００１７】
腎疾患および腎臓の病状の予防
腎臓は、自己修復または自己再生のための驚異的な能力を有しているが、腎損傷は、多くの場合、腎疾患または腎臓の病状への傾向につながる。本明細書で提供される、患者の腎損傷の処置方法によれば腎臓の修復および再生の成功が可能であり、その結果、患者における腎疾患または腎臓の病状への傾向が増加しないと理論化されている。したがって、本発明は、さらに、腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状を予防する方法を提供する。この方法は、腎疾患または腎臓の病状を予防するのに効果的な量のＨＳＣを患者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、この量は、腎損傷を処置するのに効果的であり、例えば腎機能の復元、腎臓の傍尿細管微小血管系の再生に効果的な量である。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「予防」という用語およびそこから派生する単語は、必ずしも、１００％または完全な予防を暗示するものではない。むしろ、当業者が潜在的に有益であると認識する様々な程度の予防が存在する。この点において、本明細書に記載の予防方法は、腎疾患または腎臓の病状の任意の量または任意のレベルの予防を提供する。様々な態様において、予防方法は、腎疾患もしくは腎臓の病状、またはその症状もしくは状態の、発症、展開、発生、または進行を、遅延、抑制、低減、または軽減する方法である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、予防される腎疾患または腎臓の病状は、急性腎不全、慢性腎臓疾患、腎間質線維症、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、水腎症、間質性腎炎、腎臓結石（腎結石症）、腎腫瘍（例えば、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌）、ループス腎炎、微小変化型疾患、ネフローゼ症候群、腎盂腎炎、腎不全（例えば、急性腎不全および慢性腎疾患以外）である。
【００２０】
急性腎不全
「急性腎不全」という用語は、本明細書で使用される場合、「急性腎損傷」または「ＡＲＦ」と同義であり、腎臓への損傷による腎機能の急速な損失を指す。ＡＲＦは、通常は腎臓により排泄される窒素性（例えば、血清中クレアチンおよび／または尿排出）ならびに非窒素性廃棄物生成のレベルの急激な変化により特徴付けられる。ＡＲＦの症状および診断は、当技術分野において知られている。例えば、Ａｃｕｔｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ， Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５６， ｖｏｌ．ｅｄｓ．Ｒｏｎｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｋａｒｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， ２００７およびＢｅｌｌｏｍｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ８（４）： Ｒ２０４−Ｒ２１２， ２００４を参照されたい。
【００２１】
様々な態様において、ＡＲＦは、病因に依存して、腎前性ＡＲＦ、内因性ＡＲＦ、または腎後性ＡＲＦである。この点において、腎前性ＡＲＦは、血液量減少（例えば、ショック、脱水、体液喪失、または過度の利尿薬の使用）、肝腎症候群、血管障害（例えば、ネフローゼ症候群に関連した、アテローム塞栓性疾患、腎静脈血栓症）、感染症（例えば、敗血症）、重度の熱傷、腐骨形成（例えば、心膜炎、膵臓炎による）、低血圧症（例えば、抗高血圧症、血管拡張剤の使用による）のうちの１つ以上により引き起こされ得る。
【００２２】
内因性ＡＲＦは、毒素または薬剤（例えば、ＮＳＡＩＤ、アミノ配糖体系抗生物質、ヨード造影剤、リチウム、ホスフェート腎症（例えば、結腸鏡検査におけるリン酸ナトリウムによる腸の前処理）、横紋筋融解（例えば、損傷（例えば、挫滅外傷または広範囲の鈍的外傷）により引き起こされる）、スタチン、興奮剤の使用により引き起こされる）、溶血、多発性骨髄腫、急性糸球体腎炎のうちの１つ以上により引き起こされ得る。
【００２３】
腎後性ＡＲＦは、薬剤（例えば、抗コリン作用薬）、良性の前立腺肥大症もしくは前立腺癌、腎臓結石、腹部悪性腫瘍（例えば、卵巣癌、結腸直腸癌）、導尿カテーテル閉塞、および結晶尿もしくはミオグロビン尿を引き起こす薬物、または膀胱炎のうちの１つにより引き起こされ得る。
【００２４】
ＡＲＦは、患者における虚血、毒素、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の使用、輸血反応、筋肉に対する損傷または外傷、手術、ショック、および低血圧により引き起こされ得る。ＡＲＦを引き起こす毒素は、抗真菌剤またはＸ線写真用の染料であり得る。また、いくつかの実施形態において、ＡＲＦは、急性腎尿細管壊死または腎虚血再かん流傷害を含む。
【００２５】
慢性腎臓疾患
腎疾患または腎臓の病状を予防する方法のいくつかの実施形態において、腎疾患は、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）である。本明細書において使用される場合、「慢性腎疾患」としても知られる「慢性腎臓疾患」は、何ヶ月または何年もの期間にわたる進行性の腎機能喪失を指す。処置されるＣＫＤは、例えば、第１期、第２期、第３期、第４期または第５期（確立されたＣＫＤ、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、慢性腎機能障害（ＣＫＦ）、または慢性腎不全（ＣＲＦ）としても知られる）を含む、任意の段階である。
【００２６】
ＣＫＤは、急性腎損傷、急性腎損傷の病因、糖尿病性ネフロパシーにつながる１型および２型糖尿病、高血圧（高血圧症）、糸球体腎炎（腎臓の濾過系の炎症および損傷）、多発性嚢胞腎、鎮痛薬性腎症につながる鎮痛薬（例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェン）の使用（例えば、常用および長期間の使用）、虚血性ネフロパシーにつながるアテローム性動脈硬化、石による尿の流れの阻害、前立腺肥大、狭窄症（狭窄）、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球病、ヘロインの乱用、アミロイドーシス、腎臓結石、慢性腎感染、およびある特定の癌を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子のうちのいずれか１つにより引き起こされ得る。
【００２７】
腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状の予防
慢性腎臓疾患は、心臓血管疾患および心臓血管系死亡率の主要な独立した危険因子として同定されている。本明細書に記載のようなＨＳＣの投与は、さらに、腎臓疾患および腎臓の病状以外の疾患または病状を予防するのに有用であることが理論付けられる。したがって、腎損傷を有する患者における、腎疾患または腎臓の病状により引き起こされる、またはそれに関連した、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状を予防する方法が、本明細書においてさらに提供される。この方法は、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状を予防するのに効果的な量のＨＳＣを患者に投与することを含む。ある特定の実施形態において、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状は、心臓血管疾患である。
【００２８】
生存率の増加
急性腎損傷後、または反復性および慢性の腎損傷後の慢性腎臓疾患および腎不全は、現在、世界の疾病および死亡の主要原因となっている。本明細書に記載のようなＨＳＣの投与は、さらに、腎損傷を有する患者の死亡を予防する（生存率を増加させる）のに有用であることが理論付けられている。したがって、腎損傷を有する患者の生存率を増加させる方法が、本明細書においてさらに提供される。この方法は、患者の生存率を増加させるのに効果的な量のＨＳＣを患者に投与することを含む。
【００２９】
造血幹細胞（ＨＳＣ）
本明細書の目的において、「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、例えば、骨髄性（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、樹枝状細胞）およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）を含む血液細胞型を生成する多能性幹細胞を指す。ＨＳＣは、多能性、少機能性、または単機能性ＨＳＣであってもよい。
【００３０】
ＨＳＣを得る方法およびＨＳＣ源
ＨＳＣは、当技術分野において知られた任意の手段により得ることができる。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、ドナーから単離される。「単離」という用語は、本明細書において使用される場合、その自然環境から取り出されたことを意味する。ＨＳＣは、様々な態様において、骨髄、脂肪組織、血液、卵黄嚢、骨髄組織（例えば、肝臓、脾臓、胎児、例えば胎児肝臓、胎児脾臓における）、臍帯血、胎盤、および大動脈・性腺・中腎を含むがこれらに限定されない、ＨＳＣを有する任意の成人、胎児または胚組織から単離される。
【００３１】
ＨＳＣのドナーは、患者に関して本明細書に記載される宿主のいずれかである。いくつかの態様において、ドナーは哺乳動物である。特定の態様において、ドナーはヒトである。他の態様において、ＨＳＣのドナーは、患者と同じである。この点において、ＨＳＣは、患者の「自己」細胞であるとされる。いくつかの実施形態において、ＨＳＣのドナーは、患者とは異なるが、ドナーおよび患者は同じ種である。この点において、ＨＳＣは、患者の「同種異系」細胞であるとされる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、ドナーの骨髄、例えばドナーの腰から、注射器および針を使用して単離される。別の実施形態において、ＨＳＣは、血液（例えば、末梢血）から単離される。ある特定の態様において、ＨＳＣは、骨髄から血液、例えば末梢血へのＨＳＣの移動を誘導または促進するサイトカインによるドナーの前処理後に、血液から単離される。いくつかの場合において、サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはＡＭＤ−３１００である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、初代細胞または新たに単離された細胞である。あるいは、ＨＳＣは、培養細胞、樹立細胞株からの細胞、および／またはＨＳＣの凍結ストックから解凍した細胞である。ＨＳＣは、細胞レポジトリから、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＮＳＣＲ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、および他の商業的供給者から入手可能である。
【００３４】
他の態様において、ＨＳＣの特定の集団を得るためのさらなるステップが実行される。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは精製される。本明細書において使用される場合、「精製」という用語は、純度が増加したことを意味し、「純度」とは、相対的用語であり、必ずしも絶対的な純粋さとして解釈されるべきではない。例えば、様々な態様において、純度は、少なくとも約５０％であるが、６０％、７０％もしくは８０％超であってもよく、または１００％であってもよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＨＳＣは、細胞の異種集団の一部、または実質的に同種の細胞集団の一部である。例えば、いくつかの態様において、ＨＳＣは、ＨＳＣのクローン集団であり、集団の各細胞は、集団の別の細胞から遺伝子的に区別できない。細胞の異種集団は、他の細胞型、ＨＳＣ以外の細胞を含む。例えば、いくつかの態様において、細胞の異種集団は、ＨＳＣに加えて、白血球（骨髄細胞系またはリンパ系の白血球）、赤血球、内皮細胞、循環内皮前駆細胞、上皮細胞、腎細胞、肺細胞、骨細胞、骨髄球、神経細胞、平滑筋細胞を含む。代替的に、または追加的に、細胞の異種集団は、ＨＳＣのみを含むが、ＨＳＣは、クローン細胞ではなく、例えば互いから遺伝子的に区別できる。異種集団のＨＳＣは、本明細書においてさらに論じられるように、異なる表現型を有する。特定の表現型を有する細胞、例えばＨＳＣを単離する好適な方法は、当技術分野において知られており、例えば、光学的流動選別器を使用する方法（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））および非光学的流動選別器を使用する方法（例えば、磁気活性化細胞選別）を含む。
【００３５】
ＨＳＣにより発現されるマーカー
ＨＳＣは、ＨＳＣの任意の表現型特性を有する。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、系統マーカー（の発現）に対して陰性（すなわち、ｌｉｎ−）である。いくつかの場合において、ＨＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、およびｃ−ｋｉｔのうちの１つ以上（の発現）に対して陽性である。いくつかの場合において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋であり、他の場合において、ＨＳＣは、ＣＤ４５＋である。さらに別の態様において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋である。ある特定の実施形態において、ＨＳＣの表現型は、患者に投与されると変化する。したがって、いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、マーカー、例えば循環内皮前駆細胞（ＣＥＰ）マーカー（ＣＥＰ上に発現するマーカー、例えばＣＤ１４６、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ３１）の発現に対して陽性となるＨＳＣである。
【００３６】
ＨＳＣは、任意で、異種細胞集団の一部であり、集団内の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、特定の表現型を有する。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞の異種集団の一部であり、細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ３４＋ＨＳＣである。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞の異種集団の一部であり、細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ４５＋ＨＳＣである。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞の異種集団の一部であり、細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、患者への投与後にＣＤ１４６＋ＨＳＣになるＨＳＣである。
【００３７】
ＨＳＣのさらなる改質ステップ
いくつかの態様において、ＨＳＣは、単離および／または精製後にさらに改質される。一代替例において、細胞は、ＨＳＣ集団の拡張、ＨＳＣへの遺伝子の送達、ＨＳＣの分化、または、治療薬もしくは診断薬等の化合物のＨＳＣへの結合を目的として、生体外で培養される。これらのさらなるステップを実行する方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００１；Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８１： ２８４４−２８５３ （１９９３）；米国特許第７，１４４，７３１号；Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ＦＡＳＥＢ Ｊ １５： ５８６ （２００１）；Ｎｏｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３５（４）： ６５３−６６１ （２００７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ａｎｄ Ｃｏｓｓｅｔ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ： Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ， ｅｄｓ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００７を参照されたい。
【００３８】
薬学的組成物
本明細書に記載のＨＳＣは、任意で、薬学的組成物等の組成物に製剤化される。この点において、本発明は、ＨＳＣおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。担体は、従来使用されている任意の担体であり、溶解度および活性化合物（複数を含む）との反応性の欠如等の物理化学的考慮点、ならびに投与経路によってのみ制限される。本明細書に記載の薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に利用可能である。一態様において、薬学的に許容される担体は、活性薬剤（複数を含む）、例えば造血幹細胞に対して化学的に不活性である担体、および使用条件下で有害な副作用または毒性を有さない担体である。担体の選択は、部分的に、薬学的組成物を成す特定の薬剤により、および薬学的組成物を投与するために使用される特定の経路により決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の好適な製剤が種々存在する。
【００３９】
投与経路
いくつかの実施形態において、ＨＳＣを含む薬学的組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、くも膜下投与、または腹腔内投与用に製剤化される。他の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内、スプレー、口内、エアロゾル、直腸内、または膣内投与により投与される。
【００４０】
ＨＳＣを投与する方法は、当技術分野において知られている。例えば、米国特許第５４２３７７８号、第５５５００５０号、第５６６２８９５号、第５８００８２８号、第５８００８２９号、第５８１１４０７号、第５８３３９７９号、第５８３４００１号、第５８３４０２９号、第５８５３７１７号、第５８５５６１９号、第５９０６８２７号、第６００８０３５号、第６０１２４５０号、第６０４９０２６号、第６０８３５２３号、第６２０６９１４号、第６３０３１３６号、第６３０６４２４号、第６３２２８０４号、第６３５２５５５号、第６３６８６１２号、第６４７９２８３号、第６５１４５２２号、第６５３４０５２号、第６５４１０２４号、第６５５１３３８号、第６５５１６１８号、第６５６９１４７号、第６５７９３１３号、第６５９９２７４号、第６６０７５０１号、第６６３０４５７号、第６６４８８４９号、第６６５９９５０号、第６６９２７３８号、第６６９９４７１号、第６７３６７９９号、第６７５２８３４号、第６７５８８２８号、第６７８７３５７号、第６７９０４５５号、第６８０５８６０号、第６８５２５３４号、第６８６３９００号、第６８７５４４１号、第６８８１２２６号、第６８８４４２７号、第６８８４４２８号、第６８８６５６８号、第６９１８８６９号、第６９３３２８１号、第６９３３２８６号、第６９４９５９０号、第６９６０３５１号、第７０１１８２８号、第７０３１７７５号、第７０３３３４５号、第７０３３６０３号、第７０４９３４８号、第７０７０５８２号、第７０７４２３９号、第７０９７８３２号、第７０９７８３３号、第７１３５１７２号、第７１４５０５５号、第７１５７０８０号、第７１６６２８０号、第７１７６２５６号、第７２４４２４２号、第７４５２５３２号、第７４７０４２５号、および第７４９４６４４号を参照されたい。
【００４１】
非経口
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、非経口投与用に製剤化される。本発明の目的において、非経口投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、脳内、脳室内、心臓内、皮下、骨内、皮内、くも膜下、腹腔内、膀胱内、および陰茎海綿体内注射または注入を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
非経口投与に好適な製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を対象被投与者の血液と等張性にする溶質を含有し得る、水性および非水性等張性滅菌注射液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存料を含み得る、水性および非水性滅菌懸濁液を含む。様々な態様において、薬学的組成物は、水、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連糖溶液、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコール、グリセロール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、または石鹸もしくは洗剤等の薬学的に許容される界面活性剤を添加した、または添加しないアセチル化脂肪酸グリセリド、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース等の懸濁剤、あるいは、乳化剤および他の薬学的アジュバントを含む、滅菌液体または複数の液体の混合など、薬学的担体中の生理学的に許容される希釈剤により投与される。
【００４３】
非経口製剤において任意で使用される油は、石油、動物油、植物油、または合成油を含む。油の特定の例には、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン、およびミネラルオイルが含まれる。非経口製剤における使用に好適な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルが、好適な脂肪酸エステルの例である。
【００４４】
いくつかの実施形態における非経口製剤は、保存料または緩衝剤を含有する。注射部位における刺激を最小限化または排除するためには、そのような組成物は、任意で、約１２から約１７の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有する。そのような製剤中の界面活性剤の量は、典型的には、約５重量％から約１５重量％の範囲内である。好適な界面活性剤は、ソルビタンモノオレエート等のポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、および、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、エチレンオキシドの疎水性塩基との高分子量付加体を含む。様々な態様において、非経口製剤は、単位用量または複数用量の密閉容器内、例えばアンプルおよびバイアル内に提供され、使用直前に注射用の水等の滅菌液体賦形剤を添加するだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。ある特定の態様において、上述のような無菌粉末、顆粒、および錠剤から、即席の注射液および懸濁液が調製される。
【００４５】
注射製剤は、本明細書に従う。注射組成物用の効果的な薬学的担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ， ｅｄｓ．， ｐａｇｅｓ ２３８−２５０ （１９８２）、およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ， Ｔｏｉｓｓｅｌ， ４ｔｈ ｅｄ．， ｐａｇｅｓ ６２２−６３０ （１９８６）を参照されたい）。
【００４６】
細胞送達マトリックス
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞送達マトリックスにより投与される。ある特定の実施形態において、細胞送達マトリックスは、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ポリエチレングリコール、化学架橋性または光架橋性デキストランを含むデキストラン等を含むポリマーおよびヒドロゲルのうちのいずれか１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、細胞送達マトリックスは、収縮および非収縮コラーゲンゲルを含むコラーゲン、例えばフィブリンを含むがこれらに限定されないヒドロゲル、アルギン酸塩、アガロース、ゼラチン、ヒアルロン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、化学架橋、光架橋もしくはその両方に好適なデキストランを含むデキストラン、アルブミン、ポリアクリルアミド、ポリグリコール酸、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ（ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、親水性ポリウレタン、アクリル誘導体、プルロニック、例えばポリプロピレンオキシドおよびポリエチレンオキシドコポリマー、３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、Ｐａｎａｃｒｙｌ（登録商標）生体吸収性コンストラクト、Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）ポリグラクチン９１０、ならびに自己組織化ペプチドおよびフッ素ポリマーのような非吸収性材料（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フッ素ポリマー）、プラスチックおよび金属のうちの１つ以上を含む。
【００４７】
いくつかの場合において、マトリックスは、非分解性材料、例えば、これらに限定されないが、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ（ブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、シリコーン等、または、選択的に分解性の材料、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸；ＰＬＧＡ）、ＰＬＡ、もしくはＰＧＡを含む（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１：２３３５ ２３４６， ２０００；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｍａｒｃｈ／ Ａｐｒｉｌ １９９８、３０ ３７ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｄｏｍｂ， Ｋｏｓｔ， ａｎｄ Ｄｏｍｂ， ｅｄｓ．， １９９７， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ； Ｒｏｇａｌｌａ， Ｍｉｎｉｍ．Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｓｕｒｇ．Ｎｕｒｓ．１１：６７６９， １９９７；Ｋｌｅｉｎ， Ｆａｃｉａｌ Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．９：２０５ １８， ２００１；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１ １：３３７ ３９， １９８；Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５４：８１２ １５， １９９５；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ４３：４２２ ２７， １９９８、およびＫｕｉｊｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ５１：１３６４５， ２０００もまた参照されたい）。
【００４８】
いくつかの実施形態において、マトリックスは、生体吸収性であるか否か、液体、ゲル、または固体であるかを問わず、生体適合性の骨格、格子、自己組織化構造等を含む。そのようなマトリックスは、治療的細胞処置、外科的修復、再生医療、および創傷治癒の分野において既知である。ある特定の態様において、マトリックスは、ＨＳＣで前処理される。他の実施形態において、マトリックスには、マトリックスまたはその空間に密接に関連してＨＳＣが配置される。ＨＳＣは、マトリックスに接着することができ、または、マトリックス空間内に捕捉または含有され得る。ある特定の態様において、マトリックス−ＨＳＣ複合物が生成し、細胞がマトリックスと密接に関連して成長し、治療上使用された場合には、患者自身の腎細胞の成長、修復および／または再生が刺激されおよび支援され、適切な血管形成が同様に刺激されまたは支援される。マトリックス−細胞組成物は、移植、注射、外科的付着、他の組織による移植等を含むがこれらに限定されない、当技術分野において知られた任意の手法で患者の体内に導入され得る。いくつかの実施形態において、マトリックスは、生体内で、またはさらにより好ましくはｉｎ ｓｉｔｕで形成され、例えば、本発明に従いｉｎ ｓｉｔｕ重合性ゲルを使用することができる。そのようなゲルの例は、当技術分野等において知られている。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、三次元フレームワークまたはマトリックス、例えば骨格、発泡体またはヒドロゲル等の上に播種され、適宜投与される。ある特定の態様において、フレームワークは、実質的に平坦、実質的に円筒状または管状等、様々な形状に構成されるか、または、考慮される矯正的構造に必要とされ得る、または所望され得るように、完全に自由形態であってもよい。いくつかの態様において、多層フレームワークを生成するように、２つ以上の実質的に平坦なフレームワークが重ねて配置され、必要に応じて互いに固定される。
【００５０】
本発明の態様に使用され得るマトリックス、例えば骨格の例は、マット（織られた、編まれた、より好ましくは不織の）、多孔質または半多孔質発泡体、自己組織化ペプチド等を含む。不織マットは、例えば、天然または合成ポリマーを含む繊維を使用して形成され得る。いくつかの実施形態において、ＶＩＣＲＹＬ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）の商品名で販売されているグリコール酸および乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の吸収性コポリマーを使用して、マットが形成される。例えば、米国特許第６，３５５，６９９号に記載のようにフリーズドライまたは凍結乾燥等のプロセスにより形成される、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーで構成される発泡体もまた、骨格として機能し得る。ゲルもまた、本明細書において使用されるような好適なマトリックスを形成する。例として、ｉｎ ｓｉｔｕ重合性ゲル、および、例えば自己組織化ペプチドで構成されるヒドロゲルが含まれる。いくつかの態様において、これらの材料は、組織成長の支持体として使用される。ｉｎ ｓｉｔｕ形成分解性ネットワークもまた、本発明における使用に好適である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ， Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８： １９９−２０９、Ｗａｎｇ， Ｄ．ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４： ３９６９−３９８０；Ｈｅらに対する米国特許公開第２００２／００２２６７６号を参照されたい）。これらの材料は、いくつかの態様において、注射に好適な流体として製剤化され、次いで、ｉｎ ｓｉｔｕまたは生体内で分解性ヒドロゲルネットワークを形成するために、様々な手段（例えば、温度変化、ｐＨ、光への暴露）により導入され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、フレームワークはフェルトであり、生体吸収性材料、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から作製されたマルチフィラメント糸で構成され得る。ある特定の態様において、糸は、圧着、切断、梳綿および縫製からなる標準的な繊維加工技術を用いてフェルトに加工される。ある特定の態様において、ＨＳＣは、複合構造であってもよい発泡骨格上に播種される。さらに、いくつかの態様において、三次元フレームワークが有用な形状、例えば、修復され、交換されまたは増強される腎臓内またはその周囲の特定の構造に成形される。
【００５２】
フレームワークは、細胞付着を高めるために、ＨＳＣの接種前に処理され得る。例えば、ＨＳＣでの接種前に、ナイロンマトリックスが０．１モルの酢酸で処理され、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン内でインキュベートしてナイロンをコーティングする。いくつかの態様において、ポリスチレンが硫酸を使用して同様に処理される。
【００５３】
追加の実施形態において、三次元フレームワークの外側表面は、例えば、フレームワークのプラズマコーティングにより、または１つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリンサルフェート、コンドロイチン−４−サルフェート、コンドロイチン−６−サルフェート、デルマタンサルフェート、ケラチンサルフェート）、細胞マトリックス、ならびに／もしくは他の材料、例えば、特に、これらに限定されないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、および植物ゴム等の付加により、細胞の付着または成長および組織の分化を改善するために改質される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、骨格は、骨格を抗血栓性とする材料を含む。ある特定の実施形態において、これらの材料は、内皮成長、移動、および細胞外マトリックス堆積を促進および保持する。そのような材料の例には、天然材料、例えばラミニンおよびＩＶ型コラーゲン等の基底膜タンパク質、ｅＰＴＦＥ等の合成材料、およびセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばＰＵＲＳＰＡＮ（登録商標）（Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれるが、これらに限定されない。これらの材料は、骨格を抗血栓性とするためにさらに処理され得る。そのような処理は、ヘパリン等の抗血栓剤、およびプラズマコーティング等の材料の表面電荷を改変する処理を含む。
【００５５】
ある特定の実施形態において、ＨＳＣを含む薬学的組成物は、本明細書に記載の成分のいずれかを含む、細胞送達マトリックスの成分のいずれかを含む。
【００５６】
用量
本明細書の目的において、投与される薬学的組成物の量または用量は、例えば、妥当な期間にわたり、対象または動物において治療または予防的反応をもたらすのに十分である。例えば、薬学的組成物の用量は、投与時から、約１日から４日またはそれ以上、例えば５日、６日、１週間、１０日、２週間、１６日から２０日、またはそれ以上の期間、腎虚血再かん流傷害を処置または予防するのに十分である。ある特定の実施形態において、期間はそれよりさらに長い。用量は、特定の薬学的組成物の有効性および処置される動物（例えばヒト）の状態、ならびに動物（例えばヒト）の体重により決定される。
【００５７】
投与用量を決定するための多くのアッセイが、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、所与の用量のＨＳＣを哺乳動物に投与した後、そのようなＨＳＣが損傷腎臓に局在化する程度を、それぞれ所与の異なる用量のＨＳＣが与えられる一組の哺乳動物の間で比較することを含む検定を使用して、哺乳動物に投与される開始用量が決定される。ある特定用量が投与された後にＨＳＣが損傷腎臓に局在化する程度は、例えば本明細書に記載の方法を含む当技術分野において知られた方法により検定することができる。
【００５８】
追加的または代替的に、特定用量のＨＳＣが、腎臓の傍尿細管毛細血管喪失の軽減、尿細管上皮細胞の再生、長期線維症の予防、死亡率の低減、または腎損傷後の腎機能の改善をもたらす程度を比較することを含む検定を使用して、哺乳動物に投与される開始用量を決定することができる。そのような検定は、本明細書の実施例の項に記載される。
【００５９】
薬学的組成物の用量はまた、特定の薬学的組成物の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質および程度により決定される。典型的には、担当医は、年齢、体重、全体的な健康、食生活、性別、投与される薬学的組成物の治療薬（複数を含む）、投与経路、および処置される状態の重症度等の様々な因子を考慮して、個々の患者を処置するための薬学的組成物の用量を決定する。例えば、本発明を制限することを意図せずに、薬学的組成物の用量は、少なくとも約０．５×１０６（例えば、少なくとも約１×１０６、１．５×１０６、２×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、５．０×１０６、１０７、１０８）個のＨＳＣが、患者に投与されるような用量となり得る。
【００６０】
投与のタイミング
提供される方法において、ＨＳＣは、腎臓への損傷の時間に関連した時間に患者に投与される。本発明のある特定の実施形態において、ＨＳＣの投与は遅延され、すなわち、ＨＳＣは、腎損傷の直後に投与されない（例えば、損傷後約３０分以降、約１時間以降、約２時間以降、約３時間以降、約４時間以降、約５時間以降、約６時間以降、約７時間以降、約８時間以降、約９時間以降、約１０時間以降、約１１時間以降、または約１２時間以降）。
【００６１】
本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、腎損傷の修復期の開始時に、患者に投与される。「腎損傷の修復期」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、細胞が破壊された後の既存の腎単位の再配置、好塩基性扁平上皮細胞による小管の被膜、小管細胞の正常形態の復元、上皮細胞の分化、移動、増殖または再分化、腎単位の機能的完全性の復元、腎機能の復元等により示される、腎臓再生反応が観察される損傷後の時点を指す。腎臓の修復期は、哺乳動物について十分に記述されている。例えば、Ｒｅｉｍｓｃｈｕｅｓｓｅｌ， ＩＬＡＲ Ｊ ４２： ２８５−２９１ （２００１）を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、損傷後少なくとも約１２時間（例えば、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約５２時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約５６時間、少なくとも約５８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６２時間、少なくとも約６４時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約６８時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約７２時間）で投与される。
【００６２】
さらなる実施形態において、ＨＳＣは、損傷後、上述のような時点で、および約１４日目まで（例えば、約１３日目まで、約１２日目まで、約１１日目まで、約１０日目まで、約９日目まで、約８日目まで、約７日目まで、約６日目まで、約５日目まで、約４日目まで、約３日目まで）に患者に投与される。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、損傷後約２４時間で、またはその後ある程度の時間を置いて、但し損傷後約１４日目までに、患者に投与される。
【００６３】
いくつかの態様において、ＨＳＣは、損傷後Ｘの後および損傷後Ｙの前までに投与され、ここでＸは、約２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、４０時間、４８時間、５２時間、５８時間、６４時間、７２時間、３．５日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日からなる群から選択され、Ｙは、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、１週間からなる群から選択され、ＸはＹより小さい。本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、損傷後約２０、２１、２２、２３、２４時間で投与される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、２回以上患者に投与される。ＨＳＣは、１日１回、１日２回、１日３回、４回、１週間に１回、２日、３日、４日、５日、６日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日ごとに１回、または１ヶ月に１回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、損傷後約２４時間（例えば２４時間）後に投与され、損傷後約４８時間（例えば４８時間）後に再び投与される。
【００６５】
制御放出製剤
ある特定の態様において、薬学的組成物は、薬学的組成物が投与される体内に放出される様式が、時間および体内の場所に関して制御されるように、デポー剤形に修正される（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。様々な態様において、デポー剤形は、治療または活性薬剤（複数を含む）および多孔質または非多孔質材料、例えばポリマーを含む埋め込み型組成物であり、ＨＳＣは、材料によりカプセル化されているか、または材料全体に拡散しているか、および／または非多孔質材料の分解物である。次いで、デポー剤形は体内の所望の場所に埋め込まれ、ＨＳＣが所定の速度でインプラントから放出される。
【００６６】
したがって、ある特定の態様において、薬学的組成物は、任意の種類の生体内放出プロファイルを有するように修正される。本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、徐放出、遅延放出、または二相放出製剤である。
【００６７】
複合体
本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、第２の部分、例えば、治療薬または診断薬等に付着または連結される。ＨＳＣは損傷した腎組織に特異的に局在化し得るため、これらの実施形態のＨＳＣは、標的化薬剤として機能する。したがって、本発明は、一態様において、診断薬の治療薬に付着したＨＳＣを含む組成物を提供する。本明細書の目的に好適な治療薬および診断薬は、当技術分野において知られており、本明細書に記載のもののうちのいずれをも含むが、それらに限定されない。
【００６８】
組み合わせ
複合体を含む本明細書に記載の薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、単独で投与される。他の実施形態において、複合体を含む薬学的組成物は、他の治療または診断薬と併せて投与される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、例えば、サイトカインまたは成長因子、抗炎症薬、ＴＬＲ２阻害薬、ＡＴＦ３遺伝子または遺伝子産物、およびミネラルコルチコイド受容体遮断薬（例えば、スピロノラクトン）、リゾホスファチジン酸、２−メチルアミノクロマン（例えば、Ｕ８３８３６Ｅ）、２１−アミノステロイド（例えば、ラゾロイド（Ｕ７４３８９Ｆ））、トリメタジジン、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬またはアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）、およびスラミン等を含む、腎疾患または腎臓の病状を処置するのに知られている別の治療薬とともに投与される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、抗血栓薬、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ラパマイシン）、酸化防止剤、または、腎損傷もしくは腎臓障害を処置するために当技術分野において通常使用される他の薬剤、例えばエプロジセートおよびトリプトリド、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（例えば、シンバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンおよびアトロバスタチン）、細胞溶解物、可溶性細胞分画、膜濃縮細胞分画、細胞培養培地（例えば、馴化培地）、または細胞外基質栄養素（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、骨形態形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の、他の追加的治療薬とともに投与される。
【００７０】
患者の種類
本明細書に記載の本発明の方法に関して、患者は任意の宿主であり得る。いくつかの実施形態において、宿主は哺乳動物である。本明細書において使用される場合、「哺乳動物」という用語は、単孔類、有袋類および胎盤分類のいずれをも含むがこれらに限定されない、哺乳綱の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、マウスおよびハムスター等の齧歯目の哺乳動物、ならびにウサギ等のウサギ目の哺乳動物のうちの１つである。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目の哺乳動物である。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、ウシ科（ウシ）およびブタ科（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物である。いくつかの場合において、哺乳動物は、霊長目、セボイド目もしくはシモイド目（サル）、または類人猿目（ヒトおよび類人猿）の哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００７１】
以下の実施例は、本発明を例示することのみを目的として記載され、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【実施例】
【００７２】
実施例１
実施例２〜７において、以下の材料および方法を使用した。
【００７３】
動物
８〜１０週齢の雄の免疫不全非肥満性糖尿病（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を使用した。これらのマウスは糖尿病ではないが、機能性ＴおよびＢ細胞を有さないことに留意されたい。全てのマウスは、フィルタートップケージ内で維持し、無菌食および酸性化した水を与えた。全ての実験プロトコルは、Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより承認された。
【００７４】
ヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞精製および追跡
ヒト末梢血ＣＤ３４＋幹細胞を、正常健常成人ドナーから得られた顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）動員アフェレーシス産物から選択した（カタログ番号ｍＰＢ０２６、ＡｌｌＣｅｌｌｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）。簡潔には、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ／日）を連続５日間ドナーに投与し、ＣＤ３４＋細胞を骨髄から末梢循環に動員した。ドナーは、動員された末梢血単核球を収集するために、５日目および６日目にアフェレーシスを受けた。ＣＤ３４＋細胞は、ＩＳＯＬＥＸ３００ｉ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（バージョン２．５、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、機器の取扱説明書に示されたプロトコルに従い、アフェレーシス産物から高濃縮された。精製した細胞を、フローサイトメトリーで特性決定した（下記参照）。濃縮され、選択された細胞を、０．５％ヒト血清アルブミンを含むＲＰＭＩ中で２５℃で維持し、４８時間以内に使用した。生存能力を試験するために、２×１０５個の細胞の一定量を、７−ＡＡＤ（２０μｇ／ｍｌ、２０分、４℃、１００μｌのＰＢＳ中）で標識化し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／５％ＢＳＡ）で洗浄し、次いでフローサイトメトリーで分析した。いくつかの実験において、全身投与後のＨＳＣを追跡するために、ヒトＣＤ３４＋細胞を、１μｇ／１０７細胞を用い、３０分間、２５℃で、１０ｍｌのＲＰＭＩ中で、緑色蛍光トレーサー５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化した。過剰のＣＭＦＤＡを、遠心分離（２５０×ｇ ５分）後、１０ｍｌのＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中５％ＢＳＡ（超純粋）（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させることによりクエンチした。さらなる遠心分離後、細胞を１％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ（１２．５×１０６／ｍｌ）に再懸濁させた。ＣＭＦＤＡ標識化では、７−ＡＡＤを使用して検出された生存能力の変化が見られなかった（図示せず）。
【００７５】
動物モデル
腎臓の虚血−再かん流傷害は、以前に説明されている方法［１］から修正した。簡潔には、０日目に、麻酔下の雄のマウス（８〜１０週齢）の腎臓を、脇腹への外科的切開により露出させ、３６．８〜３７．３℃の中核温度で、片方または両方の腎臓の腎動脈および腎静脈にかけて、外科用クランプを設置した。腎臓が浅黒くなったことを確認し、次いで後腹膜内に２７分間（片側モデル）または２５分間（両側モデル）再配置した。クランプを取り外し、腎臓への再かん流を目視により確認し、創傷を閉じた。ヒトＨＳＣの効果を試験するため、片側ＩＲＩ腎損傷を有するこれらのマウスを、２つの群に分けた。処置群（ｎ＝６〜１０／群）においては、腎損傷後１日目および２日目に、ＣＭＦＤＡで標識化された２．５ ×１０６個のヒトＣＤ３４＋細胞を含有する２００μｌの細胞懸濁液を、尾静脈を通して静脈内注射した。対照群においては、マウスにはビヒクルのみを投与した。腎臓のＩＲＩから３日目、５日目、７日目、１４日目および２８日目にマウスを致死させた。
【００７６】
腎機能
腎機能を評価するために、両側ＩＲＩ腎損傷（０日目）を有するマウスを、無作為に２つの群に分けた。処置群（ｎ＝１０）には、１日目および２日目に、尾静脈からの静脈内注射により２．５×１０６個のヒトＨＳＣを投与した。対照群（ｎ＝１６）には、ビヒクルのみを投与した。以前に説明されている方法［１］を使用して、損傷後１日目、２日目、５日目、７日目、１４日目および２８日目に尾静脈から採取した血液試料から、血漿クレアチニンを分析した。
【００７７】
組織の準備、免疫染色、損傷および修復の画像化および定量化
氷冷ＰＢＳでマウスをかん流し、次いで過ヨウ素酸−リジンパラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）溶液で２時間、続いて１８％ショ糖で１６時間臓器を固定し、次いで最適切断温度（ＯＣＴ）媒体（最適切断温度を確実にし、低温保持装置上で切片化するまで組織を包埋するために、凍結組織に使用される包埋剤）内で保存する（−８０℃）［２］か、または、光学顕微鏡用の組織を１０％中性緩衝ホルマリン内で１２時間固定し、７０％エタノールに移し、次いでパラフィン切片用に加工し（３ｍｍ）、切片を過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）もしくはピクロシリウスレッド染色２で染色した。５ｍｍ低温切片に対し免疫蛍光標識化を行った。腎臓、脾臓および心臓における注入されたヒト細胞を検出するために、マウス抗原に対する交差反応性を有さないヒト白血球抗原に対する抗体を使用するか、またはＣＭＦＤＡの蛍光を使用した（７日目まで）。別途説明されている方法［１、２］を採用し、以下の抗体を使用した：抗ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ）−ＡＢＣ（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ４５（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ラット抗ヒトＣＤ４５（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗ヒトＣＤ６８（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ３（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ３１（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ウサギ抗ヒトｖＷＦ（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗ヒトＣＤ１４６（ＦＩＴＣ、１：１００、Ａｂｃａｍ）、ビオチン抗ヒトＣＤ１３ ３（１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ウサギ抗ヒトＣＤ１３ ３（１：１００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、ヤギ抗ヒトＫＤＲ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびウサギ抗ヒトＫＤＲ（１：１００、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、続いてウサギ抗ＦＩＴＣ（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ラットＣｙ３もしくは抗ウサギＣｙ３もしくは抗ヤギＣｙ３（１：４００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｒｅｓｅａｒｃｈ）、または抗アビジンＣｙ３（１：３０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｒｅｓｅａｒｃｈ）。マウス血管系を標識化するために、ヒト抗原と交差反応しないラット抗マウスＣＤ３１（１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、続いて抗ラットＣｙ３（１：４００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｒｅｓｅａｒｃｈ）を適用した。切片を１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で後固定し、次いでＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ内に入れた。傍尿細管毛細血管喪失および小管損傷は、それぞれ以前に報告されているような盲検的スコア法［３］を使用して、抗ＣＤ３１−Ｃｙ３標識化腎臓切片またはＰＡＳ染色パラフィン切片を評価することにより決定した。簡潔には、皮質および髄質外部を組み込んだ矢状断面全体にわたり順次デジタル画像化（２００倍）により画像を撮像した（１０〜２０画像）。各画像をグリッドにより２５２個の正方形に分割した。傍尿細管毛細血管喪失を計算するために、傍尿細管毛細血管を含まない各正方形を正のスコアとし、最終的なスコアは正のスコアのパーセンテージとして示された。尿細管損傷を評価するために、各正方形の小管損傷の存在（小管の平坦化、壊死、アポトーシスまたは円柱の存在）を正のスコアとした。最終スコアは、画像当たりの正のスコアを有する正方形のパーセンテージであり、これを個々の腎臓からの全ての画像に対して平均化した。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００顕微鏡、ＣｏｏｌＳｎａｐカメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてエピ蛍光画像を撮影し、ＩＰラボソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して処理した。Ｎｉｋｏｎ Ｃ１ Ｄ−Ｅｃｌｉｐｓｅ共焦点顕微鏡を用いて共焦点画像を生成した。投影画像は、０．１ｍｍステップで取得した１０Ｚ−スタック画像から生成した。切片間の比較を可能とするため、含まれる全ての共焦点設定は、切片間で一定に維持した。
【００７８】
フローサイトメトリー分析および選別
以前に説明されている方法［１］を使用して、Ｉｓｏｌｅｘ濃縮ＣＤ３４細胞を、以下のヒト抗体の組み合わせを用いて分析した：抗ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４６−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＫＤＲ−ＦＩＴＣ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４０ｂ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ２９−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１０５−ＦＩＴＣ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ３４−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ９９−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４４−ＰＥ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ３８−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ６４−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ６１−ＰｅｒＣＰ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１３３−ＡＰＣ （１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＣＸＣＲ４−ＡＰＣ （１：１００、ＢＤ）、抗−ＣＤ９０−ＡＰＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１１７−ＡＰＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＶＥＧＦＲ１−ＡＰＣ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。ＨＳＣの完全な特性決定は、別途記述される（Ｄ．Ｍ．＆ Ａ．Ｃ未発表）。以前に説明されているように［２］、腎臓、脾臓および骨髄から単細胞を調製した。簡潔には、腎臓、脾臓および骨髄からの単細胞（１×１０５）を、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ヒトＣＤ４５に対する抗体（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびマウスＣＤ１１ｂに対する抗体（ＰＥ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。注射後２日目のＣＭＦＤＡで標識化したヒトＨＳＣを、ＦＡＣＳａｒｉａを使用してＦＡＣＳ選別により直接選別した［２］。腎臓からの選別されたＣＭＦＤＡ＋細胞をすぐに溶解させ、リアルタイムＰＣＲのために、ＲＮＡ Ｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）システムを使用してＲＮＡ精製した。
【００７９】
リアルタイムＰＣＲ
キット（ＲＮＡ Ｅａｓｙ Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元の取扱説明書に従い、組織および細胞から全ＲＮＡを生成した。純度はＡ２６０からＡ２８０により決定した。ｉＳｃｒｉｐｔ、ならびにランダムヘキサマーおよびｐｏｌｙ ｄＴを含むプライマーを使用して、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した［２］。以前に説明されている方法を使用して［４］、ＡＢＩ７９００ＨＴ配列検出システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、ＳＹＢＲ −Ｇｒｅｅｎ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット；Ｑｉａｇｅｎ）の存在下、ヒトおよびマウス試料のリアルタイムＰＣＲを行った。ヒトＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、アンジオポイエチン１（ＡＮＧＰＴ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、血小板由来成長因子ｂ（ＰＤＧＦｂ）、形質転換成長因子ｂ１（ＴＧＦｂ １）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＴＩＥ１に特異的なプライマー／プローブセットは、Ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製であった。同量のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ反応に使用し、すぐに使用可能な反応ミックス（Ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した。反応は全て、３重で行った。リアルタイムＰＣＲの最適化は、製造元の取扱説明書に従って行った。標準曲線の決定のために、４つのｌｏｇ２ステップで連続的に希釈し、試料に対して並行して行った全ての試料のプールを使用した。各反応の全体積は２０μｌであり、３００ｎＭの順方向プライマーおよび３００ｎＭの逆方向プライマーおよび１２５ｎｇのＤＮＡを含有した。各反応に対して適切な陰性対照を使用した。
【００８０】
統計分析
全ての値は、平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ Ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を使用して、生存率を分析した。２つの群間の比較は、対応のないｔ検定（両側）により行った。対応のあるｔ検定は、偽手術マウスと比較対照した、動物または罹患したマウスの左（ＩＲＩ）と右（対照）の腎臓を直接比較するために使用した。全ての統計試験において、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【００８１】
実施例２
Ｉｓｏｌｅｘ−生成Ｇ−Ｃｓｆ−動員造血幹細胞の特性決定
造血幹細胞動員ヒトドナーからのＣＤ３４＋濃縮白血球を、生存能力および純度について分析した。ＨＳＣの９９％超が、７−ＡＡＤ除外により生存可能であった（図示せず）。白血球の９６％超は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋であり、それらが造血幹細胞（ＨＳＣ）であることを示していた（表１参照）。少数は、ＣＤ３４を発現したがＣＤ４５は発現しなかった。多分化能の確認および推定内皮前駆細胞の同定のために、細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１４６、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２を使用して、濃縮白血球のさらなる特性決定を行った（表２参照）［１９］。特性決定は、ＨＳＣに加えて、動員されたヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞が、少数の循環内皮前駆細胞（ＣＥＰ）および稀に循環する内皮前駆細胞（ＣＥＣ）を含有することを示している。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
実施例３
ヒト造血幹細胞は、虚血再かん流傷害後の修復中に腎臓に動員される
腎臓修復に対するヒトＨＳＣの効果を試験するために、まずそれらが損傷腎臓に動員され得るかどうかを決定した。予備試験において、ＣＭＦＤＡで標識化された２．５×１０６個のＨＳＣの損傷前の静脈内注射は、注射から２４時間後も有意な動員をもたらさなかった（データは示さず）。次に、腎臓ＩＲＩ後１日目および２日目に、ＣＭＦＤＡ標識化ＨＳＣを注射し、損傷後３日目、５日目、７日目に腎臓を観察したところ（図１Ａ、Ｂ）、腎実質部に多くの動員されたＨＳＣを発見することができた。多くは傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）内に局在化していたが、いくつかは、血管周囲の毛細血管境界外で発見された（図１Ｃ）。また、片側ＩＲＩ後、非損傷腎臓に対する小規模ながらも有意なＨＳＣの動員が見られることに気付いた（図１Ｂ）。しかしながら、心臓においてはいかなるＨＳＣも発見することができず（図示せず）、これが非損傷および損傷腎臓へのＨＳＣの特異的な動員であることが示された。経時的にＣＭＦＤＡが希釈される可能性があるという懸念により、損傷後１日目および２日目に、マウスに非標識化ＨＳＣを注射した。これらの非標識化細胞は、ＨＬＡクラスＩに対する抗体により検出された（図１Ｃ、Ｄ）。ＨＬＡ−Ｉ陽性細胞は、全ての時点において腎臓で容易に検出されたが、明らかに、ＩＲＩ後１４日目および２８日目に腎臓内でＨＬＡ−Ｉ＋細胞の持続が見られた（図１Ｄ）。予想したように、ＨＳＣはまた脾臓および骨髄においても確認され（図１Ｅ〜Ｈ）、骨髄においてＨＳＣの持続が見られ、ＩＲＩ後７日目に、骨髄中のＨＳＣが骨髄マーカーＣＤ１１ｂを誘導したという痕跡があり（図１Ｇ）、ＨＳＣがマウス骨髄に植え付けられ、マウスは最終的にキメラとなったことが示唆された。
【００８４】
実施例４
全身ヒト造血幹細胞治療は、死亡率を低減し、虚血再かん流傷害後の腎機能を改善する
損傷腎臓へのＨＳＣ補充が修復中に任意の機能的結果をもたらすかどうかを決定するために、マウスに両側ＩＲＩを施し（０日目）、続いて１日目および２日目にヒトＨＳＣの静脈内注射を行った。偽手術マウスにおいて血漿クレアチニンを検定し（０日目、血漿クレアチニン値は０．０５±０．０６）、またＩＲＩ後１日目、２日目および７日目にも検定した。両側腎臓ＩＲＩは、２４時間で血清中クレアチニンの有意な増加をもたらし、４８時間でピークに達した（図２Ａ）。２４時間（第１の注射時）での血漿クレアチニンレベルは、処置群とビヒクル群とで差はなかったが、ＨＳＣが投与されたマウスにおいては、４８時間で血漿クレアチニンの顕著かつ有意な減少が見られ（図２Ａ）、一方マウスのビヒクル群は、この時点で極めて上昇した血漿クレアチニンレベルを持続した。７日目までに、ビヒクル群および処置群両方の生存したマウスは、同様のレベルの血漿クレアチニンを示した。ＩＲＩモデルは回復モデルであるため、これは驚くべきことではない。しかしながら、ビヒクル群においては、７日目にマウスの５０％しか生存しなかったが（図２Ｂ）、一方ヒトＨＳＣが投与されたマウスの９０％が７日目に生存した（図２Ｂ）。２つの群における生存数は、図２Ｂに示す。これらの驚くべき所見は、ヒトＨＳＣが、腎臓修復／再生を促進するとともに生存率を向上させることを示唆している。
【００８５】
実施例５
ヒト造血幹細胞治療は、腎臓の傍尿細管毛細血管喪失を軽減し、尿細管上皮再生を促進し、虚血再かん流傷害後の長期線維症を予防する
ＨＳＣが腎臓修復を促進する機序を調査するために、傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）の損失および小管損傷の持続について、腎臓切片を分析した（図３）。形態計測によるｍＣＤ３１標識化ＰＴＣの分析では、ＨＳＣ処置が、修復中のＰＴＣ損失を予防することが明らかとなった（図３Ａ〜Ｃ）。しかしながら、明らかに、１４日後および２８日後のＰＣＴ損失に差異はなく、これは、ＰＴＣの再生を促進する内因性の要因が存在するものの、ＨＳＣ治療が血管系の初期喪失を軽減することを示唆している。同様に、ＨＳＣ治療は、このＩＲＩモデルの修復段階における小管損傷の持続を軽減した（図３Ｄ〜Ｆ）。これは、ＨＳＣが小管再生を直接的または間接的に促進していることを示唆している。我々は以前、腎臓ＩＲＩが、慢性腎臓疾患の前兆であり、進行性の長期腎機能喪失と強く関連した、持続性間質性線維症をもたらし得ることを実証している［１４、２０〜２２］。損傷腎臓の修復中のＨＳＣの全身注射が損傷の長期的結果に影響するかどうかを試験するために、間質性線維症を定量化した（図３Ｇ〜Ｉ）。ビヒクル処置マウスにおいて、間質性線維症は、損傷後４週間で徐々に蓄積したが、ＨＳＣが投与されたマウスにおいては、間質性線維症は２８日目までに軽減された。
【００８６】
実施例６
ヒト造血幹細胞は、虚血再かん流傷害後の腎臓において、初期リンパおよび骨髄分化マーカーならびに内皮前駆細胞マーカーを獲得する
ＨＳＣは、骨髄、赤血球、巨核球よびリンパ系細胞の源である。我々は、多くのＨＳＣが損傷後３日目に腎臓に動員されたが、７日目にかけて保持される細胞の数が徐々に減少したこと、しかし、その後、損傷後最大２８日目まで再び増加したことを認めた（図１）。我々は、ヒトリンパおよび骨髄関連マーカーについて腎臓を標識化した（図４）。損傷後３日目という早期に、動員されたＨＳＣの多くがＣＤ６８またはＣＤ３を獲得し、この誘導は、非損傷および損傷腎臓の両方において同様であった（図４）。７日目までに腎臓に動員されたＨＳＣのいずれも単球性の核形態を獲得しなかったが、データは、腎臓内の骨髄およびリンパ系に対する早期の局所的関連があることを示唆している。腎臓におけるヒト細胞の数は、損傷後後期に増加する。ＩＲＩ後１４日目および２８日目の腎臓において、好中球の特徴的な核を有する偶発的ヒト細胞が観察された（図示せず）。これらの所見は、ＢＭキメラ現象の所見と併せて、腎臓におけるヒト細胞の後期の増加が、骨髄キメラ現象を反映するか、または腎臓内の成熟細胞型の局所的分化を反映するかのいずれかを示唆している。
【００８７】
腎臓におけるＨＳＣの局所的分化をさらに調査するために、マーカーＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）、ＣＤ１４６およびＣＤ１３３で標識化された切片、ならびに細胞表面発現を、注射前の幹細胞と比較した（表３）。動員された濃縮ＨＳＣはほとんどＫＤＲまたはＣＤ１４６を発現せず、大多数はＣＤ１３３を発現した。しかしながら、ＩＲＩ後３日目の腎臓において、ほぼ全ての動員されたＨＳＣはＣＤ１４６を発現したが、いずれもＣＤ１３３を発現しなかったことから、表現型の切り替えがあった。動員された濃縮ＨＳＣにおけるＫＤＲの発現は、腎臓に動員されたものと比較して同様であった。ＣＤ１４６はＣＥＰ機能と関連していたため、我々の所見は、腎臓がＣＥＰ型機能へのＨＳＣ分化を促進することを示唆している。
【００８８】
【表３】
実施例７
ヒト造血幹細胞は、主にパラクリン機序により血管修復に寄与する
肉芽形成を支援するＨＳＣのさらなる役割を調査するために、まずＨＳＣが内皮細胞に分化したかどうかを決定した。ＣＤ３１およびヒトｖＷＦに対するヒト特異的抗体、内皮細胞の２つのマーカーを使用して、７日目、１４日目および２８日目であるがそれより早期ではない時点において、損傷腎臓内のヒトＣＤ３１＋細胞を確認した（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。したがって、ＣＤ３１発現は、最大限の修復と一致しなかった。偶発的ＣＤ３１＋ＨＳＣは、ＣＤ４５発現を有さず、ＰＴＣ壁内で発見され、形態は内皮細胞と一致していた（図５Ａ）。しかしながら、ＣＤ３１＋ヒト細胞の大部分はまた、ＣＤ４５を共発現する（図５Ｂ）か、またはリンパ球および単球によるＣＤ３１発現と一致する白血球形態を伴って間質内に存在しており、またヒトＣＤ３１が内皮の特異的マーカーではないことを示していた。抗ヒトｖＷＦ抗体（マウスｖＷＦと交差反応しなかった）を使用した並行試験はまた、ＣＤ４５発現を有さない非常に稀なｖＷＦ＋ヒト細胞を確認し（図５Ｄ）、偶発的ヒト細胞が機能性内皮細胞となる観察結果を裏付けた。これらの調査は、ヒトＣＤ３４＋細胞の直接的毛細血管再生に対するごくわずかな寄与の証拠を提供したにすぎないが、全てのＨＳＣにおけるＣＥＰマーカーＣＤ１４６の顕著な誘導が見られたため（表１）、我々は、ＨＳＣがパラクリン機序により機能しているかどうかを試験した。これは、損傷後の腎臓におけるＨＳＣの血管内および血管周囲の場所を考慮すると、特に制御しやすかった。これをさらに試験するために、我々は、ＩＲＩ後４日目の腎臓に動員されたＣＭＦＤＡ標識化ＨＳＣを精製し、ＲＴ−ＰＣＲによりそのヒト特異的転写プロフィールを分析し、マウスへの全身注射前の同種ＨＳＣの転写プロフィールと比較した。ＨＳＣは、ＡＮＧ−１、ＦＧＦ−２、およびＶＥＧＦ−Ａを含む血管形成促進サイトカインの高レベルの転写物を生成し、さらに、上皮再生における役割が知られている高レベルのＨＧＦを生成した（図６）。驚くべきことに、腎臓に動員されたそれらのＨＳＣは、非常に類似した血管形成促進サイトカインの転写活性を示したが、これは、血管形成におけるパラクリンの役割をさらに支持している。
【００８９】
実施例８
本明細書に示されたデータの考察
ヒトにおける急性腎損傷は、依然として高い死亡率を示すとともに治療の選択肢が限られており、したがって、新たな治療戦略として可能性のある再生手法を特定することが強く望まれている。さらに、ヒトにおける急性腎障害は、臓器不全に至る炎症、血管障害、上皮萎縮、線維症および進行性の機能喪失を特徴とする慢性腎臓疾患の前兆であるという証拠が次々と示されている［２、１４、２２、２３］。腎損傷を軽減する、または修復および再生を向上させる新たな戦略は、短期間の影響を与えるだけでなく、おそらく、腎機能への長期コースを改変すると思われる。慢性腎臓疾患は、心臓血管疾患の独立した危険因子であるであるため［４］、そのような治療の長期的結果は、腎臓疾患だけでなく心臓血管疾患にも影響を与える。最近、成人ヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞およびＨＳＣが、脳卒中および骨損傷後の脈管形成および骨形成を促進することが報告された［１６、２４］。さらに、ＣＤ３４＋細胞は、外部から与えられたＧ−ＣＳＦの存在下で末梢循環に拡大および動員可能であり［２５〜２７］、ＨＳＣを容易に利用可能とし、臨床細胞治療の理論的根拠を支持している。
【００９０】
本研究において、我々は、腎損傷から２４時間後に全身投与されたヒトＨＳＣが、損傷腎臓に選択的に動員され、主に血管内およびその周囲に局在化することを実証した。この動員は、微小血管系／小管上皮細胞の修復の向上、機能回復の向上および生存率の増加を伴い、さらに長期線維症を予防した。ＨＳＣは、腎臓への動員後、腎臓において初期リンパおよび骨髄特定マーカーを誘導し、ＣＥＰマーカーを獲得したが、高レベルの血管形成促進転写物の合成を保持した。精製ＨＳＣは、腎臓への動員前には少数の循環内皮前駆細胞および偶発的循環内皮細胞を含有しており、腎臓に動員されたＨＳＣはＣＥＰ分化に合わせてＣＤ１４６を誘導したが、マウス毛細血管壁内ではヒト内皮細胞はほとんど確認されなかった。総合すると、ＨＳＣ媒介腎臓修復は血管の交代ではなくパラクリン機序によるものであることを、これらのデータは示している（図７）。
【００９１】
ヒトＨＳＣは、片側腎臓ＩＲＩモデルにおいて損傷腎臓に選択的に動員されたが、これは、損傷腎臓が末梢循環中のＨＳＣを選択的に動員することができることを示している。ＩＲＩ後腎臓へのヒトＨＳＣの選択的動員は、ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）を含むケモカインの局所的放出を示唆し、その受容体ＣＸＣＲ４が重要となり得ること、ならびに転写因子低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）が、局所的ケモカイン誘導の調整において役割を担っている可能性があることを示している［２８、２９］。損傷の発生時（０日目）におけるＨＳＣの全身投与ではＨＳＣの動員は良好ではなかったが、修復期の開始時のＨＳＣの遅延投与は、動員を誘発するのに極めて効果的であったことに注目すべきである。この補充パターンは、腎臓への単球流入と類似するが好中球動員とは異なり、追加のモノカインがＨＳＣ動員において役割を担っている可能性があることを示唆している。マウスに対する我々の以前の研究では、単純にＩＲＩに応答した骨髄からの内因性ＨＳＣ動員または腎臓への動員の証拠は得られなかったが、これは、正常な骨髄腔からのＨＳＣの動員のための内因性シグナルが不十分であることを示している［３０］。末梢循環へのＨＳＣの注射が腎臓への効果的な動員をもたらすことから、ＨＳＣ治療は、骨髄腔からの放出における通常の遮断を克服する。また、片側ＩＲＩモデルにおいて、非損傷腎臓にも少数のヒトＨＳＣが動員された。同じマウスの心臓もしくは消化系、または健常マウスの腎臓にはＨＳＣは補充されなかった（図示せず）。片側ＩＲＩに反応して、非損傷腎臓は代償性変化を示すが、肥大および過形成もその一部であった。したがって、非損傷腎臓へのＨＳＣ動員は、血管形成を促進するか、または損傷が存在しない状況で予防的役割を担うと考えられる。
【００９２】
ＨＳＣは、ＨＬＡ−クラス−Ｉ抗原に対する抗体を使用して、ＩＲＩ後１４日目から２８日目に腎臓内に検出された。腎臓内での経時的なＨＳＣ保持の二峰性分布が見られ、約７日目に底部が生じた。我々は、マウスが骨髄キメラ現象を発現し、１４日目および２８日目（但しそれより早期ではない）に、腎臓におけるヒト細胞のいくつかが好中球であることを認めた。したがって、腎臓の修復期の最初の７日目〜１０日目の間、ＨＳＣは幹細胞、初期特定細胞またはＣＥＰのままであり、修復が進行するにつれて徐々に腎臓から消失し、後に、元の全身循環ＨＳＣから得られるのではなく骨髄から動員された成熟白血球に置き換わったと思われる。ＣＤ３１の後期発現を伴う腎臓におけるヒト白血球の後期の増加、およびヒト好中球の出現は、キメラ骨髄からの白血球補充と一致している。しかしながら、我々のデータは、驚くべきことに、疾患の１日目および２日目のＨＳＣ注射が線維症に対し長期的に影響をもたらすことを示している。長期的線維症の低減が初期血管修復の改善を反映するものであるか、または後の時点での腎臓における修復ヒトＨＳＣの持続性集団を反映するものであるかは、これらの現在の研究からは不明である。
【００９３】
腎臓における虚血性傷害は、上皮損傷を特徴とする。傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）喪失は、より十分に説明されていない。しかしながら、重度の急性腎損傷のいくつかのモデル（虚血、毒素、一過性アンジオテンシンＩＩ）から得られたデータは、典型的には著しい線維症の発達に先行する毛細血管喪失を実証しており［１４、１５、３１］、血管形成が、血管構造の保存および臓器機能の復元における中心的プロセスである可能性がある［１２、１３、３２、３３］。また、我々は、これらの研究において、ＩＲＩ後、比較的軽度の腎損傷のみでのＰＴＣの顕著な喪失があること、また、修復中これらのＰＴＣの著しい再生があるものの、損傷後１ヶ月で血管系の持続的喪失があることを示しているが、これは、腎臓は、皮膚等の他の器官と異なり、損傷後の血管再建において固有の欠陥を有することを表している［１４］。我々の研究は、修復中、ＨＳＣが腎臓のＰＴＣ喪失を軽減すること、また、それが腎臓の急速な機能的回復およびマウスの生存率の向上の両方と関連することを明確に示している。我々の片側ＩＲＩモデルにおいて、ＰＴＣのＨＳＣ媒介再生は、２８週目において長期持続ＰＴＣ喪失を軽減しなかったが、それにもかかわらず、両側ＩＲＩモデルにおいて見られる回復および生存率に影響を与えた。これは、腎臓修復における中心的プロセスとしての早期血管修復を示している。ＨＳＣ媒介血管修復の有効性は損傷後早期の時点に限られているが、それでも損傷後１ヶ月目に腎臓における線維症進行が予防される。この早期ＨＳＣ注射の長期的効果が、間質性線維症の発達における中心的相互作用となり得る［３４］周皮細胞−内皮細胞相互作用の向上に起因するかどうかを解明するには、さらなる研究が必要である。予備的試験において、マウスのＩＲＩ後１４日目の腎臓に対するＨＳＣの後期の投与は、良好ではない動員をもたらし、血管修復の向上の証拠はほとんどみられなかったが（図示せず）、ＨＳＣが有効となり得る損傷後期間が限られていることを示している。
【００９４】
腎臓ＩＲＩモデルは、小管上皮細胞、特に、近位小管細胞のＳ３切片の重度の損傷および修復を特徴とするが、ＰＴＣ再生がないと、持続性虚血に起因して、それらの損傷尿細管はうまく再生しない可能性が高い［１４、３５］。我々の研究はまた、小管損傷スコアおよび機能回復により評価されるように、ＨＳＣが上皮再生を促進することを示した。ＨＳＣは、血管形成促進因子の高レベルの転写物を生成し、その腎臓内での場所（血管内および血管周囲）は、血管修復における主要な役割を示唆し、これは二次的に上皮修復を促進する。しかしながら、上皮に対する直接的な修復促進効果を有することが知られるＨＧＦの高レベルの転写物および上皮修復サイトカインＷＮＴ７ｂ（図示せず）（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、原稿提出中）は、ＨＳＣが、ＰＣＴ修復とは独立して、上皮修復に対する直接的なパラクリンの役割を有し得ることを示唆している。
【００９５】
また、ＨＳＣが、腎臓修復において、ＣＤ３＋およびＣＤ６８＋発現を急速に誘導したことは興味深い。損傷後の腎臓においてＴ細胞および単球由来細胞が共に修復的役割を示していることを示す証拠が漸次増加している［３６、３７］。したがって、ＨＳＣは、局所的に修復Ｔ細胞および修復マクロファージに分化することも考えられる。腎臓補充ＨＳＣと末梢血からの成熟Ｔ細胞および単球との間の差異を決定するためには、さらなる研究が必要である［３６、３７］。
【００９６】
成熟内皮細胞を直接形成することによる、内皮再生における循環内皮細胞（ＣＥＣｓ）およびＣＥＰの役割は、重要な研究対象となっている［１８、３８］。事実、我々は以前、マウス骨髄キメラにおいて、腎臓ＩＲＩおよび修復の後、内皮細胞の少数がキメラ骨髄に由来することを報告した［３０］。いくつかの研究において、Ｔｉｅ２は白血球および内皮細胞の両方を標識化するため、上皮細胞になった白血球を検出するためのプロモーターＴｉｅ２の使用は、事後解釈の問題をもたらした［３９］。したがって、ＣＥＰが内皮細胞になるという主張は言い過ぎかもしれない。これらの現在の研究において、我々は一貫して、ほぼ全ての動員されたヒトＨＳＣが共通の白血球マーカーＣＤ４５を保持することを発見したが、これは他の公開データ［１１］と一致している。我々は、ヒト内皮細胞を確認するために内皮マーカーＣＤ３１を使用したが、ＣＤ３１はまたＢ細胞および単球／マクロファージも標識化し［４０］、これらの研究においては、内皮細胞に非特異的であることが証明された。しかしながら、ヒト内皮細胞に一致して、毛細血管壁内に、内皮細胞形態、ＣＤ３１の発現、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）およびＣＤ４５の不在を伴う偶発的細胞が確認された［４１］。我々が最初に行った、精製ＨＳＣの特性決定において、精製ＣＥＣの小集団（＜０．０５％）［３８、４２］、およびＣＥＰの小集団が観察された。ＩＲＩ後腎臓において、ヒトＨＳＣの大部分はＣＥＰマーカーを獲得した。したがって、これらの偶発的ヒト内皮細胞は、ＣＥＰの内皮細胞との細胞融合、稀なＣＥＣの組み込み、またはＣＥＰの分化転換から得られると考えられる。確かに、ヒト内皮細胞の出現は、腎臓ＰＴＣ再生の重要な機序ではなかった。むしろ、我々の研究は、他の研究において報告されているように［１８、２４、４３］、ＣＥＰマーカーを有するＨＳＣおよび修復腎臓に動員されたＨＳＣが、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦ、ＡＮＧ−１、ＩＬ−８、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ−２を含む血管形成因子を分泌することができることを示している。これらのサイトカインは全て、強力な血管形成因子として認識されており、血管形成の増加により腎臓修復を促進し得る［４４〜４６］。腎臓内のＨＳＣの血管内および血管周囲の場所と併せて、我々は、ＨＳＣによる生存率および腎臓修復の両方の主要な機序が、パラクリン機序によるＰＴＣ再生であることを提案する［２４］。
【００９７】
結論として、我々は、本明細書において、全身投与された末梢血動員ヒトＨＳＣが、傍尿細管毛細血管に対するパラクリン機序により、死亡率を低減し、急速な腎臓修復および腎臓の再生を促進することを実証した。これらの所見は、急性腎臓疾患の処置のための有望な治療戦略として、また、慢性腎臓疾患の予防において、ヒトＨＳＣを支持している。
参照文献
実施例１で引用される参照文献
【００９８】
【化１】
本明細書の別の場所で引用される参照文献
【００９９】
【化２】
【０１００】
【化３】
【０１０１】
【化４】
【０１０２】
【化５】
【０１０３】
【化６】
本明細書における組成物または処置の方法に関連する全ての記述はまた、本発明の「使用」を画定すると解釈されるべきである。例えば、本発明は、本明細書に記載の状態を処置するため、または本明細書に記載の治療目標（例えば、治療を必要とするヒトの血糖の低下）を達成するための、サリチル酸源の使用を含む。同様に、本発明はまた、そのような処置／目的のための薬剤の製造のためのサリチル酸源の使用を含む。
【０１０４】
上記の要約は、本発明の全ての態様を画定することを意図せず、追加的態様は、発明を実施するための形態等の他の項に記載されている。文書全体は、統合された開示として関連することを意図し、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章または段落または項において一緒に見出されないとしても、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせが企図されることが理解されるべきである。
【０１０５】
上記に加えて、本発明は、追加的態様として、上で具体的に挙げた変形例よりもなんらかの意味で狭い範囲である、本発明の全ての実施形態を含む。属として記載された本発明の態様に関して、全ての個々の種は、個々に、本発明の別個の態様とみなされる。範囲として記載された態様に関して、全ての部分範囲および個々の値が具体的に企図される。
【０１０６】
出願者（ら）は、本明細書に添付される特許請求の全範囲を発明したが、本明細書に添付される請求項は、それらの範囲に、他者による従来技術の研究を包含することを意図しない。したがって、特許庁または他の団体もしくは個人により、請求項の範囲内の法定従来技術に対して出願人の注意が喚起された場合、出願人（ら）は、該当する特許法の下、そのような法定従来技術または法定従来技術の明らかな変形例を当該請求項の範囲から具体的に除外するために、当該請求項の主題を再定義するという、補正を行う権利を有する。そのような補正請求項により定義された本発明の変形例もまた、本発明の態様として意図される。本発明の追加的特徴および変形例は、本出願の全内容により当業者に明らかとなり、そのような特徴は全て、本発明の態様として意図される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる、２００９年１０月２日出願の米国仮特許出願第６１／２４８，３１６号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、再生のための驚異的な能力を有しているが、急性腎損傷後、または反復性および慢性腎損傷後の慢性腎臓疾患および腎不全は、現在、世界の疾病および死亡の主要原因となっている［１〜３］。さらに、慢性腎臓疾患は、心臓血管疾患および心臓血管系死亡率の主要な独立した危険因子として同定されている［４］。慢性腎疾患は、損傷後の不成功または不十分な腎臓修復を示し得るが、現在、腎臓の修復および再生を促進する治療はほとんどない［５］。
【０００３】
近年、腎臓の傍尿細管微小血管系がますます注目されてきているが、これは、この壊れやすい血管が損傷後正常に再生することができないためである。これは、腎臓の慢性虚血にかかりやすくし［１２〜１５］、慢性腎臓疾患の特徴である、慢性炎症、尿細管萎縮、および間質性線維症の引き金となり得る［１２、１３］。損傷後の傍尿細管毛細血管の再生の失敗は、慢性腎臓疾患への進行の中核となることが示唆されている［１２〜１４］。
【０００４】
骨髄からの幹細胞の修復および血管形成特性に対して大きな関心が向けられており［６〜８］、腎臓疾患のマウスモデルにおけるいくつかの研究は、マウス骨髄間葉間質細胞（ＭＳＣ）が、おそらくはパラクリンまたは全身分泌機序によって、腎損傷を予防または軽減し得ることを示している［６、９、１０］。しかしながら、腎臓修復における造血幹細胞（ＨＳＣ）の可能な血管形成の役割はほとんど探求されておらず、臓器修復および再生を促進するために、細胞治療においてヒトＨＳＣを採集する実行可能性を究明した研究はない［１１］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｅｇｕｉｄ Ｅｌ Ｎａｈａｓ Ａ， Ｂｅｌｌｏ ＡＫ． Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ： ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｌａｎｃｅｔ． Ｊａｎ ２２−２８ ２００５；３６５（９４５６）：３３１−３４０
【非特許文献２】Ｔｈａｄｈａｎｉ Ｒ， Ｐａｓｃｕａｌ Ｍ， Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ ＪＶ． Ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．Ｍａｙ ３０， １９９６；３３４（２２）：１４４８−１４６０
【非特許文献３】Ａｌｉ Ｔ， Ｋｈａｎ Ｉ， Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｗ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ａｐｒ ２００７；１８（４）：１２９２−１２９８
【非特許文献４】Ｗｅｉｎｅｒ ＤＥ， Ｔｉｇｈｉｏｕａｒｔ Ｈ， Ａｍｉｎ ＭＧ， ｅｔ ａｌ．Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｓ ａ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ａｌｌ−ｃａｕｓｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ： ａ ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｍａｙ ２００４；１５（５）：１３０７−１３１５
【非特許文献５】Ｓａｇｒｉｎａｔｉ Ｃ， Ｒｏｎｃｏｎｉ Ｅ， Ｌａｚｚｅｒｉ Ｅ， ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｋｉｄｎｅｙ ｒｅｐａｉｒ： ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．Ｊｕｌ ２００８；１４（７）：２７７−２８５
【非特許文献６】Ｔｏｇｅｌ Ｆ， Ｗｅｉｓｓ Ｋ， Ｙａｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃ， ｐａｒａｃｒｉｎｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｆｕｓｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍａｙ ２００７；２９２（５）：Ｆ１６２６−１６３５
【非特許文献７】Ｌｉ Ｂ， Ｍｏｒｉｏｋａ Ｔ， Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｊａｎ ２００６；６９（２）：３２３−３３０
【非特許文献８】Ｖａｎ Ｈｕｙｅｎ ＪＰ， Ｓｍａｄｊａ ＤＭ， Ｂｒｕｎｅｖａｌ Ｐ， ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｉｓｔａｌ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｌｏｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｅｇ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．Ｊｕｌ ２００８；２１（７）：８３７−８４６
【非特許文献９】Ｂｉ Ｂ， Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｒ， Ｉｓｒａｉｌｏｖａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ａｃｕｔｅ ｔｕｂｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ ｖｉａ ａｎ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｓｅｐ ２００７；１８（９）：２４８６−２４９６
【非特許文献１０】Ｉｍｂｅｒｔｉ Ｂ， Ｍｏｒｉｇｉ Ｍ， Ｔｏｍａｓｏｎｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１ ｓｕｓｔａｉｎｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｎａｌ ｒｅｐａｉｒ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｎｏｖ ２００７；１８（１１）：２９２１−２９２８
【非特許文献１１】Ｄｅｋｅｌ Ｂ， Ｓｈｅｚｅｎ Ｅ， Ｅｖｅｎ−Ｔｏｖ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｎｄ ｇｒｏｗｉｎｇ ｋｉｄｎｅｙｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｍａｙ ２００６；２４（５）：１１８５−１１９３
【非特許文献１２】Ｂａｓｉｌｅ ＤＰ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ａｕｇ ２００８；７４（３）：２５７−２５８
【非特許文献１３】Ｂａｓｉｌｅ ＤＰ．Ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｊｕｌ ２００７；７２（２）：１５１−１５６
【非特許文献１４】Ｂａｓｉｌｅ ＤＰ， Ｄｏｎｏｈｏｅ Ｄ， Ｒｏｅｔｈｅ Ｋ， ｅｔ ａｌ．Ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｎｏｖ ２００１；２８１（５）：Ｆ８８７−８９９
【非特許文献１５】Ｙｕａｎ ＨＴ， Ｌｉ ＸＺ， Ｐｉｔｅｒａ ＪＥ， ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｌｏｓｓ ａｆｔｅｒ ｍｏｕｓｅ ａｃｕｔｅ ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１ ａｌｐｈａ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．Ｄｅｃ ２００３；１６３（６）：２２８９−２３０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当技術分野において、腎損傷の処置のための方法を開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載の研究は、ヒトＣＤ３４＋幹細胞が損傷腎臓に動員され、生存、血管再生および機能回復を促進することを、初めて実証するものである。ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞の、腎臓の修復および再生を促進する能力は、確立されているマウス虚血再かん流傷害モデルを使用して研究された。腎損傷後に例えば全身投与されたヒトＨＳＣは、マウスの損傷腎臓に選択的に動員され、血管内および周囲に顕著に局在化した。この動員は、腎臓微小血管系、小管上皮細胞の修復の向上、機能回復の向上および生存率の増加を伴った。いくつかの場合において、ＨＳＣは、腎臓内の初期骨髄およびリンパ分化マーカーを獲得し、また内皮前駆細胞マーカーの獲得を示したが、腎臓への動員後、高レベルの血管形成促進転写物の合成を維持した。注入された精製ＨＳＣは、少数の循環内皮前駆細胞および偶発的内皮細胞を含有したが、稀なヒト内皮細胞のみがマウス毛細血管壁において同定され、これは、ＨＳＣ媒介腎臓修復が、血管の交代ではなくパラクリン機序によるものであることを示唆している。これらの研究は、ヒトＨＳＣを、損傷後の腎臓修復を促進するための有望な治療戦略として発展させるものである。
【０００８】
したがって、本発明は、患者における腎損傷を処置する方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を患者に投与することを含む方法を提供する。ＨＳＣは、腎損傷を処置するのに効果的な量で患者に投与され、この量は本明細書においてさらに説明される。ある特定の実施形態において、ＨＳＣの投与が遅延される、すなわちＨＳＣは腎損傷の直後に投与されない。本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、腎臓の修復期の開始時に、例えば少なくとも損傷後約１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間で、患者に投与される。さらなる実施形態において、ＨＳＣは、損傷後約２４時間で、またはその後ある程度の時間を置いて、但し損傷後約１４日までに、患者に投与される。ＨＳＣの投与の時間に関するさらなる実施形態は、本明細書において詳説される。
【０００９】
さらに、本明細書において、ＨＳＣの投与を含む関連した方法が提供される。例えば、腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状を予防する方法、腎損傷を有する患者の生存率を増加させる方法、および腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状により引き起こされる、またはそれに伴う、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状を予防する方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるＨＳＣは、薬学的に許容される担体とともに製剤化される。したがって、本発明は、ＨＳＣの集団および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、任意でＨＳＣに結合した、追加的な治療薬または診断薬を含む。そのような薬学的組成物は、治療薬または診断薬を損傷腎臓に送達するために使用され得る。したがって、本発明は、さらに、治療薬または診断薬を患者の損傷腎臓に送達する方法であって、治療薬または診断薬に結合したＨＳＣを患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、細胞の不均一集団を含み、ＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣ）は、集団の細胞の少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％）を構成する。本発明の薬学的組成物のさらなる実施形態およびその使用は、本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト造血幹細胞が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの虚血再かん流障害（ＩＲＩ）後の腎臓、脾臓および骨髄に動員されることを実証する図である。（Ａ）ＩＲＩ後１日目に適合移植ヒトＨＳＣを受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＩＲＩ後３日目の腎臓の代表的共焦点画像であり、マウスＣＤ３１標識化により示された傍尿細管毛細血管におけるＣＭＦＤＡ標識化ヒト細胞（矢印）を示している。（Ｂ）ＩＲＩ後３日目、５日目および７日目の、ＩＲＩ後および対照腎臓において確認されたヒトＨＳＣの数を示すグラフである。（Ｃ）ＩＲＩ後２４時間でヒトＨＳＣで処理されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの７日後のＩＲＩ腎臓のヒトＨＬＡクラスＩ（緑、矢印）を検出する代表的共焦点画像である。（Ｄ）ＩＲＩ後７日目、１４日目および２８日目の、ＩＲＩ後および対照腎臓における切片当たりのヒトＨＬＡクラスＩ細胞の数を示すグラフである。（Ｅ）腎臓ＩＲＩ後１日目に適合移植された、ＩＲＩ後３日目の脾臓におけるＣＭＦＤＡ標識化ヒトＨＳＣの代表的共焦点画像である。（Ｆ）ＩＲＩ後３日目、５日目および７日目の脾臓における、切片当たりのＣＭＦＤＡ陽性細胞の数を示すグラフである。（Ｇ）ＩＲＩ後１日目にヒトＨＳＣを適合移植された腎臓ＩＲＩ後７日目のマウスからの全骨髄のＣＤ１１ｂ（マウスおよびヒト抗原を検出する）およびヒトＣＤ４５の代表的フローサイトメトリープロットである。（Ｈ）１日目および２日目におけるマウス骨ＨＳＣ（Ｅ）におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示すグラフである。（Ｄ）における重度に損傷した小管における顕著な残屑が、（Ｅ）では、はるかに低い程度で存在することに留意されたい。（Ｆ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける尿細管損傷インデックスを示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。（Ｇ〜Ｈ）ＩＲＩ後１日目および２日目にビヒクル（Ｇ）またはＨＳＣ（Ｈ）を受けた、ＩＲＩ後２８日目のシリウスレッド染色腎臓の代表的画像である。（Ｉ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける線維症領域を示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。平均±標準偏差。＊Ｐ＜０．０５、対ビヒクル群。（バー＝５０μｍ）。
【図２】腎臓虚血再かん流障害後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対するヒトＨＳＣの適合移植が、死亡率を減少させ、腎機能を改善することを実証する図である。（Ａ）両側ＩＲＩおよびそれに続く損傷後１日目のＰＢＳ（ビヒクル、ｎ＝１６）または２．５×１０６（ＨＳＣ、ｎ＝１０）のＩＶ注射後の損傷後１日目、２日目および７日目の血漿クレアチニンレベルである。データは、平均±標準偏差である。Ｐ値＜０．０１である。（Ｂ）マウスの、両側ＩＲＩおよびそれに続く損傷後１日目のＰＢＳ（ビヒクル）または２．５×１０６ヒトＨＳＣ（ＨＳＣ）のＩＶ注射後の、生存率曲線および各時点での数である。Ｐ値＝０．０３９である。
【図３】ヒトＨＳＣの適合移植が、傍尿細管毛細血管喪失を軽減し、腎臓虚血再かん流障害後の尿細管上皮損傷を低減することを実証する図である。（Ａ〜Ｂ）１日目および２日目にビヒクル（Ａ）またはＨＳＣ（Ｂ）を受けたＩＲＩ後７日目の腎臓の、髄質外部のマウスＣＤ３１標識化傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）の代表的画像である。（Ａ）における顕著なＰＴＣ損失に留意されたい。（Ｃ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおけるＰＴＣインデックスを示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。（Ｄ〜Ｅ）１日目および２日目にビヒクル（Ｄ）またはＨＳＣ（Ｅ）を受けたマウスからの、ＩＲＩ後５日目の腎臓の髄質外部のＰＡＳ染色腎臓切片の代表的光学画像である。（Ｄ）における重度に損傷した小管における顕著な残屑が、（Ｅ）においてははるかに低い程度で存在することに留意されたい。（Ｆ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける尿細管損傷インデックスを示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。（Ｇ〜Ｈ）ＩＲＩ後１日目および２日目にビヒクル（Ｇ）またはＨＳＣ（Ｈ）を受けた、ＩＲＩ後２８日目のシリウスレッド染色腎臓の代表的画像である。（Ｉ）ビヒクルまたはＨＳＣ後のマウスにおける線維症領域を示すグラフである（時点毎にｎ＝３）。平均±標準偏差。＊Ｐ＜０．０５、対ビヒクル群。（バー＝５０μｍ）。
【図４】腎臓におけるヒトＨＳＣの分化を示す図である。腎臓髄質外部の代表的共焦点画像（Ａ、Ｃ）およびエピ蛍光画像（Ｅ）であり、マウス血管系のｍＣＤ３１（赤）を示すために共に標識化された、損傷後１日目にＨＳＣのＩＶ注射を受けたＩＲＩ後５日目の腎臓における細胞（矢尻）内のヒトＣＤ４５（Ａ）、ヒトＣＤ６８（Ｃ）、およびヒトＣＤ３（Ｅ）の発現を示している。グラフは、ＩＲＩ後腎臓および対照腎臓において確認された、ヒトＣＤ４５（Ｂ）、ヒトＣＤ６８（Ｄ）、およびヒトＣＤ３（Ｆ）細胞の数を示す。データは、平均±標準偏差である。ｎ＝６／時点である。（Ｇ〜Ｈ）ヒトＣＤ１３３（Ｇ）、ＣＤ１４６（Ｈ）およびＫＤＲ（Ｉ）に対する抗体で共に標識化された、ＣＭＦＤＡで１日目〜２日目に標識化された（矢尻）ヒトＨＳＣを受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＩＲＩ後３日目の腎臓の代表的エピ蛍光画像である。抗ＫＤＲ抗体はまた、マウス内皮（矢印）を検出したことに留意されたい（バー＝５０μｍ）。
【図５】稀なヒト内皮細胞が虚血性傷害およびＨＳＣ注入後の腎臓において検出され得ることを実証する図である。（Ａ〜Ｂ）ＩＲＩ後２８日目の腎臓の共焦点画像であり、ヒトＣＤ３１発現細胞の存在を示しており、そのいくつかは毛細血管（矢尻）（Ａ）内に統合されているようだが、大部分は形態学的に単球であり、ｈＣＤ４５を共発現している（矢尻）（Ｂ）。（Ｃ）損傷から１日後のＨＳＣの適合移植後の、ＩＲＩ後の腎臓における経時的なヒトＣＤ３１発現細胞の数を示すグラフである。（Ｄ）ＩＲＩ後腎臓におけるヒトＣＤ４５の発現を示さない細胞における、ヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）であってマウスｖＷＦではない特定の発現（矢尻）（バー＝５０μｍ）。
【図６】ヒトＨＳＣが、腎臓虚血性傷害後の腎臓において、血管形成パラクリン因子を生成することを実証する図である。適合移植前のＨＳＣ（白）および適合移植から４８時間後のＩＲＩ後腎臓から精製されたＨＳＣにおける、血管形成促進転写物のＧＡＰＤＨと比較した、相対的遺伝子発現である。腎臓に動員されたＨＳＣは、血管形成促進転写物の高レベルの発現を保持することに留意されたい。平均±標準偏差。ｎ＝６／群である。（バー＝５０μｍ）。
【図７】損傷後の腎臓の修復における、ＨＳＣの機能のモデルを示す図である。ＨＳＣは、損傷腎臓に動員され、そこでＣＥＰマーカーＣＤ１４６を獲得し、損傷した毛細血管内および間質に局在化する。アンジオポイエチンを含むサイトカイン、血管内皮成長因子、ハプトサイト（ｈａｐｔｏｃｙｔｅ）成長因子およびインスリン様成長因子の局所的産生が生じ、パラクリン機序による細胞修復を促進する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載のデータは、損傷腎臓を有する哺乳動物に対し投与されたＨＳＣの特定の局在化、およびその後の、傍尿細管微小血管系を含むがこれに限定されない損傷腎臓組織の修復を初めて実証するものであり、この修復はＨＳＣにより媒介される。したがって、本発明は、患者における腎損傷を処置する方法であって、腎損傷を処置するのに効果的な量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
「処置」という用語およびそこから派生する用語は、本明細書で使用される場合、必ずしも標的状態の１００％または完全な改善を暗示するものではない。むしろ、当業者が有益であると認識する様々な程度の治療効果が存在する。この点において、本明細書に記載の方法は、腎損傷に対する任意の量または任意のレベルの治療的利益を提供し、したがって損傷を「処置」する。例えば、様々な態様において、腎損傷を処置する方法は、患者の損傷腎臓組織の修復または再生の促進、患者の生存率の増加、腎臓の機能的回復の向上、または腎臓機能の復元のうちの１つ以上を含む。別の態様において、この方法によって提供される処置は、損傷腎臓によりもたらされる１つ以上の状態または症状の改善を含む。例えば、制限されることなく、本明細書に記載の本発明の方法は、腎臓の傍尿細管微小血管系（例えば、傍尿細管毛細血管）の修復または再生の向上、腎臓内の血管（例えば、傍尿細管微小血管系（例えば、傍尿細管毛細血管））の形成もしくは安定化、損傷腎臓内での血管形成の誘導、または小管上皮細胞の修復の向上、腎臓の負のリモデリングの発生の低減のうちの１つ以上を達成する。
【００１５】
腎損傷
本発明の様々な態様において、提供される方法は、虚血、毒素への暴露、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）もしくはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の使用、輸血反応、筋肉への損傷または外傷、手術、ショック、低血圧、または、本明細書においてさらに説明されるようなＡＲＦもしくは慢性腎疾患の原因のいずれかのうちの任意の１つ以上によって引き起こされる、腎臓に対する任意の損傷である、患者の腎損傷の処置を意図する。
【００１６】
標的とする腎損傷は、腎臓内に見られる任意の組織への損傷を含み、例えば、髄質、皮質、腎錐体、葉間動脈、腎動脈、腎静脈、腎門部、腎盂、尿管、小腎杯、腎被膜、下腎被膜、上腎被膜、葉間静脈、腎単位、大腎杯、腎乳頭、糸球体、ボーマン嚢、および腎柱の組織を含むがこれらに限定されず、これらの組織は、部分的または完全な機能喪失をもたらすほど十分損傷を受けている。損傷腎臓組織は、腎臓糸球体壁細胞、腎臓糸球体有足細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体の内皮細胞、腎臓近位小管刷子縁細胞、ヘンレ薄層部分細胞のループ（ｌｏｏｐ ｏｆ Ｈｅｎｌｅ ｔｈｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）、肥厚上行脚細胞、腎臓遠位小管細胞、腎臓集合管細胞、および間質腎細胞を含むがこれらに限定されない、腎臓内で生じ得る異なる細胞型の任意の１つ以上を含む。本発明のある特定の実施形態において、腎損傷は、腎臓の傍尿細管微小血管系への損傷を含む。ある特定の態様において、腎損傷は、傍尿細管毛細血管への損傷を含む。いくつかの態様において、腎損傷は、小管（尿細管）上皮細胞への損傷を含む。
【００１７】
腎疾患および腎臓の病状の予防
腎臓は、自己修復または自己再生のための驚異的な能力を有しているが、腎損傷は、多くの場合、腎疾患または腎臓の病状への傾向につながる。本明細書で提供される、患者の腎損傷の処置方法によれば腎臓の修復および再生の成功が可能であり、その結果、患者における腎疾患または腎臓の病状への傾向が増加しないと理論化されている。したがって、本発明は、さらに、腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状を予防する方法を提供する。この方法は、腎疾患または腎臓の病状を予防するのに効果的な量のＨＳＣを患者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、この量は、腎損傷を処置するのに効果的であり、例えば腎機能の復元、腎臓の傍尿細管微小血管系の再生に効果的な量である。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「予防」という用語およびそこから派生する単語は、必ずしも、１００％または完全な予防を暗示するものではない。むしろ、当業者が潜在的に有益であると認識する様々な程度の予防が存在する。この点において、本明細書に記載の予防方法は、腎疾患または腎臓の病状の任意の量または任意のレベルの予防を提供する。様々な態様において、予防方法は、腎疾患もしくは腎臓の病状、またはその症状もしくは状態の、発症、展開、発生、または進行を、遅延、抑制、低減、または軽減する方法である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、予防される腎疾患または腎臓の病状は、急性腎不全、慢性腎臓疾患、腎間質線維症、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、水腎症、間質性腎炎、腎臓結石（腎結石症）、腎腫瘍（例えば、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌）、ループス腎炎、微小変化型疾患、ネフローゼ症候群、腎盂腎炎、腎不全（例えば、急性腎不全および慢性腎疾患以外）である。
【００２０】
急性腎不全
「急性腎不全」という用語は、本明細書で使用される場合、「急性腎損傷」または「ＡＲＦ」と同義であり、腎臓への損傷による腎機能の急速な損失を指す。ＡＲＦは、通常は腎臓により排泄される窒素性（例えば、血清中クレアチンおよび／または尿排出）ならびに非窒素性廃棄物生成のレベルの急激な変化により特徴付けられる。ＡＲＦの症状および診断は、当技術分野において知られている。例えば、Ａｃｕｔｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ， Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５６， ｖｏｌ．ｅｄｓ．Ｒｏｎｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｋａｒｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， ２００７およびＢｅｌｌｏｍｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ８（４）： Ｒ２０４−Ｒ２１２， ２００４を参照されたい。
【００２１】
様々な態様において、ＡＲＦは、病因に依存して、腎前性ＡＲＦ、内因性ＡＲＦ、または腎後性ＡＲＦである。この点において、腎前性ＡＲＦは、血液量減少（例えば、ショック、脱水、体液喪失、または過度の利尿薬の使用）、肝腎症候群、血管障害（例えば、ネフローゼ症候群に関連した、アテローム塞栓性疾患、腎静脈血栓症）、感染症（例えば、敗血症）、重度の熱傷、腐骨形成（例えば、心膜炎、膵臓炎による）、低血圧症（例えば、抗高血圧症、血管拡張剤の使用による）のうちの１つ以上により引き起こされ得る。
【００２２】
内因性ＡＲＦは、毒素または薬剤（例えば、ＮＳＡＩＤ、アミノ配糖体系抗生物質、ヨード造影剤、リチウム、ホスフェート腎症（例えば、結腸鏡検査におけるリン酸ナトリウムによる腸の前処理）、横紋筋融解（例えば、損傷（例えば、挫滅外傷または広範囲の鈍的外傷）により引き起こされる）、スタチン、興奮剤の使用により引き起こされる）、溶血、多発性骨髄腫、急性糸球体腎炎のうちの１つ以上により引き起こされ得る。
【００２３】
腎後性ＡＲＦは、薬剤（例えば、抗コリン作用薬）、良性の前立腺肥大症もしくは前立腺癌、腎臓結石、腹部悪性腫瘍（例えば、卵巣癌、結腸直腸癌）、導尿カテーテル閉塞、および結晶尿もしくはミオグロビン尿を引き起こす薬物、または膀胱炎のうちの１つにより引き起こされ得る。
【００２４】
ＡＲＦは、患者における虚血、毒素、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の使用、輸血反応、筋肉に対する損傷または外傷、手術、ショック、および低血圧により引き起こされ得る。ＡＲＦを引き起こす毒素は、抗真菌剤またはＸ線写真用の染料であり得る。また、いくつかの実施形態において、ＡＲＦは、急性腎尿細管壊死または腎虚血再かん流傷害を含む。
【００２５】
慢性腎臓疾患
腎疾患または腎臓の病状を予防する方法のいくつかの実施形態において、腎疾患は、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）である。本明細書において使用される場合、「慢性腎疾患」としても知られる「慢性腎臓疾患」は、何ヶ月または何年もの期間にわたる進行性の腎機能喪失を指す。処置されるＣＫＤは、例えば、第１期、第２期、第３期、第４期または第５期（確立されたＣＫＤ、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、慢性腎機能障害（ＣＫＦ）、または慢性腎不全（ＣＲＦ）としても知られる）を含む、任意の段階である。
【００２６】
ＣＫＤは、急性腎損傷、急性腎損傷の病因、糖尿病性ネフロパシーにつながる１型および２型糖尿病、高血圧（高血圧症）、糸球体腎炎（腎臓の濾過系の炎症および損傷）、多発性嚢胞腎、鎮痛薬性腎症につながる鎮痛薬（例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェン）の使用（例えば、常用および長期間の使用）、虚血性ネフロパシーにつながるアテローム性動脈硬化、石による尿の流れの阻害、前立腺肥大、狭窄症（狭窄）、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球病、ヘロインの乱用、アミロイドーシス、腎臓結石、慢性腎感染、およびある特定の癌を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子のうちのいずれか１つにより引き起こされ得る。
【００２７】
腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状の予防
慢性腎臓疾患は、心臓血管疾患および心臓血管系死亡率の主要な独立した危険因子として同定されている。本明細書に記載のようなＨＳＣの投与は、さらに、腎臓疾患および腎臓の病状以外の疾患または病状を予防するのに有用であることが理論付けられる。したがって、腎損傷を有する患者における、腎疾患または腎臓の病状により引き起こされる、またはそれに関連した、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状を予防する方法が、本明細書においてさらに提供される。この方法は、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状を予防するのに効果的な量のＨＳＣを患者に投与することを含む。ある特定の実施形態において、腎臓以外の疾患または腎臓以外の病状は、心臓血管疾患である。
【００２８】
生存率の増加
急性腎損傷後、または反復性および慢性の腎損傷後の慢性腎臓疾患および腎不全は、現在、世界の疾病および死亡の主要原因となっている。本明細書に記載のようなＨＳＣの投与は、さらに、腎損傷を有する患者の死亡を予防する（生存率を増加させる）のに有用であることが理論付けられている。したがって、腎損傷を有する患者の生存率を増加させる方法が、本明細書においてさらに提供される。この方法は、患者の生存率を増加させるのに効果的な量のＨＳＣを患者に投与することを含む。
【００２９】
造血幹細胞（ＨＳＣ）
本明細書の目的において、「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、例えば、骨髄性（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、樹枝状細胞）およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）を含む血液細胞型を生成する多能性幹細胞を指す。ＨＳＣは、多能性、少機能性、または単機能性ＨＳＣであってもよい。
【００３０】
ＨＳＣを得る方法およびＨＳＣ源
ＨＳＣは、当技術分野において知られた任意の手段により得ることができる。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、ドナーから単離される。「単離」という用語は、本明細書において使用される場合、その自然環境から取り出されたことを意味する。ＨＳＣは、様々な態様において、骨髄、脂肪組織、血液、卵黄嚢、骨髄組織（例えば、肝臓、脾臓、胎児、例えば胎児肝臓、胎児脾臓における）、臍帯血、胎盤、および大動脈・性腺・中腎を含むがこれらに限定されない、ＨＳＣを有する任意の成人、胎児または胚組織から単離される。
【００３１】
ＨＳＣのドナーは、患者に関して本明細書に記載される宿主のいずれかである。いくつかの態様において、ドナーは哺乳動物である。特定の態様において、ドナーはヒトである。他の態様において、ＨＳＣのドナーは、患者と同じである。この点において、ＨＳＣは、患者の「自己」細胞であるとされる。いくつかの実施形態において、ＨＳＣのドナーは、患者とは異なるが、ドナーおよび患者は同じ種である。この点において、ＨＳＣは、患者の「同種異系」細胞であるとされる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、ドナーの骨髄、例えばドナーの腰から、注射器および針を使用して単離される。別の実施形態において、ＨＳＣは、血液（例えば、末梢血）から単離される。ある特定の態様において、ＨＳＣは、骨髄から血液、例えば末梢血へのＨＳＣの移動を誘導または促進するサイトカインによるドナーの前処理後に、血液から単離される。いくつかの場合において、サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはＡＭＤ−３１００である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、初代細胞または新たに単離された細胞である。あるいは、ＨＳＣは、培養細胞、樹立細胞株からの細胞、および／またはＨＳＣの凍結ストックから解凍した細胞である。ＨＳＣは、細胞レポジトリから、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＮＳＣＲ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、および他の商業的供給者から入手可能である。
【００３４】
他の態様において、ＨＳＣの特定の集団を得るためのさらなるステップが実行される。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは精製される。本明細書において使用される場合、「精製」という用語は、純度が増加したことを意味し、「純度」とは、相対的用語であり、必ずしも絶対的な純粋さとして解釈されるべきではない。例えば、様々な態様において、純度は、少なくとも約５０％であるが、６０％、７０％もしくは８０％超であってもよく、または１００％であってもよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＨＳＣは、細胞の異種集団の一部、または実質的に同種の細胞集団の一部である。例えば、いくつかの態様において、ＨＳＣは、ＨＳＣのクローン集団であり、集団の各細胞は、集団の別の細胞から遺伝子的に区別できない。細胞の異種集団は、他の細胞型、ＨＳＣ以外の細胞を含む。例えば、いくつかの態様において、細胞の異種集団は、ＨＳＣに加えて、白血球（骨髄細胞系またはリンパ系の白血球）、赤血球、内皮細胞、循環内皮前駆細胞、上皮細胞、腎細胞、肺細胞、骨細胞、骨髄球、神経細胞、平滑筋細胞を含む。代替的に、または追加的に、細胞の異種集団は、ＨＳＣのみを含むが、ＨＳＣは、クローン細胞ではなく、例えば互いから遺伝子的に区別できる。異種集団のＨＳＣは、本明細書においてさらに論じられるように、異なる表現型を有する。特定の表現型を有する細胞、例えばＨＳＣを単離する好適な方法は、当技術分野において知られており、例えば、光学的流動選別器を使用する方法（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））および非光学的流動選別器を使用する方法（例えば、磁気活性化細胞選別）を含む。
【００３５】
ＨＳＣにより発現されるマーカー
ＨＳＣは、ＨＳＣの任意の表現型特性を有する。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、系統マーカー（の発現）に対して陰性（すなわち、ｌｉｎ−）である。いくつかの場合において、ＨＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、およびｃ−ｋｉｔのうちの１つ以上（の発現）に対して陽性である。いくつかの場合において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋であり、他の場合において、ＨＳＣは、ＣＤ４５＋である。さらに別の態様において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋である。ある特定の実施形態において、ＨＳＣの表現型は、患者に投与されると変化する。したがって、いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、マーカー、例えば循環内皮前駆細胞（ＣＥＰ）マーカー（ＣＥＰ上に発現するマーカー、例えばＣＤ１４６、ＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ３１）の発現に対して陽性となるＨＳＣである。
【００３６】
ＨＳＣは、任意で、異種細胞集団の一部であり、集団内の細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、特定の表現型を有する。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞の異種集団の一部であり、細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ３４＋ＨＳＣである。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞の異種集団の一部であり、細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、ＣＤ４５＋ＨＳＣである。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞の異種集団の一部であり、細胞の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）は、患者への投与後にＣＤ１４６＋ＨＳＣになるＨＳＣである。
【００３７】
ＨＳＣのさらなる改質ステップ
いくつかの態様において、ＨＳＣは、単離および／または精製後にさらに改質される。一代替例において、細胞は、ＨＳＣ集団の拡張、ＨＳＣへの遺伝子の送達、ＨＳＣの分化、または、治療薬もしくは診断薬等の化合物のＨＳＣへの結合を目的として、生体外で培養される。これらのさらなるステップを実行する方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００１；Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８１： ２８４４−２８５３ （１９９３）；米国特許第７，１４４，７３１号；Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ＦＡＳＥＢ Ｊ １５： ５８６ （２００１）；Ｎｏｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３５（４）： ６５３−６６１ （２００７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ａｎｄ Ｃｏｓｓｅｔ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ： Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ， ｅｄｓ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００７を参照されたい。
【００３８】
薬学的組成物
本明細書に記載のＨＳＣは、任意で、薬学的組成物等の組成物に製剤化される。この点において、本発明は、ＨＳＣおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。担体は、従来使用されている任意の担体であり、溶解度および活性化合物（複数を含む）との反応性の欠如等の物理化学的考慮点、ならびに投与経路によってのみ制限される。本明細書に記載の薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、および希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に利用可能である。一態様において、薬学的に許容される担体は、活性薬剤（複数を含む）、例えば造血幹細胞に対して化学的に不活性である担体、および使用条件下で有害な副作用または毒性を有さない担体である。担体の選択は、部分的に、薬学的組成物を成す特定の薬剤により、および薬学的組成物を投与するために使用される特定の経路により決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の好適な製剤が種々存在する。
【００３９】
投与経路
いくつかの実施形態において、ＨＳＣを含む薬学的組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、くも膜下投与、または腹腔内投与用に製剤化される。他の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内、スプレー、口内、エアロゾル、直腸内、または膣内投与により投与される。
【００４０】
ＨＳＣを投与する方法は、当技術分野において知られている。例えば、米国特許第５４２３７７８号、第５５５００５０号、第５６６２８９５号、第５８００８２８号、第５８００８２９号、第５８１１４０７号、第５８３３９７９号、第５８３４００１号、第５８３４０２９号、第５８５３７１７号、第５８５５６１９号、第５９０６８２７号、第６００８０３５号、第６０１２４５０号、第６０４９０２６号、第６０８３５２３号、第６２０６９１４号、第６３０３１３６号、第６３０６４２４号、第６３２２８０４号、第６３５２５５５号、第６３６８６１２号、第６４７９２８３号、第６５１４５２２号、第６５３４０５２号、第６５４１０２４号、第６５５１３３８号、第６５５１６１８号、第６５６９１４７号、第６５７９３１３号、第６５９９２７４号、第６６０７５０１号、第６６３０４５７号、第６６４８８４９号、第６６５９９５０号、第６６９２７３８号、第６６９９４７１号、第６７３６７９９号、第６７５２８３４号、第６７５８８２８号、第６７８７３５７号、第６７９０４５５号、第６８０５８６０号、第６８５２５３４号、第６８６３９００号、第６８７５４４１号、第６８８１２２６号、第６８８４４２７号、第６８８４４２８号、第６８８６５６８号、第６９１８８６９号、第６９３３２８１号、第６９３３２８６号、第６９４９５９０号、第６９６０３５１号、第７０１１８２８号、第７０３１７７５号、第７０３３３４５号、第７０３３６０３号、第７０４９３４８号、第７０７０５８２号、第７０７４２３９号、第７０９７８３２号、第７０９７８３３号、第７１３５１７２号、第７１４５０５５号、第７１５７０８０号、第７１６６２８０号、第７１７６２５６号、第７２４４２４２号、第７４５２５３２号、第７４７０４２５号、および第７４９４６４４号を参照されたい。
【００４１】
非経口
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、非経口投与用に製剤化される。本発明の目的において、非経口投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、脳内、脳室内、心臓内、皮下、骨内、皮内、くも膜下、腹腔内、膀胱内、および陰茎海綿体内注射または注入を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
非経口投与に好適な製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を対象被投与者の血液と等張性にする溶質を含有し得る、水性および非水性等張性滅菌注射液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存料を含み得る、水性および非水性滅菌懸濁液を含む。様々な態様において、薬学的組成物は、水、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連糖溶液、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコール、グリセロール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、または石鹸もしくは洗剤等の薬学的に許容される界面活性剤を添加した、または添加しないアセチル化脂肪酸グリセリド、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース等の懸濁剤、あるいは、乳化剤および他の薬学的アジュバントを含む、滅菌液体または複数の液体の混合など、薬学的担体中の生理学的に許容される希釈剤により投与される。
【００４３】
非経口製剤において任意で使用される油は、石油、動物油、植物油、または合成油を含む。油の特定の例には、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン、およびミネラルオイルが含まれる。非経口製剤における使用に好適な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルが、好適な脂肪酸エステルの例である。
【００４４】
いくつかの実施形態における非経口製剤は、保存料または緩衝剤を含有する。注射部位における刺激を最小限化または排除するためには、そのような組成物は、任意で、約１２から約１７の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有する。そのような製剤中の界面活性剤の量は、典型的には、約５重量％から約１５重量％の範囲内である。好適な界面活性剤は、ソルビタンモノオレエート等のポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、および、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合により形成される、エチレンオキシドの疎水性塩基との高分子量付加体を含む。様々な態様において、非経口製剤は、単位用量または複数用量の密閉容器内、例えばアンプルおよびバイアル内に提供され、使用直前に注射用の水等の滅菌液体賦形剤を添加するだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。ある特定の態様において、上述のような無菌粉末、顆粒、および錠剤から、即席の注射液および懸濁液が調製される。
【００４５】
注射製剤は、本明細書に従う。注射組成物用の効果的な薬学的担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ， ｅｄｓ．， ｐａｇｅｓ ２３８−２５０ （１９８２）、およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ， Ｔｏｉｓｓｅｌ， ４ｔｈ ｅｄ．， ｐａｇｅｓ ６２２−６３０ （１９８６）を参照されたい）。
【００４６】
細胞送達マトリックス
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、細胞送達マトリックスにより投与される。ある特定の実施形態において、細胞送達マトリックスは、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ポリエチレングリコール、化学架橋性または光架橋性デキストランを含むデキストラン等を含むポリマーおよびヒドロゲルのうちのいずれか１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、細胞送達マトリックスは、収縮および非収縮コラーゲンゲルを含むコラーゲン、例えばフィブリンを含むがこれらに限定されないヒドロゲル、アルギン酸塩、アガロース、ゼラチン、ヒアルロン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、化学架橋、光架橋もしくはその両方に好適なデキストランを含むデキストラン、アルブミン、ポリアクリルアミド、ポリグリコール酸、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ（ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、親水性ポリウレタン、アクリル誘導体、プルロニック、例えばポリプロピレンオキシドおよびポリエチレンオキシドコポリマー、３５／６５ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、Ｐａｎａｃｒｙｌ（登録商標）生体吸収性コンストラクト、Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）ポリグラクチン９１０、ならびに自己組織化ペプチドおよびフッ素ポリマーのような非吸収性材料（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フッ素ポリマー）、プラスチックおよび金属のうちの１つ以上を含む。
【００４７】
いくつかの場合において、マトリックスは、非分解性材料、例えば、これらに限定されないが、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ（ブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、シリコーン等、または、選択的に分解性の材料、例えばポリ（乳酸−コ−グリコール酸；ＰＬＧＡ）、ＰＬＡ、もしくはＰＧＡを含む（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１：２３３５ ２３４６， ２０００；Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｍａｒｃｈ／ Ａｐｒｉｌ １９９８、３０ ３７ページ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｄｏｍｂ， Ｋｏｓｔ， ａｎｄ Ｄｏｍｂ， ｅｄｓ．， １９９７， Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ； Ｒｏｇａｌｌａ， Ｍｉｎｉｍ．Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｓｕｒｇ．Ｎｕｒｓ．１１：６７６９， １９９７；Ｋｌｅｉｎ， Ｆａｃｉａｌ Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．９：２０５ １８， ２００１；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１ １：３３７ ３９， １９８；Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５４：８１２ １５， １９９５；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ４３：４２２ ２７， １９９８、およびＫｕｉｊｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ５１：１３６４５， ２０００もまた参照されたい）。
【００４８】
いくつかの実施形態において、マトリックスは、生体吸収性であるか否か、液体、ゲル、または固体であるかを問わず、生体適合性の骨格、格子、自己組織化構造等を含む。そのようなマトリックスは、治療的細胞処置、外科的修復、再生医療、および創傷治癒の分野において既知である。ある特定の態様において、マトリックスは、ＨＳＣで前処理される。他の実施形態において、マトリックスには、マトリックスまたはその空間に密接に関連してＨＳＣが配置される。ＨＳＣは、マトリックスに接着することができ、または、マトリックス空間内に捕捉または含有され得る。ある特定の態様において、マトリックス−ＨＳＣ複合物が生成し、細胞がマトリックスと密接に関連して成長し、治療上使用された場合には、患者自身の腎細胞の成長、修復および／または再生が刺激されおよび支援され、適切な血管形成が同様に刺激されまたは支援される。マトリックス−細胞組成物は、移植、注射、外科的付着、他の組織による移植等を含むがこれらに限定されない、当技術分野において知られた任意の手法で患者の体内に導入され得る。いくつかの実施形態において、マトリックスは、生体内で、またはさらにより好ましくはｉｎ ｓｉｔｕで形成され、例えば、本発明に従いｉｎ ｓｉｔｕ重合性ゲルを使用することができる。そのようなゲルの例は、当技術分野等において知られている。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、三次元フレームワークまたはマトリックス、例えば骨格、発泡体またはヒドロゲル等の上に播種され、適宜投与される。ある特定の態様において、フレームワークは、実質的に平坦、実質的に円筒状または管状等、様々な形状に構成されるか、または、考慮される矯正的構造に必要とされ得る、または所望され得るように、完全に自由形態であってもよい。いくつかの態様において、多層フレームワークを生成するように、２つ以上の実質的に平坦なフレームワークが重ねて配置され、必要に応じて互いに固定される。
【００５０】
本発明の態様に使用され得るマトリックス、例えば骨格の例は、マット（織られた、編まれた、より好ましくは不織の）、多孔質または半多孔質発泡体、自己組織化ペプチド等を含む。不織マットは、例えば、天然または合成ポリマーを含む繊維を使用して形成され得る。いくつかの実施形態において、ＶＩＣＲＹＬ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）の商品名で販売されているグリコール酸および乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の吸収性コポリマーを使用して、マットが形成される。例えば、米国特許第６，３５５，６９９号に記載のようにフリーズドライまたは凍結乾燥等のプロセスにより形成される、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーで構成される発泡体もまた、骨格として機能し得る。ゲルもまた、本明細書において使用されるような好適なマトリックスを形成する。例として、ｉｎ ｓｉｔｕ重合性ゲル、および、例えば自己組織化ペプチドで構成されるヒドロゲルが含まれる。いくつかの態様において、これらの材料は、組織成長の支持体として使用される。ｉｎ ｓｉｔｕ形成分解性ネットワークもまた、本発明における使用に好適である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ， Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８： １９９−２０９、Ｗａｎｇ， Ｄ．ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４： ３９６９−３９８０；Ｈｅらに対する米国特許公開第２００２／００２２６７６号を参照されたい）。これらの材料は、いくつかの態様において、注射に好適な流体として製剤化され、次いで、ｉｎ ｓｉｔｕまたは生体内で分解性ヒドロゲルネットワークを形成するために、様々な手段（例えば、温度変化、ｐＨ、光への暴露）により導入され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、フレームワークはフェルトであり、生体吸収性材料、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から作製されたマルチフィラメント糸で構成され得る。ある特定の態様において、糸は、圧着、切断、梳綿および縫製からなる標準的な繊維加工技術を用いてフェルトに加工される。ある特定の態様において、ＨＳＣは、複合構造であってもよい発泡骨格上に播種される。さらに、いくつかの態様において、三次元フレームワークが有用な形状、例えば、修復され、交換されまたは増強される腎臓内またはその周囲の特定の構造に成形される。
【００５２】
フレームワークは、細胞付着を高めるために、ＨＳＣの接種前に処理され得る。例えば、ＨＳＣでの接種前に、ナイロンマトリックスが０．１モルの酢酸で処理され、ポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン内でインキュベートしてナイロンをコーティングする。いくつかの態様において、ポリスチレンが硫酸を使用して同様に処理される。
【００５３】
追加の実施形態において、三次元フレームワークの外側表面は、例えば、フレームワークのプラズマコーティングにより、または１つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリンサルフェート、コンドロイチン−４−サルフェート、コンドロイチン−６−サルフェート、デルマタンサルフェート、ケラチンサルフェート）、細胞マトリックス、ならびに／もしくは他の材料、例えば、特に、これらに限定されないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、および植物ゴム等の付加により、細胞の付着または成長および組織の分化を改善するために改質される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、骨格は、骨格を抗血栓性とする材料を含む。ある特定の実施形態において、これらの材料は、内皮成長、移動、および細胞外マトリックス堆積を促進および保持する。そのような材料の例には、天然材料、例えばラミニンおよびＩＶ型コラーゲン等の基底膜タンパク質、ｅＰＴＦＥ等の合成材料、およびセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えばＰＵＲＳＰＡＮ（登録商標）（Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれるが、これらに限定されない。これらの材料は、骨格を抗血栓性とするためにさらに処理され得る。そのような処理は、ヘパリン等の抗血栓剤、およびプラズマコーティング等の材料の表面電荷を改変する処理を含む。
【００５５】
ある特定の実施形態において、ＨＳＣを含む薬学的組成物は、本明細書に記載の成分のいずれかを含む、細胞送達マトリックスの成分のいずれかを含む。
【００５６】
用量
本明細書の目的において、投与される薬学的組成物の量または用量は、例えば、妥当な期間にわたり、対象または動物において治療または予防的反応をもたらすのに十分である。例えば、薬学的組成物の用量は、投与時から、約１日から４日またはそれ以上、例えば５日、６日、１週間、１０日、２週間、１６日から２０日、またはそれ以上の期間、腎虚血再かん流傷害を処置または予防するのに十分である。ある特定の実施形態において、期間はそれよりさらに長い。用量は、特定の薬学的組成物の有効性および処置される動物（例えばヒト）の状態、ならびに動物（例えばヒト）の体重により決定される。
【００５７】
投与用量を決定するための多くのアッセイが、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、所与の用量のＨＳＣを哺乳動物に投与した後、そのようなＨＳＣが損傷腎臓に局在化する程度を、それぞれ所与の異なる用量のＨＳＣが与えられる一組の哺乳動物の間で比較することを含む検定を使用して、哺乳動物に投与される開始用量が決定される。ある特定用量が投与された後にＨＳＣが損傷腎臓に局在化する程度は、例えば本明細書に記載の方法を含む当技術分野において知られた方法により検定することができる。
【００５８】
追加的または代替的に、特定用量のＨＳＣが、腎臓の傍尿細管毛細血管喪失の軽減、尿細管上皮細胞の再生、長期線維症の予防、死亡率の低減、または腎損傷後の腎機能の改善をもたらす程度を比較することを含む検定を使用して、哺乳動物に投与される開始用量を決定することができる。そのような検定は、本明細書の実施例の項に記載される。
【００５９】
薬学的組成物の用量はまた、特定の薬学的組成物の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質および程度により決定される。典型的には、担当医は、年齢、体重、全体的な健康、食生活、性別、投与される薬学的組成物の治療薬（複数を含む）、投与経路、および処置される状態の重症度等の様々な因子を考慮して、個々の患者を処置するための薬学的組成物の用量を決定する。例えば、本発明を制限することを意図せずに、薬学的組成物の用量は、少なくとも約０．５×１０６（例えば、少なくとも約１×１０６、１．５×１０６、２×１０６、２．５×１０６、３．０×１０６、５．０×１０６、１０７、１０８）個のＨＳＣが、患者に投与されるような用量となり得る。
【００６０】
投与のタイミング
提供される方法において、ＨＳＣは、腎臓への損傷の時間に関連した時間に患者に投与される。本発明のある特定の実施形態において、ＨＳＣの投与は遅延され、すなわち、ＨＳＣは、腎損傷の直後に投与されない（例えば、損傷後約３０分以降、約１時間以降、約２時間以降、約３時間以降、約４時間以降、約５時間以降、約６時間以降、約７時間以降、約８時間以降、約９時間以降、約１０時間以降、約１１時間以降、または約１２時間以降）。
【００６１】
本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、腎損傷の修復期の開始時に、患者に投与される。「腎損傷の修復期」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、細胞が破壊された後の既存の腎単位の再配置、好塩基性扁平上皮細胞による小管の被膜、小管細胞の正常形態の復元、上皮細胞の分化、移動、増殖または再分化、腎単位の機能的完全性の復元、腎機能の復元等により示される、腎臓再生反応が観察される損傷後の時点を指す。腎臓の修復期は、哺乳動物について十分に記述されている。例えば、Ｒｅｉｍｓｃｈｕｅｓｓｅｌ， ＩＬＡＲ Ｊ ４２： ２８５−２９１ （２００１）を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、損傷後少なくとも約１２時間（例えば、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約５２時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約５６時間、少なくとも約５８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６２時間、少なくとも約６４時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約６８時間、少なくとも約７０時間、少なくとも約７２時間）で投与される。
【００６２】
さらなる実施形態において、ＨＳＣは、損傷後、上述のような時点で、および約１４日目まで（例えば、約１３日目まで、約１２日目まで、約１１日目まで、約１０日目まで、約９日目まで、約８日目まで、約７日目まで、約６日目まで、約５日目まで、約４日目まで、約３日目まで）に患者に投与される。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、損傷後約２４時間で、またはその後ある程度の時間を置いて、但し損傷後約１４日目までに、患者に投与される。
【００６３】
いくつかの態様において、ＨＳＣは、損傷後Ｘの後および損傷後Ｙの前までに投与され、ここでＸは、約２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、４０時間、４８時間、５２時間、５８時間、６４時間、７２時間、３．５日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日からなる群から選択され、Ｙは、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、１週間からなる群から選択され、ＸはＹより小さい。本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、損傷後約２０、２１、２２、２３、２４時間で投与される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＣは、２回以上患者に投与される。ＨＳＣは、１日１回、１日２回、１日３回、４回、１週間に１回、２日、３日、４日、５日、６日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日もしくは１４日ごとに１回、または１ヶ月に１回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、損傷後約２４時間（例えば２４時間）後に投与され、損傷後約４８時間（例えば４８時間）後に再び投与される。
【００６５】
制御放出製剤
ある特定の態様において、薬学的組成物は、薬学的組成物が投与される体内に放出される様式が、時間および体内の場所に関して制御されるように、デポー剤形に修正される（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。様々な態様において、デポー剤形は、治療または活性薬剤（複数を含む）および多孔質または非多孔質材料、例えばポリマーを含む埋め込み型組成物であり、ＨＳＣは、材料によりカプセル化されているか、または材料全体に拡散しているか、および／または非多孔質材料の分解物である。次いで、デポー剤形は体内の所望の場所に埋め込まれ、ＨＳＣが所定の速度でインプラントから放出される。
【００６６】
したがって、ある特定の態様において、薬学的組成物は、任意の種類の生体内放出プロファイルを有するように修正される。本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、徐放出、遅延放出、または二相放出製剤である。
【００６７】
複合体
本発明のいくつかの態様において、ＨＳＣは、第２の部分、例えば、治療薬または診断薬等に付着または連結される。ＨＳＣは損傷した腎組織に特異的に局在化し得るため、これらの実施形態のＨＳＣは、標的化薬剤として機能する。したがって、本発明は、一態様において、診断薬の治療薬に付着したＨＳＣを含む組成物を提供する。本明細書の目的に好適な治療薬および診断薬は、当技術分野において知られており、本明細書に記載のもののうちのいずれをも含むが、それらに限定されない。
【００６８】
組み合わせ
複合体を含む本明細書に記載の薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、単独で投与される。他の実施形態において、複合体を含む薬学的組成物は、他の治療または診断薬と併せて投与される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、例えば、サイトカインまたは成長因子、抗炎症薬、ＴＬＲ２阻害薬、ＡＴＦ３遺伝子または遺伝子産物、およびミネラルコルチコイド受容体遮断薬（例えば、スピロノラクトン）、リゾホスファチジン酸、２−メチルアミノクロマン（例えば、Ｕ８３８３６Ｅ）、２１−アミノステロイド（例えば、ラゾロイド（Ｕ７４３８９Ｆ））、トリメタジジン、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬またはアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）、およびスラミン等を含む、腎疾患または腎臓の病状を処置するのに知られている別の治療薬とともに投与される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、抗血栓薬、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ラパマイシン）、酸化防止剤、または、腎損傷もしくは腎臓障害を処置するために当技術分野において通常使用される他の薬剤、例えばエプロジセートおよびトリプトリド、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（例えば、シンバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチンおよびアトロバスタチン）、細胞溶解物、可溶性細胞分画、膜濃縮細胞分画、細胞培養培地（例えば、馴化培地）、または細胞外基質栄養素（例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、骨形態形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、マトリクス・メタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の、他の追加的治療薬とともに投与される。
【００７０】
患者の種類
本明細書に記載の本発明の方法に関して、患者は任意の宿主であり得る。いくつかの実施形態において、宿主は哺乳動物である。本明細書において使用される場合、「哺乳動物」という用語は、単孔類、有袋類および胎盤分類のいずれをも含むがこれらに限定されない、哺乳綱の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、マウスおよびハムスター等の齧歯目の哺乳動物、ならびにウサギ等のウサギ目の哺乳動物のうちの１つである。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目の哺乳動物である。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、ウシ科（ウシ）およびブタ科（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物である。いくつかの場合において、哺乳動物は、霊長目、セボイド目もしくはシモイド目（サル）、または類人猿目（ヒトおよび類人猿）の哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００７１】
以下の実施例は、本発明を例示することのみを目的として記載され、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【実施例】
【００７２】
実施例１
実施例２〜７において、以下の材料および方法を使用した。
【００７３】
動物
８〜１０週齢の雄の免疫不全非肥満性糖尿病（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を使用した。これらのマウスは糖尿病ではないが、機能性ＴおよびＢ細胞を有さないことに留意されたい。全てのマウスは、フィルタートップケージ内で維持し、無菌食および酸性化した水を与えた。全ての実験プロトコルは、Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより承認された。
【００７４】
ヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞精製および追跡
ヒト末梢血ＣＤ３４＋幹細胞を、正常健常成人ドナーから得られた顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）動員アフェレーシス産物から選択した（カタログ番号ｍＰＢ０２６、ＡｌｌＣｅｌｌｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）。簡潔には、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ／日）を連続５日間ドナーに投与し、ＣＤ３４＋細胞を骨髄から末梢循環に動員した。ドナーは、動員された末梢血単核球を収集するために、５日目および６日目にアフェレーシスを受けた。ＣＤ３４＋細胞は、ＩＳＯＬＥＸ３００ｉ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（バージョン２．５、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、機器の取扱説明書に示されたプロトコルに従い、アフェレーシス産物から高濃縮された。精製した細胞を、フローサイトメトリーで特性決定した（下記参照）。濃縮され、選択された細胞を、０．５％ヒト血清アルブミンを含むＲＰＭＩ中で２５℃で維持し、４８時間以内に使用した。生存能力を試験するために、２×１０５個の細胞の一定量を、７−ＡＡＤ（２０μｇ／ｍｌ、２０分、４℃、１００μｌのＰＢＳ中）で標識化し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／５％ＢＳＡ）で洗浄し、次いでフローサイトメトリーで分析した。いくつかの実験において、全身投与後のＨＳＣを追跡するために、ヒトＣＤ３４＋細胞を、１μｇ／１０７細胞を用い、３０分間、２５℃で、１０ｍｌのＲＰＭＩ中で、緑色蛍光トレーサー５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化した。過剰のＣＭＦＤＡを、遠心分離（２５０×ｇ ５分）後、１０ｍｌのＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中５％ＢＳＡ（超純粋）（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させることによりクエンチした。さらなる遠心分離後、細胞を１％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ（１２．５×１０６／ｍｌ）に再懸濁させた。ＣＭＦＤＡ標識化では、７−ＡＡＤを使用して検出された生存能力の変化が見られなかった（図示せず）。
【００７５】
動物モデル
腎臓の虚血−再かん流傷害は、以前に説明されている方法［１］から修正した。簡潔には、０日目に、麻酔下の雄のマウス（８〜１０週齢）の腎臓を、脇腹への外科的切開により露出させ、３６．８〜３７．３℃の中核温度で、片方または両方の腎臓の腎動脈および腎静脈にかけて、外科用クランプを設置した。腎臓が浅黒くなったことを確認し、次いで後腹膜内に２７分間（片側モデル）または２５分間（両側モデル）再配置した。クランプを取り外し、腎臓への再かん流を目視により確認し、創傷を閉じた。ヒトＨＳＣの効果を試験するため、片側ＩＲＩ腎損傷を有するこれらのマウスを、２つの群に分けた。処置群（ｎ＝６〜１０／群）においては、腎損傷後１日目および２日目に、ＣＭＦＤＡで標識化された２．５ ×１０６個のヒトＣＤ３４＋細胞を含有する２００μｌの細胞懸濁液を、尾静脈を通して静脈内注射した。対照群においては、マウスにはビヒクルのみを投与した。腎臓のＩＲＩから３日目、５日目、７日目、１４日目および２８日目にマウスを致死させた。
【００７６】
腎機能
腎機能を評価するために、両側ＩＲＩ腎損傷（０日目）を有するマウスを、無作為に２つの群に分けた。処置群（ｎ＝１０）には、１日目および２日目に、尾静脈からの静脈内注射により２．５×１０６個のヒトＨＳＣを投与した。対照群（ｎ＝１６）には、ビヒクルのみを投与した。以前に説明されている方法［１］を使用して、損傷後１日目、２日目、５日目、７日目、１４日目および２８日目に尾静脈から採取した血液試料から、血漿クレアチニンを分析した。
【００７７】
組織の準備、免疫染色、損傷および修復の画像化および定量化
氷冷ＰＢＳでマウスをかん流し、次いで過ヨウ素酸−リジンパラホルムアルデヒド（ＰＬＰ）溶液で２時間、続いて１８％ショ糖で１６時間臓器を固定し、次いで最適切断温度（ＯＣＴ）媒体（最適切断温度を確実にし、低温保持装置上で切片化するまで組織を包埋するために、凍結組織に使用される包埋剤）内で保存する（−８０℃）［２］か、または、光学顕微鏡用の組織を１０％中性緩衝ホルマリン内で１２時間固定し、７０％エタノールに移し、次いでパラフィン切片用に加工し（３ｍｍ）、切片を過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）もしくはピクロシリウスレッド染色２で染色した。５ｍｍ低温切片に対し免疫蛍光標識化を行った。腎臓、脾臓および心臓における注入されたヒト細胞を検出するために、マウス抗原に対する交差反応性を有さないヒト白血球抗原に対する抗体を使用するか、またはＣＭＦＤＡの蛍光を使用した（７日目まで）。別途説明されている方法［１、２］を採用し、以下の抗体を使用した：抗ヒト白血球抗原クラスＩ（ＨＬＡ）−ＡＢＣ（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ４５（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ラット抗ヒトＣＤ４５（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗ヒトＣＤ６８（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ３（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ３１（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ウサギ抗ヒトｖＷＦ（１：２００、Ａｂｃａｍ）、抗ヒトＣＤ１４６（ＦＩＴＣ、１：１００、Ａｂｃａｍ）、ビオチン抗ヒトＣＤ１３ ３（１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ウサギ抗ヒトＣＤ１３ ３（１：１００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、ヤギ抗ヒトＫＤＲ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびウサギ抗ヒトＫＤＲ（１：１００、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、続いてウサギ抗ＦＩＴＣ（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ラットＣｙ３もしくは抗ウサギＣｙ３もしくは抗ヤギＣｙ３（１：４００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｒｅｓｅａｒｃｈ）、または抗アビジンＣｙ３（１：３０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｒｅｓｅａｒｃｈ）。マウス血管系を標識化するために、ヒト抗原と交差反応しないラット抗マウスＣＤ３１（１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、続いて抗ラットＣｙ３（１：４００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｒｅｓｅａｒｃｈ）を適用した。切片を１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で後固定し、次いでＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ内に入れた。傍尿細管毛細血管喪失および小管損傷は、それぞれ以前に報告されているような盲検的スコア法［３］を使用して、抗ＣＤ３１−Ｃｙ３標識化腎臓切片またはＰＡＳ染色パラフィン切片を評価することにより決定した。簡潔には、皮質および髄質外部を組み込んだ矢状断面全体にわたり順次デジタル画像化（２００倍）により画像を撮像した（１０〜２０画像）。各画像をグリッドにより２５２個の正方形に分割した。傍尿細管毛細血管喪失を計算するために、傍尿細管毛細血管を含まない各正方形を正のスコアとし、最終的なスコアは正のスコアのパーセンテージとして示された。尿細管損傷を評価するために、各正方形の小管損傷の存在（小管の平坦化、壊死、アポトーシスまたは円柱の存在）を正のスコアとした。最終スコアは、画像当たりの正のスコアを有する正方形のパーセンテージであり、これを個々の腎臓からの全ての画像に対して平均化した。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００顕微鏡、ＣｏｏｌＳｎａｐカメラ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてエピ蛍光画像を撮影し、ＩＰラボソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して処理した。Ｎｉｋｏｎ Ｃ１ Ｄ−Ｅｃｌｉｐｓｅ共焦点顕微鏡を用いて共焦点画像を生成した。投影画像は、０．１ｍｍステップで取得した１０Ｚ−スタック画像から生成した。切片間の比較を可能とするため、含まれる全ての共焦点設定は、切片間で一定に維持した。
【００７８】
フローサイトメトリー分析および選別
以前に説明されている方法［１］を使用して、Ｉｓｏｌｅｘ濃縮ＣＤ３４細胞を、以下のヒト抗体の組み合わせを用いて分析した：抗ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４６−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＫＤＲ−ＦＩＴＣ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４０ｂ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ２９−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１０５−ＦＩＴＣ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ３４−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ９９−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４４−ＰＥ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ３８−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ６４−ＰＥ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ６１−ＰｅｒＣＰ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１３３−ＡＰＣ （１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗ＣＸＣＲ４−ＡＰＣ （１：１００、ＢＤ）、抗−ＣＤ９０−ＡＰＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＣＤ１１７−ＡＰＣ（１：１００、ＢＤ）、抗ＶＥＧＦＲ１−ＡＰＣ（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。ＨＳＣの完全な特性決定は、別途記述される（Ｄ．Ｍ．＆ Ａ．Ｃ未発表）。以前に説明されているように［２］、腎臓、脾臓および骨髄から単細胞を調製した。簡潔には、腎臓、脾臓および骨髄からの単細胞（１×１０５）を、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ヒトＣＤ４５に対する抗体（ＦＩＴＣ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびマウスＣＤ１１ｂに対する抗体（ＰＥ、１：２００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。注射後２日目のＣＭＦＤＡで標識化したヒトＨＳＣを、ＦＡＣＳａｒｉａを使用してＦＡＣＳ選別により直接選別した［２］。腎臓からの選別されたＣＭＦＤＡ＋細胞をすぐに溶解させ、リアルタイムＰＣＲのために、ＲＮＡ Ｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）システムを使用してＲＮＡ精製した。
【００７９】
リアルタイムＰＣＲ
キット（ＲＮＡ Ｅａｓｙ Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元の取扱説明書に従い、組織および細胞から全ＲＮＡを生成した。純度はＡ２６０からＡ２８０により決定した。ｉＳｃｒｉｐｔ、ならびにランダムヘキサマーおよびｐｏｌｙ ｄＴを含むプライマーを使用して、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した［２］。以前に説明されている方法を使用して［４］、ＡＢＩ７９００ＨＴ配列検出システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、ＳＹＢＲ −Ｇｒｅｅｎ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット；Ｑｉａｇｅｎ）の存在下、ヒトおよびマウス試料のリアルタイムＰＣＲを行った。ヒトＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、アンジオポイエチン１（ＡＮＧＰＴ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、血小板由来成長因子ｂ（ＰＤＧＦｂ）、形質転換成長因子ｂ１（ＴＧＦｂ １）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＴＩＥ１に特異的なプライマー／プローブセットは、Ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製であった。同量のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ反応に使用し、すぐに使用可能な反応ミックス（Ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した。反応は全て、３重で行った。リアルタイムＰＣＲの最適化は、製造元の取扱説明書に従って行った。標準曲線の決定のために、４つのｌｏｇ２ステップで連続的に希釈し、試料に対して並行して行った全ての試料のプールを使用した。各反応の全体積は２０μｌであり、３００ｎＭの順方向プライマーおよび３００ｎＭの逆方向プライマーおよび１２５ｎｇのＤＮＡを含有した。各反応に対して適切な陰性対照を使用した。
【００８０】
統計分析
全ての値は、平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ Ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を使用して、生存率を分析した。２つの群間の比較は、対応のないｔ検定（両側）により行った。対応のあるｔ検定は、偽手術マウスと比較対照した、動物または罹患したマウスの左（ＩＲＩ）と右（対照）の腎臓を直接比較するために使用した。全ての統計試験において、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【００８１】
実施例２
Ｉｓｏｌｅｘ−生成Ｇ−Ｃｓｆ−動員造血幹細胞の特性決定
造血幹細胞動員ヒトドナーからのＣＤ３４＋濃縮白血球を、生存能力および純度について分析した。ＨＳＣの９９％超が、７−ＡＡＤ除外により生存可能であった（図示せず）。白血球の９６％超は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋であり、それらが造血幹細胞（ＨＳＣ）であることを示していた（表１参照）。少数は、ＣＤ３４を発現したがＣＤ４５は発現しなかった。多分化能の確認および推定内皮前駆細胞の同定のために、細胞表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１４６、ＣＤ１３３、ＣＤ３１、ＶＥＧＦＲ２を使用して、濃縮白血球のさらなる特性決定を行った（表２参照）［１９］。特性決定は、ＨＳＣに加えて、動員されたヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞が、少数の循環内皮前駆細胞（ＣＥＰ）および稀に循環する内皮前駆細胞（ＣＥＣ）を含有することを示している。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
実施例３
ヒト造血幹細胞は、虚血再かん流傷害後の修復中に腎臓に動員される
腎臓修復に対するヒトＨＳＣの効果を試験するために、まずそれらが損傷腎臓に動員され得るかどうかを決定した。予備試験において、ＣＭＦＤＡで標識化された２．５×１０６個のＨＳＣの損傷前の静脈内注射は、注射から２４時間後も有意な動員をもたらさなかった（データは示さず）。次に、腎臓ＩＲＩ後１日目および２日目に、ＣＭＦＤＡ標識化ＨＳＣを注射し、損傷後３日目、５日目、７日目に腎臓を観察したところ（図１Ａ、Ｂ）、腎実質部に多くの動員されたＨＳＣを発見することができた。多くは傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）内に局在化していたが、いくつかは、血管周囲の毛細血管境界外で発見された（図１Ｃ）。また、片側ＩＲＩ後、非損傷腎臓に対する小規模ながらも有意なＨＳＣの動員が見られることに気付いた（図１Ｂ）。しかしながら、心臓においてはいかなるＨＳＣも発見することができず（図示せず）、これが非損傷および損傷腎臓へのＨＳＣの特異的な動員であることが示された。経時的にＣＭＦＤＡが希釈される可能性があるという懸念により、損傷後１日目および２日目に、マウスに非標識化ＨＳＣを注射した。これらの非標識化細胞は、ＨＬＡクラスＩに対する抗体により検出された（図１Ｃ、Ｄ）。ＨＬＡ−Ｉ陽性細胞は、全ての時点において腎臓で容易に検出されたが、明らかに、ＩＲＩ後１４日目および２８日目に腎臓内でＨＬＡ−Ｉ＋細胞の持続が見られた（図１Ｄ）。予想したように、ＨＳＣはまた脾臓および骨髄においても確認され（図１Ｅ〜Ｈ）、骨髄においてＨＳＣの持続が見られ、ＩＲＩ後７日目に、骨髄中のＨＳＣが骨髄マーカーＣＤ１１ｂを誘導したという痕跡があり（図１Ｇ）、ＨＳＣがマウス骨髄に植え付けられ、マウスは最終的にキメラとなったことが示唆された。
【００８４】
実施例４
全身ヒト造血幹細胞治療は、死亡率を低減し、虚血再かん流傷害後の腎機能を改善する
損傷腎臓へのＨＳＣ補充が修復中に任意の機能的結果をもたらすかどうかを決定するために、マウスに両側ＩＲＩを施し（０日目）、続いて１日目および２日目にヒトＨＳＣの静脈内注射を行った。偽手術マウスにおいて血漿クレアチニンを検定し（０日目、血漿クレアチニン値は０．０５±０．０６）、またＩＲＩ後１日目、２日目および７日目にも検定した。両側腎臓ＩＲＩは、２４時間で血清中クレアチニンの有意な増加をもたらし、４８時間でピークに達した（図２Ａ）。２４時間（第１の注射時）での血漿クレアチニンレベルは、処置群とビヒクル群とで差はなかったが、ＨＳＣが投与されたマウスにおいては、４８時間で血漿クレアチニンの顕著かつ有意な減少が見られ（図２Ａ）、一方マウスのビヒクル群は、この時点で極めて上昇した血漿クレアチニンレベルを持続した。７日目までに、ビヒクル群および処置群両方の生存したマウスは、同様のレベルの血漿クレアチニンを示した。ＩＲＩモデルは回復モデルであるため、これは驚くべきことではない。しかしながら、ビヒクル群においては、７日目にマウスの５０％しか生存しなかったが（図２Ｂ）、一方ヒトＨＳＣが投与されたマウスの９０％が７日目に生存した（図２Ｂ）。２つの群における生存数は、図２Ｂに示す。これらの驚くべき所見は、ヒトＨＳＣが、腎臓修復／再生を促進するとともに生存率を向上させることを示唆している。
【００８５】
実施例５
ヒト造血幹細胞治療は、腎臓の傍尿細管毛細血管喪失を軽減し、尿細管上皮再生を促進し、虚血再かん流傷害後の長期線維症を予防する
ＨＳＣが腎臓修復を促進する機序を調査するために、傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）の損失および小管損傷の持続について、腎臓切片を分析した（図３）。形態計測によるｍＣＤ３１標識化ＰＴＣの分析では、ＨＳＣ処置が、修復中のＰＴＣ損失を予防することが明らかとなった（図３Ａ〜Ｃ）。しかしながら、明らかに、１４日後および２８日後のＰＣＴ損失に差異はなく、これは、ＰＴＣの再生を促進する内因性の要因が存在するものの、ＨＳＣ治療が血管系の初期喪失を軽減することを示唆している。同様に、ＨＳＣ治療は、このＩＲＩモデルの修復段階における小管損傷の持続を軽減した（図３Ｄ〜Ｆ）。これは、ＨＳＣが小管再生を直接的または間接的に促進していることを示唆している。我々は以前、腎臓ＩＲＩが、慢性腎臓疾患の前兆であり、進行性の長期腎機能喪失と強く関連した、持続性間質性線維症をもたらし得ることを実証している［１４、２０〜２２］。損傷腎臓の修復中のＨＳＣの全身注射が損傷の長期的結果に影響するかどうかを試験するために、間質性線維症を定量化した（図３Ｇ〜Ｉ）。ビヒクル処置マウスにおいて、間質性線維症は、損傷後４週間で徐々に蓄積したが、ＨＳＣが投与されたマウスにおいては、間質性線維症は２８日目までに軽減された。
【００８６】
実施例６
ヒト造血幹細胞は、虚血再かん流傷害後の腎臓において、初期リンパおよび骨髄分化マーカーならびに内皮前駆細胞マーカーを獲得する
ＨＳＣは、骨髄、赤血球、巨核球よびリンパ系細胞の源である。我々は、多くのＨＳＣが損傷後３日目に腎臓に動員されたが、７日目にかけて保持される細胞の数が徐々に減少したこと、しかし、その後、損傷後最大２８日目まで再び増加したことを認めた（図１）。我々は、ヒトリンパおよび骨髄関連マーカーについて腎臓を標識化した（図４）。損傷後３日目という早期に、動員されたＨＳＣの多くがＣＤ６８またはＣＤ３を獲得し、この誘導は、非損傷および損傷腎臓の両方において同様であった（図４）。７日目までに腎臓に動員されたＨＳＣのいずれも単球性の核形態を獲得しなかったが、データは、腎臓内の骨髄およびリンパ系に対する早期の局所的関連があることを示唆している。腎臓におけるヒト細胞の数は、損傷後後期に増加する。ＩＲＩ後１４日目および２８日目の腎臓において、好中球の特徴的な核を有する偶発的ヒト細胞が観察された（図示せず）。これらの所見は、ＢＭキメラ現象の所見と併せて、腎臓におけるヒト細胞の後期の増加が、骨髄キメラ現象を反映するか、または腎臓内の成熟細胞型の局所的分化を反映するかのいずれかを示唆している。
【００８７】
腎臓におけるＨＳＣの局所的分化をさらに調査するために、マーカーＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）、ＣＤ１４６およびＣＤ１３３で標識化された切片、ならびに細胞表面発現を、注射前の幹細胞と比較した（表３）。動員された濃縮ＨＳＣはほとんどＫＤＲまたはＣＤ１４６を発現せず、大多数はＣＤ１３３を発現した。しかしながら、ＩＲＩ後３日目の腎臓において、ほぼ全ての動員されたＨＳＣはＣＤ１４６を発現したが、いずれもＣＤ１３３を発現しなかったことから、表現型の切り替えがあった。動員された濃縮ＨＳＣにおけるＫＤＲの発現は、腎臓に動員されたものと比較して同様であった。ＣＤ１４６はＣＥＰ機能と関連していたため、我々の所見は、腎臓がＣＥＰ型機能へのＨＳＣ分化を促進することを示唆している。
【００８８】
【表３】
実施例７
ヒト造血幹細胞は、主にパラクリン機序により血管修復に寄与する
肉芽形成を支援するＨＳＣのさらなる役割を調査するために、まずＨＳＣが内皮細胞に分化したかどうかを決定した。ＣＤ３１およびヒトｖＷＦに対するヒト特異的抗体、内皮細胞の２つのマーカーを使用して、７日目、１４日目および２８日目であるがそれより早期ではない時点において、損傷腎臓内のヒトＣＤ３１＋細胞を確認した（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。したがって、ＣＤ３１発現は、最大限の修復と一致しなかった。偶発的ＣＤ３１＋ＨＳＣは、ＣＤ４５発現を有さず、ＰＴＣ壁内で発見され、形態は内皮細胞と一致していた（図５Ａ）。しかしながら、ＣＤ３１＋ヒト細胞の大部分はまた、ＣＤ４５を共発現する（図５Ｂ）か、またはリンパ球および単球によるＣＤ３１発現と一致する白血球形態を伴って間質内に存在しており、またヒトＣＤ３１が内皮の特異的マーカーではないことを示していた。抗ヒトｖＷＦ抗体（マウスｖＷＦと交差反応しなかった）を使用した並行試験はまた、ＣＤ４５発現を有さない非常に稀なｖＷＦ＋ヒト細胞を確認し（図５Ｄ）、偶発的ヒト細胞が機能性内皮細胞となる観察結果を裏付けた。これらの調査は、ヒトＣＤ３４＋細胞の直接的毛細血管再生に対するごくわずかな寄与の証拠を提供したにすぎないが、全てのＨＳＣにおけるＣＥＰマーカーＣＤ１４６の顕著な誘導が見られたため（表１）、我々は、ＨＳＣがパラクリン機序により機能しているかどうかを試験した。これは、損傷後の腎臓におけるＨＳＣの血管内および血管周囲の場所を考慮すると、特に制御しやすかった。これをさらに試験するために、我々は、ＩＲＩ後４日目の腎臓に動員されたＣＭＦＤＡ標識化ＨＳＣを精製し、ＲＴ−ＰＣＲによりそのヒト特異的転写プロフィールを分析し、マウスへの全身注射前の同種ＨＳＣの転写プロフィールと比較した。ＨＳＣは、ＡＮＧ−１、ＦＧＦ−２、およびＶＥＧＦ−Ａを含む血管形成促進サイトカインの高レベルの転写物を生成し、さらに、上皮再生における役割が知られている高レベルのＨＧＦを生成した（図６）。驚くべきことに、腎臓に動員されたそれらのＨＳＣは、非常に類似した血管形成促進サイトカインの転写活性を示したが、これは、血管形成におけるパラクリンの役割をさらに支持している。
【００８９】
実施例８
本明細書に示されたデータの考察
ヒトにおける急性腎損傷は、依然として高い死亡率を示すとともに治療の選択肢が限られており、したがって、新たな治療戦略として可能性のある再生手法を特定することが強く望まれている。さらに、ヒトにおける急性腎障害は、臓器不全に至る炎症、血管障害、上皮萎縮、線維症および進行性の機能喪失を特徴とする慢性腎臓疾患の前兆であるという証拠が次々と示されている［２、１４、２２、２３］。腎損傷を軽減する、または修復および再生を向上させる新たな戦略は、短期間の影響を与えるだけでなく、おそらく、腎機能への長期コースを改変すると思われる。慢性腎臓疾患は、心臓血管疾患の独立した危険因子であるであるため［４］、そのような治療の長期的結果は、腎臓疾患だけでなく心臓血管疾患にも影響を与える。最近、成人ヒト末梢血ＣＤ３４＋細胞およびＨＳＣが、脳卒中および骨損傷後の脈管形成および骨形成を促進することが報告された［１６、２４］。さらに、ＣＤ３４＋細胞は、外部から与えられたＧ−ＣＳＦの存在下で末梢循環に拡大および動員可能であり［２５〜２７］、ＨＳＣを容易に利用可能とし、臨床細胞治療の理論的根拠を支持している。
【００９０】
本研究において、我々は、腎損傷から２４時間後に全身投与されたヒトＨＳＣが、損傷腎臓に選択的に動員され、主に血管内およびその周囲に局在化することを実証した。この動員は、微小血管系／小管上皮細胞の修復の向上、機能回復の向上および生存率の増加を伴い、さらに長期線維症を予防した。ＨＳＣは、腎臓への動員後、腎臓において初期リンパおよび骨髄特定マーカーを誘導し、ＣＥＰマーカーを獲得したが、高レベルの血管形成促進転写物の合成を保持した。精製ＨＳＣは、腎臓への動員前には少数の循環内皮前駆細胞および偶発的循環内皮細胞を含有しており、腎臓に動員されたＨＳＣはＣＥＰ分化に合わせてＣＤ１４６を誘導したが、マウス毛細血管壁内ではヒト内皮細胞はほとんど確認されなかった。総合すると、ＨＳＣ媒介腎臓修復は血管の交代ではなくパラクリン機序によるものであることを、これらのデータは示している（図７）。
【００９１】
ヒトＨＳＣは、片側腎臓ＩＲＩモデルにおいて損傷腎臓に選択的に動員されたが、これは、損傷腎臓が末梢循環中のＨＳＣを選択的に動員することができることを示している。ＩＲＩ後腎臓へのヒトＨＳＣの選択的動員は、ストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）を含むケモカインの局所的放出を示唆し、その受容体ＣＸＣＲ４が重要となり得ること、ならびに転写因子低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）が、局所的ケモカイン誘導の調整において役割を担っている可能性があることを示している［２８、２９］。損傷の発生時（０日目）におけるＨＳＣの全身投与ではＨＳＣの動員は良好ではなかったが、修復期の開始時のＨＳＣの遅延投与は、動員を誘発するのに極めて効果的であったことに注目すべきである。この補充パターンは、腎臓への単球流入と類似するが好中球動員とは異なり、追加のモノカインがＨＳＣ動員において役割を担っている可能性があることを示唆している。マウスに対する我々の以前の研究では、単純にＩＲＩに応答した骨髄からの内因性ＨＳＣ動員または腎臓への動員の証拠は得られなかったが、これは、正常な骨髄腔からのＨＳＣの動員のための内因性シグナルが不十分であることを示している［３０］。末梢循環へのＨＳＣの注射が腎臓への効果的な動員をもたらすことから、ＨＳＣ治療は、骨髄腔からの放出における通常の遮断を克服する。また、片側ＩＲＩモデルにおいて、非損傷腎臓にも少数のヒトＨＳＣが動員された。同じマウスの心臓もしくは消化系、または健常マウスの腎臓にはＨＳＣは補充されなかった（図示せず）。片側ＩＲＩに反応して、非損傷腎臓は代償性変化を示すが、肥大および過形成もその一部であった。したがって、非損傷腎臓へのＨＳＣ動員は、血管形成を促進するか、または損傷が存在しない状況で予防的役割を担うと考えられる。
【００９２】
ＨＳＣは、ＨＬＡ−クラス−Ｉ抗原に対する抗体を使用して、ＩＲＩ後１４日目から２８日目に腎臓内に検出された。腎臓内での経時的なＨＳＣ保持の二峰性分布が見られ、約７日目に底部が生じた。我々は、マウスが骨髄キメラ現象を発現し、１４日目および２８日目（但しそれより早期ではない）に、腎臓におけるヒト細胞のいくつかが好中球であることを認めた。したがって、腎臓の修復期の最初の７日目〜１０日目の間、ＨＳＣは幹細胞、初期特定細胞またはＣＥＰのままであり、修復が進行するにつれて徐々に腎臓から消失し、後に、元の全身循環ＨＳＣから得られるのではなく骨髄から動員された成熟白血球に置き換わったと思われる。ＣＤ３１の後期発現を伴う腎臓におけるヒト白血球の後期の増加、およびヒト好中球の出現は、キメラ骨髄からの白血球補充と一致している。しかしながら、我々のデータは、驚くべきことに、疾患の１日目および２日目のＨＳＣ注射が線維症に対し長期的に影響をもたらすことを示している。長期的線維症の低減が初期血管修復の改善を反映するものであるか、または後の時点での腎臓における修復ヒトＨＳＣの持続性集団を反映するものであるかは、これらの現在の研究からは不明である。
【００９３】
腎臓における虚血性傷害は、上皮損傷を特徴とする。傍尿細管毛細血管（ＰＴＣ）喪失は、より十分に説明されていない。しかしながら、重度の急性腎損傷のいくつかのモデル（虚血、毒素、一過性アンジオテンシンＩＩ）から得られたデータは、典型的には著しい線維症の発達に先行する毛細血管喪失を実証しており［１４、１５、３１］、血管形成が、血管構造の保存および臓器機能の復元における中心的プロセスである可能性がある［１２、１３、３２、３３］。また、我々は、これらの研究において、ＩＲＩ後、比較的軽度の腎損傷のみでのＰＴＣの顕著な喪失があること、また、修復中これらのＰＴＣの著しい再生があるものの、損傷後１ヶ月で血管系の持続的喪失があることを示しているが、これは、腎臓は、皮膚等の他の器官と異なり、損傷後の血管再建において固有の欠陥を有することを表している［１４］。我々の研究は、修復中、ＨＳＣが腎臓のＰＴＣ喪失を軽減すること、また、それが腎臓の急速な機能的回復およびマウスの生存率の向上の両方と関連することを明確に示している。我々の片側ＩＲＩモデルにおいて、ＰＴＣのＨＳＣ媒介再生は、２８週目において長期持続ＰＴＣ喪失を軽減しなかったが、それにもかかわらず、両側ＩＲＩモデルにおいて見られる回復および生存率に影響を与えた。これは、腎臓修復における中心的プロセスとしての早期血管修復を示している。ＨＳＣ媒介血管修復の有効性は損傷後早期の時点に限られているが、それでも損傷後１ヶ月目に腎臓における線維症進行が予防される。この早期ＨＳＣ注射の長期的効果が、間質性線維症の発達における中心的相互作用となり得る［３４］周皮細胞−内皮細胞相互作用の向上に起因するかどうかを解明するには、さらなる研究が必要である。予備的試験において、マウスのＩＲＩ後１４日目の腎臓に対するＨＳＣの後期の投与は、良好ではない動員をもたらし、血管修復の向上の証拠はほとんどみられなかったが（図示せず）、ＨＳＣが有効となり得る損傷後期間が限られていることを示している。
【００９４】
腎臓ＩＲＩモデルは、小管上皮細胞、特に、近位小管細胞のＳ３切片の重度の損傷および修復を特徴とするが、ＰＴＣ再生がないと、持続性虚血に起因して、それらの損傷尿細管はうまく再生しない可能性が高い［１４、３５］。我々の研究はまた、小管損傷スコアおよび機能回復により評価されるように、ＨＳＣが上皮再生を促進することを示した。ＨＳＣは、血管形成促進因子の高レベルの転写物を生成し、その腎臓内での場所（血管内および血管周囲）は、血管修復における主要な役割を示唆し、これは二次的に上皮修復を促進する。しかしながら、上皮に対する直接的な修復促進効果を有することが知られるＨＧＦの高レベルの転写物および上皮修復サイトカインＷＮＴ７ｂ（図示せず）（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、原稿提出中）は、ＨＳＣが、ＰＣＴ修復とは独立して、上皮修復に対する直接的なパラクリンの役割を有し得ることを示唆している。
【００９５】
また、ＨＳＣが、腎臓修復において、ＣＤ３＋およびＣＤ６８＋発現を急速に誘導したことは興味深い。損傷後の腎臓においてＴ細胞および単球由来細胞が共に修復的役割を示していることを示す証拠が漸次増加している［３６、３７］。したがって、ＨＳＣは、局所的に修復Ｔ細胞および修復マクロファージに分化することも考えられる。腎臓補充ＨＳＣと末梢血からの成熟Ｔ細胞および単球との間の差異を決定するためには、さらなる研究が必要である［３６、３７］。
【００９６】
成熟内皮細胞を直接形成することによる、内皮再生における循環内皮細胞（ＣＥＣｓ）およびＣＥＰの役割は、重要な研究対象となっている［１８、３８］。事実、我々は以前、マウス骨髄キメラにおいて、腎臓ＩＲＩおよび修復の後、内皮細胞の少数がキメラ骨髄に由来することを報告した［３０］。いくつかの研究において、Ｔｉｅ２は白血球および内皮細胞の両方を標識化するため、上皮細胞になった白血球を検出するためのプロモーターＴｉｅ２の使用は、事後解釈の問題をもたらした［３９］。したがって、ＣＥＰが内皮細胞になるという主張は言い過ぎかもしれない。これらの現在の研究において、我々は一貫して、ほぼ全ての動員されたヒトＨＳＣが共通の白血球マーカーＣＤ４５を保持することを発見したが、これは他の公開データ［１１］と一致している。我々は、ヒト内皮細胞を確認するために内皮マーカーＣＤ３１を使用したが、ＣＤ３１はまたＢ細胞および単球／マクロファージも標識化し［４０］、これらの研究においては、内皮細胞に非特異的であることが証明された。しかしながら、ヒト内皮細胞に一致して、毛細血管壁内に、内皮細胞形態、ＣＤ３１の発現、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）およびＣＤ４５の不在を伴う偶発的細胞が確認された［４１］。我々が最初に行った、精製ＨＳＣの特性決定において、精製ＣＥＣの小集団（＜０．０５％）［３８、４２］、およびＣＥＰの小集団が観察された。ＩＲＩ後腎臓において、ヒトＨＳＣの大部分はＣＥＰマーカーを獲得した。したがって、これらの偶発的ヒト内皮細胞は、ＣＥＰの内皮細胞との細胞融合、稀なＣＥＣの組み込み、またはＣＥＰの分化転換から得られると考えられる。確かに、ヒト内皮細胞の出現は、腎臓ＰＴＣ再生の重要な機序ではなかった。むしろ、我々の研究は、他の研究において報告されているように［１８、２４、４３］、ＣＥＰマーカーを有するＨＳＣおよび修復腎臓に動員されたＨＳＣが、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦ、ＡＮＧ−１、ＩＬ−８、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ−２を含む血管形成因子を分泌することができることを示している。これらのサイトカインは全て、強力な血管形成因子として認識されており、血管形成の増加により腎臓修復を促進し得る［４４〜４６］。腎臓内のＨＳＣの血管内および血管周囲の場所と併せて、我々は、ＨＳＣによる生存率および腎臓修復の両方の主要な機序が、パラクリン機序によるＰＴＣ再生であることを提案する［２４］。
【００９７】
結論として、我々は、本明細書において、全身投与された末梢血動員ヒトＨＳＣが、傍尿細管毛細血管に対するパラクリン機序により、死亡率を低減し、急速な腎臓修復および腎臓の再生を促進することを実証した。これらの所見は、急性腎臓疾患の処置のための有望な治療戦略として、また、慢性腎臓疾患の予防において、ヒトＨＳＣを支持している。
参照文献
実施例１で引用される参照文献
【００９８】
【化１】
本明細書の別の場所で引用される参照文献
【００９９】
【化２】
【０１００】
【化３】
【０１０１】
【化４】
【０１０２】
【化５】
【０１０３】
【化６】
本明細書における組成物または処置の方法に関連する全ての記述はまた、本発明の「使用」を画定すると解釈されるべきである。例えば、本発明は、本明細書に記載の状態を処置するため、または本明細書に記載の治療目標（例えば、治療を必要とするヒトの血糖の低下）を達成するための、サリチル酸源の使用を含む。同様に、本発明はまた、そのような処置／目的のための薬剤の製造のためのサリチル酸源の使用を含む。
【０１０４】
上記の要約は、本発明の全ての態様を画定することを意図せず、追加的態様は、発明を実施するための形態等の他の項に記載されている。文書全体は、統合された開示として関連することを意図し、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章または段落または項において一緒に見出されないとしても、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせが企図されることが理解されるべきである。
【０１０５】
上記に加えて、本発明は、追加的態様として、上で具体的に挙げた変形例よりもなんらかの意味で狭い範囲である、本発明の全ての実施形態を含む。属として記載された本発明の態様に関して、全ての個々の種は、個々に、本発明の別個の態様とみなされる。範囲として記載された態様に関して、全ての部分範囲および個々の値が具体的に企図される。
【０１０６】
出願者（ら）は、本明細書に添付される特許請求の全範囲を発明したが、本明細書に添付される請求項は、それらの範囲に、他者による従来技術の研究を包含することを意図しない。したがって、特許庁または他の団体もしくは個人により、請求項の範囲内の法定従来技術に対して出願人の注意が喚起された場合、出願人（ら）は、該当する特許法の下、そのような法定従来技術または法定従来技術の明らかな変形例を当該請求項の範囲から具体的に除外するために、当該請求項の主題を再定義するという、補正を行う権利を有する。そのような補正請求項により定義された本発明の変形例もまた、本発明の態様として意図される。本発明の追加的特徴および変形例は、本出願の全内容により当業者に明らかとなり、そのような特徴は全て、本発明の態様として意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における腎損傷を処置する方法であって、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約１４日までに、ある量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記患者に投与することを含み、前記量は、前記患者における前記腎損傷を処置するのに効果的である、方法。
【請求項２】
腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状を予防する方法であって、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約１４日までに、ある量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記患者に投与することを含み、前記量は、前記患者における前記腎疾患または腎臓の病状を予防するのに効果的である、方法。
【請求項３】
前記腎疾患または腎臓の病状は、急性腎不全、慢性腎疾患、および間質性線維症からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
腎損傷を有する患者の生存率を増加させる方法であって、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約１４日までに、ある量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記患者に投与することを含み、前記量は、前記患者の生存率を増加させるのに効果的である、方法。
【請求項５】
前記腎損傷は、前記患者の腎臓における傍尿細管毛細血管喪失をもたらす、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記急性腎損傷は、前記患者における虚血、毒素、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の使用、輸血反応、筋肉に対する損傷または外傷、手術、ショック、および低血圧のうちの１つ以上によりもたらされる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腎損傷は、腎虚血再かん流傷害である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＳＣは、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約７日までに投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＳＣは、少なくとも損傷後約２２時間から損傷後約４日までに投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＳＣは、損傷後約２４時間で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＳＣの第２の投与をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＳＣの第２の投与は、第１の投与後約少なくとも１２時間で投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＳＣの第２の投与は、第１の投与後少なくとも約２４時間で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＳＣは、細胞の少なくとも３０％がＣＤ３４＋ＨＳＣである細胞集団の一部である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞の少なくとも５０％がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の少なくとも７５％がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞の７５％超がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＳＣは、ドナーの抹消血から単離された動員骨髄細胞である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ドナーは、前記患者であり、前記ＨＳＣは、前記患者の自己細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２．５×１０６個のＨＳＣが、前記患者に投与される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＳＣは、非経口的に投与される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＳＣの集団および薬学的担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
非経口投与用に製剤化された、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記ＨＳＣは、腎虚血再かん流傷害の治療薬に結合している、請求項２２または２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
腎疾患または腎臓の病状の治療のための治療薬をさらに含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記治療薬は、ＴＬＲ２阻害薬、ＡＴＦ３遺伝子または遺伝子産物、およびミネラルコルチコイド受容体遮断薬、リゾホスファチジン酸、２−メチルアミノクロマン、２１−アミノステロイド、トリメタジジン、ならびにスラミンからなる群から選択される、請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項１】
患者における腎損傷を処置する方法であって、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約１４日までに、ある量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記患者に投与することを含み、前記量は、前記患者における前記腎損傷を処置するのに効果的である、方法。
【請求項２】
腎損傷を有する患者における腎疾患または腎臓の病状を予防する方法であって、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約１４日までに、ある量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記患者に投与することを含み、前記量は、前記患者における前記腎疾患または腎臓の病状を予防するのに効果的である、方法。
【請求項３】
前記腎疾患または腎臓の病状は、急性腎不全、慢性腎疾患、および間質性線維症からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
腎損傷を有する患者の生存率を増加させる方法であって、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約１４日までに、ある量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を前記患者に投与することを含み、前記量は、前記患者の生存率を増加させるのに効果的である、方法。
【請求項５】
前記腎損傷は、前記患者の腎臓における傍尿細管毛細血管喪失をもたらす、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記急性腎損傷は、前記患者における虚血、毒素、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の使用、輸血反応、筋肉に対する損傷または外傷、手術、ショック、および低血圧のうちの１つ以上によりもたらされる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腎損傷は、腎虚血再かん流傷害である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＳＣは、少なくとも損傷後約２０時間から損傷後約７日までに投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＳＣは、少なくとも損傷後約２２時間から損傷後約４日までに投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＳＣは、損傷後約２４時間で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＳＣの第２の投与をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＳＣの第２の投与は、第１の投与後約少なくとも１２時間で投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＳＣの第２の投与は、第１の投与後少なくとも約２４時間で投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＳＣは、細胞の少なくとも３０％がＣＤ３４＋ＨＳＣである細胞集団の一部である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞の少なくとも５０％がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の少なくとも７５％がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞の７５％超がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＳＣは、ドナーの抹消血から単離された動員骨髄細胞である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ドナーは、前記患者であり、前記ＨＳＣは、前記患者の自己細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２．５×１０６個のＨＳＣが、前記患者に投与される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＳＣは、非経口的に投与される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＳＣの集団および薬学的担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
非経口投与用に製剤化された、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記ＨＳＣは、腎虚血再かん流傷害の治療薬に結合している、請求項２２または２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
腎疾患または腎臓の病状の治療のための治療薬をさらに含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記治療薬は、ＴＬＲ２阻害薬、ＡＴＦ３遺伝子または遺伝子産物、およびミネラルコルチコイド受容体遮断薬、リゾホスファチジン酸、２−メチルアミノクロマン、２１−アミノステロイド、トリメタジジン、ならびにスラミンからなる群から選択される、請求項２５に記載の薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０６６８１（Ｐ２０１３−５０６６８１Ａ）
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３２２９３（Ｐ２０１２−５３２２９３）
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４１４７８
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０８１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４１４７８
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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