【課題】Ｆｌｔ４タンパク質およびそのペプチド断片の産生およびその他の供給源からの関連遺伝子の発見に有用なＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼをコードする単離ポリペプチド（例えば、所定の構造のＤＮＡまたはＲＮＡセグメント）の提供。
【解決手段】精製されたＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼポリペプチドおよびその断片、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリペプチドに特異的に結合する抗体。また、これらの使用法。

【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は１９９８年１０月９日に出願された米国特許出願番号第０９／１６９，０７９号、１９９７年７月２８日に出願された米国特許出願番号第０８／９０１，７１０号、１９９４年１１月１４日に出願された米国特許出願番号第０８／３４０，０１１号（現米国特許第５，７７６，７５５号）、および１９９４年６０月９日に出願された米国特許出願番号第０８／２５７，７５４号（すでに放棄）（なお、後者２つは１９９２年１０月９日に出願された米国特許出願番号第０７／９５９，９５１号（すでに放棄）の一部継続である）の優先権を主張する継続出願である。これらの出願は総て引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、受容体遺伝子、特には受容体チロシンキナーゼ遺伝子、組換えＤＮＡベクターへのそれらの挿入、ならびに得られたタンパク質の、宿主菌株および宿主真核細胞での生産に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｆｌｔ４、すなわち受容体チロシンキナーゼ、Ｆｌｔ４をコードするヌクレオチド配列、Ｆｌｔ４をコードするＤＮＡおよびそれらの遺伝子産物の作製方法、かかる受容体をコードする核酸を特異的に認識する（ハイブリダイズする）核酸プローブ、かかる受容体を特異的に認識する抗体、ならびに例えば動物およびヒト組織においてリンパ管および高内皮細静脈（ＨＥＶ）を同定する、および病理学的症状においてＦｌｔ４発現細胞の増殖を増強または阻害するためにかかるプローブおよび抗体ならびその他のＦｌｔ４結合化合物を使用する方法に向けられる。
【０００３】
背景
分化細胞および組織の発達、維持および修復に役割を果たす細胞の挙動は大部分、増殖因子および同様のリガンドならびにそれらの受容体を介して運ばれる細胞内シグナルによって調節される。受容体は応答細胞の細胞表面に位置し、増殖因子ならびにその他のホルモン様リガンドとして知られるペプチドまたはポリポリペプチドと結合する。この相互作用の結果、応答細胞で速やかに生物学的変化が起こり、同時に迅速かつ長期にわたる細胞内遺伝子発現の再調整が起こる。種々の細胞表面に会合したいくつかの受容体が特異的増殖因子と結合し得る。
チロシンのリン酸化は原形質膜を横切る鍵となるシグナル変換様式の１つである。いくつかのチロシンキナーゼ遺伝子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−Ａおよび−Ｂ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などのポリペプチド増殖因子およびホルモンのトランスメンブラン受容体をコードしている[Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich et al., Cell, 61: 243-54 (1990)] 。いくつかの造血増殖因子の受容体はチロシンキナーゼであり、これらにはコロニー刺激因子−１受容体であるｃ−ｆｒｎｓ[Sherr et al., Cell, 41: 665-676 (1985)］、および原始的な造血増殖因子受容体であるｃ−ｋｉｔ[Huang et al., Cell, 63: 225-33 (1990)]が含まれる。
【０００４】
これらの受容体はその特異性と親和性が異なっている。一般に、受容体チロシンキナーゼは、特異的増殖因子、トランスメンブランドメインと結合し得る細胞外ドメイン、通常タンパク質のα−らせん部分であるトランスメンブランドメイン、膜近傍ドメイン（受容体が例えばタンパク質リン酸化によって調節され得る場合）、チロシンキナーゼドメイン（受容体の酵素成分）、ならびに多くの受容体で、チロシンキナーゼの基質の認識および結合に関与するカルボキシ末端からなる糖タンパク質である。
【０００５】
いくつかの受容体チロシンキナーゼでは、選択的スプライシングおよび選択的ポリアデニル化のプロセスは、同じ遺伝子に由来するいくつかの異なるポリペプチドを作り出すことができる。これらは上記で挙げられた種々のドメインを含んでも含んでいなくともよい。結局、いくつかの細胞外ドメインは細胞によって分泌された個々のタンパク質として発現されてもよく、いくつかの形態の受容体はチロシンキナーゼドメインを欠いていてもよく、短いカルボキシ末端含むトランスメンブランドメインを介して原形質膜に挿入された細胞外ドメインのみを含んでもよい。
【０００６】
脈管系、胚の脈管形成および脈管形成、血液凝固、創傷治癒および再生、ならびにいくつかの疾病の生理学には血管を裏打ちする血管内皮が関与している。脈管樹状構造の発達は脈管形成を通じ、いくつかの理論に従って起こり、血管からの出芽による動脈およぼ静脈の発達の少し後にリンパ系の形成が始まる。F.R., Am. J. Anat. 9:43 (1909);およびvan der Putte, S.C.J, Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 51:3 (1975)参照。
【０００７】
胎児期の後、内皮細胞は、新血管新生に関する脈管形成時以外は極めてゆっくり増殖する。脈管形成を刺激する増殖因子は特異的内皮細胞表面受容体チロシンキナーゼを介してそれらの作用を発揮する。
【０００８】
受容体チロシンキナーゼのリガンドのうち、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）はひな漿尿膜では弱くとも脈管形成性があることが分かっている。形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）はいくつかの腫瘍細胞種により、またマクロファージにより分泌される脈管形成因子である。ｃ−ｍｅｔ前癌遺伝子によりコードされる受容体のリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）もまた、培養内皮細胞におけるＴＧＦαのそれに対する応答同様、強力な脈管形成性、誘導性がある。
【０００９】
種々の証拠が、内皮細胞の増殖、分化、ならびにある種の分化した機能の刺激に腫瘍な役割を果たし得る内皮細胞特異的増殖因子および受容体が存在することを示している。最も広く研究されている増殖因子は、ＰＤＧＦファミリーのメンバーである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。血管内皮増殖因子はジスルフィド結合２３ｋＤａサブユニットの二量体糖タンパク質であり、これは内皮細胞に対するその分裂促進活性およびその血管透過誘導能（従ってその別名は血管透過性因子）のために発見された。報告されているその他のＶＥＧＦの作用としては、細胞内Ｃａ^２＋の可動化、プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベターインヒビター−１合成の誘導、内皮細胞におけるヘキソース輸送の刺激、ならびにin vitroにおける単球移動の促進が挙げられる。異なるｍＲＮＡスプライシング変異体によってコードされる４つのＶＥＧＦイソ型は同じように内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激し得ることが分かっている。ＶＥＧＦの１２１および１６５アミノ酸イソ型は可溶性形態で分泌されるが、１８９および２０６アミノ酸残基のイソ型は細胞表面に会合したままであり、強いヘパリン親和性を有する。関連の胎盤増殖因子としては、可溶性の非ヘパリン結合形態およびヘパリン結合形態（ＰｌＧＦ、それぞれ１３１および１５２アミノ酸）も記載されており、これは胎盤、栄養膜腫瘍やヒト培養内皮細胞で発現する。
【００１０】
ＶＥＧＦ発現のパターンは正常な脈管系の発達および維持、ならびに腫瘍の脈管形成におけるその関与が示唆されている。ネズミの発達中、交尾後７．５日の内胚葉は総てＶＥＧＦを発現し、心室神経外胚葉は毛細血管挿入期にＶＥＧＦを産生する。ウズラ発達２日目では、卵黄嚢の血管新生領域ならびに胚全体でＶＥＧＦの発現が見られる。さらにマウス成体において有窓内皮に隣接する内皮細胞は持続性のＶＥＧＦ発現を示し、このことはこの特異的内皮表現型および機能の維持における役割を示唆している。
【００１１】
高い親和性の２つのＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１）およびＶＥＧＦＲ−２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ−１（キナーゼインサートドメイン含有受容体／胎児肝キナーゼ−１）が同定されている。これらの受容体はＰＤＧＦ受容体ファミリーに分類されている。しかしながらＶＥＧＦ受容体はそれらの細胞外ドメインに７つの免疫グロブリン様ループ（ＰＤＧＦファミリーのその他のメンバーでは５つであるのに対して）とより長いキナーゼインサートを有する。ＶＥＧＦ受容体の発現はいくらかは単球や黒色腫細胞系統にも存在するが、主として血管内皮細胞で起こる。内皮細胞だけがＶＥＧＦに応答して増殖することが報告されているが、異なる供給源からの内皮細胞は異なる応答を示す。このように、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦ−２によって媒介されるシグナルは細胞種特異的であることが明らかである。
【００１２】
ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２はＶＥＧＦ１６５と高い親和性（それぞれＫ_ｄ２０ｐＭおよび２００ｐＭ）。Ｆｌｋ−１受容体もＶＥＧＦに応答して自己リン酸化を受けることが示されているが、Ｆｌｔ１のリン酸化はほとんど検出されていない。ＶＥＧＦＲ−２によって媒介されるシグナルはこの受容体を過剰発現するブタ大動脈内皮細胞の著しい形態変化、アクチン再構成および波打ち運動を引き起こす。これらの細胞では、ＶＥＧＦＲ−２もリガンド誘導性の走化性および細胞分裂促進を媒介したが、一方、ＶＥＧＦＲ−１トランスフェクト細胞はＶＥＧＦに対する細胞分裂応答を欠いていた。これに対してＶＥＧＦはＶＥＧＦＲ−１を発現するラット洞様内皮細胞に対して強い増殖刺激作用を持っていた。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２と共沈降するリンタンパク質は異なっているが、このことは異なるシグナル伝達分子が受容体特異的細胞内配列と相互作用することを示唆するものである。
【００１３】
in situハイブリダイゼーション研究では、マウスＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡ発現は、内皮が由来する卵黄嚢および胚内中胚葉（交尾後（ｐ．ｃ．）推定７．５日の胚）、ならびにその後、予定血管芽細胞、心内膜、および大・小血管内皮（１２．５日ｐ．ｃ．）で認められた。増殖中の血管芽内皮細胞および胎児および生後初期の脳の分枝中の血管にＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡが豊富であり、成体の脳で発現が低いことは、ＶＥＧＦＲ−２が脈管形成および血管形成の主要なレギュレーターであることを示唆するものである。ＶＥＧＦＲ−１発現はマウス胎児における初期の血管発達および治癒中の皮膚創傷における新血管新生に同様に関連している。しかしながら成体の器官で高レベルのＶＥＧＦＲ−１の発現が検出されたことは、ＶＥＧＦＲ−１が細胞増殖には関連のない休止した成熟血管内皮における機能を有していることを示唆している。鳥類のＶＥＧＦＲ−２相同体は原腸形成の開始から中胚葉で認められたが、ＶＥＧＦＲ−１相同体は初期に内皮マーカーを同時発現する細胞で認められた。in vitroエピブラスト培養では、これらの細胞の脈管形成分化に必要なＦＧＦ−２はＶＥＧＦＲ−２発現をアップレギュレートした。両ＶＥＧＦ受容体の発現はその後の発達ではより制限されるようになることが分かっている。ヒト胎児組織では、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は重複するがわずかに異なる発現パターンを示した。これらのデータはＶＥＧＦおよびその受容体がパラ分泌様式で働いて内皮細胞の分化と組織の新血管新生を調節することを示唆している。
【００１４】
最近、ＶＥＧＦは内皮細胞の増殖および脈管形成の低酸素症誘発性の刺激因子であことが示され、特異的モノクローナル抗体を用いるＶＥＧＦ活性の阻害が実験的腫瘍の増殖およびそれらの脈管形成密度を低下させることが示されている[Ferrara et al., Endocrine Reviews, 18: 4-25 (1997); Shibuya et al, Adv. Cancer Res., 67:281-316 (1995); Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993)]。
【００１５】
数立方ミリメートルの大きさを超える固形腫瘍の増殖は血管供給に依存し、このことは脈管形成を魅力ある抗癌療法とする。内因性脈管形成阻害剤、またはアンギオスタチン、プラスミノーゲン断片、およびエンドスタチン、コラーゲン１８断片を含む「スタチン類」で助長的な結果が報告されている[O'Reilly et al, Cell, 79: 315-328 (1994); O'Rreilly et al., Cell, 88: 277-85 (1997)]。両因子は通常、一次腫瘍によって産生され、転移休眠を維持する。いずれかのスタチンの全身投与は動物モデルの一次腫瘍の休眠を誘導および維持することも示されている。受容体およびスタチンによるシグナル伝達、ならびにそれらを活性化するプロテアーゼはまだ同定されていない。癌およびその他の病理学的病状の治療における脈管形成の制御するためにはさらなる治療分子の必要性が存在する。
【００１６】
一次乳癌はいくつかの脈管形成性ポリペプチド（そのうちＶＥＧＦが最も存在量が多い）を発現することが示されている[例えば、Relf et al, Cancer Res., 57: 963-969 (1997)参照]。腫瘍細胞は侵襲性および非侵襲性いずれの腺管癌(in situ)乳癌でも高レベルのＶＥＧＦｍＲＮＡを含んでいた[Brown et al., Hum. Pathol., 26: 86-91 (1995)]。in situ癌腫に隣接する内皮細胞はＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２ｍＲＮＡを発現した。ＶＥＧＦおよびその受容体は、いくつかの独立した研究で腫瘍の血管密度と疾病の予後との間に相関が認められていることから、悪性乳癌の脈管形成の進行に寄与している可能性がある[Weidner et al., J. Natl. Cancer Inst., 84 1875-1887 (1992)]。診断およびスクリーニングを改良し、ならびに治療的介入の標的として機能させるには、乳癌および乳癌に関連する脈管形成のさらなるマーカーの必要性が存在する。
【００１７】
リンパ系の主要な機能は、組織からの環流を与え、多くの血管外物質を再び血液へ輸送することである。さらに、成熟のプロセスでは、リンパ球は血液から出発し、リンパ器官やその他の器官を通って移動してリンパ管に入り、胸管を通って血液に戻る。特殊な細静脈である高内皮細静脈（ＨＥＶ）は再びリンパ球と結合して、それらの組織への管外遊出を引き起こす。このようにリンパ管および特にリンパ節は免疫および種々の腫瘍の転移の進行に重要な役割を果たす。
【００１８】
２０世紀のはじめから、胎児のリンパ系の起源に関して３つの異なる理論が示されている。しかしながらリンパ管はそれらのための利用できる特異的マーカーが知られていないので同定が困難であった。
【００１９】
リンパ管は最も一般にはリンパ管造影によって研究されている。リンパ管造影では、Ｘ線造影剤が直接リンパ管に注入される。この造影剤はリンパ節に回収されるが、ここで半年まで留まり、この期間の間Ｘ線解析によりリンパ節の大きさや構造の追跡調査が可能となる。この診断はリンパ節に転移のある癌患者や、リンパ腫などのリンパ性腫瘍においては特に重要である。しかしながら当技術分野ではリンパ組織を造画する材料および方法の改良が必要とされている。
【００２０】
発明の概要
本発明は、第５染色体に位置し、未知のヒト白血病細胞由来チロシンキナーゼ相同体ＰＣＲ−ｃＤＮＡ断片として同定される、新規な受容体チロシンキナーゼ遺伝子を得ようとするものである[Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]。この遺伝子およびそのコードタンパク質はＦｌｔ４と呼ばれる。この略号はｆｍｓ様チロシンキナーゼ４から来ている。
【００２１】
Ｆｌｔ４はＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２遺伝子の産物に構造的に密接に関連のある受容体チロシンキナーゼである。この類似性および続いて発見されたこれら３つの受容体のリガンド間の類似性により、Ｆｌｔ４受容体は加えてＶＥＧＦＲ−３と呼ばれている。Ｆｌｔ４およびＶＥＧＦＲ−３は本明細書では相互交換的に用いられる。これら３つの受容体間の類似性にもかかわらず成熟型のＦｌｔ４はＶＥＧＦとは異なっており、これは細胞外ドメインのタンパク質分解切断において１２５／１２０ｋＤと７５ｋＤの２つのジスルフィド結合ポリペプチドが得られる。Ｆｌｔ４遺伝子は４．５と５．８ｋｂのｍＲＮＡをコードし、これは選択的３’エキソンを示し、それぞれ１９０ｋＤと１９５ｋＤのポリペプチドをコードしている。
【００２２】
識別のさらなる証拠としては、ＶＥＧＦはＦｌｔ４に対して特異的結合を示さず、その自己リン酸化を誘導しないということである。
【００２３】
Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ１およびＫＤＲ／Ｆｌｔ−１受容体ｍＲＮＡシグナルの比較からは、研究された組織においては重複するが異なる発現パターンが示されている[Kaipainen, et al., J. Exp. Med., 178: 2077 (1993)]。Ｆｌｔ４遺伝子の発現はＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２の発現よりも制限されていると思われる。Ｆｌｔ４の発現はまず、交尾後８．５日のマウス胚の頭部間葉織の血管芽細胞、主静脈、および胚外では尿膜におけるin situハイブリダイゼーションによって検出可能となっている。交尾後１２．５日の胚においては、Ｆｌｔ４シグナルは発達中の静脈および予定リンパ内皮で認めらるが、動脈内皮は陰性であると思われる。その後の発達段階では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは発達中のリンパ管に限られるようになる。成人組織ではリンパ内といくつかの高内皮静脈だけがＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現し、転移性のリンパ節およびリンパ管腫のリンパ洞で高い発現が起こる。これらの結果はリンパ管の静脈起源説を支持するものである。
【００２４】
ヒト赤白血病細胞系統からクローン化されたＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼｃＤＮＡのタンパク質産物はＮ−グリコシル化されており、その細胞外ドメインに７つの免疫グロブリン様ループを含んでいる。Ｆｌｔ４およびＫＤＲの細胞質チロシンキナーゼドメインはＦｌｔ１およびＫＤＲの対応するドメインとアミノ酸レベルで約８０％同一であり、血小板由来増殖因子、コロニー刺激因子−１、幹細胞因子の受容体、およびＦｌｔ３受容体と約６０％同一である。Pajusola et al., Cancer Res., 52: 5738 (1992)参照。
【００２５】
本発明は、Ｆｌｔ４タンパク質およびそのペプチド断片の産生およびその他の供給源からの関連遺伝子の発見に有用なＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼをコードする単離ポリペプチド（例えば、所定の構造のＤＮＡまたはＲＮＡセグメント）を提供する。
【００２６】
本発明は、微生物または真核細胞に挿入可能であって、コードされているタンパク質を発現できる、Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼまたは関連のタンパク質をコードする異種セグメントを含む組換えＤＮＡベクターを提供する。
【００２７】
本発明は、有用な量のＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼおよび多くの種に由来する同一機能を有するタンパク質を産生可能な真核細胞を提供する。
【００２８】
本発明は、実験室内で、または微生物によって合成的に産生し得るペプチド（このペプチドは天然のＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質の活性を模倣する）を提供する。もう１つの具体例では本発明は、Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質の活性を阻害するペプチドに向けられる。
【００２９】
（ａ）Ｆｌｔ４短鎖型（そのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は配列番号１および２に示されている）、および（ｂ）そのカルボキシ末端に異なるヌクレオチドおよび対応するアミノ酸残基を有する第２の形態、すなわちＦｌｔ４長鎖型（そのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は配列番号３および４に示されている）からなる群から選択されるペプチドが特に好ましい。Ｆｌｔ４長鎖型は１３６３個のアミノ酸残基長を有する。
【００３０】
上記で示されたタンパク質またはペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡおよびＲＮＡ分子、組換えＤＮＡベクター、および改変された微生物または真核細胞も本発明の一部をなす。特に、下記の２つのＤＮＡ配列番号、すなわち（ａ）Ｆｌｔ４短鎖型［配列番号２］をコードする配列番号１のようなＤＮＡ配列、および（ｂ）Ｆｌｔ４長鎖型［配列番号４］をコードする、配列番号１のヌクレオチド３９１３〜４４１６が変化したＦｌｔ４をコードする配列番号３のようなＤＮＡ配列の総てもしくは一部を含んでなる配列、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、または対応するＲＮＡ配列が特に好ましい。
【００３１】
遺伝子操作およびオリゴヌクレオチドプローブの作製の技術によるかかるペプチドの産生に関する本発明の好ましい態様を実施するのに用いられる、さらに大きな配列のセグメントを含むＤＮＡおよびＲＮＡ分子も提供される。
【００３２】
本明細書ではＦｌｔ４タンパク質をコードするＤＮＡ配が同定されているので、市販の装置を用いて例えばポリメラーゼ連鎖反応、または合成化学によってＦｌｔ４タンパク質をコードするＤＮＡを作製し、その後、その遺伝子を組換えＤＮＡ技術の公知の手法を用い、利用可能な多くのＤＮＡベクターのいずれかへ挿入すればよい。さらに、本明細書に開示されたペプチドのいずれかの直接合成を容易に利用できるようにする自動装置も利用できる。
【００３３】
本発明はまたＦｌｔ４ペプチドおよびその他の構築物、ならびにリンパ内皮細胞の特異的マーカーとしてのＦｌｔ４の使用に向けられる。
【００３４】
具体例では、本発明は、Ｆｌｔ４を認識する核酸プローブおよび抗体、特にモノクローナル抗体、ならびにかかる抗体を含む組成物に向けられる。
【００３５】
また具体例では、本発明は、組織サンプルおよび器官においてリンパ管をモニターする方法に向けられる。さらに本発明の目的としては、リンパ組織および特にはリンパ管の状態（炎症、感染、外傷、増殖など）を示す臨床的検出法を提供すること、ならびに生物においてリンパ管、例えばリンパ管形成を検出する方法を提供することがある。
【００３６】
本発明のさらなる目的としては、Ｆｌｔ４受容体タンパク質またはその種々のエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することにある。組織、特にリンパ組織においてＦｌｔ４受容体を検出および定量する診断目的でこれらのモノクローナル抗体を使用することも本発明の目的である。抗Ｆｌｔ４抗体に関して、「Ｆｌｔ４を特異的に認識する」、「Ｆｌｔ４と特異的に結合する」、「Ｆｌｔ４に特異的」などは抗体が、ＶＥＧＦＲ−２／Ｋｄｒ／Ｆｌｋ−１およびＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ１をはじめとするその他の内皮細胞表面受容体よりも優先的にＦｌｔ４と結合する（免疫反応する）ことを意味する。このように、Ｆｌｔ４「に特異的」なＦｌｔ４抗体またはその他のＦｌｔ４結合化合物はその他の抗原のエピトープには結合できないか、またはこれらの実施上無視できるような、それらのＦｌｔ４結合親和性より十分に低い親和性でしか他の抗原には結合しないので、本明細書に記載の本発明の方法に従って組織または生物学的サンプル中のＦｌｔ４を同定および／または標識する（例えば、造画、検出、スクリーニングまたは標的治療）に有用である。
【００３７】
本発明のもう１つの態様は、細胞サンプルのＦｌｔ４受容体の存在を決定する方法であって、（ａ）細胞サンプルを本発明の抗体、特にモノクローナル抗体に曝して；（ｂ）該モノクローナル抗体とＦｌｔ４受容体との結合を検出する工程を含んでなる方法に関する。
【００３８】
本発明はリンパ管形成、ならびに炎症性、感染性および免疫学的症状においてＦｌｔ４の機能を調整する（例えば、弱めるまたは増大させる）方法にさらに向けられる。例えば１つの具体例において、かかる方法は、特にＦｌｔ４の機能が転移性癌、リンパ腫、炎症（慢性または急性）、感染症および免疫学的症状などの疾病と関連している場合に、かかる反応にあずかるＦｌｔ４内皮細胞部位を封鎖するに十分な量のＦｌｔ４結合化合物を提供することによりＦｌｔ４によって媒介されるリンパ管形成を阻害することを含んでなる。
【００３９】
本発明は特異的Ｆｌｔ４刺激リガンドおよびモノクローナル抗体と、リンパ系内皮を刺激するためのその使用、またＦｌｔ４機能に関連する様々な病状におけるものなど、要すれば、Ｆｌｔ４の機能を阻害するリガンドの研究により誘導された抗体とともに、断片およびペプチドにもさらに向けられる。
【００４０】
本発明はＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼのリガンドの細胞系統供給源を提供する。これらの細胞からのコンディショニング培地を用いてＦｌｔ４リガンドを精製し、当技術分野の常法を用いてクローニングする。このコンディショニング培地または精製リガンドを用いてＦｌｔ４リガンドのアッセイ系および二量体化阻害剤、ならびにＦｌｔ４シグナル変換の阻害剤を得られるが、これらによりかかる阻害剤の同定および調製が可能となる。
【００４１】
本発明の好ましい具体例では、ＰＣ−３細胞系統のコンディショニング培地はＦｌｔ４受容体を刺激してある内皮細胞の増殖および分化、ならびに分化した機能を調節し得るタンパク質またはその断片を含んでなる。Ｆｌｔ４リガンドまたはそのペプチドもしくは誘導体は内皮細胞の増殖、分化、およびその分化した機能の調節において、またリガンドのアゴニストおよびアンタゴニストの生成において有用である。特にＦｌｔ４リガンドはリンパ系内皮の調節において有用である。しかしながら、Ｆｌｔ４リガンドはまた精製または組換え起源からの作製の際に、関連したＫＤＲ／ａＦｌｋ−１受容体も刺激すると思われる。
【００４２】
Ｆｌｔ４刺激リガンドの同定により直接的にこのリガンドの阻害剤またはＦｌｔ４機能の阻害剤についてアッセイすることが可能になる。かかる阻害剤をＦｌｔ４リガンド含有コンディショニング培地に単純に加え、それらが自己リン酸化を阻害する場合、それらはＦｌｔ４シグナリング阻害剤として作用していることになる。例えば組換えまたは合成ペプチド（限定されるものではないが、Ｆｌｔ４細胞外ドメインの断片を含む）をＦｌｔ４−リガンド相互作用またはＦｌｔ４二量体化の阻害についてアッセイすることができる。かかる推定Ｆｌｔ４阻害剤および、さらにはＦｌｔ４受容体−リガンド相互作用を妨害するＦｌｔ４リガンドに対する抗体、ペプチドまたは他の化合物、ならびにＦｌｔ４リガンドをコードするｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが内皮細胞の調節において、また内皮細胞機能に関連した疾病の治療において有用である。
【００４３】
ＶＥＧＦ−Ｃと呼ばれるＦｌｔ４リガンドの詳細な特性が、１９９８年２月２日に出願され、国際公開第ＷＯ９８／３３９１７号として公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号；１９９６年８月１日に出願され、国際公開第ＷＯ９７／０５２５０号として公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７号；および優先権を得た米国特許出願優先権証明書で提供されており、これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる。プレプロＶＥＧＦ−Ｃの推定アミノ酸配列は本明細書において配列番号２１で示されている。
【００４４】
ＶＥＧＦ−Ｄと呼ばれる第２のＦｌｔ４リガンドの詳細な説明がAchen, et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 95 (2): 548-553 (1998)、およびＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＴ０００１８５で提供されており、これら双方とも引用することにより本明細書の一部とされる。プレプロＶＥＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列は本明細書において配列番号２２で示されている。
【００４５】
本発明はまた細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる疾病を患う哺乳類生物を治療する方法であって、哺乳類生物に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と生物の細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４機能を阻害する工程を含んでなる方法に向けられる。該疾病は所望でないリンパ管形成を特徴とする疾病など、すでに上述した疾病である。さらに、Ｆｌｔ４発現が少なくともいくつかの乳癌、およびあるいはその他の癌に関連する血管の脈管構造においても（すなわち相当する正常（健康な）組織の血管の脈管構造におけるかろうじて検出可能な、または検出されないレベルの発現を大いに上回るレベルにおいて）起こることが見出された。よって、好ましい具体例において細胞は内皮細胞（リンパ系または血管）を含んでなる。もう１つの具体例において細胞はＦｌｔ４を発現するあるリンパ腫などの腫瘍細胞を含んでなる。特にヒトの治療が意図される。
【００４６】
「Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と生物の細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物」とは、ＰＣ−３コンディショニング培地から単離可能な血管内皮増殖因子Ｃとして本明細書に記載されるＦｌｔ４リガンドの結合を阻害するいずれの化合物をも意味する。かかる化合物はまた血管内皮増殖因子ＤとＦｌｔ４との結合を阻害するのにも有効であると考えられる。典型的な化合物として次のポリペプチド：（ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド；（ｂ）可溶性Ｆｌｔ４断片（例えば細胞外ドメイン断片）を含んでなるポリペプチド（この断片およびポリペプチドはＦｌｔ４リガンドと結合し得る）；（ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は天然の宿主細胞（すなわちそれらの表面で天然のＦｌｔ４タンパク質を発現する生物の細胞）で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激することはできない）；および（ｄ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激することはできない）が挙げられる。
【００４７】
標準in vitroスクリーニングアッセイにより、例えばＶＥＧＦ−Ｃおよび組換えにより発現されるＦｌｔ４を用いて同定可能な小分子阻害剤もまた意図される。抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチドが非常に好ましい。かかるポリペプチドには、例えばＦｌｔ４と特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体；かかる抗体の断片；キメラおよびヒト化抗体；Ｆｌｔ４と特異的に結合し、また別の抗原とも特異的に結合する二重特異性抗体などが挙げられる。循環中のＦｌｔ４リガンドと結合し、それによりリガンドとＦｌｔ４との結合を阻害する化合物の使用についても意図される。かかる化合物には、抗ＶＥＧＦ−Ｃもしくは抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体またはその抗原結合断片を含んでなるポリペプチドが挙げられる。関連の変法では、本発明は下流で細胞内Ｆｌｔ４シグナル伝達を妨害し、それによりＦｌｔ４機能を阻害する治療方法を意図する。
【００４８】
好ましい変法では、化合物は本明細書の他の部分で記載した検出可能な標識、または細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる。典型的な細胞傷害性薬剤には、植物毒（例えばリシン、サポニン）、細菌または真菌毒、放射性同位元素（例えば２１１−アスタチン、２１２−ビスマス、９０−イットリウム、１３１−ヨウ素、９９ｍ−テクニチウム、および本明細書に記載のその他のもの）、抗代謝剤（例えばメトトレキサート、５−フルオロデオキシウリジン）、アルキル化剤（例えばクロラムブチル）、有糸分裂阻害剤（例えばビンカアルカロイド）、およびＤＮＡインタカレート剤（例えば、アドリアマイシン）が挙げられる。
【００４９】
また、投与を改良するには組成物が医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体媒質をさらに含んでなることが好ましい。
【００５０】
本明細書において詳細に説明するように、Ｆｌｔ４発現は主として健康な成人のリンパ系内皮に限定されるところ、少なくともある腫瘍を取り囲む血管構造で確認された。従って、本発明は血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を治療する方法であって、かかる治療を必要とする哺乳類生物に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と生物の血管内皮細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４によって媒介される血管内皮細胞の増殖を阻害する工程を含んでなる方法をさらに含む。特に癌腫（乳癌）、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫および肉腫から選択される腫瘍性疾患の治療を意図する。しかしながら、本明細書において詳細に記載されるスクリーニング手法により本明細書において記載される抗Ｆｌｔ４治療管理に従いやすい候補となる、血管内皮細胞におけるＦｌｔ４発現によって特徴づけられるその他の腫瘍が確認されることは容易に理解されよう。
【００５１】
特に血管内皮細胞におけるＦｌｔ４発現によって特徴づけられる乳癌の治療を意図する。「血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼの発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患」とは、本明細書において例示されるように健康な組織の血管で通常観察される、かろうじて検出可能な、または検出されないレベルをかなり上回るレベルにおいてＦｌｔ４が血管構造で同定可能である疾患を意味する。
【００５２】
治療上有効な量の化合物は、当技術分野で認知される用量漸増および用量−反応アッセイを用いて経験的に決定される。「腫瘍の治療に治療上有効な」とは、癌治療を受ける患者に対して許容できないレベルの副作用がなく、腫瘍増殖を弱めるのに有効な量、もしくは腫瘍増殖を抑えるのに有効な量、または腫瘍を全体的に縮小するまたは排除するのに有効な量を意味する。化合物が抗体またはその他のポリペプチドを含んでなる場合、特に体重ｋｇ当たり約０．１〜１００ｍｇ抗体の用量、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇであると考えられる。典型的に長期循環半減期を示すヒト化抗体については、特に毎日〜１ヶ月おきの範囲に及ぶ間隔で、さらに好ましくは毎週、もしくは１週間おき、または３週間おきの投与が考えられる。治療の経過、患者の副作用、および循環する抗体レベルをモニターすることにより、任意の投与管理についてのさらなる指針が提供される。その他の抗体を基礎材料にした癌治療用物質（例えば抗ＨＥＲ２、抗ＥＧＦ受容体）についての公開されかつ進行中の臨床試験のデータによっても有用な投与管理指針が提供される。
【００５３】
本明細書において記載される治療方法に関し、好ましい化合物には抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド、および可溶性Ｆｌｔ４細胞外ドメイン断片を含んでなるポリペプチドが挙げられる。ヒトおよびヒト化抗Ｆｌｔ４抗体が極めて好ましい。
【００５４】
本発明の治療方法の期待される利点は、Ｆｌｔ４が通常健康な組織の血管構造ではいずれの重大なレベルでは発現されないということにある。極めて好ましい具体例において、治療用化合物は二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、該抗体または断片はＦｌｔ４と特異的に結合し、かつ血管内皮マーカー抗原と特異的に結合する。「血管内皮マーカー抗原」とは、増殖中の血管内皮細胞で発現され、好ましくはリンパ系内皮細胞では発現されないいずれかの細胞表面抗原を意味する。典型的な血管内皮マーカーには、ＰＡＬ−Ｅ［deWaal, et al., Am. J. Pathol., 150: 1951-1957 (1994)］、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２［Ferrara et al., Endocrine Reviews, 18: 4-25 (1997)］、Ｔｉｅ［Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992)］、エンドグリン［引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，７７６，４２７号］、およびフォン・ビルブラント因子が挙げられる。かかる二重特異性抗体はＦｌｔ４および血管内皮マーカーの双方を発現する腫瘍関連脈管構造に選択的に存在すると考えられる。極めて好ましい具体例において、化合物は腫瘍細胞を壊死させる、および／または腫瘍細胞への脈管構造供給を立つ目的で二重特異性抗体と共役した抗腫瘍薬または細胞傷害性薬剤をさらに含んでなる。典型的な薬剤には、上述のものおよびまた宿主において腫瘍に対する免疫応答を刺激するスタチン類、サイトカイン類、ケモカイン類などの治療用タンパク質も挙げられる。
【００５５】
もう１つの具体例において、化合物はＦｌｔ４／Ｆｌｔ４リガンド複合体（例えば、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄと結合したＦｌｔ４からなる複合体）からなるエピトープを認識する抗体（または二重特異性抗体）を含んでなる。
【００５６】
治療用化合物を、脈管形成因子を阻害する可能性を有する広域スペクトルを有する薬剤と複合化して、またはこの薬剤と同時投与することもさらに意図される。かかる薬剤には、例えば ヘパリンと結合する脈管形成因子を阻害するヘパリン結合剤（ペントサンおよびスラミン類似体）；およびフマギリンなどの内皮細胞増殖および移動を止める化学薬剤が挙げられる。
【００５７】
また抗Ｆｌｔ４化合物と、抗Ｆｌｔ４化合物により腫瘍血管に向けられ、次いで腫瘍増殖部位で局所的に活性化される（例えば照射）プロドラッグとの共役も意図される。かかるプロドラッグ戦略の使用にはＦｌｔ４を発現する薬剤の健康なリンパ管への副作用が最小限になるという利点があると考えられている。
【００５８】
同様に、本発明は、血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を治療する方法であって、血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患状態を患う哺乳類生物を同定し、かかる治療を必要とする哺乳類生物に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と生物の血管内皮細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４によって媒介される血管内皮細胞の増殖を阻害する工程を含んでなる方法を含む。
【００５９】
本発明はまた生物学的サンプルをＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質（Ｆｌｔ４）の存在についてスクリーニングする方法であって、（ａ）化合物と生物学的サンプル中のＦｌｔ４とが結合する条件下でＦｌｔ４を含むと推定される生物学的サンプルと、Ｆｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物とを接触させ；（ｂ）生物学的サンプル中のＦｌｔ４と結合していないＦｌｔ４結合化合物を除去する条件下で生物学的サンプルを洗浄し；さらに（ｃ）洗浄工程後にそのサンプルにおいてＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出することにより、サンプルをＦｌｔ４の存在についてスクリーニングする工程を含んでなる方法を提供する。好ましくは、化合物は（ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド；および（ｂ）Ｆｌｔ４リガンドまたはＦｌｔ４結合断片またはその類似体を含んでなるポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる。特異的にＦｌｔ４と結合し、かつ検出可能なマーカーをさらに含んでなる抗体が非常に好ましい。
【００６０】
本発明はＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼタンパク質（Ｆｌｔ４）を発現する細胞を含むと推定される脊椎生物組織のイメージング法であって、（ａ）脊椎生物組織とＦｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物とを接触させ；さらに（ｂ）その組織に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出することにより組織を造画する工程を含んでなる方法にも向けられる。好ましくはその組織はヒト組織であり、その方法は接触工程の後、造画工程の前に、組織から組織中のＦｌｔ４と結合していないＦｌｔ４化合物を除去する条件下で組織を洗浄する工程をさらに含んでなる。
【００６１】
関連した変法では、本発明は脊椎生物由来の組織の腫瘍イメージング法であって、（ａ）腫瘍を含むと推定される脊椎生物組織と、Ｆｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物とを接触させ；（ｂ）その組織において細胞に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出し；さらに（ｃ）Ｆｌｔ４結合化合物が結合した血管内皮細胞を同定することにより固形腫瘍を造画し、そこでＦｌｔ４を発現する血管が組織における腫瘍の存在および位置に相関している工程を含んでなる方法を提供する。
【００６２】
１つの好ましい具体例において、その方法は組織と、リンパ系内皮細胞には実質的に存在しない血管内皮マーカー（例えばＰＡＬ−Ｅ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２）と特異的に結合する第２の化合物とを接触させ；さらに組織において細胞と結合した第２の化合物を検出する工程をさらに含んでなり、造画工程が、Ｆｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標識された血管を同定することを含んでなり、ここでＦｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標識された血管が組織における腫瘍の存在および位置に相関している。第２の化合物の使用は医師がＦｌｔ４を発現している血管とその表面でＦｌｔ４を発現する正常なリンパ管とをより迅速に識別する補助となることが理解されよう。
【００６３】
本発明は腫瘍性疾患の状態のスクリーニング方法であって、（ａ）腫瘍性疾患の状態にあると推定される哺乳類生物由来の組織と、Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼと特異的に結合する抗体または抗体断片を含んでなる組成物とを接触させ；（ｂ）哺乳類生物において細胞に結合した抗体または抗体断片を検出し；さらに（ｃ）哺乳類生物において細胞に結合した抗体の量または分布から腫瘍性疾患をスクリーニングする工程を含んでなる方法にさらに向けられる。本明細書において記載されるようにＦｌｔ４（通常血管構造においては検出されないか、またはかろうじて検出可能である）は少なくともいくつかの腫瘍の血管構造で強く染色される。よって、１つの具体例においてスクリーニング工程では血管内皮細胞に結合した抗体または抗体断片の検出は腫瘍性疾患の存在に相関している。この方法での「検出」とは、本明細書において記載されるように相当する正常（健康な）組織で起こるかろうじて検出可能な、または検出されないレベルを有意に上回るレベルにおける検出を意味する。かかる特徴的な発現は健康な生物由来の組織を用いて行う対照との比較により確認できる。特に哺乳類組織の腫瘍のスクリーニングを意図する。上述のように、かかる方法の実施は血管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物を哺乳類に投与することによりさらに容易になり、そこで検出工程は腫瘍内皮細胞と結合した第１および第２の化合物を検出することを含んでなる。
【００６４】
上述から本発明の方法における使用が記載された様々な化合物もまた本発明の態様とされることがさらに理解されよう。かかる化合物には、例えば上述の抗Ｆｌｔ４抗体および二重特異性抗体が挙げられる。同様に、本明細書に記載された治療もしくは診断、または造画のための医薬の製造における、本明細書に記載されたいずれの化合物の（単独または組み合わせての）使用もまた本発明の態様とされる。医薬は医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体などをさらに含んでなってもよい。
【００６５】
同様に、本発明は本発明の方法を実施するため、その使用が容易になるようにパッケージされた本発明の化合物または組成物を含んでなるキットを含む。最も簡単な具体例において、かかるキットは、密閉ボトルまたは密閉容器などのラベルの貼られた容器にパッケージされた、または本発明の方法を実施するために化合物または組成物の使用を記載するパッケージに入っている本発明の化合物または組成物を含む。好ましくは化合物または組成物は単位投与形にパッケージされる。もう１つの具体例では、本発明のキットはリンパ系内皮には実質的に存在しないが、血管内皮細胞の表面で発現されるマーカー（抗原）と結合する第２の化合物とともにパッケージされたＦｌｔ４結合化合物を含む。
本発明のさらなる特徴および変法は、詳細な説明をはじめとする本出願全容から当業者には明らかであり、かかる総ての特徴は本発明の態様とされる。また本明細書において記載された本発明の特徴は、特徴の組合せが本発明の態様または具体例として特に上述されるか否かには関係なく、さらなる具体例に再び組み入れることが可能であり、これはまた本発明の態様とされる。また本発明に重要であるとして本明細書において記載されるかかる制限のみを制限とみるべきであり；重要であるとは本明細書において記載されなかった制限のない本発明の変法も本発明の態様とされる。
【００６６】
上述のものに加え、本発明はさらなる態様として、特に上述された変法よりもとにかく範囲の制限された本発明の総ての具体例を含む。出願人は本明細書に添付される請求の全範囲を発明したが、本明細書に添付される請求の範囲は他者の先行技術研究をその範囲内に含むものではない。よって、特許庁もしくはその他の団体または個人により請求の範囲内にある制定法上の先行技術が出願人の目に留まる場合には、かかる請求の範囲の内容を再び定義して、特にかかる請求の範囲からかかる制定法上の先行技術または制定法上の先行技術の明白な変形を排除する適用できる特許法の下、出願人は修正された権利を行使する権利を有する。かかる補正の請求の範囲により定義された本発明の変形もまた本発明の態様とされる。
【００６７】
詳細な説明
Ｆｌｔ４と呼ばれる新規受容体チロシンキナーゼのクローニング、配列決定および発現について以下に記載する。Ｆｌｔ４遺伝子は数多くの増殖因子および増殖因子受容体が存在する染色体領域５ｑ３５に位置している。Ｆｌｔ４の細胞外ドメインは１２の有力なグリコシル化部位をはじめとする７つの免疫グロブリン様ループで構成されている。構造上の類似性から、Ｆｌｔ４およびこれまでに知られているＦｌｔ１ならびにＫＤＲ／ＦＬＫ１受容体がIII型チロシンキナーゼのサブファミリーを構成していると考えられる。Ｆｌｔ４遺伝子はその３’配列において異なり、かつＨＥＬおよびＤＡＭＩ白血病細胞で特異的に発現されることが分かっている５．８ｋｂおよび４．５ｋｂのｍＲＮＡとして発現される。
ウイルムス腫瘍細胞系統、網膜芽腫細胞系統および非分化奇形癌細胞系統はＦｌｔ４を発現したが、分化奇形癌細胞は陰性であった。ほとんどの胎児組織もまたＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現し、脾臓、脳中間帯および肺で最も高いレベルを示した。ヒト成人組織では最も高い発現レベルは、発現の減少順に胎盤、肺、腎臓、心臓および肝臓で見られた。in situハイブリダイゼーションでは、Ｆｌｔ４オートラジオグラフの粒子の大きさにより胎児肺の内皮細胞が修飾された。
【００６８】
胎児組織におけるＦｌｔ４の免疫組織化学的染色により内皮細胞の染色が確認された。Ｆｌｔ４の発現パターンはＦｌｔ１およびＫＤＲとの比較において１８週齢ヒト胎児組織で極めて異なっている。Kaipainen et al., J. Exp. Med, 178: 2077 (1993)参照。
【００６９】
実施例４および１１に記載されるようにＦｌｔ４ｃＤＮＡを含有する発現ベクターを作製し、ＣＯＳおよびＮＩＦＩ３Ｔ３細胞で発現させた。
【００７０】
本発明のＦｌｔ４ＤＮＡおよびポリペプチドはＦｌｔ４リガンドの精製、および様々な生物における内皮細胞の増殖および分化の調節に有用であると考えられる。またこれらはある疾病の診断／治療においても価値のあることが証明されよう。
【００７１】
次の説明では、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術に用いられる数多くの用語が広く使用される。明細書および請求項の十分に、かつ首尾一貫した理解が得られるように、かかる用語に与えられるべき範囲など、次の定義を提供する。
【００７２】
遺伝子 ＲＮＡポリメラーゼの鋳型を含むＤＮＡ配列。遺伝子から転写されたＲＮＡはタンパク質をコードしていてもよいし、コードしていなくともよい。タンパク質に関してコードするＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼び、真核生物ではＲＮＡポリメラーゼIIにより転写される。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼII鋳型を含む遺伝子を構築することも知られており、そこでは通常は翻訳されないが、特異なｍＲＮＡのものに相補的な配列を有するＲＮＡ配列が転写される。かかる遺伝子構築物を本明細書では「アンチセンスＲＮＡ遺伝子」と呼び、かかるＲＮＡ転写物を「アンチセンスＲＮＡ」と呼ぶ。アンチセンスＲＮＡはアンチセンスＲＮＡ配列にある翻訳停止コドンの存在により通常翻訳することができない。
【００７３】
「相補的ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」遺伝子は介在配列（イントロン）を欠いたｍＲＮＡの逆転写により合成された組換え遺伝子を含む。
【００７４】
クローニングビヒクル 宿主細胞において自律的に複製が可能であり、かつそこでかかるＤＮＡ配列をビヒクルの本質的生物学的機能を失うことなく、限定し得る様式で切断し、そこにＤＮＡをスプライシングしてその複製およびクローニングをなし遂げる、１または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位により特徴づけられるプラスミドまたはファージＤＮＡもしくはその他のＤＮＡ配列。クローニングビヒクルはクローニングビヒクルで形質転換した細胞の同定における使用に好適なマーカーをさらに含む。例えばマーカーはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。「ベクター」は時に「クローニングベクター」の代わりに使用される。
【００７５】
発現ベクター クローニングビヒクルに類似しており、宿主への形質転換の後にそれにクローニングできる遺伝子を発現し得るビヒクルまたはベクター。クローニングされた遺伝子は通常、プロモーター配列などの（すなわち機能し得る形で連結された）ある調節配列の制御下に置かれている。発現調節配列はベクターが原核生物または真核生物宿主において機能し得る形で連結された遺伝子を発現するよう設計されているかどうかによって異なり、エンハンサーエレメント、終結配列、組織特異性エレメント、および／または翻訳開始および終結部位などの転写エレメントを含んでいると考えられる。
【００７６】
本発明は組換えＦｌｔ４タンパク質（短鎖型および長鎖型）の発現とこれらのタンパク質の機能的誘導体の両方に関係する。
【００７７】
機能的誘導体 Ｆｌｔ４タンパク質の「機能的誘導体」は、非組換えＦｌｔ４タンパク質の生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を持ったタンパク質である。Ｆｌｔ４タンパク質の機能的誘導体は特異的な機能を行うためのかかる修飾の必要性により、共有結合した炭水化物などの翻訳後修飾を含んでもよいし、含まないともよい。「機能的誘導体」とは、分子の「断片」、「変異体」、「類似体」および「化学的誘導体」を包含するよう意図されている。
【００７８】
本明細書において使用されるように、分子が通常の分子の一部ではなく、さらなる化学的部分を含む場合にはそれは別の分子の「化学的誘導体」であるとする。かかる部分は分子の可溶性、吸収、生物学的半減期などを改質する。またこの部分は分子の毒性を弱めて分子等のいずれの所望でない副作用を排除しまたは弱める。かかる作用を媒介し得る部分についてはRemington's Pharmaceutical Sciences (1980)で開示される。かかる部分と分子との結合手順は当技術分野で公知である。
【００７９】
断片 Ｆｌｔ４タンパク質などの分子の「断片」とは、ペプチドコアまたはペプチドコアの変異体などの分子のいずれの部分をもいう。
【００８０】
変異体 Ｆｌｔ４タンパク質などの分子の「変異体」とは、構造および生物学的活性において完全分子またはその断片のいずれかと実質的に同じ分子をいう。よって、２つの分子が同じ活性をもっている場合、たとえその一方の分子の組成物または二次、三次もしくは四次構造がもう一方のもので見られるものと同じでなく、またアミノ酸残基の配列が同じでない場合でもそれらは本明細書において使用される変異体と考えられる。
【００８１】
類似体 Ｆｌｔ４タンパク質または遺伝子配列の「類似体」とは、機能において本明細書のＦｌｔ４タンパク質または遺伝子配列と実質的に同じタンパク質または遺伝子配列をいう。
【００８２】
好ましい具体例の説明
本発明は出願人らが「Ｆｌｔ４」と呼ぶもの、チロシンキナーゼの受容体、Ｆｌｔ４をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなど）、Ｆｌｔ４遺伝子配列およびその産物からのＦｌｔ４ペプチドまたはＦｌｔ４タンパク質の産生、組換えＦｌｔ４発現ベクター、Ｆｌｔ４類似体および誘導体、ならびにＦｌｔ４および関連タンパク質、Ｆｌｔ４リガンド、Ｆｌｔ４アンタゴニストおよび抗Ｆｌｔ４抗体の診断用および／または治療用の使用に向けられる。
【００８３】
組換えＦｌｔ４の産生
好適な宿主細胞においてＦｌｔ４をコードする配列またはその機能的に同等なものをクローニングし発現させることにより、生物学的に活性なＦｌｔ４が産生され得る。
【００８４】
組換えＤＮＡ技術を用いるＦｌｔ４の産生は記載目的のために段階的な工程に分割できる：（１）所望のＦｌｔ４のコード配列（遺伝子）の単離または作製；（２）所望のＦｌｔ４の合成にあたることのできる発現ベクターの構築；（３）Ｆｌｔ４遺伝子を複製し、発現し、かつ／または遺伝子産物をプロセッシングして所望のＦｌｔ４を産生し得る適当な宿主細胞のトランスフェクトまたは形質転換；ならびに（４）所望のＦｌｔ４産物の同定および精製。
【００８５】
Ｆｌｔ４遺伝子の単離または作製
Ｆｌｔ４またはその機能的に同等なもののヌクレオチドコード配列を用いて、所望のＦｌｔ４産物の発現にあたるであろう組換え発現ベクターを構築することができる。本発明の方法の実施において、本明細書に示されるヌクレオチド配列またはその機能的に同等なものの断片を用いて、適当な宿主細胞において組換えＦｌｔ４産物の発現を命令する組換え分子を作製することができる。Ｆｌｔ４をコードするヌクレオチド配列はＦｌｔ４様活性を示す、および／またはＦｌｔ４をコードするｍＲＮＡを発現する種々の細胞供給源から得ることができる。出願人らはをヒト胎盤、白血病細胞およびいくつかの腫瘍細胞系統をはじめとするＦｌｔ４のいくつかの好適なヒト細胞供給源を同定している。
【００８６】
Ｆｌｔ４コード配列はかかる細胞供給源から単離および精製されたＲＮＡからのｃＤＮＡクローニングによってまたはゲノムクローニングによって得てもよい。Ｆｌｔ４配列は、例えば、当技術分野で十分に公知の技術を用いてポリメラーゼ鎖反応によってｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ物質から増幅させてもよい。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのクローンのいずれかは当技術分野で十分に公知の技術を用いて調製することができ、またＦｌｔ４遺伝子のいずれかの部分に実質的に相補的なヌクレオチドプローブを用いて特定のＦｌｔ４ＤＮＡをスクリーニングすることもできる。発現ベクターを構築するためには、全長クローン、すなわち、所望のＦｌｔ４の全コード領域を含むものを選択することもできる。あるいは、当技術分野で標準的な技術を用いて化学合成によってＦｌｔ４をコードするＤＮＡ全部をまたは部分的に合成してもよい。ヌクレオチドコード配列の内在する縮重のために、実質的に同一のまたは機能的に同等なアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列を本発明の方法の実施に用いてもよい。Ｆｌｔ４ヌクレオチド配列のかかる変更としては同一または機能的に同等な遺伝子産物をコードする配列をもたらす、種々のヌクレオチドの欠失、付加または置換が挙げられる。遺伝子産物が配列内にサイレント変化をもたらし、従って生理活性産物を産生するアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含む場合もある。かかるアミノ酸置換は含まれる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリジンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有し荷電していない極性頭部基または非極性頭部基を有するアミノ酸としては以下のロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。
【００８７】
Ｆｌｔ４発現ベクターの構築
この情報を用いて、Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼを適当な量で提供し得る種々の組換えＤＮＡベクターが提供される。本明細書で同定される鍵となる構造特性を有する合成タンパク質、ならびに他の供給源由来の同一ファミリーのタンパク質をコードする関連構造のさらなる組換えＤＮＡベクターを組換えＤＮＡ技術の標準的な技術を用いてＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼｃＤＮＡから作製することができる。形質転換発現Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼがこの技術の例として作製されている（実施例３および４参照）。新規に発見された配列および構造情報を用いて、真核細胞のトランスフェクションによりＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼおよび生物学的目的のためのその種々のドメインを調製することができる。
【００８８】
Ｆｌｔ４遺伝子産物を発現するトランスフェクタントまたは形質転換体の同定
組換えコード配列を含み、生物学的に活性な成熟産物を発現する宿主細胞は少なくとも４種の一般的なアプローチによって同定できる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在；（ｃ）宿主細胞におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルの評価；および（ｄ）免役アッセイおよび最終的には生物学的活性によって測定される成熟遺伝子産物の検出。
【００８９】
第１のアプローチでは、発現ベクターに挿入されたＦｌｔ４コード配列の存在がＦｌｔ４コード配列と相同なヌクレオチド配列からなるプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出され得る。
【００９０】
第２のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系がある「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキサート耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の存在または不在に基づいて同定され、選択され得る。例えば、Ｆｌｔ４コード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されれば、そのコード配列を含む組換え体をマーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子はＦｌｔ４コード配列の発現を制御するのに用いられるものと同一のまたは異なるプロモーターの制御の下にＦｌｔ４配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じたマーカーの発現はＦｌｔ４コード配列の発現を示す。
【００９１】
第３のアプローチでは、Ｆｌｔ４コード領域の転写活性がハイブリダイゼーションアッセイによって評価され得る。例えば、Ｆｌｔ４コード配列またはその特定の部分と相同なプローブを用いるノーザンブロッティングによってポリアデニル化ＲＮＡを単離、解析することができる。あるいは、宿主細胞の総核酸を抽出し、かかるプローブに対するハイブリダイゼーションについてアッセイしてもよい。
【００９２】
第４のアプローチでは、Ｆｌｔ４の発現が、例えば、ウエスタンブロット、放射性免役沈降、酵素結合型免役アッセイなどの免役アッセイによって免疫学的に評価され得る。しかしながら、発現系の成功についての最終的な試験には生物学的に活性なＦｌｔ４遺伝子産物の検出が必要である。宿主細胞が遺伝子産物を分泌する場合には、培養されたトランスフェクト宿主細胞から得られる細胞を含まない培地をＦｌｔ４活性に関してアッセイすればよい。遺伝子産物が分泌されない場合には、細胞溶解物をかかる活性に関してアッセイすればよい。いずれの場合にも、Ｆｌｔ４へのリガンド結合またはＦｌｔ４のその他の生理活性を測定するアッセイを用いればよい。
【００９３】
Ｆｌｔ４誘導体、類似体およびペプチド
Ｆｌｔ４に関連する誘導体、類似体およびペプチドの作製および使用も考慮され、かつ、本発明の範囲内にある。かかる誘導体、類似体またはペプチドは特定の適用に依存して生物学的活性を天然のＦｌｔ４と比較して増強しているかまたは低下させている場合もある。本発明のＦｌｔ４関連誘導体、類似体およびペプチドは当技術分野で公知の種々の手段によって作製できる。ゲノムおよびタンパク質レベルでの処置および操作は本発明の範囲内にある。ペプチド合成は当技術分野で標準的なものであるが、これを用いてＦｌｔ４ペプチドを得てもよい。タンパク質レベルでは、限定されるものではないが、エンドペプチダーゼ（例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）またはエキソペプチダーゼによる特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化などをはじめとする当技術分野で公知の技術によって多数の化学修飾を用いてＦｌｔ４様誘導体、類似体またはペプチドを作製してもよい。
【００９４】
好ましい誘導体、類似体およびペプチドはＦｌｔ４リガンド結合性活性を保持するものである。Ｆｌｔ４リガンドを結合するがそれに応じてシグナルを伝達しない誘導体、類似体およびペプチドはＦｌｔ４阻害剤として有用である。Ｆｌｔ４リガンドを結合し、かつ、それに応じて、例えば、細胞内Ｆｌｔ４自己リン酸化を含む過程を通してシグナルを伝達する誘導体、類似体およびペプチドは天然Ｆｌｔ４として同様に有用である。かかる結合および／または自己リン酸化アッセイにおいて使用するのに好ましいＦｌｔ４リガンドは本明細書に記載のＰＣ−３コンディショニング培地から単離可能な約２３ｋｄのポリペプチドを含んでなるリガンドである。血管内皮増殖因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）と呼ばれるこのリガンドは１９９６年８月１日に出願され、国際公開ＷＯ９７／０５２５０として公開され、優先権は米国特許出願優先権証明書にある、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７に詳細に特徴づけられている（なお、これらは総て引用することにより本明細書の一部とされる）。
【００９５】
抗Ｆｌｔ４抗体
本発明の範囲内にはＦｌｔ４または関連タンパク質を認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製もある。
当技術分野で公知の種々の手順をＦｌｔ４のエピトープに対するポリクローナル抗体の作製に用いることができる。抗体の作製に関しては、種々の宿主動物（限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどをはじめとする）をＦｌｔ４または合成Ｆｌｔ４ペプチドの注射によって免疫することができる。宿主種にもよるが、限定されるものではないが、フロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、オイルエマルション、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびＢＣＧ（バチルス・カルメット−グエリン(Bacillus Calmette-Guerin)）およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)などの有用である可能性のあるヒトアジュバントをはじめとする種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させることができる。
【００９６】
Ｆｌｔ４のエピトープに対するモノクローナル抗体は連続培養細胞系統によって抗体分子を産生させるいずれの技術を用いて調製してもよい。これらとしては、限定されるものではないが、Kohler et al., Nature, 256,:495-497 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、およびより最近ではヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術[Kosbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)]およびＥＢＶハイブリドーマ技術[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., pp77-96 (1985)]が挙げられる。また、Ｆｌｔ４に対する抗体は細菌において、クローニングされた免疫グロブリンｃＤＮＡからも産生され得る。組換えファージ抗体系の使用に関しては、細菌培養物において抗体を迅速に産生し、選抜し、またその構造を遺伝子操作することが可能であり得る。
【００９７】
分子のイディオタイプを含む抗体断片も公知の技術によって作製することができる。例えば、かかる断片としては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生じ得るＦ（ａｂ’）_２断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片のジスルフィド橋の還元によって作製できるＦａｂ’断片、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製できる２種のＦａｂ断片が挙げられる。
【００９８】
Ｆｌｔ４に対する抗体は成熟Ｆｌｔ４およびＦｌｔ４前駆およびサブコンポーネント種の定性および定量検出、Ｆｌｔ４ポリペプチドのアフィニティー精製、およびＦｌｔ４生合成、代謝および機能の解明に用いることができる。Ｆｌｔ４チロシンキナーゼ活性の検出をかかるアッセイにおけるＦｌｔ４特異的シグナルの作製および増幅の酵素的な手段として用いることができる。また、Ｆｌｔ４に対する抗体は診断および治療薬として有用であり得る。
【００９９】
Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ４をコードする核酸分子および抗Ｆｌｔ４抗体の使用
出願人らは、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ４類似体および誘導体、Ｆｌｔ４をコードする核酸分子、アンチセンス核酸分子および抗Ｆｌｔ４抗体の診断用のおよび／または治療用の使用をはじめとする本発明の組成物の広範な種々の使用を考慮している。
【０１００】
Ｆｌｔ４をコードする核酸分子またはその断片をプローブとして用いてＦｌｔ４をコードするｍＲＮＡを検出および定量することができる。核酸プローブを用いて公知の遺伝子配列の総てまたは一部を含んでなる配列を検出するアッセイは当技術分野では十分に公知である。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡレベルは出現および／または存在する腫瘍形成ならびにその他のヒトの疾病の発症および／または進行を示し得る。００００従って、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡを検出し、定量し得るアッセイは貴重な診断手段を提供し得る。
【０１０１】
アンチセンスＦｌｔ４ＲＮＡ分子は、治療目的がＦｌｔ４の存在の排除を望む、またはそのレベルのダウンレギュレートを望む場合には、Ｆｌｔ４をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するために治療上有用である。Ｆｌｔ４アンチセンスＲＮＡは、例えば、Ｆｌｔ４が、例えばその過剰発現によって原因剤として関与する疾病の治療においてＦｌｔ４拮抗剤として有用であり得る。さらに、Ｆｌｔ４アンチセンスＲＮＡはＦｌｔ４機能的機構の排除において有用である。Ｆｌｔ４をコードする核酸分子は本出願において個別に論じられる組換えＦｌｔ４タンパク質および関連分子の産生のために用いることができる。
【０１０２】
アンチＦｌｔ４抗体を用いて、種々の範囲においてＦｌｔ４を診断し、定量することができる。例えば、Ｆｌｔ４の種々のドメインに対する抗体をＦｌｔ４免役アッセイまたはＦｌｔ４の免役組織化学的評価のベースとして用いてもよい。Ｆｌｔ４のチロシンキナーゼ活性はこれらのアッセイにおいてＦｌｔ４シグナルを作製するための酵素的増幅反応として有用であり得る。また、アンチＦｌｔ４抗体も細胞表面のＦｌｔ４量の研究において有用であり得る。
【０１０３】
Ｆｌｔ４リガンドアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し、それによってＦｌｔ４活性の低下が可能となる抗体を作製できる。また、合成法によって、または組換え法によってランダムオリゴヌクレオチドからランダムペプチドも作製でき、Ｆｌｔ４受容体への特異的結合を示すものをＦｌｔ４細胞外ドメインを用いて選抜することができる。かかるペプチドセグメントはまた、当技術分野で標準的な方法を用いて、Ｆｌｔ４の細胞外ドメインを用いてファージディスプレーライブラリーから選抜することもできる。かかるペプチドはアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有し得る。Ｆｌｔ４抗体はまた、種々の化合物へ結合した後にＦｌｔ４発現細胞および組織または腫瘍のin vivoイメージングのための貴重な診断手段を提供し得る。
【０１０４】
Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体を好適な強磁性、常磁性、電子密度、音波発生または放射活性剤に共有または非共有のいずれかで結合させ、標的とされるイメージング剤を作製することができる。モノクローナル抗体のエピトープ結合性ドメインを用いて作製された分子のタンパク質分解または化学的処理によって生じた抗体断片は完全な抗体に代用することができる。次いで、このイメージング剤を診断目的のためのヒト身体のＸ線、磁性共鳴、音波ホログラフィーまたはシンチグラフィーイメージングの造影剤として利用できるであろう。
【０１０５】
Ｆｌｔ４の分子生物学
配列番号１および３に示されるＦｌｔ４ｃＤＮＡクローンの完全配列は、別のスプライシング次第で、４１９５または４７９５のヌクレオチドにわたり、１２９８個または１３６３個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームを含む。ヌクレオチドおよび推定されるＦｌｔ４アミノ酸配列（短鎖型）が配列番号１および２に示されている。図２はＦｌｔ４アミノ酸配列とＦｌｔ１チロシンキナーゼアミノ酸配列との比較を示している。Shibuya et al., Oncogens, 5: 519-524 (1990)参照。
【０１０６】
大部分が疎水性のアミノ酸からなる推定シグナルペプチド配列がイニシエーターメチオニンに続いている。対応するＡＴＧの周囲の配列は共通翻訳開始配列と一致している[Kozak, Nucl. Acids Res., 15: 8125-8135 (1987)]。両Ｆｌｔ４ポリペプチドの予想される細胞外部分は７７５個のアミノ酸長であり、アスパラギン結合型グリコシル化についての１２個の可能性ある部位（ＮＸＳ／Ｔ）を含んでいる。また、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーについて記載されたスペーシングパターンを示す数個のアミノ酸残基も含んでいる[Williams et al., Annu. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988)]。それは１２個のシステイン残基を有し、７個の免役グロブリン様ドメインを構成し得る。予想されるＩｇ様ドメインIVはシステイン残基を欠いている。また、図２はＦｌｔ１の細胞外ドメイン示しており（配列番号５）、これはＦｌｔ４の最も近いヒト相同体である。この図からシステイン残基の整列およびＩｇ様領域の極めて類似した組成がわかる。
【０１０７】
Ｆｌｔ４の細胞質ドメインは２３個の疎水性アミノ酸残基からなる推定膜貫通領域によって細胞外部分から分離されている。この配列は細胞質側で塩基性領域によってフランクされており、このことは膜貫通ドメインと細胞質ドメインの間の結合を示唆するものである。チロシンキナーゼ相同ドメインは残基８４３で始まり、ＡＴＰ結合ポケットおよびＹ１０６８でのｃ−ｓｒｃのＹ４１６に相同な推定自己リン酸化部位を含む（図２）。Ｆｌｔ４のチロシンキナーゼ触媒ドメインは、大部分が親水性でＦｌｔ１に相同性を示さない６５個のアミノ酸配列（ａａ９４４〜１００８）によって２つのサブドメインに分割されている。Ｆｌｔ１とは異なり、Ｆｌｔ４はそのキナーゼ挿入部分にチロシン残基を含まない。
【０１０８】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡの第２種は別の３’末端を有し、これは長鎖型のＦｌｔ４タンパク質をコードしている。
【０１０９】
図３Ａ〜Ｃでは、別のスプライシングによる短および長鎖型のＦｌｔ４ｍＲＮＡの産生が例示されている。図３ＡはクローンＪ．１．１およびＩ．１．１のｃＤＮＡ挿入部分の３’末端の概略構造を示している。クローンＪ．１．１のＴＡＧ終結コドンならびにポリアデニル化部位（ポリＡ）が示されている。クローンＩ．１．１は陰をつけたセグメントでクローンＪ．１．１と異なっている（それぞれ、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡの長鎖型および短鎖型）。ＴＡＡおよびポリＡはクローンＩ．１．１の終結コドンおよびポリアデニル化部位を示している。さらに、ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩの制限エンドヌクレアーゼ切断部位が示されている。下記に示されるものはｃＲＮＡ保護分析に用いたクローンＩ．１．１の２５６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩ挿入部分である。濃く陰をつけたセグメントのほとんどはin vitroでアンチセンス鎖を転写するための線状化センスＲＮＡ鋳型中のポリリンカーに由来する配列を示している。ＲＮアーゼ保護分析にかんがみた保護断片の概略構造も示されている。図３Ｂおよび３Ｃは２５６ｂｐの^３５Ｓ標識アンチセンスＲＮＡプローブならびに示された細胞系統由来（Ｔｅｒａ−２は奇形癌細胞系統であり、ここでは１０日間のレチノイン酸（ＲＡ）処理をともなうかともなわないで分析されている）のポリアデニル化ＲＮＡによって保護された場合の、長鎖型および短鎖型のＦｌｔ４ＲＮＡに相当する２１１および１２４ｂｐの消化断片のオートラジオグラムを示している。（負）対照レーンは転移ＲＮＡを用いた保護の結果を示している。Ｔｅｒａ−２細胞の分化の際のＦｌｔ４ｍＲＮＡのダウンレギュレーションが注目される。クローン１３のＴｅｒａ−２細胞はDr. C. F. Graham(Department of Zoology, University of Oxford, UK)から提供された。継代１８〜４０の間の細胞をこの研究に用いた。細胞は１０％ウシ胎児血清および抗生物質を添加したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）で維持した。分化を誘導するためには、細胞をゼラチンコートした組織培養等級皿で１．５×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で培養した。翌日、２×１０^−６ＭのＲＡを培地に加えた。細胞をＲＡの存在下で１０日間まで培養した。
【０１１０】
図３Ａ〜Ｃに示される結果は別のスプライシングによって生成したこれら２種のＦｌｔ４（長鎖および短鎖）型のカルボキシ末端の生成を例示している。
その推定されるアミノ酸配列によれば、Ｆｌｔ４はクラスIIIＲＴＫに属する。より詳しくは、Ｆｌｔ４はそれらの細胞外部分に７個のＩｇループを含み、従って、５個のＩｇループを含むクラスIIIＲＴＫのその他のメンバーとは異なる、ＲＴＫのサブファミリーに属する。Ｆｌｔ４はｖ−ｒｏｓ関連ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングされたＦＬＴファミリーの原型受容体、Ｆｌｔ１[Shibuya et al., Oncogene, 5: 519-524 (1990)]とおよびマウス肝臓の造血幹細胞濃縮画分からクローニングされたマウスＦＬＫ１受容体[Matthews et al., Cell, 65: 1143-1152 (1991);Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991)]と最も密接に相同である。Ｆｌｔ４の細胞外ドメインはヒトＦｌｔ１およびマウスＦＬＫ１とそれぞれ３３％および３７％のアミノ酸配列同一性を示す。Ｆｌｔ１およびＦＬＫ１はＦｌｔ４同様、肺、心臓および腎臓などの種々の正常組織において広く発現されている。さらに、最近同定されたヒト内皮細胞受容体チロシンキナーゼＫＤＲ[Terman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)]はＦｌｔ４およびＦｌｔ１ファミリーメンバーと相当な相同性を示す。利用できる配列データから、ＫＤＲはチロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインにおいてＦｌｔ４と８１％同一であると算出できる。さらに、ＫＤＲの細胞外ドメインもまた、７個のＩｇループ構造を有し、そのＴＫ１およびＴＫ２ドメインはマウスＦＬＫ１受容体の相当するドメインと９５％および９７％同一である。このことはＫＤＲはマウスＦＬＫ１のヒト相同体であるということを示唆するものである。
【０１１１】
Ｆｌｔ４ＴＫドメインはＦｌｔ１およびＦＬＫ１／ＫＤＲのＴＫドメインと約８０％同一であるが、ＲＴＫクラスIIIのその他の受容体のＴＫドメインとは約６０％しか同一でない。これらの他の受容体はまた、細胞外領域に５個のＩｇ様ドメインしか有さず、Ｆｌｔ４、Ｆｌｔ１およびＦＬＫ１／ＫＤＲをクラスIIIＲＴＫ内の個別のＦＬＴサブファミリーに分類できる。
【０１１２】
ＰＤＧＦＲのキナーゼ挿入部分、ｃ−ｆｍｓおよびｃ−ｋｉｔ中の配列Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｙ−Ｍ／Ｖ−Ｐ／Ｄ／Ｅ−Ｍ[Cantley, et al., Cell, 64: 281-302 (1991)]（配列番号６）中に位置するチロシン残基は自己リン酸化部位であり、リン酸化されるとホスファチジルイノシトール３’キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）のＳＨ２ドメインを結合する[Reedljk et al., EMBO J., 11: 1365-1372 (1992)]。興味深いことに、これらのクラスIIIＲＴＫとは異なり、ＦＬＴサブファミリーのメンバーまたはＦｌｔ３／ＦＬＫ２受容体はかかる共通モチーフを含まない。
【０１１３】
８個のヒトクラスIIIＲＴＫ遺伝子は３個の異なる染色体に集中している。
染色体４はｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ−αおよびＫＤＲ遺伝子を含んでいる[Yarden et al., EMBO J., 6: 3341-3351 (1987);Stenman et al., Genes, Chromosomes, Cancer, 1:155-158 (1989);Terman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)]。Ｆｌｔ１およびＦｌｔ３遺伝子は染色体１３ｑ１２に位置しており[Satoh et al., Jpn. J. Cancer Res., 78:772-775 (1987);Rosnet et al., Genomics, 9: 380-385 (1991)]、他方、Ｆｌｔ４は染色体５バンドｑ３５に局在している[Aprelikova et al., Cancer Res., 52: 746-748 (1992)]、ｆｍｓおよびＲＤＧＦＲ−β遺伝子の近くにある[Warringron et al., Genomics, 11: 701-708 (1991)]。染色体５の長腕は白血病細胞において認められる転座に関与している。難治性貧血および大球症を患う患者の骨髄細胞において染色体５の長腕部の欠失が認められた[Van Den Berghe et al., Nature, 251: 437-439 (1974)]。過剰の芽細胞をともなう難治性貧血[Swolin et al., Blood, 58: 986-993 (1981)]、原因不明骨髄化生[Whang-Pang et al., Leuk. Res. 2: 41-48 (1978)]、慢性骨髄性白血病[Tomiyasu et al., Cancer Genet. Cytogenet., 2: 309-315 (1980)]、真性赤血球増加症[Van Den Berghe et al., Cancer Genet. Cytogenet., 1: 157-162 (1979)]および本態性血小板血症[Nowell et al., Cancer, 42: 2254-2260 (1978)]などのいくつかのその他の脊髄増殖性疾患において異常な５ｑ染色体が認められている。
【０１１４】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現に関する発見はそのタンパク質産物はある白血球細胞に特有のものであるということを示唆する。巨核芽球細胞および内皮細胞間で共有されるいくつかの分化抗原が、例えば、血小板糖タンパク質IIIａとして存在すると示されている[Ylanne et al., Blood, 72: 1478-1486 (1988);Kiefler et al., Blood, 72:1209-1215 (1988);Berridge et al., Blood, 66: 76-85 (1985)]。さらに、Ｆｌｔ４は胎児期に例えば、肺および腎臓の特定の内皮細胞によって発現されている。
【０１１５】
発達の際のＦｌｔ４の役割をさらに理解するために、マウスＦｌｔ４の部分ｃＤＮＡをクローニングした。これらのプローブをin situハイブリダイゼーションに用いて、マウス発達の際のＦｌｔ４ｍＲＮＡ発現を分析した。Ｆｌｔ４はリンパ系の脈管形成および腫瘍起因性脈管形成の際に発現されると決定された。また、Ｆｌｔ４が健常および病的状態のヒト成人組織双方のリンパ系内皮ならびにいくつかの高内皮細静脈（ＨＥＶ）において認められたので、これらの発見が健常および病的ヒト成人組織においても妥当であると確認された。
【０１１６】
マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片のクローニングによりそれらの推定されるアミノ酸配列が相当するヒト配列とほとんど同一であると示された（研究された両セグメントにおけるアミノ酸同一性約９６％）。マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡの同一性に関するさらなる証拠がノーザンハイブリダイゼーション研究から得られ、これでは両種に由来するプローブによりマウス組織から特有の５．８ｋｂのｍＲＮＡシグナルが生じた。成体マウスの種々の組織から単離されたＲＮＡの分析から、肝臓、肺、心臓、脾臓および腎臓におけるＦｌｔ４発現が示されたが、脳および精巣では全くハイブリダイズしないか、またはほとんどハイブリダイズしなかった。このパターンはGalland et al., Oncogene, 8: 1233 (1993)によって早くに報告されたパターンと同様である。ＲＮアーゼ保護の結果からＦｌｔ４遺伝子はマウス発達の際に必要とされ、８．５日ｐ．ｃ．胚から始まり、相対的発現レベルは全く安定しているようであると示唆された。
【０１１７】
in situハイブリダイゼーションのために、細胞外ドメインの配列をコードするマウスＦｌｔ４ｃＤＮＡの２つの断片を選抜した。これによりハイブリダイゼーションパターンの、細胞外領域においてＦｌｔ４と極めて低い程度にしか配列同一性を示さない関連ＦＬＫ−１およびＦｌｔ１受容体パターンとの明確な区別が可能となった。Mellauer et al., Cell, 72: 835 (1993);Yamaguchi et al., Development, 118: 489 (1993);Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8915 (1993);Finnerty et al., Oncogene, 8: 2293 (1993)参照。
【０１１８】
Ｆｌｔ４はＦＬＫ−１、Ｆｌｔ１、ＴｉｅおよびＴｅｋ内皮受容体チロシンキナーゼ遺伝子と同様に、７．５日交尾後（ｐ．ｃ．）胚において発現されなかった。８．５日ｐ．ｃ．胚では最も強いＦｌｔ４シグナルが尿膜、頭部間葉の血管芽細胞、背部大動脈、および主要静脈に局在していた。心内膜で弱いシグナルが認められた。対照的に、卵黄嚢の血管芽細胞は、ＦＬＫ−１およびＦｌｔ１、ＴｉｅおよびＴｅｋに関してとは異なり陰性であった。Korhonen et al., Oncogene, 8: 395 (1993);およびPeters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8915 (1993)参照。Ｆｌｔ４発現の静脈系への限定は１１．５日マウス胚由来のサンプルにおいてさらにより明確であり、これではＴｉｅｍＲＮＡが動脈でも発現された。１２．５日ｐ．ｃ．胚では、Ｆｌｔ４シグナルは発達中の静脈のおよび推定上リンパ系内皮を修飾したが、内皮Ｔｉｅ受容体チロシンキナーゼに関してとは異なり、動脈内皮は陰性であった。発達の後期段階の間に、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは発達中のリンパ管に相当する、血液細胞を含まない血管神経叢に限定されるようになった。成人ヒト組織ではリンパ系内皮といくつかの高内皮細静脈のみがＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現した。リンパ洞および高内皮細静脈、転移リンパ節およびリンパ管腫では発現が増加した。マウス胚からのデータの解釈が困難であるため、リンパ系はヒトにおいてよりいっそう明確にされているのでヒト内皮を研究した。また、種々の内皮から確立された細胞はＦｌｔ４発現の特異性がin vitro条件で持続しているかどうか調べるために細胞培養物で研究することができよう。内皮細胞系統はin vitro培養では分化した特性を失っていると知られている。従って、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡに関して陰性であるとは予想しなかった。培養大動脈内皮細胞もＦｌｔｍＲＮＡを欠いていた。しかしながら、微小血管系から、ならびに大腿部および腹部中央の静脈から増殖させたヒト内皮細胞からシグナルが得られた。従って、少なくともＦｌｔ４発現の特異性のいくつかは細胞培養物において保持された。
【０１１９】
成人ヒト組織のin situハイブリダイゼーション分析により、発達中のマウス胚において認められたＦｌｔ４のリンパ系への限定が確認された。Ｆｌｔ４発現はリンパ系内皮におよびヒトリンパ節洞に認められた。興味深いことに、立方体様内皮を有し、白血球のリンパ節への輸送において機能すると示されているいくつかのＨＥＶもまたＦｌｔ４陽性であった。さらに、平行ハイブリダイゼーション分析により、これらの転移構造において正常なリンパ節と比較してＦｌｔ４ｍＲＮＡレベルが高まったと示された。また、Ｆｌｔ４は、結合組織間質と増殖性の内皮が並んだリンパチャンネルからなる良性腫瘍であるリンパ管腫において極めて顕著であった。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡはこれらの腫瘍のリンパ系内皮に限定されており、それらの動脈、静脈、毛細血管には存在しなかった。ヒト肺では、リンパ構造は唯一の同定されたＦｌｔ４陽性管であった。
【０１２０】
前記の結果はＦｌｔ４はヒト成人組織におけるリンパ管およびいくつかの高内皮細静脈の新規マーカーであるということを示すものである。この結果はまたリンパ管の静脈起源に関する理論を支持する。Ｆｌｔ４は増殖因子受容体としてこれらの管の分化および機能に関与し得る。Ｆｌｔ４リガンド、ＶＥＧＦ−Ｃを介してＦｌｔ４を通して媒介される生物学的作用の詳細な特性決定は１９９６年８月１日に出願され、国際公開ＷＯ９７／０５２５０として公開された、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７に提供されている。
【０１２１】
これらの結果と本発明のＦｌｔ４結合化合物とを組み合わせて、特に、可視化され得る、放射活性、電子密度またはその他のレポーター物質と結合した本発明の抗体を用いることによる、リンパ系内皮の選択的標識化が可能となる。リンパ系にＦｌｔ４受容体インターナリゼーション誘導性モノクローナル抗体またはリガンドを含む物質を注射し、それによって規定の分子をリンパ系内皮に輸送することも可能であり得る。また、本発明のＦｌｔ４結合化合物を、高められたレベルのＦｌｔ４受容体を発現する、高内皮細静脈、特に活性化ＨＥＶの検出のために用いることも可能であり得る。本発明者らの知見の限りでは、リンパ系内皮のかかる特異的なマーカーは目下のところ利用できない。
【０１２２】
以下の実施例は単に本発明を例示するために記載されるものであり、その範囲を何ら限定するものではない。
実施例１
Ｆｌｔ４をコードするｃＤＮＡクローンの単離および特徴づけ
λバクテリオファージｇｔ１１のオリゴ−ｄＴプライマーヒトＨＥＬ細胞ｃＤＮＡ[好意によりDr. Mortimer Poncz, Childrens Hospital of Philadelphia, PA; Poncz et al., Blood, 69: 219-223(19871) から提供を受けた] を同じライブラリーからＰＣＲ−増幅したｃＤＮＡ断片でスクリーニングした [Aprelikova et al., Cancer Rex. 52, 746-748(1992)]。陽性のプラークを同定し、記載されているように精製した[Sambrook et al., Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]。λバクテリオファージのｃＤＮＡ挿入物をＥｃｏＲＩ断片として単離し、ＧＥＭ３Ｚｔ（＋）プラスミド（Promega）にサブクローニングした。全長のＦｌｔ４蛋白質コード領域を単離した。ＨＥＬ−ライブラリーから単離した３つの重複クローン（図1に例示）を、得られた配列により設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたジデオキシ鎖成長停止反応を使用して配列決定した。ｃＤＮＡｓの全ての部分の両鎖を配列決定した。配列分析は、ＧＣＧパッケージプログラムを使用して実施した[Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12: 387-395(1984)およびthe Prosite program for Apple MacIntosh]。
【０１２３】
図1Aは、分析したＦｌｔ4ｃＤＮＡクローンの構造略図を例示している。矢印は、図1Bに図示するノーザンブロットのプローブに使用するサブクローニングした制限断片（サイズはkb単位）を示す。Ｅ＝ＥｃｏＲＩ部位、Ｓ＝ＳｐｈＩ部位。図１Ｂは、図１Ａに示すプローブを用いたＤＡＭＩおよびＨＥＬ白血病細胞ＲＮＡｓのノーザンハイブリダイゼーション分析を例示する。
【０１２４】
結果
ＨＥＬ細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲクローニング方法によって単離した２１０ｂｐ鎖長のＦｌｔ4ｃ断片を、オリゴｄＴ−プライマーヒト赤白血病細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための分子プローブとして使用した。
【０１２５】
クローンのヌクレオチド配列分析は、１２９８アミノ酸（ａａ）残基のオープンリーディングフレーム（配列番号：2、図2）を明らかにした。図中の翻訳イニシエーターメチオニンの周囲には典型的なコンセンサス配列が配置され[Kozac, Nucleic Acids Res., 12: 857-872(1984)]、その次に、小胞体内に転座するためのシグナル配列を特徴とする疎水性アミノ酸配列が配置されている。
【０１２６】
Ｆｌｔ4の細胞外ドメインは７つの免疫グロブリン様ループ内に配列されることもある（図2）。図はまた、Ｆｌｔ4と、非常に類似した構造を含有するＦｌｔ１の比較を示す。Ｆｌｔ１のアミノ酸配列を配列番号：５に記載する。
【０１２７】
アミノ酸残基７７５〜７９８は、受容体の膜貫通ドメインとして機能すると思われる疎水性配列鎖およびそれに続くポリペプチドの細胞質側と推定されるもののいくつかの塩基性残基を形成する。膜近傍ドメインは、ａａ８４２のチロシンキナーゼ配列相同性の開始部位手前の４４残基である。６５ａａのキナーゼ挿入配列に相同性が中断されている場合には、この相同性は受容体のカルボキシ末端部分の１１７５ａａにおいて最初に欠損している。アミノ酸配列データベースの関連するチロシンキナーゼドメインの検索（SwissprotおよびNBRF）は、触媒作用を有するチロシンキナーゼ領域の、それぞれ、約８０％および６０％の相同性を有するＦｌｔ１およびＰＤＧＦＲＢチロシンキナーゼを同定している。
【０１２８】
実施例２
抗−Ｆｌｔ4抗血清の調製
大腸菌(Ｅ. ｃｏｌｉ)内でＧＳＴ−Ｆｌｔ４融合蛋白質を作製するために、Ｆｌｔ4短鎖型の予測されるｃ−末端をコードする６５７塩基対のＥｃｏＲＩ断片をｐＧＥＸ−１λＴ細菌発現ベクター（Pharmacia）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼコード領域内にクローニングした。得られた融合蛋白質を細菌内で産生し、製造業者の指示により、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィーによって部分的に精製した。Ｆｌｔ4に対するポリクローナル抗体を産生するためにこの蛋白質をウサギの免疫化に使用した。３回めの追加抗原投与による免疫化後の抗血清を使用した。
【０１２９】
実施例３
ＣＯＳ細胞におけるＦｌｔ4の発現
材料および方法
全長のＦｌｔ4蛋白質コード配列（３つのクローンを合わせたもの、図1）をＳＶｐｏｌｙ哺乳類発現ベクター [Stacey et al., Nucleic Acids Res., 18: 2829(1990)] 構築物ＳＶ１４〜２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。発現ベクター（Ｆｌｔ4ｃＤＮＡのそれぞれの形態を含有する、ＳＶ−ＦＬＴ４短鎖およびＳＶ−ＦＬＴ長鎖）をＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション方法によってＣＯＳ細胞に導入した[MacCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-357(1968)]。トランスフェクションの２日後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）で洗浄し、免疫沈降緩衝液（10 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.5% Nonidet P40、0.1% SDS、0.1 TIU/ml Aprotinin）中に回収した。溶解物を超音波処理し、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、３ｍｌの抗血清と共に氷上で終夜インキュベーションした。プロテインＡセファロース（Pharmacia）を添加し、回転させながらインキュベーションを３０’継続した。沈殿物を免疫沈降緩衝液で４回、ＰＢＳで１回、水で１回洗浄してから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１３０】
結果
全長のＦｌｔ4短鎖および長鎖蛋白質コード領域をｐＳＶｐｏｌｙ発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、これらの発現ベクターをＣＯＳ細胞にトランスフェクトすることによってＦｌｔ4ｃＤＮＡ配列の予測される構造を試験した。これらの２つの構築物によって産生される蛋白質はＣ−末端が異なる：長い方の鎖形態はさらに６５アミノ酸を含有する。トランスフェクションの２日後、細胞を溶解し、予測されるＦｌｔ4蛋白質の短鎖型の４０カルボキシル末端アミノ酸残基を含有するＧＳＴ−Ｆｌｔ４融合蛋白質（すなわち、Ｆｌｔ４の短鎖型および長鎖型の両方に共通する部分）に対して形成した抗体を使用して免疫沈降した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって免疫沈降ポリペプチドを分析した。免疫形成前の血清はいかなる特異的なバンドも示さなかったが、Ｆｌｔ４−特異的抗体は約１７０ＫＤおよび１９０ＫＤの２つのバンドを認識する。これらの２つのバンドは識別的にグリコシル化される形態のＦｌｔ4蛋白質を示す可能性がある。
【０１３１】
実施例４
ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦｌｔ４の発現
全長のＦｌｔ４ｃＤＮＡ（短鎖型）を、モロニーマウス白血病ウイルス長鎖末端反復プロモーターを含有するＬＴＲｐｏｌｙベクター（ATCC受託番号77109およびGeneBank受託番号X60280を有する、プラスミドベクターｐＬＴＲｐｏｌｙを開示しているＬＴＲｐｏｌｙベクター（Makela et al., Gene, 118: 293-294(1992)を参照）にサブクローニングした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に同時トランスフェクトするためにこのＬＴＲ−Ｆｌｔ４発現ベクターをｐＳＶ２ｎｅｏマーカープラスミドと共に使用し、Ｇ４１８耐性クローンをＦｌｔ４発現について分析した。
【０１３２】
ウェスタン免疫ブロット分析は、１つの集密化した大型平板培地の細胞を２．５％ＳＤＳ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．５で溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ｐａｇｅで電気泳動し、ニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。膜を、Ｆｌｔ４カルボキシ末端ペプチドに対して形成された抗血清と共にインキュベーションし、結合した抗体をワサビペルオキシダーゼ結合ブタ抗−ウサギ抗血清（Dako）およびＥＣＬ試薬（Amersham）を使用して可視化した。代謝標識化は、培養物を１００μＣｉ／ｍｌ^３５Ｓ−メチオニンで１時間標識した。標識後、細胞を２回洗浄し、増殖培地中で１または２時間インキュベーションし、溶解し、抗−Ｆｌｔ４抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、オートラジオグラフィーを実施した。
【０１３３】
結果
１７０および１９０ＫＤポリペプチドはＦｌｔ４短鎖型をトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞では検出できたが、ｐＳＶ２ｎｅｏだけをトランスフェクトした細胞では検出できなかった。これら２つのバンド以外に、約１２０Ｋｄの主要なバンドがＦｌｔ４産生クローンで観察された。代謝標識およびパルス−チェイス実験は、この蛋白質は、短鎖型Ｆｌｔ４ポリペプチドの翻訳後処理の結果として産生されることを示した。
【０１３４】
実施例５
Ｆｌｔ４クローンの染色体マッピング
クラスＩＩＩ受容体遺伝子のいくつかの集合化が観察されたので、Ｆｌｔ４の染色体局在化を求めることは非常に興味深い。従って、げっ歯類−ヒト細胞ハイブリッドを分析し、ヒト染色体５へのＦｌｔ４の結合を示している。
【０１３５】
染色体５ｓの一部を保有するハイブリッドを使用して、領域５ｑ３３−＞５ｑｔｅｒ内のＦｌｔ４遺伝子の局在化を求めた。これらのハイブリッドは、フィルターハイブリダイゼーションによってＦｌｔ４遺伝子座の存在について試験した。Ｆｌｔ４−陽性ハイブリッドに共通で、Ｆｌｔ４−陰性ハイブリッドに欠損している染色体５領域は５ｑ３３．１−ｑｔｅｒであった。従って、ハイブリッドのヒト染色体５ｑ３３−ｑｔｅｒの存在はＦｌｔ４配列の存在と関連している。局所的マッピングの結果は、Ｆｌｔ４遺伝子座はＣＳＲＩＲ／血小板誘導増殖因子受容体−β（ＰＤＧＦＲＥ）遺伝子座およびβ−アドレナリン作動性受容体（ＡＤＲＢＲ）遺伝子座のテロメアであり、その理由はこれらの遺伝子座は全て、Ｆｌｔ４が陰性であるハイブリッドＧＢ１３中に存在するからであることを示した。
【０１３６】
実施例６
腫瘍細胞系統および内皮細胞におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの発現
この検討に使用した白血病細胞系統（K562）はいくつかの以前の報告に報告されている；[Lozzio et al., Blood, 45: 321-334(1975)]。ＨＬ−６０[Collins et al., Nature, 270: 347-349(1977)]、ＨＥＬ[Martin et al, Science, 216: 1233-1235(1982)]、ＤＡＭＩ[Greenberg et al., Blood, 72: 1968-1977(1988)]、ＭＯＬＴ−４[Minowada et al., J. Natl, Cancer Inst. 49: 891-895(1972)] 、ジャーカット [Schwenk et al., Blut. 31: 299-306(1975)] 、Ｕ９３７[Sundstom et al., Int. J. Cancer, 17: 565-577(1976)]、ＫＧ−１[Kieffler et al., Science, 200: 1153-1154(1978)]、ＪＯＫ−１[Andersson et al, 1982, in R. F. Revoltekka(ed.), Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells, 239-245, Raven Press, New York]およびＭＬ−２[Gahrnberg et al.,1985, in L. C. Anderson, et al(ed.), Gene Ezpression During Normal and Malignant Differentiation, 107-123, Academic Press, London]。American Type Culture Collectionから入手した以下の腫瘍細胞系統も分析した：ＪＥＧ−３、絨毛癌；Ａ２０４、横紋筋肉腫；ＳＫ−ＮＥＰ−１，腎芽細胞腫；ＢＴ−４７４、乳癌；Ｙ７９、網膜芽腫。白血病細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および抗体を含有するＲＰＭＩ中で増殖した。Dami細胞は１０％ウマ血清を加えたIscoveの改良ＤＭＥＭで培養した。第一継代ヒト臍静脈内皮細胞にＡ５４９肺癌細胞を融合することによって得られた永久ハイブリッド内皮細胞系統（EAhy926）[Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 50: 3734-3737(1983)]を、１０％ＦＣＳおよび抗体を含有するＤＭＥＭ−ＨＡＴ培地で培養した。
【０１３７】
記載されているように[Sambrook et al.,上記参照]、細胞系統からポリ（Ａ）⁻ＲＮＡを抽出した。５μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ試料を、ホルムアルデヒドを含有するアガロールゲルで電気泳動し、標準的な条件を使用してブロットした[Sambrook et al.,上記参照]。Ｆｌｔ４ｃＤＮＡクローンの挿入物をランダムプライミング方法によって標識し、ブロットにハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５×デンハルト溶液（100×デンハルト溶液は、各々2%のフィコール、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミンである）、５×ＳＳＰＥ（3M NaCl、200 mM NaH₂PO₄-H₂O、20 mM EDTA、pH 7.0）、０.１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および０．１ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で４２℃において１８〜２４時間実施した。フィルターは６５℃において１×ＳＳＣ（150 mM NaCl，15 mM、クエン酸ナトリウム15 mM、pH 7.0）、０．１％ＳＤＳで洗浄し、Kodak ＸＡＲ−５フィルムに露出した。
【０１３８】
ノーザン分析は、８種の白血病細胞系統（HEL、K562、DAMI、U937、MOLT4、HL60、ジャーカットおよびKG-1）および内皮ハイブリッド細胞系統（EAhy926）から抽出したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを用いて実施した。ＧＡＰＤＨプローブを用いたハイブリダイゼーションを、分析に均一な量のＲＮＡを負荷するための内部対照として使用した。ＨＥＬ赤白血病細胞およびＤＡＭＩ骨髄巨核芽球白血病細胞だけが５．８ｋｂおよび４．５ｋｂのＦｌｔ４ｍＲＮＡを発現した。Ｋ５６２赤白血病、ジャーカットおよびＭＯＬＴ−４細胞白血病、並びにＨＬ−６０前骨髄細胞白血病、Ｕ９３７単球性白血病およびＫＧ−１骨髄性白血病細胞はＦｌｔ４ｍＲＮＡが陰性であった。
【０１３９】
ノーザン分析は５種の腫瘍細胞系統（JEG-3、A-204、SK-NEP-1、BT-474およびY79）および上記白血病細胞系統のうちの２種（JOK-1、MOLT-4）から抽出したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを用いて実施した。標識したＳ２．５ｃＤＮＡクローン（図1参照）はハイブリダイゼーションプローブとして使用した。β−アクチンプローブを用いたハイブリダイゼーションを、分析に均一な量のＲＮＡを負荷するための内部対照として使用した。ＳＫ−ＮＥＰ−１腎芽細胞腫およびＹ７９網膜芽腫細胞だけがＦｌｔ４転写物を含有することが観察された。
【０１４０】
Ｔｅｒａ−２−奇形癌細胞は、ニューロン分化を誘発するために、基剤（−）またはレチノイン酸（＋）で１０日間処理した後に分析した[Thompson et al., J. Cell Sci., 72: 37-64(1984)]。細胞から単離したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡのノーザンブロット分析では、未分化の細胞は５．８ｋｂおよび４．７ｋｂのＦｌｔ４のｍＲＮＡを発現したが、１０日の分化後では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡはノーザンブロットおよびハイブリダイゼーションでは検出できなかったことが見出された。これらの結果は、Ｆｌｔ４はこれらの細胞の分化中にダウンレギュレーションされたことを示している。
【０１４１】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現も未分化およびＴＰＡ−分化ＨＥＬ細胞中で分析した。ＨＥＬおよびＤＡＭＩ細胞系統は共に赤血球系／骨髄巨核芽球二重表現型を保有し、腫瘍プロモーター１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）による処理によって骨髄巨核芽球マーカーのさらなる発現を誘発することができる。本発明者らは、Ｆｌｔ４の発現が分化中にこれらの細胞において刺激されるかどうかを分析した。ＨＥＬ細胞は、ＴＰＡまたはそれを溶解するために使用したＤＭＳＯで処理した２日後に分析した。Ｆｌｔ４シグナルを帯状化後、レーンの均一な負荷を確認するためにフィルターにＲｂ−１およびβ−アクチンｃＤＮＡｓをプローブ化した。オートラジオグラフのデンシトメトリー走査分析およびＧＡＰＤＨ遺伝子の構成的発現に対する正規化に基づいて、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡレベルは、細胞が骨髄巨核芽球分化を受けた場合にはＴＰＡ−誘導化ＨＥＬ細胞では約３．４倍増加したことが求められた。
【０１４２】
実施例７
胎児肺におけるＦｌｔ４の発現
インサイチューハイブリダイゼーション：１５週齢のヒト胎児の肺組織をUniversity Central Hospitalおよびthe University of Turku, Finlandの合同倫理委員会の許可を得て入手した。試料を４℃において１０％ホルマリンに１８時間固定し、脱水し、ワックスに包埋し、６μｍの切片に切断した。ＳＰ６およびＴ７ポリメラーゼ並びに[^３５Ｓ]−ＵＴＰを使用して直線化したプラスミドから２０６および１５７塩基（アンチセンスおよびセンス）のＲＮＡプローブを作製した。切片のインサイチューハイブリダイゼーションは、以下の改良を加えて、Wilkinson et al., Development, 99: 493-500(1987); Wilkinson, Cell. 50: 79-88(1987)により実施した：１）トルエンの代わりに、パラフィンワックスに包埋する前にキシレンを使用した；２）６μｍの切片を切断し、２％３−アミノプロピル−トリエトキシシラン（Sigma）で前処理したガラススライドの表面のジエチルピロカルボネート処理した水の層の上に配置した、３）プローブのアルカリ性加水分解を省いた、４）ハイブリダイゼーション混合物は６０％のホルムアミド脱イオン水液を含有した；５）高度の緊縮条件は５０ｍＭＤＴＴおよび１×ＳＣＣを含有する溶液中で６５℃において８０分間とした；６）切片はＮＴＢ−２エマルジョン（Kodak）をカバーし、４℃において保存した。１４日間の露出時間後、スライドをKodak D-19現像液で２．５分間現像し、Unifix(Kodak)で５分間固定した。切片はヘマトキシリン水溶液で染色した。
【０１４３】
アンチセンスプローブを使用したハイブリダイゼーション検討では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは１５週齢の胎児のある種の内皮細胞中に主に観察された。センス鎖プローブおよびＲＮＡａｓｅ Ａ処理切片を用いた対照ハイブリダイゼーションはバックグラウンド以上の信号を生じなかった。
【０１４４】
免疫ペルオキシダーゼ染色法は、１００倍希釈の抗−Ｆｌｔ４抗体、ペルオキシダーゼ結合ブタ抗−ウサギ抗体および当技術上標準的な方法を使用した。免疫形成前血清または免疫源遮断血清の対照染色は信号を生じなかった。１７週齢のヒト胎児の肺組織を分析し、結果は、ｍＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション実験の結果と一致しており、肺のある種の大血管の内皮細胞はウサギ抗−Ｆｌｔ４抗血清で陽性に染色された。
【０１４５】
実施例８
ヒト以外の哺乳類種におけるＦｌｔ４遺伝子の同定
図４には、異なる種のＤＮＡ中のＦｌｔ４配列の存在を検討した実験の結果を示す。Ｆｌｔ４遺伝子が進化によりどの程度保存されるかを明らかにするために、２．５ｋｂのｃＤＮＡ断片（図1参照）を異なる動物および酵母から精製したゲノムＤＮＡｓにハイブリダイゼーションし、ＥｃｏＲＩで消化した。ハイブリダイゼーション溶液は５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液（100×デンハルト溶液は、各々2%のフィコール、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミンである）、５×生理食塩液−リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ（3M NaCl，200mM NaH₂PO₄-H₂O、20 mM EDTA、pH 7.0）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡを含んだ。ハイブリダイゼーションは、４２℃において２４時間実施した。フィルターは６５℃において１×標準的な生理食塩液クエン酸塩（150 mM NaCl、15 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.0）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄し、Kodak XAR-5フィルムに露出した。特定のバンドはサル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギおよびニワトリＤＮＡｓ中に見出されたが、酵母ＤＮＡは信号を生じなかった。Ｆｌｔ４ｃＤＮＡはウズラから単離されている。Eichmann et al., Gene, 174(1):3-8(1996年9月26日)およびGenebank 受託番号Ｘ８３２８７を参照。
【０１４６】
実施例９
成人組織中のＦｌｔ４遺伝子の発現
成人組織中のＦｌｔ４ｍＲＮＡの発現は、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓組織のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ（Multiple Tissue Northern Blot, Clontech Inc.）を使用して、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションによって分析した。構成的に発現される遺伝子のプローブを用いた対照ハイブリダイゼーションはレーンの均一な負荷を示した。
【０１４７】
Ｆｌｔ４ｃＤＮＡ断片を用いた種々のヒト組織のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡのハイブリダイゼーションは、胎盤、肺、心臓および腎臓に５．８および４．５ｋｂの移動度のｍＲＮＡバンドと６．２ｋｂの弱く標識されたバンドを示した。弱いｍＲＮＡバンドが肝臓および骨格筋に見られたが、胎盤および脳は、含有されたとしても非常にわずかなＦｌｔ４ＲＮＡしか含有しないと思われる。
【０１４８】
実施例１０
ヒト胎児組織におけるＦｌｔ４の発現
ヒト胎児組織におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの発現を検討するために、１６〜１９週のヒト胎児の以下に掲載する組織の総ＲＮＡを含有するノーザンブロットに１．９ｋｂのＦｌｔ４ｃＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションし（図1参照）、得られたオートラジオグラフをデンシトメトリーで走査した。結果は、対応する臭化エチジウム（EtBr）染色ゲルのＵＶ像から推定されるＲＮＡ量について正規化した。以下の記号は増える順にｍＲＮＡのレベルを示す：−、＋、＋＋、＋＋＋。
【０１４９】
表１
胎児組織 ｍＲＮＡ
脳
髄膜 ＋
皮質板 ＋＋
中間帯 ＋＋＋
上衣帯 ＋
小脳 ＋＋
脈絡叢 ＋
肝臓 ＋
胎盤 ＋
小腸 −
心臓 ＋
肺 ＋＋＋
腎臓 ＋＋
副腎 ＋＋
皮膚 ＋＋
脾臓 ＋＋＋
胸腺 −
【０１５０】
ヒト胎児組織の分析は、胸腺および小腸を除いた全てがＦｌｔ４転写物を含有することを示した。最も高い発現レベルは肺および脾臓で見られた。
【０１５１】
実施例１１
Ｆｌｔ４発現ベクター
全長のＦｌｔ４ｃＤＮＡ（短鎖型）は、１）５２．５ｋｂの断片の５’側末端に[プライマーオリゴヌクレオチド5'-ACATGCATGC CACCATGCAG CGGGGCGCCG CGCTGTGCCT GCGACTGTGG CTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3'（配列番号：7）（順方向）および5'-ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3'（逆方向）（配列番号：8）を使用してＳ２．５ｋｂのクローン（図1参照）から増幅した]ＳｐｈＩ−切断Ｆｌｔ４ＰＣＲ断片をライゲーションし、２箇所のＳｐｈＩ部位を使用して、ｐＳＰ７３ベクター（Promega）にサブクローニングし、ｂ）オリゴヌクレオチドプライマー5'-CGGAATTCCC CATGACCCCAAC-3'(配列番号：9)（順方向）および5'-CCATCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTT CTT-3'(配列番号：１０（逆方向）を用いて０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（図1参照）から増幅した末端の１３８ｂｐｓを含有するＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を使用して、構築物ａ)の３’側末端にライゲーションし、ｃ）構築物ｂ）のＥｃｏＲＩ部位に１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をライゲーションし、ｄ）得られた全長のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ切断ＳＶ−ポリ発現ベクターにライゲーションすることによって作製した[Stacy et al., Nucl. Acids Res., 18: 2829(1990)]。
【０１５２】
実施例１２
Ｆｌｔ４リガンドの同定
ウシ胎仔血清（ＰＢＳ）の不在下においてＦ１２培地で７日間培養したＰＣ−３前立腺腺癌細胞系統の調整培地を１６０００×ｇで２０分間遠心分離して除去して、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を誘導する能力についてスクリーニングした。
【０１５３】
組換えによりＦｌｔ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３−細胞（実施例１３を参照）を直径５ｃｍの細胞培養皿に再度接種し、１０％ウシ胎仔血清および抗体を含有するダルベッコの改良最小必須培地（ＤＭＥＭ）で集密化するまで増殖させた。集密化した細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＤＭＥＭＥ／２％ウシ血清アルブミン中で終夜飢餓化した。刺激は、飢餓培地を１ｍｌの調整培地と交換し、細胞を３７℃において５分間インキュベーションした。
【０１５４】
ＰＣ−３調整培地での刺激後、細胞を含有する培養平板培地を氷上に置き、１００ｍＭＮａＶＯ_４を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ ｍＭＮａＣｌで２回洗浄した。洗浄液を培養皿から除去し、細胞を、アプロチニン、１ｍM ＰＭＳＦおよび１ｍMＮａＶＯ_４を含有するＲＩＰＡ緩衝液[10 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM NaCl、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.5% Norrider P40、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）]で溶解し、溶解物を１０秒間、２回超音波処理した。次いで、溶解物を１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を新しい管に移し、免疫沈降に使用した。
【０１５５】
Ｆｌｔ４Ｃ−末端に対するポリクローナル抗体（上記）を免疫沈降に使用した。細胞溶解物の上清を２〜４μｌのウサギポリクローナル抗−Ｆｌｔ４抗血清と共に氷上で２時間インキュベーションした。プロテインＡ−セファロース（Pharmacia）の約３０μｌの５０％（vol/vol）ＰＢＳ溶液を添加し、＋４℃において回転させながら４５分間インキュベーションを継続した。免疫沈降物をＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。
【０１５６】
次いで、免疫沈降物に７．５％ゲルでＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施し、ニトロセルロースにブロットした。これらのウェスタンブロットをモノクローナル抗−ホスホチロシン（抗-P-Tyr）抗体（2000倍希釈のPT-66 Sigma、カタログ番号P-3300）と共にインキュベーションし、次に化学発光検出システム（Amersham）を使用してペルオキシダーゼ結合ウサギ抗−マウス抗体（1000倍希釈、Dako、カタログ番号P-161）で検出した。ブロットを帯状化し、時折撹拌しながら、１００ｍＭ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．７中で５０℃において３０分間以前の信号を除去し、抗−Ｆｌｔ４抗体（1000倍希釈）で再度染色し、次にペルオキシダーゼ−結合ブタ抗−ウサギ抗体（1000倍希釈、Dako、P217）で染色した。Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化の陽性対照として、１００ｍＭのチロシルホスファターゼ阻害剤過バナジン酸ナトリウム（PerVO4）で２０分間処理したＦｌｔ４発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の抗−Ｆｌｔ４免疫沈降物を使用した。過バナジン酸ナトリウムナトリウムによる細胞の処理は、１００ｍＭ（最終濃度）のオルトバナジン酸ナトリウムおよび２ｍＭ（最終濃度）の過酸化水素を細胞培地に添加し、３７℃において５％ＣＯ_２雰囲気下で２０分間細胞をインキュベーションすることによって実施した。その手法によって、生細胞中の蛋白質チロシンホスファターゼの非常に強力な阻害剤であるバナジン酸の過酸化型（バナジルヒドロペルオキシド）が形成された。
【０１５７】
ＰＣ−３細胞調整培地は、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化処理された成熟型と共に同時移動した１２０ｋＤのポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激した。同時移動は、抗−Ｆｌｔ４抗体でブロットを再度染色することにより確認した。
【０１５８】
１２０ｋＤのポリペプチドが調整培地の非特定成分でないことを証明するために、１５ｍｌの調整培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースにブロットし、ブロットを抗−Ｐ−Ｔｙｒ抗体で染色した。いくつかのポリペプチドが検出されたが、それらのどれもＦｌｔ４と同時移動しなかった。これは、１２０ｋＤバンドが実際に刺激された細胞から免疫沈降されたチロシン−リン酸化蛋白質であることを示している。室温において２時間ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（Pharmacia）で前処理したＰＣ−３調整培地による刺激の分析は（レーン3）、Ｆｌｔ４リガンドはヘパリンに結合しないことを示している。
【０１５９】
未張性培地はＦｌｔ４自己リン酸化を誘導しなかった。また、非トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＦＧＦＲ−４をトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞はどちらもＰＣ−３細胞の調整培地による刺激の結果、１２０ｋＤのポリペプチドのチロシンリン酸化を示さなかった。ＰＣ−３調整培地をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０濃縮剤（Amicon）を使用して４倍に濃縮した場合、刺激作用はかなり増加した。また、分子量１０，０００未満（<10,000）の蛋白質を含有する、濃縮後に得られたフロースルーはＦｌｔ４のリン酸化を刺激しなかった。製造業者の指示により、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（1 mg/ml）に結合したＦｌｔ４細胞外ドメイン（Flt4EC-6XHis、以下参照）５０ｍｌを用いたＰＣ−３細胞の濃縮した調整培地の前処理はＦｌｔ４のチロシンリン酸化を完全に消失させた。セファロースＣＬ−４Ｂを用いた調整培地の同様の前処理は刺激作用に影響を与えなかった。
【０１６０】
これらのデータは、ＰＣ−３細胞はＦｌｔ４の可溶性リガンドを生ずることを証明している。上記の実験は、リガンドは組換えＦｌｔ４ＥＣドメインに結合することを証明している。従って、そのリガンドは、アフィニティークロマトグラフィーにおいてＦｌｔ４ＥＣドメインを使用して精製することができる。精製した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、二フッ化ポリビニリデン（PVDF）膜にブロットし、そのアミノ末端配列を当技術上標準的な方法によって決定することができる。または、アミノ末端配列決定のために精製したリガンドをペプチドまで消化してもよい。精製した蛋白質から得られたペプチド配列を、このような配列をコードするオリゴヌクレオチドの混合物を合成するために使用する。当技術上標準的な方法によって（Wen et al., Cell 69: 559-572(1992)）、このようなオリゴヌクレオチドおよびそれらの相補的なＤＮＡ鎖相対物を放射性標識し、リガンドをコードするｃＤＮＡを得るためにＰＣ−３細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用することができる。または、このようなオリゴヌクレオチドおよびそれらの相対物を、鋳型としてＰＣ−３細胞ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを使用して、リガンドをコードする配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用することができる。このようなｃＤＮＡ合成方法およびＰＣＲ（RT-PCR）は当技術上標準的である（Innis et al., 1990, PCR protocols, Academic Press; McPherson, M. J. et al., 1991, PCR, a practical approach, IRL Press; Partanen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 8913-8917(1990)）。よりさらなる別法は、真核発現ベクターにクローニングしたｃＤＮＡｓを使用して（例えば、Invitrogen LibrarianクローニングキットおよびpcDNAまたはpcDNA IIIなどの提供されているベクターを使用する）ＰＣ−３細胞のＦｌｔ４リガンドをクローニングし、例えばＣＯＳ細胞にトランスフェクトしたこのようなライブラリーをＦｌｔ４−アルカル性ホスファターゼ（Cheng and Flanagan, Cell, 79: 158-168,(1994)）、Ｆｌｔ４−免疫グロブリン（Flt4-Ig）（Lyman et al., Cell, 75; 1157-1167(1993)）、または同様の親和性試薬を用いて当技術上標準的な方法によってスクリーニングすることである。
【０１６１】
実施例１３
細胞系統およびトランスフェクション
ＮＩＨ３Ｔ３細胞および２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen）を１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで培養した。安定な発現のために、ＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（Boehringer-Mannheim）を使用してリポフェクション方法によって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡがモロニーマウス白血病ウィルスＬＴＲプロモーターのコントール下で発現されるＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクターおよびｐＳＶ−ｎｅｏベクターをトランスフェクトした（上記実施例4参照）。ＣＯＳ−１細胞はＤＥＡＥデキストラン方法によってトランスフェクトした（McClutchan and Pagano, J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-35(1968) ）。トランスフェクトした細胞は５００ｍｇ／ｍｌネオマイシン中で選択した。
【０１６２】
実施例１４
Ｆｌｔ４融合蛋白質の構築および発現
ｐＶＴＢａｃ−ＦＬＴ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ融合構築物。Ｆｌｔ４コードするｃＤＮＡの末端は以下のように改変した：細胞外ドメイン（ＥＣ）をコードするＦｌｔ４ｃＤＮＡ配列の３’側末端を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Germany）に結合するための６つのヒスチジン残基をコードする、オリゴヌクレオチド5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'（配列番号：13、下線はSalI部位、配列番号：1のヌクレオチド2184〜2204に相当する配列を含有する）および5'-CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3'（配列番号：14、下線はBamHI部位、配列番号：1のヌクレオチド2341〜2324に相当する配列を含む）およびその次の停止コドンを使用して増幅した。増幅した断片はＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクター内にライゲーションし（実施例4参照）、Ｆｌｔ４膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を含有する独自のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片に交換した。
【０１６３】
Ｆｌｔ４シグナル配列コード領域を含有しないＦｌｔ４ｃＤＮＡの５’側末端は、オリゴヌクレオチド5'-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3'（配列番号：11、下線はHindIIIおよびBamHI部位、配列番号：1のヌクレオチド86〜103に相当する配列を含有する）および5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3'（配列番号：12、配列番号：1のヌクレオチド700〜681に相補的な配列を含有する）を使用してＰＣＲによって増幅した。この増幅した断片（配列番号：1のヌクレオチド86〜700を含んだ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで消化した（ＳｐｈＩ部位、配列番号：1のヌクレオチド588〜593に相当する、Ｆｌｔ４ｃＤＮＡの増幅した領域内にある）。
【０１６４】
得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片を使用して、すぐ上に上記した改変ＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片に交換した（HindIII部位はFlt4挿入物とベクターのpLTRpoly部分の5'側結合部であり、SphI部位はFlt4cDNA内にあり、配列番号：1のヌクレオチド588〜593に相当する）。次いで、得られたＦｌｔ４ＥＣ−６ＸＨｉｓ挿入物をｐＶＴＢａｃプラスミドのＢａｍＨＩ部位のＢａｍＨＩ断片としてライゲーションした（Tessier et al., Gene 98: 177-183(1991)）。構築物をバキュロウィルスゲノムＤＮＡと共にリポフェクションによってＳＦ−９細胞にトランスフェクトした。組換えウィルスを作製し、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞（Invitrogen）の感染に使用した。
【０１６５】
Ｆｌｔ４−ＡＰ融合構築物。Ｆｌｔ４ＥＣドメインをコードする配列の３’側末端を、オリゴヌクレオチド5'CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'（配列番号：15）および5'-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3'（配列番号：16）を使用して増幅し、ＬＴＲ−Ｆｌｔ４ｌベクターにＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてライゲーションし、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列と交換した。次いで、得られた挿入物を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として、アルカル性ホスファターゼコード領域内のプラスミドＡＰｔａｇ−１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ部位にライゲーションした（Flanagan and Leder, 1990, Cell 63: 185-194）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＦｌｔ４−ＡＰ構築物およびｐＳＶｎｅｏ（Southern and Berg., J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341(1982)）と共にＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（Boehringer）を使用してリポフェクションによって同時トランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を５００ｍｇ／ｍｌネオマイシンの存在下で選択した。培地中に産生された組換え蛋白質は、アルカル性ホスファターゼ活性の染色について発色反応によって検出した（Cheng and Flangan, Cell 79: 157-168(1994)）。
【０１６６】
Ｆｌｔ４−Ｉｇ構築物。Ｆｌｔ４−免疫グロブリンキメラをコードする組換えＤＮＡは以下のように構築した：シグナル配列をコードするＦｌｔ４ヌクレオチドを含むＦｌｔ４をコードするｃＤＮＡの５’側末端を、プライマー5'-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCAGCGGGGCGCC-3'（配列番号：17）および5'-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3'（配列番号：18）を使用してＰＣＲによって増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクターにライゲーションした。Ｆｌｔ４ＥＣコード配列の３’側末端をオリゴヌクレオチド5'-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3'（配列番号：19）および5'-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCTGCCCTTATCCTCG-3'（配列番号：20）を使用して増幅し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌベクターにライゲーションして、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列と交換した。スプライスドナー部位を含有するこのＦｌｔ４ＥＣ挿入物を、まずヒト免疫グロブリン重鎖ヒンジおよび不変領域エクソンをコードするエクソンを含有するｐＨγＣＥ２にライゲーションした（Karjalainen, K., TIBTECH, 9: 109-113(1991)）。Ｆｌｔ４−Ｉｇキメラを含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物を当技術上標準的な方法によってブロットし（Klenov）、ｐＲＥＰ７（Invitrogen）のブロットしたＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションした。リン酸カルシウム沈降方法によって構築物を２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトし、調整培地をプロテインＡ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによるＦｌｔ４−Ｉｇ蛋白質の単離のために使用した。
【０１６７】
実施例１５〜１７
Ｆｌｔ４リガンドの精製および配列決定
血清欠損条件下下でＰＣ−３細胞によって産生された細胞培養上清をCetriprepフィルターカートリッジを使用して３０〜５０倍に濃縮し、固定したＦｌｔ４細胞質ドメインのカラムに負荷する。別の構築物および方法を使用して２つの親和性基質を調製する。第一の場合では、Ｆｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ融合蛋白質をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（Pharmacia）に架橋し、第二の場合では、Ｆｌｔ４−Ｉｇ融合蛋白質をプロテインＡ−セファロースにジメチルピメリジン（Schneider et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 10766-10869）。アフィニティーカラムから溶出した物質をイオン交換および逆相高速液体クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してさらに精製する。クロマトグラフィー分画は、Ｆｌｔ４のチロシンリン酸化を刺激する能力について試験する。精製した生物学的に活性なリガンド蛋白質を微小配列決定し、リガンドをコードするｃＤＮＡを単離し、クローニングする目的のために、例えば、ＰＣ−３細胞から単離したポリ（Ａ）⁻ＲＮＡから作製されるｃＤＮＡライブラリーから、得られたアミノ酸配列に基づいて、変性オリゴヌクレオチドを作製する。
【０１６８】
血管内皮増殖因子Ｃ（VEGF-C）と命名されるＦｌｔ４リガンドの詳細な特徴並びに、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｃ変種および類似物をコードする未変性のヒト、ヒト以外の哺乳類および鳥類のポリヌクレオチド配列は、その全てが全体の内容が参照として組み入れられている１９９８年２月に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号（国際公開公報第98/33917号として1998年8月06日に公開）；Joukov et al., J. Biol. Chem., 273: 6599-6602(1998)；Joukov et al.,EMBO J., 16(13): 3898-3911(1992)および１９９６年８月１日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＦＩ９６／００４２７号（国際公開公報第97/05250号として公開）に提供されている。そこに詳細に説明されているように、ヒトＶＥＧＦ−Ｃは最初、４１９アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドとしてヒト細胞中で産生される。ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸配列は配列番号２１に記載されており、ヒトＶＥＧＦ−ＣをコードするｃＤＮＡは、ブタペスト条約の規定に従って、American Type Culture Collection(ATCC)、１０８０１University Blvd. Manasses, VA 20110-2209(USA)に寄託されている（寄託日、1995年7月24日、受託番号97231）。他の種のＶＥＧＦ−Ｃ配列も報告されている。例えば、参照として本明細書に組み入れられているGenbank Accession Nos. MMU73620(Mus musculus)およびCCY15837(Cotunix cotunix)
【０１６９】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃは多段階で処理されて、約２１〜２３ｋＤｎｏ成熟した、最も活性なＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを産生する（還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価したとき）。このような処理には、シグナルペプチドの切断（配列番号：21、残基1-31）；約２９ｋＤの部分的に処理された形態を作製するための、カルボキシル−末端ペプチドの切断（配列番号：21のアミノ酸228-419にほぼ相当し、Balbiani環3蛋白質（BR3P）配列を回想する間隔をおいたシステイン残基パターンを有する[Dignam et al., Gene, 88:: 133-40(1990); Paulsson et al., J. Mol. Biol., 211: 331-49(1990)]；および約２１〜２３ｋＤの完全に処理された成熟型を作製するための、アミノ−末端ペプチド（配列番号：21のアミノ酸32-103にほぼ相当）の切断（あきらかに細胞外）が含まれる。実験による証拠は、ＶＥＧＦ−Ｃの部分的に処理された形態（例えば、29 kD型）はＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）受容体に結合することができるが、ＶＥＧＦＲ−２への高親和性結合は、ＶＥＧＦ−Ｃの完全に処理された形態にのみ生じる。ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは天然には非ジスルフィド結合ダイマーとして結合すると思われる。
【０１７０】
さらに、配列番号：２のアミノ酸配列１０３〜２２７はＶＥＧＦ−Ｃ機能を維持するために必ずしも重大ではないことが実証されている。配列番号：２のアミノ酸１１３〜２１３からなるポリペプチド（１０３〜１１２および２１４〜２２７を欠失する）はＶＥＧＦ−Ｃ受容体に結合し、刺激する能力を維持し、残基約１３１〜残基約２１１におよぶポリペプチドはＶＥＧＦ−Ｃ生物活性を維持していることが期待される。位置１５６のシステイン残基はＶＥＧＦＲ−２結合能力にとって重要であることが示されている。しかし、ＶＥＧＦ−ＣΔＣ_１５６ポリペプチド（すなわち、欠失または置換によりこのシステインを欠失している類似物）は、ＶＥＧＦＲ−３の強力な活性を維持している。配列番号：２の位置１６５のシステインはどちらかの受容体の結合に必須であるが、位置８３または１３７のシステインを欠失する類似物は両受容体との結合に関してＶＥＧＦ−Ｃと競合し、両受容体を刺激する。
【０１７１】
ヒトＶＥＧＦ−Ｃと他の種のＶＥＧＦ−Ｃを並べると（一般に許容されている任意の配列アルゴリズムを使用して実施される）、ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を破壊することなく、改変が導入されていてもよい追加の残基を示唆している（ずなわち、挿入、置換および/または欠失）。２つ以上の種の並べたＶＥＧＦ-Ｃポリペプチドが異なるアミノ酸、特に異なる化学的特性の側鎖を有する異なるアミノ酸を有する任意の位置は、それと同時に機能の消失を伴うことなく、改変を受けやすい位置であってもよい。ヒト、マウスおよびウズラＶＥＧＦ-Ｃを例示的に並べたものはＰＣＴ／ＵＳ９８／０１９７３号の図５に記載されている。
【０１７２】
上記の考慮とは別に、数多くの同類アミノ酸置換を野生型ＶＥＧＦ-Ｃ配列に実施することができ、特にこのような置換が小規模である場合には、ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を維持するポリペプチドが得られると思われる。「同類アミノ酸置換」は、ある種のアミノ酸と同様の化学的特徴の側鎖を有するアミノ酸の置換を意味する。同類アミノ酸置換を作製するための同様のアミノ酸には、酸性側鎖（グルタミン酸、アスパラギン酸）、塩基性側鎖（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、極性アミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）、疎水性脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）、芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、小型側鎖（グリニン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）または脂肪族ヒドロキシ側鎖（セリン、スレオニン）を有するものを含む。ＶＥＧＦ-Ｃ生物活性を破壊することなく、１つまたは少数の内部アミノ酸の付加または欠失も考慮される。
【０１７３】
上記から、多数のポリペプチドおよび変異体が高親和性でＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）に結合することが考えられ、従って、Ｆｌｔ４結合化合物を使用して、組織試料の画像形成またはスクリーニングを含む本発明の局面においてＦｌｔ４結合化合物として有用である。得られたポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３の高い結合特異性を有するように、ＶＥＧＦＲ−３結合親和性を低下または排除する変更を保有する型のＶＥＧＦ-Ｃは特に興味深い。上記のように、このような変更には、実質的にＶＥＧＦＲ−３結合親和性を排除するＣｙｓ_１５６の欠損または交換、または天然のプレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃ蛋白質分解処理部位を破壊するアミノ酸配列変更を含む（ＶＥＧＦＲ−2親和性は完全に処理されたＶＥＧＦ-Ｃで最も高いからである）。また、Ｆｌｔ４結合親和性を維持するが、Ｆｌｔ４自己リン酸化を活性化しないように改変されているＶＥＧＦ-Ｃ分子は、本明細書に記載する治療方法の有用なＦｌｔ４拮抗剤である。本明細書に記載するＦｌｔ４リガンドは、ヒトＦｌｔ４対立遺伝子変異体の正体を確認し、本明細書に教示するＦｌｔ４配列に相同性を有する非ヒト遺伝子配列（例えば、実施例8および図4参照）が実際にＦｌｔ４の非ヒト相対物であることを確認するための追加の指標としてアッセイに使用することができることは上記の教示からさらに明らかになる。プレプロ-ＶＥＧＦ-Ｃの推定されるアミノ酸配列を本明細書の配列番号：21に記載する。
【０１７４】
血管内皮増殖因子Ｄ（VEGF-D）と命名されるＦｌｔ４リガンドの詳細な特徴並びに、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｄ変異体および類似物をコードする未変性のヒトポリヌクレオチド配列は、その全てが全体の内容が参照として組み入れられている１９９７年８月２１日に提出され、国際公開公報第９８／０７８３２号として１９９８年２月２６日に公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６号；Achen et al., Proc. Natl. Acad. Scie U.S.A., 95(2):548-553(1998)に提供されている。そこに詳細に説明されているように、ヒトＶＥＧＦ−Ｄは最初、３５４アミノ酸のプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドとしてヒト細胞中で産生される。ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−ＤのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は配列番号２２に記載されている。他の種のＶＥＧＦ−Ｄ配列も報告されている。例えば、参照として本明細書に組み入れられている、Genebank Accession Noｓ.Ｄ８９６２８（Mus musculus）およびＡＦ０１４８２７（Rattus norvegicus）参照。
【０１７５】
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは２１アミノ酸のシグナルペプチドと推定され、明らかにプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｄの処理と類似した方法で蛋白質分解的に処理される。配列番号：２２の「組換えにより変異させたＶＥＧＦ−Ｄ欠損残基１〜９２および２０２から３５４は、受容体をＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３活性化する能力を維持し、非共有結合的に結合したダイマーとして結合すると思われる。本発明のＦｌｔ４結合化合物としてのＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの利用性はＶＥＧＦ−Ｃについて上記したものと類似している。同様に、ＶＥＧＦ−Ｄの同様の変更（ＶＥＧＦ相同ドメインにおいて８つの保存されたシステインの２番目を排除する、Ｃｙｓ_１３６または蛋白質分解処理部位を排除する）により、ＶＥＧＦＲ−２結合親和性が低下または排除された、従って、Ｆｌｔ４特異性が増加したポリペプチドが得られる。Ｆｌｔ４結合親和性を維持するが、Ｆｌｔ４自己リン酸化を活性化しないように改変されているＶＥＧＦ−Ｄ分子は、本明細書に記載されている治療方法の有用はＦｌｔ４拮抗剤である。
【０１７６】
実施例１８
マウスＦｌｔ４ｃＤＮＡプローブのクローニング
１２９ＳＶマウス（Stratagene）のλＦＩＸ（登録商標）ＩＩゲノムライゲーションの約１０^６プラークを、細胞質ドメインをカバーする、上記Ｓ２．５ヒトＦｌｔ４受容体ｃＤＮＡ断片でスクリーニングしたPajusola et al., Cancer Res. 52: 5738(1992)を参照。２．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片を陽性プラークからサブクローニングし、両方の末端から配列決定した。このサブクローンからポリメラーゼ連鎖反応を使用して、増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋／−ベクター（Stratagene）にマウスＦｌｔ４ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１７４５〜２０４９をカバーするエクソン断片クローニングした。Pinnerty et al., Oncogene, 8: 2293(1993)。
ヌクレオチド１〜１９２をカバーする第二の断片を同様にクローニングした。
【０１７７】
実施例１９
マウス組織におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析
Chomoczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156(1987)により発生中の胚（8〜18日p. c.および1日齢のマウス）から総ＲＮＡを単離した。8日p. c.胚の試料は胎盤も含んでいた。
【０１７８】
ＲＮＡａｓｅ保護分析は、アンチセンス方向化のために[^３２Ｐ]−ＵＴＰおよびＴ７ポリメラーゼを使用して、実施例１８により得た直線化したマウスＦｌｔ４プラスミドからＲＮＡプローブを作製した。使用したβ−アクチンプローブは報告されているマウスβ−アクチン配列のヌクレオチド１１８８〜１２７９に相当する。Tokunaga, et al., Nucleic Acid Res., 14: 2829(1986) を参照。６％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで精製後、標識した転写物を３０μｇの総ＲＮＡに５２℃において終夜ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションしなかったＲＮＡをＲＮＡａｓｅ Ａ（１０Ｕ／ｍｌ）およびＴ１（１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃においてｐＨ７．５で１時間消化した。ＲＮＡａｓｅは３７℃においてプロテイナーゼＫ消化によって１５分間で不活性化し、試料を６％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル中で分析した。
【０１７９】
この実験において分析したＦｌｔ４の発現パターンは、非常に弱いｍＲＮＡシグナルが肺、肝臓、心臓、腎臓、骨格筋および脾臓から得られたが、精巣および脳は特異的なシグナルを明らかに生じなかった。ＲＮＡａｓｅ保護アッセイによって異なる発生段階において採取された一連のＲＮＡｓの分析は、Ｆｌｔ４ＲＮＡは８ｐ．ｃ．から新生児マウスまでの胚形成期間中に大きなシグナル強度の変化を生ずることなく発現されることを示した。
【０１８０】
実施例２０
マウス胚におけるＦｌｔ４のインサイチューハイブリダイゼーション
Ｆｌｔ４転写物を細胞および組織によりよく割り付けるために、７．５および８．５日ｐ．ｃ．マウス胚の切片に標識したＦｌｔ４ＲＮＡｓでハイブリダイゼーションした。マウス胚はＣＢＡとＮＭＲＩマウスの交配から誘導した。妊娠マウスは断頭によって犠牲にし、胚を速やかに凍結するか、またはリン酸緩衝生理食塩液を介して４％パラホルムアルデヒドに移した。胚および単離したマウス器官を４℃において１８時間固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、６μｍの切片に切断した。
【０１８１】
１９２および３０５ヌクレオチドのＲＮＡプローブ（アンチセンスおよびセンス）（実施例18参照）は、[^３５Ｓ]−ＵＴＰを使用して直線化したプラスミドから作製した。切片のインサイチューハイブリダイゼーションは、以下の改良を加えて参照として本明細書に組み入れられているWilkinson et al., Development, 99: 493(1987);およびWilkinson et al., Cell. 50: 79(1987)により実施した：１）トルエンの代わりに、パラフィンワックスに包埋する前にキシレンを使用した；２）２）６μｍの切片を切断し、２％３−リエトキシシリルプロピルアミンで前処理したガラススライドの表面のジエチルピロカルボネート処理した水の層の上に配置した；３）プローブのアルカリ性加水分解を省いた；４）高度の緊縮条件洗浄は３０ｍＭＤＴＴおよび１×ＳＣＣを含有する溶液中で６５℃において８０分間とした。切片はＮＴＢ−２エマルジョン（Kodak）をカバーし、４℃において保存した。スライドを１４日間の露出し、現像し、ヘマトキシリンで染色した。センス鎖およびＲＮＡａｓｅ−Ａ処理した切片を用いた対照ハイブリダイゼーションはバックグラウンドを上回る特定のシグナルを生じなかった。
【０１８２】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現は７．５日ｐ．ｃ．マウス胚では検出されなかったが、はっきりしたシグナルが発生８．５日の発生中の大動脈で検出された。一方、発生中の卵黄嚢はＦｌｔ４−陰性であった。胚外組織では、Ｆｌｔ４は羊水中で顕著に発現されたが、卵黄嚢の発生中の血島は陰性であった。一方、頭部間葉の血管芽細胞は強力にＦｌｔ４陽性であった。発生中の胎盤では、Ｆｌｔ４シグナルは抹消洞様血管に最初に見られた。９．５日ｐ．ｃ．胎盤では、静脈小窩の内皮およびライヘルト膜に部分的に融合した巨大細胞はＦｌｔ４を発現した。
【０１８３】
従って、Ｆｌｔ４発現は早期の内皮細胞前駆体、血管芽細胞では非常に顕著であるが、８．５日ｐ．ｃ．胚のある種の血管に制限されると思われた。Ｔｉｅ受容体は発生中のマウス胚の全ての内皮細胞に発現することが知られているので、これらの細胞のマーカーとなる。Korhonen, et al., Oncogene, 8: 395(1993) ；およびKorhonen et al., Blood, 80: 2548-2555(1992) 参照。Ｔｉｅプローブとは異なって、注目すべきことには、Ｆｌｔ４プローブは、あったとしても非常に弱く、１１．５日ｐ．ｃ．胚の動脈内皮、例えば発生中の背大動脈または頚動脈の内皮とハイブリダイゼーションした。代わりに、Ｆｌｔ４シグナルは発生中の静脈でははるかにずっと顕著であった。例えば、Ｆｌｔ４シグナルは発生中の後腎を取り巻く静脈内で検出されたが、Ｔｉｅプローブは後腎内部の毛細血管を顕著に認識した。
【０１８４】
Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは１２．５日ｐ．ｃ．マウス胚のいくつかの領域に分布していることが観察され、腋窩領域の拡張した血管に特に顕著であった。同様のＦｌｔ４−陽性血管構造は頸静脈領域の中心−矢状断面において見られた（データは示していない）。Ｆｌｔ４発現血管の網状組織様パターンは眼窩周囲領域および発生中の脊椎周囲で見られた。また、発生中の皮膚の下層でも、Ｆｌｔ４陽性血管網が明らかであった。より弱い毛細管シグナルは、発生中の脳を含むいくつかの領域から得られた。Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは頸部領域、発生中の鼻および発生中の舌の基底部並びに尾領域の小血管中でも検出された。また、肝臓は、斑点状パターンでＦｌｔ４ｍＲＮＡが強力に陽性であった。
【０１８５】
さらに発生中では、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡは胚のある種の血管により限定されるようになると思われる。１４．５日ｐ．ｃ．胚はこの制限されたパターンの発現をうまく示している。このような胚の中矢状切片では、最も顕著なＦｌｔ４信号はその前部の発生中の脊柱に沿って観察された。このシグナルは、この発生時期において形成される最も大きいリンパ管である胸管の内皮細胞を起源としていると考えられた。一方、背大動脈および下大静脈は陰性であった。腸間膜領域の拡張した血管もＦｌｔ４が強力に陽性であった。さらに、１２．５日ｐ．ｃ．胚と同様に、眼窩周囲、下顎並びに頸部領域の解剖学的境界に沿った血管網はＦｌｔ４陽性内皮を含有した。同様の組織は心膜空間および皮下組織に存在した。注目すべきことに、Ｆｌｔ４陰性血管とは異なって、全てのＦｌｔ４陽性血管はその内腔に血球細胞が欠損していた。これらの発現パターンは、Ｆｌｔ４は、この発生時期ではリンパ管の内皮に限定されることを示唆している。Ｆｌｔ４発現が観察される追加の部位は発生中の骨髄の洞内である。
【０１８６】
Ｆｌｔ４プローブをハイブリダイゼーションした１６．５日ｐ．ｃ．胚の上部胸部の横方向の切片を分析した。ヘマトキシリン−エオシン染色はこの領域の異なる種類の血管を可視化するために実施した。これらには、サイズがより小さく、周囲の血管および結合組織を欠損している頚動脈および腕頭動脈、大静脈および胸管が含まれる。より高倍率下では、胸管並びにその付近の小血管の内皮細胞はＦｌｔ４プローブとハイブリダイゼーションすることが観察された。
【０１８７】
実施例２１
培養内皮細胞におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析
実施例２０に記載されたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果は、Ｆｌｔ４が、動脈細胞ではなく、静脈内皮細胞で発現し、そしてリンパ管およびいくつかの静脈内皮細胞において後期に発現していることを明らかにした。そのような調節がインビトロで維持されているかどうかを明らかにするために、本発明者らは、ノーザンブロッティング分析およびハイブリダイゼーション分析を使用して培養内皮細胞を調べた。
【０１８８】
ヒト大動脈、大腿深静脈、臍静脈および包皮微小血管から内皮細胞を単離および培養して、この分野で以前に記載されているようにして特徴付けを行った。Ｖａｎ Ｈｉｎｓｂｅｒｇ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、７：３８９（１９８７）；およびＶａｎＨｉｎｓｂｅｒｇ他、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、５７：１４８（１９８７）を参照のこと。ポリアデニル化ＲＮＡを単離するために、細胞を５代〜８代の継代（１：３のスプリット比）の後のコンフルエンス密度で使用した。
【０１８９】
内皮細胞株のＢＡｈｙ９２６（Ｅｄｇｅｌｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：３７３４〜３７３７（１９８３））、ＢＣＥ（Ｆｏｌｋｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：５２１７〜５２２１（１９７９））およびＬＥＩＩ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：６１３８（１９８５））はＦｌｔ４を発現しなかった。しかし、培養されたヒト微小血管、静脈および臍静脈の内皮細胞は、Ｆｌｔ４に特異的な５．８ｋｂおよび４．５ｋｂのｍＲＮＡに関して陽性であったが、大動脈の内皮細胞は陰性であった。対照的に、別の内皮細胞レセプターのチロシンキナーゼ遺伝子ｔｉｅは、調べたすべての内皮細胞タイプで４．４ｋｂのｍＲＮＡとして発現していた。
【０１９０】
実施例２２
成人ヒト組織におけるＦｌｔ４のｍＲＮＡ
実施例２０で得られた結果は、Ｆｌｔ４のｍＲＮＡが、発達中のリンパ管の内皮細胞に大部分が限定されることを示していた。ヒトにおけるこの発見は重要と考えられるために、本発明者らはまた、成人ヒト組織におけるＦｌｔ４の発現を、ヒトＦｌｔ４プローブを使用して調べた。使用されたヒトＦｌｔ４プローブは、ｃＤＮＡ（配列番号１）の塩基対１〜５９５を覆うＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントであった。Ｐａｊｕｓｏｌａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：５７３８（１９９２）もまた参照のこと。フォンウィルブラント因子プローブは、塩基対１〜２３３４を覆うＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであった。Ｂｏｔｔｈｒｏｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４１：７１２５（１９８６）。
【０１９１】
本発明者らは、組織病理学的診断のために送られてきた固定化材料を日常的に使用した。正常な肺組織を、類表皮ガンに冒された左下肺葉の切除物から得た。腸間膜および腸間リンパ節を結腸腺ガン患者から得た。唾液腺に隣接する正常なリンパ節を、その異常なサイズのために摘出した。２名の患者から得られた扁桃および２つの虫垂は診断的な変化を有していなかった。２つのリンパ管筋腫症および３つの嚢胞性リンパ管腫を調べたが、類似する結果が得られた。
【０１９２】
組織病理診断のために１０％ホルマリンで固定された日常的なサンプルであるヒト組織の場合、正常なｉｎ ｓｉｔｕプロトコルはバックグラウンドを与えただけであったが、プロテイナーゼＫの代わりにマイクロ波での処理は特異的なハイブリダイゼーションを可能にした。Ｓｈｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：５７７４（１９９１）；Ｃａｔｏｒｅｔｔｉ他、Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１６８：３５７（１９９２）。
【０１９３】
腸間膜において、肺および虫垂のリンパ内皮細胞はＦｌｔ４シグナルを与えたが、静脈、動脈および毛細血管は陰性であった。Ｆｌｔ４がＨＥＶで発現しているかどうかを調べるために、扁桃を調べた。実際、扁桃において、Ｆｌｔ４に特異的なオートラジオグラフィーシグナルがいくつかのＨＥＶで検出された。
【０１９４】
実施例２３
正常なリンパ節および転移性リンパ節ならびにリンパ管腫におけるＦｌｔ４ｍＲＮＡの分析
ヒトの腸間リンパ節（実施例２２を参照）の一部をＦｌｔ４の発現について分析した。Ｆｌｔ４の発現が、リンパ洞ならびに求心性および遠心性のリンパ管で認められた。同じパターンが、腺ガン転移物を含むリンパ節で認められた。正常なリンパ節および転移性リンパ節の両方におけるいくつかのＨＥＶもまた陽性であった。嚢胞性リンパ管腫におけるＦｌｔ４の発現は、すべての血管のフォンウィルブラント因子に対するｉｎ ｓｉｔｕシグナルとの比較から明らかであるように、リンパ内皮細胞に特異的であった。
【０１９５】
これらの結果と一致して、Ｆｌｔ４に関する免疫染色は、考えられるリンパ内皮細胞の増殖を特徴とする希な疾患である皮膚のリンパ管腫転移物の内皮細胞において強い陽性であった。Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３（２）：３９５〜４０３（１９９８年８月）、これは参考としてその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１９６】
さらに、Ｆｌｔ４に対する免疫染色により、紡錘細胞がカポジ肉腫皮膚節病巣組織サンプル内に同定された。Ｊｕｓｓｉｌａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：１５９９〜１６０４（１９９８年４月）。Ｆｌｔ４の明らかなリンパ特異性を考慮して、これらの結果は、カポジ肉腫内の特定の細胞はリンパ内皮細胞起源であるという示唆と一致すると考えることができる。例えば、Beckstead他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１１９：２９４〜３００（１９８５）；Ｄｉｃｔｏｒ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３０：４１１〜４１７（１９８８）を参照のこと。
【０１９７】
実施例２４
胎児内皮細胞中へのFlt4の局在化
実施例２で述べたように、短形の40個のカルボキシ基末端アミノ酸をエンコードしたFlt cDNA断片を657bpEcoRJ断片として、グルタチオン-S-転移酵素コード化部位を有するフレーム中のpGEX-1λT細菌性発現ベクターへクローン化した。得られるGST-Flt4融合蛋白は、E.coli中に生産され、グルタチオン-Sepharose 4Bカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製したプロテインを凍結乾燥し、PBSに溶解し、フロインドアジュバントと混合し、ウサギの免疫化に使用した。抗血清を三番目の追加免疫の免疫化に使用した。
【０１９８】
17週及び20週齢のヒト胎児からの組織を、プロスタグランジンで誘発した合法的流産児から得た。本研究は，Helsinki Central 病院の倫理委員会の承認を受けた。妊娠期間は、胎児の足の長さから推定した。胎児組織はTissue-Tek中に包埋し、ただちに凍結し、-70℃で保管した。
【０１９９】
Anti-Flt4抗血清を、GST-Sepharoseカラムに交叉吸着させ、anti-GST抗体を除去し、次いで、GST-Flt4アフィニティークロマトグラフィーで精製した。厚さ６μmの数個のクリオスタット組織切片をアセトンで固定し、メタノール中０.３%のH₂O₂で３０分間処理し、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。洗浄後、切片を５%標準豚スクラムで培養した。次に切片をFlt4に対する抗体で培養し、洗浄した。結合した抗体はペルオキシダーゼ-複合豚 抗-ウサギIgGで検出し、次いでペルオキシダーゼ活性のために基質として0.2% 3,3-ジアミノベンチジン（Ameraham）を用いて染色した。
【０２００】
ヒト胎児腸間膜のAnti-Flt4免疫ペルオキシダーゼ染色により、幾つかの内腱鞘血管Flt4蛋白が認められた。一方、抗原-ブロックしたanti-Flt4抗体およびプレ免疫血清による対照染色は陰性であった。比較のために、切片を、FactorVIIIに関係する抗原に対する抗血清で染色した。これは血管内皮細胞に特異的である。Flt4の免疫ペルオキシダーゼ染色は、血管の内皮細胞上で観察された。これには、赤血球細胞は含まれていない。一方、血管は陰性であった。赤血球のない血管はリンパ性の内皮細胞のようであり；そのような血管は特に腸間膜に多い。FactorVIIIに関係する抗原に対する抗体により、全ての内皮細胞を染色した。
【０２０１】
実施例２５
Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体の産生
融合Ｉ：
Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞においてＦｌｔ４ＥＣ−６ｘＨｉｓ−ｐＶＴＢａｃプラスミド（実施例１４）を発現することによって、組換えＦｌｔ４細胞外ドメイン蛋白質を産生した。組換えＦｌｔ４細胞外ドメインのＣＯＯＨ−末端にコードされる６ｘＨｉｓ標識を結合し、溶出するために、Ｆｌｔ４細胞外ドメイン（Ｆｌｔ４ＥＣ）は、製造業者の指示により、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して感染させたＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞の培養培地から精製した。
【０２０２】
４月齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスに、フロイントの完全アジュバントで乳化した組換え産生し、精製したＦｌｔ４細胞外ドメイン蛋白質（１５０μｇ／マウス）を腹腔内注射することによって免疫した。１５０μｇの追加抗原投与は３〜４週間間隔で投与し、最終抗原投与（１０μｇＦｌｔ４ ＢＣのＰＢＳ溶液、腹腔内投与）はさらに３週間の間隔後に投与した。最後の追加抗原投与の４日後に、マウスを犠牲にし、マウスの脾臓リンパ系細胞にＳＰ２／０形質細胞腫細胞を２：１の比でそれぞれ融合した。
【０２０３】
融合した細胞を、９６ウェルの培養プレート（NUNC）の２０％ウシ胎仔血清およびＨＡＴ強化剤（ハイポキサンチン−アミノプテリン−チミジン；ＧＩＢＣＯ，０４３−０１０６０Ｈ；５０倍希釈）を含有するＥｘ−Ｃｅｌｌ３２０培地（SERALAB）に回収した。細胞を＋３７℃において、５％ＣＯ_２雰囲気中で培養した。１０日後、ＨＡＴ−強化培地をＨＴ強化した細胞培養培地（ＧＩＢＣＯ，０４３−０１０６５Ｈ；５０倍希釈）に交換した。ＨＴ培地はＨＡＴ培地と同じであるが、アミノプテリンを欠損している。
【０２０４】
３週間後、特異的な抗体産生を、以下の実施例２６に記載した抗原特異的ImmunoFluoroMetric Assay,(IFMA)によって求めた。マスタークローンをStaszewski et al., Yale Journal of Biology and Madicine, 57: 865-868(1984)によって記載されているように限界希釈によってクローニングした。陽性クローンを２４ウェルの組織培養プレート（NUNC）で増殖し、再度クローニングし、同じ方法によって試験した。陽性のクローンは蛍光活性化細胞選別（FACS）によって試験した。
【０２０５】
安定なクローンは、おそらくクラスＩｇＡに属するＩｇを産生した１つを除いて、ＩｇＧ_１クラスに属する免疫グロブリンを分泌した。モノクローナル抗体のサブクラスは、ＩＦＭＡにおけるビオチン結合物（SEROTEC）としてマウスサブクラスに対するラットモノクローナル抗体を使用して求めた。
【０２０６】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用して腹水中でモノクローナル抗体を産生した。上記のハイブリドーマを、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン９８％、ALDRICH-CHEMIE F 7924 Steinheim,カタログ番号T2,280-2）で動物を前処理した後に、マウスに腹腔内注射した。０．５ｍｌのプリスタン（i.v.）を、ハイブリドーマ細胞の約２週間前に注射した。注射した細胞の量は約７．５〜９×１０^６／マウスであった。ハイブリドーマの注射の１０〜１４日後に腹水を採取した。
【０２０７】
融合ＩＩ：
２月齢のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）に、フロイントの完全アジュバントで乳化した組換え産生し、精製したＦｌｔ４細胞外ドメイン蛋白質（２０μｇ／マウス）を腹腔内注射することによって免疫した。２０μｇの追加抗原投与は３〜４週間間隔で投与し、最終抗原投与（１０μｇＦｌｔ４ ＢＣのＰＢＳ溶液、静脈内投与）はさらに３週間の間隔後に投与した。最後の追加抗原投与の４日後に、マウスを犠牲にし、マウスの脾臓リンパ系細胞にＳＰ２／０形質細胞腫細胞を２：１の比でそれぞれ融合した。
【０２０８】
融合した細胞を、９６ウェルの培養プレート（FALCON）の２０％ウシ胎仔血清およびＨＡＴ強化剤（ハイポキサンチン−アミノプテリン−チミジン；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ２１０６０−０１７；５０倍希釈）を含有するＯｐｔｉＭＥＭ１（およびＧｌｕｔａｍａｘ,１,５１９８５−０２６,ＧＩＢＣＯＢＲＬ）培地に回収した。細胞を＋３７℃において、５％ＣＯ_２雰囲気中で培養した。１０日後、ＨＡＴ−強化培地をＨＴ強化した細胞培養培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，４１６０５−０１２；５０倍希釈）に交換した。
【０２０９】
３週間後、特異的な抗体産生を、以下の実施例２６に記載した抗原特異的ImmunoFluoroMetric Assay,(IFMA)によって求めた。マスタークローンをStaszewski et al(1984)によって記載されているように限界希釈によってクローニングした。陽性クローンを２４ウェルの組織培養プレート（FALCON）で増殖し、再度クローニングし、同じ方法によって試験した。陽性のクローンはＦＡＣＳによって試験した。
【０２１０】
２Ｅ１１および６Ｂ２クローンはＩｇＧ_１クラスに属する免疫グロブリンを分泌し、２Ｂ１２はＩｇＭに属するＩｇを分泌した。マウスサウブクラスＩｇＧ_１は、ＩＦＭＡにおいてビオチン結合物（SEROTEC）としてマウスサブクラス重鎖に対するラットモノクローナル抗体を使用して求め、マウスサブクラスＩｇＭは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Dipstick Format)(19663-012, Life Technologies Inc.)を用いて求めた。
【０２１１】
実施例２６
Ｆｌｔ４に対するモノクローナル抗体の特異性
精製された組換えＦｌｔ４細胞外ドメイン−６ｘＨｉｓ融合生成物（実施例１４および２５に記載されたように製造された）をMukkala et al., Anal.Biochem,176(2),319-325(1989)に従ってユーロピウムで標識した。但し次のような改変がなされた：イソチオシアネートＤＴＴＡ−Ｅｕ（Ｎ１キレート、ＷＡＬＬＡＣ、フィンランド）の２５０倍モルの過剰量をＦｌｔ４溶液（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）に加え、ｐＨを０．５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．８を加えることによってｐＨ約９に調整した。標識は＋４℃で一晩で実施した。未結合の標識はＰＤ−１０（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ、スウェーデン）をＴＳＡ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．１５ＭＮａＣｌを含む）とともに用いることにより除去した。
【０２１２】
精製の後、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を表紙記されたＦｌｔ４に加え、標識を＋４℃で保存した。Ｆｌｔ４一分子あたり導入されたユーロピウムの平均数は、公知のＥｕＣｌ_３標準に対するフルオレセンスの比を測定することにより決定した（hemmila et al., Anal. Biochem., 137:335-343(1984)）ところ、１．９であった。
【０２１３】
実施例２５で生産された抗体をサンドウィッチ型免疫蛍光アッセイを用いて、ウサギ抗マウスＩｇ（Ｚ２５９、ＤＡＫＯＰＡＴＴＳ）でコーティングされたマイクロタイターストリップウェル（ＮＵＮＣ、ｐｏｌｙｓｏｒｂ）を用いて、スクリーニングした。あらかじめコートされたウェルをPlatewash1296-024(WALLAC）とＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液により一回洗浄した。ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝溶液を、前段階のスクリーニングアッセイにポジティブコントロールとして用いられる、細胞培養用のおよび脾臓摘出マウスの血清用の希釈緩衝液（１：１０００から１：１００，０００の間の希釈）として、用いられた。
【０２１４】
＋４℃での一晩の（あるいは室温で２時間の）インキュベーションはPlateshaker shaker（１２９６−００１、ＷＡＬＬＡＣ）で５分間振とうすることにより開始した。次いで上記の洗浄溶液で４回洗浄した。
【０２１５】
ユーロピウムで標識されたＦｌｔ４はアッセイ緩衝溶液１００μｌ中１：５００の希釈で加えられた。
【０２１６】
増強溶液（ＤＥＬＦＩＡ）は２００μｌ／ウェルで加えられた。プレートは次いでPlateshake shakerで５分間振とうされ蛍光の密度がＡＲＣＵＳ−１２３０（ＷＡＬＬＡＣ）で１０〜１５分間で測定された（Lovgren et al., In:Collins W.P.(Ed)Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons Ltd.(1985),pp203-216）。ＤＥＬＦＩＡの結果は、試験されたすべてのモノクローナル抗体がＦｌｔ４ＥＣ高原に結合したことを示している。Ｆｌｔ４（およびその抗体を生産するハイブリドーマ）と反応性であるモノクローナル抗体は、さらなるスクリーニングのために選択された。
【０２１７】
得られたモノクローナル抗体は、ＬＴＲ−ＦＬＴ４構築物を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞およびネオマイシン耐性トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞の二重抗体免疫蛍光染色において使用した。細胞はＥＤＴＡを用いて培養プレートから剥離させ、染色し、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）において分析した。ＦＡＣＳ分析の結果は細胞染色陽性の割合と示唆されたモノクローナル抗体によって示されている（下記表２参照）。
表２
Ｍａｂクローン ＬＴＲ％^ａ） Ｎｅｏ％^ｂ） DELFIA−カウント
１Ｂ１ ６７．３ １ ２０６２５
１Ｂ１Ｄ１１ ７５ １．２ １９６９４
１Ｂ１Ｆ８ ７６．１ １．４ １８５８０
４Ｆ６ ６９．９ １．２ ２３２２９
４Ｆ６Ｂ８Ｇ１２ ７５ ０．３ ２４３７４
４Ｆ６Ｂ８Ｈ１１ ７５．９ ０．３ ２８２８１
４Ｆ６Ｂ８Ｅ１２ ７４．８ ０．４ ２７０９７
４Ｆ６Ｂ８Ｇ１０ ７５．３ ０．４ ２６０６３
９Ｄ９ ４５．１ ０．７５ １７３１６
９Ｄ９Ｄ１０ ７１．７ ２．３ １８２３０
９Ｄ９Ｆ９ ７３ １．８ １１９０４
９Ｄ９Ｇ６ ７４．３ ２．９ １６７４３
９Ｄ９Ｇ７ ７０．７ １．３ １７００９
１０Ｅ４ ２４．２ １．４ ３９２０２
１０Ｅ４Ｂ１０Ｅ１２ ３２．３ ０．３ ４２４９０
１０Ｅ４Ｂ１０Ｇ１０ ３６．５ ０．３ ５４８１５
１０Ｅ４Ｂ１０Ｆ１２ ４５．６ ０．４ ４３９０９
１０Ｅ４Ｂ１０Ｇ１２ ４５．７ ０．５ ３５５７６
１１Ｇ２ ３０．２ １．６ １１３０４
１１Ｇ２Ｄ１２ ７４．４ １．５ １４６６０
１１Ｇ２Ｇ９ ７４．２ ０．９ １０２８３
１１Ｇ２Ｈ７ ７４．４ ２．１ ２５３８２

ａ）ＬＴＲ感染細胞から結果として得られたＦＡＣＳ
ｂ）ＮＥＯ細胞（コントロール）から結果として得られたＦＡＣＳ
【０２１８】
ＬＴＲ−ＦＬＴ４ｌトランスフェクト細胞でのＦＡＣＳの結果は、抗体がＦｌｔ４発現細胞を有効に認識することを示している。これらの同じ抗体はネオマイシンホスホトランフェラーゼトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞のバックグラウンド染色のみを示す。従って、これらの抗体は細胞表面でＦｌｔ４チロシンキナーゼを特異的に認識する。
【０２１９】
抗Ｆｌｔ４ハイブリドーマ９Ｄ９Ｆ９と表示される１つのクローンは、ＩＦＭＡにより免疫グロブリンクラスＩｇＧ_１のものであると同定されたモノクローナル抗体を安定して分泌することが分かった。ハイブリドーマ９Ｄ９Ｆ９はGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Department of Human and Animal Cell Cultures and Viruses, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweing, Germany, March 23, 1995に寄託し、受託番号ＡＣＣ２２１０を得た。
【０２２０】
融合II抗体
上記のユーロピウム標識Ｆｌｔ４細胞外ドメインタンパク質を用いても実施例２５に記載の融合ll抗体をスクリーニングした。抗体は、ウサギ抗マウスＩｇ（Ｚ２５９、ＤＡＫＯ）で被覆した微量滴定ウェル（Ｎｕｎｃ、ｐｏｌｙｓｏｒｂ）Ｆｌｔ４特異的を用いてＩＦＭＡでスクリーニングした。ＤＥＬＺＦＩＡプレート洗浄装置を用いてこのプレコートウェルを洗浄溶液（Ｗａｌｌａｃ）で１回洗浄した。
【０２２１】
ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファーを細胞培養上清（予備スクリーニングでは１：２希釈）および脾臓摘出マウスの血清（１：１０００〜１：１００，０００希釈）の希釈バッファーとして用い、これを陽性対照として用いた。標準としては精製抗Ｆｌｔ４ ９Ｄ９Ｆ９（マウスサブクラスＩｇＧ_１）を１．０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で用いた。まずサンプルを室温で５分間プレートシェーク・シェーカーで振盪し、次ぎに４℃で約１８時間インキュベートした。このフレームをまず４回洗浄し、次ぎにＥｕ標識Ｆｌｔ４（１００μｌアッセイバッファー中１：２０００）を加え、最後にそのフレームを室温で１時間インキュベートした。記載のようにして洗浄した後、増強溶液（２００μｌ／ウェル、Ｗａｌｌａｃ）を加え、フレームを５分間プレートシェーク・シェーカーで浸透した。蛍光強度はＡＲＣＵＳ−１２３０（Ｗａｌｌａｃ）で測定した。上記のようにしてＦｌｔ４発現ＮＴＨ３Ｔ３細胞を用いる二重抗体免疫蛍光染色アッセイでさらなるスクリーニングのために、Ｆｌｔ４に反応性のあるモノクローナル抗体を選択した。
【０２２２】
得られたＦＬｔ４に対する融合IIモノクローナル抗体およびそれに対応するＦＡＣＳ分析の結果（記載のモノクローナル抗体で陽性染色される細胞のパーセンテージで表示）は表３に要約されている。
【０２２３】
抗Ｆｌｔ４抗体の定量のための標準曲線はアフィニティー精製した抗Ｆｌｔ４ ９Ｄ９Ｆ９によって作製した。直線範囲は１．０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍｌまでに達した。
【０２２４】
表面で全長Ｆｌｔ４を発現するｐＬＴＲＦＬＴ４ｌ構築物で同時トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞溶解物を、６．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動に付し、タンパク質を硝酸ニトロセルロース膜に移した（０．４５μｍ、SCHLEICHER & SCHUELL）に移し、モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ細胞培養上清（１：１０、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−４％メタノールを含有する４０ｍＭグリシンバッファー、ＳＤＳ０．０４％）で免疫ブロッティングした。モノクローナルの特異性は、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗体Ｉｇ（Ｐ１６１、ＤＡＫＯ、１５０ｍＭ生理食塩水、５％粉乳を含有する２０ｍＭ ＴＲＩＳバッファー、ｐＨ７．５で１：１０００希釈）およびＥＣＬ（増強化学発光、AMERSHAM）でインキュベーションすることにより検出した。
表３
Ｍａｂクローン ＬＴＲ％^ａ） ＮＥＯ^ｂ） およそのＭａｂ産生量 ＷＢ ng/ml/10^６細胞^ｃ）
２Ｂ１２Ｅ１０ ３９．５ ６．０ ４４０ ＋
２Ｅ１１Ｄ１１ ４４．６ ８．８ １１０ ＋
２Ｅ１１Ｆ９ ４９．５ ４．５ １００ ＋
２Ｅ１１Ｆ１２ ４６．０ ４．１ １８０ ＋
２Ｅ１１Ｇ８ ４１．２ ７．８ １６０ ＋
６Ｂ２Ｅ１２ ＮＦ ＮＦ １３９０ ＋
６Ｂ２Ｆ８ ＮＦ ＮＦ ４７０ ＋
６Ｂ２Ｇ６ ＮＦ ＮＦ ６３０ ＋
６Ｂ２Ｈ５ ＮＦ ＮＦ ７４０ ＋
６Ｂ２Ｈ８ ＮＦ ＮＦ １８００ ＋

ａ）ＬＴＲトランスフェクト細胞によるＦＡＣＳの結果
ｂ）ＮＥＯ細胞（対照）によるＦＡＣＳの結果
ｃ）標準として用いたアフィニティー精製した抗ＦＬＴ ９Ｄ９Ｆ９抗体に基づくＭａｂ産生の定量
ＮＦ ＦＡＣＳに作用しない
ＷＢ ウエスタン免疫ブロッティングで首尾よく使用
【０２２５】
実施例２７
細胞溶解物中のおよびヒト組織におけるパンパ内皮細胞で発現したＦｌｔを同定するために抗Ｆｌｔ４抗体の使用
上記実施例に記載のハイブリドーマ９Ｄ９によって産生されたモノクローナル抗体をＨＥＬ細胞の溶解物の免疫沈降およびウエスタンブロッティングに用いた。実施例６で報告したように、Ｆｌｔ４ｍＲＮＡ発現はこれまでにＨＥＬ細胞で認められていた。約２Ｘ１０^７のＨＥＬ培養細胞を実施例１１で明示したＲＩＰＡバッファーで溶解し、約２ｇの９Ｄ９抗体を用いて免疫沈降させた（実施例１１においてポリクローナル抗体について記載した通り）。ウエスタン解析については、免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％ゲル）で電気泳動に付し、ニトロセルロース膜へエレクトロブロッティングした。１μｇ／ｍｌ希釈の９Ｄ９抗体を用いた免疫沈降物のウエスタンブロッティング解析で、Ｆｌｔ４ポリペプチドに相当する１７５ｋＤと１２５ｋＤのポリペプチドバンドが検出された。
【０２２６】
ヒト皮膚組織の免疫染色は９Ｄ９モノクローナル抗体およびアルカリ性ホスファターゼＡＢＣ−ＡＰキット（Ｄａｋｏ）を用いて行った。要するに、６μｍの成人皮膚サンプルを含むスライドを３０分間室温で乾燥させ、１０分間冷アセトンで固定し、その後５分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。次ぎにこのサンプルを２％ウマ血清とともに室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で５分間３度洗浄した。
【０２２７】
免疫染色については、サンプルを９Ｄ９一次抗体とともに室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で５分間３回洗浄した。洗浄後、サンプルをビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体とともに室温で３０分間インキュベートし、再びＰＢＳで５分間３回洗浄した。
【０２２８】
結合した抗体は、ＡＢＣ−ＡＰ複合体とともにサンプルを室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、ＡＰ−基質（Sigma Fast Red TR/Naphtol AS-MX（カタログ番号Ｆ−４６４８））とともに室温で１５分間インキュベートして水洗することにより検出した。次ぎにサンプルをメイヤーのヘマトキシリンで３０秒間対比染色して水洗した。水をのせてカバーガラスをかけ、顕微鏡下でサンプルを観察した。これらのヒト皮膚切片のリンパ内皮細胞で９Ｄ９抗体染色が認められた。血管内皮細胞は極めて弱い染色しか示さなかったか、あるいは全く染色されていなかった。リンパ内皮に対する明らかな特異性を確認するためにさらなる分析を用いた。Lymbouskaki et al., Am. J. Pathol., 153(2):395-403（１９９８年８月）、およびJussila et al., Cancer Res., 58:1599-1604（１９９８年４月）参照。なお、両者とも引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０２２９】
これらの結果からさらに、リンパ内皮の有用なマーカーとしてのＦｌｔ４の有用性、ならびに組織サンプルにおいてこれらの細胞で発現されたＦｌｔ４を同定および視覚化するための抗Ｆｌｔ４抗体の有用性が確認される。
【０２３０】
実施例２８
乳癌の脈管形成におけるＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達経路のアップレギュレーション
上記の実施例はＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）が正常な組織におけるリンパ内皮の特異的脈管形成マーカーとして有用であることを示している。以下の手法はさらに、ＶＥＧＦＲ−３が悪性乳癌において脈管形成マーカーとして（例えば診断およびスクリーニングのため）、また治療標的として有用であることを証明するものである。組織学的に正常な乳房組織に比べて侵襲性乳癌では、極めて高い数のＶＥＧＦＲ−３陽性血管が認められた（Ｐ＜０．０００１）。
【０２３１】
材料および方法
ヘルシンキ大学病理学科のファイルから新たに凍結させた乳房組織サンプルを入手した。このサンプルは腺管癌（ｎ＝６）、小葉癌（ｎ＝６）、分泌管内癌（ｎ＝８）、繊維腺癌（ｎ＝４）および組織学的に正常な乳房細胞（ｎ＝１２）からなっていた。サンプルは総て摘出後直ちに液体窒素中で凍結させ、−７０℃で保存した。
【０２３２】
ヒトＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は実質的に上記実施例、例えば実施例２５に記載のようにして作製した。ＶＥＧＦＲ−３細胞外タンパク質ドメイン（ＶＥＧＦＲ−３ＥＣ）は培地から精製した昆虫細胞中の組換えバキュウロウイルスによって発現させた。次ぎに標的な方法を用いてＶＥＧＦＲ−３ＥＣに対するマウスモノクローナル抗体を作製し、ハイブリドーマ腹水またはTecnomouse（登録商標）培養上清からＡタンパク質アフィニティークロマトグラフィーによって免疫グロブリン画分を精製した。
【０２３３】
５μｍの組織サンプルの凍結切片を風乾し、冷アセトン中で１０分間固定した。この切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で再び水和し、室温下、５％正常ウマ血清中で３０分間インキュベートした。次ぎにこの切片を加湿雰囲気下、室温で２時間、１．０μｇ／ｍｌの濃度のＭａｂ ９Ｄ９Ｆ９（実施例２６）とともにインキュベートした。ＶＥＧＦＲ−３ＥＣの異なるエピトープに対するその他の抗ＶＥＧＦＲ−３Ｍａｂについても検討し、２Ｂ１１Ｄ１１（実施例２６）および７Ｂ８Ｆ９（実質的に実施例２６に記載のようにして作製）をそれぞれ９．５および８．５μｇ／ｍｌの濃度で用いた。次ぎにビオチニル化抗マウス血清中で３０分間インキュベートした後、Vectastain Elite Mouse IgG ABCキット(Vector laboratories, Burlingame, USA)の試薬を用いて６０分間インキュベートした。３−アミノ−９−エチルカルバゾール（AEC, Sigma, St. Louis, USA）で１０分間ペルオキシダーゼ活性を進展させた。最後にこの切片をヘマトキシリンで２０秒間染色した。陰性対照は一次抗体を除くか、または同じイソ型の無関係の一次抗体を用いて行った。精製したバキュウロウイルス免疫原を用いてもう一方の陰性対照として９Ｄ９抗体の結合をブロックした。これらの実験では、抗体をＰＢＳ中で１０倍モル過剰のＶＥＧＦＲ−３ＥＣタンパク質とともに一晩インキュベートした。４０００ｒｐｍ、４℃、４分間の遠心分離後、上清を注意深く回収し、次ぎに一次抗体として用いた。抗ＶＥＧＦＲ−３抗体で染色したものに隣接する５μｍの凍結切片を、血管内皮マーカーＰＡＬ−Ｅ（０．１５μｇ／ｍｌ, Monosan, Uden, the Netherlands）、ラミニン（ＬＡＭ−８９１, Sigma, St Louis, MOの上清の１：４０００希釈）、コラーゲンXVIII（１．９μｇ／ｍｌ）、α−平滑筋アクチン（SMA, ０．５μｇ／ｍｌ, クローンＩＡ４, Sigma）、ＶＥＧＦＲ−１（クローン１９の上清の１：２００希釈）またはＶＥＧＦＲ−２（１：１００希釈）に関して免疫染色した。
【０２３４】
上記試料のすべての病理学検査は、上記染色手順後に行われた。血管の密度は、ＧａｓｐａｒｉｎｉおよびＨａｒｒｉｓによって薦められたガイドラインに従って、ＰＡＬ−Ｅ［ｄｅＷａａｌ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５０：１９５１〜１９５７（１９９７）］に対して染色されたスライドから得られた。［ＧａｓｐａｒｉｎｉＧ、およびＨａｒｒｉｓＡ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１３：７６５〜７８２（１９９５）］ＶＥＧＦＲ−３の正の血管密度は同様に研究された。スライドは最初に低倍率で走査され、次に腫瘍内血管密度は、最も高い血管密度（「血管ホットスポット」）を有する領域または最も高いＶＥＧＦＲ−３正血管密度を有する領域において４００倍の倍率の高電界（ｈｐｆ）当りの染色された血管の数を数えることによって決められた。１スライドにつき最低５つの電界が計数された後、３つの最高計数値が平均された。
【０２３５】
二重染色は、２つの導管内の癌腫において小リンパ管および血管の免疫組織化学染色を区別するために行われた。アセトン固定の５μｍの低温部分は、抗ＰＡＬ−Ｅ抗体で一時間、ビオチン化された馬の抗マウス抗体（ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＭｏｕｓｅＩｇＧ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ研究所、米国バーリンゲーム）で３０分間、ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、１：１００）で４５分間培養され、最終的にＡＥＣで１０分間現像された。第二工程は、上記部分が、ＩＳＨ信号向上のために文献に前に記載された手順に従って、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体で１時間（０．１４μｇ／ｍｌ）、次にビオチン化抗マウス抗体によって３０分間（クローンの上澄みの１：２００の希釈）、ＡＢＣペルオキシダーゼで３０分間（１：１００）、０．０１％の過酸化物を含有しているビオチン化チラミン溶液（１：２０００）で５分間、ＡＢＣアルカリ性ホスファターゼ（１：１００）で２０分間培養され、ＦａｓｔＢｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ、米国セントルイス）で２０分間現像された。［Ｋｅｒｓｔｅｎｓ等、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、４３：３４７〜３５２（１９９５）］二重に染色された部分に隣接している低温部分（５μｍ）はまた、ＶＥＧＦＲ−３抗体でのみ上述したように免疫染色された。
【０２３６】
ポリクローン抗体は、成熟し分泌されたヒトの導管内皮成長因子ＣのＮ末端のアミノ酸残基２〜１８に相当する合成ペプチド（ＶＥＧＦ−Ｃ）（ＶＥＧＦ−ＣプレプロＶＥＧＦ−Ｃ ポリペプチドの残基１０４〜１２０）に対してウサギにおいて文献に記載されたように生成された。［Ｊｏｕｋｏｖ等、ＥＭＢＯ Ｊ．１６：３８９８〜３９１１（１９９７）、参照で全体において準用される］抗血清は、エポキシで活性化されたセファロース６Ｂカラムに結合された免疫原性のポリペプチドを用いてアフィニティー精製され且つＶＥＧＦ−Ｃまたは対照β−ガラクトシダーゼを表すアデノウイルス性ベクトルで感染された細胞を使用して、ＶＥＧＦ−Ｃの特定の染色に対して試験された。
【０２３７】
８つの導管内癌腫およびＶＥＧＦＲ−３に対して分析された侵入癌腫のすべては、ＶＥＧＦ−Ｃの発現をさらに分析するために選択された。抗ＶＥＧＦＲ−３抗体で染色された部分に隣接している５ミクロメートルの低温部分は、冷アセトンにおいて１０分間空気乾燥且つ固定された。上記部分はＰＢＳにおいて再度水和され、５％の正常なヤギの血清において３０分間培養された後、ＰＢＳにおいて１：２００で希釈されたヒトのＶＥＧＦ−Ｃに対するウサギの多クローン性抗体で２時間湿気のある雰囲気において室温で培養された。次のビオチン化抗ウサギ血清における３０分間の培養後、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＲａｂｂｉｔＩｇＧ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ研究所、米国バーリンゲーム）の試薬を用いて６０分間の培養が行われた。上記部分は、上述したようにさらに処理された。負の対照として、精製された免疫原が使用されてＶＥＧＦ−Ｃ抗体の結合を妨げた。これらの実験において、ＶＥＧＦ−Ｃ抗体は、ＰＢＳにおけるＶＥＧＦ−Ｃタンパク質の１０倍モル超過で一晩培養された。４分間４０００ｒｐｍ＋４℃の遠心分離後、上記上澄みは注意深く集められ且つ免疫染色に使用された。
【０２３８】
ヒト型ＸＶＩＩＩコラーゲンに対するモノクローン抗体は、ＤｉａＢｏｒＬｔｄ．（オール、フィンランド）によって、ヒト型ＸＶＩＩＩコラーゲンのＮ端子ＮＣ１領域の共通領域に相当する組み換えポリペプチドＱＨ４８．１８でマウスを免疫化することによって生成された［Ｓａａｒｅｌａ等、ＭａｔｒｉｘＢｉｏｌｏｇｙ、１６：３１９〜２８（１９９８）］。クローンは、ポリペプチドＱＨ４８．１８を使用してＥＬＩＳＡ検定およびＷｅｓｔｅｒｎ分析によって、また凍結ヒト組織部分の免疫蛍光染色によって篩い分けられた。ハイブリドーマ・クローンの篩い分けの結果、３つの単クローン性抗体は、上述したすべての３つの検定において正であった（ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ、免疫蛍光染色）。最も強い信号を出した抗体の１つ、ＤＢ１４４−Ｎ２は次の実験に使用された。該抗体は、多クローン性の抗全ヒト（ＸＶＩＩＩ）のパターンに対して（例えば、成人の皮膚および肝臓の試料において）同一の染色パターンを与えた。
【０２３９】
結果
Ａ． 組織的に正常な胸部組織および良性繊維腺腫におけるＶＥＧＦＲ−３
正常な胸部組織におけるＶＥＧＦＲ−３の免疫組織化学染色は、導管内の間質の毛管に非常に弱い染色を示した。これらの導管は特定のパターンを形成しなかったが、間質に分散されていた。正常な胸部組織試料におけるＶＥＧＦＲ−３正導管の密度の範囲はｈｐｆ当り６〜１７で、中央値は９（ｎ＝１２）であった。このような導管のほとんどは、血管の内皮マーカーＰＡＬ−Ｅおよび基底板成分、コラーゲンＸＶＩＩＩに対して強く染色され、ここでＶＥＧＦＲ−３は正常な胸部組織の血管において弱く表されたことを示唆する。しかしながら、間質におけるいくつかの細い導管は、ＶＥＧＦＲ−３に対して明瞭に染色されたが、ＰＡＬ−Ｅに対して負であり且つコラーゲン型ＸＶＩＩＩに対してのみ弱く正であったが、ここで導管が小リンパ管であることを示唆した。ＶＥＧＦＲ−３正導管はまた、良性繊維腺腫において一様に見られたが、ここで導管の密度（中央値はｈｐｆ当り８つの導管；範囲３〜１９；ｎ＝４）は、組織的に正常な胸部組織の密度（中央値８つの導管、９；Ｐ＞０．１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）と異ならなかった。
【０２４０】
Ｂ．分泌管内癌におけるＶＥＧＦＲ−３陽性癌
分泌管内癌において、 強く染色されたＶＥＧＦＲ−３陽性管の識別パターンが観察された。この陽性管は、変質管の回りにアーチ状構造を形成していた（図５Ａ）。また、この「ネックレス」パターンは、血管の内皮の標識ＰＡＫ−Ｅ（図５Ｂ）についての隣接する区域の染色にも観察され、ＶＥＧＦＲ−３表現が毛細管内皮で高められたことを示唆していた。血管とリンパ管とをさらに明確に区別するとともに管壁内の平滑筋細胞および周皮細胞の存在を調べるために、平滑筋αアクチン（ＳＭＡ）に対する抗体およびラミニンやＸＶＩＩＩタイプのコラーゲンなどの基底板成分を使用して、追加の染色を行った。この染色によれば、分泌管内癌に近接する小さい管は、同時にＶＥＧＦＲ−３および基底板蛋白質を示したが、ＳＭＡに対してさらに弱く染色され、これらの管が管壁（図５Ｃ−図５Ｆの白抜き矢印）内の周皮細胞／平滑筋細胞によって不完全に覆われることを示した。対照的に、腺管内の病変から離間した大きな血管は、一般にＶＥＧＦＲ−３に対して陰性であるが、ラミニン、コラーゲンＸＶＩＩＩおよびＳＭＡに対して陽性である（赤矢印）。また、ＶＥＧＦＲ−３に対して陽性であるが、基底板蛋白質、ラミニンおよびＸＶＩＩＩタイプのコラーゲンに対して非常に弱く染色され、ＳＭＡに対して全く染色されない管が発見された（緑矢印）。これらは、リンパ管を示すものと考えられた。
【０２４１】
Ｃ．血管およびリンパ管の差別的な二重染色
免疫組織化学的二重染色手順によりリンパ管と血管とをさらに明確に区別するために、２つの分泌管内癌を選んだ（de Wallら、Am.J.Pathol., １５０、１９５１−１９５７頁（１９９７年）参照）。この方法を使用して、ＶＥＧＦＲ−３陽性管を青く染色するとともに、ＰＡＬ−Ｅ陽性管および基底板を茶色に染色した。いずれの試験試料も同様の染色パターンを示し、腫瘍で満たした管を内側に張った管は、主としてＰＡＬ−Ｅ陽性管である（図５Ｇおよび図５Ｈの矢印の頭部）とともに、おそらくリンパ管であり、腺管内ストロマ内で少し離間したＶＥＧＦＲ−３陽性管は、ＰＡＬ−Ｅ陰性管であった（図５Ｇおよび図５Ｈの黒矢印）。陽性の二重染色の人為結果による誤った解釈を除外するために、隣接する５μｍの区域をアンチＶＥＧＦＲ−３だけで染色した。この染色は、ＰＡＬ−Ｅ陽性血管の幾つかがＶＥＧＦＲ−３に対しても陽性であることを確認した。
【０２４２】
Ｄ．分泌管内癌細胞内のＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２、および隣接する管内のその受容体
ヒトＶＥＧＦ−Ｃに対する親和性生成したポリクロナール抗体を使用して、８つの分泌管内癌試料を染色した。いずれの試験試料も少なくとも幾つかのＶＥＧＦ−Ｃを含んでいたが、染色の強度および表現パターンにおいてかなりの異質性が観察された。ある場合には、殆どの癌細胞がＶＥＧＦ−Ｃに対して強い陽性であるとともに、他の癌細胞では、少しの癌細胞だけが染色信号を与えた。対照的に、変質しない正常な管の上皮では、非常に少ない染色が観察され、または全く染色が観察されなかった。抗原阻止実験は、ＶＥＧＦ−Ｃに対する染色が特異的であることを示した。他のＶＥＧＦ−Ｃ受容体、ＶＥＧＦＲ−２だけでなくＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−１）も、分泌管内癌に隣接する同じ「ネックレス」管内に表現された。
【０２４３】
Ｅ．侵入性乳癌におけるＶＥＧＦＲ−３陽性管およびＶＥＧＦ−Ｃ
検討した全ての侵入性腺管癌および小葉癌には、強く染色したＶＥＧＦＲ−３陽性管も存在した。ＶＥＧＦＲ−３陽性管は、特異的な分布パターンを形成しないように見られ、これらの管の殆どは、ＰＡＬ−Ｅ抗原に対しても免疫反応的であった。腫瘍内のＶＥＧＦＲ−３陽性管の密度（中央値２１、範囲：ｈｐｆ当たり９−５６の管、ｎ＝１２）は、正常な乳房の組織（中央値２１対９、Ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験）と比較して、侵入性乳癌ではかなり高くなっていた。時折、ＶＥＧＦＲ−３陽性リンパ管への癌細胞の侵入を観察することもできた。
【０２４４】
検討した侵入性癌の中で ＶＥＧＦ−Ｃの免疫染色が強く変化した。幾つかの癌細胞はＶＥＧＦ−Ｃに対して強い陽性であり、他の癌細胞は非常に弱く染色され、ある場合には、染色が全く観察されなかった。腺管内の癌のように、これらの区域における結合組織では、染色が非常に少なく観察され、または全く観察されなかった。
【０２４５】
上記のデータは、殆ど大人の組織内の主にリンパ内皮の標識であるように見えたＶＥＧＦＲ−３が、正常な乳房の組織の毛細管内皮にも非常に弱く示されることを明らかにしている。さらに重要なことは、腺管内の癌では、強く染色されるＶＥＧＦＲ−３の陽性の管の「ネックレス」パターンが、腫瘍で満たされた管が内側に張られたことを検出されたことである。これらの管の殆どは、血管内皮の標識ＰＡＬ−Ｅおよび基底板成分、ラミニンおよびコラーゲンＸＶＩＩＩを示したが、ＳＭＡに対する抗体を使用して染色することによって示されるように、腫瘍細胞からさらに離れた所に位置する血管よりも見かけ上少ない周皮細胞／平滑筋細胞を有していた。これらの特徴は、「ネックレス」管が上述した血管形成であったことを示唆している。変質管から離れて配置された第２のグループの管は、ＶＥＧＦＲ−３に対して陽性であったが、基底板成分に対して非常に弱い陽性であり、ＰＡＬ−Ｅに対して陰性であり、これらはリンパ管であることを示唆した。また、これらの管は、ＳＭＡ陽性の周皮細胞成分も欠乏していた。侵入性乳癌においても、ＶＥＧＦＲ−３はＰＡＬ−Ｅ陽性血管において上方に調整されていたが、見られた血管パターンは、腫瘍細胞の回りの結合組織のストロマ内にさらにランダムに組織されていた。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−３表現が、腫瘍の成長と関連する血管形成中に乳癌において上方に調整されることを示している。原位置の癌において発見された非常に多くの数のＶＥＧＦＲ−３陽性管は、癌細胞がその癌細胞のすぐ近くの血管の成長を活性化する要因となるという仮説に適合している。
【０２４６】
ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦＲ−２の両方と高い親和性で結合し、腺管内および侵入性癌細胞のいずれもＶＥＧＦ−Ｃ蛋白質に対して陽性に染色することが多かったので、この成長の要因が、癌におけるＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２陽性管に対する成長の要因候補である。これらのデータは、３５の殆ど半分が（乳癌、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫および肉腫を含む）悪性の侵入性腫瘍を選択せず、ノーザンブロット法分析においてＶＥＧＦ−ＣｍＲＮＡを含んでいた他の研究と一致している（Ｓａｌｖｅｎら、Am.J.Pathol., １５３（１）、１０３−１０８頁（１９９８年７月）参照）。ここで報告したデータは、集合的に乳癌の治療の指示を提供し、ＶＥＧＦＲ−３やＶＥＧＦＲ−２のＶＥＧＦ−Ｃ介在シミュレーションを阻止する因子を有する他の非リンパ癌も提供する可能性がある。期待される遮断薬は、抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、ＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−１と結合する二特異性（bispecific）抗体、循環ＶＥＧＦ−Ｃを結合するＶＥＧＦＲ−３の可溶性の細胞外領域の断片、ＶＥＧＦＲ−３やＶＥＧＦＲ−２を結合させ且つこのような受容体の活性化を示すＶＥＧＦ−Ｃ断片および類似体、 ＶＥＧＦＲ−３やＶＥＧＦＲ−２を結合させ且つ適当な治療薬と接合するＶＥＧＦ−Ｃのポリペプチド、断片および類似体、ＶＥＧＦＲ−３チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの受容体を結合させ且つ阻害する小さい分子を含む。また、ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２の両方を結合させるので、抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体および抑制ＶＥＧＦ−Ｄの断片および類似体も適当な遮断薬であることが期待される。ヒト抗体、または抗体薬をヒト治療のために選択される程度までヒト化した抗体およびその断片が好ましい。また、本発明の他の見地として、例えば、悪性および悪性の広がりのための診断およびスクリーニングのために、哺乳類の組織を生体外または生体内で評価するために、上述した遮断薬のいずれかを使用することが期待される。
【０２４７】
上述した遮断薬のいずれについても、放射性同位元素（例えば^１４Ｃ、^１３３Ｉおよび^１２５Ｉ）、発色団（例えばフルオレセイン、フィコビリプロティエン、テトラエチルローダミン、蛍光による検出のために蛍光または着色生成物を生成する酵素、電子顕微鏡検査による検出のための電子密度の高い生成物を生成する吸光度、可視色または凝集反応）、またはフェリチン、ペルオキシダーゼ、金のビーズのような電子密度の高い分子などを含む検出可能なラベルの付加によって、診断およびスクリーニングのために遮断薬をさらに改良してもよいことが期待される。
【０２４８】
同様に、植物、動物、微生物または菌類の起源の毒素のような抗腫瘍性特性を有する分子、放射性同位元素、薬剤、酵素、シトキン（cytokines）および他の治療蛋白質を付加（例えば接合）またはこれらとともに投与することによって、治療のために遮断薬をさらに改良してもよい（例えばPieterszおよびMcKenzie（癌の治療用抗体接合体）、Immunological Reviews、１２９、５７―８０頁（１９９２年）参照）。
【０２４９】
例２９
ヒトの治療薬として投与するための抗Ｆｌｔ４抗体
Ａ．抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体のヒト化
本明細書、例えば例２８に記載のＦｌｔ４の生物学は、Ｆｌｔ４レセプターのリガンド依存性シグナル形成を遮断するＦｌｔ４インヒビター（アンタゴニスト）に対する治療薬の使用を示している。Ｆｌｔ４中和抗体は、Ｆｌｔ４アンタゴニストとして用いられる治療薬の一つのクラスを含んでなる。下記のものは、抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体を「ヒト化」してそれらの血清中半減期を向上させかつヒト宿主における免疫原性を少なくする（すなわち、非ヒト抗Ｆｌｔ４抗体に対するヒト抗体の応答を防止する）ことによって、モノクローナル抗体のヒトにおける治療薬としての有用性を向上させるためのプロトコールである。
【０２５０】
ヒト化の原理は文献に記載されており、抗体タンパク質のモジュール配置によって促進される。補体結合の可能性を最小限にするには、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト化抗体が好ましい。
【０２５１】
例えば、ヒト化のレベルは、本明細書記載の抗Ｆｌｔ４モノクローナル抗体のような目的とする非ヒト抗体タンパク質の可変ドメインをヒト抗体分子の定常ドメインと共に含んでなるキメラ抗体を生成することによって達成される（例えば、Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1989)を参照）。Ｆｌｔ４中和抗Ｆｌｔ４抗体の可変ドメインは、Ｂ細胞ハイブリドーマのゲノムＤＮＡまたは目的とするハイブリドーマから単離したｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡからクローニングされる。Ｖ領域遺伝子断片をヒト抗体定常ドメインをコード化するエキソンに連結し、生成する構築物を適当な方法に宿主細胞（例えば、骨髄腫またはＣＨＯ細胞）中で発現させる。
【０２５２】
ヒト化のレベルを更に高くするため、非ヒトモノクローナル抗体遺伝子の抗原結合相補性決定領域（「ＣＤＲ」）をコードする可変領域遺伝子断片の部分のみをヒト抗体配列中にクローニングする［例えば、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechman et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-36 (1988); およびTempest et al., Bio/Technology, 9:266-71 (1991)を参照］。必要ならば、ＣＤＲ３領域を取り巻くヒト抗体のβ−シート骨格も改質して、もとのモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次元構造を一層緊密に反映させる（Kettleborough et al., Protein Engin, 4:773-783 (1991);およびFoote et al., J. Mol. Biol., 224:487-499 (1992)を参照）。
【０２５３】
もう一つの方法では、目的とする非ヒトモノクローナル抗体の表面を、非ヒト抗体の内部を総て保持して残基を接触させたまま、非ヒト抗体の選択された表面残基を変更することによって、例えば位置指定突然変異誘発によって、ヒト化する。Padlan, Molecular Immunol., 28(4/5):489-98 (1991)を参照されたい。
【０２５４】
上記の方法は、Ｆｌｔ４を中和するＦｌｔ４モノクローナル抗体およびそれらを生成するハイブリドーマ、例えば抗体９Ｄ９Ｆ９を用いて用いられ、Ｆｌｔ４発現が有害な症状を治療しまたは緩和する治療薬として有用なヒト化したＦｌｔ４中和抗体を生成させる。
【０２５５】
Ｂ．ファージディスプレー由来のヒトＦｌｔ４中和抗体
ヒトＦｌｔ４中和抗体は、Aujame et al., Human Antibodies, 8(4):155-168 (1997); Hoogenboom, TIBTECH, 15:62-70 (1997); およびRader et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8:503-508 (1997)に記載のファージディスプレー法によって生成し、上記文献の総ての内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。例えば、Ｆａｂ断片または連結した単一鎖Ｆｖ断片の形態での抗体可変領域を繊維状ファージマイナーコートタンパク質ｐIIIに融合させる。融合タンパク質を発現しこれを成熟ファージコートに組み入れると、表面に抗体を示しかつ抗体をコードする遺伝子材料を含むファージ粒子を生じる。このような構築物を含んでなるファージライブラリーを細菌で発現させ、ライブラリーを標識または固定したＦｌｔ４を抗原プローブとして用いてＦｌｔ４特異的ファージ抗体についてパンニング（スクリーニング）する。
【０２５６】
Ｃ．トランスジェニックマウス由来のヒトＦｌｔ４中和抗体
ヒトＦｌｔ４中和抗体は、Bruggemann and Neuberger, Immunol. Today, 17(8):391-97 (1996)およびBruggemann and Taussig, Curr. Opin. Biotechnol., 8:455-58 (1997)に本質的に記載されている方法でトランスジェニックマウスで生成させる。生殖系列配置でヒトＶ遺伝子セグメントを有し、これらのトランスジーンをリンパ系組織で発現するトランスジェニックマウスを、通常の免疫法を用いてＦｌｔ４組成物で免役する。ハイブリドーマを、通常の方法を用いて免疫マウス由来のＢ細胞を用いて生成させ、スクリーニングを行って抗Ｆｌｔ４ヒト抗体（例えば、上記のもの）を分泌するハイブリドーマを同定する。
【０２５７】
Ｄ．二重特異性抗体
Ｆｌｔ４に特異的に結合しかつ病因および／または治療に関連する他の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を、文献に記載されている標準的方法を用いて生成させ、単離して、試験する。例えば、Pluckthum & Pack, Immunotechnology, 3:83-105 (1997); Carter et al., J. Hematotherapy, 4: 463-470 (1995); Renner & Pfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, No. 145, pp. 179-209; Pfreundschuhの米国特許第５，６４３，７５９号明細書; Segal et al., J. Hematotherapy, 4:377-382 (1995); Segal et al., Immunobiology, 185: 390-402 (1992); およびBolhuis et al., Cancer Immunol. Immunother., 34: 1-8 (1991)を参照されたい。上記文献の総ての内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０２５８】
例３０
癌の治療のための抗Ｆｌｔ４療法の効果を示すための動物モデル
癌治療のための任意の認められた動物を用いて、癌治療のための抗Ｆｌｔ４療法の効果を示すことができると考えられる。標準的な用量−応答研究を用いる乳癌の治療の効果を示す代表的なモデルとしては、Tekmal and Durgam, Cancer Lett., 118 (1): 21-28 (1997); Moshakis et al., Br. J. Cancer, 43: 575-580 (1981); およびWilliams et al., J. Nat. Cancer Inst., 66: 147-155 (1981)に記載されているものが挙げられる。ネズミモデルの他に、イヌおよびブタモデルが考えられるが、少なくともある種の抗ヒトＦｌｔ４抗体（例えば、９Ｄ９抗体）はイヌおよびブタ由来のＦｌｔ４も認識するからである。腫瘍の大きさおよび副作用を観察して、コントロールに対する治療効果を示す。
【０２５９】
本発明の概要または詳細な説明に引用されている特許明細書および文献などの総ての文書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。
【０２６０】
本発明を具体的態様について記載してきたが、本発明は更に改質することが可能であり、また、本出願明細書は、一般的に本発明の原理に従って本発明の任意の変化、用途または翻案をカバーし、本発明が関係する技術の範囲内での既知または通常の実施の範囲内に収まり、上記の本質的特徴に適用することができ、特許請求の範囲に示されるような本開示からの離反を包含するものであることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１Ａ】Ｆｌｔ４ｃＤＮＡクローン構造の略図である。
【図１Ｂ】ノーザンハイブリダイゼーションゲルの写真複写である。
【図２】Ａ〜Ｆ：Ｆｌｔ４の構造的特徴の略図とＦｌｔ１チロシンキナーゼ配列との比較を示す。
【図３Ａ】クローンＪ．１．１およびＩ．１．１のｃＤＮＡ挿入物３’末端の略図である。
【図３Ｂ】アンチセンスＲＮＡプローブと長鎖型および短鎖型Ｆｌｔ４ＲＮＡとのハイブリダイゼーションのオートラジオグラフの写真複写である。
【図３Ｃ】アンチセンスＲＮＡプローブと長鎖型および短鎖型Ｆｌｔ４ＲＮＡとのハイブリダイゼーションのオートラジオグラフの写真複写である。
【図４】異なる種由来のＤＮＡサンプルのＦｌｔ４配列のハイブリダイゼーション解析を示すゲルの写真複写である。
【図５】脈管内癌においてＶＥＧＦＲ−３を発現する血管の免疫組織化学的特徴を示す。隣接する部分（図５Ａ、Ｂ）では、ＶＥＧＦＲ−３およびＰＡＬ−Ｅが癌細胞で占められた脈管周囲に類似したパターンの「ネックレス」管（矢印）を与えている。別の隣接する部分群とＶＥＧＦＲ−３（図５Ｃ）、ラミニン（図５Ｄ）、コラーゲンＸＶIII（図５Ｅ）およびＳＭＡ（図５Ｆ）に関する染色とを比較した。ＰＡＬ−ＥおよびＶＥＧＦＲ−３（図５Ｇ）に関する二重染色とＶＥＧＦＲ−３単独（図５Ｈ）に関して染色した隣接する部分との比較。影響を受けた脈管に隣接する血管は二重陽性であり（矢印）、ＶＥＧＦＲ−３陽性血管は脈管間ストロマにある影響を受けた脈管から少し離れたところに存在する（矢印）。基底膜が二重染色手順においてＰＡＬ−Ｅに関し陽性であることには留意のこと；拡大写真：図５Ａ、Ｂ ４００倍、図５Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ ３２０倍、図５Ｅ、Ｆ ４８０倍。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍に隣接する血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を治療する方法であって、
かかる治療を必要とする哺乳類生物に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と該生物の血管内皮細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４によって媒介される該血管内皮細胞の増殖を阻害する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
悪性腫瘍に隣接する血管の内皮細胞におけるＦｌｔ４受容体チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）の発現によって特徴づけられる腫瘍性疾患を患う哺乳類生物を治療する請求項１に記載の方法であって、
（ａ）哺乳類生物をスクリーニングしてこれらの生物に由来する悪性腫瘍に隣接する血管におけるＦｌｔ発現内皮細胞の有無を判定し；
（ｂ）スクリーニング工程から、悪性腫瘍に隣接する血管におけるＦｌｔ発現内皮細胞の存在によって特徴づけられる悪性腫瘍を有すると判定される生物を選択し；さらに
（ｃ）選択された生物に、Ｆｌｔ４リガンドタンパク質と該生物の血管内皮細胞で発現されるＦｌｔ４との結合を阻害するのに有効な化合物を含んでなる組成物を投与し、それによりＦｌｔ４によって媒介される該血管内皮細胞の増殖を阻害する
工程を含んでなる、方法。
【請求項３】
腫瘍性疾患が癌腫、扁平上皮癌、リンパ腫、黒色腫および肉腫からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍性疾患が血管内皮細胞におけるＦｌｔ４の発現によって特徴づけられる乳癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
生物がヒトである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
化合物が、
（ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）可溶性Ｆｌｔ４断片を含んでなるポリペプチド（この断片およびポリペプチドはＦｌｔ４リガンドと結合し得る）；
（ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）前駆ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激することはできない）；および
（ｄ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）前駆ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激することはできない）
からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物が抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含むポリペプチドを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
化合物が二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、該抗体または断片が、Ｆｌｔ４と特異的に結合する抗原結合ドメインと、リンパ系内皮には実質的に存在しない血管内皮マーカー抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインとを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
血管内皮マーカー抗原がＰＡＬ−Ｅ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物が抗Ｆｌｔ４抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抗Ｆｌｔ４抗体はヒト化抗体である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
化合物が二重特異性抗体と結合した抗腫瘍薬をさらに含んでなる、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が検出可能な標識をさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が医薬上許容される希釈剤、アジュバントまたは担体媒質をさらに含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
脊椎生物由来の組織の腫瘍のイメージング法であって、
（ａ）腫瘍を含むと疑いがある脊椎生物組織と、Ｆｌｔ４結合化合物を含んでなる組成物とを接触させ；
（ｂ）その組織において細胞に結合したＦｌｔ４結合化合物を検出し；さらに
（ｃ）Ｆｌｔ４結合化合物が結合した血管内皮細胞を同定することにより固形腫瘍を造画し、Ｆｌｔ４を発現する血管が組織における腫瘍の存在および位置に相関している
工程を含んでなる、方法。
【請求項１６】
組織がヒト組織を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
接触工程の後、造画工程の前に、組織から組織中のＦｌｔ４と結合していないＦｌｔ４結合化合物を除去する条件下で組織を洗浄する工程をさらに含んでなる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｆｌｔ４結合化合物が、
（ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）前駆ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は細胞で発現されるＦｌｔ４と結合する）；および
（ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）前駆ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は細胞で発現されるＦｌｔ４と結合する）
からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
化合物が抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含むポリペプチドを含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆｌｔ４結合化合物が抗Ｆｌｔ４抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
抗Ｆｌｔ４抗体がヒト化抗体である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
化合物がそれに共有結合した検出可能な標識をさらに含んでなる、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
組織と、リンパ系内皮細胞には実質的に存在しない血管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物とを接触させ；さらに
組織において細胞と結合した第２の化合物を検出する
工程をさらに含んでなり、
造画工程が、Ｆｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標識された血管を同定することを含んでなり、ここでＨｌｔ４結合化合物と第２の化合物の双方で標識された血管が組織における腫瘍の存在および位置に相関している、
請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
血管内皮マーカーがＰＡＬ−Ｅ、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｆｌｔ４結合化合物が二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、該抗体または断片が、Ｆｌｔ４と特異的に結合する抗原結合ドメインと、リンパ系内皮には実質的に存在しない血管内皮マーカー抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインとを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍内皮細胞の変化によって特徴づけられる疾病のスクリーニング方法であって、
（ａ）腫瘍内皮細胞の変化によって特徴づけられる病状にあると疑われる脊椎生物から組織サンプルを採取し；
（ｂ）その組織サンプルを、その生物の細胞によって発現されたＦｌｔ４受容体キナーゼ（Ｆｌｔ４）と特異的に結合する化合物を含んでなる組成物に曝し；
（ｃ）その組織サンプルを洗浄し；さらに
（ｄ）組織サンプルにおいて化合物の存在、量または分布を検出することによって疾病をスクリーニングし、血管内皮細胞におけるＦｌｔ４発現が、腫瘍内皮細胞の変化によって特徴づけられる疾病のマーカーとして同定される
工程を含んでなる、方法。
【請求項２７】
組織サンプルを、血管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物に曝すことをさらに含んでなり、かつ、スクリーニング工程が、Ｆｌｔ４に結合する化合物と腫瘍内皮細胞に結合した第２の化合物を検出して、Ｆｌｔ４および血管内皮マーカーの双方を発現する内皮細胞の存在、量または分布を求める、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳類の腫瘍内皮細胞を検出する方法であって、
（ａ）哺乳類Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ４）と特異的に結合する第１の化合物を含んでなる組成物を哺乳類に投与し；さらに
（ｂ）腫瘍内皮細胞と結合した第１の化合物を検出し、それによりその生物における腫瘍内皮細胞を検出する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２９】
血管内皮マーカーと特異的に結合する第２の化合物を哺乳類に投与することをさらに含んでなり、かつ、検出工程が、腫瘍内皮細胞と結合した第１および第２の化合物を検出することを含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
悪性腫瘍と隣接するＦｌｔ４発現血管によって特徴づけられる悪性腫瘍の診断スクリーニング、イメージングまたは治療のための医薬の製造における、Ｆｌｔ４受容体チロシンキナーゼと結合する化合物の使用。
【請求項３１】
化合物が、
（ａ）抗Ｆｌｔ４抗体の抗原結合断片を含んでなるポリペプチド；
（ｂ）可溶性Ｆｌｔ４断片を含んでなるポリペプチド（この断片およびポリペプチドはＦｌｔ４リガンドと結合し得る）；
（ｃ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）前駆ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激することはできない）；および
（ｄ）脊椎動物血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）前駆ポリペプチドの断片または類似体を含んでなるポリペプチド（このポリペプチドおよび断片または類似体は天然の宿主細胞で発現されるＦｌｔ４と結合するが、これを刺激することはできない）
からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
化合物が抗Ｆｌｔ４抗体、またはその抗原結合断片を含んでなる、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
化合物が二重特異性抗体またはその断片を含んでなり、該抗体または断片が、Ｆｌｔ４と特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、さらに、リンパ系内皮には実質的に存在しない血管内皮マーカー抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
抗体がヒト化抗体である、請求項３２および３３記載の使用。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図５Ｇ】

【図５Ｈ】

【公開番号】特開２０１２−１９７９０（Ｐ２０１２−１９７９０Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１７８５５３（Ｐ２０１１−１７８５５３）
【出願日】平成２３年８月１７日（２０１１．８．１７）
【分割の表示】特願２０００−５７５５３３（Ｐ２０００−５７５５３３）の分割
【原出願日】平成１１年１０月８日（１９９９．１０．８）
【出願人】（５０８０８８７７５）ベジェニクス　ピーティーワイ　リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＧＥＮＩＣＳ　ＰＴＹ　ＬＴＤ
【Ｆターム（参考）】